ES2524886T3

ES2524886T3 - Preparados de fibrinógeno enriquecidos en fibrinógeno con una cadena alfa extendida

Info

Publication number: ES2524886T3
Application number: ES11700052.1T
Authority: ES
Inventors: Joseph Grimbergen; Jacob Koopman; Abraham Bout
Original assignee: Profibrix BV
Current assignee: Profibrix BV
Priority date: 2010-01-08
Filing date: 2011-01-07
Publication date: 2014-12-15
Anticipated expiration: 2031-01-07
Also published as: US10004787B2; AU2011204557A1; US20160158323A1; JP2013516443A; CN102724995B; US9694054B2; JP5960606B2; AU2011204557B2; EP2521566B1; EP2521566A2; US20170266262A1; CA2785594A1; US20130011382A1; CN102724995A; DK2521566T3; WO2011083153A2; WO2011083153A3; CA2785594C; JP2016216476A

Abstract

Un preparado de fibrinógeno que contiene al menos 95% (p/p) de fibrinógeno basado en la proteína total, y en donde al menos 10% (p/p) del fibrinógeno está en forma de Fib420, para uso en un método para tratar episodios de hemorragia aguda, hiperfibrinolisis, deficiencia en fibrinógeno u otros trastornos hemorrágicos, y en donde el Fib420 se prepara mediante tecnología recombinante.

Description

Preparados de fibrinógeno enriquecidos en fibrinógeno con una cadena alfa extendida

Campo de la invención

La presente invención se refiere a preparados de fibrinógeno y al uso de preparados de fibrinógeno en aplicaciones médicas. En particular, se refiere al uso de preparados de fibrinógeno que están enriquecidos en fibrinógeno con una cadena alfa extendida.

Antecedentes de la invención

El fibrinógeno es una glicoproteína del plasma soluble que se sintetiza en el cuerpo humano, principalmente por parte de células del parénquima del hígado. Es una molécula dimérica, que consiste en dos pares de tres cadenas polipeptídicas designadas A, B y , que están conectados por puentes disulfuro. Las tres cadenas polipeptídicas son codificadas por tres genes separados. La forma predominante (HMW fib) alberga una cadena A que se sintetiza como un precursor de 625 aminoácidos y está presente en el fibrinógeno encontrado en el plasma sanguíneo como una cadena polipeptídica de 610 amino ácidos, la cadena B contiene 461 y la cadena  411 aminoácidos. Los tres polipéptidos se sintetizan individualmente a partir de 3 ARNms. El ensamblaje de las tres cadenas componentes (A, B y ) en su forma final como un dímero de seis cadenas (A, B, )2 se produce en el lumen del retículo endoplasmático (ER -siglas en inglés).

El fibrinógeno circula en la sangre en concentraciones altas (1-2 g/L) y demuestra un alto grado de heterogeneidad. Se estima que en cada individuo circulan aproximadamente un millón de diferentes moléculas de fibrinógeno. La mayoría de estas variantes, que representan sólo una pequeña porción del fibrinógeno total (en la mayoría de los casos no más de unos pocos porcentajes), difieren en la función y estructura.

La proteólisis de la parte carboxi-terminal de la cadena A resulta en tres formas circulantes de fibrinógeno principales que tienen claramente diferentes pesos moleculares. El fibrinógeno se sintetiza en la forma de alto peso molecular (HMW; peso molecular 340 kDa; la forma predominante de cadenas A en la circulación contiene 610 aminoácidos). La degradación de una de las cadenas A da lugar a la forma LMW (PM = 305 kDa); la forma LMW’ (270 kDa) es la variante en la que las dos cadenas de A están parcialmente degradadas en el extremo carboxi. En la sangre de individuos sanos, 50 -70% del fibrinógeno es HMW, 20 -50% es fibrinógeno con una o dos cadenas A degradadas (de Maat y Verschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12, 377). Las variantes HMW y LMW’ muestran claras diferencias en el tiempo de coagulación y en la estructura de polímero de fibrina (Hasegawa N, Sasaki S. (1990) Thromb. Res. 57, 183).

Variantes bien conocidas que son el resultado de corte y empalme alternativo son las llamadas variante gamma prima (') y la variante -ext Fib o Fib420.

La variante -ext Fib o Fib420, que tiene un peso molecular de 420 kDa, representa el 1-3% del fibrinógeno circulante total (de Maat y Verschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12, 377). La isoforma -ext Fib extendida se distingue de la cadena  convencional de fibrinógeno por la presencia de un dominio globular en el extremo C de 236 residuos adicional debido al corte y empalme alternativo. En la bibliografía se dan datos contradictorios sobre la función y las características de Fib420. Sobre la base de estudios con -ext Fib derivada de plasma, Applegate et al, Blood (2000) 95: 2297, llegaron a la conclusión de que las propiedades de polimerización y reticulación de un -ext Fib no son totalmente diferentes de HMW Fib derivada de plasma. Concluyen que el dominio C adicional no tiene efecto alguno sobre la coagulación y sugieren que la función del dominio puede ser para apoyar la adhesión celular mediada por la integrina. En el documento EP 1 495 051 se sugiere que Fib420 podría ser menos sensible a la degradación y podría tener un efecto sobre la estructura del coágulo. Sin embargo, no se da justificación alguna y no hay sugerencia alguna en cuanto a si el efecto puede ser una mejora o un deterioro en la estructura o resistencia del coágulo. Mosesson et al. (Biophys. Chem. 112, 209: 2004) han estudiado la ultraestructura de los coágulos que se basan en -ext Fib derivada de plasma del cordón umbilical. Informaron que las fibras de los coágulos de -ext Fib son más delgadas y están más ramificadas que las basadas en fibrinógeno HMW, pero tienen la misma periodicidad que caracteriza a todas las fibras de fibrina. Los autores sugieren que la probable función para la cadena  extendida en -ext Fib es proporcionar sitios para la interacción con integrinas celulares.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a un preparado de fibrinógeno que contiene al menos 95% (p/p) de fibrinógeno basado en la proteína total, y en donde al menos el 10% del fibrinógeno está en forma de Fib420, para uso en un método para tratar episodios de hemorragia aguda, hiperfibrinolisis, deficiencia en fibrinógeno u otros trastornos

hemorrágicos, y en donde el Fib420 se prepara mediante tecnología recombinante.

En el sector, a Fib420 también se le alude como '-ext Fib', 'fibrinógeno con una cadena alfa extendida" o "fibrinógeno420'. En el presente contexto, estos términos y expresiones se utilizan indistintamente. Todos estos términos y expresiones se refieren a una molécula simétrica de la estructura (Aext, B, ), en donde tanto las cadenas  de fibrinógeno convencionales tal como se encuentran en HMW fib, han sido reemplazados por cadenas alfa extendidas.

En el presente contexto, la expresión ‘preparado de fibrinógeno' se refiere al fibrinógeno en forma aislada, por ejemplo, a un aislado de plasma o aislado de sobrenadante celular de fibrinógeno. También puede referirse a un preparado sintético de fibrinógeno. Un preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con la invención es un preparado puro en el que sustancialmente no están presentes contaminantes tales como proteínas y contiene preferiblemente al menos 95% p/p, por lo menos 96% p/p, por lo menos 97% p/p o por lo menos 98% p/p de fibrinógeno, basado en la proteína total. Lo más preferiblemente, un preparado de fibrinógeno de acuerdo con la invención comprende al menos 99% p/p o al menos 99,5% p/p de fibrinógeno, basado en la proteína total. Preparados de fibrinógeno puros de este tipo son particularmente adecuadas para formular composiciones que se utilizan en aplicaciones médicas, es decir, composiciones para tratar episodios de hemorragia aguda, hiperfibrinolisis, deficiencia en fibrinógeno u otros trastornos hemorrágicos.

De acuerdo con la invención, al menos 10% p/p del fibrinógeno en el preparado está en forma de Fib420. Preferiblemente, al menos 15% p/p, por lo menos 20% p/p, por lo menos 25% p/p o por lo menos 30% p/p del fibrinógeno está en forma de Fib420. Más preferiblemente, por lo menos 40% p/p, por lo menos 50% p/p, por lo menos 60% p/p, por lo menos 70% p/p, por lo menos 80% p/p o por lo menos 90% p/p está en forma de Fib420. Lo más preferiblemente, por lo menos 95% p/p, por lo menos 99% p/p o todo el fibrinógeno está en forma de Fib420. Una ventaja del preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con la invención es que la digestión mediada por plasmina del preparado de fibrinógeno es más lenta que para el fibrinógeno derivado del plasma. Su mayor resistencia a la digestión por plasmina es probable que sea beneficiosa para el tratamiento de pacientes que padecen hiperfibrinolisis, que a menudo se observa en casos de coagulopatía adquirida.

Esto significa que la estabilidad del coágulo de fibrina se mejora debido al uso de acuerdo con la invención y que el preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con la invención es más potente que los preparados del estado de la técnica. El uso de un preparado de fibrinógeno más potente permite la reducción tanto de la cantidad de fluido como la cantidad de proteína terapéutica a administrar. Esto es una ventaja para el uso por vía intravenosa para tratar la coagulopatía dilucional. Actualmente, para la inyección intravenosa (i.v.) de fibrinógeno para compensar la baja actividad de coagulación de la sangre, se requieren altas dosis de fibrinógeno (~ 5 gramos de fibrinógeno por tratamiento). Éste se administra mediante inyección directa a una dosis de 70 mg/kg. Dado que el fibrinógeno, en general, puede ser disuelto en una concentración máxima de 20 mg/ml, esto significa que aproximadamente 250 ml de fluido tienen que ser administrados por vía intravenosa a un adulto. Sería beneficiosa la reducción de esta dosis, proporcionando un fibrinógeno más potente.

Sin embargo, otra ventaja es que, debido al uso de acuerdo con la invención, la formación del coágulo es menos dependiente del factor XIII, dependiendo de cuando se utilicen preparados de fibrinógeno derivado del plasma o fibrinógeno HMW. No se requiere factor XIII para formar coágulos firmes. Por lo tanto, en una realización, el preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con la invención está libre de factor XIII.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende un preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con la invención. Además del fibrinógeno, la composición puede comprender un activador, tal como trombina o una proteína similar a la trombina tal como reptilasa. También puede comprender excipientes que son adecuados para su uso en un preparado inyectable. El preparado puede estar en forma seca y subsiguientemente ser reconstituido, p. ej., con solución salina tamponada, y similares, o puede estar en forma líquida, ya sea como una suspensión o disolución. Materiales excipientes adecuados pueden incluir disolventes y co-disolventes tales como etanol, glicerol, PEG, aceites, y similares; agentes solubilizantes, humectantes, de suspensión, emulsionantes o espesantes tales como carboximetilcelulosa, gelatina hidrolizada, pluronics, polisorbatos, y similares; agentes quelantes tales como EDTA de calcio, DTPA, y similares; antioxidantes y agentes reductores tales como BHT, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio, y similares; conservantes antimicrobianos tales como alcohol bencílico, fenol, parabenos, y similares; tampones y agentes de ajuste del pH, tales como trometamina, fosfato de sodio, acetato de sodio, hidróxido de sodio, y similares; agentes de carga, protectores y ajustadores de tonicidad tales como alanina, albúmina, dextrano, lactosa, sorbitol, cloruro de sodio, histidina, y similares; aditivos especiales tales como simeticona como agente anti-espumante, trehalosa para la reducción de la agregación de proteínas.

La composición que comprende un preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con la invención es una composición farmacéutica y comprende un soporte farmacéuticamente aceptable. "Soporte farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo, agente auxiliar, adyuvante, diluyente, excipiente o soporte con el que se

administra el preparado de fibrinógeno de la invención. Ejemplos de soportes farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación, agua, solución salina tamponada, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares), dimetilsulfóxido (DMSO), aceites, detergentes, agentes de suspensión o mezclas adecuadas de los mismos. Soportes y formulaciones farmacéuticamente aceptables adecuados se describen en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19ª Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995) y "Remington: The Science And Practice Of Pharmacy " por Alfonso R. Gennaro (Lippincott Williams & Wilkins, 2005).

La composición farmacéutica que comprende un preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con la invención puede ser aplicada por vía tópica y puede incluir soportes que son solubles en agua, absorbentes de agua, insolubles en agua o expandibles en agua. Materiales adecuados incluyen sacáridos tales como mono-y disacáridos, incluidos lactosa, manitol y trehalosa, o dextrano y polímeros de dextrano tales como, p. ej., Sephadex, que están disponibles en diferentes tamaños de partículas, almidones, derivados de pululano, ésteres de ácido hialurónico, y similares. Productos de celulosa tales como celulosa microcristalina (gama Avicel), metilcelulosa, carboximetil-celulosa, celulosa microfina o hidroxipropil-celulosa, y otros materiales tales como polivinilpirrolidona (PVP) reticulada, se pueden utilizar solos o en mezcla. También, vehículos adecuados incluyen polietilenglicol (PEG), que tiene preferiblemente un peso molecular de aproximadamente 1000; polivinilpirrolidona (PVP), que tiene preferiblemente un peso molecular medio de aproximadamente 50.000; poli(ácido acrílico), PVA, poli (metilviniléter co-anhídrido maleico), poli(óxido de etileno), y dextrano, que tienen típicamente un peso molecular medio de aproximadamente 40.000. Gomas y agentes gelificantes que pueden usarse incluyen, por ejemplo, tragacanto, goma karaya, almidón soluble, gelatina, pectina, goma guar y goma gellan.

Un aditivo particularmente preferido es Emdex®, es decir, una forma hidratada de dextratos (dextrosa cristalizada en aerosol que contiene pequeñas cantidades de oligosacáridos de almidón). Es un producto altamente refinado compuesto de esferas macroporosas blancas, libremente fluyentes y cristalizadas en aerosol con un tamaño medio de partícula de 190-220 µm.

Un aditivo más preferido es NON-PAREIL SEEDS®: (Esferas de azúcar). Éstas se utilizan en múltiples unidades de fármacos para mejorar la uniformidad del contenido, la liberación consistente y controlada de fármaco y alta estabilidad del fármaco, intervalos de tamaño de 200 a 2000 mm.

La composición farmacéutica que comprende un preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con la invención es adecuada para la administración intravenosa.

Un preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con la invención se puede utilizar para la preparación de un medicamento para el tratamiento de episodios de hemorragia aguda, hiperfibrinolisis, deficiencia en fibrinógeno, ya sea adquirida o congénita, u otros trastornos hemorrágicos.

Con el fin de producir un -ext Fib de una manera económicamente viable, se requieren altos niveles de expresión de fibrinógeno intacto, funcional y, por lo tanto, se emplea la producción recombinante. En el contexto de la presente invención, fibrinógeno o una cadena de fibrinógeno está 'en forma intacta' cuando la secuencia de aminoácidos contiene todos los aminoácidos que fueron codificados por la secuencia de nucleótidos, opcionalmente sin los aminoácidos que se separan durante el procesamiento celular normal (secreción). Por lo tanto, las cadenas de alfaext que tienen 866 u 847 aminoácidos son ejemplos de una cadena alfa en forma intacta.

La producción recombinante de fibrinógeno tiene muchas ventajas con respecto al uso de materiales derivados de plasma. Estos incluyen su perfil de seguridad preferido, la posibilidad de hacer preparados homogéneos puros de variantes libres de cualquier otro contaminante que proceda de la sangre y el suministro ilimitado. Además, para aplicaciones específicas (p. ej., uso de fibrinógeno como un hemostato intravenoso) se requieren modificaciones post-traducción apropiadas (p. ej., glicosilación). Por lo tanto, se prefiere la expresión en sistemas eucarióticos, en particular, sistemas de mamíferos, más en particular en sistemas de seres humanos.

En una realización preferida, una preparación de fibrinógeno para uso de acuerdo con la invención se prepara por un método que comprende las etapas de: -proporcionar un vector de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos, secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena de polipéptidos alfa extendida de fibrinógeno; -transformar una célula eucariota con el vector de expresión; -mantener la célula eucariótica transformada en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena de polipéptidos alfa extendida de fibrinógeno.

Vectores de expresión para hospedantes eucariotas son conocidos en la técnica y se puede utilizar cualquiera de los vectores convencionalmente utilizados para la expresión en células eucariotas. Un vector de expresión contiene típicamente un promotor enlazado operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos a ser expresada y sitios de unión al ribosoma, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores

aguas arriba y potenciadores. En una realización, se utiliza un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como por células CHO o PER.C6®. Tales vectores se conocen en la técnica y ejemplos adecuados incluyen plásmidos pcDNA3.1, GATEWAY (Invitrogen), pCMV/Bsd (Invitrogen), vectores pFN (Promega) y numerosos otros sistemas de vectores.

En el presente contexto, ‘una cadena de polipéptidos alfa extendida de fibrinógeno' puede referirse a una cadena alfa de fibrinógeno de 866 aminoácidos con una secuencia señal, o a una sin una secuencia señal y a cualesquiera variantes de la misma que han surgido a través de polimorfismos genéticos o diferencias en la glicosilación y fosforilación. Un ejemplo adecuado de una secuencia de aminoácidos de la cadena alfa extendida se da en SEQ ID Nº 1. Las expresiones ‘cadena alfa' y ‘cadena A' se utilizan indistintamente en el contexto de la presente invención.

La persona experta entenderá que la célula eucariota también debe contener secuencias de ácidos nucleicos que codifican las cadenas beta y gamma del fibrinógeno para que sea capaz de producir una molécula de fibrinógeno. La producción recombinante de fibrinógeno a partir de cadenas alfa, beta y gamma se han descrito antes, véase, por ejemplo, el documento PCT/EP2009/058754, US 6.037.457 o WO 95/023868.

En el contexto de la presente invención, las expresiones ‘cadena beta' y 'cadena B' se utilizan indistintamente. Pueden referirse tanto a tipo salvaje como a variantes de la cadena beta, con o sin la secuencia señal. Un ejemplo adecuado de una secuencia de aminoácidos de la cadena beta de fibrinógeno se da en SEQ ID Nº 2.

En el contexto de la presente invención, el término ‘cadena gamma' y 'cadena 'se utilizan indistintamente. Pueden referirse tanto a tipo salvaje como a variantes de la cadena gamma, con o sin la secuencia señal. Ejemplos adecuados de una secuencia de aminoácidos de la cadena gamma de fibrinógeno se dan en SEQ ID Nº 3 y 4.

Preferiblemente, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican una cadena de fibrinógeno están optimizadas. Una secuencia de ácido nucleico optimizada permite la expresión eficaz de fibrinógeno recombinante en forma intacta. Preferiblemente, están optimizadas para la expresión en un sistema de cultivo celular eucariótico, tal como para la expresión en un sistema de cultivo de células COS, células BHK, células NS0, células Sp2/0, células CHO, una célula PER.C6, una célula HEK293 o de células de insecto. Más preferiblemente, están optimizados para la expresión en un sistema de cultivo de células de mamíferos. Lo más preferiblemente, las secuencias de ácidos nucleicos están optimizadas para la expresión en un sistema de cultivo de células humanas tal como para un sistema de cultivo de células PER.C6 o un sistema de cultivo de células HEK293. La secuencia de nucleótidos que está optimizada puede ser ADN o ARN. Preferiblemente, es ADNc.

Una secuencia de nucleótidos optimizada que codifica una cadena alfa extendida, beta o gamma de fibrinógeno muestra una identidad de al menos el 70% con su respectivo homólogo no optimizado. En una realización, una secuencia de nucleótidos optimizada que codifica una cadena -ext Fib, B y  de fibrinógeno muestra una identidad del 70-80% con sus respectivas secuencias no optimizadas. Preferiblemente, las secuencias de nucleótidos optimizadas que codifican una cadena alfa extendida, beta o gamma de fibrinógeno no contienen sitios que actúan en cis tales como los sitios de corte y empalme y señales poli(A).

Una secuencia de nucleótidos optimizada para uso de acuerdo con la invención y que codifica una cadena alfa extendida de fibrinógeno no contiene 39 pares de bases de secuencias de repetición directa que normalmente están presentes en el gen que codifica la cadena alfa del fibrinógeno humano. La secuencia de repetición debe ser cambiada sin cambiar la secuencia de proteínas codificada.

En una realización preferida, se utiliza una secuencia de nucleótidos optimizada de acuerdo con SEQ ID Nº 5 o la parte de esta secuencia sin la señal (nucleótidos 60 -2598) para expresar la cadena alfa extendida.

En otra realización preferida, se utiliza una secuencia de nucleótidos optimizada de acuerdo con SEQ ID Nº 6 o la parte de esta secuencia sin la secuencia señal (nucleótidos 93-1473) para expresar la cadena beta.

En otra realización preferida, se utiliza una secuencia de nucleótidos optimizada de acuerdo con SEQ ID Nº 7 u 8 o la parte de estas secuencias sin una secuencia señal (nucleótidos 51-1311 de SEQ ID Nº 7 y nucleótidos 51-1359 de SEQ ID Nº 8) para expresar la cadena gamma.

Secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden codificar cualquier tipo de cadenas de fibrinógeno. Preferiblemente, codifican las cadenas de fibrinógeno de mamífero, más preferiblemente codifican cadenas de fibrinógeno de primates, lo más preferiblemente codifican cadenas de fibrinógeno humano. También son posibles combinaciones tales como, por ejemplo, una o dos cadenas de fibrinógeno de mamífero en combinación con una o dos cadenas de fibrinógeno de roedores. La expresión recombinante para uso de acuerdo con la presente invención permite niveles de expresión de Fib420 que son similares a los de HMWFib recombinante.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 Análisis de transferencia Western. La pista 1 es un control que contiene fibrinógeno de tipo salvaje derivado de plasma (FIB3, Enzyme Research Laboratories). La pista 2 contiene el sobrenadante del cultivo del clon W115, clones PER.C6 que expresan un -ext rhFib. El marcador de peso molecular (MW) se indica a la izquierda.

Figura 2 La imagen muestra un gel de proteína teñido con Coomassie cargado con material de material derivado de plasma degradado con plasmina (ERL FIB3; panel superior, y -ext Fib (panel inferior). Las condiciones se indican en la parte superior del gel; y se muestra también el tiempo de incubación (0, 1, 5, 30, 60 y 120 minutos y o/n (durante la noche)). A la derecha del gel se muestra el marcador PM.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 Preparación de construcciones de ADNc optimizadas

ADNcs que codifican cadenas de polipéptidos de fibrinógeno humanos de -ext Fib (Fib420), B y  se sintetizaron en formato optimizado en codones por GeneArt (Regensburg, Alemania): (i) se separaron sitios de actuación cis (sitios de corte y empalme, señales poli(A)); (ii) se modificó la secuencia de repetición de la cadena A; (iii) se incrementó el contenido de GC para la semivida prolongada del ARNm; (iv) se adaptó el uso de codones a CHO (índice de adaptación de codones -CAI-> 0,95). Los ADNcs optimizados en codones para la cadena -ext Fib (SEQ ID Nº 5), B (SEQ ID Nº 6) y  (SEQ ID Nº 6) se subclonaron en derivados de pcDNA3.1. A-extendido (Fib420) en pcDNA3.1(+)neo, cadenas B en pcDNA3.1(+)hygro y cadena  en pcDNA3.1(-)hygro (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.).

Ejemplo 2 líneas de células PER.C6 que expresan -ext Fib humana recombinante.

La generación de líneas celulares PER.C6 productoras de fibrinógeno humano recombinante es similar a la descrita antes en el documento PCT/EP2009/058754. En resumen, las células se cultivaron en suspensión en medio MAb y se transfectaron utilizando el dispositivo de nucleofección AMAXA (programa A-27) y utilizando el Nucleofector kit T con tres vectores que codifican las tres cadenas diferentes de la proteína fibrinógeno humano (cadenas A-ext, B y ) y que contiene las cadenas de ADNc optimizado (SEQ ID Nº 5, SEQ ID Nº 6 y SEQ ID Nº 7, respectivamente).

Después de la transfección y la extensión en placas de 96 pocillos, se transfirieron 325 clones y se seleccionaron en placas de 48 pocillos. Al final de la trayectoria de expansión, se transfirieron 24 clones a matraces con agitador, de los cuales 8 fueron seleccionados para el análisis de la estabilidad y la expresión en el ensayo de cultivo en tandas continuo.

Los rendimientos en cultivo en tandas eran similares a los rendimientos obtenidos con las líneas celulares que expresan la cadena A en formato de 610 ó 625 aminoácidos, lo que indica que la extensión de la cadena A no afecta los niveles de expresión. Esto no se esperaba de antemano, ya que el fibrinógeno derivado de plasma sólo contiene 1-3% de la cadena A extendida en comparación con el fibrinógeno con contenido en la cadena A 610/625. El análisis de proteínas utilizando SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia Western indican que el fibrinógeno recombinante se produce en formato intacto, teniendo la cadena  el tamaño esperado (Figura 1).

Ejemplo 3 Purificación de fibrinógeno -extendido a partir de medio de cultivo de células PER.C6.

Fibrinógeno -extendido recombinante humano se purificó a partir de sobrenadante de cultivo celular de acuerdo con métodos estándar. En síntesis, (NH4)2SO4 se añadió al sobrenadante del cultivo a una saturación del 40% y el precipitado se recogió mediante centrifugación. Subsiguientemente, el precipitado se disolvió en tampón de carga TMAE (Tris-HCl 5 mM pH 8,5, Tween-20 al 0,01%), seguido de diálisis para el mismo tampón. A continuación, la disolución de proteínas se cargó en una columna de intercambio de iones Fractogel EMD TMAE (m) 40-90 µm (3 ml) (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). Fibrinógeno -extendido recombinante humano se eluyó subsiguientemente utilizando un gradiente de sal continuo de NaCl 0 -1 M en 20 volúmenes de columna. Fibrinógeno recombinante humano en las fracciones de los picos se precipitó de nuevo añadiendo (NH4)2SO4 a una saturación del 40% y se recogió mediante centrifugación. Finalmente, el material se disolvió en TBS (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM) y se dializó frente a TBS para separar cualquier (NH4)2SO4 restante.

Ejemplo 4 Digestión de plasmina de -ext rhFib y fibrinógeno derivado del plasma.

La fibrinogenolisis de -ext rhFib humano purificado recombinante se sometió a ensayo mediante incubación con plasmina. En síntesis, el fibrinógeno se diluyó en TBST (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, Tween-20 al

0,01%), se añadió CaCl2 o EDTA (concentración final 5 mM) y se añadió plasmina (concentración final 10 nM), seguido de incubación a 37ºC. A diferentes intervalos de tiempo se tomaron muestras y se mezclaron inmediatamente con tampón de muestra de SDS-PAGE (tampón de muestra NuPAGE LDS, Invitrogen, nº de cat NP0007). Las muestras se sometieron entonces a separación por tamaño en un gel de SDS-PAGE no reducido

5 (NuPAGE Tris-Acetato al 3-8%, Invitrogen, nº de cat WG1602). La proteína se visualizó mediante tinción de Coomassie (SimplyBlue SafeStain, Invitrogen, nº de cat LC6060).

Los resultados, tal como se muestran en la Figura 2, indican que la digestión mediada por plasmina de -ext rhFib es significativamente más lenta que para el fibrinógeno derivado del plasma. Por ejemplo, en presencia de Ca2+,

10 después de 60 minutos, todo el fibrinógeno derivado del plasma se degrada a las especies de fragmentos D y E. Para -ext rhFib esto supone más de 120 minutos y sólo la incubación durante una noche muestra la generación de cantidades sustanciales de fragmento E, que ya están presentes en el producto de digestión del fibrinógeno derivado del plasma después de 30 minutos.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110>: ProFibrix BV

5: <120> Preparados de fibrinógeno enriquecidos en fibrinógeno con una cadena alfa extendida

<130>: P631WO

10: <140> <141> PCT/EP2011/050191

<150> <151>: EP10150391.0

15: <160> 8

<170>: PatentIn versión 3.3

20: <210> <211> <212> <213> 1 866 PRT Homo sapiens

25: <400> 1

<210> 2

<211> <212> <213>: 491 PRT Homo sapiens

5: <400> 2

5: <210> <211> <212> <213> 3 437 PRT Homo sapiens

<400>: 3

5: <210> <211> <212> <213> 4 453 PRT Homo sapiens

<400>: 4

5: <210> <211> <212> <213> 5 2598 ADN Homo sapiens

<400>: 5

5: <210> <211> <212> <213> 6 1473 ADN Homo sapiens

<400>: 6

5: <210> <211> <212> <213> 7 1311 ADN Homo sapiens

<400>: 7

5: <210> <211> <212> <213> 8 1359 ADN Homo sapiens

<400>: 8

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un preparado de fibrinógeno que contiene al menos 95% (p/p) de fibrinógeno basado en la proteína total, y en donde al menos 10% (p/p) del fibrinógeno está en forma de Fib420, para uso en un método para tratar episodios de hemorragia aguda, hiperfibrinolisis, deficiencia en fibrinógeno u otros trastornos hemorrágicos, y en donde el Fib420

5 se prepara mediante tecnología recombinante.
2. Un preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el Fib240 se prepara mediante un método que comprende:

-

proporcionar un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena de

10 polipéptidos alfa extendida de fibrinógeno; -transformar una célula de mamífero con el vector de expresión; -mantener la célula de mamífero transformada en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena de polipéptidos alfa extendida de fibrinógeno.

15 3. Un preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica una cadena de polipéptidos alfa extendida de fibrinógeno está optimizada para la expresión en un sistema de cultivo de células de mamífero.
4. Un preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en donde la secuencia de

20 nucleótidos es una secuencia optimizada de acuerdo con SEQ ID Nº 5.
5. Un preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con las reivindicaciones 2-4, en donde la célula de mamífero es una célula humana.

25 6. Un preparado de fibrinógeno para uso de acuerdo con las reivindicaciones 2-5, en donde la célula de mamífero es una célula PER.C6.