BR112021006737A2

BR112021006737A2 - engenharia de enzimas dnase para fabricação e terapia

Info

Publication number: BR112021006737A2
Application number: BR112021006737-0A
Authority: BR
Inventors: Tobias A. Fuchs; R. Abdul Hakkim
Original assignee: Neutrolis, Inc.
Priority date: 2018-10-08
Filing date: 2019-10-08
Publication date: 2021-07-13
Also published as: KR20210072790A; WO2020076817A1; EP3864147A4; SG11202103426XA; CN112996911A; US11578314B2; IL282058A; EP3864147A1; JP2022504400A; US20220162575A1; MX2021004022A; AU2019358915A1; CA3115766A1

Abstract

ENGENHARIA DE ENZIMAS DNASE PARA FABRICAÇÃO E TERAPIA. A presente divulgação fornece proteínas DNASE extracelulares humanas engenheiradas (por exemplo, variantes de DNASE1 (D1), DNASE1-TIPO 1 (D1L1), DNASE1-TIPO 2 (D1L2), DNASE1-TIPO 3 Isoforma 1 (D1L3), DNASE1-TIPO 3 Isoforma 2 (D1L3-2), DNASE2A (D2A) e DNASE2B (D2B)) que são úteis para tratar condições caracterizadas por acumulação e/ou liberação de armadilha extracelular de neutrófilo (NET). De acordo com a invenção, a variante DNase tem vantagens para terapia e/ou fabricação em grande escala.

Description

ENGENHARIA DE ENZIMAS DNASE PARA FABRICAÇÃO E TERAPIA PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica o benefício e a prioridade dos Pedidos Provisórios U.S. 62 / 742.682 depositados em 8 de outubro de 2018; 62 / 775.563 depositado em 5 de dezembro de 2018; 62 / 779.104 depositado em 13 de dezembro de 2018; 62.808.601 depositado em 21 de fevereiro de 2019; e 62/846.904 depositado em 13 de maio de 2019, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] Esta invenção se refere ao campo das enzimas DNASE engenheiradas.

FUNDAMENTOS

[003] A inflamação é uma resposta essencial do hospedeiro para controlar micróbios invasores e curar tecidos danificados. A inflamação descontrolada e persistente causa lesão tecidual em uma infinidade de distúrbios inflamatórios. Os neutrófilos são os leucócitos predominantes na inflamação aguda. Durante as infecções, os neutrófilos geram armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), treliças de filamentos de DNA decoradas com histonas e enzimas tóxicas que imobilizam e neutralizam bactérias. No entanto, as NETs liberadas de maneira inadequada podem prejudicar as células hospedeiras devido à sua atividade citotóxica, pró-inflamatória e protrombótica.

[004] DNASE1 (D1) se forma junto com DNASE1-LIKE 1 (D1L1), DNASE1-LIKE 2 (D1L2) e DNASE1-LIKE 3 (D1L3), a família de proteínas DNASE1, um grupo de enzimas DNase secretadas homólogas. DNASE2A e DNASE2B formam um grupo adicional de enzimas DNase extracelulares homólogas. Os membros da família de proteínas DNASE1- e DNASE2- são evolutivamente conservados e expressos em várias espécies, incluindo humanos. Membros da família de proteínas DNASE1 e DNASE2 humanas recombinantes fornecem candidatos a drogas para doenças associadas a NET. Embora D1 tenha sido desenvolvido para algumas aplicações terapêuticas em pacientes, as condições para a fabricação em grande escala dos outros membros da família de proteínas DNASE1 não foram descritas. Além disso, as propriedades físicas, enzimáticas e farmacocinéticas dessas enzimas não são ideais para aplicações clínicas. Assim, há uma necessidade de definir um processo de fabricação para as enzimas D1L1, D1L2 e D1L3 e para DNases de engenharia para uso em terapia, incluindo NETs degradantes.

SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO

[005] A presente invenção fornece proteínas DNASE extracelulares humanas engenheiradas (por exemplo, variantes de DNASE1 (D1), DNASE1-TIPO 1 (D1L1), DNASE1-TIPO 2 (D1L2), DNASE1-TIPO 3 Isoforma 1 (D1L3), DNASE1-TIPO 3 Isoforma 2 (D1L3-2), DNASE2A (D2A) e DNASE2B (D2B)) que são úteis para tratar condições caracterizadas por DNA extracelular, cromatina extracelular e acumulação e/ou liberação de armadilha extracelular de neutrófilo (NET). De acordo com aspectos da invenção, as variantes de DNase aqui descritas são mais adequadas para terapia e / ou mais passíveis de fabricação em larga escala. Em algumas modalidades, as variantes de DNase aqui descritas têm benefícios para terapia médica, incluindo terapia sistêmica. Esses benefícios incluem eliminação mais lenta da droga, por exemplo, meia-vida circulatória aumentada (por exemplo, meia-vida sérica), uma duração prolongada da atividade farmacodinâmica, alta atividade degradante da cromatina e resistência à protease.

[006] Em alguns aspectos, a invenção fornece uma variante D1L3, em que a variante D1L3 tem um ou mais de estabilidade de proteína aumentada, eliminação de droga mais lenta e duração aumentada de atividade farmacodinâmica, resistência à degradação proteolítica, níveis de produção mais altos com sistemas de expressão in vitro , melhor adequação para purificação, e não substancialmente menos, a mesma ou melhor atividade de degradação da cromatina e / ou NET em comparação com a enzima D1L3 Isoforma 1 de tipo selvagem de SEQ ID NO: 4 ou enzima D1L3 Isoforma 2 de tipo selvagem de SEQ ID NO: 5

[007] Em algumas modalidades, a variante D1L3 é uma proteína de fusão que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à enzima madura definida por SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5, uma sequência de aminoácidos de albumina no N- terminus da enzima madura e, opcionalmente, uma sequência de aminoácidos de ligação entre a sequência de aminoácidos da albumina (o domínio da albumina) e a sequência de aminoácidos D1L3 (o domínio D1L3). Nessas modalidades, o D1L3 exibe eliminação mais lenta (por exemplo, meia-vida circulatória melhorada ou meia-vida sérica) e uma longa duração da atividade farmacodinâmica, incluindo para terapia sistêmica. Em algumas modalidades, a fusão da albumina com a sequência de ligação ao domínio D1L3 não afeta substancialmente a atividade de degradação da cromatina da enzima (por exemplo, medida usando um ensaio in vitro) em comparação com a enzima sem uma fusão de albumina.

[008] Nessas modalidades, o domínio D1L3 da proteína de fusão tem uma deleção de todo ou parte do domínio básico C-terminal que está presente na enzima D1L3 de tipo selvagem. A deleção ou inativação do domínio básico C-terminal melhora substancialmente a atividade de degradação da cromatina. Ou seja, a remoção do domínio básico C-terminal (BD) ativa a enzima D1L3 de tipo selvagem para degradar a cromatina.

[009] Em algumas modalidades, a variante D1L3 tem uma ou mais substituições de bloco de construção de D1. Por exemplo, a variante D1L3 pode ter a substituição de bloco de construção de Q282_S305delinsK, que inclui uma deleção do domínio básico C-terminal, cujo domínio está ausente em D1. Em algumas modalidades, a variante D1L3 tem uma substituição de aminoácido na posição correspondente à posição 101 da SEQ ID NO: 4. A substituição pode ser Arg com base no bloco de construção correspondente de D1 ou, em algumas modalidades, é Lys. As substituições nesta posição podem intensificar a atividade de degradação da cromatina de uma variante D1L3.

[0010] O ligante, quando presente, pode ser um ligante flexível, um ligante rígido ou um ligante clivável fisiologicamente, tal como um ligante clivável por protease. Por exemplo, o ligante pode ser uma sequência de aminoácidos hidrofílica e pode ser predominantemente construído a partir de aminoácidos selecionados de Gly, Ala, Ser, Thr e Pro. Em algumas modalidades, a variante é um ligante flexível que é predominantemente resíduos de glicina e serina (por exemplo, ligantes (GyS)n , onde y é de 1 a 5 e n é de 1 a 20). Em algumas modalidades, o ligante é um ligante α-helicoidal. Em algumas modalidades, o ligante tem pelo menos 15 aminoácidos ou pelo menos 25 aminoácidos. Em várias modalidades, ligantes mais longos de pelo menos 15 aminoácidos podem fornecer melhorias no rendimento após a expressão em sistemas de expressão de mamíferos e não mamíferos, tais como células CHO ou Pichia pastoris. Além disso, e surpreendentemente, sequências ligantes mais longas mostraram atividade de degradação da cromatina melhorada em um ensaio de degradação da cromatina in vitro, em comparação com sequências ligantes mais curtas.

[0011] Em várias modalidades, a variante D1L3 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 17 a 30, em cada caso tendo opcionalmente de uma a vinte modificações de aminoácidos independentemente selecionadas de inserções, deleções ou substituições. Estas sequências fornecem proteínas de fusão exemplificativas entre D1L3

(ou variantes de D1L3) com sequências de albumina, incluindo com vários projetos de ligante. Em algumas modalidades, as modificações de aminoácidos estão no domínio D1L3, no domínio da albumina ou em ambos os domínios. Em algumas modalidades, a variante tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 30. Nessas modalidades, a variante D1L3 compreende, na ordem do N-terminal ao C-terminal: uma sequência de aminoácidos de albumina, um ligante flexível intermediário ou longo e uma sequência de aminoácidos D1L3 (isto é, incluindo variantes de D1L3). SEQ ID NO: 28 compreende ainda uma fusão de albumina no C-terminal através de um ligante peptídico longo e flexível.

[0012] Em outras modalidades, o ligante é clivável por uma protease, como uma protease da via de coagulação, como o Fator XII ativado. Em certas modalidades, o ligante contém a sequência de aminoácidos do Fator XI e / ou pré-calicreína. Em outras modalidades, o ligante inclui uma sequência de peptídeo que é direcionada para clivagem por uma protease específica de neutrófilos, como elastase de neutrófilos, catepsina G ou proteinase 3.

[0013] Em alguns aspectos, a invenção fornece variantes de enzimas DNASE extracelulares engenheiradas para ter vantagens na fabricação, proporcionando a produção da enzima recombinante adequada para uso em terapia. Em várias modalidades, a invenção fornece uma variante recombinante D1, D1L1, D1L2 e D1L3 compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos em resíduos de cisteína (ou PEGuilação de resíduos Cys), resultando em reticulação intra e inter-molecular reduzida via pontes dissulfeto durante a expressão da proteína.

[0014] Em outros aspectos, a invenção fornece variantes de enzimas DNASE extracelulares engenheiradas para ter vantagens na resistência à protease, para melhorar a exposição in vivo , por exemplo, retardar a eliminação, por exemplo, prolongar a meia-vida (por exemplo, meia-vida sérica) e prolongar a duração da atividade farmacodinâmica, bem como reduzir a proteólise durante a produção de enzimas recombinantes. Esta divulgação identifica, por exemplo, resíduos D1L3 que são sensíveis à proteólise por plasmina, trombina e / ou tripsina, bem como resíduos (por exemplo, aminoácidos básicos emparelhados) que são sensíveis a proteases produzidas por linhagens de células de mamíferos e não mamíferos. A mutação engenheirada desses resíduos pode conferir essas vantagens na resistência à protease.

[0015] Em outros aspectos, a invenção fornece um método para a produção recombinante de proteínas DNASE extracelulares, incluindo variantes dos mesmos aqui descritas. Em algumas modalidades, o método emprega um sistema de expressão de não mamífero, por exemplo, um sistema de expressão eucariótico de não mamífero, como Pichia pastoris. Em algumas modalidades, a Pichia pastoris codifica a enzima DNase com seu peptídeo sinal nativo, permitindo a secreção das células hospedeiras. Em algumas modalidades, o sistema de expressão é um sistema de expressão de células de mamífero, como células de ovário de hamster chinês (CHO).

[0016] Em algumas modalidades, o sistema de expressão recombinante tem uma deleção ou inativação de uma ou mais proteases que clivam em aminoácidos básicos emparelhados. Enzimas exemplificativas incluem Furina (expressa por células CHO) e Proteinase Aspártica 3 (Ysp1) e Kexina (Kex2) expressa por Pichia pastoris. Em algumas modalidades, essas enzimas não são geneticamente deletadas ou inativadas, mas sua atividade é inibida com um inibidor de protease durante a produção de proteína recombinante.

[0017] Em algumas modalidades, o meio de crescimento para o sistema de expressão de não mamífero ou sistema de expressão de mamífero é suplementado com poliânions, tais como sulfato de dextrana, heparinas, citrato férrico e EDTA. Em outras modalidades, o meio de crescimento de Pichia pastoris ou outro sistema de expressão é suplementado com sulfato de dextrana que tem um peso molecular médio entre 5 kDa e 100 kDa. Por exemplo, o poliânion pode ser adicionado à cultura numa quantidade suficiente para complexar com a proteína recombinante produzida. Em algumas modalidades, as proteínas DNASE extracelulares recombinantes e variantes dos mesmos do meio de cultura do sistema de expressão de não mamífero ou sistema de expressão de mamífero, são purificadas através de um método que inclui a dissociação de proteínas DNASE extracelulares recombinantes e variantes de poliânions, como sulfato de dextrana, heparinas e EDTA.

[0018] Em outros aspectos, a invenção fornece polinucleotídeos isolados que codificam as variantes D1, D1L1, D1L2 ou D1L3, bem como vetores e células hospedeiras. Os polinucleotídeos podem codificar mRNA ou DNA. As células hospedeiras podem ser células de um sistema de expressão recombinante, incluindo bactérias ou eucarióticas, sejam de não mamíferos, como Pichia pastoris, ou de mamíferos, como células CHO. Em outras modalidades, a célula hospedeira pode ser distribuída para terapia DNASE. Por exemplo, a invenção em algumas modalidades fornece células hospedeiras, por exemplo, células humanas, por exemplo, glóbulos brancos, modificados para secretar uma ou mais das proteínas DNASE extracelulares aqui descritas e destinadas à administração como um agente terapêutico.

[0019] A invenção fornece ainda composições farmacêuticas compreendendo a proteína DNASE extracelular ou variante da mesma como aqui descrito, ou opcionalmente o polinucleotídeo ou o vetor como descrito, e um transportador farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser formulada para qualquer via de administração.

[0020] Em outros aspectos, a invenção fornece um método para tratar um sujeito em necessidade de degradação de DNA extracelular, degradação da cromatina extracelular, degradação da armadilha extracelular (ET) e / ou degradação da armadilha extracelular de neutrófilos (NET), por meio da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de DNASE extracelular ou variante da mesma ou composição aqui descrita.

[0021] Outros aspectos e modalidades da invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0022] FIG. 1 ilustra que as mutações Q101R e Q282_S305delinsK em SEQ ID NO: 4 aumentam a atividade para degradar a cromatina de alto peso molecular de DNASE1L3. As células CHO foram transfectadas transitoriamente com DNASE1L3 ou DNASE1L3 de tipo selvagem com substituições de blocos de construção. Os sobrenadantes das células transfectadas foram incubados com núcleos purificados (cromatina de alto peso molecular) ou tampão. O DNA foi isolado e analisado por eletroforese em gel de agarose. A figura mostra o gel de agarose corado com um corante de DNA.

[0023] FIG. 2 mostra que a caracterização de duas variantes DNASE1L3. Diferentes concentrações de sobrenadantes de células CHO que foram transfectadas com DNASE1L3 ou DNASE1L3 de tipo selvagem com uma mutação Q101R ou Q282_S305delinsK foram analisadas por Western Blot (WB) usando um anticorpo anti-DNASE1L3. Uma banda maior (variante 1) e uma menor (variante 2) foram detectadas em amostras com DNASE1L3 de tipo selvagem e o mutante Q101R. Apenas a banda menor (variante 2) foi mostrada em amostras com o mutante Q282_S305delinsK. Paralelamente, foi analisada a atividade degradante da cromatina nas diferentes concentrações de sobrenadantes. A figura mostra o DNA analisado por eletroforese em gel de agarose. Ambas, mutações Q101R ou Q282_S305delinsK, aumentaram a atividade de degradação da cromatina em comparação com DNASE1L3 de tipo selvagem.

[0024] FIG. 3 ilustra a presença de DNASE1L3 variante 1 e 2 em sobrenadantes de células CHO que foram transfectadas de forma estável com DNASE1L3 de tipo selvagem. As amostras foram analisadas por Western Blot (WB) usando um anticorpo anti-DNASE1L3. Uma banda maior (variante 1) e uma menor (variante 2) foram detectadas em 5 clones.

[0025] FIG. 4 mostra sequências de aminoácidos C-terminais de D1L3 de tipo selvagem expressa de forma recombinante em Pichia pastoris para identificar sítios de clivagem frequentes. O sequenciamento de aminoácidos de D1L3 de tipo selvagem purificado identificou três mutantes de deleção C-terminal: K291_S305del, K292_S305del e S293_S305del. O C-terminal de D1L3 de tipo selvagem não foi detectado. Em paralelo, a atividade de degradação da cromatina nas diferentes concentrações de proteína purificada foi analisada e comparada com a DNASE1 purificada (D1) e a DNASE1L3 Deletada por Domínio Básico (BDD-D1L3) com uma mutação F275Y / F279_K280delinsVM / Q282_S305delinsK. A figura mostra o DNA analisado por eletroforese em gel de agarose.

[0026] FIG. 5 mostra que a adição de sulfato de dextrana ao meio CHO melhora o rendimento da proteína. Conjuntos estáveis de células CHO que expressam D1L3 de tipo selvagem foram incubados em meio CHO padrão ou meio CHO suplementado com sulfato de dextrano. Os sobrenadantes foram analisados por Western Blot (WB) usando um anticorpo anti-DNASE1L3. A figura mostra que D1L3 expressa mal em células CHO com baixo rendimento. A adição de sulfato de dextrano aumenta o rendimento, mas não evita a fragmentação da produção.

[0027] FIG. 6 ilustra o uso de superfície de troca aniônica e superfície de troca catiônica para purificação por afinidade de D1L3 complexado com sulfato de dextrano.

[0028] FIG. 7 lista as estratégias de mutação do sítios de clivagem da tripsina para limitar a degradação de D1L3.

[0029] FIG. 8 é um alinhamento das sequências de aminoácidos D1 humana (SEQ ID NO: 1) e D1L3 humana (SEQ ID NO: 4), com os resíduos KR sensíveis à plasmina mostrados.

[0030] FIG. 9 ilustra estratégias de mutação no sítio de clivagem da plasmina para limitar a degradação de D1L3.

[0031] FIG. 10 mostra que D1L3 com sítios de clivagem de plasmina mutados retém atividade enzimática. Os sobrenadantes de células que foram transfectadas transitoriamente DNASE1L3 contendo mutações em quatro sítios de clivagem de plasmídeo putativos (K180_A181delinsGL, P198_A201delinsRPSQ, K259A, R285A) foram incubados com núcleos purificados (cromatina de alto peso molecular) ou tampão. O DNA foi isolado e analisado por eletroforese em gel de agarose. A figura mostra o gel de agarose corado com um corante de DNA.

[0032] FIG. 11 lista os sítios de clivagem da plasmina com base na digestão da plasmina e mostra estratégias de mutação para limitar a degradação de D1L3.

[0033] FIG. 12 mostra que D1L3 tem uma propensão a dobrar incorretamente quando expresso em células CHO. Painel A ilustra um vetor de expressão simples para a expressão de D1L3 usando o peptídeo sinal secretório nativo. Os sobrenadantes de conjuntos estáveis foram analisados por Western Blot usando um anticorpo anti-DNASE1L3 Painel B mostra a presença de agregados de alto peso molecular sob condições não redutoras, que são resolvidos sob condições redutoras

[0034] FIG. 13 é um alinhamento de sequências de aminoácidos D1 humana (SEQ ID NO: 1) e D1L3 humana (SEQ ID NO: 4), com resíduos de cisteína conservados e não conservados mostrados.

[0035] FIG. 14 lista os resíduos de cisteína em D1L3 e mostra estratégias de mutação para limitar os agregados de alto peso molecular durante a expressão da proteína.

[0036] FIG. 15 mostra que a mutação C68A e C194A em D1L3 não afeta a atividade de degradação da cromatina. As mutações C24A e C52A anularam a atividade de degradação da cromatina. Os sobrenadantes de células que foram transitoriamente transfectadas com variantes DNASE1L3 mutadas foram incubados com núcleos purificados ou tampão. O DNA foi isolado e analisado por eletroforese em gel de agarose. A figura mostra o gel de agarose corado com um corante de DNA.

[0037] FIG. 16A illustra a expressão de D1L3 em Pichia pastoris usando o sinal secretório nativo ou o fator de acoplamento α de Saccharomyces cerevisiae (αMF). αMF resultou em glicosilação e não processamento do peptídeo sinal (FIG. 16B).

[0038] FIG. 17A ilustra um construto de fusão com αMF, albumina de soro humano (HSA), sequência de ligante e D1L3. Este construto de fusão não é glicosilado no sistema de expressão de P. pastoris (FIG. 17B), e retém a atividade de degradação da cromatina (FIG. 17C).

[0039] FIG. 18 ilustra os níveis de expressão de construtos de fusão de albumina de soro humano (HSA) de Domínio Básico Deletado-DNASE1L3 (BDD-D1L3) ou DNASE1L3 de tipo selvagem (D1L3) em Pichia pastoris. O HSA é fundido ao N-terminal ou C de BDD-

D1L3 ou D1L3. Duas sequências de ligação, L1 e L2, foram colocadas entre HSA e BDD- D1L3 ou D1L3.

[0040] FIG. 19 ilustra os níveis de expressão de construto de fusão de albumina de soro humano (HSA) de DNASE1L3 de tipo selvagem (D1L3) em Pichia pastoris. O HSA é fundido ao N-terminal de D1L3. Três sequências ligantes diferentes (L2, L3, L4) foram colocadas entre HSA e D1L3.

[0041] FIG. 20 ilustra os níveis de expressão e a atividade de degradação da cromatina de construtos de fusão de albumina de soro humano (HSA) de Domínio Básico Deletado- DNASE1L3 (BDD-D1L3) produzidos em Pichia pastoris. O HSA é fundido ao N-terminal de BDD-D1L3. Três sequências ligantes diferentes (L5, L6, L7) foram colocadas entre HSA e D1L3.

[0042] FIG. 21A mostra que Dnase1-/-Dnase1l3-/- injetados com SED ID NO: 14 e SEQ ID NO: 19 mostram atividade semelhante de degradação da cromatina no soro. FIG. 21B mostra que a SEQ ID NO: 19 tem uma meia-vida de circulação de 3,3 dias em camundongos que expressam o receptor FcRn humano.

[0043] FIG. 22 ilustra os níveis de expressão e a atividade de degradação da cromatina de construtos de fusão de albumina de soro humano (HSA) de Domínio Básico Deletado- DNASE1L3 (BDD-D1L3) produzidos em Pichia pastoris. O HSA é fundido ao N-terminal e C-terminal de BDD-D1L3. Duas sequências de ligação diferentes (L7 e L8) foram colocadas entre HSA e BDD-D1L3.

[0044] FIG. 23 ilustra um construto de fusão com HSA e um ligante clivável pelo Fator XIIa. Um ligante contendo uma sequência do Fator XI humano (SEQ ID NO: 42) e um ligante contendo uma sequência de pré-calecreína humana (SEQ ID NO: 44) são mostrados.

[0045] FIG. 24 ilustra outros construtos que empregam ligantes cliváveis do Fator XIIa para proteínas de fusão estendida de meia-vida, incluindo para DNases extracelulares humanas, fatores de coagulação humana e fatores de complemento humano.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0046] A presente invenção fornece candidatos de proteínas DNASE extracelulares humanas engenheiradas (por exemplo, variantes de DNASE1 (D1), DNASE1-TIPO 1 (D1L1), DNASE1-TIPO 2 (D1L2), DNASE1-TIPO 3 Isoforma 1 (D1L3), DNASE1-TIPO 3 Isoforma 2 (D1L3-2), DNASE2A (D2A) e DNASE2B (D2B)) que são úteis para tratar condições caracterizadas por DNA extracelular, cromatina extracelular e acumulação e/ou liberação de armadilha extracelular de neutrófilo (NET). De acordo com aspectos da invenção, as variantes de DNase aqui descritas são mais adequadas e/ou eficazes para terapia e / ou são mais passíveis de fabricação em larga escala. Em algumas modalidades, as variantes de DNase aqui descritas têm benefícios para terapia sistêmica. Esses benefícios incluem exposição mais longa (por exemplo, eliminação mais lenta, meia-vida circulatória mais longa), duração prolongada da ação farmacodinâmica, melhora da atividade de degradação da cromatina e resistência à protease. Definições

[0047] Como utilizado neste documento e nas reivindicações, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem a referência no singular e no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, uma referência a "um agente" inclui um único agente e uma pluralidade de tais agentes.

[0048] O termo "cromatinase" refere-se a uma classe de enzima desoxirribonuclease que exibe mais do que uma capacidade insignificante de cortar, clivar ou digerir a cromatina, ou seja, DNA associado a uma ou mais proteínas histonas. DNASE1L3 humana é uma cromatinase. Geralmente, as várias variantes de DNASE1L3 aqui divulgadas são cromatinases. Nem todas as enzimas DNASE são cromatinases. Por exemplo, a DNASE1 humana essencialmente não tem capacidade para cortar, clivar ou digerir a cromatina e não é uma cromatinase.

[0049] Conforme usado neste documento com referência a uma droga, "meia-vida" refere- se à meia-vida de eliminação da concentração da droga em um animal, conforme medido em uma matriz de interesse, por exemplo, soro ou plasma. O versado compreenderá que nem todas as drogas exibem cinética de primeira ordem ou o fazem durante todas as fases de eliminação. Nesses casos, o versado compreenderá que os termos "extensão de meia-vida" ou "meia-vida estendida" são expressões que se referem a uma taxa mais lenta de eliminação.

[0050] “Isolado” significa alterado ou removido do estado natural. Por exemplo, um ácido nucleico ou um peptídeo naturalmente presente em um animal vivo não é "isolado", mas o mesmo ácido nucleico ou peptídeo parcialmente ou completamente separado dos materiais coexistentes de seu estado natural é "isolado". Um ácido nucleico ou uma proteína isolada pode existir em forma substancialmente purificada ou pode existir em um ambiente não nativo, tal como, por exemplo, uma célula hospedeira.

[0051] Como utilizado neste documento, "armadilha extracelular de neutrófilos" e o acrônimo "NET" referem-se a uma rede de fibras extracelulares compreendendo conteúdo nuclear, por exemplo, DNA ligado a proteínas histonas que são liberadas de uma célula imune, normalmente um neutrófilo, de uma forma programada.

[0052] A menos que especificado de outra forma, uma "sequência de nucleotídeo ou ácido nucleico codificando uma sequência de aminoácido" inclui todas as sequências de nucleotídeos que são versões degeneradas umas das outras e que codificam a mesma sequência de aminoácido. A frase sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ou um RNA também pode incluir íntrons na medida em que a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína pode, em alguma versão, conter um íntron(s).

[0053] Os termos “cerca de” e “aproximadamente” incluem uma quantidade que é ± 10% de um valor numérico associado.

[0054] O termo "DNASE extracelular" refere-se às proteínas DNASE extracelulares da família DNASE1 e DNASE2 (por exemplo, DNASE1 (D1), DNASE1-LIKE 1 (D1L1), DNASE1-LIKE 2 (D1L2), DNASE1-LIKE 3 Isoforma 1 ( D1L3), DNASE1-LIKE 3 Isoforma 2 (D1L3-2), DNASE2A (D2A) e DNASE2B (D2B)).

[0055] Em alguns aspectos e modalidades, a DNASE extracelular ou variante da mesma é fundida, opcionalmente por meio de um ligante interposto, a uma fração de prolongamento de meia-vida, como albumina, transferrina, um Fc ou proteína semelhante a elastina, ou uma variante da mesma. Ver, por exemplo, U.S. 9.458.218, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, a DNASE extracelular ou variante da mesma é dimerizada por uma região de dobradiça de imunoglobulina. Por exemplo, as enzimas projetadas aqui descritas também podem incluir um domínio de fusão Fc (por exemplo, domínios de dobradiça e CH2 e domínios CH3 de uma imunoglobulina). Em algumas modalidades, a DNASE (por exemplo, variante D1L3) é fundida a uma sequência de aminoácidos de albumina ou domínio, por exemplo, albumina humana ou um fragmento ou variante da mesma. Ver, por exemplo, WO 2015/066550 e U.S. 9.221.896, que são aqui incorporados por referência na sua totalidade. A albumina pode ser unida ao DNASE, opcionalmente com um ligante interposto, no N-terminal e / ou no C-terminal da DNASE extracelular engenheirada ou variante da mesma. Uma sequência de aminoácidos de albumina exemplificativa é fornecida pela SEQ ID NO: 39. Em algumas modalidades, D1L3 e D1, ou variantes como aqui descritas, são juntos dimerizados por uma região de dobradiça

Fc, criando uma molécula dimérica com propriedades funcionais sinérgicas para NETs de degradação. Em algumas modalidades, a DNASE extracelular ou variante da mesma é fundida no N-terminal a uma sequência de aminoácidos de albumina, através de um ligante peptídico. O ligante peptídico pode ser um ligante flexível, um ligante rígido ou, em algumas modalidades, um ligante clivável fisiologicamente (por exemplo, um ligante clivável por protease). Em algumas modalidades, o ligante tem 5 a 100 aminoácidos de comprimento ou 5 a 50 aminoácidos de comprimento. Em ainda outras modalidades, o ligante é uma molécula orgânica, grupo, polímero (por exemplo, PEG) ou fração química que é covalentemente acoplada à DNASE extracelular e fração de prolongamento da meia-vida (por exemplo, albumina).

[0056] Em alguns aspectos, a invenção fornece uma variante D1L3, em que a variante D1L3 tem um ou mais de estabilidade de proteína aumentada, aumento da exposição farmacocinética e duração aumentada de atividade farmacodinâmica, resistência à degradação proteolítica, níveis de produção mais altos com sistemas de expressão in vitro , melhor adequação para purificação, e não substancialmente menos, a mesma ou melhor atividade de degradação da cromatina e / ou NET em comparação com a enzima D1L3 Isoforma 1 de tipo selvagem de SEQ ID NO: 4 ou enzima D1L3 Isoforma 2 de tipo selvagem de SEQ ID NO: 5 Como utilizado neste documento, a menos que indicado em contrário, o termo "D1L3" inclui a Isoforma 1 ou a Isoforma 2.

[0057] A atividade de degradação de DNA e / ou cromatina e / ou NET de uma enzima, por exemplo, uma variante D1L3, pode ser medida in vitro, por exemplo, por incubação da enzima com DNA, cromatina ou NETs, obtida, por exemplo, a partir de núcleos purificados, DNA ou sangue ex vivo ou neutrófilos induzidos para formar NETs. Alternativamente, a atividade de degradação de DNA e / ou cromatina e / ou NET de uma enzima, por exemplo, uma variante D1L3, pode ser medida in vivo, por exemplo, administrando a enzima a um sujeito, em que o sujeito produz ou é induzido a produzir DNA extracelular, cromatina ou NETs, e medir o efeito da enzima nas concentrações de DNA, cromatina ou níveis de NET em uma matriz, por exemplo, soro, de preferência com um controle negativo paralelo, ou comparando temporalmente as concentrações antes e após a administração da enzima.

[0058] Em algumas modalidades, a variante D1L3 tem aproximadamente a mesma atividade de degradação da cromatina e / ou NET em comparação com a enzima D1L3 Isoforma 1 de tipo selvagem de SEQ ID NO: 4 ou enzima D1L3 Isoforma 2 de tipo selvagem de SEQ ID

NO: 5. Em algumas modalidades, a variante D1L3 tem maior atividade de degradação da cromatina e / ou NET em comparação com a enzima D1L3 Isoforma 1 de tipo selvagem de SEQ ID NO: 4 ou enzima D1L3 Isoforma 2 de tipo selvagem de SEQ ID NO: 5.

[0059] Em algumas modalidades, a variante D1L3 é uma proteína de fusão compreendendo um domínio de albumina, um ligante opcional e um domínio D1L3. Em algumas modalidades, o domínio de albumina e o ligante opcional estão localizados no lado N- terminal do domínio D1L3. Em algumas modalidades, o domínio de albumina e o ligante opcional estão localizados no lado C-terminal do domínio D1L3. Em todas essas modalidades, o ligante opcional é interposto entre o domínio de albumina e o domínio D1L3.

[0060] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de albumina ou domínio da proteína de fusão é pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de albumina de referência definida pela SEQ ID NO: 39. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de albumina ou domínio compreende ou consiste na sequência de albumina de referência definida por SEQ ID NO: 39. Em várias modalidades, a sequência de aminoácidos da albumina se liga ao receptor Fc neonatal (FcRn), por exemplo, FcRn humano. A sequência de aminoácidos da albumina pode ser uma variante de HSA de tipo selvagem (por exemplo, como representado por SEQ ID NO: 39). Em várias modalidades, as variantes de albumina podem ter de uma a vinte, ou de uma a dez modificações de aminoácidos independentemente selecionadas de deleções, substituições e inserções em relação à SEQ ID NO: 39. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de albumina é qualquer sequência de aminoácidos de albumina de mamífero.

[0061] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de albumina ou domínio é um fragmento de albumina de comprimento total, conforme representado por SEQ ID NO: 39. O termo "fragmento", quando usado no contexto de albumina, refere-se a qualquer fragmento de albumina de comprimento total ou uma variante do mesmo (como descrito acima) que estende a meia-vida de uma enzima DNASE à qual está fundida ou conjugada, em relação ao DNASE não fundido correspondente. Em algumas modalidades, um fragmento de uma albumina pode se referir a uma sequência de aminoácidos que compreende uma fusão de múltiplos domínios de albumina (ver, por exemplo, WO2011 / 124718), como domínios I e III e domínios II e III. Geralmente, um fragmento de albumina tem pelo menos cerca de 100 aminoácidos ou pelo menos cerca de 200 ou pelo menos cerca de 300 aminoácidos da sequência de comprimento total. Em várias modalidades, o fragmento de albumina mantém a capacidade de se ligar ao FcRn humano.

[0062] Em algumas modalidades, o domínio semelhante a D1L3 da proteína de fusão é pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de referência da enzima D1L3 madura definida por SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o domínio D1L3 compreende ou consiste na sequência de referência definida pela SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, a sequência de referência não inclui o domínio básico C-terminal de SEQ ID NO: 4 ou 5 definido pelos 23 aminoácidos C-terminal.

[0063] Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende um domínio D1L3, em que a sequência de aminoácidos do domínio D1L3 é pelo menos cerca de 80% idêntica à enzima madura definida por SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5. A proteína de fusão pode compreender ainda a sequência ou domínio de aminoácidos da albumina no N-terminal da enzima madura e uma sequência de aminoácidos de ligação entre a sequência de aminoácidos da albumina e a sequência de aminoácidos da enzima madura. Em algumas modalidades, o domínio D1L3 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90% idêntica à sequência de referência da enzima madura definida por SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, a sequência de referência não inclui o domínio básico C-terminal de SEQ ID NO: 4 ou 5 definido pelos 23 aminoácidos C-terminal. A proteína de fusão que compreende o domínio D1L3 exibe meia-vida circulatória melhorada e duração do efeito farmacodinâmico, incluindo para terapia sistêmica. Além disso, a fusão de albumina com a sequência de ligação não afeta substancialmente (ou em algumas modalidades não tem nenhum impacto negativo sobre) a atividade de degradação da cromatina, conforme determinado usando um ensaio de degradação da cromatina in vitro, em comparação com a variante sem uma fusão de albumina.

[0064] Quando se refere à identidade de sequência com enzimas DNase do tipo selvagem e, salvo indicação em contrário, sequências referem-se a enzimas maduras sem o peptídeo sinal. Além disso, salvo indicação em contrário, as posições dos aminoácidos são numeradas em relação à sequência completa da DNase traduzida, incluindo o peptídeo sinal, para maior clareza. Desta forma, por exemplo, a referência à identidade de sequência com a enzima da SEQ ID NO: 4 (D1L3 humana, Isoforma 1) refere-se a uma porcentagem de identidade com a enzima madura que tem M21 no N-terminal. Do mesmo modo, a referência à identidade de sequência com a enzima da SEQ ID NO: 1 (D1 humano) refere-se a uma identidade percentual com a enzima madura tendo L23 no N-terminal.

[0065] Em algumas modalidades, D1L3 tem uma exclusão de todo ou parte do domínio básico do C-terminal. O domínio básico C-terminal é definido como os 23 aminoácidos C- terminais de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5. A deleção ou inativação do domínio básico C-terminal de D1L3 melhora substancialmente a atividade de degradação da cromatina. Ver FIGS. 1, 2, e 4. Em algumas modalidades, a variante D1L3 tem uma deleção de aminoácidos do domínio básico C-terminal, como pelo menos 5 aminoácidos, ou em algumas modalidades, pelo menos 10 aminoácidos, ou em algumas modalidades, pelo menos 15 aminoácidos, ou em alguns modalidades com pelo menos 20 aminoácidos do domínio básico C-terminal. Em algumas modalidades, a variante D1L3 tem uma deleção de todo o domínio básico do C-terminal definido pelos 23 aminoácidos do C-terminal da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5. Deleções BD exemplificativas incluem Q282_S305delinsK (ver SEQ ID NO: 9), S305delinsK (ver SEQ ID NO: 10), K292_S305del (ver SEQ ID NO: 11) e S293_S305del (ver SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, o C-terminal do domínio D1L3 (tendo uma deleção BD) tem de 1 a 10 ou de 1 a 5 aminoácidos no C-terminal que não se alinham com o BD- C-terminal, e que não impactam negativamente a atividade de degradação da cromatina em um ensaio in vitro.

[0066] Em algumas modalidades, a variante D1L3 é uma proteína de fusão engenheirada que compreende: um domínio DNASE1L3 de uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 8 a SEQ ID NO: 16; um ligante de uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 31 a SEQ ID NO: 38; e um domínio de albumina possuindo a sequência de SEQ ID NO: 39 ou uma variante ou fragmento conforme descrito. Em algumas modalidades, a variante D1L3 tem uma ou mais substituições de bloco de construção de D1, que são descritas em PCT / US2018 / 04708, que é aqui incorporado por referência.

[0067] Em algumas modalidades, a sequência ou domínio D1L3 contém uma substituição de bloco de construção de D1, que pode ser selecionada a partir de um ou mais de: M21_R22delinsLK, C24_S25delinsAA, V28_S30delinsIQT, S34T, Q36_V44delinsMSNATLVSY, K47_K50delinsQILS, C52Y, I55_M58delinsIALVQE, I60_K61delinsVR, N64_I70delinsHLTAVGK, M72_K74delinsLDN, R77_I83delinsQDAPD, N86H, I89V, S91_R92delinsEP, T97S, Q101R, A103L, L105V,

K107_L110delinsRPDQ, V113_R115delinsAVD, H118Y, H120D, Y122_A127delinsGCEPCGN, V129T, S131N, F135_V136delinsAI, W138R, Q140_H143delinFSRF, A145_D148delinsEVRE, V150A, I152V, T156_T157delinsAA, E159_S161delinsGDA, K163A, E167A, V169_E170delinsYD, T173L, K176_R178delinsQEK, K180_A181delinsGL, N183_F186delinsDVML, P198_A201delinsRPSQ, K203_N204delinsSS, R208W, D210S, R212T, V214Q, G218P, Q220_E221delinsSA, V225_S228delinsATP, N230H, L238_R239delinsVA, Q241_S246delinsMLLRGA, K250D, N252_V254delinsALP, D256N, K259A, K262G, T264_E267delinsSDQL, L269_V271delinsQAI, F275Y, F279_K280delinsVM, Q282_S205delinsK, em que cada uma das substituições anteriores é numerada em relação a SEQ ID NO: 4.

[0068] Por exemplo, a variante D1L3 pode ter a substituição de bloco de construção de D1 de Q282_S305delinsK, que inclui uma deleção do domínio básico C-terminal, que está ausente em D1. Em algumas modalidades, a enzima D1L3 tem uma substituição de aminoácido na posição correspondente à posição 101 da SEQ ID NO: 4. A substituição pode ser Arg com base no bloco de construção correspondente de D1 ou, em algumas modalidades, é Lys. As substituições nesta posição podem intensificar a atividade de degradação da cromatina de D1L3. Outras substituições nesta posição provavelmente mostrarão propriedades semelhantes.

[0069] Os ligantes, quando presentes, podem ser selecionados de ligantes peptídicos flexíveis, rígidos e cliváveis. Os ligantes flexíveis são predominantemente ou inteiramente compostos por pequenos resíduos não polares ou polares, como Gly, Ser e Thr. Um ligante flexível exemplificativo compreende ligantes (GlyySer)n , onde y é de 1 a 10 (por exemplo, de 1 a 5) e n é de 1 a cerca de 10 e, em algumas modalidades, é de 3 a cerca de 6. Em modalidades exemplificativas, y é de 2 a 4 e n é de 3 a 8. Devido à sua flexibilidade, esses ligantes não são estruturados. Ligantes mais rígidos incluem motivos poliprolina ou poli Pro- Ala e ligantes α-helicoidais. Um ligante α-helicoidal exemplificativo é A(EAAAK)nA, onde n é como definido acima (por exemplo, de 1 a 10, ou 2 a 6). Geralmente, os ligantes podem ser predominantemente compostos de aminoácidos selecionados de Gly, Ser, Thr, Ala e Pro. Sequências ligantes exemplificativas contêm pelo menos 10 aminoácidos e podem estar na faixa de 15 a 35 aminoácidos. Projetos de ligante exemplificativos são fornecidos como SEQ ID NOS: 31 a 38.

[0070] Em algumas modalidades, a variante compreende um ligante, em que a sequência de aminoácidos do ligante é predominantemente glicina e resíduos de serina ou consiste essencialmente em resíduos de glicina e serina. Em algumas modalidades, a razão de Ser e Gly no ligante é, respectivamente, de cerca de 1:1 a cerca de 1:10, de cerca de 1:2 a cerca de 1:6 ou cerca de 1:4. Sequências ligantes exemplificativas compreendem S(GGS)4GSS (SEQ ID NO: 36), S(GGS)9GS (SEQ ID NO: 37), (GGS)9GS (SEQ ID NO: 39). Em algumas modalidades, o ligante tem pelo menos 10 aminoácidos, ou pelo menos 15 aminoácidos, ou pelo menos 20 aminoácidos, ou pelo menos 25 aminoácidos. Por exemplo, o ligante pode ter um comprimento de 15 a 30 aminoácidos. Em várias modalidades, ligantes mais longos de pelo menos 15 aminoácidos podem fornecer melhorias no rendimento após a expressão em Pichia pastoris. Veja a FIG. 20. Além disso, e surpreendentemente, sequências ligantes mais longas mostraram atividade de degradação da cromatina melhorada, em comparação com sequências ligantes mais curtas. Veja a FIG. 20.

[0071] Em várias modalidades, a variante D1L3 é uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 17 a 30. Em outras modalidades, a variante D1L3 é uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 17 a 30 e tendo de uma a vinte ou de um a dez, ou de uma a cinco modificações de aminoácidos independentemente selecionadas de inserções, deleções ou substituições de aminoácidos em relação à sequência de referência selecionada de SEQ ID NOS: 17 a 30. Em algumas modalidades, as modificações de aminoácidos estão no domínio D1L3, no domínio da albumina ou em ambos os domínios da proteína de fusão. Em algumas modalidades, a variante tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 30. Nessas modalidades, a sequência de aminoácidos da albumina é fundida no N-terminal ou no lado do N-terminal de D1L3 (ou variante) através de um ligante flexível intermediário ou longo.

[0072] Em outras modalidades, o ligante é um ligante clivável fisiologicamente, como um ligante clivável por protease. Por exemplo, a protease pode ser uma protease da via de coagulação, como o Fator XII ativado. Em certas modalidades, o ligante compreende a sequência de aminoácidos do Fator XI (SEQ ID NO: 42) e / ou pré-calicreína (SEQ ID NO: 44 ou 45) ou um fragmento fisiologicamente clivável do mesmo. Em modalidades selecionadas, a sequência de aminoácidos do ligante do Fator XI contém a totalidade ou partes da SEQ ID NO: 42 (por exemplo, partes da SEQ ID NO: 42, incluindo modificações da SEQ ID NO: 42 que permitem a clivagem pelo Fator XIIa). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos ligante da pré-calicreína contém toda ou partes da SEQ ID NO: 44 (por exemplo, partes da SEQ ID NO: 44, incluindo modificações da SEQ ID NO: 44 que permitem a clivagem pelo Fator XIIa). Em outras modalidades, o ligante inclui uma sequência de peptídeo que é direcionada para clivagem por uma protease específica de neutrófilos, como elastase de neutrófilos, catepsina G e proteinase 3.

[0073] Algumas modalidades exemplificativas de proteínas de fusão D1L3 compreendem uma combinação de três sequências de aminoácidos que podem ser independentemente selecionadas das sequências divulgadas neste documento, e tais sequências organizadas em ordem do N-terminal ao C-terminal: Fusão 1: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39; Fusão 2: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39; Fusão 3: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39; Fusão 4: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39; Fusão 5: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39; Fusão 6: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39; Fusão 7: SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39; Fusão 8: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39; Fusão 9: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39; Fusão 10: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39; Fusão 11: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39; Fusão 12: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39; Fusão 13: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39; Fusão 14: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39; Fusão 15: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39; Fusão 16: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39; Fusão 17: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39; Fusão 18: SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39; Fusão 19: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39; Fusão 20: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39; Fusão 21: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39;

Fusão 22: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39; Fusão 23: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39; Fusão 24: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39; Fusão 25: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39; Fusão 26: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39; Fusão 27: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39; Fusão 28: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39; Fusão 29: SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39; Fusão 30: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39; Fusão 31: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39; Fusão 32: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39; Fusão 33: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39; Fusão 34: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39; Fusão 35: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39; Fusão 36: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39; Fusão 37: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39; Fusão 38: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39; Fusão 39: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39; Fusão 40: SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39; Fusão 41: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39; Fusão 42: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39; Fusão 43: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39; Fusão 44: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39; Fusão 45: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; Fusão 46: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; Fusão 47: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; Fusão 48: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; Fusão 49: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; Fusão 50: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; Fusão 51: SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; Fusão 52: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; Fusão 53: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39;

Fusão 54: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; Fusão 55: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; Fusão 56: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; Fusão 57: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; Fusão 58: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; Fusão 59: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; Fusão 60: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; Fusão 61: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; Fusão 62: SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; Fusão 63: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; Fusão 64: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; Fusão 65: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; Fusão 66: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; Fusão 67: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; Fusão 68: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; Fusão 69: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; Fusão 70: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; Fusão 71: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; Fusão 72: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; Fusão 73: SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; Fusão 74: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; Fusão 75: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; Fusão 76: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; Fusão 77: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; Fusão 78: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; Fusão 79: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; Fusão 80: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; Fusão 81: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; Fusão 82: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; Fusão 83: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; Fusão 84: SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; Fusão 85: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39;

Fusão 86: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; Fusão 87: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; Fusão 88: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; Fusão 89: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; Fusão 90: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; Fusão 91: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; Fusão 92: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; Fusão 93: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; Fusão 94: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; Fusão 95: SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; Fusão 96: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; Fusão 97: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; Fusão 98: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; Fusão 99: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39 Fusão 100: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39; Fusão 101: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39; Fusão 102: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39; Fusão 103: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39; Fusão 104: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39; Fusão 105: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39; Fusão 106: SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39; Fusão 107: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39; Fusão 108: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39; Fusão 109: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39; Fusão 110: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39; Fusão 111: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39; Fusão 112: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39; Fusão 113: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39; Fusão 114: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39; Fusão 115: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39; Fusão 116: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39; Fusão 117: SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39;

Fusão 118: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39; Fusão 119: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39; Fusão 120: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39; Fusão 121: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39; Fusão 122: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39; Fusão 123: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39; Fusão 124: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39; Fusão 125: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39; Fusão 126: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39; Fusão 127: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39; Fusão 128: SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39; Fusão 129: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39; Fusão 130: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39; Fusão 131: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39; Fusão 132: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39;

[0074] Em algumas modalidades, a proteína de fusão é sintetizada com um peptídeo sinal. O peptídeo sinal pode ser removido durante a secreção da célula hospedeira. Peptídeos de sinal exemplificativos são mostrados SEQ ID NOS: 4 a 16 e SEQ ID NOS: 44 a 46. Em algumas modalidades, a proteína de fusão é a proteína madura, isto é, sem um peptídeo sinal.

[0075] Em várias modalidades, a proteína de fusão é selecionada de proteínas de fusão 1 a 132 e a proteína de fusão selecionada pode opcionalmente ter até 20 (ou até 10) modificações de aminoácidos independentemente selecionadas de deleções, inserções e substituições de aminoácidos.

[0076] Em alguns aspectos, a invenção fornece variantes de enzimas DNASE extracelulares projetadas para ter vantagens na fabricação, proporcionando a produção da enzima recombinante adequada para uso em terapia e que pode ser opcionalmente usada em conexão com modalidades de proteína de fusão (incluindo modalidades de fusão de albumina) conforme já descrito. Em várias modalidades, a invenção fornece uma variante recombinante D1, D1L1, D1L2 e D1L3 compreendendo uma ou mais substituições ou deleções de aminoácidos de resíduos de cisteína, resultando em reticulação intra e intermolecular reduzida via pontes dissulfeto durante a expressão da proteína. Por exemplo, a variante de DNase pode não ter um, dois ou três resíduos de cisteína presentes na sequência de tipo selvagem (por exemplo, um, dois ou três resíduos de cisteína são deletados), ou tem um ou mais desses resíduos de cisteína substituídos com outro(s) aminoácido(s). Em algumas modalidades, um ou mais resíduos de cisteína são substituídos por um aminoácido selecionado independentemente de Ala, Gly e Ser, ou um ou mais dos resíduos de cisteína são substituídos como parte de uma substituição de bloco de construção. Em algumas modalidades, um ou mais resíduos de cisteína que são substituídos são / não são conservados entre outros membros da família de proteínas D1 (por exemplo, D1, D1L1, D1L2 e D1L3). Em algumas modalidades, a enzima projetada compreende ou compreende ainda pelo menos uma substituição de bloco de construção de outro membro da família de proteínas D1 e / ou outra mutação pontual que resulta em estabilidade de proteína aumentada, resistência aumentada à degradação por proteases, biodisponibilidade aumentada e substancialmente o mesmo ou melhor DNA e / ou cromatina e / ou atividade de degradação de NET (in vitro ou in vivo) em comparação com a enzima de tipo selvagem. Em algumas modalidades, as substituições e / ou modificações incluem, entre outras modificações, apenas uma única modificação nos resíduos de cisteína. Em algumas modalidades, a remoção de um único resíduo de cisteína é suficiente para vantagens significativas na fabricação.

[0077] Em outros aspectos, a invenção fornece variantes de enzimas DNASE extracelulares engenheiradas para ter vantagens na resistência à protease, para melhorar a meia-vida in vivo , bem como reduzir a proteólise durante a produção de enzima recombinante. Esta divulgação identifica, por exemplo, resíduos D1L3 que são sensíveis à proteólise por plasmina, trombina e / ou tripsina, bem como resíduos (por exemplo, aminoácidos básicos emparelhados) que são sensíveis a proteases produzidas por linhagens de células de mamíferos e não mamíferos.

[0078] As variantes de DNASE extracelulares recombinantes aqui descritas podem ter uma combinação de mutações pontuais incluindo substituições em resíduos de cisteína, substituições em resíduos sensíveis à protease e / ou podem compreender uma ou mais substituições de bloco. A Engenharia de Proteína de bloco de Construção (BBPE) é descrita em PCT / US18 / 47084 e US 62 / 800.790, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência. A BBPE envolve o fornecimento de um alinhamento proteína-proteína da enzima DNASE extracelular do doador e do receptor e a identificação de sequências de aminoácidos variáveis para transferência ("bloco de construção"). Os aminoácidos variáveis são flanqueados por um ou mais aminoácidos conservados nas enzimas DNASE extracelulares doador e receptor (a montante e a jusante do bloco de construção). Esses blocos de construção podem ser trocados entre as proteínas do receptor e do doador, para produzir uma enzima quimérica.

[0079] Em outros aspectos, a invenção fornece um método para a produção recombinante de proteínas DNASE extracelulares, incluindo variantes dos mesmos aqui descritas. Em algumas modalidades, o método emprega um sistema de expressão de não mamífero, como Pichia pastoris. Em algumas modalidades, a Pichia pastoris codifica a enzima DNase com o peptídeo sinal nativo, permitindo a secreção das células hospedeiras. Em algumas modalidades, o sistema de expressão é um sistema de expressão de células de mamífero, como células de ovário de hamster chinês (CHO). Em algumas modalidades, ao remover resíduos de cisteína que são desnecessários para a atividade, a invenção evita ligações dissulfeto intermoleculares e intramoleculares que de outra forma formam e impedem a produção recombinante. Em algumas modalidades, reduções substanciais em ligações dissulfeto intramoleculares e intramoleculares errôneas podem ser alcançadas com a substituição de um único resíduo de cisteína.

[0080] Em algumas modalidades, o sistema de expressão recombinante tem uma deleção ou inativação de uma ou mais proteases que clivam em aminoácidos básicos emparelhados. Enzimas exemplificativas incluem Furina (expressa por células CHO) e Proteinase Aspártica 3 (Ysp1) e Kexina (Kex2) expressa por Pichia pastoris. Em algumas modalidades, essas enzimas não são geneticamente deletadas ou inativadas, mas sua atividade é inibida com um inibidor de protease durante a produção de proteína recombinante.

[0081] Em algumas modalidades, o meio de crescimento para o sistema de expressão de não mamífero ou sistema de expressão de mamífero é suplementado com poliânions, tais como sulfato de dextrana, heparinas, citrato férrico e EDTA. Em outras modalidades, o meio de crescimento de Pichia pastoris ou outro sistema de expressão é suplementado com sulfato de dextrana que tem um peso molecular médio entre 5 kDa e 100 kDa. Em algumas modalidades, o sulfato de dextrano tem um peso molecular médio que é cerca de 10 kDa ou menos, ou cerca de 20 kDa ou menos, ou cerca de 30 kDa ou menos, ou cerca de 40 kDa ou menos, ou cerca de 50 kDa ou menos, ou cerca de 75 kDa ou menos, ou cerca de 100 kDa ou menos. Em várias modalidades, o poliânion é adicionado à cultura em uma quantidade suficiente para complexar com a proteína recombinante produzida.

[0082] Em algumas modalidades, as proteínas DNASE extracelulares recombinantes e variantes dos mesmos do meio de cultura do sistema de expressão de não mamífero ou sistema de expressão de mamífero, são purificadas através de um método que inclui a dissociação de proteínas DNASE extracelulares recombinantes e variantes de poliânions, como sulfato de dextrana, heparinas, EDTA. Em certas modalidades, o método de purificação inclui resinas de troca aniônica fortes, como trietilaminoetil. Em algumas modalidades, a proteína DNASE extracelular produzida de acordo com o método é D1L3 ou uma variante da mesma.

[0083] Consequentemente, em algumas modalidades, a invenção fornece uma variante D1L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à enzima definida por SEQ ID NO: 4 (D1L3 humano, Isoforma 1) ou SEQ ID NO: 5 (D1L3 humano, Isoforma 2), e tendo uma ou mais substituições de resíduos de cisteína e / ou uma ou mais substituições de aminoácidos que são sensíveis à proteólise, por exemplo, proteólise in vivo. Em algumas modalidades, a variante da proteína D1L3 compreende uma ou mais modificações adicionais que resultam em maior estabilidade da proteína (por exemplo, resistência à protease), níveis de produção mais elevados com sistemas de expressão in vitro e / ou não substancialmente menos, o mesmo ou melhor DNA e / ou atividade de degradação da cromatina e / ou NET em comparação com a proteína D1L3 de tipo selvagem de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5. Por exemplo, a variante D1L3 pode compreender pelo menos uma substituição de bloco de construção adicional ou mutação pontual divulgada em PCT / US2018 / 47084 (que é aqui incorporada por referência em sua totalidade), ou pode incluir uma ou mais substituições aqui descritas para aumentar a resistência à protease.

[0084] Em algumas modalidades, a variante D1L3 tem uma substituição de Cys 68, que é opcionalmente substituída por um aminoácido selecionado de Ala, Ser e Gly. Em algumas modalidades, a variante compreende a substituição N64_I70delinsHLTAVGK. Em algumas modalidades, a sequência HLTAVGK pode ser ainda modificada por uma, duas ou três substituições, deleções e / ou inserções (coletivamente), com a condição de que um resíduo Cys não seja incluído. Em algumas modalidades, a variante D1L3 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 98% de identidade com a referência SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO 5.

[0085] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma enzima D1L3 com uma fração de polietileno glicol (PEG) conjugada na posição correspondente a Cys 68, que se acredita ser uma cisteína não pareada. Em algumas modalidades, a variante D1L3 tem uma conjugação de PEG com o aminoácido correspondente a C194. Nessas modalidades, a fração de PEG fornecerá uma propriedade de extensão de meia-vida, evitando embaralhamento de dissulfeto e / ou dobramento incorreto da proteína. Em algumas modalidades, a porção PEG é conjugada por meio da química da maleimida, que pode ser conduzida em condições suaves. Outras químicas de conjugação são conhecidas e podem ser utilizadas, como as químicas de ativação de vinil sulfona, ditiopiridina e iodoacetamida. A fração PEG pode ser linear ou ramificada e pode estar geralmente na faixa de 10 kDa a 40 kDa, ou na faixa de 20 a 30 kDa.

[0086] Alternativamente, ou adicionalmente, a invenção fornece uma variante D1L3 compreendendo um ou mais resíduos de arginina e / ou lisina substituídos, resultando em resistência à protease aumentada. Em algumas modalidades, a variante D1L3 tem uma substituição em uma ou mais posições correspondentes a K180, K200, K259 e / ou R285 de SEQ ID NO: 4. De acordo com esta divulgação, tais resíduos de lisina e arginina são identificados como potenciais sítios sensíveis à protease. Assim, um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) desses resíduos podem ser modificados com um resíduo não carregado, como um resíduo selecionado independentemente de Ala, Gly, Leu, Ile, Val, Thr, Ser e Pro. Em algumas modalidades, resíduos de lisina ou arginina sensíveis à protease são substituídos como parte de uma substituição de bloco de construção. Por exemplo, a variante D1L3 pode compreender uma ou mais substituições selecionadas de: K180_A181delinsGL, P198_A201delinsRPSQ e K259A. Em algumas modalidades, a variante D1L3 compreende uma ou ambas as substituições: K180_A181delinsGL e / ou P198_A201delinsRPSQ, qualquer um dos quais é opcionalmente modificado por uma ou duas substituições, deleções ou inserções de aminoácidos, com a condição de que a substituição de bloco de construção não seja modificada por substituição ou inserção com um resíduo R ou K. Em algumas modalidades, a variante D1L3 aumentou a resistência à proteólise por uma ou mais proteases selecionadas de plasmina, trombina e / ou tripsina.

[0087] Alternativamente ou além disso, a variante D1L3 compreende uma ou mais mutações de um resíduo básico emparelhado. Em algumas modalidades, o resíduo básico emparelhado corresponde a uma posição selecionada de K50 / R51, R80 / R81, K114 / R115, K199 /

K200, K226 / K227, K291 / K292, R297 / K298 / K299 e K303 / R304 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, a variante D1L3 tem uma ou mais substituições selecionadas de uma substituição correspondente a R114T, R114A, R114D, R114Q, K227S e K227E de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, uma ou mais mutações de um resíduo básico emparelhado incluem uma substituição de aminoácido correspondente a R51K, R81K, R115K e R304K. Em algumas modalidades, o resíduo básico emparelhado é substituído usando uma substituição de bloco de construção correspondente. De acordo com essas modalidades, a variante D1L3 será mais resistente a proteases expressas pelo sistema de expressão de proteína recombinante (por exemplo, CHO e Pichia pastoris).

[0088] Em alguns aspectos, a invenção fornece uma variante de DNase 1 (D1) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à enzima definida por SEQ ID NO: 1, com uma ou mais substituições de resíduos de cisteína. Em algumas modalidades, a variante da proteína D1 tem uma ou mais modificações adicionais, resultando em maior estabilidade da proteína, níveis de produção mais elevados com sistemas de expressão in vitro e / ou não substancialmente menos, o mesmo ou melhor DNA e / ou cromatina e / ou NET atividade de degradação de NET em comparação com a proteína D1 de tipo selvagem de SEQ ID NO: 1. Por exemplo, a variante D1 pode compreender pelo menos uma substituição de bloco de construção adicional ou mutação pontual divulgada em PCT / US2018 / 47084, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0089] Em algumas modalidades, a variante D1 tem uma substituição de um ou ambos C123 e C126, e que é / são opcionalmente substituídos por Ala, Ser e Gly. Em algumas modalidades, a variante D1 compreende a substituição G122_N128delinsYQGDA. Em algumas modalidades, a variante D1 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 1.

[0090] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma enzima D1 com uma fração de PEG conjugada na posição correspondente a C123 e / ou C126. Nessas modalidades, a fração de PEG fornecerá uma propriedade de extensão de meia-vida, evitando embaralhamento de dissulfeto e / ou dobramento incorreto da proteína. Em algumas modalidades, a porção PEG é conjugada por meio da química da maleimida, que pode ser conduzida em condições suaves. Outras químicas de conjugação são conhecidas e podem ser utilizadas, como as químicas de ativação de vinil sulfona, ditiopiridina e iodoacetamida. A fração PEG pode ser linear ou ramificada e pode estar geralmente na faixa de 10 kDa a 40 kDa, ou na faixa de 20 a 30 kDa.

[0091] Em outros aspectos, a invenção fornece uma variante D1L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à enzima definida por SEQ ID NO: 2, com um ou mais resíduos de cisteína substituídos. O(s) resíduo(s) de cisteína são opcionalmente não conservados dentro da família D1 (por exemplo, C22 e / ou C50) e são opcionalmente substituídos por Gly, Arg ou Ser, ou são substituídos como parte de uma substituição de bloco de construção. Em algumas modalidades, a variante D1L1 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 2.

[0092] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma enzima D1L1 com uma fração de PEG conjugada na posição correspondente a C22 e/ou C50. Nessas modalidades, a fração de PEG fornecerá uma propriedade de extensão de meia-vida, evitando embaralhamento de dissulfeto e / ou dobramento incorreto da proteína. Em algumas modalidades, a porção PEG é conjugada por meio da química da maleimida, que pode ser conduzida em condições suaves. Outras químicas de conjugação são conhecidas e podem ser utilizadas, como as químicas de ativação de vinil sulfona, ditiopiridina e iodoacetamida. A fração PEG pode ser linear ou ramificada e pode estar geralmente na faixa de 10 kDa a 40 kDa, ou na faixa de 20 a 30 kDa.

[0093] Em alguns aspectos, a invenção fornece uma variante D1L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à enzima definida por SEQ ID NO: 3, com um ou mais resíduos de cisteína substituídos. Os resíduos de cisteína podem ser não conservados dentro da família D1 (por exemplo, C43) e é / são opcionalmente substituídos por Gly, Arg ou Ser, ou são substituídos como parte de uma substituição de bloco de construção. Em algumas modalidades, a variante D1L2 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 3.

[0094] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma enzima D1L2 com uma fração de PEG conjugada na posição correspondente a C43. Nessas modalidades, a fração de PEG fornecerá uma propriedade de extensão de meia-vida, evitando embaralhamento de dissulfeto e / ou dobramento incorreto da proteína. Em algumas modalidades, a porção PEG é conjugada por meio da química da maleimida, que pode ser conduzida em condições suaves. Outras químicas de conjugação são conhecidas e podem ser utilizadas, como as químicas de ativação de vinil sulfona, ditiopiridina e iodoacetamida. A fração PEG pode ser linear ou ramificada e pode estar geralmente na faixa de 10 kDa a 40 kDa, ou na faixa de 20 a 30 kDa.

[0095] Em outros aspectos, a invenção fornece polinucleotídeos isolados que codificam as variantes D1, D1L1, D1L2 ou D1L3 divulgados aqui, bem como vetores e células hospedeiras. As células hospedeiras podem ser células de qualquer sistema de expressão, incluindo bactérias ou eucarióticas, sejam de não mamíferos, como Pichia pastoris, ou de mamíferos, como células CHO.

[0096] Em algumas modalidades, a distribuição de polinucleotídeos é usada para terapia. Os polinucleotídeos de codificação podem ser distribuídos como mRNA ou como construtos de DNA usando procedimentos conhecidos, por exemplo, eletroporação ou compressão de células e / ou vetores (incluindo vetores virais). Os polinucleotídeos de mRNA podem incluir modificações conhecidas (mmRNA) para evitar a ativação do sistema imunológico inato. Ver WO 2014/028429, que é incorporado por meio deste por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é distribuído ao corpo de um sujeito. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são distribuídos a uma célula in vitro, e a célula é distribuída ao corpo de um sujeito. A célula pode ser, por exemplo, um glóbulo branco (por exemplo, uma célula T ou macrófago), uma célula endotelial, uma célula epitelial, um hepatócito ou uma célula-tronco.

[0097] Em outros aspectos, a invenção fornece um método para a produção de uma variante extracelular de DNASE aqui descrita. O método compreende a cultura de células que expressam um polinucleotídeo que codifica a DNASE extracelular e a recuperação da proteína DNase recombinante. As células podem ser procarióticas ou eucarióticas. Em algumas modalidades, a DNase é expressa usando um sistema de expressão de não mamífero, que é opcionalmente Pichia pastoris ouSaccharomyces spp. Em algumas modalidades, um sistema de expressão de mamífero, como células CHO, é empregado.

[0098] A invenção fornece ainda composições farmacêuticas compreendendo a DNASE extracelular ou variante da mesma como aqui descrito, ou opcionalmente o polinucleotídeo ou o vetor como descrito, e um transportador farmaceuticamente aceitável.

[0099] Um vetor geralmente compreende um ácido nucleico isolado e que pode ser usado para distribuir o ácido nucleico isolado ao interior de uma célula. Numerosos vetores são conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, polinucleotídeos lineares, polinucleotídeos associados a compostos iônicos ou anfifílicos, plasmídeos e vírus. Os vetores exemplificativos incluem plasmídeos de replicação autônoma ou um vírus. O termo também deve ser interpretado como incluindo compostos não plasmídicos e não virais que facilitam a transferência de ácido nucleico para as células, tais como, por exemplo, compostos de polilisina, lipossomas e semelhantes. Exemplos de vetores virais incluem, mas não estão limitados a, vetores adenovirais, vetores de vírus adenoassociados, vetores retrovirais e semelhantes.

[00100] A composição farmacêutica pode ser formulada para qualquer via de administração, incluindo administração tópica, parenteral ou pulmonar. Em várias modalidades, a composição é formulada para administração intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intra-articular, intravenosa, subcutânea, intra-arterial, oral, sublingual, pulmonar ou transdérmica. Em algumas modalidades, a composição é formulada para administração intravenosa ou subcutânea.

[00101] Em outros aspectos, a invenção fornece um método para tratar um sujeito em necessidade de degradação de DNA extracelular, degradação da cromatina extracelular, degradação de armadilha extracelular (ET) e / ou degradação de armadilha extracelular de neutrófilos (NET). O método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da DNASE extracelular ou variante ou composição aqui descrita. Indicações exemplificativas em que um sujeito necessita de DNA extracelular ou degradação da cromatina (incluindo degradação ET ou NET) são divulgadas em PCT / US18 / 47084, cuja divulgação é aqui incorporada por referência. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para tratar um sujeito em necessidade, o método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína que é representada por qualquer uma das sequências SEQ ID NO: 8 a SEQ ID NO: 30.

[00102] Em cada caso em que um método para tratar um sujeito é descrito, a invenção também fornece o uso de uma ou mais das proteínas DNASE extracelulares para o tratamento ou prevenção de doenças associadas a ETs e / ou NETs.

[00103] Em várias modalidades, a presente invenção fornece um método para tratar, prevenir ou gerenciar doenças ou condições caracterizadas pela presença ou acúmulo de NETs. Tais doenças ou condições incluem, mas não estão limitadas a, doenças associadas com neutrofilia crônica, agregação de neutrófilos e leucostase, trombose e oclusão vascular,

lesão de isquemia-reperfusão, lesão cirúrgica e traumática do tecido, uma reação ou doença inflamatória aguda ou crônica, uma doença autoimune, doença cardiovascular, doença metabólica, inflamação sistêmica, doenças inflamatórias do trato respiratório, doenças inflamatórias renais, doenças inflamatórias relacionadas ao tecido transplantado (por exemplo, doença do enxerto contra hospedeiro) e câncer (incluindo leucemia).

[00104] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se ao tratamento de doenças ou condições caracterizadas pela deficiência de D1L3 ou uma deficiência de D1. Em alguns casos, o sujeito tem uma mutação (por exemplo, uma mutação de perda de função) no gene Dnase1l3 ou no gene Dnase1. Esses sujeitos podem se manifestar com uma doença autoimune (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico (SLE) (incluindo nefrite lúpica), esclerodermia ou esclerose sistêmica, artrite reumatoide, doença inflamatória intestinal (incluindo doença de Crohn e colite ulcerativa) e vasculite urticária). Em alguns casos, o sujeito possui um inibidor adquirido de D1 (por exemplo, anticorpo anti-DNase1 e actina) e / ou D1L3 (por exemplo, anticorpo anti-Dnase1l3). Esses sujeitos também podem ter uma doença autoimune ou inflamatória (por exemplo, SLE, esclerose sistêmica).

[00105] Em algumas modalidades, o sujeito tem ou está em risco de NETs obstruindo os sistemas ductais. Por exemplo, as enzimas DNASE aqui divulgadas podem ser administradas a um sujeito para tratar pancreatite, colangite, conjuntivite, mastite, doença do olho seco, obstruções dos vasos deferentes ou doenças renais.

[00106] Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou corre o risco de acumular NETs nas superfícies endoteliais (por exemplo, aderências cirúrgicas), na pele (por exemplo, feridas/cicatrizes) ou nas articulações sinoviais (por exemplo, gota e artrite, por exemplo, artrite reumatoide). As enzimas DNASE aqui descritas podem ser administradas a um sujeito para tratar uma condição caracterizada por um acúmulo de NETs em uma superfície endotelial como, mas não limitado a, uma aderência cirúrgica.

[00107] Outras doenças e condições associadas a NETs, que as enzimas DNASE divulgadas neste documento podem ser usadas para tratar ou prevenir, incluem: vasculite associada a ANCA, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, dermatose neutrofílica, dermatomiosite, queimaduras, celulite, meningite, encefalite, otite média, faringite, amigdalite, pneumonia, endocardite, cistite, pielonefrite, apendicite, colecistite, pancreatite, uveíte, ceratite, coagulação intravascular disseminada, lesão renal aguda, síndrome do desconforto respiratório agudo, choque hepático, síndrome hepatorrenal, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, isquemia de intestino, isquemia de membro, torção testicular, pré-eclâmpsia, eclâmpsia e transplante de órgão sólido (por exemplo, transplante de rim, coração, fígado e / ou pulmão). Além disso, as enzimas DNASE divulgadas neste documento podem ser usadas para prevenir uma cicatriz ou contratura, por exemplo, por aplicação local na pele, em um indivíduo em risco, por exemplo, um indivíduo com uma incisão cirúrgica, laceração ou queimadura.

[00108] Em várias modalidades, o sujeito tem uma doença que é ou foi tratada com Dnases do tipo selvagem, incluindo D1 e estreptodornase. Tais doenças ou condições incluem trombose, acidente vascular cerebral, sepse, lesão pulmonar, aterosclerose, infecção viral, doença falciforme, infarto do miocárdio, infecção no ouvido, cicatrização de feridas, lesão hepática, endocardite, infecção hepática, pancreatite, disfunção primária do enxerto, reperfusão de isquemia de membros, lesão renal, coagulação sanguínea, inflamação induzida por alume, lesão hepatorenal, exsudações pleurais, hemotórax, coágulos sanguíneos, anemia pós-pneumática, úlceras, condições otorrinolaringológicas, infecções orais, lesões leves, sinusite, rinoplastias pós-operatórias, infertilidade, cateter da bexiga, limpeza de feridas, teste de reação cutânea, meningite pneumocócica, gota, úlceras de perna, fibrose cística, síndrome de Kartegener, asma, atelectasia lobar, bronquite crônica, bronquiectasia, lúpus, discinesia ciliar primária, bronquiolite, empiema, infecções pleurais, câncer, doença dos olhos secos, infecções do trato respiratório inferior, hematomas crônicos, doença de Alzheimer e doença pulmonar obstrutiva.

[00109] Outros aspectos e modalidades da invenção serão evidentes a partir dos exemplos a seguir.

EXEMPLOS

[00110] Quase 70% de todos os produtos biológicos são produzidos usando células de ovário de hamster chinês (CHO). Na verdade, a DNASE1 de tipo selvagem (D1; dornase alfa) é normalmente produzida em células CHO. Apesar das vantagens significativas no desenvolvimento de linhagem celular e produção em larga escala usando células CHO, ainda permanece um desafio significativo na produção de enzimas Dnase devido a um grau considerável de variabilidade e nenhum método confiável para predizer ou modelar as características de crescimento celular. É importante ressaltar que as células CHO não foram capazes de produzir de forma estável variantes hiperativas de D1, o que impediu sua fabricação clínica, e antes da presente divulgação, as propriedades de fabricação de outros membros da família de proteínas DNASE1, incluindo DNASE1-LIKE 3 (D1L3), eram desconhecidas.

[00111] Usando CHO e sistemas de expressão microbiana, vários desafios foram identificados na fabricação de D1L3, incluindo baixo rendimento de produção, degradação proteolítica, dobramento incorreto de proteínas e glicosilação errônea ou indesejada. Esta divulgação fornece soluções técnicas para esses e outros desafios na fabricação, que também podem melhorar as propriedades terapêuticas de D1L3. Exemplo 1: Expressão e Caracterização de D1L3 com Deleção de Domínio Básico (BDD) em Células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) e em Pichia pastoris

[00112] DNASE1 e DNASE1L3 preferencialmente clivam DNA livre de proteína e complexos de DNA-histona (isto é, cromatina), respectivamente. Estudos anteriores sugerem que um domínio básico (BD) no C-terminal de DNASE1L3, que está ausente em DNASE1, é responsável pelas especificidades de substrato distintas de ambas as enzimas (Sisirak et al., Cell, 2016; Keyel, Developmental Biology, 2017).

[00113] Uma tecnologia de engenharia de proteínas, denominada Engenharia de Proteína de bloco de Construção, é descrita em PCT / US18 / 47084 e US 62 / 800.790, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Esta abordagem pode ser aplicada a membros da família de proteínas DNASE1 e DNASE2. O método é baseado nas seguintes etapas: proporcionar um alinhamento proteína-proteína das enzimas Dnase doadora e receptora; identificar sequências variáveis de aminoácidos para transferência, sendo os aminoácidos variáveis flanqueados por um ou mais aminoácidos conservados nas enzimas Dnase doadora e receptora; substituir os aminoácidos variáveis da Dnase receptora pelos aminoácidos variáveis da Dnase doadora para criar uma Dnase quimérica; e produção recombinante da Dnase quimérica.

[00114] Para caracterizar os aminoácidos que são responsáveis pela atividade de degradação da cromatina (atividade "cromatinase"), D1L3 de tipo selvagem foi substituído por substituições de blocos de construção de D1, conforme divulgado em PCT / US2018 /

047084. As substituições de bloco de construção para D1L3 são selecionadas de D1 humano e resultam em variantes de D1L3 humano, que apresentam as seguintes mutações: M21_R22delinsLK, C24_S25delinsAA, V28_S30delinsIQT, S34T, Q36_V44delinsMSNATLVSY, K47_K50delinsQILS, C52Y, I55_M58delinsIALVQE, I60_K61delinsVR, N64_I70delinsHLTAVGK, M72_K74delinsLDN,

R77_I83delinsQDAPD, N86H, I89V, S91_R92delinsEP, T97S, Q101R, A103L, L105V, K107_L110delinsRPDQ, V113_R115delinsAVD, H118Y, H120D, Y122_A127delinsGCEPCGN, V129T, S131N, F135_V136delinsAI, W138R, Q140_H143delinFSRF, A145_D148delinsEVRE, V150A, I152V, T156_T157delinsAA, E159_S161delinsGDA, K163A, E167A, V169_E170delinsYD, T173L, K176_R178delinsQEK, K180_A181delinsGL, N183_F186delinsDVML, P198_A201delinsRPSQ, K203_N204delinsSS, R208W, D210S, R212T, V214Q, G218P, Q220_E221delinsSA, V225_S228delinsATP, N230H, L238_R239delinsVA, Q241_S246delinsMLLRGA, K250D, N252_V254delinsALP, D256N, K259A, K262G, T264_E267delinsSDQL, L269_V271delinsQAI, F275Y, F279_K280delinsVM, Q282_S205delinsK com relação a SEQ ID NO: 4.

[00115] Estas 63 variantes D1L3 foram selecionadas para perda ou ganho de atividade de degradação da cromatina. Em resumo, as variantes D1L3 foram expressas transitoriamente em células CHO usando um vetor de expressão in vitro . Os sobrenadantes da cultura foram coletados e testados quanto à atividade de degradação da cromatina usando núcleos purificados como fonte de cromatina. Conforme mostrado na FIG. 1, as substituições de bloco de construção #17 e #63 de D1 melhoraram significativamente a degradação da cromatina de alto peso molecular (HMW) em pequenos fragmentos, quando comparado com D1L3 de tipo selvagem. A substituição do bloco de construção #7 causa uma mutação sem sentido Q101R, que substitui a glutamina na posição 101 por arginina (SEQ ID NO: 8). A substituição do bloco de construção #63 causa a mutação Q282_S305delinsK, que exclui o BD C-terminal completo de D1L3 da posição de aminoácido 283 para 305 e substitui a glutamina (Q) na posição 282 por lisina (SEQ ID NO: 9). Em seguida, realizamos análise de Western Blot dos sobrenadantes para detectar os níveis de expressão de D1L3 de tipo selvagem e ambos os mutantes (FIG. 2). Para nossa surpresa, detectamos duas variantes de D1L3 de tamanhos diferentes em amostras com D1L3 de tipo selvagem e o mutante Q101R. As amostras com Q282_S305delinsK continham apenas a variante D1L3 menor. Os dados sugerem que o BD de D1L3 de tipo selvagem é removido espontaneamente (por exemplo, proteolisado) durante a expressão ou pós-secreção em células CHO. As duas variantes D1L3 também foram detectadas em sobrenadantes de células CHO que expressam de forma estável WT-D1L3 (FIG. 3). De nota, o Domínio

Básico sem D1L3 (BDD-D1L3) mostrou atividade da cromatinase substancialmente aumentada, quando comparado com D1L3 de tipo selvagem.

[00116] Em seguida, testamos Pichia pastoris como um sistema de expressão microbiana alternativo para células CHO. Geralmente observamos níveis de expressão mais elevados com BDD-D1L3, quando comparado com D1L3 de tipo selvagem. Aqui, purificamos e caracterizamos D1L3 e BDD-D1L3 de tipo selvagem de sobrenadantes de fermentação de Pichia pastoris (FIG. 4). Inesperadamente, observamos que D1L3 de tipo selvagem foi truncado proteoliticamente dentro do BD nas posições de aminoácidos K291, K291 ou S293, levando a uma mistura heterogênea de variantes de D1L3 após a purificação. Ao contrário de D1L3 de tipo selvagem, a expressão de BDD-D1L3 devido a três substituições de blocos de construção (F275Y, F279_K280delinsVM, Q282_S205delinsK) gerou uma proteína pura.

[00117] Em seguida, comparamos a atividade da cromatinase de ambas as purificações D1L3. Observamos que a mistura heterogênea de variantes D1L3 com truncamentos BD nas posições K291, K291 ou S293 tinha atividade da cromatinase aproximadamente 10 vezes menor em comparação com a variante D1L3 com uma deleção BD completa devido a F275Y / F279_K280delinsVM / Q282_S205delinsK. Coletivamente, os dados ilustram que a clivagem proteolítica do BD pode ocorrer naturalmente em sistemas de expressão microbiana e de mamíferos (ou seja, CHO e P. pastoris), e a remoção do BD parece ativar a atividade D1L3 para degradar a cromatina. Exemplo 2: Expressão de D1L3 em células CHO em biorreatores

[00118] É divulgado aqui o desenvolvimento de linhagens de células CHO estáveis produzindo D1L3 de tipo selvagem (SEQ ID NO: 4). As linhagens celulares foram cultivadas em biorreatores usando meio de cultura CHO padrão. Especificamente, a FIG. 5 mostra um Western Blot de D1L3 humano expresso e segregado por células CHO em um biorreator sob condições compatíveis com cGMP. As amostras foram coletadas em diferentes momentos (t1 - t3). Apenas níveis menores de fragmentos D1L3 e D1L3 foram detectados. Os dados sugerem que o baixo rendimento de produção de D1L3 é um desafio na fabricação de D1L3.

[00119] Conforme divulgado neste documento, altos níveis de produção de D1L3 de tipo selvagem foram alcançados pela adição de poliânions ao meio de cultura. Esses poliânions podem compreender uma ou mais de heparina, sulfato de dextrano, citrato férrico e ácido etilenodiaminotetracético e representam o ingrediente biologicamente ativo em "reagentes anticolulares". Especificamente, adicionamos sulfato de dextrano ao meio de cultura CHO e observamos um forte aumento em fragmentos D1L3, bem como D1L3 (FIG. 5). Os dados ilustram que os poliânions aumentaram o rendimento da produção de D1L3, mas não impediram a degradação proteolítica.

[00120] FIG. 6A mostra que os poliânions, como o sulfato de dextrano (DS), formam um complexo com D1L3. O complexo D1L3-DS evita a interação e eliminação de D1L3 por superfícies carregadas negativamente durante o processo de produção. Essas superfícies carregadas negativamente incluem, mas não estão limitadas a, superfície celular de células de produção (por exemplo, células CHO, Pichia pastoris, Saccharomyces spp.), DNA exposto por células morrendo e superfícies de biorreator. FIG. 6B e FIG. 6C mostram o processo de purificação de duas etapas de D1L3 a partir de complexos DS-D1L3. Conforme mostrado na FIG. 6, a primeira etapa visa dissociar o complexo DS-D1L3. A dissociação pode ser obtida incubando o complexo DS-D1L3 com fortes superfícies de troca aniônica, que se ligam ao DS e, portanto, liberam D1L3. Especificamente, o processo de purificação pode incluir a passagem do meio de cultura contendo o DS-D1L3 através de uma coluna de cromatografia que é preenchida com uma resina de troca aniônica forte seguida pela coleta do fluxo, que contém o D1L3 livre de DS. A segunda etapa do processo de purificação é mostrada na FIG. 6C e inclui a purificação por afinidade de D1L3 do fluxo livre de DS através da aplicação de uma resina de troca catiônica forte. Em conclusão, o rendimento da produção de D1L3 pode ser substancialmente aumentado através da adição de poliânions, como sulfato de dextrano. Exemplo 3: Engenharia de D1L3 para resistência à protease

[00121] A D1L3 de tipo selvagem contém 50 resíduos de arginina e lisina, o que torna a enzima particularmente suscetível a proteases como tripsina, trombina e plasmina. Neste exemplo, os sítios de clivagem de tripsina e plasmina foram identificados em D1L3. Os sítios podem ser mutados para variantes geradas de resistência à protease de D1L3.

[00122] Em resumo, D1L3 purificado foi digerido com tripsina. Fragmentos D1L3 foram isolados, e a sequência de aminoácidos dos fragmentos determinada usando combinações de cromatografia líquida (LC) e espectrometria de massa (MS). Foi identificado que a tripsina clivou D1L3 nos seguintes resíduos de arginina e lisina: R22, R29, R51, R66, R80, R81, R95, K99, R115, K147, K163, K180, R208, R212, R235, R239,

K250, e K262. Esses resíduos de arginina e lisina podem ser substituídos por pequenos aminoácidos como alanina, valina e serina ou por aminoácidos que têm propriedades semelhantes de acordo com a pontuação de distância de Grantham (por exemplo, histidina, glutamina e glutamato; FIG. 7). D1, que é resistente à protease, apresenta resíduos de arginina e lisina correspondentes a R51, R95, K99 e R235, sugerindo que esses resíduos não são os principais responsáveis pela degradação proteolítica de D1L3.

[00123] A Engenharia de Proteína de bloco de Construção foi aplicada para transferir os seguintes blocos de Construção de D1 para substituir os blocos de Construção de D1L3 que contêm os sítios de clivagem de tripsina (FIG. 7): R22 (Mutação: M21_R22delinsLK), R29 (V28_S30delinsIQT), R66 (N64_I70delinsHLTAVGK), R80 (R77_I83delinsQDAPD), R81 (R77_I83delinsQDAPD), R115 (V113_R115delinsAVD), K163 (K163A), K180 (K180_A181delinsGL), R208 (R208W) MR212 (R212T), R239 (L238_R239delinsVA), K250 (K250D) e K262 (K262G).

[00124] A plasmina é uma protease plasmática gerada pela ativação de seu zimogênio, o plasminogênio. O inibidor 1 do ativador do plasminogênio (PAI-1) inibe a ativação da plasmina. Curiosamente, o PAI-1 aumenta a atividade enzimática de D1L3 no soro, sugerindo que a plasmina pode inativar proteoliticamente D1L3. No entanto, os sítios de clivagem da plasmina em D1L3 não foram identificados.

[00125] A análisein silico mostrou que se acredita que a combinação de aminoácidos lisina-alanina (KA) ou arginina-alanina (RA) é preferencialmente clivada pela protease plasmina ou proteases que possuem atividade semelhante à plasmina. D1L3 contém um total de quatro sítios putativos de clivagem de plasmina (FIG. 8): (Sítio 1) K180 / A181 (K160 / A161 sem peptídeo sinal), (Local 2) K200 / A201 (K180 / A181 sem peptídeo sinal), (Sítio 3) K259 / A260 (K239 / A240 sem peptídeo sinal) e (Sítio 4) R285 / A286 (R270 / A250 sem peptídeo sinal). Usando um alinhamento emparelhado de D1 e D1L3, descobrimos que nenhum dos sítios de clivagem da plasmina estão presentes em D1 (FIG. 8). Os dados estão de acordo com o fato de a atividade D1 ser resistente à inativação por proteases séricas, como a trombina e a plasmina. A Engenharia de Proteína de blocos de Construção foi aplicada para transferir os seguintes Blocos de Construção de D1 para substituir os blocos de Construção de D1L3 que contêm os sítios de clivagem da plasmina (FIG. 9): (Sítio 1) K180_A181delinsGL, (Sítio 2) P198_A201delinsRPSQ e (Sítio 3) K259A . R285 / A286 (Sítio 4) está localizado em uma extensão C-terminal que está ausente em D1.

Consequentemente, geramos uma variante D1L3 em que todos os quatro sítios de clivagem de plasmina putativos foram mutados: K180_A181delinsGL, P198_A201delinsRPSQ, K259A e R285A. Em seguida, analisamos a degradação da cromatina pela variante D1L3 e observamos uma potente atividade de degradação da cromatina na D1L3 mutada (FIG. 10). Coletivamente, os dados mostram que quatro resíduos de arginina e lisina, K180, K200, K259 e R285, podem ser mutados para reduzir o risco de degradação proteolítica sem comprometer a atividade enzimática.

[00126] Em seguida, D1L3 purificado foi digerido com plasmina purificada. Fragmentos D1L3 foram isolados e a sequência de aminoácidos dos fragmentos determinada usando combinações de LC e MS. Identificamos que a plasmina clivou D1L3 nos seguintes resíduos de arginina e lisina: R22, R29, K45, K47, K74, R81, R92, K107, K176, R212, R226, R227, K250, K259 e K262. Esses resíduos de arginina e lisina podem ser substituídos por pequenos aminoácidos como alanina, valina e serina ou por aminoácidos que têm propriedades semelhantes de acordo com a pontuação de distância de Grantham (por exemplo, histidina, glutamina e glutamato; FIG. 11). D1, que é resistente à protease, apresenta um resíduo de lisina correspondente a K45, sugerindo que este resíduo não é o principal responsável pela degradação proteolítica de D1L3 pela plasmina. A Engenharia de Proteína do bloco de Construção foi aplicada para transferir os seguintes blocos de Construção de D1 para substituir os blocos de Construção de D1L3 que contêm os sítios de clivagem de tripsina in silico (FIG. 11): R22 (Mutação: M21_R22delinsLK), R29 (V28_S30delinsIQT), K47 (K47_K50delinsQILS), K74 (M72_K74delinsLDN), R81 (R77_I83delinsQDAPD), R92 (S91_R92delinsEP), K107 (K107_L110delinsRPDQ), K176 (K176_R178delinsQEK), R212 (R212T), K226 (V225_S228delinsATP), K227 (V225_S228delinsATP), K250 (K250D), K259 (K259A) e K262 (K262G).

[00127] Finalmente, D1L3 de tipo selvagem expressa de forma recombinante foi isolada e seu C-terminal sequenciado. Três sequências de aminoácidos diferentes foram identificadas terminando em S290 (SEQ ID NO: 10), K291 (SEQ ID NO: 11) e K292 (SEQ ID NO: 12), respectivamente (FIG. 4, Exemplo 1). Os dados identificam os resíduos de lisina 291 e 292 como sítios de clivagem proteolítica proeminentes de D1L3 durante a fabricação em grande escala. Exemplo 4: Engenharia de D1L3 para evitar a degradação

[00128] Observamos fragmentação de D1L3 após expressão heteróloga em Pichia pastoris. A análise dos fragmentos caracterizou aminoácidos básicos pareados, resíduos de arginina (R) e lisina (K), como sítios de clivagem proteolítica. Um padrão de degradação semelhante foi observado após expressar D1L3 em células CHO. Estas observações sugerem que Pichia pastoris e células CHO compartilham proteases homólogas que clivam D1L3 em aminoácidos básicos emparelhados, embora o efeito tenha sido mais significativo em células CHO.

[00129] Foi determinado que a enzima de clivagem de aminoácidos básicos emparelhados (PACE) contribuiu para a fragmentação de DNASE1L3. PACE, também conhecido como Furina (Uniprot ID: P09958), é expresso em humanos e mamíferos. Pichia pastoris expressa duas enzimas, que direcionam aminoácidos básicos emparelhados, a saber, proteinase aspártica 3 (Gene: Ysp1; Uniprot ID: P32329) e Kexina (Gene: Kex2; Uniprot ID: P13134). Assim, as variantes DNASE1L3 e DNASE1L3 podem ser expressas em Pichia pastoris e em células CHO nas quais Furina, Proteinase aspártica 3 e Kexina são farmacologicamente inibidas ou geneticamente esgotadas.

[00130] Além disso, as mutações de aminoácidos básicos emparelhados nas variantes DNASE1L3 e DNASE1L3 permitem sua expressão em CHO e Pichia pastoris com fragmentação reduzida. A análise dos fragmentos DNASE1L3 identificados apresentam aminoácidos básicos emparelhados nas posições: K50 / R51, R80 / R81, K114 / R115, K199 / K200, K226 / K227, K291 / K292, R297 / K298 / K299 e K303 / R304 em SEQ ID NO: 2.

[00131] Conforme divulgado no Pedido de Patente Provisório U.S. 62 / 800.790 (que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade), DNASE1L3 de outras espécies apresentam substituições de aminoácidos nestes sítios de clivagem, incluindo R114T (Camundongo), R114A (Rato), R114D (Porquinho da índia), R114Q (vaca), K227S (cão) e K227E (elefante). Estas substituições de aminoácidos podem ser aplicadas à DNASE1L3 humana para tornar a enzima resistente à degradação proteolítica, incluindo durante a expressão em células CHO e Pichia pastoris.

[00132] Kexina cliva preferencialmente após os resíduos KR e RR. As características DNASE1L3 em K50 / R51, R80 / R81, K114 / R115 e K303 / R304 são 4 sítios de clivagem KEX2. As substituições de aminoácidos destes resíduos tornam DNASE1L3 resistente a KEX2 e permitem a expressão de variantes DNASE1L3 e DNASE1L3 em Pichia pastoris e em células CHO. Estas substituições de aminoácidos podem ser conservativas, por exemplo, R51K, R81K, R115K e R304K. Exemplo 5: Variantes D1L3 de engenharia para prevenir agregados de alto peso molecular

[00133] Durante a expressão compatível com cGMP de D1L3 em células CHO (FIG. 12A), o acúmulo de agregados de alto peso molecular de D1L3 foi observado, apontando para um desafio adicional para a fabricação clínica de D1L3. Os agregados de alto peso molecular foram observados em uma extensão muito menor em Pichia pastoris.

[00134] A aplicação de condições redutoras a proteínas de material de biorreator dissolveu agregados D1L3. Os dados ilustram que a formação do agregado D1L3 é causada por reticulação intra e / ou intermolecular via pontes dissulfeto durante a expressão da proteína. Especificamente, como mostrado na FIG. 12B, o gel foi executado em condições não redutoras e mostra o acúmulo de agregados de alto peso molecular de D1L3 ao longo do tempo. O gel foi executado sob condições redutoras e nenhum agregado foi detectado. Os dados ilustram que ligações dissulfeto intra e intermoleculares errôneas causam dobramento incorreto de D1L3 humano sob condições de fabricação.

[00135] FIG. 13 mostra um alinhamento de sequência de aminoácidos de D1 humano (SEQ ID NO: 1) e D1L3 humano (SEQ ID NO: 4). O peptídeo sinal, aminoácidos conservados, aminoácidos variáveis, resíduos de cisteína não conservados e resíduos de cisteína conservados são destacados. Mutações em resíduos de cisteína não conservados reduzirão as possibilidades de ligações dissulfeto intra e intermoleculares durante a expressão da proteína. A análise da sequência de aminoácidos de D1L3 (SEQ ID NO: 4) mostrou a presença de cinco resíduos de cisteína (C): C24, C52, C68, C194 e C231 (FIG. 14). Os resíduos de cisteína C194 e C231 são conservados entre todos os membros da família de proteínas DNASE1 e formam ligações dissulfeto que são necessárias para a atividade enzimática de DNASE1. A função dos resíduos de cisteína em D1L3 não eram conhecidas antes da presente divulgação. Consequentemente, como aqui divulgado, a mutação desses resíduos de cisteína reduz a reticulação por meio de pontes dissulfeto e, assim, aumenta o rendimento da produção de proteína.

[00136] Os resíduos de cisteína podem ser substituídos por outros pequenos aminoácidos, nomeadamente alanina (A), serina (S) e glicina (G), entre outros. Tais substituições causam as seguintes mutações de aminoácidos C24A / S / G, C52A / S / G, C68A / S / G, C194A / S / G e C231A / S / G. Além disso, os blocos de construção que compreendem os resíduos de cisteína conservados podem ser substituídos por blocos de construção de um doador DNase da família de proteínas DNASE1 (por exemplo, D1 e D1L3). Os seguintes blocos de construção de D1 foram usados para substituir os blocos de construção de D1L3 que contêm os resíduos de cisteína não conservados C24, C52 e C68: C24_S25delinsAA, C52Y e N64_I70delinsHLTAVGK. A atividade de degradação da cromatina das variantes D1L3 foi quantificada, conforme descrito em PCT / US18 / 4708. Ambas as substituições convencionais de aminoácidos (C24A, C52A) e substituições de blocos de construção (C24_S25delinsAA, C52Y) causaram uma ausência completa de degradação da cromatina, indicando que C24 e C52 são necessários para a atividade D1L3 (FIG. 15). É importante notar que a mutação da cisteína C68, seja por substituição de aminoácido convencional [C68A, (SEQ ID NO: 13)] ou por mutação BB (N64_I70delinsHLTAVGK), resultou em uma variante D1L3 com atividade degradante da cromatina (FIG. 15). O alinhamento da sequência de aminoácidos mostrou que a cisteína C68 não é conservada entre outros membros da família da proteína DNASE1, apoiando a noção de que o C68 não é necessário para a atividade enzimática. Além disso, foi observado que a substituição de aminoácidos da cisteína C194 altamente conservada com alanina (C194A), mas não a mutação da cisteína C231 altamente conservada com alanina (C231A), resultou em uma variante D1L3 enzimaticamente ativa (FIG. 15). Assim, a cisteína C68 e C194 podem sofrer mutação para reduzir o risco de ligações dissulfeto errôneas durante a produção de D1L3.

[00137] Uma abordagem semelhante pode ser aplicada para mutar os resíduos de cisteína não conservados nos outros membros da família de proteínas DNase1: D1, DNase1- semelhante 1 (D1L1) e DNase1-semelhante 2 (D1L2). D1 tem duas cisteínas não conservadas: C123 e C126. D1L1 mostra dois resíduos de cisteína não conservados (C22, C50) que correspondem a C24 e C52 em D1L2 e tem apenas um resíduo de cisteína não conservado: C43. A mutação de resíduos de cisteína não conservados de membros da família de proteínas DNASE1 reduzirá a reticulação por meio de pontes dissulfeto errôneas durante a expressão da proteína e, assim, permitirá a fabricação de D1, D1L1, D1L2 e D1L3 para aplicações terapêuticas. Exemplo 6: Construção e expressão de proteínas de fusão D1L3 e albumina-D1L3 em Pichia pastoris

[00138] A expressão de Pichia pastoris de DNASES extracelulares humanas recombinantes, incluindo D1L3, foi testada. Conforme mostrado na FIG. 16A, o terminal N de D1L3 foi liderado pelo líder de pré-secreção do fator de acoplamento alfa (aMF) de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 46), uma ferramenta comum para a expressão de proteínas heterólogas em Pichia pastoris. Conforme divulgado neste documento, a combinação de aMF com D1L3 causou o não processamento inesperado de aMF devido à glicosilação (FIG. 16B). A glicosilação da proteína D1L3 impede o uso de P. pastoris para a fabricação clínica de D1L3. D1L3 foi adequadamente processado, quando o N-terminal foi conduzido pelo peptídeo sinal secretório nativo de D1L3 [FIG. 16B, (SEQ ID NO: 48)]. É importante ressaltar que aMF aumentou a expressão de D1L3 3-5 vezes, quando comparado ao peptídeo sinal nativo de D1L3. Portanto, testamos o processamento de proteínas de fusão D1L3. Em estudos piloto, uma fusão N-terminal de aMF e albumina de soro humano [HSA, (SEQ ID NO: 39)] para D1L3 foi gerada (FIG. 17A). Algumas variantes continham peptídeo ligante [por exemplo, (GSSSS)3] entre HSA e D1L3. Conforme mostrado na FIG. 17B e FIG. 17C, a expressão da proteína de fusão em P. pastoris gerou um D1L3 não glicosilado e enzimaticamente ativo. Além disso, os níveis de expressão aumentaram 5-10 vezes, quando comparados com a expressão de D1L3 dirigida por peptídeo de sinal secretório nativo. Coletivamente, os dados ilustram que a fusão de D1L3 com albumina permite a fabricação em Pichia pastoris.

[00139] Com base nesses estudos piloto, vários construtos de fusão HSA de D1L3 de tipo selvagem e BDD-D1l3 foram projetados e selecionados para níveis de expressão da proteína alvo (SEQ ID NOS: 17 a 28). Conforme mostrado na FIG. 18, observamos que a fusão N-terminal de albumina de soro humano (SEQ ID: NO: 17) a uma variante BDD-D1l3 (SEQ ID NO: 16) não aumentou substancialmente os níveis de expressão. No entanto, é importante notar que detectamos um forte aumento nos níveis de expressão quando inserimos um ligante flexível composto de resíduos de glicina (G) e serina (S) entre HSA e BDD-D1L3. Além disso, o comprimento da sequência de ligação está correlacionado com o aumento da expressão. Por exemplo, enquanto 12 ± 1,9 unidades de expressão relativas foram obtidas com um ligante de 5 aminoácidos (SEQ ID NO: 18), e com um ligante de 15 aminoácidos (SEQ ID NO: 19), a expressão foi de 32 ± 3,2 unidades relativas, uma melhoria de aproximadamente 7,5 vezes em relação à fusão HSA sem um ligante. Além disso, a localização do N-terminal foi crítica para os níveis de expressão melhorados porque a fusão do C-terminal dos construtos de ligante-HSA foi expressa em níveis baixos (SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21). De notar, a fusão N-terminal de HSA através de um ligante flexível também aumentou de forma robusta a expressão de D1L3 de tipo selvagem (SEQ ID NO: 22), aproximadamente 20 vezes em relação a D1L3 nativo (SEQ ID NO: 4). Em conclusão, a fusão de HSA por meio de um ligante ao N-terminal permite a produção de D1L3, bem como variantes de BDD-D1L3.

[00140] Em seguida, testamos se a natureza da sequência de ligação era crítica para a melhoria da expressão de D1L3. Testamos duas sequências adicionais, APAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 33, 14 aminoácidos, ligante rígido) e AEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 34, 12 aminoácidos, ligante helicoidal rígido). Conforme mostrado na FIG. 19, em ambos os construtos de teste (SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24), observamos um forte aumento na expressão, mas o ligante helicoidal rígido não atingiu níveis de expressão fortes semelhantes aos observados para o ligante GGGGSGGGGSGGGGS. Assim, o comprimento e a composição de ácido do ligante impactaram os níveis de expressão de D1L3.

[00141] Em seguida, analisamos a relação entre o comprimento do ligante, o nível de expressão e a atividade enzimática. Para estes testes, vetores de expressão projetados compreendendo fusão N-terminal de HSA com um GS-ligante para as variantes BDD-D1L3 (SEQ ID NO: 25 a 27). Três comprimentos de ligante diferentes foram testados SGGSGSS [7 aminoácidos, (SEQ ID NO: 35)], SGGSGGSGGSGGSGSS [16 aminoácidos, (SEQ ID NO: 36)] e SGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGSS [31 aminoácidos, (SEQ ID NO: 37)]. Conforme mostrado na FIG. 20, observamos que o alongamento da sequência ligante de 7 aminoácidos para 16 aminoácidos resultou em um aumento no nível de expressão. O alongamento adicional de 16 para 31 aminoácidos não aumentou a expressão da proteína, mas aumentou a atividade enzimática, conforme detectado pela degradação da cromatina-HMW em cromatina-LMW. Os produtos biológicos fundidos com a fusão da albumina frequentemente mostram uma atividade reduzida porque a albumina impede estericamente a interação com substratos e ligandos. Assim, os ligantes peptídicos podem ser usados para aumentar a distância entre a albumina e a proteína de fusão ou peptídeo. No entanto, a observação de que a inserção de uma sequência de ligante entre HSA e D1L3 melhora simultaneamente a atividade enzimática e os níveis de expressão foi inesperada.

[00142] Comparamos a atividade de degradação da cromatina de BDD-D1L3 (SEQ ID NO: 14) com sua contraparte de fusão de albumina (SEQ ID NO: 19). Em resumo, camundongos Dnase1-/-Dnase1l3-/- foram injetados com SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 19. O soro foi coletado 15 minutos após a injeção. Conforme mostrado na FIG. 21A, observamos atividade de degradação da cromatina sérica semelhante em ambos os animais. É importante ressaltar que a fusão de albumina ao N-terminal de D1L3 e outras DNASES extracelulares humanas fornece uma terapia DNASE de meia-vida estendida. Conforme divulgado neste documento, determinamos a meia-vida de SED ID NO: 19, uma proteína de fusão HSA- BDD-D1L3 com um ligante GS flexível de 15 aminoácidos, em um modelo de roedor disponível comercialmente. O modelo animal é caracterizado pela expressão transgênica do FcRn humano, responsável pela longa meia-vida da albumina em circulação. Embora D1L3 não conjugado (por exemplo, SEQ ID NO: 4) tenha uma meia-vida muito curta em circulação (<30 minutos), a fusão de albumina estendeu a meia-vida para 3,3 dias, melhorando substancialmente a exposição sistêmica, ao mesmo tempo que confere rápida absorção com um tmax de 5 minutos (FIG. 21B). Coletivamente, os dados demonstram que a fusão N-terminal de HSA com D1L3 por meio de uma sequência de ligante não apenas facilita a fabricação, mas também melhora as propriedades farmacocinéticas in vivo de D1L3.

[00143] Finalmente, testamos a fusão dupla de HSA com os terminais N e C de D1L3. Em primeiro lugar, analisamos o terminal C de D1L3 para potenciais sítios de fixação. Identificamos dois resíduos de serina nas posições 283 e 284, que fornecem uma conexão flexível do BD (RAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS) ao corpo central de D1L3. Assim, excluímos o BD e escolhemos anexar HSA por meio de um GS-ligante flexível (SEQ ID NO: 38) ao S284. Conforme mostrado na FIG. 22, a fusão de HSA com os terminais N e C de BDD-D1L3 (SEQ ID NO: 28) manteve os níveis de expressão elevados que foram observados com a fusão de HSA N-terminal (SEQ ID NO: 27). Exemplo 7: Projeto de sequências ligantes cliváveis

[00144] As descobertas aqui divulgadas têm implicações além da fabricação. Por exemplo, variantes D1L3 com deleções de aminoácidos C-terminal, que retêm sua atividade enzimática para degradar a cromatina e / ou NETs, como exemplificado por SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 12, podem ser usadas para terapia D1L3. Além disso, a alquilação específica do sítio de um tiol de cisteína não pareado é comumente usada para gerar produtos biológicos estendidos de meia-vida para aplicações terapêuticas. Especificamente, as cisteínas não essenciais C68 e C194 de D1L3 podem ser usadas para PEGuilação específica do sítio (PEG, polietileno glicol). Além disso, as variantes D1L3 que são resistentes à inativação pela plasmina, devido a mutações, como K180_A181delinsGL, P198_A201delinsRPSQ, K259A e R285A, devem ter uma meia-vida melhorada e, portanto, eficácia em aplicações terapêuticas.

[00145] É importante ressaltar que a fusão de albumina ao N-terminal de D1L3 e outras DNASES extracelulares humanas fornece uma DNASE com meia-vida prolongada (FIG. 23A). Várias sequências ligantes foram usadas para reduzir a inibição estérica de D1L3 pela albumina. Além disso, foi desenvolvido um ligante peptídico fisiologicamente clivável. O peptídeo ligante foi projetado para ser clivado quando a proteína de fusão está em estreita proximidade com armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs). As sequências de peptídeos que são direcionadas por proteases específicas de neutrófilos, como elastase de neutrófilos, catepsina G e proteinase 3, são candidatas à sequência de ligação clivável.

[00146] Foi desenvolvida uma sequência ligante clivável que é clivada intravascularmente e, portanto, ideal para terapêutica de DNASE aplicada por via intravenosa e intra-arterial. Para desenhar o peptídeo, consideramos que os NETs têm a capacidade de ativar fatores de coagulação do sangue, em particular o fator de coagulação XII (FXII). FXII ativado (FXIIa) tem dois substratos principais: fator de coagulação XI (FXI, SEQ ID NO: 40) e pré-calicreína (PK, SEQ ID NO: 41). Um alinhamento de sequência de aminoácidos mostrou que o sítio de clivagem de FXIIa é conservado em FXI e PK (FIG. 23B). No FXI, o sítio de clivagem está entre arginina 387 e isoleucina 388. Na PK, o sítio de clivagem está entre arginina 390 e isoleucina 391. Na verdade, FXI e PK são proteínas homólogas. Conforme divulgado neste documento, projetamos vários peptídeos de ligação que contêm a totalidade ou partes da posição 380 da sequência de FXI na posição 403 (SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43) ou da posição da sequência PK 383 na posição 406 (SEQ ID NO : 44).

[00147] Finalmente, o ligante clivável por FXIIa pode ser usado para a fabricação de uma versão estendida de meia-vida de outros produtos biológicos (FIG. 24), incluindo, mas não se limitando a, variantes de outra DNASE extracelular, fatores de coagulação humana

(por exemplo, Fator VII, Fator VIII, e Fator IX), e fatores de complemento (por exemplo, Fator H).

[00148] Todas as patentes e publicações de patentes citadas neste documento são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.

DNASES humanas de tipo selvagem SEQ ID NO: 1 DNASE1 (NP_005212.2): Peptídeo Sinal, Proteína Madura:

MRGMKLLGALLALAALLQGAVSLKIAAFNIQTFGETKMSNATLVSYIVQILSRYDIALVQ EVRDSHLTAVGKLLDNLNQDAPDTYHYVVSEPLGRNSYKERYLFVYRPDQVSAVDSYYYD DGCEPCGNDTFNREPAIVRFFSRFTEVREFAIVPLHAAPGDAVAEIDALYDVYLDVQEKW GLEDVMLMGDFNAGCSYVRPSQWSSIRLWTSPTFQWLIPDSADTTATPTHCAYDRIVVAG

MLLRGAVVPDSALPFNFQAAYGLSDQLAQAISDHYPVEVMLK SEQ ID NO: 2 DNASE1-LIKE 1 (NP_006721.1): Peptídeo Sinal; Proteína Madura:

MHYPTALLFLILANGAQAFRICAFNAQRLTLAKVAREQVMDTLVRILARCDIMVLQEVVD SSGSAIPLLLRELNRFDGSGPYSTLSSPQLGRSTYMETYVYFYRSHKTQVLSSYVYNDED DVFAREPFVAQFSLPSNVLPSLVLVPLHTTPKAVEKELNALYDVFLEVSQHWQSKDVILL GDFNADCASLTKKRLDKLELRTEPGFHWVIADGEDTTVRASTHCTYDRVVLHGERCRSLL HTAAAFDFPTSFQLTEEEALNISDHYPVEVELKLSQAHSVQPLSLTVLLLLSLLSPQLCP

AA SEQ ID NO: 3 DNASE1-LIKE 2 (NP_001365.1): Peptídeo Sinal, Proteína Madura:

MGGPRALLAALWALEAAGTAALRIGAFNIQSFGDSKVSDPACGSIIAKILAGYDLALVQE VRDPDLSAVSALMEQINSVSEHEYSFVSSQPLGRDQYKEMYLFVYRKDAVSVVDTYLYPD PEDVFSREPFVVKFSAPGTGERAPPLPSRRALTPPPLPAAAQNLVLIPLHAAPHQAVAEI DALYDVYLDVIDKWGTDDMLFLGDFNADCSYVRAQDWAAIRLRSSEVFKWLIPDSADTTV GNSDCAYDRIVACGARLRRSLKPQSATVHDFQEEFGLDQTQALAISDHFPVEVTLKFHR

SEQ ID NO: 4 DNASE1-LIKE 3; Isoforma 1 (NP_004935.1): Peptídeo Sinal, Proteína Madura:

MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEI KDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYH DYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWK AENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRG QEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKT

KSKRS SEQ ID NO: 5 DNASE1-LIKE 3, Isoforma 2 (NP_001243489.1): Peptídeo Sinal; Proteína Madura:

MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEI KDSNNRICPILMEKLNREKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFV IIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTD PRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALD

VSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS SEQ ID NO: 6 DNASE2A (O00115): Peptídeo Sinal; Proteína Madura:

MIPLLLAALLCVPAGALTCYGDSGQPVDWFVVYKLPALRGSGEAAQRGLQYKYLDESSGG WRDGRALINSPEGAVGRSLQPLYRSNTSQLAFLLYNDQPPQPSKAQDSSMRGHTKGVLLL DHDGGFWLVHSVPNFPPPASSAAYSWPHSACTYGQTLLCVSFPFAQFSKMGKQLTYTYPW VYNYQLEGIFAQEFPDLENVVKGHHVSQEPWNSSITLTSQAGAVFQSFAKFSKFGDDLYS GWLAAALGTNLQVQFWHKTVGILPSNCSDIWQVLNVNQIAFPGPAGPSFNSTEDHSKWCV SPKGPWTCVGDMNRNQGEEQRGGGTLCAQLPALWKAFQPLVKNYQPCNGMARKPSRAYKI

SEQ ID NO: 7 DNASE2B (Q8WZ79): Peptídeo sinal; Proteína madura:

MKQKMMARLLRTSFALLFLGLFGVLGAATISCRNEEGKAVDWFTFYKLPKRQNKESGETG LEYLYLDSTTRSWRKSEQLMNDTKSVLGRTLQQLYEAYASKSNNTAYLIYNDGVPKPVNY SRKYGHTKGLLLWNRVQGFWLIHSIPQFPPIPEEGYDYPPTGRRNGQSGICITFKYNQYE AIDSQLLVCNPNVYSCSIPATFHQELIHMPQLCTRASSSEIPGRLLTTLQSAQGQKFLHF AKSDSFLDDIFAAWMAQRLKTHLLTETWQRKRQELPSNCSLPYHVYNIKAIKLSRHSYFS SYQDHAKWCISQKGTKNRWTCIGDLNRSPHQAFRSGGFICTQNWQIYQAFQGLVLYYESC

K Variantes DNASE1L3 humanas SEQ ID NO: 8 DNASE1-LIKE 3, Q101R (Peptídeo Sinal; Proteína Madura)

MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEI KDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKERYAFLYKEKLVSVKRSYHYH DYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWK AENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRG QEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKT

KSKRS SEQ ID NO: 9 DNASE1L3, Q282_S305delinksK (Peptídeo sinal; Proteína madura):

MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEI KDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYH DYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWK AENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRG

QEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLK SEQ ID NO: 10 DNASE1L3, S305delinsK (Peptídeo sinal; Proteina madura:

MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEI KDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYH DYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWG LENFIFMGDFNAGCSYVRPSQWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRG

QEIVSSVVPKSNSVFDFQAAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNS SEQ ID NO: 11 DNASE1L3, K292_S305del (Peptídeo Sinal; Proteína Madura):

QEIVSSVVPKSNSVFDFQAAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSK SEQ ID NO: 12 DNASE1L3, S293_S305del (Peptídeo Sinal; Proteína Madura):

QEIVSSVVPKSNSVFDFQAAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKK SEQ ID NO: 13 DNASE1L3, C68A (Peptídeo sinal; Proteína madura):

MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEI KDSNNRIAPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYH DYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWK AENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRG QEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKT

KSKRS SEQ ID NO: 14 DNASE1L3, F275Y/F279_K280delinsVM/Q282_S305delinsK (Peptídeo sinal; Proteína madura):

QEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHYPVEVMLK SEQ ID NO: 15 DNASE1L3, S283_S305del (Peptídeo Sinal; Proteína Madura):

QEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQ SEQ ID NO: 16 DNASE1L3, R285_S305del (Peptídeo Sinal; Proteína Madura):

VSDHFPVEFKLQSS Fusões de albumina com DNASE1L3 e variantes SEQ ID NO: 17 Albumina - Variante DNASE1L3 - Proteína de fusão. (Albumina, Variante DNASE1L3):

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEV DVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKC CAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST PTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTES LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKAT KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLMRICSFNVRSFGESK QEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGR NTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLH TTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVW LIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHY

PVEVMLK SEQ ID NO: 18 Albumina - Variante DNASE1L3 - Proteína de fusão. (Albumina, Variante DNASE1L3):

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEV DVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKC CAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST PTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTES LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKAT KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSMRICSFNVRS FGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVIS SRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFV IIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTD PRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALD

VSDHYPVEVMLK SEQ ID NO: 19 Albumina - Variante DNASE1L3 - Proteína de fusão. (Albumina, Variante DNASE1L3):

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEV DVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKC CAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST PTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTES LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKAT KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSGGGGS MRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSR RGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQ SPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKK AWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKA

YKLTEEEALDVSDHYPVEVMLK SEQ ID NO: 20 Variante DNASE1L3 - Albumina - Proteína de fusão. (Albumina, Variante DNASE1L3):

MRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSR RGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQ SPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKK AWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKA YKLTEEEALDVSDHYPVEVMLKGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQ CPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAK QEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPE LLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKA WAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISS KLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYE YARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCE LFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYL SVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADI CTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGK

KLVAASQAALGL SEQ ID NO: 21 Variante DNASE1L3 - Albumina - Proteína de fusão. (Albumina, Variante DNASE1L3):

MRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSR RGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQ SPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKK AWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKA YKLTEEEALDVSDHYPVEVMLKGGGGSGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALV LIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRET YGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIA RRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASL QKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKY ICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAK DVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEE PQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEA KRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFN AETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADD

KETCFAEEGKKLVAASQAALGL SEQ ID NO: 22 Albumina - DNASE1L3 - Proteína de fusão. (Albumina, DNASE1L3):

YKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS SEQ ID NO: 23 Albumina - DNASE1L3 - Proteína de fusão. (Albumina, DNASE1L3):

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEV DVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKC CAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST PTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTES LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKAT KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAPAPAPAPAPAPAPM RICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRR GITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQS PHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKA WKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAY

KLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS SEQ ID NO: 24 Albumina - DNASE1L3 - Proteína de fusão. (Albumina, DNASE1L3):

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEV DVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKC CAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST PTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTES LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKAT KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAEAAAKEAAAKAMRI CSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGI TYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPH TAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWK NIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKL TEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS

SEQ ID NO: 25 Albumina - Variante DNASE1L3 - Proteína de fusão. (Albumina, Variantes DNASE1L3):

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEV DVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKC CAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST PTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTES LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKAT KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLSGGSGSSMRICSFNV RSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYV ISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKD FVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLR TDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEA

LDVSDHFPVEFKLQ SEQ ID NO: 26 Albumina - Variante DNASE1L3 - Proteína de fusão. (Albumina, Variante DNASE1L3):

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEV DVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKC CAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST PTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTES LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKAT KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLSGGSGGSGGSGGSGS SMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNS RRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWF QSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPK KAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQK

AYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQ SEQ ID NO: 27 Albumina - Variante DNASE1L3 - Proteína de fusão. (Albumina, Variante DNASE1L3):

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEV DVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKC CAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST PTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTES LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKAT KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLSGGSGGSGGSGGSGG SGGSGGSGGSGGSGSSMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSN NRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQD GDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENF IFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIV

SSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQ SEQ ID NO: 28 Albumina - Variante DNASE1L3 - Albumina - Proteína de fusão. (Albumina, Variante DNASE1L3):

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEV DVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKC CAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST PTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTES LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKAT KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLSGGSGGSGGSGGSGG SGGSGGSGGSGGSGSSMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSN NRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQD GDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENF IFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIV SSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGG SGGSGGSGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAK TCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPN LPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQA ADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEV SKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIA EVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAK TYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRY TKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSD RVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVE

LVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL SEQ ID NO: 29 Albumina - DNASE1L3 Isoforma 2 - Proteína de fusão. (Albumina, DNASE1L3 Isoforma 2):

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEV DVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKC CAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST PTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTES LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKAT KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLSGGSGGSGGSGGSGG SGGSGGSGGSGGSGSSMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSN NRICPILMEKLNREQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAV KDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIR LRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEE

EALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS SEQ ID NO: 30 Albumina - Variante DNASE1L3 Isoforma 2 - Proteína de fusão. (Albumina, DNASE1L3 Isoforma 2):

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEV DVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKC CAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST PTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTES LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKAT KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLSGGSGGSGGSGGSGG SGGSGGSGGSGGSGSSMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSN NRICPILMEKLNREQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAV KDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIR LRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEE EALDVSDHFPVEFKLQ

SEQUÊNCIAS LIGANTES SEQ ID NO: 31

GGGGS SEQ ID NO: 32

GGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO: 33

APAPAPAPAPAPAP SEQ ID NO: 34

AEAAAKEAAAKA SEQ ID NO: 35

SGGSGSS SEQ ID NO: 36

SGGSGGSGGSGGSGSS SEQ ID NO: 37

SGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGS SEQ ID NO: 38

GGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGS

OUTRAS SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 39 Albumina de soro humano (proteína madura):

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEV DVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKC CAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST PTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTES LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKAT KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL

SEQ ID NO: 40 Fator humano XI:

MIFLYQVVHFILFTSVSGECVTQLLKDTCFEGGDITTVFTPSAKYCQVVCTYHPRCLLFT FTAESPSEDPTRWFTCVLKDSVTETLPRVNRTAAISGYSFKQCSHQISACNKDIYVDLDM KGINYNSSVAKSAQECQERCTDDVHCHFFTYATRQFPSLEHRNICLLKHTQTGTPTRITK LDKVVSGFSLKSCALSNLACIRDIFPNTVFADSNIDSVMAPDAFVCGRICTHHPGCLFFT FFSQEWPKESQRNLCLLKTSESGLPSTRIKKSKALSGFSLQSCRHSIPVFCHSSFYHDTD FLGEELDIVAAKSHEACQKLCTNAVRCQFFTYTPAQASCNEGKGKCYLKLSSNGSPTKIL HGRGGISGYTLRLCKMDNECTTKIKPRIVGGTASVRGEWPWQVTLHTTSPTQRHLCGGSI IGNQWILTAAHCFYGVESPKILRVYSGILNQSEIKEDTSFFGVQEIIIHDQYKMAESGYD IALLKLETTVNYTDSQRPICLPSKGDRNVIYTDCWVTGWGYRKLRDKIQNTLQKAKIPLV TNEECQKRYRGHKITHKMICAGYREGGKDACKGDSGGPLSCKHNEVWHLVGITSWGEGCA

QRERPGVYTNVVEYVDWILEKTQAV SEQ ID NO: 41 Pré-calicreína humana:

MILFKQATYFISLFATVSCGCLTQLYENAFFRGGDVASMYTPNAQYCQMRCTFHPRCLLF SFLPASSINDMEKRFGCFLKDSVTGTLPKVHRTGAVSGHSLKQCGHQISACHRDIYKGVD MRGVNFNVSKVSSVEECQKRCTNNIRCQFFSYATQTFHKAEYRNNCLLKYSPGGTPTAIK VLSNVESGFSLKPCALSEIGCHMNIFQHLAFSDVDVARVLTPDAFVCRTICTYHPNCLFF TFYTNVWKIESQRNVCLLKTSESGTPSSSTPQENTISGYSLLTCKRTLPEPCHSKIYPGV DFGGEELNVTFVKGVNVCQETCTKMIRCQFFTYSLLPEDCKEEKCKCFLRLSMDGSPTRI AYGTQGSSGYSLRLCNTGDNSVCTTKTSTRIVGGTNSSWGEWPWQVSLQVKLTAQRHLCG GSLIGHQWVLTAAHCFDGLPLQDVWRIYSGILNLSDITKDTPFSQIKEIIIHQNYKVSEG NHDIALIKLQAPLNYTEFQKPICLPSKGDTSTIYTNCWVTGWGFSKEKGEIQNILQKVNI PLVTNEECQKRYQDYKITQRMVCAGYKEGGKDACKGDSGGPLVCKHNGMWRLVGITSWGE GCARREQPGVYTKVAEYMDWILEKTQSSDGKAQMQSPA

SEQUÊNCIAS LIGANTES ATIVÁVEIS SEQ ID NO: 42 Ligante suscetível a FXIIa (peptídeo Fator XI):

CTTKIKPRIVGGTASVRGEWPWQVT SEQ ID NO: 43 Ligante suscetível a FXIIa

GGGGSPRIGGGGS SEQ ID NO: 44 Ligante suscetível a FXIIa (peptídeo de pré-calicreína):

VCTTKTSTRIVGGTNSSWGEWPWQVS EQ ID NO: 45 Ligante suscetível a FXIIa (peptídeo de pré-calicreína):

STRIVGG

PEPTÍDEOS SINAL SEQ ID NO: 46 Fator de acoplamento alfa (P01149):

MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTN

NGLLFINTTIASIAAKEEGVS SEQ ID NO: 47 Peptídeo Sinal Secretório de Albumina Humana + Propeptídeo (P02768):

MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR SEQ ID NO: 48 Peptídeo sinal DNASE1L3 humano (Q13609):

MSRELAPLLLLLLSIHSALA

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Variante 3 tipo DNase-1 (D1L3), caracterizada pelo fato de que a variante de proteína D1L3 tem um ou mais de: resistência elevada à degradação proteolítica; meia-vida de circulação elevada; níveis de produção mais altos com sistemas de expressão in vitro; e atividade de cromatina e/ou degradante de NET in vitro não substancialmente menor, a mesma ou melhor; em cada caso em comparação com a proteína D1L3 tipo selvagem de SEQ ID NO: 4 e/ou SEQ ID NO: 5.

2. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a variante D1L3 é uma proteína de fusão compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% idêntica à enzima madura definida por SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:5, uma sequência de aminoácido de albumina no lado N-terminal da enzima madura e uma sequência de aminoácido de ligação entre a sequência de aminoácido de albumina e a sequência de aminoácido da enzima madura.

3. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a variante D1L3 compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica à enzima madura definida por SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:5.

4. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a variante D1L3 tem uma deleção de pelo menos 5 aminoácidos do domínio básico C-terminal, o domínio básico C-terminal sendo definido pelos 23 aminoácidos C-terminal de SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:5.

5. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que D1L3 tem uma deleção de pelo menos 10 aminoácidos do domínio básico C-terminal.

6. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que D1L3 tem uma deleção de pelo menos 15 aminoácidos do domínio básico C-terminal.

7. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que D1L3 tem uma deleção de todo o domínio básico C-terminal.

8. Variante D1L3, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que D1L3 tem uma substituição de aminoácido na posição correspondente à posição 101 de SEQ ID NO:4.

9. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que D1L3 tem uma substituição de aminoácido que é Q101R.

10. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o ligante é flexível, rígido ou compreende um sítio de clivagem de protease.

11. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o ligante é um ligante flexível.

12. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada pelo fato de que o ligante tem pelo menos 10 aminoácidos ou pelo menos 15 aminoácidos.

13. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o ligante tem de 15 a 35 aminoácidos.

14. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a variante compreende a sequência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOS: 8 a 30, em cada caso tendo opcionalmente de uma a vinte modificações de aminoácidos independentemente selecionadas de inserções, deleções ou substituições.

15. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a variante tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 30.

16. Variante D1L3, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais substituições de bloco de construção de D1 e/ou uma ou mais deleções ou substituições de resíduos de cisteína em comparação com a enzima de SEQ ID NO: 4.

17. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o aminoácido correspondente a C68 de SEQ ID NO: 4 é substituído.

18. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o aminoácido correspondente a C68 de SEQ ID NO: 4 é substituído por um aminoácido selecionado de Ala, Ser e Gly.

19. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a variante compreende a substituição N64_I70delinsHLTAVGK, que é opcionalmente modificada por uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções de aminoácidos, com a condição de que a substituição de bloco de construção não seja modificada para incluir um resíduo de cisteína.

20. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma conjugação de PEG ao aminoácido correspondente a C68 e/ou C194.

21. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que tem uma ou mais substituições de resíduos de arginina e lisina que estão presentes em SEQ ID NO: 4 e/ou SEQ ID NO: 5, em que a substituição torna a variante D1L3 menos sensível à proteólise por plasmina, trombina e/ou tripsina, em comparação com a proteína de SEQ ID NO: 4 ou a proteína de SEQ ID NO: 5.

22. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que uma ou mais das substituições de arginina e lisina correspondem à(s) seguinte(s) posição(ões) de SEQ ID NO: 4: K180, K200, K259 e R285.

23. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a substituição de arginina ou lisina é selecionada de um ou mais de K180A, K200A, K259A e R285A em relação à SEQ ID NO: 4.

24. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a variante compreende uma substituição selecionada de: K180_A181delinsGL, P198_A201delinsRPSQ e K259A em relação à SEQ ID NO: 4.

25. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a variante compreende uma ou mais mutações de um resíduo básico emparelhado, o resíduo básico emparelhado correspondendo a uma posição selecionada de K50/R51, R80/R81, K114/R115, K199/K200, K226/K227, K291/K292, R297/K298/K299 e K303/R304 de SEQ ID NO:4.

26. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que as uma ou mais mutações de um resíduo básico emparelhado incluem uma substituição de aminoácido selecionada de R114T, R114A, R114D, R114Q, K227S e K227E em relação à SEQ ID NO: 4.

27. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que as uma ou mais mutações de um resíduo básico emparelhado incluem uma substituição de aminoácido selecionada de R51K, R81K, R115K e R304K em relação à SEQ ID NO: 4.

28. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o ligante é clivável por uma protease de via de coagulação.

29. Variante D1L3, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que o ligante é clivável por Fator XII ou uma protease de neutrófilo.

30. Variante DNase 1 (D1), caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% idêntica à enzima definida por SEQ ID NO: 1, com uma ou mais deleções ou substituições de resíduos de cisteína.

31. Variante D1, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que um ou mais aminoácidos correspondentes a C123 e C126 de SEQ ID NO: 1 são deletados ou substituídos.

32. Variante D1, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a(s) cisteína(s) é/são substituídas por um aminoácido independentemente selecionado de Ala, Ser e Gly.

33. Variante D1, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a variante compreende a substituição G122_N128delinsYQGDA.

34. Variante D1, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, caracterizada pelo fato de que a variante D1 é uma proteína de fusão compreendendo uma sequência de aminoácido de albumina e, opcionalmente, um ligante peptídico.

35. Variante D1, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que o domínio de albumina da proteína de fusão está localizado no lado N-terminal do domínio D1.

36. Proteína variante D1, de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizada pelo fato de que um ligante peptídico é interposto entre o domínio de albumina e o domínio D1.

37. Variante D1, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que o ligante peptídico é um ligante flexível, um ligante rígido ou um ligante clivável por protease.

38. Variante D1, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o ligante tem pelo menos 10 aminoácidos ou pelo menos 15 aminoácidos.

39. Variante D1, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o ligante tem de 15 a 35 aminoácidos.

40. Variante D1, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 39, caracterizada pelo fato de que o domínio D1 da proteína de fusão compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% idêntica à enzima madura definida por SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:5

41. Variante D1, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que a variante D1 tem atividade de degradação de DNA de pelo menos 80% em comparação com a proteína D1 tipo selvagem de SEQ ID NO: 1.

42. Variante D1, de acordo com a reivindicação 40 ou 41, caracterizada pelo fato de que a variante D1 compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 98% idêntica à enzima de SEQ ID NO:1.

43. Variante D1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% idêntica à enzima definida por SEQ ID NO: 1 e tendo uma conjugação de PEG com o aminoácido correspondente a C123 e/ou C126.

44. Variante 1 tipo DNase1 (D1L1), caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% idêntica à enzima definida por SEQ ID NO: 2 com um ou mais resíduos de cisteína deletados ou substituídos.

45. Variante D1L1, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que pelo menos um resíduo de cisteína substituído ou deletado é a posição correspondente a C22 ou C50 de SEQ ID NO:2.

46. Variante D1L1, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que os um ou mais dos resíduos de cisteína substituídos são substituídos por um aminoácido que é Gly, Arg ou Ser.

47. Variante D1L1, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 46, caracterizada pelo fato de que a variante D1L1 compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 98% idêntica à enzima de SEQ ID NO: 2.

48. Variante D1L1, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 47, caracterizada pelo fato de que a variante é uma proteína de fusão compreendendo uma sequência de aminoácido de albumina e, opcionalmente, um ligante peptídico entre um domínio D1L1 e um domínio de albumina.

49. Variante D1L1, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que o domínio de albumina está localizado no lado N-terminal do domínio D1L1.

50. Variante D1L1, de acordo com a reivindicação 48 ou 49, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão compreende um ligante peptídico, em que o ligante peptídico é um ligante flexível, um ligante rígido ou um ligante clivável por protease.

51. Variante D1L1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% idêntica à enzima definida por SEQ ID NO: 2 e tendo uma conjugação de PEG com o aminoácido correspondente a C22 e/ou C50.

52. Variante 2 tipo DNase1 (D1L2), caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% idêntica à enzima definida por SEQ ID NO: 3 com um ou mais resíduos de cisteína substituídos ou deletados.

53. Variante D1L2, de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que o resíduo de cisteína correspondente a C43 de SEQ ID NO: 3 é substituído ou deletado.

54. Variante D1L2, de acordo com a reivindicação 52 ou 53, caracterizada pelo fato de que um ou mais dos resíduos de cisteína substituídos são substituídos por um aminoácido que é Gly, Arg ou Ser.

55. Variante D1L2, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 54, caracterizada pelo fato de que a variante D1L2 compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 98% idêntica à enzima de SEQ ID NO: 2.

56. Variante D1L2, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 55, caracterizada pelo fato de que a variante é uma proteína de fusão compreendendo uma sequência de aminoácido de albumina e, opcionalmente, um ligante peptídico entre um domínio D1L2 e um domínio de albumina.

57. Variante D1L2, de acordo com a reivindicação 56, caracterizada pelo fato de que o domínio de albumina está localizado no lado N-terminal do domínio D1L2.

58. Variante D1L2, de acordo com a reivindicação 56 ou 57, caracterizada pelo fato de que um ligante peptídico é interposto entre o domínio de albumina e o domínio D1L2.

59. Variante D1L2, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que o ligante peptídico é um ligante flexível, um ligante rígido ou um ligante clivável por protease.

60. Variante D1L2, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% idêntica à enzima definida por SEQ ID NO: 3 e tendo uma conjugação de PEG com o aminoácido correspondente a C43.

61. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que codifica a variante D1, D1L1, D1L2 ou D1L3 de qualquer uma das reivindicações 1 a 60.

62. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é um mRNA.

63. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é DNA.

64. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 61 a 63.

65. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor da reivindicação 64.

66. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que é modificada para expressar variante D1, D1L1, D1L2 ou D1L3 de qualquer uma das reivindicações 1 a 60.

67. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a variante D1, D1L1, D1L2 ou D1L3 de qualquer uma das reivindicações 1 a 60, o polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 61 a 63, o vetor da reivindicação 64 ou a célula hospedeira da reivindicação 65 ou 66 e um transportador farmaceuticamente aceitável.

68. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que é formulada para administração tópica, parenteral ou pulmonar.

69. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato de que é formulada para administração intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intra- articular, intravenosa, subcutânea, intra-arterial, oral, sublingual, pulmonar ou transdérmica.

70. Método para tratar um sujeito em necessidade de degradação de DNA extracelular, degradação de cromatina extracelular, degradação de armadilha extracelular (ET) e/ou degradação de armadilha extracelular de neutrófilo (NET), o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de qualquer um das reivindicações 67 a 69.

71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem uma mutação de perda de função no gene D1L3.

72. Método, de acordo com a reivindicação 70 ou 71, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem uma condição selecionada de neutrofilia crônica, agregação de neutrófilo ou leucostase, trombose ou oclusão vascular, lesão de isquemia-reperfusão, lesão de tecido cirúrgica ou traumática, uma reação ou doença inflamatória aguda ou crônica, uma doença autoimune, doença cardiovascular, doença metabólica, inflamação sistêmica, doença inflamatória do trato respiratório, doença inflamatória renal, doença inflamatória relativa a tecido transplantado e câncer.

73. Método, de acordo com a reivindicação 70 ou 71, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem, ou está em risco de ter, NETs obstruindo sistemas ductais, em que a condição é opcionalmente selecionada de pancreatite, colangite, conjuntivite, mastite, doença do olho seco, obstruções de vas deferens e doença renal.

74. Método, de acordo com a reivindicação 70 ou 71, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem, ou está em risco de ter, NETs acumulando em superfícies endoteliais.

75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 74, caracterizado pelo fato de que a variante D1L3 é uma proteína de fusão compreendendo uma sequência de aminoácido de albumina e que é administrada parenteralmente ao sujeito, em que a administração é aproximadamente semanal.

76. Método para produzir uma variante DNase recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar células expressando um polinucleotídeo codificando a variante DNase e recuperar a proteína recombinante.

77. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que as células são Pichia pastoris.

78. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que as células Pichia pastoris têm uma deleção ou inativação genética ou inibição farmacológica de proteinase 3 aspártica e/ou Kexin.

79. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que as células são células CHO.

80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que as células CHO têm uma deleção ou inativação genética, ou inibição farmacológica de Furin protease.

81. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76 a 80, caracterizado pelo fato de que a variante DNase é uma variante D1L3 compreendendo uma ou mais mutações de um resíduo básico emparelhado, o resíduo básico emparelhado correspondendo a uma posição selecionada de K50/R51, R80/R81, K114/R115, K199/K200, K226/K227, K291/K292, R297/K298/K299, e K303/R304 de SEQ ID NO:4.

82. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais mutações de um resíduo básico emparelhado incluem uma substituição de aminoácido selecionada de R114T, R114A, R114D, R114Q, K227S e K227E.

83. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais mutações de um resíduo básico emparelhado incluem uma substituição de aminoácido selecionada de R51K, R81K, R115K e R304K.

84. Método para produzir um membro da família de proteína D1 recombinante ou variante da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar células expressando um polinucleotídeo codificando a variante DNase na presença de um composto de poliânion e recuperar a proteína recombinante.

85. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que o membro da família de proteína D1 recombinante é uma variante de D1, D1L3, D1L1 ou D1L2.

86. Método, de acordo com a reivindicação 84 ou 85, caracterizado pelo fato de que o poliânion é selecionado de um ou mais de sulfato de dextrano, heparinas, citrato férrico e EDTA.

87. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que o poliânion é sulfato de dextrano.

88. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 87, caracterizado pelo fato de que as células são procarióticas ou eucarióticas.

89. Método, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que a DNase é expressa usando um sistema de expressão de não mamífero que é opcionalmente Pichia pastoris, Saccharomyces spp ou Escherichia coli.

90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o sistema de expressão é Pichia pastoris.

91. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que as células de Pichia pastoris têm uma deleção ou inativação genética ou inibição farmacológica de proteinase aspártica 3 e/ou Kexin.

92. Método, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que as células são células CHO.

93. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que as células CHO têm uma deleção ou inativação genética, ou inibição farmacológica de Furin protease.

94. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 93, caracterizado pelo fato de que o membro da família D1 recombinante compreende uma fusão de albumina no N-terminal através de um ligante peptídico.

95. Método, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que o ligante é um ligante flexível.

96. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que o ligante é um ligante clivável, opcionalmente clivável por uma protease de via de coagulação ou uma protease de neutrófilo.

97. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que a protease de fator de coagulação é Fator XII.

98. Método, de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo fato de que o ligante peptídico é selecionado de todo ou parte do sítio de clivagem de FXII no Fator XI ou pré- calicreína.

99. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 98, caracterizado pelo fato de que o membro ou variante da família D1 recombinante é expresso com um construto que codifica um peptídeo sinal que direciona secreção da proteína recombinante das células.

100. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 99, caracterizado pelo fato de que o membro ou variante da família D1 recombinante é purificado do composto de poliânion usando uma resina de troca aniônica.

101. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que o membro ou variante da família D1 recombinante é purificado adicionalmente usando uma resina de troca catiônica.