RU2585231C2 - Слитый белок, обладающий активностью фактора vii - Google Patents
Слитый белок, обладающий активностью фактора vii Download PDFInfo
- Publication number
- RU2585231C2 RU2585231C2 RU2012157301/10A RU2012157301A RU2585231C2 RU 2585231 C2 RU2585231 C2 RU 2585231C2 RU 2012157301/10 A RU2012157301/10 A RU 2012157301/10A RU 2012157301 A RU2012157301 A RU 2012157301A RU 2585231 C2 RU2585231 C2 RU 2585231C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fvii
- fusion protein
- linker
- transferrin
- seq
- Prior art date
Links
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 title claims abstract description 146
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 15
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims abstract description 150
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims abstract description 148
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 51
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims abstract description 37
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 101
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 101
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 33
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 28
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 13
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 11
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 11
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 8
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 2
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 claims description 2
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 21
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 21
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 11
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 10
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 7
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 7
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 7
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 6
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 6
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 6
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 5
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 5
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 229940112216 novoseven Drugs 0.000 description 5
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 5
- 108010013773 recombinant FVIIa Proteins 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150025711 TF gene Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 3
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 3
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 3
- 102100028169 BET1-like protein Human genes 0.000 description 2
- 101710138653 BET1-like protein Proteins 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 2
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 2
- 239000012743 FreeStyle Max reagent Substances 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 108010050062 mutacin GS-5 Proteins 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 1
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 101000621945 Homo sapiens Vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 Proteins 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 241000144290 Sigmodon hispidus Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 102000002070 Transferrins Human genes 0.000 description 1
- 108010015865 Transferrins Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 102100023485 Vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 Human genes 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N carboxyglutamic acid Chemical group OC(=O)C(N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 150000004683 dihydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000004880 explosion Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000006126 farnesylation Effects 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000009093 first-line therapy Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940043257 glycylglycine Drugs 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 108010014806 prothrombinase complex Proteins 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/49—Platelet-derived growth factor [PDGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Представленная группа изобретений касается слитого белка, ДНК, кодирующей такой белок, рекомбинантного вектора и клетки-хозяина. Охарактеризованный слитый белок содержит фактор VII (FVII) и трансферрин, где указанный трансферрин соединен с С-концом указанного FVII, необязательно через линкер. Предложенный слитый белок FVII имеет улучшенную удельную активность FVII по сравнению с существующими слитыми белками FVII, содержащими другие партнеры слияния, отличные от трансферрина, и, таким образом, может быть эффективно использован в терапии с использованием FVII. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 7 ил.,6 табл., 8 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к слитому белку, обладающему активностью фактора VII (FVII); и, более конкретно, к слитому белку, содержащему FVII и трансферрин и обладающему удельной активностью FVII 0,7 или более по сравнению с неслитым FVII природного типа, ДНК, кодирующей его, рекомбинантному вектору, содержащему ДНК, и клетке-хозяину, содержащей рекомбинантный вектор.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Различные геморрагические нарушения обусловлены недостатком факторов свертывания крови. Наиболее обычные нарушения представляют собой гемофилию A и B, обусловленные недостаточностью или аномалиями факторов свертывания крови VIII и IX, соответственно.
Гемофилия A представляет собой генетическое нарушение кровотечения, обусловленное X-сцепленным рецессивным признаком дефективного гена фактора VIII. Концентрат полученного из плазмы или рекомбинантного фактора VIII использовали для лечения гемофилии A. Гемофилия B обусловлена недостаточностью или нарушением функции фактора IX, которое лечат посредством использования концентрата полученного из плазмы или рекомбинантного фактора IX. Однако образование аллогенных антител против замещающих факторов остается серьезной медицинской проблемой в лечении гемофилии A и B. Образование антител против фактора VIII происходит у вплоть до 30% пациентов с гемофилией А. Несмотря на то, что образование антител против фактора IX происходит в меньшей степени, они менее чувствительны к индукционной терапии иммунной толерантности, что ведет к более серьезным результатам.
Инициация коагуляции крови происходит посредством формирования комплекса между тканевым фактором, который становится доступен для циркулирующей крови после повреждения стенки сосуда, и активированной формы фактора VII (FVIIa). Такой комплекс активирует фактор IX и фактор X и получаемый фактор Xa образует ограниченное количество тромбина. В контуре положительной обратной связи тромбин активирует различные факторы (такие как фактор VIII, фактор V, фактор XI и т.д.) коагуляционного каскада крови, и активированные факторы образуют комплекс протеазы фактора X или протромбиназный комплекс. Эти комплексы дополнительно усиливают образование самих себя и образование тромбина. Это достаточное количество тромбина, которое называют «тромбиновым взрывом», превращает фибриноген в местах кровотечения в фибрин, тем самым достигая полного гемостаза. Однако в случае с пациентами с гемофилией, которые имеют высокую концентрацию нейтрализующих антител против фактора VIII или фактора IX, достаточного гемостаза не достигают, поскольку не могут быть получены комплексы протеазы фактора X, указанные выше. FVIIa использовали в качестве основного терапевтического средства для пациентов, которые имеют нейтрализующие антитела против фактора VIII или фактора IX, поскольку он может активировать фактор X, даже в отсутствие фактора VIII и фактора IX, тем самым в конечном итоге создавая достаточное количество тромбина для достижения желаемых терапевтических эффектов.
FVII представляет собой одноцепочечный гликопротеин, состоящий из 406 аминокислот, имеет молекулярную массу 50 кДа и секретируется в кровоток в виде зимогена. FVII состоит из четырех отдельных доменов, т.е. домен аминоконцевой карбоксиглутаминовой кислоты (Gla), два подобных эпидермальному фактору роста (EGF) домена и домен сериновой протеазы (Hagen FS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83(8):2412-2416, 1986). FVII превращается в свою активированную форму FVIIa посредством формирования двух полипептидных цепей, связанных дисульфидной связью, т.е. N-концевой легкой цепи (24 кДа) и C-концевой тяжелой цепи (28 кДа) через протеолиз одной пептидной связи, расположенной в Arg152-Ile153. В плазме FVII представлен в концентрации 500 нг/мл, и 1% (т.е. 5 нг/мл) FVII представлен в виде FVIIa.
Между тем, сообщалось о том, что время полужизни FVII в плазме составляет приблизительно 4 часа (3~6 часов), тогда как таковое для FVIIa составляет приблизительно 2,5 часа. В связи с коротким временем полужизни, FVIIa необходимо вводить в виде нескольких внутривенных инъекций или непрерывной инъекции. Однако, это будет ограничивать терапевтическое использование FVIIa с точки зрения высоких затрат на лечение и причинения пациенту неудобств.
Для того, чтобы преодолеть эти проблемы, предоставлены способы получения слитых белков, содержащих FVII и партнер слияния, соединенный с ним, но получаемые белки имели проблему утраты их биологических активностей, даже несмотря на то, что короткое время полужизни in vivo было несколько улучшено по сравнению с неслитым белком.
Соответственно, существует потребность в предоставлении и укреплении слитого белка FVII, который имеет улучшенное время полужизни in vivo, при этом сохраняя биологическую активность FVII природного типа.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА
Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить слитый белок, имеющий биологическую активность FVII природного типа.
Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить ген, кодирующий слитый белок.
Дополнительная цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить рекомбинантный вектор, содержащий ген.
Еще одна другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить клетку-хозяина, содержащую рекомбинантный вектор.
РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, предоставлен слитый белок, содержащий фактор VII (FVII) и трансферрин, где трансферрин соединен с C-концом FVII.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, предоставлена ДНК, которая кодирует слитый белок.
В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения, предоставлен рекомбинантный вектор, который содержит ДНК.
В соответствии с еще одним дополнительным аспектом настоящего изобретения, предоставлена клетка-хозяин, которая содержит рекомбинантный вектор.
ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Слитый белок в соответствии с настоящим изобретением имеет улучшенное время полужизни in vivo по сравнению с FVII природного типа, при этом сохраняя высокую биологическую активность FVII, и, таким образом, его можно эффективно использовать в терапии с использованием FVII.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
Приведенные выше и другие цели и признаки настоящего изобретения будут очевидны из следующего описания изобретения, когда берут в сочетании с сопроводительными рисунками, на которых, соответственно, представлено:
На фиг. 1 представлено схематическое изображение, показывающее процедуру клонирования для конструирования экспрессирующего вектора FVII-Tf из вектора, содержащего кДНК, которая кодирует последовательность FVII, и вектора, содержащего кДНК, которая кодирует последовательность трансферрина (Tf);
На фиг. 2 представлено схематическое изображение, на котором показана процедура конструирования экспрессирующего вектора FVII-GS1 (линкер)-Tf посредством перекрывающейся ПЦР;
На фиг. 3 представлено схематическое изображение, показывающее процедуру конструирования экспрессирующих векторов FVII-линкер GS-Tf, которые содержат GS3, GS5, GS7, GS9, GS11, GS13, GS15 или GS-1-T в качестве линкера;
На фиг. 4 представлены результаты вестерн-блоттинга слитых белков VII-Tf, FVII-GS1-Tf, FVII-GS3-Tf, FVII-GS5-Tf, FVII-GS7-Tf, FVII-GS9-Tf, FVII-GS11-Tf, FVII-GS13-Tf, FVII-GS15-Tf, FVII-GS1-T-Tf и FVII-Спираль-Tf по настоящему изобретению, слитого белка FVII-альбумин (FVII-Alb) и FVII (NovoSevenTM);
На фиг. 5 представлен график, показывающий удельные активности слитых белков по настоящему изобретению FVII-Tf, FVII-GS1-Tf, FVII-GS3-Tf, FVII-GS5-Tf, FVII-GS7-Tf, FVII-GS9-Tf, FVII-GS11-Tf, FVII-GS13-Tf, FVII-GS15-Tf, FVII-GS1-T-Tf и FVII-Спираль-Tf и слитого белка FVII-альбумин (FVII-Alb);
На фиг. 6 представлена структура линкера и последовательности узнавания рестрикции на обоих концах в слитом белке FVII-GS1-T-Tf; и
На фиг. 7 представлены результаты вестерн-блоттинга очищенных слитых белков по настоящему изобретению FVII-Tf, FVII-GS1-Tf, FVII-GS1-T-Tf, FVII-GS3-Tf и FVII-GS15-Tf, NovoSevenTM и FVII.
ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему фактор VII (FVII) и трансферрин.
FVII и трансферрин для слитого белка по настоящему изобретению можно извлекать у любого млекопитающего, предпочтительно у человека. Более предпочтительно, FVII и трансферрин, используемые в настоящем изобретении, могут иметь не менее чем 95% гомологии последовательности относительно таковой у природного типа белков, найденных в крови человека, соответственно. Наиболее предпочтительно, FVII имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и трансферрин имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
Вдобавок, FVII или трансферрин, используемые в слитом белке по настоящему изобретению, могут представлять собой функциональный эквивалент или функциональное производное их природного типа, которое имеет по существу эквивалентную функциональную активность. Образцовые функциональные эквиваленты включают мутанты, которые возникают посредством делеции, инсерции или неконсервативной или консервативной замены любых аминокислотных остатков или их сочетания в аминокислотных последовательностях, представленных посредством SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно, в которых такие изменения по существу не изменяют активные центры или домены, обеспечивающие биологические активности в FVII.
В некоторых случаях, слитый белок по настоящему изобретению можно модифицировать, например, через фосфорилирование, сульфатирование, акрилирование, гликозилирование, метилирование, фарнезилирование, ацетилирование, амидирование и другое, для улучшения или снижения его физических или химических свойств, и такие функциональные производные также попадают в объем настоящего изобретения при условии, что биологическая активность FVII по существу сохранена.
В слитом белке по настоящему изобретению трансферрин предпочтительно соединен с C-концом FVII. Слитый белок с порядком FVII-трансферрин превосходит слитый белок с порядком трансферрин-FVII, вероятно, в связи с доступностью N-конца FVII (см. таблицу 3).
Слитый белок по настоящему изобретению дополнительно может содержать последовательность(и) узнавания для рестрикционного фермента между FVII и трансферрином для того, чтобы облегчать инсерцию линкера, как описано ниже. Последовательность узнавания рестрикции может представлять собой любую последовательность узнавания рестрикции, известную специалисту в данной области, и предпочтительно можно использовать последовательность узнавания AgeI (A/CCGGT). Другими словами, слитые белки, в которых последовательность узнавания рестрикции связана с C-концом FVII и трансферрин связан с последовательностью узнавания рестрикции, включены в объем настоящего изобретения.
Настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему линкер между FVII и трансферрином.
Линкер может иметь от 1 до 100 аминокислот, предпочтительно от 1 до 75 аминокислот, более предпочтительно от 5 до 25 аминокислот, и он может представлять собой любые пептиды, которые могут функционально разделять FVII и трансферрин. Линкер может иметь стабильную вторичную структуру, такую как спираль, или может происходить из шарнирной области IgG. Предпочтительно, линкер может свободно вращаться в водном растворе и не имеет фиксированной структуры и, следовательно, он будет неиммуногенным и будет увеличивать активности FVII слитых белков посредством минимизации потенциального препятствия между двумя партнерами слияния. В качестве примера, такой линкер может представлять собой спиральный линкер, представленный посредством аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11. Кроме того, такой гибкий линкер может содержать глицин (G) и серин (S) в повторяющемся или случайном паттерне. Например, линкер содержит (GGGGS)N (где N представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 20), и предпочтительно имеет только одно, выбранное из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: с 3 до 11 (см. таблицу 1). Вдобавок, любые аминокислотные последовательности, имеющие гомологию с линкером не менее чем 80%, предпочтительно имеющие гомологию не менее чем 85%, также можно использовать в слитом белке по настоящему изобретению.
Кроме того, линкер также может содержать сайт(ы) расщепления протеазы, который распознает протеаза(ы), присутствующие в поврежденной ткани в изобилии. Сайт расщепления можно расщеплять посредством протеазы, выбранной из группы, состоящей из тромбина, фактора Xa, фактора IXa и фактора VIIa. Слитый белок, имеющий такой сайт расщепления протеазы, расщепляют в рабочем сайте для того, чтобы получить каждый белок, т.е. FVII и трансферрин, и получаемые белки выполняют функцию отдельных белков. Предпочтительно, линкер имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 (см. таблицу 1).
Линкер можно вставлять внутрь слитого белка более легко посредством последовательности узнавания рестрикционного фермента, которая расположена между FVII и трансферрином. Соответственно, последовательность узнавания рестрикционного фермента может быть представлена на любом одном конце или обоих концах линкера и в свою очередь быть транслирована в аминокислоты, кодируемые посредством последовательности. Например, когда используют последовательность узнавания рестрикционного фермента AgeI, Thr может присутствовать на N-конце линкера и Thr-Gly может присутствовать на C-конце линкера. То есть, когда используют линкер (GGGGS)3, последовательность узнавания и линкер могут присутствовать в форме --T(GGGGS)3TG--. Аминокислоты, транслируемые на N- и C-концах линкера могут варьировать в зависимости от используемых последовательностей узнавания рестрикционного фермента, но их присутствие не влияет на активности слитых белков (см. таблицу 5).
Слитый белок по настоящему изобретению проявляет удельную активность FVII не менее чем 0,7 по сравнению с неслитым FVII природного типа.
В одном из аспектов настоящего изобретения слитый белок, который содержит FVII, представленный посредством аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и трансферрин, представленный посредством аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, имеет приблизительно от 0,82 приблизительно до 0,92 удельной активности FVII по сравнению с неслитым FVII природного типа (см. таблицы 2 и 3).
Вдобавок, слитый белок, который содержит FVII, представленный посредством аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, линкер, представленный посредством аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, и трансферрин, представленный посредством аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, имеет удельную активность FVII приблизительно 0,97 по сравнению с неслитым FVII природного типа (см. таблицу 2).
Слитые белки в соответствии с настоящим изобретением, в которые другие линкеры вставлены между FVII и трансферрином, также имеют удельные активности FVII от приблизительно 0,74 приблизительно до 1 по сравнению с неслитым FVII природного типа (см. таблицу 2).
Кроме того, слитый белок по настоящему изобретению имеет время полужизни 3~4 раза более длительное, чем таковое у FVII без трансферрина, связанного с ним (см. таблицу 6).
Настоящее изобретение также относится к ДНК, кодирующей слитый белок.
ДНК, кодирующую слитый белок, можно подвергать различным изменениям и модификациям вследствие вырожденности кодонов или принимая во внимание кодоны, предпочтительные для экспрессии слитого белка организмом, если аминокислотная последовательность слитого белка по существу не изменена, и модифицированная ДНК также включена в объем настоящего изобретения. В настоящем изобретении ДНК, кодирующая слитый белок, предпочтительно может быть представлена посредством любой одной из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: с 13 до 24. ДНК, кодирующая слитый белок по настоящему изобретению, может быть предоставлена посредством вектора для экспрессии ДНК.
Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему ДНК, кодирующую слитый белок.
Термин «вектор», используемый в настоящем документе, относится к средству для введения ДНК, кодирующей указанный слитый белок, в клетку-хозяина и экспрессии в ней слитого белка. Вектор может включать все стандартные векторы, такие как плазмидные векторы, космидные векторы, бактериофаговые векторы, вирусные векторы и другие, предпочтительно плазмидный вектор.
Подходящий экспрессирующий вектор содержит экспрессионные регуляторные элементы, такие как промоторы, инициирующие кодоны, терминирующие кодоны, сигналы полиаденилирования и энхансеры, а также сигнальные последовательности или лидерные последовательности для нацеливания на мембрану или секреции, и его можно получать различными способами согласно с целями. Следует убедиться, что инициирующий кодон и терминирующий кодон будут работать в организме, в который вводят генную конструкцию, и что они совпадают по рамке считывания с кодирующей последовательностью. Кроме того, экспрессирующий вектор содержит маркер селекции для отбора клеток-хозяев, содержащих вектор, и участок начала репликации, если экспрессирующий вектор является репродуцируемым. Вектор может самореплицироваться или может быть встроен внутрь ДНК клетки-хозяина.
В частности, рекомбинантный экспрессирующий вектор в соответствии с настоящим изобретением можно получать посредством вставки ДНК, кодирующей последовательность слитого белка, внутрь вектора pcDNA3.1-hygro.
Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, которая продуцирует слитый белок посредством трансформации с использованием указанного рекомбинантного экспрессирующего вектора.
Поскольку уровни экспрессии и модификации белков варьируют в зависимости от типа клеток-хозяев, предпочтительно выбирать клетку-хозяина, наиболее подходящую для этой цели. Примеры клеток-хозяев включают клетки млекопитающих, например, клетки яичника китайского хомяка (CHO), эмбриональные клетки почки человека (HEK293), клетки почки хомяка (BHK 21), клетки злокачественной опухоли печени человека (Hep G2) и другие, но без ограничения.
Для того чтобы трансформировать клетку-хозяина рекомбинантным экспрессирующим вектором в соответствии с настоящим изобретением, можно использовать любой способ, известный специалистам в данной области, и примеры такого способа включают, но без ограничения, электропорацию, слияние протопластов, преципитацию фосфатом кальция (CaPO4), преципитацию хлоридом кальция (CaCl2), и другие.
ВАРИАНТ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Следующие примеры приведены только с целью иллюстрации, и не предназначены для того, чтобы ограничивать объем настоящего изобретения.
Пример 1: Получение плазмидного вектора фактора VII (FVII) (pcDNA3.1-hygro-FVII)
Общую РНК, очищенную от клеток Hep G2 (KCLB № 88065) использовали в качестве матрицы для обратной транскрипции. Комплементарный ДНК (кДНК) транскрипт амплифицировали посредством ПЦР с использованием специфичных к гену FVII праймеров, FVII-F и FVII-R (SEQ ID NO: 25 и 26), чтобы получить открытую рамку считывания гена FVII человека. ПЦР осуществляли посредством обработки 50 мкл реакционного раствора (0,5 мкл кДНК, 0,4 мкМ (10 пмоль/мкл) праймеров SEQ ID NO: 25 и 26, 0,2 мМ dNTP, 5 единиц ДНК полимеразы Taq и вода) при следующих условиях: 1 цикл денатурации при 94°C в течение 5 мин, 35 циклов амплификации при 94°C в течение 1 мин, при 60°C в течение 1 мин и при 72°C в течение 2,5 мин, и 1 цикл конечной элонгации при 72°C в течение 5 мин. Очищенный продукт ПЦР клонировали в вектор pGEM-T Easy (Promega, № по каталогу: A1360). Положительные клоны отбирали посредством рестрикционного расщепления с использованием EcoRI и NcoI. Отобранные клоны дополнительно верифицировали посредством секвенирования ДНК. Для того, чтобы перенести ORF из FVII (FVII-ORF) в экспрессирующий вектор, FVII-ORF, расщепленный с использованием NotI, затупляли посредством T4 ДНК полимеразы и лигировали с использованием вектора pcDNA3.1-hygro (Invitrogen), расщепленного с использованием HindIII/XbaI и затупленного. Лигированный вектор подтверждали посредством рестрикционного расщепления с использованием ApaI, XbaI, EcoRI, NcoI, PstI и секвенирования ДНК. Этот вектор обозначили «pcDNA3.1-hygro-FVII».
Пример 2: Конструирование экспрессирующего вектора FVII-Tf (pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf)
кДНК FVII, полученную в примере 1, сливали с кДНК трансферрина (Tf) человека для того, чтобы экспрессировать в виде одного зимогена в клетке животного. кДНК трансферрина человека приобретали в Origene (№ по каталогу: SC322130) и проверяли, совпадает ли она с последовательностью с номером доступа GenBank NM_001063.2. Праймеры, используемые в слиянии, разрабатывали для того, чтобы удалить терминирующий кодон FVII и сигнальный пептид трансферрина. Для того, чтобы облегчить инсерцию линкеров различных размеров между FVII и Tf, сайт AgeI (ACCGGT), который будет транслирован в треонин (Thr) и глицин (Gly), добавляли в связывающие праймеры. Получаемый слитый белок будет иметь следующую структуру: (лидерный пептид)-(зрелый FVII)-(Thr-Gly)-(зрелый Tf) (в котором лидерный пептид состоит из сигнального пептида (пептид-предшественник), не присутствующего в зрелом FVII, и пропептида, подлежащего расщеплению посредством процессирующего фермента, который состоит из 38 аминокислот и соответствует аминокислотам в диапазоне положений от 1 до 38 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1). кДНК для FVII и Tf амплифицировали посредством использования праймеров FVII-S1, FVII-AS1, Tf-S1 и Tf-AS1 (SEQ ID NO: с 27 до 30) и использовали вектор, как описано в примере 1. Праймеры с SEQ ID NO: 27 и 30 содержат сайты NheI и XhoI, соответственно.
Стратегия клонирования для соединения кДНК FVII и кДНК Tf изображена на фиг. 1. Сначала, кДНК FVII амплифицировали из вектора pcDNA3.1-hygro-FVII посредством ПЦР. ПЦР осуществляли посредством обработки 50 мкл реакционного раствора (1 мкл матрицы вектора, 1 мкл набора праймеров, FVII-S1 и FVII-AS1 (10 мкМ), 10 мкл 5× буфера Phusion HF, 200 мкМ dNTP, 0,5 мкл ДНК полимеразы Phusion (FINNZYMES, #F-530S, 2 единицы/мкл) и 35,5 мкл воды) при следующих условиях: 1 цикл денатурации при 98°C в течение 30 сек, 30 циклов амплификации при 98°C в течение 10 сек, при 60°C в течение 45 сек и при 72°C в течение 30 сек, и 1 цикл конечной элонгации при 72°C в течение 7 мин.
Затем Tf амплифицировали с использованием кДНК трансферрина в качестве матрицы. Указанную выше процедуру ПЦР повторяли, за исключением использования набора праймеров (Tf-S1: 10 мкМ; Tf-AS1: 10 мкМ).
Амплифицированные FVII и кДНК Tf соединяли посредством серии рестрикций и лигирований. Каждую ДНК, амплифицированную посредством ПЦР, расщепляли с использованием AgeI и XhoI, или с использованием NheI. Расщепленную ДНК очищали и лигировали с молярным отношением 1:1. Лигированную ДНК субклонировали в вектор pcDNA3.1-hygro (Invitrogen), расщепленный с использованием NheI/XhoI. Размер и последовательность вставки дополнительно верифицировали посредством секвенирования ДНК.
Пример 3: Конструирование экспрессирующего вектора FVII-линкер GS-Tf
Пептид, состоящий из 5 аминокислот, содержащих глицин и серин, использовали в качестве базового линкерного блока. Базовый линкерный блок содержит четыре глицина и один серин при следующей последовательности: «GGGGS». Базовый линкерный блок (далее в настоящем документе обозначаемый как «линкер GS-X», в котором X представляет собой число повторений базового линкерного блока GS) использовали для того, чтобы составить более длинные линкеры GS. В этом примере конструировали линкеры в диапазоне от GS-1 до GS-15.
1) Конструирование экспрессирующего вектора FVII-линкер GS-1-Tf
Набор праймеров, GS-FV-AS1 и GS-Tf-S1 (SEQ ID NO: 31 и 32), содержащих базовый линкерный блок GS, синтезировали и вставляли между FVII и Tf посредством перекрывающейся ПЦР (см. фиг. 2).
Линкер GS-1 соединяли с FVII посредством ПЦР с использованием набора праймеров FVII-S1 и GS-FV-AS1 (SEQ ID NO: 27 и 31) и ДНК полимеразы Phusion (FINNZYMES, #F-530S). ПЦР осуществляли посредством обработки 50 мкл реакционного раствора (1 мкл вектора pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf, 1 мкл FVII-S1 (10 пмоль/1 мкл), 1 мкл GS-FV-AS1 (10 пмоль/мкл), 1 мкл 10 мМ dNTP, 10 мкл 5× буфера Phusion HF, 35,5 мкл воды и 0,5 мкл ДНК полимеразы Phusion (2 ед/мкл)) при следующих условиях: 1 цикл денатурации при 98°C в течение 30 сек, 35 циклов амплификации при 98°C в течение 10 сек, при 64°C в течение 30 сек и при 72°C в течение 45 сек, и 1 цикл конечной элонгации при 72°C в течение 7 мин. Между тем, чтобы соединить линкер GS-1 с Tf, повторяли приведенную выше процедуру ПЦР, за исключением использования набора праймеров GS-Tf-S1 и Tf-AS1 (SEQ ID NO: 32 и 30). Амплифицированные продукты ПЦР использовали в качестве матриц для перекрывающейся ПЦР. Перекрывающуюся ПЦР осуществляли посредством обработки реакционного раствора (1 мкл амплифицированных продуктов ПЦР, 1 мкл FVII-S1 (10 пмоль/мкл, SEQ ID NO: 27), 1 мкл антисмыслового праймера (Tf-AS1 10 пмоль/мкл, SEQ ID NO: 30), 10 мкл 5× буфера Phusion HF, 1 мкл 10 мМ dNTP, 34,5 мкл воды, 0,5 мкл ДНК полимеразы Phusion (2 ед/мкл)) при следующих условиях: 1 цикл денатурации при 98°C в течение 1 мин, 45 циклов амплификации при 98°C в течение 10 сек, при 66/68°C в течение 30 сек, и при 72°C в течение 45 сек, и 1 цикл конечной элонгации при 72°C в течение 7 мин. Амплифицированный продукт перекрывающейся ПЦР клонировали в pcDNA3.1-hygro-lacZ, расщепленный с использованием NheI и XhoI.
2) Конструирование экспрессирующего вектора FVII-GS-3 линкер-Tf
Синтезировали набор праймеров, GS3-S и GS3-AS (SEQ ID NO: 33 и 34), содержащий GS-3 и сайт AgeI. Чтобы создать двухцепочечный линкер GS-3, праймеры отжигали посредством нагревания смеси (5 мкл GS3-S (100 пмоль/мкл), 5 мкл GS3-AS (100 пмоль/мкл), 2 мкл 10× буфера для отжига (100 мМ Tris-Cl [pH 8,0], 1 M NaCl, 10 мМ ЭДТА) и 8 мкл воды) при 98°C в течение 10 мин и охлаждали при 25°C в течение 1 часа. Отожженный линкер расщепляли с использованием AgeI, а также вектор pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf, полученный в примере 2, расщепляли с использованием AgeI. Расщепленный вектор обрабатывали в 1 мкл CIP (кишечная фосфатаза теленка; NEB, #M0290S) при 37°C в течение 1 часа и подвергали процедуре экстрагирования в геле (QIAGEN, #28704), за чем следовало лигирование при молярном отношении 1:3 (вектор:вставка) с использованием ДНК лигазы T4 (TAKARA, #2011A).
3) Конструирование экспрессирующих векторов с FVII-GS-5 линкер-Tf до FVII-GS-15 линкер-Tf
Для того, чтобы конструировать экспрессирующий слитый белок вектор, содержащий линкер GS-5, реализовали новую стратегию. Векторы слияния FVII-Tf, содержащие удлиненные линкеры, конструировали посредством следующих двух стадий.
Первая стадия представляет собой добавление синтезированного двухцепочечного (ds) линкера GS2 в предварительно полученный линкер. После подтверждения удлинения линкера, линкер вырезали и вставляли между генами FVII и Tf в вектор pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf. Например, для того, чтобы удлинить линкер GS-3 до линкера GS-5, синтезированный линкерный блок dsGS-2 SEQ ID NO: 35 расщепляли с использованием BglII и лигировали с использованием вектора pcDNA3.1-hygro-FVII-GS3-Tf, обработанного с использованием BamHI и StuI. Затем, после подтверждения удлинения линкера посредством расщепления BamHI и AgeI, удлиненный линкер вырезали с использованием AgeI и субклонировали в вектор pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf, обработанный с использованием AgeI и CIP. Экспрессирующие слияние FVII-Tf векторы, содержащие линкеры GS-7, GS-9, GS-11, GS-13 и GS-15, конструировали посредством аналогичной стратегии (см. фиг. 3).
Пример 4: Конструкция экспрессирующего вектора FVII-Tf (pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1-T-Tf), содержащего линкер, содержащий сайт расщепления тромбина
Линкер, содержащий сайт расщепления тромбина, получали посредством присоединения блока GS-1 к обоим концам последовательности узнавания тромбина (далее в настоящем документе обозначаемой «линкер GS1-T»). Линкер dsGS1-T с SEQ ID NO: 36 (смысловая) разрабатывали и синтезировали, чтобы он содержал сайты AgeI на обоих концах. Линкер dsGS1-T расщепляли с использованием AgeI и очищали с использованием PCR Purification Kit (Qiagen, № по каталогу: 28104). Очищенный линкер лигировали в вектор pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf, обработанный с использованием CIP/AgeI.
Пример 5: Конструкция экспрессирующего вектора FVII-Tf (pcDNA3.1-hygro-FVII-Спираль-Tf), содержащего спиральный линкер
Спиральный линкер ДНК получали способом, который раскрыт в выложенной публикации США № 2009/0170163. Сайт AgeI добавляли на оба конца полученного спирального линкера ДНК посредством использования праймеров, спиральный линкер S и спиральный линкер AS (SEQ ID NO: 37 и 38). Праймеры спиральный линкер S и спиральный линкер AS отжигали и расщепляли с использованием AgeI, за чем следовала вставка внутрь вектора pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf, обработанного с использованием AgeI и CIP. Сконструированный вектор подтверждали посредством секвенирования ДНК.
Сравнительный пример 1: Конструирование экспрессирующего слияние FVII-альбумин вектора (FVII-Alb)
Конструировали слитый белок FVII-альбумин, раскрытый в патенте EP № 1816201. кДНК альбумина человека получали посредством ОТ-ПЦР с использованием мРНК печени человека (Clontech) в качестве матрицы и геноспецифических праймеров для альбумина, альбумин-S и альбумин-AS (SEQ ID NO: 39 и 40). ОТ-ПЦР осуществляли посредством использования AccuScript High Fideleity RT-PCR System Kit (№ по каталогу 600180) в соответствии с руководством производителя. Сначала 10 мкл реакционного раствора для обратной транскрипции (1 мкл 10× буфера для обратной транскриптазы, 0,6 мкл праймера oligo-dT, 1 мкл dNTP, 0,4 мкл воды, 5 мкл мРНК печени человека (10 нг/мкл)) держали при 65°C в течение 5 мин и при комнатной температуре в течение 5 мин, и подвергали реакции с 1 мкл 100 мМ DTT и 1 мкл обратной транскриптазы при 42°C в течение 1 часа. Последовательность альбумина человека получали посредством ПЦР с использованием синтезированной кДНК в качестве матрицы и праймеров альбумин-S и альбумин-AS. ПЦР осуществляли посредством обработки 50 мкл реакционного раствора (1 мкл кДНК, 10 мкл 5× буфера Phusion HF, 1 мкл праймеров Альбумин-S и Альбумин-AS, соответственно, 1 мкл 10 мМ dNTP, 0,5 мкл ДНК полимеразы Phusion (FINNZYMES, #F-530S; 2 ед/мкл) и 35,5 мкл воды) при следующих условиях: 1 цикл денатурации при 98°C в течение 1 мин, 30 циклов амплификации при 98°C в течение 10 сек, при 62°C в течение 30 сек и при 72°C в течение 60 секунд, и 1 цикл конечной элонгации при 72°C в течение 7 мин. Синтезированные олигонуклеотиды с SEQ ID NO: 41 и 42 отжигали к линкеру GS [SS(GGS)9GS] (SEQ ID NO: 45), раскрытому в патенте EP № 1816201. Для того, чтобы соединить кДНК FVII, полученную в примере 1, с указанным выше линкером, терминирующий кодон FVII в векторе pcDNA3.1-hygro-FVII заменяли на сайт XhoI посредством мутагенеза на основе ПЦР с использованием праймеров mut FVII(XhoI)-S и mut FVII(XhoI)-AS (SEQ ID NO: 43 и 44). Используя сайты XhoI/ApaI, линкер GS [SS(GGS)9GS] сливали с 3'-концом кДНК FVII в векторе pcDNA3.1-hygro-FVII. В конце кДНК альбумина человека, расщепленную с использованием BamHI, вставляли внутрь вектора pcDNA3.1-hygro-FVII-GS-линкер. Полученный экспрессирующий вектор pcDNA3.1-hygro-FVII-GS-линкер-альбумин подтверждали посредством секвенирования ДНК.
Характеристики экспрессирующих векторов, сконструированных в примерах со 2 по 5 и сравнительном примере 1, приведены в таблице 1.
Экспериментальный пример 1: Измерение удельных активностей FVII-слитых белков
FVII-слитые белки, сконструированные в примере со 2 по 5 и сравнительном примере 1, экспрессировали в клетках CHO (CHO(VK2)) которые стабильно экспрессируют VKORC1 (субъединица 1 комплекса эпоксидредуктазы витамина K).
Экспрессирующие векторы, сконструированные в примере со 2 по 5 и сравнительном примере 1, очищали посредством использования Endo-free Plasmid Maxi Kit (Qiagen, #27104). β-галактозидазу использовали в качестве внутреннего контроля для трансфекции. Клетки CHO (VK2) высевали с плотностью 1,5×106 клеток/лунка в 6-луночные планшеты. Клетки инкубировали в α-MEM (Lonza, #12-169F) с добавлением 10% FBS (Lonza, #14-501F), 1× HT (Invitrogen, #11067-030), 4 мМ L-глутамина (Lonza, #17-605E) и 200 мкг/мл гигромицина (Invitrogen, #10687-010) в течение 24 часов, и затем осуществляли трансфекцию с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) в соответствии с руководством изготовителя. Через четыре часа после трансфекции среду заменяли бессывороточной средой (OptiMEM) и добавляли 5 мкг/мл витамина K. После 48 часов инкубации брали образцы среды для культивирования и хранили их при -70°C.
Экспрессируемые слитые белки FVII анализировали на их хромогенные активности и количества антигенов с использованием COATEST Factor VII Assay Kit (Chrmogenix, #821900-63) и FVII ELISA Kit (Cedarlene Lab, #CL20030K), соответственно. Анализы осуществляли в соответствии с руководством изготовителя. Стандартную плазму человека, нормализованную по стандарту ВОЗ, использовали в качестве контрольного FVII в обоих анализах. Экспрессию белка оценивали посредством анализа вестерн-блоттинга. Основываясь на результатах ELISA, загружали равные количества слитых FVII белков. Обнаружено, что экспрессируемые слитые белки FVII обладают ожидаемыми размерами без обнаружимой фрагментации (см. фиг. 4).
Между тем, удельные активности слитых белков FVII-трансферрин составляли от 0,74 до 1, что было выше по сравнению с таковыми слитого белка FVII-альбумин (0,52) (см. таблицу 2). Слитые белки FVII-трансферрин, содержащие линкеры, также сохраняли не менее чем 70% активности FVII. Зависимость между длиной линкера и удельной активностью отсутствует, но FVII слитые белки с более короткими линкерами GS показывали несколько более высокие удельные активности, чем слитые белки с более длинными. В частности, слитые белки FVII-GS1-Tf и FVII-GS1-T-Tf показывали сравнимые удельные активности (см. фиг. 5).
Пример 6: Определение характеристик слитых белков FVII в соответствии с направлением слияния Tf
В этом примере слитый белок, в котором трансферрин человека (Tf) связан с N-концом FVII, получали и сравнивали со слитым белком, в котором трансферрин связан с C-концом FVII для того, чтобы проверить изменение характеристик в соответствии с направлением слияния в слитых белках. Детальная процедура представляет собой следующее.
<6-1> Конструирование экспрессирующих векторов Tf-FVII и Tf-GS1-T-FVII
Два слитых белка с Tf, соединенным с N-концом FVII, разрабатывали согласно следующему: (1) (лидерный пептид из Tf)-(зрелый Tf)-(Thr-Gly)-(зрелый FVII); и (2) (лидерный пептид из Tf)-(зрелый Tf)-(Thr)-(GS1-T; SEQ ID NO: 12)-(Thr-Gly)-(зрелый FVII).
Сначала для того, чтобы получить последовательность гена Tf, содержащего лидерный пептид, прямой праймер (Nhe-Tf: SEQ ID NO: 46) разрабатывали так, чтобы он содержал сайт NheI для целей клонирования, и обратный праймер (Tf-Age: SEQ ID NO: 47) разрабатывали так, чтобы он содержал сайт AgeI для целей удаления терминирующего кодона трансферрина и клонирования. Для клонирования зрелого FVII с удаленным лидерным пептидом, прямой праймер (Age-FVII: SEQ ID NO: 48) разрабатывали так, чтобы он содержал сайт AgeI, и обратный праймер разрабатывали так, чтобы он содержал сайт XhoI.
Для гена Tf, кДНК, приобретенную в Origene (№ по каталогу: SC322130) как в примере 2 использовали в качестве матрицы для ПЦР. ПЦР осуществляли посредством обработки 50 мкл реакционного раствора (1 мкл матрицы вектора, 2 мкл праймеров Nhe-Tf и Tf-AgeI (10 мкМ), 10 мкл 5× буфера Phusion HF, 1 мкл 10 мМ dNTP, 0,5 мкл ДНК полимеразы Phusion (FINNZYMES, #F-530S, 2 ед/мкл) и 33,5 мкл воды) при следующих условиях: 1 цикл денатурации при 98°C в течение 30 сек, 25 циклов амплификации при 98°C в течение 10 сек, при 70°C в течение 30 сек и при 72°C в течение 36 сек, и 1 цикл конечной элонгации при 72°C в течение 10 мин. FVII амплифицировали посредством ПЦР с использованием вектора pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1-T-Tf в качестве матрицы, как в примере 4. Условия ПЦР аналогичны приведенным выше условиям ПЦР Tf, за исключением использования праймеров Age-FVII (10 мкМ) и VII-Xho (10 мкМ).
Амплифицированный ген Tf вставляли внутрь вектора pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1-T-Tf посредством использования NheI/AgeI для того, чтобы получить вектор pcDNA3.1-hygro-Tf-Tf. Вектор pcDNA3.1-hygro-Tf-Tf и продукт ПЦР FVII расщепляли с использованием AgeI/XhoI и лигировали для того, чтобы сконструировать экспрессирующий вектор, содержащий слитый белок pcDNA3.1-hygro-Tf-FVII. Экспрессирующий вектор pcDNA3.1-hygro-Tf-GS1-T-FVII конструировали посредством вставки последовательности dsGS1-T, синтезированной в примере 4, посредством AgeI. Сконструированные экспрессирующие векторы подтверждали посредством рестрикционного картирования и секвенирования ДНК.
<6-2> Экспрессия слитых белков и определение характеристик
Для того чтобы охарактеризовать слитые белки с Tf, связанным с N-концом FVII, экспрессирующие их векторы, т.е. pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf, pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1-Tf-VII, pcDNA3.1-hygro-Tf-FVII и pcDNA3.1-hygro-Tf-GS1-T-FVII, транзиторно экспрессировали в клетках CHO.
ДНК сконструированных четырех плазмид выделяли с использованием Endo-free Maxi Prep Kit (Qiagen). За один день до трансфекции, клетки CHO (DG44), которые культивировали в колбах T75, выделяли посредством трипсина и высевали при плотности 1,5×106 клеток/лунка в 6-луночные планшеты. После 24 часов клетки трансфицировали в соответствии с руководством изготовителя. Через четыре часа после трансфекции среду в каждой лунке удаляли и заменяли на 2 мл среды для выращивания с добавлением 5 мкг/мл витамина K. После трансфекции 6-луночный планшет инкубировали в 37°C, 5% CO2 инкубаторе, и через 48 часов среду собирали. Собранный супернатант переносили в 1,5 мл пробирки и хранили при -70°C для хромогенного анализа и ELISA для FVII. Планшет с удаленной средой промывали с использованием 2 мл HBSS на лунку и лизировали с использованием 250 мкл раствора для лизиса (Tropix, #ABX210LM, добавление 1 мМ DTT), за чем следовало хранение при -70°C для анализа β-галактозидазы.
Хромогенный анализ и ELISA для FVII осуществляли как в экспериментальном примере 1. Образцы для анализа получали посредством размораживания хранящейся замороженной среды после трансфекции, непосредственно перед экспериментом, и получения супернатанта центрифугированием. Стандартную плазму человека (Dade Behring, # ORKL13, Lot#503216F) использовали в качестве стандарта в анализе.
Результаты измерения приведены в таблице 3. Для Tf-FVII и Tf-GS1-T-Tf с Tf, соединенным с N-концом FVII, активности не измеряли, в отличие от FVII-Tf и FVII-GS1-T-Tf с Tf, соединенным с C-концом FVII. Кроме того, низкие количества слитых белков с Tf, соединенным с N-концом, обнаруживали в ELISA для FVII. Однако независимо от направлений слияния, слитые белки показывали схожие чувствительности обнаружения в результатах вестерн-блоттинга с использованием поликлональных антител к Tf. Результаты показывают, что когда Tf соединен с N-концом FVII, происходит образование слитых белков без активностей FVII, даже несмотря на то, что трансляция аминокислот проходила нормально.
| Таблица 3 | |||
| Слитый белок | Активность FVII (%) | Антиген FVII (%) | Удельная активность (активность/антиген) |
| FVII-Tf | 33,8±0,73 | 37,0±2,17 | 0,92 |
| Tf-FVII | не обнаружена | 8,0±1,51 | - |
| FVII-GS-1-T-Tf | 46,6±0,29 | 43,0±4,75 | 1,08 |
| Tf-GS-1-T-Tf | не обнаружена | 13,5±1,01 | - |
Пример 7: Определение характеристик слитых белков в соответствии с делецией последовательности узнавания рестрикционного фермента, использованной в слиянии
В примере 2, последовательности узнавания рестрикционного фермента (AgeI) использовали для облечения вставки различных линкеров между FVII и Tf. Как следствие, некоторые слитые белки стали иметь Thr и Gly, которые кодирует указанный выше рестрикционный фермент, на обоих концах линкеров. В этом примере проверяли, изменены или нет свойства слитых белков за счет присутствия последовательности узнавания рестрикционного фермента (AgeI).
Последовательности узнавания рестрикционного фермента удаляли из слитого белка FVII-GS1-T-Tf, содержащего линкер GS1-T, посредством сайт-специфического мутагенеза на основе ПЦР с использованием мутагенных праймеров. Как показано на фиг. 6, этот эксперимент разрабатывали для того, чтобы удалить «Thr» на N-конце и «Thr-Gly» на C-конце, а праймеры, использованные в эксперименте, перечислены в таблице 4.
<7-1> Делеция Thr-Gly
Проводили мутагенез на основе ПЦР. ПЦР осуществляли посредством обработки реакционного раствора (1 мкл вектора pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1-T-Tf, 0,2 мкл смыслового праймера (TG del-S 10 мкМ), 0,2 мкл антисмыслового праймера (TG del-AS 10 мкМ), 1 мкл 10 мМ dNTP, 4 мкл 5× буфера для ПЦР, 14 мкл воды и 0,2 мкл ДНК полимеразы Phusion (FINNZYMES, #F-530S)) при следующих условиях: 1 цикл денатурации при 98°C в течение 30 сек, 18 циклов амплификации при 98°C в течение 10 сек, при 58°C в течение 30 сек и при 72°C в течение 3 мин, и 1 цикл конечной элонгации при 72°C в течение 7 мин. Для того, чтобы удалить исходную матричную ДНК, амплифицированный продукт ПЦР обрабатывали с использованием 1 мкл DpnI (NEB, #R0176S) и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. 50 мкл HIT компетентных клеток (DH5α, RH617) трансформировали с использованием 10 мкл обработанной DpnI ДНК и инкубировали в твердой среде LB+amp (10 мг/мл) в течение ночи. Четыре клона, полученных таким образом, анализировали посредством секвенирования ДНК и два клона были подтверждены в качестве мутантов.
<7-2> Делеция Thr
Для того чтобы удалить Thr, способ, схожий с тем, что в примере <7-1>, проводили посредством использования различных праймеров. В кратком изложении, мутагенез на основе ПЦР осуществляли посредством использования, в качестве матрицы, 1 мкл плазмидной ДНК клонов, в которых мутацию подтверждали в примере <7-1>, и 1 мкл смыслового праймера (T del-S; 10 пмоль) и 1 мкл антисмыслового праймера (T del-AS; 10 пмоль), в тех же условиях. Посредством секвенирования ДНК четырех клонов, которые отобрали, у трех клонов подтвердили наличие мутаций. Гарантированный экспрессирующий вектор назвали «pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1-T-Tf(M3)».
<7-3> Определение характеристик слитых белков с удаленными последовательностями узнавания рестрикционного фермента
Клетки CHO трансфицировали экспрессирующими векторами FVII-GS1-T-Tf и FVII-GS1-T-Tf(M3) и экспрессирующим вектором FVII-Alb в качестве контроля, и получали супернатанты сред. Полученные супернатанты подвергали хромогенному анализу FVII (Chromogenix) и ELISA для FVII (Cedarlane) для того, чтобы подтвердить изменение в отношении активность/антиген. Как показано в таблице 5, количества антигена и активности слитых белков FVII-GS1-T-Tf и FVII-GS1-T-Tf(M3) были почти равны друг другу, и отношения (удельные активности) также не варьировали. Вдобавок, подтверждали, что удельные активности значительно выше таковых у слитого белка FVII-Alb.
Пример 8: Измерение времени полужизни слитых белков
Для того чтобы проверить увеличение времени полужизни в слитых белках в соответствии с настоящим изобретением, FVII-Tf, FVII-GS1-Tf, FVII-GS3-Tf, FVII-GS15-Tf и FVII-GS1-T-Tf использовали в качестве экспериментальных групп, и FVII дикого типа и FVIIa коммерчески доступный (NovoSeven®; Novo Nordisk) использовали в качестве контрольных групп.
<8-1> Получение образца
1) Обеспечение среды для экспрессии
Белок дикого типа FVII и пять слитых с Tf слитых белков FVII экспрессировали в клеточной линии FreeStyleTM CHO-S (Invitrogen, № по каталогу R800-07). Клетки CHO-S культивировали в суспензии во вращающейся колбе со средой для экспрессии Freestyle CHO с добавлением 8 мМ L-glu (GIBCO, L-глутамин 200 мМ (100×), № по каталогу 25030-081). Культивируемые клетки высевали при плотности 4×105 клеток/мл за 24 часа до трансфекции, и осуществляли трансфекцию, когда плотность становилась 1×106 клеток/мл. ДНК, используемую в трансфекции, получали посредством использования Endo-free Maxi Prep Kit (QIAGEN, № по каталогу 12362) или Endo-free Plasmid Mega Prep Kit (QIAGEN, 12381), и трансфекцию проводили в соответствии с протоколом трансфекции FreeStyle MAX Reagent (Invitrogen, № по каталогу 16447-100). 500 мкг ДНК добавляли в 8 мл OptiPRO SFM (Invitrogen, № по каталогу 12309-019) и смешивали. В другую пробирку добавляли 8 мл OptiPRO SFM (Invitrogen, № по каталогу 12309-019) и 500 мкл FreeStyle Max Reagent и затем указанные выше две смеси медленно смешивали и хранили при комнатной температуре в течение 10 мин. Через 10 мин клетки FreeStyleTM CHO-S трансфицировали смесью. Трансфицированные клетки культивировали в 37°C, 5% CO2 инкубаторе в течение 3~5 суток, и затем получали супернатант.
2) Очистка среды для экспрессии
Среду, полученную посредством культуры во вращающейся колбе, фильтровали через 0,22 мкм фильтр (Corning) для того, чтобы удалить оставшиеся клетки и дебрис. Фильтрованную среду концентрировали в 10 раз посредством ультрафильтрования с использованием мембраны тангенциального потока (Satorious, 30 КДа). Концентрированную среду наносили на колонку XK16/20 (GE healthcare), загруженную смолой Ceramic Hydroxyapatite (BIO-RAD, 157-0040). Колонку с Ceramic Hydroxeapatite уравновешивали с использованием уравновешивающего буфера в количестве более 10 объемов колонки (25 мМ имидазол, 0,02% Tween 80 и 150 мМ NaCl, pH 6,5). После загрузки концентрированной среды колонку промывали уравновешивающим буфером и промывающим буфером-1 (25 мМ имидазол, 0,02% Tween 80, 100 мМ фосфат натрия, pH 6,3) и промывающим буфером-2 (25 мМ имидазол, 0,02% Tween 80, 100 мМ фосфат натрия, 1M NaCl, pH 6,3). После промывания слитый белок, захваченный на колонке, элюировали элюирующим буфером (25 мМ имидазол, 0,02% Tween 80, 500 мМ фосфат натрия, pH 6,3). Элюированный белок анализировали посредством FVII-хромогенного анализа, анализа ELISA для FVII и SDS-PAGE/вестерн-блоттинга.
<8-2> Анализ вестерн-блоттинга
Посредством SDS-PAGE/окрашивания кумаси синим подтверждали, что слитые белки FVII и FVII/Tf, частично очищенные через двухстадийные колонки, имеют чистоту 45% или более. Присутствие полученных из FVII фрагментов в очищенных белках оценивали посредством вестерн-блоттинга, поскольку фрагментированные FVII в очищенных слитых белках могут иметь более короткое время полужизни, чем интактный слитый белок FVII и вести к неправильному определению времени полужизни каждого слитого белка FVII. NovoSeven® (Novo Nordisk, 1,2 мг/флакон, 60 тыс. МЕ) и очищенные образцы получали при 0,1 МЕ (активность FVII)/10 мкл, и затем проводили SDS-PAGE посредством использования геля NuPage 4-12% bis-Tri (Invitrogen). После выполнения электрофореза, гель переносили на ПВДФ мембрану, и мембрану блокировали при комнатной температуре в течение 1 часа посредством добавления 10 мл блокирующего буфера (25 мМ Tris, 150 мМ NaCl (pH 7,2), 5% обезжиренное молоко и 0,1% Tween 80). Блокирующий раствор декантировали, и 10 мл (5% обезжиренное молоко в PBS-T) антитела против FVII (№ по каталогу F8146, Sigma) или антитела мыши против трансферрина (sc52256, Santa Cruz) добавляли в соотношении 1:5000 и 1:500 и инкубировали в течение 1 часа в поворотном встряхивателе. Мембрану промывали четыре раза промывающим раствором (25 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,2) и инкубировали в течение 1 часа в 10 мл (5% снятое молоко в PBS-T) раствора, в котором антитело козы против IgG мыши-HRP (№ по каталогу G21040, Invitrogen) в качестве вторичного антитела добавляли в соотношении 1:50000. После промывания мембраны четыре раза промывающим раствором (25 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,2), 2 мл Super-Signal West Femto Mix (Thermo) добавляли на нее в течение 5 мин. После завершения реакции, пленку проявляли.
Результаты вестерн-блоттинга приведены на фиг. 7. Как показано на фиг. 7, в очищенных белках полученные из FVII фрагменты не обнаруживали. На блоте, зондированном антителом против трансферрина, фрагментированные трансферрины не обнаруживали.
<8-3> Измерение времени полужизни
Время полужизни слитого белка, не имеющего линкер, слитых белков, имеющих четыре линкера (GS1, GS1-T, GS3 и GS15), и FVII дикого типа, экспрессированного и очищенного в тех же условиях, и коммерчески доступного NovoSeven в качестве контролей измеряли и сравнивали друг с другом на крысах. Количественный анализ количества FVII в образцах, подлежащих введению, и образцах, собранных в эксперименте на животных, проводили посредством ELISA для FVII человека (Cedarlane, Paired Antibodies for ELISA Factor VII, #CL20030K), в соответствии с инструкцией изготовителя. Концентрации образцов, подлежащих введению, определяли посредством усреднения значений из трех различных разведений образца. Разбавляющий раствор для введения (NaCl 3 мг/мл, CaCl2 дигидрат 1,5 мг/мл, глицилглицин 1,3 мг/мл, полисорбат 80 0,1 мг/мл и маннит 30 мг/мл, pH 5,5) использовали в качестве разбавителя. После количественного определения ELISA для FVII каждый белок разводили разбавляющим раствором для введения, и разведенный образец внутривенно вводили крысам (250~300 г Sprague Dawley, три крысы на группу) через хвостовую вену в дозе 150 Ед/кг, основываясь на массах крыс, измеренных в день эксперимента. Всего кровь брали в 11 моментов времени, т.е. через 0 мин, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 60 мин, 1,5 часа, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов и 24 часа после введения лекарственного средства. 225 мкл крови и 25 мкл 3,2% цитрата натрия смешивали и центрифугировали при 4°C и 13000 об./мин в течение 1 мин, за чем следовало хранение супернатанта при -70°C. Плазму крыс анализировали посредством разведения 1/50 или 1/100 промывающим буфером, используемым в FVII ELISA Kit (Cedarlane). Регрессионную кривую получали посредством построения зависимости логарифма концентрации антигена FVII человека от момента времени получения образца. Время полужизни каждого FVII определяли посредством вычисления по формуле «время полужизни = ln2/наклон регрессионной кривой». Как показано в таблице 6, слитые белки по настоящему изобретению показывали в 3~4 раза улучшенное время полужизни по сравнению с FVII дикого типа.
Claims (16)
1. Слитый белок, обладающий активностью фактора VII и содержащий фактор VII (FVII) и трансферрин, где указанный трансферрин соединен с С-концом указанного FVII, необязательно через линкер.
2. Слитый белок по п. 1, где указанный FVII представляет собой полипептид, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
3. Слитый белок по п. 1, где указанный трансферрин представляет собой полипептид, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2.
4. Слитый белок по п. 1, который дополнительно содержит последовательность узнавания рестрикционного фермента между С-концом указанного FVII и указанным трансферрином.
5. Слитый белок по п. 1, где линкер состоит из от 1 до 100 аминокислот.
6. Слитый белок по п. 1, где линкер состоит из от 1 до 75 аминокислот.
7. Слитый белок по п. 1, где линкер состоит из 5 до 25 аминокислот.
8. Слитый белок по п. 4, где одна или несколько аминокислот, транслируемых из участка узнавания рестрикционного фермента, присутствуют на одном конце или обоих концах линкера.
9. Слитый белок по п. 1, где линкер представляет собой пептид, представленный любой одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3-11.
10. Слитый белок по п. 1, где линкер содержит сайт расщепления протеазы, который способен быть расщепленным протеазой, выбранной из группы, состоящей из тромбина, фактора Ха, фактора IXa и фактора VIIa.
11. Слитый белок по п. 10, где линкер представляет собой пептид, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12.
12. Слитый белок по любому одному из пп. 1-11, где слитый белок имеет удельную активность FVII не менее чем 0,7 по сравнению с неслитым FVII природного типа.
13. ДНК, кодирующая слитый белок, обладающий активностью фактора VII, по любому одному из пп. 1-11.
14. ДНК по п. 13, где ДНК представлена любой одной из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 13-24.
15. Рекомбинантный вектор, экспрессирующий ДНК по п. 13, содержащий ДНК по п. 13.
16. Клетка-хозяин, являющаяся клеткой китайского хомячка (CHO), для получения ДНК по п. 13, содержащая рекомбинантный вектор по п. 15.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2010-0052719 | 2010-06-04 | ||
| KR20100052719 | 2010-06-04 | ||
| PCT/KR2011/004131 WO2011152694A2 (en) | 2010-06-04 | 2011-06-07 | Fusion protein having factor vii activity |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012157301A RU2012157301A (ru) | 2014-07-20 |
| RU2585231C2 true RU2585231C2 (ru) | 2016-05-27 |
Family
ID=45067214
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012157301/10A RU2585231C2 (ru) | 2010-06-04 | 2011-06-07 | Слитый белок, обладающий активностью фактора vii |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9644197B2 (ru) |
| EP (1) | EP2576625B1 (ru) |
| JP (2) | JP6143297B2 (ru) |
| KR (1) | KR101331101B1 (ru) |
| CN (2) | CN107188970A (ru) |
| AU (1) | AU2011262494B2 (ru) |
| BR (1) | BR112012030941A2 (ru) |
| CA (1) | CA2801223C (ru) |
| ES (1) | ES2676874T3 (ru) |
| MX (1) | MX348567B (ru) |
| RU (1) | RU2585231C2 (ru) |
| WO (1) | WO2011152694A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA201300066B (ru) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2576625B1 (en) | 2010-06-04 | 2018-04-25 | TiumBio Co., Ltd. | Fusion protein having factor vii activity |
| CA2813038C (en) * | 2010-09-28 | 2021-12-28 | Amylin Pharmaceuticals, Llc | Highly soluble leptins |
| US20140056870A1 (en) * | 2012-08-27 | 2014-02-27 | Allergan, Inc. | Fusion proteins |
| KR20140106448A (ko) * | 2013-02-25 | 2014-09-03 | 에스케이케미칼주식회사 | 인자 vii을 포함하는 융합 단백질의 분리 및 정제 방법 |
| KR102058864B1 (ko) | 2013-12-16 | 2019-12-24 | 주식회사 티움바이오 | 인자 vii의 융합 단백질을 포함하는 안정성이 개선된 약학적 조성물 |
| EP3351263A1 (en) | 2017-01-20 | 2018-07-25 | Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf | Pharmaceutical preparation for treating or preventing tissue adhesion |
| BR112020003403A2 (pt) | 2017-08-18 | 2020-08-25 | Neutrolis Inc. | enzimas de dnase engenheiradas e uso na terapia |
| EP3705423A4 (en) | 2017-10-30 | 2020-12-30 | Panasonic Intellectual Property Management Co., Ltd. | SHELF LABEL DETECTION DEVICE, SHELF LABEL DETECTION METHOD AND SHELF LABEL DETECTION PROGRAM |
| US10988746B2 (en) * | 2018-10-08 | 2021-04-27 | Neutrolis, Inc. | Manufacturing and engineering of DNASE enzymes for therapy |
| BR112021006737A2 (pt) | 2018-10-08 | 2021-07-13 | Neutrolis, Inc. | engenharia de enzimas dnase para fabricação e terapia |
| CN110218259B (zh) * | 2019-06-24 | 2022-09-16 | 王跃驹 | 植物生产胰高血糖素样肽-1短肽与转铁蛋白的融合蛋白制造口服降糖胶囊的应用 |
| CN110229237A (zh) * | 2019-06-24 | 2019-09-13 | 王跃驹 | 植物生产口服epo与转铁蛋白融合蛋白胶囊的应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003020746A1 (en) * | 2001-08-30 | 2003-03-13 | Biorexis Pharmaceutical Corporation | Modified transferrin fusion proteins |
| US20060130158A1 (en) * | 2002-08-30 | 2006-06-15 | Turner Andrew J | Modified transferrin fusion proteins comprising duplicate transferrin amino or carboxy terminal domains |
| RU2466141C2 (ru) * | 2006-02-06 | 2012-11-10 | Ксл Бехринг Гмбх | МОДИФИЦИРОВАННЫЙ КОАГУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР VIIa С ПРОДЛЕННЫМ ВРЕМЕНЕМ ПОЛУЖИЗНИ |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5223409A (en) * | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
| ATE428445T1 (de) | 2000-02-11 | 2009-05-15 | Bayer Healthcare Llc | Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate |
| US8129504B2 (en) | 2001-08-30 | 2012-03-06 | Biorexis Technology, Inc. | Oral delivery of modified transferrin fusion proteins |
| CN101519449A (zh) | 2001-08-30 | 2009-09-02 | 比奥雷克西斯药物公司 | 经修饰的运铁蛋白融合蛋白 |
| US7176278B2 (en) * | 2001-08-30 | 2007-02-13 | Biorexis Technology, Inc. | Modified transferrin fusion proteins |
| US7125843B2 (en) * | 2001-10-19 | 2006-10-24 | Neose Technologies, Inc. | Glycoconjugates including more than one peptide |
| RU2345789C2 (ru) | 2002-05-01 | 2009-02-10 | Шеринг Акциенгезельшафт | Новые антитела к тканевому фактору в качестве антикоагулянтов |
| US20070072271A1 (en) | 2004-01-07 | 2007-03-29 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Method for the production of recombinant proteins |
| EP2650305B1 (en) * | 2006-03-24 | 2024-05-08 | Bioverativ Therapeutics Inc. | PC5 as a factor IX propeptide processing enzyme |
| GB0614780D0 (en) * | 2006-07-25 | 2006-09-06 | Ucb Sa | Biological products |
| WO2009086132A2 (en) | 2007-12-20 | 2009-07-09 | University Of Southern California | Design of spacers to increase the expression of recombinant fusion proteins |
| EP4074327A1 (en) | 2008-06-27 | 2022-10-19 | Duke University | Therapeutic agents comprising elastin-like peptides |
| BR112012013554A2 (pt) * | 2009-12-08 | 2017-10-10 | Koninl Philips Electronics Nv | método de correção das medições de absorção do marcador para um paciente, programa de computador e sistema de correção |
| EP2576625B1 (en) | 2010-06-04 | 2018-04-25 | TiumBio Co., Ltd. | Fusion protein having factor vii activity |
-
2011
- 2011-06-07 EP EP11790052.2A patent/EP2576625B1/en active Active
- 2011-06-07 CA CA2801223A patent/CA2801223C/en active Active
- 2011-06-07 MX MX2012013807A patent/MX348567B/es active IP Right Grant
- 2011-06-07 AU AU2011262494A patent/AU2011262494B2/en active Active
- 2011-06-07 BR BR112012030941A patent/BR112012030941A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-06-07 JP JP2013513120A patent/JP6143297B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-06-07 RU RU2012157301/10A patent/RU2585231C2/ru active
- 2011-06-07 WO PCT/KR2011/004131 patent/WO2011152694A2/en active Application Filing
- 2011-06-07 CN CN201710403215.1A patent/CN107188970A/zh active Pending
- 2011-06-07 KR KR1020110054573A patent/KR101331101B1/ko active IP Right Grant
- 2011-06-07 US US13/701,333 patent/US9644197B2/en active Active
- 2011-06-07 ES ES11790052.2T patent/ES2676874T3/es active Active
- 2011-06-07 CN CN2011800277076A patent/CN103068854A/zh active Pending
-
2013
- 2013-01-03 ZA ZA2013/00066A patent/ZA201300066B/en unknown
-
2016
- 2016-03-25 US US15/080,757 patent/US10696960B2/en active Active
- 2016-07-01 JP JP2016131637A patent/JP6422918B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003020746A1 (en) * | 2001-08-30 | 2003-03-13 | Biorexis Pharmaceutical Corporation | Modified transferrin fusion proteins |
| US20060130158A1 (en) * | 2002-08-30 | 2006-06-15 | Turner Andrew J | Modified transferrin fusion proteins comprising duplicate transferrin amino or carboxy terminal domains |
| RU2466141C2 (ru) * | 2006-02-06 | 2012-11-10 | Ксл Бехринг Гмбх | МОДИФИЦИРОВАННЫЙ КОАГУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР VIIa С ПРОДЛЕННЫМ ВРЕМЕНЕМ ПОЛУЖИЗНИ |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KIM BJ et al., Transferrin fusion technology: a novel approach to prolonging biological half-life of insulinotropic peptides, J Pharmacol Exp Ther., 2010 May 24, Vol.334, No.3, pp.682-92. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US10696960B2 (en) | 2020-06-30 |
| WO2011152694A8 (en) | 2013-01-17 |
| EP2576625A4 (en) | 2013-11-06 |
| AU2011262494A2 (en) | 2013-08-01 |
| BR112012030941A2 (pt) | 2017-06-06 |
| EP2576625B1 (en) | 2018-04-25 |
| CN103068854A (zh) | 2013-04-24 |
| CA2801223A1 (en) | 2011-12-08 |
| CA2801223C (en) | 2019-12-03 |
| AU2011262494A1 (en) | 2013-01-24 |
| US20160194622A1 (en) | 2016-07-07 |
| WO2011152694A3 (en) | 2012-04-19 |
| EP2576625A2 (en) | 2013-04-10 |
| MX2012013807A (es) | 2012-12-17 |
| CN107188970A (zh) | 2017-09-22 |
| AU2011262494B2 (en) | 2016-01-21 |
| RU2012157301A (ru) | 2014-07-20 |
| ES2676874T3 (es) | 2018-07-25 |
| MX348567B (es) | 2017-06-20 |
| KR101331101B1 (ko) | 2013-11-19 |
| JP2013529914A (ja) | 2013-07-25 |
| JP2017000144A (ja) | 2017-01-05 |
| JP6422918B2 (ja) | 2018-11-14 |
| US9644197B2 (en) | 2017-05-09 |
| ZA201300066B (en) | 2014-03-26 |
| JP6143297B2 (ja) | 2017-06-07 |
| WO2011152694A2 (en) | 2011-12-08 |
| KR20110133454A (ko) | 2011-12-12 |
| US20130236945A1 (en) | 2013-09-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2585231C2 (ru) | Слитый белок, обладающий активностью фактора vii | |
| US8828939B2 (en) | Modified vitamin K dependent polypeptides | |
| CA2737094C (en) | Factor ix polypeptide mutant, its uses and a method for its production | |
| JP5823088B2 (ja) | 止血を調節する組成物および方法 | |
| US7220849B2 (en) | Enhanced gamma-carboxylation of recombinant vitamin K-dependent clotting factor | |
| AU2016248817A1 (en) | Combination therapy with coagulation factors and multispecific antibodies | |
| EA012566B1 (ru) | Химерный белок, способ его получения и способ лечения заболеваний с применением химерного белка | |
| US9617328B2 (en) | Fusion protein having factor IX activity | |
| JPH11512621A (ja) | トロンビン抑制剤の解毒薬としてのトロンビンムテイン | |
| US20160060612A1 (en) | Method of Isolating and Purifying Fusion Protein Comprising Factor VII | |
| CN110831613A (zh) | 因子ix融合蛋白及其制备和使用方法 | |
| JP2022531664A (ja) | 一本鎖第ｖｉｉｉ因子分子 | |
| CN114258405A (zh) | 用于制备因子Xa和衍生物的组合物和方法 | |
| WO2023171719A1 (ja) | 活性化プロテインｃ配列 | |
| KR20190003742A (ko) | 인자 ｘ 변이체 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20170710 |