KR20210072790A - 제조 및 치료를 위한 dnase 효소의 엔지니어링 - Google Patents

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KR20210072790A
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토비아스 에이. 푹스
알. 압둘 하킴
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뉴트롤리스 인코포레이티드
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Abstract

본 개시 내용은 엔지니어링된 인간 세포외 DNASE 단백질 (예를 들어, DNASE1 (D1), DNASE1-유사 1 (D1L1), DNASE1-유사 2 (D1L2), DNASE1-유사 3 이소폼 1 (D1L3), DNASE1-유사 3 이소폼 2 (D1L3-2), DNASE2A (D2A) 및 DNASE2B (D2B)의 변이체)을 제공하고, 호중구 세포외 트랩 (NET) 축적 및/또는 방출을 특징으로하는 병태를 치료하는데 유용하다. 본 발명에 따르면, DNase 변이체는 치료 및/또는 대규모 제조를 위한 이점을 갖는다.

Description

제조 및 치료를 위한 DNASE 효소의 엔지니어링
관련출원
본 출원은 2018년 10월 8일에 출원된 미국 가출원 번호 62/742,682; 2018년 12월 5일 출원된 62/775,563; 2018년 12월 13일 출원된 62/779,104; 2019년 2월 21일 출원된 62,808,601; 및 2019년 5월 13일에 출원된 62/846,904의 이익 및 그에 대한 우선권을 청구하며, 그 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 엔지니어링된 DNASE 효소 분야에 관한 것이다.
염증은 침입하는 미생물을 통제하고 손상된 조직을 치유하기 위한 필수적 숙주 반응이다. 통제되지 않는 지속적 염증은 과다 염증성 장애에서 조직 손상을 유발한다. 호중구는 급성 염증에서 우세한 백혈구이다. 감염 동안 호중구는, 박테리아를 부동화시키고 중화시키는 효소 및 독성 히스톤으로 장식된 DNA-필라멘트의 격자, 호중구 세포외 트랩 (NET)을 생성한다. 그러나, 부적절하게 방출된 NET는 그의 세포독성, 전염증성, 및 전혈전성 활성으로 인해 숙주 세포를 해칠 수 있다.
DNASE1 (D1)은 DNASE1-유사 1 (D1L1), DNASE1-유사 2 (D1L2) 및 DNASE1-유사 3 (D1L3), DNASE1-단백질 패밀리, 상동 분비 DNase 효소 그룹과 함께 형성된다. DNASE2A 및 DNASE2B는 상동 세포외 DNase 효소의 추가 그룹을 형성시킨다. DNASE1- 및 DNASE2- 단백질 패밀리 구성원은 인간을 포함한 다양한 종에서 진화적으로 보존되고 발현된다. 재조합 인간 DNASE1- 및 DNASE2- 단백질 패밀리 구성원은 NET 관련 질환에 대한 약물 후보물질을 제공한다. D1은 환자의 일부 치료적 응용로 개발되었지만, DNASE1- 단백질 패밀리의 다른 구성원의 대규모 제조 조건은 설명되지 않았다. 더욱이, 이러한 효소의 물리적, 효소적, 약동학적 특성은 임상 응용에 이상적이지 않다. 따라서, D1L1, D1L2 및 D1L3 효소에 대한 제조 과정을 정의하고 NET 분해를 포함하여 치료에 사용하기 위한 DNase를 엔지니어링할 필요가 있다.
본 발명은 세포외 DNA, 세포외 크로마틴 및 호중구 세포외 트랩 (NET) 축적 및/또는 방출을 특징으로 하는 병태를 치료하는데 유용한 엔지니어링된 인간 세포외 DNASE 단백질 (예를 들어, DNASE1 (D1), DNASE1-유사 1 (D1L1), DNASE1-유사 2 (D1L2), DNASE1-유사 3 이소폼 1 (D1L3), DNASE1-유사 3 이소폼 2 (D1L3-2), DNASE2A (D2A) 및 DNASE2B (D2B)의 변이체)을 제공한다. 본 발명의 양태에 따르면, 본원에 기재된 DNase 변이체는 치료에 더 적합하고/하거나 대규모 제조에 더 적합하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 DNase 변이체는 전신 치료를 포함하는 의학 치료에 대한 이점을 갖는다. 이러한 이점에는 느린 약물 제거, 예를 들어 증가된 (예를 들어, 혈청 반감기), 연장된 약력학적 활성 기간, 높은 크로마틴 분해 활성 및 프로테아제 내성이 포함된다.
일부 양태에서, 본 발명은 D1L3 변이체를 제공하며, 여기서 D1L3 변이체는, 서열 번호: 4의 야생형 D1L3 이소폼 1 효소 또는 서열 번호: 5의 야생형 D1L3 이소폼 2 효소와 비교해서, 증가된 단백질 안정성, 보다 느린 약물 제거 및 증가된 약력학적 활성 기간, 단백질 분해에 대한 내성, 시험관내 발현 시스템에 대한 더 높은 생산 수준, 정제에 대한 더 우수한 적합성, 실질적으로 적지 않거나, 같거나, 또는 더 나은 크로마틴 및/또는 NET-분해 활성 중 하나 이상을 갖는다.
일부 구현예에서, D1L3 변이체는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 5로 정의된 성숙 효소와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열, 성숙 효소의 N-말단에서 알부민 아미노산 서열, 및 선택적으로 알부민 아미노산 서열 (알부민 도메인)과 D1L3 아미노산 서열 (D1L3 도메인) 사이의 아미노산 서열 연결을 포함하는 융합 단백질이다. 이러한 구현예에서, D1L3은 더 느린 제거(예를 들어, 개선된 순환 반감기 또는 혈청 반감기) 및 전신 치료를 포함하는 연장된 약력학적 활성 기간을 나타낸다. 일부 구현예에서, D1L3 도메인에 대한 연결 서열과 알부민의 융합은 알부민 융합이 없는 효소와 비교하여 효소의 크로마틴 분해 활성 (예를 들어, 시험관내 분석 시험을 사용하여 측정됨)에 실질적으로 영향을 미치지 않는다.
이들 구현예에서, 융합 단백질의 D1L3 도메인은 야생형 D1L3 효소에 존재하는 C-말단 염기성 도메인의 전부 또는 일부의 결실을 갖는다. C-말단 염기성 도메인의 결실 또는 비활성화는 크로마틴 분해 활성을 실질적으로 개선한다. 즉, C-말단 염기성 도메인 (BD)의 제거는 크로마틴 분해를 위한 야생형 D1L3 효소를 활성화시킨다.
일부 구현예에서, D1L3 변이체는 D1로부터 하나 이상의 빌딩 블록 치환을 갖는다. 예를 들어, D1L3 변이체는 D1에 없는 도메인인 C-말단 염기성 도메인의 결실을 포함하는 Q282_S305delinsK의 빌딩 블록 치환을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, D1L3 변이체는 서열 번호: 4의 위치 101에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 갖는다. 치환은 D1의 상응하는 빌딩 블록을 기초로 하는 Arg일 수 있거나, 일부 구현예에서 Lys이다. 이 위치에서의 치환은 D1L3 변이체의 크로마틴 분해 활성을 향상시킬 수 있다.
존재하는 링커는 가요성 링커, 경질 링커, 또는 생리학적으로 절단 가능한 링커, 예컨대 프로테아제 절단 가능한 링커일 수 있다. 예를 들어, 링커는 친수성 아미노산 서열일 수 있고, 주로 Gly, Ala, Ser, Thr 및 Pro로부터 선택된 아미노산으로부터 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체는 주로 글리신 및 세린 잔기(예를 들어, (GyS)n 링커, 여기서 y는 1 내지 5이고, n은 1 내지 20 임) 인 가요성 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 α-나선형 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 적어도 15 개의 아미노산 또는 적어도 25 개의 아미노산을 갖는다. 다양한 구현예에서, 적어도 15 개 아미노산의 더 긴 링커는 포유류 및 비-포유류 발현 시스템, 예컨대 CHO 세포 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 에서의 발현시 수율(yield)의 개선을 제공할 수 있다. 또한 놀랍게도, 더 긴 링커 서열은 더 짧은 링커 서열과 비교하여 시험관내 크로마틴 분해 분석 시험에서 개선된 크로마틴 분해 활성을 나타냈다.
다양한 구현예에서, D1L3 변이체는 서열 번호: 17 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 각각의 경우 삽입, 결실 또는 치환으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 20 개의 아미노산 변형을 선택적으로 갖는다. 이들 서열은 다양한 링커 디자인을 포함하여 알부민 서열과 D1L3 (또는 D1L3 변이체) 사이의 예시적인 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 아미노산 변형은 D1L3 도메인, 알부민 도메인 또는 두 도메인 모두에 있다. 일부 구현예에서, 변이체는 서열 번호: 19, 서열 번호: 22, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29 또는 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 갖는다. 이들 구현예에서, D1L3 변이체는 N-말단에서 C-말단까지 순서대로: 알부민 아미노산 서열, 중간 또는 긴 가요성 링커, 및 D1L3 아미노산 서열 (즉, D1L3 변이체 포함)을 포함한다. 서열 번호: 28은 긴 가요성 펩티드 링커를 통한 C-말단에서의 알부민 융합을 추가로 포함한다.
다른 구현예에서, 링커는 예컨대 활성화된 인자 XII와 같은 응고 경로 프로테아제와 같은 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 특정 구현예에서, 링커는 인자 XI 및/또는 프레칼리크레인(prekallikrein)의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 링커는 예컨대 호중구 엘라스타제, 카텝신 G 또는 프로테아제 3과 같은 호중구 특이적 프로테아제에 의한 절단을 표적으로 하는 펩티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 치료에 사용하기에 적합한 재조합 효소의 생산을 제공하여 제조에 이점을 갖도록 엔지니어링된 세포외 DNASE 효소의 변이체를 제공한다. 다양한 구현예에서, 본 발명은, 단백질 발현 중, 다이설파이드 브릿지를 통한 감소된 분자내 및 분자간 가교 결합을 초래하는 시스테인 잔기 (또는 Cys 잔기의 페길화(PEGylation))에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 D1, D1L1, D1L2 및 D1L3 변이체를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 생체내(in vivo) 노출을 개선하고, 예를 들어, 제거를 늦춤, 예를 들어, 반감기 연장 (예를 들어, 혈청 반감기), 및 약력학적 활성의 기간 연장, 재조합 효소 생산 중 단백질 분해(proteolysis) 감소를 위해 프로테아제 내성에 이점을 갖도록 엔지니어링된 세포외 DNASE 효소의 변이체를 제공한다. 본 개시내용은, 예를 들어, 플라스민, 트롬빈 및/또는 트립신에 의한 단백질 분해에 민감한 D1L3 잔기뿐만 아니라 포유류 및 비-포유류 세포주에 의해 생산된 프로테아제에 민감한 잔기 (예를 들어, 쌍을 이룬 염기성 아미노산)를 확인한다. 이들 잔기의 엔지니어링된 돌연변이는 프로테아제 내성에 이러한 이점을 부여할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 변이체를 포함하는 세포외 DNASE 단백질의 재조합을 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 비-포유류 발현 시스템, 예를 들어, 진핵 비-포유류 발현 시스템, 예컨대 피키아 파스토리스를 사용한다. 일부 구현예에서, 피키아 파스토리스는 숙주 세포로부터 분비를 허용하는 천연 신호 펩티드로 DNase 효소를 암호화한다. 일부 구현예에서, 발현 시스템은 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포와 같은 포유류 세포 발현 시스템이다.
일부 구현예에서, 재조합 발현 시스템은 쌍을 이룬 염기성 아미노산에서 절단되는 하나 이상의 프로테아제의 결실 또는 불활성화를 갖는다. 예시적인 효소는 푸린 (CHO 세포에 의해 발현됨) 및 아스파르트산 프로테아제 3 (Ysp1) 및 피키아 파스토리스에 의해 발현된 켁신 (Kex2)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 효소는 유전적으로 결실되거나 불활성화되지 않지만, 재조합 단백질 생산동안 프로테아제 억제제로 활성이 억제된다.
일부 구현예에서, 비-포유류 발현 시스템 또는 포유류 발현 시스템을 위한 성장배지는 덱스트란 설페이트, 헤파린, 시트르산철 및 EDTA와 같은 다가 음이온으로 보충된다. 추가 구현예에서, 피키아 파스토리스 또는 다른 발현 시스템의 성장배지는 5 kDa 내지 100 kDa 사이의 평균 분자량을 갖는 덱스트란 설페이트로 보충된다. 예를 들어, 다가 음이온은 생산된 재조합 단백질과 복합체를 형성하기에 충분한 양으로 배양물에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 비-포유류 발현 시스템 또는 포유류 발현 시스템의 배양배지로부터의 재조합 세포외 DNASE 단백질 및 이의 변이체는, 재조합 세포외 DNASE 단백질 및 덱스트란 설페이트, 헤파린 및 EDTA와 같은 다가 음이온으로부터의 변이체의 분해를 포함하는 방법을 통해 정제된다.
다른 양태에서, 본 발명은 벡터 및 숙주 세포뿐만 아니라 D1, D1L1, D1L2 또는 D1L3 변이체를 암호화하는 단리된 폴리 뉴클레오티드를 제공한다. 폴리 뉴클레오티드는 mRNA 또는 DNA를 암호화할 수 있다. 숙주 세포는 피키아 파스토리스와 같은 비-포유류이든 CHO 세포와 같은 포유류이든, 박테리아 또는 진핵 생물을 포함하는 재조합 발현 시스템의 세포일 수 있다. 다른 구현예에서, 숙주 세포는 DNASE 치료를 위해 전달될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 본 발명은 본원에 기재된 세포외 DNASE 단백질 중 하나 이상을 분비하도록 변형되고 치료제로서 투여되도록 의도된 숙주 세포, 예를 들어, 인간 세포, 예를 들어, 백혈구를 제공한다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 세포외 DNASE 단백질 또는 이의 변이체, 또는 기재된 바와 같이 선택적으로 폴리 뉴클레오티드 또는 벡터, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다. 약학적 조성물은 임의의 투여 경로를 위해 제형화 될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본원에 기재된 세포외 DNASE 또는 이의 변이체 또는 조성물을 투여함으로써, 세포외 DNA 분해, 세포외 크로마틴 분해, 세포외 트랩 (ET) 분해 및/또는 호중구 세포외 트랩 (NET) 분해를 필요로하는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태 및 구현예는 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 서열 번호: 4의 돌연변이 Q101R 및 Q282_S305delinsK가 DNASE1L3의 고분자량 크로마틴을 분해하기 위해 활성을 증가시킨다는 것을 예시한다. CHO 세포는 빌딩 블록 치환과 함께 야생형 DNASE1L3 또는 DNASE1L3으로 일시적으로 트랜스팩션되었다. 트랜스팩션된 세포의 상층액은 정제된 핵(nuclei) (고분자량 크로마틴) 또는 완충제와 함께 배양되였다. DNA가 단리되었고 아가로스겔 전기 영동으로 분석되었다. 도면은 DNA 염료로 염색된 아가로스겔을 보여준다.
도 2는 2 개의 DNASE1L3 변이체의 특성화를 나타낸다. Q101R 또는 Q282_S305delinsK 돌연변이를 갖는 야생형 DNASE1L3 또는 DNASE1L3로 트랜스팩션된 CHO 세포의 상이한 농도의 상층액은 항-DNASE1L3 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 (WB)에 의해 분석되었다. 야생형 DNASE1L3 및 Q101R 돌연변이체가 있는 샘플에서 더 큰 (변이체 1) 및 더 작은 (변이체 2) 밴드가 검출되었다. Q282_S305delinsK 돌연변이체가 있는 샘플에서는 더 작은 밴드 (변이체 2) 만 나타냈다. 동시에, 상이한 농도의 상층액에서 크로마틴 분해 활성이 분석되었다. 도면은 아가로스겔 전기 영동으로 분석된 DNA를 나타낸다. Q101R 또는 Q282_S305delinsK 돌연변이 모두 야생형 DNASE1L3에 비해 크로마틴 분해 활성을 증가시켰다.
도 3은 야생형 DNASE1L3로 안정적으로 형질 감염된 CHO 세포의 상층액에서 DNASE1L3 변이체 1 및 2의 존재를 예시한다. 샘플은 항-DNASE1L3 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 (WB)에 의해 분석되었다. 5 개의 클론에서 더 큰 (변이체 1) 및 더 작은 (변이체 2) 밴드가 검출되었다.
도 4는 빈번한 절단 부위를 확인하기 위해 피키아 파스토리스에서 재조합 적으로 발현된 야생형 D1L3의 C-말단 아미노산 서열을 나타낸다. 정제된 야생형 D1L3의 아미노산 시퀀싱은 K291_S305del, K292_S305del 및 S293_S305del의 세가지 C-말단 결실 돌연변이체를 확인했다. 야생형 D1L3의 C-말단은 검출되지 않았다. 동시에, 정제된 단백질의 상이한 농도에서 크로마틴 분해 활성이 분석되었고, 정제된 DNASE1 (D1) 및 F275Y/F279_K280delinsVM/Q282_S305delinsK 돌연변이를 갖는 염기성 도메인 삭제된 DNASE1L3 (BDD-D1L3)과 비교되었다. 도면은 아가로스겔 전기 영동으로 분석된 DNA를 나타낸다.
도 5는 CHO 배지에 덱스트란 설페이트를 첨가하면 단백질 수율이 향상됨을 보여준다. 야생형 D1L3을 발현하는 안정한 CHO 세포 풀은 표준 CHO 배지 또는 덱스트란 설페이트로 보충된 CHO 배지에서 인큐베이션되었다. 항-DNASE1L3 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 (WB)에 의해 상층액이 분석되었다. 도면은 D1L3이 낮은 수율로 CHO 세포에서 잘 발현되지 않음을 나타낸다. 덱스트란 설페이트를 첨가하면 수율이 증가하지만, 생산 단편화를 예방하지 않는다.
도 6은 덱스트란 설페이트-복합 D1L3의 친화도 정제를 위한 음이온 교환 표면 및 양이온 교환 표면의 사용을 예시한다.
도 7은 D1L3 분해를 제한하기 위한 트립신 절단 부위 돌연변이 전략을 나열한다.
도 8은 인간 D1 (서열 번호: 1) 및 인간 D1L3 (서열 번호: 4) 아미노산 서열의 정렬이며, 플라스민 민감성 KR 잔기가 제시되어 있다.
도 9는 D1L3 분해를 제한하기 위한 플라스민 절단 부위 돌연변이 전략을 예시한다.
도 10은 플라스민 절단 부위가 돌연변이된 D1L3이 효소 활성을 유지함을 보여준다. 4 개의 추정 플라스미드 절단 부위 (K180_A181delinsGL, P198_A201delinsRPSQ, K259A, R285A)에 돌연변이를 포함하는 DNASE1L3을 일시적으로 형질 감염시킨 세포의 상층액은 정제된 핵 (고 분자량 크로마틴) 또는 완충제와 함께 인큐베이팅되었다. DNA는 단리되었고 아가로스겔 전기 영동으로 분석되었다. 도면은 DNA 염료로 염색된 아가로스겔을 나타낸다.
도 11은 플라스민 분해에 기초한 플라스민 절단 부위를 나열하고, D1L3 분해를 제한하기 위한 돌연변이 전략을 나타낸다.
도 12는 D1L3이 CHO 세포에서 발현될 때 잘못 접히는 경향이 있음을 보여준다. 패널 A는 천연 분비 신호 펩티드를 사용한 D1L3 발현을 위한 간단한 발현 벡터를 예시한다. 항-DNASE1L3 항체를 사용하여 안정한 풀의 상층액은 웨스턴 블랏으로 분석되었다. 패널 B는 환원 조건에서 분해되는 비환원 조건 하에서 고분자량 응집체의 존재를 나타낸다.
도 13은 인간 D1 (서열 번호: 1) 및 인간 D1L3 (서열 번호: 4) 아미노산 서열의 정렬이며, 보존 및 비보존 시스테인 잔기가 도시되어 있다.
도 14는 D1L3의 시스테인 잔기를 나열하고, 단백질 발현동안 고분자량 응집체를 제한하는 돌연변이 전략을 나타낸다.
도 15는 D1L3에서 C68A 및 C194A 돌연변이가 크로마틴 분해 활성에 영향을 미치지 않음을 보여준다. 돌연변이 C24A 및 C52A는 크로마틴 분해 활성을 제거했다. 돌연변이된 DNASE1L3 변이체로 일시적으로 형질 감염된 세포의 상층액은 정제된 핵 또는 완충제와 함께 인큐베이팅되었다. DNA가 단리되었고 아가로스겔 전기 영동으로 분석되었다. 도면은 DNA 염료로 염색된 아가로스겔을 나타낸다.
도 16a는 천연 분비 신호 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) (αMF)로부터의 α-결합 인자를 사용하여 피키아 파스토리스에서 D1L3의 발현을 예시한다. αMF는 신호 펩티드의 글리코실화 및 비-프로세싱을 초래했다 (도 16b).
도 17a는 αMF, 인간 혈청 알부민 (HSA), 링커 서열 및 D1L3과의 융합 구조물을 예시한다. 이 융합 구조물은 P. pastoris 발현 시스템에서 글리코실화되지 않고 (도 17b), 크로마틴 분해 활성을 유지한다 (도 17c).
도 18은 피키아 파스토리스에서 염기성 도메인 결실-DNASE1L3 (BDD-D1L3) 또는 야생형 DNASE1L3 (D1L3)의 발현 수준 인간 혈청 알부민 (HSA) 융합 구조물을 예시한다. HSA는 BDD-D1L3 또는 D1L3의 N-또는 C-말단에 융합된다. 2 개의 링커 서열, L1 및 L2는 HSA와 BDD-D1L3 또는 D1L3 사이에 배치되었다.
도 19는 피키아 파스토리스에서 야생형 DNASE1L3 (D1L3)의 인간 혈청 알부민 (HSA) 융합 구조물의 발현 수준을 예시한다. HSA는 D1L3의 N-말단에 융합된다. 세 가지 다른 링커 서열 (L2, L3, L4)이 HSA와 D1L3 사이에 배치되었다.
도 20은 피키아 파스토리스에서 생산된 염기성 도메인 결실-DNASE1L3 (BDD-D1L3)의 인간 혈청 알부민 (HSA) 융합 구조물의 발현 수준 및 크로마틴 분해 활성을 예시한다. HSA는 BDD-D1L3의 N-말단에 융합된다. 3 개의 서로 다른 링커 서열 (L5, L6, L7)이 HSA와 D1L3 사이에 배치되었다.
도 21a는 서열 번호: 14 및 서열 번호: 19가 주사된 Dnase1 -/- Dnase1l3 -/- 마우스가 혈청에서 유사한 크로마틴 분해 활성을 보여준다는 것을 나타낸다. 도 21b는 서열 번호: 19가 인간 FcRn 수용체를 발현하는 마우스에서 3.3 일의 순환 반감기를 갖는다는 것을 나타낸다.
도 22는 피키아 파스토리스에서 생산된 염기성 도메인 결실-DNASE1L3 (BDD-D1L3)의 인간 혈청 알부민 (HSA) 융합 구조물의 발현 수준 및 크로마틴 분해 활성을 예시한다. HSA는 BDD-D1L3의 N-말단 및 C-말단에 융합된다. 2 개의 서로 다른 링커 서열 (L7 및 L8)이 HSA와 BDD-D1L3 사이에 배치되었다.
도 23은 HSA 및 인자 XIIa에 의해 절단가능한 링커와의 융합 구조물을 예시한다. 인간 인자 XI 서열 (서열 번호: 42)을 포함하는 링커 및 인간 프리칼렉 레인 (서열 번호: 44) 서열을 포함하는 링커가 제시된다.
도 24는 인간 세포외 DNase, 인간 응고 인자 및 인간 보체 인자를 포함하여 반감기 연장된 융합 단백질에 대해 인자 XIIa 절단가능한 링커를 적용하는 다른 구조물을 예시한다.
본 발명은 엔지니어링된 인간 세포외 DNASE 단백질 (예를 들어, DNASE1 (D1), DNASE1-유사 1 (D1L1), DNASE1-유사 2 (D1L2), DNASE1-유사 3 이소폼 1 (D1L3), DNASE1-유사 3 이소폼 2 (D1L3-2), DNASE2A (D2A) 및 DNASE2B (D2B)의 변이체)의 후보물질을 제공하고, 세포외 DNA, 세포외 크로마틴 및 호중구 세포외 트랩 (NET) 축적 및/또는 방출을 특징으로 하는 병태를 치료하는데 유용하다. 본 발명의 양태에 따르면, 본원에 기재된 DNase 변이체는 치료에 더 적합하고/하거나 효과적이며/이거나 대규모 제조에 더 적합하다(amenable). 일부 구현예에서, 본원에 기재된 DNase 변이체는 전신 치료에 대한 이점을 갖는다. 이러한 이점에는 더 긴 노출 (예를 들어, 더 느린 제거, 더 긴 순환 반감기), 연장된 약력학적 작용의 기간, 개선된 크로마틴 분해 활성 및 프로테아제 내성이 포함된다.
정의
본원 및 청구 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 단수 및 복수의 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "제제(an agent)"에 대한 언급은 단일 제제 및 복수의 이러한 제제들을 포함한다.
용어 "크로마티나제"는 크로마틴, 즉 하나 이상의 히스톤 단백질과 관련된 DNA를 절개(cut), 절단(cleave) 또는 소화하는 무시해도 될 정도의(negligible) 능력 이상을 나타내는 데옥시리보뉴클레아제 효소의 부류를 지칭한다. 인간 DNASE1L3은 크로마티나제이다. 일반적으로, 본원에 개시된 다양한 DNASE1L3 변이체는 크로마티나제이다. 모든 DNASE 효소가 크로마티나제는 아니다. 예를 들어, 인간 DNASE1은 본질적으로 크로마틴을 절개, 절단 또는 소화하는 능력이 없으며 크로마티나제가 아니다.
약물과 관련하여 본원에서 사용되는 "반감기"는 관심 매트릭스, 예를 들어, 혈청 또는 혈장에서 측정된 동물에서 약물 농도의 제거 반감기를 의미한다. 통상의 기술자는, 제거의 모든 단계에서 모든 약물이 1차 동역학을 나타내거나 그렇게 하는 것은 아니라는 것을 이해할 것이다. 그러한 경우에, 통상의 기술자는 용어 "반감기 연장" 또는 "연장된 반감기"가 더 느린 제거율을 지칭하는 표현임을 이해할 것이다.
"단리된"은 자연 상태에서 변경되거나 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리되지" 않지만, 그것의 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드가 "단리된"다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어, 숙주 세포와 같은 비천연 환경에 존재할 수 있다.
본원에 사용된 "호중구 세포외 트랩" 및 약어(acronym) "NET"은 핵 함량, 예를 들어, 프로그래밍된 방식으로 면역 세포, 전형적인 호중구로부터 방출되는 히스톤 단백질에 결합된 DNA를 포함하는 세포외 섬유의 네트워크를 지칭한다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 핵산"은 서로의 퇴화된(degenerate) 버전이고 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이라는 문구는 또한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 포함할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "약" 및 "대략"은 관련 수치 값의 ± 10%인 양을 포함한다.
용어 "세포외 DNASE"는 DNASE1- 및 DNASE2- 계열의 세포외 DNASE 단백질을 지칭한다(예: DNASE1 (D1), DNASE1-유사 1 (D1L1), DNASE1-유사 2 (D1L2), DNASE1-유사 3 이소폼 1 (D1L3), DNASE1-유사 3 이소폼 2 (D1L3-2), DNASE2A (D2A) 및 DNASE2B (D2B)).
일부 양태 및 구현예에서, 세포외 DNASE 또는 이의 변이체는, 선택적으로 개재된 링커에 의해 반감기 연장된 모이어티, 예컨대 알부민, 트랜스페린, Fc 또는 엘라스틴-유사 단백질, 또는 이의 변이체에 융합된다. 예를 들어, US 9,458,218(이는 그 전체가 본원에 참조로 포함됨) 참조. 일부 구현예에서, 세포외 DNASE 또는 이의 변이체는 면역글로불린 힌지 영역에 의해 이량체화된다. 예를 들어, 본원에 기재된 엔지니어링된 효소는 또한 Fc-융합 도메인 (예를 들어, 면역글로불린의 힌지 및 CH2 도메인 및 CH3 도메인)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, DNASE (예를 들어, D1L3 변이체)는 알부민 아미노산 서열 또는 도메인, 예를 들어, 인간 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체에 융합된다. 예를 들어, WO 2015/066550 및 US 9,221,896을 참조하고, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 알부민은 엔지니어링된 세포외 DNASE 또는 이의 변이체의 N-말단 및/또는 C-말단에서, 선택적으로 개재된 링커를 사용하여, DNASE에 이어질 수 있다. 예시적인 알부민 아미노산 서열은 서열 번호: 39에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, D1L3 및 D1, 또는 본원에 기재된 변이체는 Fc 힌지 영역에 의해 함께 이량체화되어 NET 분해를 위한 상승적 기능적 특성을 갖는 이량체 분자를 생성한다. 일부 구현예에서, 세포외 DNASE 또는 그의 변이체는 펩티드 링커를 통해 N-말단에서 알부민 아미노산 서열에 융합된다. 펩티드 링커는 가요성 링커, 경질 링커, 또는 일부 구현예에서 생리학적으로 절단 가능한 링커 (예를 들어, 프로테아제 절단 가능한 링커)일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 길이가 5 개 내지 100 개 아미노산이거나, 길이가 5 개 내지 50 개 아미노산이다. 또 다른 구현예에서, 링커는 세포외 DNASE 및 반감기 연장 모이어티 (예를 들어, 알부민)에 공유 결합된 유기 분자, 그룹, 폴리머 (예를 들어, PEG) 또는 화학적 모이어티다.
일부 양태에서, 본 발명은 D1L3 변이체를 제공하며, 여기서 D1L3 변이체는 서열번호: 4의 야생형 D1L3 이소폼 1 효소 또는 서열번호: 5의 야생형 D1L3 이소폼 2 효소와 비교하여, 증가된 단백질 안정성, 증가된 약동학적 노출 및 약력학적 활성 기간, 단백질 분해에 대한 내성, 시험관내 발현 시스템에 대한 더 높은 생산 수준, 정제에 대한 더 우수한 적합성, 실질적으로 적지 않거나, 같거나, 또는 더 나은 크로마틴 및/또는 NET-분해 활성 중 하나 이상을 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "D1L3"은 이소폼 1 또는 이소폼 2를 포함한다.
효소의 DNA- 및/또는 크로마틴- 및/또는 NET- 분해 활성, 예를 들어, D1L3 변이체는, 예를 들어, 정제된 핵, DNA 또는 NET을 형성하도록 유도된 생체외(ex vivo) 혈액 또는 호중구로부터 얻은 DNA, 크로마틴 또는 NET과 함께 효소를 인큐베이션함으로써 시험관내에서 측정될 수 있다. 대안적으로, 효소의 DNA- 및/또는 크로마틴- 및/또는 NET- 분해 활성, 예를 들어, D1L3 변이체는, 예를 들어, 효소를 대상체에게 투여함으로써 생체내에서 측정될 수 있으며, 여기서 대상체는 세포외 DNA, 크로마틴 또는 NET을 생성하거나 생성하도록 유도되고, 예를 들어, 혈청, 바람직하게는 병렬 음성 대조군과 함께, 또는 효소 투여 전후의 농도를 일시적으로 비교함으로써, DNA, 크로마틴 또는 매트릭스의 NET 레벨, 농도에 대한 효소의 효과를 측정한다.
일부 구현예에서, D1L3 변이체는 서열 번호: 4의 야생형 D1L3 이소폼 1 효소 또는 서열 번호: 5의 야생형 D1L3 이소폼 2 효소와 비교하여 거의 동일한 크로마틴 및/또는 NET- 분해 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, D1L3 변이체는 서열 번호: 4의 야생형 D1L3 이소폼 1 효소 또는 서열 번호: 5의 야생형 D1L3 이소폼 2 효소와 비교하여 더 높은 크로마틴- 및/또는 NET- 분해 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, D1L3 변이체는 알부민 도메인, 선택적 링커 및 D1L3 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 알부민 도메인 및 선택적 링커는 D1L3 도메인의 N-말단 측에 위치한다. 일부 구현예에서, 알부민 도메인 및 선택적 링커는 D1L3 도메인의 C-말단 측에 위치한다. 이러한 모든 구현예에서, 선택적 링커는 알부민 도메인과 D1L3 도메인 사이에 개재된다.
일부 구현예에서, 융합 단백질의 알부민 아미노산 서열 또는 도메인은 서열 번호: 39로 정의된 참조 알부민 서열과 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 구현예에서, 알부민 아미노산 서열 또는 도메인은 서열 번호: 39로 정의된 참조 알부민 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 다양한 구현예에서, 알부민 아미노산 서열은 신생아 Fc 수용체 (FcRn), 예를 들어, 인간 FcRn에 결합한다. 알부민 아미노산 서열은 야생형 HSA의 변이체일 수 있다 (예를 들어, 서열 번호 39로 표시됨). 다양한 구현예에서, 알부민 변이체는 서열 번호: 39에 대하여 결실, 치환 및 삽입으로부터 독립적으로 선택된 1 개 내지 20 개, 또는 1 내지 10 개의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 알부민 아미노산 서열은 임의의 포유류 알부민 아미노산 서열이다.
일부 구현예에서, 알부민 아미노산 서열 또는 도메인은 서열 번호: 39로 표시된 바와 같은 전장 알부민의 단편이다. 알부민의 맥락에서 사용될 때, 용어 "단편"은, 비-융합 DNASE와 비교하여 그것이 융합되거나 접합되는 DNASE 효소의 반감기를 연장시키는 전장 알부민의 임의의 단편 또는 이의 변이체(상기 기재된 바와 같음)를 지칭한다, 일부 구현예에서, 알부민의 단편은 도메인 I 및 III, 및 도메인 II 및 III와 같은 알부민의 다중 도메인 (예를 들어, WO2011/124718 참조)의 융합을 포함하는 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. 일반적으로, 알부민의 단편은 전장 서열의 적어도 약 100 개의 아미노산 또는 적어도 약 200 개의 아미노산 또는 적어도 약 300 개의 아미노산을 갖는다. 다양한 구현예에서, 알부민 단편은 인간 FcRn에 결합하는 능력을 유지한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질의 D1L3-유사 도메인은 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 5로 정의된 성숙 D1L3 효소 참조 서열과 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일하다. 일부 구현예에서, D1L3 도메인은 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 5로 정의된 참조 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 참조 서열은 C-말단 23 개 아미노산에 의해 정의된 서열 번호: 4 또는 5의 C-말단 염기성 도메인을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 D1L3 도메인을 포함하고, 여기서 D1L3 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 5로 정의된 성숙 효소와 적어도 약 80% 동일하다. 융합 단백질은 성숙 효소의 N-말단에 알부민 아미노산 서열 또는 도메인, 및 알부민 아미노산 서열과 성숙 효소의 아미노산 서열 사이의 연결 아미노산 서열을 추가로 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, D1L3 도메인은 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 5로 정의된 성숙 효소 참조 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 참조 서열은 C-말단 23 개 아미노산에 의해 정의된 서열 번호: 4 또는 5의 C-말단 염기성 도메인을 포함하지 않는다. D1L3 도메인을 포함하는 융합 단백질은 전신 치료를 포함하여 개선된 순환 반감기 및 약력학적 효과의 기간을 나타낸다. 추가로, 알부민과 연결 서열의 융합은, 알부민 융합이 없는 변이체와 비교하여 시험관내 크로마틴 분해 분석 시험을 사용하여 결정된 크로마틴 분해 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는다 (또는 일부 구현예에서 어떠한 부정적인 영향도 미치지 않음).
야생형 DNase 효소와의 서열 동일성을 언급할 때, 달리 언급되지 않는 한, 서열은 신호 펩티드가 결여된 성숙 효소를 지칭한다. 또한, 달리 언급되지 않는 한, 아미노산 위치는 명확성을 위해 신호 펩티드를 포함하는 완전 번역된 DNase 서열에 대하여 넘버링된다. 따라서, 예를 들어, 서열 번호: 4의 효소 (인간 D1L3, 이소폼 1)에 대한 서열 동일성에 대한 언급은 N-말단에 M21을 갖는 성숙 효소와의 퍼센트 동일성을 지칭한다. 유사하게, 서열 번호: 1의 효소 (인간 D1)에 대한 서열 동일성에 대한 언급은 N-말단에 L23을 갖는 성숙 효소와의 퍼센트 동일성을 지칭한다.
일부 구현예에서, D1L3은 C-말단 염기성 도메인의 전부 또는 일부의 결실을 갖는다. C-말단 염기성 도메인은 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 5의 C-말단 23 개 아미노산으로 정의된다. D1L3의 C-말단 염기성 도메인의 결실 또는 불활성화는 크로마틴 분해 활성을 실질적으로 향상시킨다. 도 1,2 및 4 참조. 일부 구현예에서, D1L3 변이체는 C-말단 염기성 도메인 아미노산, 예를 들어, 적어도 5 개 아미노산, 또는 일부 구현예에서 적어도 10 개 아미노산, 또는 일부 구현예에서 적어도 15 개 아미노산, 또는 일부 구현예에서 C-말단 염기성 도메인의 20 개 이상의 아미노산을 갖는다. 일부 구현예에서, D1L3 변이체는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 5의 C-말단 23 개 아미노산에 의해 정의된 전체 C-말단 염기성 도메인의 결실을 갖는다. 예시적인 BD 결실은 Q282_S305delinsK (서열 번호: 9 참조), S305delinsK (서열 번호: 10 참조), K292_S305del (서열 번호: 11 참조) 및 S293_S305del (서열 번호: 12 참조)을 포함한다. 일부 구현예에서, D1L3 도메인 (BD 결실을 가짐)의 C-말단은 C-말단 BD와 정렬되지 않은 C-말단에 1 내지 10 개 또는 1 내지 5 개의 아미노산을 갖고, 시험관내 분석 시험에서 크로마틴 분해 활성에 부정적인 영향을 미친다.
일부 구현예에서, D1L3 변이체는 다음을 포함하는 엔지니어링된 융합 단백질이다: 서열 번호: 8 내지 서열 번호: 16으로부터 선택된 서열의 DNASE1L3 도메인; 서열 번호: 31 내지 서열 번호: 38으로부터 선택된 서열의 링커; 및 서열 번호: 39의 서열을 갖는 알부민 도메인 또는 기재된 바와 같은 변이체 또는 단편. 일부 구현예에서, D1L3 변이체는 본원에 참조로 포함되는 PCT/US2018/04708에 기재된 D1로부터의 하나 이상의 빌딩 블록 치환을 갖는다.
일부 구현예에서, D1L3 서열 또는 도메인은 다음 중 하나 이상으로부터 선택 될 수 있는 D1로부터의 빌딩 블록 치환을 포함한다: M21_R22delinsLK, C24_S25delinsAA, V28_S30delinsIQT, S34T, Q36_V44delinsMSNATLVSY, K47_K50delinsQILS, C52Y, I55_M58delinsIALVQE, I60_K61delinsVR, N64_I70delinsHLTAVGK, M72_K74delinsLDN, R77_I83delinsQDAPD, N86H, I89V, S91_R92delinsEP, T97S, Q101R, A103L, L105V, K107_L110delinsRPDQ, V113_R115delinsAVD, H118Y, H120D, Y122_A127delinsGCEPCGN, V129T, S131N, F135_V136delinsAI, W138R, Q140_H143delinFSRF, A145_D148delinsEVRE, V150A, I152V, T156_T157delinsAA, E159_S161delinsGDA, K163A, E167A, V169_E170delinsYD, T173L, K176_R178delinsQEK, K180_A181delinsGL, N183_F186delinsDVML, P198_A201delinsRPSQ, K203_N204delinsSS, R208W, D210S, R212T, V214Q, G218P, Q220_E221delinsSA, V225_S228delinsATP, N230H, L238_R239delinsVA, Q241_S246delinsMLLRGA, K250D, N252_V254delinsALP, D256N, K259A, K262G, T264_E267delinsSDQL, L269_V271delinsQAI, F275Y, F279_K280delinsVM, Q282_S205delinsK, 여기서 각각의 전술한 치환은 서열 번호: 4에 대해 넘버링된다.
예를 들어, D1L3 변이체는 D1에 없는 C-말단 염기성 도메인의 결실을 포함하는 Q282_S305delinsK의 D1에서 빌딩 블록 치환을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, D1L3 효소는 서열 번호: 4의 위치 101에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 갖는다. 치환은 D1의 상응하는 빌딩 블록을 기초로 하는 Arg 일 수 있거나, 일부 구현예에서 Lys이다. 이 위치에서의 치환은 D1L3의 크로마틴 분해 활성을 향상시킬 수 있다. 이 위치의 다른 치환은 유사한 특성을 보여줄 가능성이 높다.
존재하는 링커는 가요성, 경질 및 절단 가능한 펩티드 링커로부터 선택될 수 있다. 가요성 링커는 대부분 또는 전부 Gly, Ser 및 Thr과 같은 작은, 비극성 또는 극성 잔기로 구성된다. 예시적인 가요성 링커는 (GlyySer)n 링커를 포함하고, 여기서 y는 1 내지 10 (예를 들어, 1 내지 5)이고, n은 1 내지 약 10이고, 일부 구현예에서 3 내지 약 6이다. 예시적인 구현예에서, y는 2 내지 4이고, n은 3 내지 8이다. 그들의 가요성으로 인해, 이들 링커는 구조화되지 않는다. 더욱 경질인 링커는 폴리프롤린 또는 폴리 Pro-Ala 모티프 및 α-나선형 링커를 포함한다. 예시적인 α-나선형 링커는 A(EAAAK)nA이고, 여기서 n은 상기 정의된 바와 같다 (예를 들어, 1 내지 10, 또는 2 내지 6). 일반적으로, 링커는 대부분 Gly, Ser, Thr, Ala 및 Pro로부터 선택된 아미노산으로 구성될 수 있다. 예시적인 링커 서열은 적어도 10 개의 아미노산을 포함하고, 15 내지 35 개의 아미노산 범위에 있을 수 있다. 예시적인 링커 디자인은 서열 번호: 31 내지 38로 제공된다.
일부 구현예에서, 변이체는 링커를 포함하고, 여기서 링커의 아미노산 서열은 대부분 글리신 및 세린 잔기이거나, 본질적으로 글리신 및 세린 잔기로 이루어진다. 일부 구현예에서, 링커에서 Ser 및 Gly의 비는 각각 약 1:1 내지 약 1:10, 약 1:2 내지 약 1:6, 또는 약 1:4이다. 예시적인 링커 서열은 S(GGS)4GSS (서열 번호: 36), S(GGS)9GS (서열 번호: 37), (GGS)9GS (서열 번호: 39)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 적어도 10 개의 아미노산, 또는 적어도 15 개의 아미노산, 또는 적어도 20 개의 아미노산, 또는 적어도 25 개의 아미노산을 갖는다. 예를 들어, 링커는 15 개 내지 30 개 아미노산 길이를 가질 수 있다. 다양한 구현예에서, 적어도 15 개 아미노산의 더 긴 링커는 피키아 파스토리스에서 발현시 수율의 개선을 제공할 수 있다. 도 20 참조. 또한, 놀랍게도, 더 긴 링커 서열은 더 짧은 링커 서열에 비해 개선된 크로마틴 분해 활성을 나타냈다. 도 20 참조.
다양한 구현예에서, D1L3 변이체는 서열 번호: 17 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질이다. 다른 구현예에서, D1L3 변이체는 서열 번호: 17 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호: 17 내지 30으로부터 선택된 참조 서열에 대하여 아미노산 삽입, 결실 또는 치환으로부터 독립적으로 선택된 1 개 내지 20 개 또는 1 개 내지 10 개, 또는 1 내지 5 개의 아미노산 변형을 가는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 아미노산 변형은 융합 단백질의 D1L3 도메인, 알부민 도메인, 또는 두 도메인에 있다. 일부 구현예에서, 변이체는 서열 번호: 19, 서열 번호: 22, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29 또는 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 갖는다. 이들 구현예에서, 알부민 아미노산 서열은 중간 또는 긴 가요성 링커를 통해 D1L3 (또는 변이체)의 N-말단 또는 N-말단 측에서 융합된다.
다른 구현예에서, 링커는 프로테아제 절단 가능한 링커와 같은 생리학적으로 절단 가능한 링커이다. 예를 들어, 프로테아제는 활성화된 인자 XII와 같은 응고 경로 프로테아제일 수 있다. 특정 구현예에서, 링커는 인자 XI (서열 번호: 42) 및/또는 프레칼리크레인 (서열 번호: 44 또는 45)의 아미노산 서열 또는 이의 생리학적으로 절단 가능한 단편을 포함한다. 선택된 구현예에서, 인자 XI로부터의 링커 아미노산 서열은 서열 번호: 42의 전부 또는 일부 (예를 들어, 인자 XIIa에 의한 절단을 허용하는 서열 번호: 42의 변형을 포함하는 서열 번호: 42의 일부)를 포함한다. 일부 구현예에서, 프레칼리크레인으로부터의 링커 아미노산 서열은 서열 번호: 44의 전부 또는 일부 (예를 들어, 인자 XIIa에 의한 절단을 허용하는 서열 번호: 44의 변형을 포함하는 서열 번호: 44의 일부)를 포함한다. 다른 구현예에서, 링커는 호중구 엘라스타제, 카텝신 G 및 프로테아제 3과 같은 호중구 특이적 프로테아제에 의한 절단을 표적으로 하는 펩티드 서열을 포함한다.
D1L3 융합 단백질의 일부 예시적인 구현예는 본원에 개시된 서열로부터 독립적으로 선택될 수 있는 3 개의 아미노산 서열의 조합을 포함하고, 이러한 서열은 N-말단에서 C-말단으로 순서대로 배열된다:
융합 1: 서열 번호: 4, 서열 번호: 31, 서열 번호: 39;
융합 2: 서열 번호: 5, 서열 번호: 31, 서열 번호: 39;
융합 3: 서열 번호: 8, 서열 번호: 31, 서열 번호: 39;
융합 4: 서열 번호: 9, 서열 번호: 31, 서열 번호: 39;
융합 5: 서열 번호: 10, 서열 번호: 31, 서열 번호: 39;
융합 6: 서열 번호: 11, 서열 번호: 31, 서열 번호: 39;
융합 7: 서열 번호: 12 서열 번호: 31, 서열 번호: 39;
융합 8: 서열 번호: 13, 서열 번호: 31, 서열 번호: 39;
융합 9: 서열 번호: 14, 서열 번호: 31, 서열 번호: 39;
융합 10: 서열 번호: 15, 서열 번호: 31, 서열 번호: 39;
융합 11: 서열 번호: 16, 서열 번호: 31, 서열 번호: 39;
융합 12: 서열 번호: 4, 서열 번호: 32, 서열 번호: 39;
융합 13: 서열 번호: 5, 서열 번호: 32, 서열 번호: 39;
융합 14: 서열 번호: 8, 서열 번호: 32, 서열 번호: 39;
융합 15: 서열 번호: 9, 서열 번호: 32, 서열 번호: 39;
융합 16: 서열 번호: 10, 서열 번호: 32, 서열 번호: 39;
융합 17: 서열 번호: 11, 서열 번호: 32, 서열 번호: 39;
융합 18: 서열 번호: 12 서열 번호: 32, 서열 번호: 39;
융합 19: 서열 번호: 13, 서열 번호: 32, 서열 번호: 39;
융합 20: 서열 번호: 14, 서열 번호: 32, 서열 번호: 39;
융합 21: 서열 번호: 15, 서열 번호: 32, 서열 번호: 39;
융합 22: 서열 번호: 16, 서열 번호: 32, 서열 번호: 39;
융합 23: 서열 번호: 4, 서열 번호: 33, 서열 번호: 39;
융합 24: 서열 번호: 5, 서열 번호: 33, 서열 번호: 39;
융합 25: 서열 번호: 8, 서열 번호: 33, 서열 번호: 39;
융합 26: 서열 번호: 9, 서열 번호: 33, 서열 번호: 39;
융합 27: 서열 번호: 10, 서열 번호: 33, 서열 번호: 39;
융합 28: 서열 번호: 11, 서열 번호: 33, 서열 번호: 39;
융합 29: 서열 번호: 12 서열 번호: 33, 서열 번호: 39;
융합 30: 서열 번호: 13, 서열 번호: 33, 서열 번호: 39;
융합 31: 서열 번호: 14, 서열 번호: 33, 서열 번호: 39;
융합 32: 서열 번호: 15, 서열 번호: 33, 서열 번호: 39;
융합 33: 서열 번호: 16, 서열 번호: 33, 서열 번호: 39;
융합 34: 서열 번호: 4, 서열 번호: 34, 서열 번호: 39;
융합 35: 서열 번호: 5, 서열 번호: 34, 서열 번호: 39;
융합 36: 서열 번호: 8, 서열 번호: 34, 서열 번호: 39;
융합 37: 서열 번호: 9, 서열 번호: 34, 서열 번호: 39;
융합 38: 서열 번호: 10, 서열 번호: 34, 서열 번호: 39;
융합 39: 서열 번호: 11, 서열 번호: 34, 서열 번호: 39;
융합 40: 서열 번호: 12 서열 번호: 34, 서열 번호: 39;
융합 41: 서열 번호: 13, 서열 번호: 34, 서열 번호: 39;
융합 42: 서열 번호: 14, 서열 번호: 34, 서열 번호: 39;
융합 43: 서열 번호: 15, 서열 번호: 34, 서열 번호: 39;
융합 44: 서열 번호: 16, 서열 번호: 34, 서열 번호: 39;
융합 45: 서열 번호: 4, 서열 번호: 35, 서열 번호: 39;
융합 46: 서열 번호: 5, 서열 번호: 35, 서열 번호: 39;
융합 47: 서열 번호: 8, 서열 번호: 35, 서열 번호: 39;
융합 48: 서열 번호: 9, 서열 번호: 35, 서열 번호: 39;
융합 49: 서열 번호: 10, 서열 번호: 35, 서열 번호: 39;
융합 50: 서열 번호: 11, 서열 번호: 35, 서열 번호: 39;
융합 51: 서열 번호: 12 서열 번호: 35, 서열 번호: 39;
융합 52: 서열 번호: 13, 서열 번호: 35, 서열 번호: 39;
융합 53: 서열 번호: 14, 서열 번호: 35, 서열 번호: 39;
융합 54: 서열 번호: 15, 서열 번호: 35, 서열 번호: 39;
융합 55: 서열 번호: 16, 서열 번호: 35, 서열 번호: 39;
융합 56: 서열 번호: 4, 서열 번호: 36, 서열 번호: 39;
융합 57: 서열 번호: 5, 서열 번호: 36, 서열 번호: 39;
융합 58: 서열 번호: 8, 서열 번호: 36, 서열 번호: 39;
융합 59: 서열 번호: 9, 서열 번호: 36, 서열 번호: 39;
융합 60: 서열 번호: 10, 서열 번호: 36, 서열 번호: 39;
융합 61: 서열 번호: 11, 서열 번호: 36, 서열 번호: 39;
융합 62: 서열 번호: 12 서열 번호: 36, 서열 번호: 39;
융합 63: 서열 번호: 13, 서열 번호: 36, 서열 번호: 39;
융합 64: 서열 번호: 14, 서열 번호: 36, 서열 번호: 39;
융합 65: 서열 번호: 15, 서열 번호: 36, 서열 번호: 39;
융합 66: 서열 번호: 16, 서열 번호: 36, 서열 번호: 39;
융합 67: 서열 번호: 4, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39;
융합 68: 서열 번호: 5, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39;
융합 69: 서열 번호: 8, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39;
융합 70: 서열 번호: 9, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39;
융합 71: 서열 번호: 10, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39;
융합 72: 서열 번호: 11, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39;
융합 73: 서열 번호: 12 서열 번호: 37, 서열 번호: 39;
융합 74: 서열 번호: 13, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39;
융합 75: 서열 번호: 14, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39;
융합 76: 서열 번호: 15, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39;
융합 77: 서열 번호: 16, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39;
융합 78: 서열 번호: 4, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39;
융합 79: 서열 번호: 5, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39;
융합 80: 서열 번호: 8, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39;
융합 81: 서열 번호: 9, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39;
융합 82: 서열 번호: 10, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39;
융합 83: 서열 번호: 11, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39;
융합 84: 서열 번호: 12 서열 번호: 38, 서열 번호: 39;
융합 85: 서열 번호: 13, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39;
융합 86: 서열 번호: 14, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39;
융합 87: 서열 번호: 15, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39;
융합 88: 서열 번호: 16, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39;
융합 89: 서열 번호: 4, 서열 번호: 42, 서열 번호: 39;
융합 90: 서열 번호: 5, 서열 번호: 42, 서열 번호: 39;
융합 91: 서열 번호: 8, 서열 번호: 42, 서열 번호: 39;
융합 92: 서열 번호: 9, 서열 번호: 42, 서열 번호: 39;
융합 93: 서열 번호: 10, 서열 번호: 42, 서열 번호: 39;
융합 94: 서열 번호: 11, 서열 번호: 42, 서열 번호: 39;
융합 95: 서열 번호: 12 서열 번호: 42, 서열 번호: 39;
융합 96: 서열 번호: 13, 서열 번호: 42, 서열 번호: 39;
융합 97: 서열 번호: 14, 서열 번호: 42, 서열 번호: 39;
융합 98: 서열 번호: 15, 서열 번호: 42, 서열 번호: 39;
융합 99: 서열 번호: 16, 서열 번호: 42, 서열 번호: 39
융합 100: 서열 번호: 4, 서열 번호: 43, 서열 번호: 39;
융합 101: 서열 번호: 5, 서열 번호: 43, 서열 번호: 39;
융합 102: 서열 번호: 8, 서열 번호: 43, 서열 번호: 39;
융합 103: 서열 번호: 9, 서열 번호: 43, 서열 번호: 39;
융합 104: 서열 번호: 10, 서열 번호: 43, 서열 번호: 39;
융합 105: 서열 번호: 11, 서열 번호: 43, 서열 번호: 39;
융합 106: 서열 번호: 12 서열 번호: 43, 서열 번호: 39;
융합 107: 서열 번호: 13, 서열 번호: 43, 서열 번호: 39;
융합 108: 서열 번호: 14, 서열 번호: 43, 서열 번호: 39;
융합 109: 서열 번호: 15, 서열 번호: 43, 서열 번호: 39;
융합 110: 서열 번호: 16, 서열 번호: 43, 서열 번호: 39;
융합 111: 서열 번호: 4, 서열 번호: 44, 서열 번호: 39;
융합 112: 서열 번호: 5, 서열 번호: 44, 서열 번호: 39;
융합 113: 서열 번호: 8, 서열 번호: 44, 서열 번호: 39;
융합 114: 서열 번호: 9, 서열 번호: 44, 서열 번호: 39;
융합 115: 서열 번호: 10, 서열 번호: 44, 서열 번호: 39;
융합 116: 서열 번호: 11, 서열 번호: 44, 서열 번호: 39;
융합 117: 서열 번호: 12 서열 번호: 44, 서열 번호: 39;
융합 118: 서열 번호: 13, 서열 번호: 44, 서열 번호: 39;
융합 119: 서열 번호: 14, 서열 번호: 44, 서열 번호: 39;
융합 120: 서열 번호: 15, 서열 번호: 44, 서열 번호: 39;
융합 121: 서열 번호: 16, 서열 번호: 44, 서열 번호: 39;
융합 122: 서열 번호: 4, 서열 번호: 45, 서열 번호: 39;
융합 123: 서열 번호: 5, 서열 번호: 45, 서열 번호: 39;
융합 124: 서열 번호: 8, 서열 번호: 45, 서열 번호: 39;
융합 125: 서열 번호: 9, 서열 번호: 45, 서열 번호: 39;
융합 126: 서열 번호: 10, 서열 번호: 45, 서열 번호: 39;
융합 127: 서열 번호: 11, 서열 번호: 45, 서열 번호: 39;
융합 128: 서열 번호: 12 서열 번호: 45, 서열 번호: 39;
융합 129: 서열 번호: 13, 서열 번호: 45, 서열 번호: 39;
융합 130: 서열 번호: 14, 서열 번호: 45, 서열 번호: 39;
융합 131: 서열 번호: 15, 서열 번호: 45, 서열 번호: 39;
융합 132: 서열 번호: 16, 서열 번호: 45, 서열 번호: 39;
일부 구현예에서, 융합 단백질은 신호 펩티드로 합성된다. 신호 펩티드는 숙주 세포로부터 분비되는 동안 제거될 수 있다. 예시적인 신호 펩티드는 서열 번호: 4 내지 16 및 서열 번호: 44 내지 46에 제시된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 성숙 단백질, 즉 신호 펩티드가 결여된 것이다.
다양한 구현예에서, 융합 단백질은 융합 단백질 1 내지 132로부터 선택되고, 선택된 융합 단백질은 아미노산 결실, 삽입 및 치환으로부터 독립적으로 선택된 최대 20 개 (또는 최대 10 개)의 아미노산 변형을 선택적으로 가질 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 제조에 이점을 갖도록 엔지니어링된 세포외 DNASE 효소의 변이체를 제공하고, 치료에 사용하기에 적합한 재조합 효소의 생산을 제공하고, 이미 기재된 바와 같이 선택적으로 융합 단백질 구현예(알부민 융합 구현예 포함)와 관련하여 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 발명은 단백질 발현 중 다이설파이드 브릿지를 통한 감소된 분자내 및 분자간 가교 결합을 초래하는 시스테인 잔기의 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 재조합 D1, D1L1, D1L2 및 D1L3 변이체를 제공한다. 예를 들어, DNase 변이체는 야생형 서열에 존재하는 1 개, 2 개 또는 3 개의 시스테인 잔기가 결여될 수 있거나 (예를 들어, 1 개, 2 개 또는 3 개의 시스테인 잔기가 결실됨), 또는 다른 아미노산(들)로 치환된 이러한 시스테인(들) 하나 이상의 갖는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인 잔기는 Ala, Gly 및 Ser로부터 독립적으로 선택된 아미노산으로 치환되거나, 또는 하나 이상의 시스테인 잔기는 빌딩 블록 치환의 일부로서 치환된다. 일부 구현예에서, 치환된 하나 이상의 시스테인 잔기는 D1 단백질 패밀리의 다른 구성원 (예를 들어, D1, D1L1, D1L2 및 D1L3) 사이에 보존되지 않는다. 일부 구현예에서, 엔지니어링된 효소는, 증가된 단백질 안정성, 프로테아제에 의한 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 생체이용률 및 실질적으로 야생형 효소와 비교하여 동일하거나 더 나은 DNA 및/또는 크로마틴 및/또는 NET- 분해 활성 (시험관내 또는 생체내)을 초래하는, D1 단백질 패밀리의 다른 구성원으로부터의 적어도 하나의 빌딩 블록 치환 및/또는 다른 점 돌연변이를 포함하거나 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 치환 및/또는 변형은, 다른 변형 중에서 시스테인 잔기의 단일 변형만을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 시스테인 잔기의 제거는 제조에서 상당한 이점을 위해 충분하다.
다른 양태에서, 본 발명은 재조합 효소 생산 동안 생체내 반감기를 개선하고 단백질 분해를 감소시키기 위해 프로테아제 내성에 이점을 갖도록 엔지니어링된 세포외 DNASE 효소의 변이체를 제공한다. 본 개시 내용은, 예를 들어, 플라스민, 트롬빈 및/또는 트립신에 의한 단백질 분해에 민감한 D1L3 잔기뿐만 아니라 포유류 및 비-포유류 세포주에 의해 생산된 프로테아제에 민감한 잔기 (예를 들어, 쌍을 이룬 염기성 아미노산)를 확인한다.
본원에 기재된 재조합 세포외 DNASE 변이체는 시스테인 잔기의 치환, 프로테아제-민감성 잔기의 치환을 포함하는 점 돌연변이의 조합을 가질 수 있고/있거나 하나 이상의 블록 치환을 포함할 수 있다. 빌딩 블록 단백질 엔지니어링 (BBPE)은 PCT/US18/47084 및 US 62/800,790에 설명되어 있으며, 그 개시 내용은 여기에 참조로 포함된다. BBPE는 공여자와 수여자 세포외 DNASE 효소의 단백질-단백질 정렬을 제공하는 것과 전달을 위한 가변 아미노산 서열을 확인하는 것을 수반한다("빌딩 블록"). 가변 아미노산(들)은 공여자 및 수여자 세포외 DNASE 효소 (빌딩 블록의 상류 및 하류)에서 하나 이상의 보존된 아미노산의 측면에 위치된다. 이러한 빌딩 블록은 키메라 효소를 생산하기 위해 수여자와 공여자 단백질간에 교환될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 이들의 변이체를 포함하는 세포외 DNASE 단백질의 재조합 생산 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 피키아 파스토리스와 같은 비-포유류 발현 시스템을 적용한다. 일부 구현예에서, 피키아 파스토리스는 숙주 세포로부터 분비를 허용하는 천연 신호 펩티드로 DNase 효소를 암호화한다. 일부 구현예에서, 발현 시스템은, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포와 같은 포유류 세포 발현 시스템이다. 일부 구현예에서, 활성에 불필요한 시스테인 잔기를 제거함으로써, 본 발명은 그렇지 않으면 재조합 생산을 형성하고 방해하는 분자간 및 분자내 다이설파이드 결합을 피한다. 일부 구현예에서, 단일 시스테인 잔기의 치환으로 잘못된 분자간 및 분자내 다이설파이드 결합의 실질적인 감소가 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 발현 시스템은 쌍을 이룬 염기성 아미노산에서 절단되는 하나 이상의 프로테아제의 결실 또는 불활성화를 갖는다. 예시적인 효소는 푸린 (CHO 세포에 의해 발현됨) 및 아스파르트산 프로테아제 3 (Ysp1) 및 피키아 파스토리스에 의해 발현된 켁신 (Kex2)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 효소는 유전적으로 결실되거나 불활성화되지 않지만, 재조합 단백질 생산 동안 프로테아제 억제제로 활성이 억제된다.
일부 구현예에서, 비-포유류 발현 시스템 또는 포유류 발현 시스템을 위한 성장 배지는 덱스트란 설페이트, 헤파린, 시트르산철 및 EDTA와 같은 다가 음이온으로 보충된다. 추가 구현예에서, 피키아 파스토리스 또는 다른 발현 시스템의 성장배지는 5 kDa 내지 100 kDa 사이의 평균 분자량을 갖는 덱스트란 설페이트로 보충된다. 일부 구현예에서, 덱스트란 설페이트는 약 10kDa 이하, 또는 약 20kDa 이하, 또는 약 30kDa 이하, 또는 약 40kDa 이하, 또는 약 50kDa 이하, 또는 약 75 kDa 이하, 또는 약 100 kDa 이하인 평균 분자량을 갖는다. 다양한 구현 예에서, 다가 음이온은 생산된 재조합 단백질과 복합체가 되기에에 충분한 양으로 배양물에 첨가된다.
일부 구현예에서, 비-포유 동물 발현 시스템 또는 포유 동물 발현 시스템의 배양 배지로부터의 재조합 세포외 DNASE 단백질 및 이의 변이체는, 재조합 세포외 DNASE 단백질 및 덱스트란 설페이트, 헤파린, EDTA 와 같은 다가 음이온으로부터의 변이체의 분해를 포함하는 방법을 통해 정제된다. 특정 구현예에서, 정제 방법은 트리에틸아미노에틸과 같은 강한 음이온 교환 수지를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법에 따라 생산된 세포외 DNASE 단백질은 D1L3 또는 이의 변이체이다.
따라서, 일부 구현예에서 본 발명은 서열 번호: 4 (인간 D1L3, 이소폼 1) 또는 서열 번호: 5 (인간 D1L3, 이소폼 2)로 정의된 효소와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 시스테인 잔기의 하나 이상의 치환 및/또는 단백질 분해, 예를 들어, 생체내 단백질 분해에 민감한 아미노산의 하나 이상의 치환을 갖는 D1L3 변이체를 제공한다. 일부 구현예에서, D1L3 단백질 변이체는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 5의 야생형 D1L3 단백질과 비교하여 증가된 단백질 안정성 (예를 들어, 프로테아제 내성), 시험관내 발현 시스템에 의한 더 높은 생산 수준, 및/또는 실질적으로 적지 않거나, 같거나, 또는 더 나은 DNA 및/또는 크로마틴 및/또는 NET- 분해 활성을 초래하는 하나 이상의 추가적 변형을 포함한다. 예를 들어, D1L3 변이체는 PCT/US2018/47084 (이는 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 적어도 하나 추가 빌딩 블록 치환 또는 점 돌연변이를 포함할 수 있고, 또는 프로테아제 내성을 증가시키기 위해 본원에 기재된 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, D1L3 변이체는 Cys 68의 치환을 가지며, 이는 Ala, Ser 및 Gly로부터 선택된 아미노산으로 선택적으로 치환된다. 일부 구현예에서, 변이체는 치환 N64_I70delinsHLTAVGK를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열 HLTAVGK는, 1 개, 2 개 또는 3 개의 치환, 결실 및/또는 삽입(종합적으로)에 의해, 단, Cys 잔기가 포함되지 않는 한, 추가로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, D1L3 변이체는 참조 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 5에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 짝을 이루지 않은 시스테인으로 여겨지는 Cys 68에 상응하는 위치에서 접합된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티를 갖는 D1L3 효소를 제공한다. 일부 구현예에서, D1L3 변이체는 C194에 상응하는 아미노산에 대한 PEG 접합을 갖는다. 이러한 구현예에서, PEG 모이어티는 다이설파이드 스크램블링 및/또는 단백질 미스폴딩을 피하면서 반감기 연장 특성을 제공할 것이다. 일부 구현예에서, PEG 모이어티는 온화한 조건 하에서 수행될 수 있는 말레이미드 화학을 통해 접합된다. 비닐 술폰, 디티오피리딘 및 요오드아세트아미드 활성화 화학과 같은 다른 접합 화학이 알려져 있고 사용될 수 있다. PEG 모이어티는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 일반적으로 10 kDa 내지 40 kDa 범위, 또는 20 내지 30 kDa 범위 일 수 있다.
대안적으로, 또는 추가로, 본 발명은 증가된 프로테아제 내성을 초래하는 하나 이상의 치환된 아르기닌 및/또는 라이신 잔기를 포함하는 D1L3 변이체를 제공한다. 일부 구현예에서, D1L3 변이체는 서열 번호: 4의 K180, K200, K259, 및/또는 R285에 상응하는 하나 이상의 위치에서 치환을 갖는다. 본 개시 내용에 따르면, 이러한 라이신 및 아르기닌 잔기는 잠재적인 프로테아제 민감성 부위로 확인된다. 따라서, 이들 잔기 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4 개)은 Ala, Gly, Leu, Ile, Val, Thr, Ser 및 Pro에서 독립적으로 선택된 잔기와 같은 하전되지 않은 잔기로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로테아제-민감성 라이신 또는 아르기닌 잔기는 빌딩 블록 치환의 일부로서 치환된다. 예를 들어, D1L3 변이체는 K180_A181delinsGL, P198_A201delinsRPSQ 및 K259A로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, D1L3 변이체는 하나 또는 둘 모두의 치환: K180_A181delinsGL 및/또는 P198_A201delinsRPSQ를 포함하며, 이들 중 어느 하나는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 선택적으로 변형되고, 단 빌딩 블록 치환은 R 또는 K 잔기로의 치환 또는 삽입에 의해 변형되지 않는다. 일부 구현예에서, D1L3 변이체는 플라스민, 트롬빈 및/또는 트립신으로부터 선택된 하나 이상의 프로테아제에 의한 단백질 분해에 대한 증가된 내성을 갖는다.
대안적으로 또는 추가로, D1L3 변이체는 쌍을 이룬 염기성 잔기의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 쌍을 이룬 염기성 잔기는 서열 번호: 4의 K50/R51, R80/R81, K114/R115, K199/K200, K226/K227, K291/K292, R297/K298/K299, 및 K303/R304로부터 선택된 위치에 상응한다. 일부 구현예에서, D1L3 변이체는 서열 번호: 4의 R114T, R114A, R114D, R114Q, K227S 및 K227E에 상응하는 치환으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, 쌍을 이룬 염기성 잔기의 하나 이상의 돌연변이는 R51K, R81K, R115K 및 R304K에 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 쌍을 이룬 염기성 잔기는 상응하는 빌딩 블록 치환을 사용하여 치환된다. 이들 구현예에 따르면, D1L3 변이체는 재조합 단백질 발현 시스템 (예를 들어, CHO 및 피키아 파스토리스)에 의해 발현되는 프로테아제에 대해 더 내성이 있을 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 시스테인 잔기의 하나 이상의 치환과 함께 서열 번호: 1에 의해 정의된 효소와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 DNase 1 (D1) 변이체를 제공한다. 일부 구현예에서, D1 단백질 변이체는 서열 번호: 1의 야생형 D1 단백질과 비교하여 증가된 단백질 안정성, 시험관내 발현 시스템으로 더 높은 생산 수준, 및/또는 실질적으로 적지 않거나, 같거나, 또는 더 나은 DNA 및/또는 크로마틴 및/또는 NET-분해 활성을 초래하는 하나 이상의 추가 변형을 갖는다. 예를 들어, D1 변이체는 PCT/US2018/47084에 개시된 적어도 하나의 추가 빌딩 블록 치환 또는 점 돌연변이를 포함할 수 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, D1 변이체는 C123 및 C126 중 하나 또는 둘 모두의 치환을 가지며, 이는 Ala, Ser 및 Gly로 선택적으로로 치환된다. 일부 구현예에서, D1 변이체는 치환 G122_N128delinsYQGDA를 포함한다. 일부 구현예에서, D1 변이체는 서열 번호: 1에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 C123 및/또는 C126에 상응하는 위치에서 접합된 PEG 모이어티를 갖는 D1 효소를 제공한다. 이러한 구현예에서, PEG 모이어 티는 다이설파이드 스크램블링 및/또는 단백질 미스폴딩을 피하면서, 반감기 연장 특성을 제공할 것이다. 일부 구현예에서, PEG 모이어티는 온화한 조건 하에서 수행될 수 있는 말레이미드 화학을 통해 접합된다. 비닐 술폰, 디티오피리딘 및 요오드아세트아미드 활성화 화학과 같은 다른 접합 화학이 알려져 있고 사용될 수 있다. PEG 모이어티는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 일반적으로 10 kDa 내지 40 kDa 범위, 또는 20 내지 30 kDa 범위 일 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 치환된 시스테인 잔기와 함께, 서열 번호: 2로 정의된 효소와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 D1L1 변이체를 제공한다. 시스테인 잔기(들)는 선택적으로 D1 패밀리 (예를 들어, C22 및/또는 C50) 내에서 보존되지 않으며, Gly, Arg 또는 Ser으로 선택적으로 치환되거나, 빌딩 블록 치환의 일부로 치환된다. 일부 구현예에서, D1L1 변이체는 서열 번호: 2에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 C22 및/또는 C50에 상응하는 위치에서 접합된 PEG 모이어티를 갖는 D1L1 효소를 제공한다. 이러한 구현예에서, PEG 모이어티는 다이설파이드 스크램블링 및/또는 단백질 미스폴딩을 피하면서 반감기 연장 특성을 제공할 것이다. 일부 구현예에서, PEG 모이어티는 온화한 조건 하에서 수행될 수 있는 말레이미드 화학을 통해 접합된다. 비닐 술폰, 디티오피리딘 및 요오드아세트아미드 활성화 화학과 같은 다른 접합 화학이 알려져 있고 사용될 수 있다. PEG 모이어티는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 일반적으로 10 kDa 내지 40 kDa 범위, 또는 20 내지 30 kDa 범위 일 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 치환된 시스테인 잔기와 함께, 서열 번호: 3에 의해 정의된 효소와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 D1L2 변이체를 제공한다. 시스테인 잔기는 D1 패밀리(예를 들어, C43) 내에서 보존되지 않을 수 있고, Gly, Arg 또는 Ser으로 선택적으로 치환되거나, 빌딩 블록 치환의 일부로서 치환된다. 일부 구현예에서, D1L2 변이체는 서열 번호: 3에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 C43에 상응하는 위치에서 접합된 PEG 모이어 티를 갖는 D1L2 효소를 제공한다. 이러한 구현예에서, PEG 모이어티는 다이설파이드 스크램블링 및/또는 단백질 미스폴딩을 피하면서 반감기 연장 특성을 제공할 것이다. 일부 구현예에서, PEG 모이어티는 온화한 조건 하에서 수행될 수 있는 말레이미드 화학을 통해 접합된다. 비닐 술폰, 디티오피리딘 및 요오드아세트아미드 활성화 화학과 같은 다른 접합 화학이 알려져 있고 사용될 수 있다. PEG 모이어티는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 일반적으로 10 kDa 내지 40 kDa 범위, 또는 20 내지 30 kDa 범위 일 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 D1, D1L1, D1L2 또는 D1L3 변이체 뿐만 아니라 벡터 및 숙주 세포를 암호화하는 단리된 폴리 뉴클레오티드를 제공한다. 숙주 세포는 피키아 파스토리스와 같은 비-포유 동물이든 CHO 세포와 같은 포유류이든 박테리아 또는 진핵 생물을 포함한 임의의 발현 시스템의 세포 일 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리 뉴클레오티드의 전달은 치료를 위해 사용된다. 암호화 폴리 뉴클레오티드는 공지된 절차, 예를 들어, 전기천공법 또는 세포압착법 및/또는 벡터 (바이러스 벡터 포함)를 사용하여 mRNA 또는 DNA 구조물로서 전달될 수 있다. mRNA 폴리 뉴클레오티드는 선천적 면역계의 활성화를 피하기 위해 알려진 변형 (mmRNA)을 포함할 수 있다. 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO 2014/028429를 참조한다. 일부 구현예에서, 폴리 뉴클레오티드는 대상체의 신체로 전달된다. 일부 구현예에서, 폴리 뉴클레오티드는 시험관내 세포로 전달되고, 세포는 대상체의 신체로 전달된다. 세포는 예를 들어, 백혈구 (예를 들어, T 세포 또는 대식세포), 내피 세포, 상피 세포, 간세포 또는 줄기 세포일 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 세포외 DNASE 변이체를 생산하는 방법을 제공한다. 방법은 세포외 DNASE를 암호화하는 폴리 뉴클레오티드를 발현하는 세포를 배양하고, 재조합 DNase 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 세포는 원핵 또는 진핵 세포 일수 있다. 일부 구현예에서, DNase는 선택적으로 피키아 파스토리스 또는 사카로마이세스 spp인 비-포유 동물 발현 시스템을 사용하여 발현된다. 일부 구현예에서, CHO 세포와 같은 포유 동물 발현 시스템이 적용된다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 세포외 DNASE 또는 이의 변이체, 또는 선택적으로 기재된 바와 같은 폴리 뉴클레오티드 또는 벡터, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
벡터는 일반적으로 단리된 핵산을 포함하며 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는 데 사용할 수 있다. 선형 폴리 뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 관련된 폴리 뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 수많은 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 벡터는 자체적 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 이 용어는 또한 예를 들어, 폴리 라이신 화합물, 리포좀 등과 같은 핵산의 세포 내부로의 전달을 촉진하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노 바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로 바이러스 벡터 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
약학적 조성물은 국소, 비경구 또는 폐 투여를 포함하는 임의의 투여 경로를 위해 제형화 될 수 있다. 다양한 구현예에서, 조성물은 피 내, 근육 내, 복강 내, 관절 내, 정맥 내, 피하, 동맥 내, 경구, 설하, 폐 또는 경피 투여용으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 정맥 내 또는 피하 투여용으로 제형화된다.
다른 양태에서, 본 발명은 세포외 DNA 분해, 세포외 크로마틴 분해, 세포외 트랩 (ET) 분해 및/또는 호중구 세포외 트랩 (NET) 분해를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에 기재된 세포외 DNASE 또는 그의 변이체 또는 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 대상체가 세포외 DNA 또는 크로마틴 분해 (ET 또는 NET 분해 포함)를 필요로 하는 예시적인 적응증은 PCT/US18/47084에 개시되어 있으며, 그 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 서열 번호: 8 내지 서열 번호: 30 중 어느 하나에 의해 표시되는 단백질의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
대상체를 치료하는 방법이 기재된 각각의 경우에서, 본 발명은 마찬가지로 ET 및/또는 NET과 관련된 질환의 치료 또는 예방을 위한 하나 이상의 세포외 DNASE 단백질의 용도를 제공한다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 NET의 존재 또는 축적을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 치료, 예방 또는 관리하는 방법을 제공한다. 이러한 질환 또는 병태는 만성 호중구, 호중구 응집 및 백혈구울혈, 혈전증 및 혈관 폐색, 허혈-재관류 손상, 외과적 및 외상성 조직 손상, 급성 또는 만성 염증 반응 또는 질환, 자가 면역 질환, 심혈관 질환, 대사 질환, 전신 염증, 호흡기 염증 질환, 신장 염증 질환, 이식 조직과 관련된 염증 질환 (예를 들어, 이식편 대 숙주 질환) 및 암 (백혈병 포함)과 관련된 질병을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
특정 구현예에서, 본 발명은 D1L3의 결핍 또는 D1의 결핍을 특징으로 하는 질환 또는 병태의 치료에 관한 것이다. 일부 경우에, 대상체는 Dnase1l3 유전자 또는 Dnase1 유전자에 돌연변이 (예를 들어, 기능 돌연변이 상실)를 갖는다. 이러한 대상체는 자가 면역 질환 (예를 들어, 전신 홍반성 루푸스 (SLE) (루푸스 신염 포함), 경피증 또는 전신 경화증, 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환 (크론병 및 궤양성 대장염 포함) 및 두드러기성 혈관염)으로 나타날 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 D1의 후천적 억제제 (예를 들어, 항-DNase1-항체 및 액틴) 및/또는 D1L3 (예를 들어, 항 -Dnase1l3- 항체)를 갖는다. 이러한 대상체는 또한 자가 면역 또는 염증성 질환 (예를 들어, SLE, 전신 경화증)을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체는 관 시스템을 폐색하는 NET을 갖거나 가질 위험이 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 DNASE 효소는 췌장염, 담관염, 결막염, 유방염, 안구 건조증, 정관의 폐쇄 또는 신장 질환을 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체는 내피 표면 (예를 들어, 외과적 유착), 피부 (예를 들어, 상처/흉터), 또는 윤활관절 (예를 들어, 통풍 및 관절염, 예를 들어, 류마티스 관절염)에 NET이 축적되거나 축적될 위험이 있다. 본원에 기재된 DNASE 효소는 외과적 유착과 같은, 그러나 이에 한정되지 않은 내피 표면상의 NET의 축적을 특징으로 하는 병태를 치료하기 위해 대상체에게 투여 될 수 있다.
본원에 개시된 DNASE 효소가 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 NET과 관련된 다른 질환 및 병태는 다음을 포함한다: ANCA-관련 혈관염, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 호중구 피부병, 피부 근염, 화상, 봉와직염, 뇌수막염, 뇌염, 중이염, 인두염, 편도선염, 폐렴, 심내막염, 방광염, 신우신염, 충수염, 담낭염, 췌장염, 포도막염, 각막염, 파종성 혈관 내 응고, 급성 신장 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 쇼크 간, 간신 증후군, 심근 경색, 뇌졸중, 허혈성 장, 하지 허혈, 고환 염전, 자간전증, 자간증 및 고형 장기 이식 (예를 들어, 신장, 심장, 간 및/또는 폐 이식). 더욱이, 본원에 개시된 DNASE 효소는, 예를 들어, 피부에 국소 적용함으로써, 예를 들어, 외과적 절개, 열상 또는 화상을 입은 개인에서, 그 위험에 처한 개인에서 흉터 또는 구축을 예방하는데 사용될 수 있다.
다양한 구현예에서, 대상체는 D1 및 스트렙토도르나제를 포함하는 야생형 Dnase로 치료되었거나 치료받은 질환을 갖는다. 이러한 질환 또는 병태는 혈전증, 뇌졸중, 패혈증, 폐 손상, 죽상 경화증, 바이러스 감염, 겸상 적혈구 질환, 심근 경색, 귀 감염, 상처 치유, 간 손상, 심내막염, 간 감염, 췌장염, 일차 이식 기능 장애, 하지 허혈 재관류, 신장 손상, 혈액 응고, 명반 유발 염증, 간 신장 손상, 흉막 삼출물, 혈흉, 담즙 내 혈전, 공기압 후 빈혈, 궤양, 이비인후과 질환, 구강 감염, 경미한 부상, 부비동염, 수술 후 비성형, 불임, 방광 카테터, 상처 청소, 피부 반응 검사, 폐렴 구균성 뇌막염, 통풍, 다리 궤양, 낭포성 섬유증, 카테게너 증후군, 천식, 폐엽성무기폐, 만성 기관지염, 기관지 확장증, 루푸스, 원발성 섬모 운동 이상증, 세기관지염, 농흉, 흉막 감염, 암, 안구 건조증, 하기도 감염, 만성 혈종, 알츠하이머 병 및 폐쇄성 폐 질환을 포함한다.
본 발명의 다른 양태 및 구현예는 다음 실시예로부터 명백할 것이다.
실시예
모든 생물의약품의 거의 70%는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 사용하여 생산된다. 실제로, 야생형 DNASE1 (D1; 도르나제 알파)은 일반적으로 CHO 세포에서 생산된다. CHO 세포를 사용한 세포주 개발 및 대규모 생산에 있어 상당한 이점이 있음에도 불구하고, 적지 않은 정도의 가변성과 세포 성장 특성을 예측하거나 모델링하는 신뢰할 수 있는 방법이 없기 때문에, Dnase 효소의 생산에 여전히 중요한 문제가 남아 있다. 중요한 것은, CHO 세포가 D1의 과활성 변이체를 안정적으로 생산할 수 없었기 때문에 임상적 제조를 방해했으며, 본 개시 전에는 DNASE1-유사 3 (D1L3)을 포함한 다른 DNASE1-단백질 패밀리 구성원의 제조 특성이 알려지지 않았다.
CHO 및 미생물 발현 시스템을 사용하여, D1L3 제조에서 낮은 생산 수율, 단백질 분해, 단백질 미스폴딩, 및 오류 또는 원치 않는 글리코실화를 포함하는 여러 문제가 확인되었다. 본 개시 내용은 D1L3의 치료적 특성을 개선할 수 있는 제조에서 이러한 문제 및 기타 문제에 대한 기술적 솔루션을 제공한다.
실시예 1: 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 피키아 파스토리스에서 염기성 도메인 결실 (BDD)을 갖는 D1L3의 발현 및 특성화
DNASE1과 DNASE1L3은 각각 단백질이 없는 DNA와 DNA-히스톤-복합체 (즉, 크로마틴)를 우선적으로 절단한다. 이전 연구에서는 DNASE1에 없는 DNASE1L3의 C-말단에 있는 염기성 도메인 (BD)은, 두 효소의 독특한 기질 특이성을 담당한다고 시사한다(Sisirak et al., Cell, 2016; Keyel, Developmental Biology, 2017).
빌딩 블록 단백질 엔지니어링이라고 하는 단백질 엔지니어링 기술은, PCT/US18/47084 및 US 62/800,790에 기재되어 있으며, 그 개시 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 이 접근법은 DNASE1 및 DNASE2-단백질 패밀리의 구성원에 적용될 수 있다. 이 방법은 다음 단계를 기초로 한다: 공여자 및 수여자 Dnase 효소의 단백질-단백질 정렬 제공하는 단계; 전달을 위한 가변 아미노산 서열을 확인하고, 가변 아미노산은 공여자 및 수여자 Dnase 효소에서 하나 이상의 보존된 아미노산 측면에 위치하는 단계; 수여자 Dnase의 가변 아미노산을 공여자 Dnase의 가변 아미노산으로 치환하여 키메라 Dnase를 생성하는 단계; 및 키메라 Dnase를 재조합적으로 생산하는 단계.
크로마틴 분해 활성 ("크로마티나제" 활성)을 담당하는 아미노산을 특성화하기 위해, PCT/US2018/047084에 개시된 바와 같이 야생형 D1L3은 D1의 빌딩 블록 치환으로 치환되었다. D1L3에 빌딩 블록 치환은 인간 D1에서 선택되고, 다음의 돌연변이 특징을 이루는 인간 D1L3의 변이체가 된다: M21_R22delinsLK, C24_S25delinsAA, V28_S30delinsIQT, S34T, Q36_V44delinsMSNATLVSY, K47_K50delinsQILS, C52Y, I55_M58delinsIALVQE, I60_K61delinsVR, N64_I70delinsHLTAVGK, M72_K74delinsLDN, R77_I83delinsQDAPD, N86H, I89V, S91_R92delinsEP, T97S, Q101R, A103L, L105V, K107_L110delinsRPDQ, V113_R115delinsAVD, H118Y, H120D, Y122_A127delinsGCEPCGN, V129T, S131N, F135_V136delinsAI, W138R, Q140_H143delinFSRF, A145_D148delinsEVRE, V150A, I152V, T156_T157delinsAA, E159_S161delinsGDA, K163A, E167A, V169_E170delinsYD, T173L, K176_R178delinsQEK, K180_A181delinsGL, N183_F186delinsDVML, P198_A201delinsRPSQ, K203_N204delinsSS, R208W, D210S, R212T, V214Q, G218P, Q220_E221delinsSA, V225_S228delinsATP, N230H, L238_R239delinsVA, Q241_S246delinsMLLRGA, K250D, N252_V254delinsALP, D256N, K259A, K262G, T264_E267delinsSDQL, L269_V271delinsQAI, F275Y, F279_K280delinsVM, Q282_S205delinsK.
이들 63 개의 D1L3 변이체는 크로마틴 분해 활성의 손실 또는 획득에 대해 스크리닝되었다. 간단히 말해서, D1L3 변이체는 시험관내 발현 벡터를 사용하여 CHO 세포에서 일시적으로 발현되었다. 배양 상층액을 수집하고 정제된 핵을 크로마틴 공급원으로 사용하여 크로마틴 분해 활성을 테스트했다. 도 1에 도시된 바와 같이, D1의 빌딩 블록 치환 #17 및 #63은 야생형 D1L3과 비교할 때 고분자량 (HMW) 크로마틴의 작은 단편으로의 분해를 현저하게 개선했다. 빌딩 블록 치환 #7은 위치 101의 글루타민을 아르기닌 (서열 번호: 8)으로 대체하는 미스센스 돌연변이 Q101R을 유발한다. 빌딩 블록 치환 #63은 D1L3의 전체 C-말단 BD를 아미노산 위치 283에서 305로 삭제하고 위치 282에서 글루타민 (Q)을 라이신 (서열 번호: 9)으로 대체하는 돌연변이 Q282_S305delinsK를 유발한다. 다음으로, 본 발명자들은 야생형 D1L3 및 두 돌연변이체의 발현 수준을 검출하기 위해 상층액의 웨스턴 블롯 분석을 수행했다(도 2). 놀랍게도, 본 발명자들은 야생형 D1L3 및 Q101R 돌연변이체를 가진 샘플에서 크기가 다른 두개의 D1L3 변이체를 검출했다. Q282_S305delinsK가 있는 샘플에는 더 작은 D1L3 변형만 포함되었다. 데이터는 야생형 D1L3의 BD가 CHO 세포에서 발현 또는 분비 후(post-secretion) 자발적으로 제거(예를 들어, 단백질 분해)됨을 시사한다. 두 개의 D1L3 변이체는 WT-D1L3을 안정적으로 발현하는 CHO 세포의 상층액에서도 검출되었다(도 3). 참고로, 염기성 도메인 결실된-D1L3(BDD-D1L3)은 야생형 D1L3과 비교할 때 상당히 증가된 크로마틴 활성을 나타냈다.
다음으로, 본 발명자들은 CHO 세포에 대한 대안적인 미생물 발현 시스템으로 피키아 파스토리스를 테스트했다. 본 발명자들은 일반적으로 야생형 D1L3과 비교할 때 BDD-D1L3에서 더 높은 발현 수준을 관찰했다. 여기서, 본 발명자들은 피키아 파스토리스발효 상층액으로부터 야생형 D1L3 및 BDD-D1L3을 정제하고 특성화했다 (도 4). 예기치 않게, 본 발명자들은 야생형 D1L3이 아미노산 위치 K291, K291 또는 S293에서 BD 내에서 단백질 분해로 길이를 줄여(truncated), 정제 후 D1L3 변이체의 이종 혼합으로 이어지는 것을 관찰했다. 야생형 D1L3과 달리 3 개의 빌딩 블록 치환 (F275Y, F279_K280delinsVM, Q282_S205delinsK)으로 인한 BDD-D1L3의 발현은 순수한 단백질을 생성했다.
다음으로, 본 발명자들은 두 D1L3 정제의 크로마티나제 활성을 비교했다. 본 발명자들은 위치 K291, K291 또는 S293에서 BD 길이가 줄어듬을 갖는 D1L3 변이체의 이종 혼합이 F275Y/F279_K280delinsVM/Q282_S205delinsK로 인해 전체 BD 결실을 갖는 D1L3 변이체에 비하여 약 10-폴드 더 낮은 크로마틴 활성을 가짐을 관찰했다. 종합적으로, 데이터는 BD의 단백질 분해 절단이 미생물 및 포유류 발현 시스템 (즉, CHO 및 피키아 파스토리스)에서 자연적으로 발생할 수 있고 BD의 제거가 크로마틴을 분해하는 D1L3 활성을 활성화하는 것으로 나타난다는 것을 예시한다.
실시예 2: 생물반응기의 CHO 세포에서 D1L3의 발현
본원에서는 야생형 D1L3 (서열 번호: 4)을 생산하는 안정한 CHO 세포주의 개발이 개시된다. 세포주는 표준 CHO 배양 배지를 사용하여 생물반응기에서 배양되었다. 구체적으로, 도 5는 cGMP-적합성 조건하에 생물반응기에서 CHO 세포에 의해 발현되고 분비되는 인간 D1L3의 웨스턴 블롯을 보여준다. 샘플은 다른 시점 (t1 - t3)에서 수집되었다. 소량의 D1L3 및 D1L3 단편만 검출되었다. 데이터는 D1L3의 낮은 생산 수율이 D1L3의 제조에 있어 문제라는 것을 시사한다.
본원에 개시된 바와 같이, 야생형 D1L3의 높은 생산 수준은 배양 배지에 다가 음이온을 첨가함으로써 달성되었다. 이러한 다가 음이온은 하나 이상의 헤파린, 덱스트란 설페이트, 시트르산철 및 에틸렌디아민테트라아세트산을 포함할 수 있으며, "항 세포 군집 시약"에서 생물학적 활성 구성요소를 나타낸다. 구체적으로, 본 발명자들은 CHO 배양 배지에 덱스트란 설페이트를 첨가하여 D1L3 및 D1L3 단편이 크게 증가하는 것을 관찰했다 (도 5). 데이터는 다가 음이온이 D1L3의 생산 수율을 증가시켰지만 단백질 분해를 예방하지는 못했다는 것을 예시한다.
도 6a는 덱스트란 설페이트(DS)와 같은 다가 음이온이 D1L3과 복합체를 형성함을 보여준다. D1L3-DS-복합체는 생산 과정 중에 음전하를 띤 표면에 의한 D1L3의 상호 작용 및 청소(scavenging)를 예방한다. 이러한 음전하를 띤 표면은 생산 세포의 세포 표면 (예를 들어, CHO 세포, 피키아 파스토리스, 사카로마이세스 spp.), 죽어가는 세포에 노출된 DNA 및 생물 반응기 표면을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 도 6b 및 도 6c는 DS-D1L3 복합체로부터 D1L3의 2 단계 정제 과정을 보여준다. 도 6에 도시된 바와 같이, 첫 번째 단계는 DS-D1L3 복합체를 분해하는 것을 목표로 한다. 분해는 DS-D1L3 복합체를 강력한 음이온 교환 표면으로 배양하여 달성할 수 있으며, 이는 DS를 결합하여 D1L3를 해방시킨다. 구체적으로, 정제 과정은 강한 음이온 교환 수지로 채워진 크로마토그래피 컬럼을 통해 DS-D1L3을 포함하는 배양 배지를 통과시킨 후 DS-없는 D1L3을 포함하는 유동을 수집하는 것을 포함할 수 있다. 정제 과정의 두 번째 단계는 도 6c에 도시되어 있고, 강력한 양이온 교환 수지의 적용을 통해 DS가 없는 흐름에서 D1L3의 친 화성 정제를 포함한다. 결론적으로, D1L3의 생산 수율은 덱스트란 설페이트와 같은 다가 음이온의 첨가를 통해 실질적으로 증가시킬 수 있다.
실시예 3: 프로테아제 내성을 위한 D1L3 엔지니어링
야생형 D1L3에는 50 개의 아르기닌 및 라이신 잔기가 포함되어 있어, 효소가 트립신, 트롬빈 및 플라스민과 같은 프로테아제에 특히 취약하다. 이 실시예에서 트립신 및 플라스민 절단 부위는 D1L3에서 확인되었다. 부위는 D1L3의 생성된 프로테아제 내성 변이체로 돌연변이될 수 있다.
간단히 말해, 정제된 D1L3은 트립신으로 분해되었다. D1L3 단편이 분리되었고, 단편의 아미노산 서열을 액체 크로마토그래피 (LC) 및 질량 분석법 (MS)의 조합을 사용하여 결정되었다. 트립신은 다음의 아르기닌 및 라이신 잔기에서 D1L3을 절단하는 것으로 확인되었다: R22, R29, R51, R66, R80, R81, R95, K99, R115, K147, K163, K180, R208, R212, R235, R239, K250, 및 K262. 이러한 아르기닌 및 라이신 잔기는 알라닌, 발린 및 세린과 같은 작은 아미노산 또는 Grantham의 거리 점수에 따라 유사한 특성을 갖는 아미노산 (예를 들어, 히스티딘, 글루타민 및 글루타메이트; 도 7)으로 치환될 수 있다. 단백질 분해 효소 내항성인 D1은 R51, R95, K99 및 R235에 해당하는 아르기닌 및 라이신 잔기를 특징으로 하며, 이는 이러한 잔기가 D1L3의 단백질 분해에 주로 책임이 없음을 시사한다.
빌딩 블록 단백질 엔지니어링은 트립신 절단 부위를 포함하는 D1L3의 빌딩 블록을 대체하기 위해 D1에서 다음 빌딩 블록을 전달하기 위해 적용되었다 (도 7): R22 (돌연변이: M21_R22delinsLK), R29 (V28_S30delinsIQT), R66 (N64_I70delinsHLTAVGK), R80 (R77_I83delinsQDAPD), R81 (R77_I83delinsQDAPD), R115 (V113_R115delinsAVD), K163 (K163A), K180 (K180_A181delinsGL), R208 (R208W) MR212 (R212T), R239 (L238_R239delinsVA), K250 (K250D), K250 (K250D).
플라스민은 자이모겐 플라스미노겐의 활성화에 의해 생성되는 혈장 프로테아제다. 플라스미노겐활성화인자억제제 1 (PAI-1)은 플라스민의 활성화를 억제한다. 흥미롭게도 PAI-1은 혈청에서 D1L3의 효소 활성을 증가시켜, 플라스민이 D1L3을 단백질 분해로 비활성화 할 수 있음을 시사한다. 그러나, D1L3에서 플라스민 절단 부위는 확인되지 않았다.
인실리코 분석은 아미노산 조합 라이신-알라닌 (KA) 또는 아르기닌-알라닌 (RA)이 바람직하게는 플라스민 유사 활성을 갖는 프로테아제 플라스민 또는 프로테아제에 의해 절단되는 것으로 여겨진다는 것을 보여주었다. D1L3은 총 4 개의 추정 플라스민 절단 부위를 포함한다 (도 8): (사이트 1) K180/A181 (신호 펩티드가 없는 K160/A161), (사이트 2) K200/A201 (신호 펩티드가 없는 K180/A181), (사이트 3) K259/A260 (신호 펩티드가 없는 K239/A240) 및 (사이트 4) R285/A286 (신호 펩티드가 없는 R270/A250). D1과 D1L3의 쌍을 이룬 정렬을 사용하여, 본 발명자들은 플라스민 절단 부위가 D1에 존재하지 않음을 발견했다 (도 8). 이 데이터는 D1 활성이 트롬빈 및 플라스민과 같은 혈청 프로테아제에 의한 불활성화에 내성이 있다는 사실과 일치한다. 빌딩 블록 단백질 엔지니어링은 플라스민 절단 부위를 포함하는 D1L3의 빌딩 블록을 대체하기 위해 D1에서 다음의 빌딩 블록을 전달하기 위해 적용되었다 (도 9): (사이트 1) K180_A181delinsGL, (사이트 2) P198_A201delinsRPSQ 및 (사이트 3) K259A. R285/A286 (사이트 4)은 D1에 없는 C 터미널 연장에 위치한다. 결과적으로, 본 발명자들은 4 개의 추정 플라스민 절단 부위가 모두 돌연변이된 D1L3 변이체를 생성했다: K180_A181delinsGL, P198_A201delinsRPSQ, K259A 및 R285A. 다음으로, 본 발명자들은 D1L3 변이체에 의한 크로마틴 분해를 분석했고 돌연변이된 D1L3에서 강력한 크로마틴 분해 활성을 관찰했다 (도 10). 종합적으로, 데이터는 4 개의 아르기닌 및 라이신 잔기인 K180, K200, K259 및 R285가 효소 활성을 손상시키지 않고 단백질 분해의 위험을 줄이기 위해 돌연변이될 수 있음을 보여준다.
다음으로, 정제된 D1L3은 정제된 플라스민으로 분해되었다. D1L3 단편은 분리되었고 LC 및 MS의 조합을 사용하여 단편의 아미노산 서열을 결정했다. 본 발명자들은 플라스민이 R22, R29, K45, K47, K74, R81, R92, K107, K176, R212, R226, R227, K250, K259 및 K262에서 D1L3을 절단했다는 것을 확인했다. 이러한 아르기닌 및 라이신 잔기는 알라닌, 발린 및 세린과 같은 작은 아미노산 또는 Grantham의 거리 점수에 따라 유사한 특성을 갖는 아미노산 (예를 들어, 히스티딘, 글루타민 및 글루타메이트; 도 11)으로 치환될 수 있다. 프로테아제 내성인 D1은 K45에 상응하는 라이신 잔기를 특징으로 하며, 이것는 이 잔기가 플라스민에 의한 D1L3의 단백질 분해에 주로 책임이 없음을 시사한다. 빌딩 블록 단백질 엔지니어링은 D1으로부터 다음의 빌딩 블록을 전송하여 실리코에서 트립신 절단 부위를 포함하는 D1L3의 빌딩 블록을 대체하기 위해 적용되었다 (도 11): R22 (Mutation: M21_R22delinsLK), R29 (V28_S30delinsIQT), K47 (K47_K50delinsQILS), K74 (M72_K74delinsLDN), R81 (R77_I83delinsQDAPD), R92 (S91_R92delinsEP), K107 (K107_L110delinsRPDQ), K176 (K176_R178delinsQEK), R212 (R212T), K226 (V225_S228delinsATP), K227 (V225_S228delinsATP), K250 (K250D), K259 (K259A), 및 K262 (K262G).
마지막으로, 재조합적으로 발현된 야생형 D1L3가 단리되었고 C-말단 서열이 분석되었다. 각각 S290 (서열 번호: 10), K291 (서열 번호: 11) 및 K292 (서열 번호: 12)로 끝나는 3 개의 상이한 아미노산 서열이 각각 확인되었다 (도 4, 실시예 1). 데이터는 대규모 제조동안 D1L3의 현저한 단백질 분해 절단 부위로 라이신 잔기 291 및 292를 확인한다.
실시예 4: 성능 저하를 방지하기 위한 D1L3 엔지니어링
본 발명자들은 피키아 파스토리스에서 이종 발현 후 D1L3의 단편화를 관찰했다. 단편 분석은 단백질 분해 절단 부위로서 쌍을 이룬 염기성 아미노산, 아르기닌 (R) 및 라이신 (K) 잔기를 특성화했다. CHO 세포에서 D1L3을 발현한 후에도 유사한 분해 패턴이 관찰되었다. 이러한 관찰은 피키아 파스토리스와 CHO 세포가 쌍을 이룬 염기성 아미노산에서 D1L3을 절단하는 상동 프로테아제를 공유하지만, 그 효과는 CHO 세포에서 더 중요하다는 것을 시사한다.
쌍을 이룬 염기성 아미노산 절단 효소 (PACE)가 DNASE1L3 단편화에 기여한 것으로 확인되었다. 푸린 (Uniprot ID: P09958)으로도 알려진 PACE는 인간과 포유류에서 발현된다. 피키아 파스토리스는 쌍을 이룬 염기성 아미노산, 즉 아스파르트산 프로테아제 3 (유전자: Ysp1; Uniprot ID: P32329)과 켁신 (유전자: Kex2; Uniprot ID : P13134)을 표적으로 하는 두 가지 효소를 발현한다. 따라서 DNASE1L3 및 DNASE1L3 변이체는 피키아 파스토리스 및 푸린, 아스파르트산 프로테아제 3 및 켁신이 약리학적으로 억제되거나 유전적으로 고갈된 CHO 세포에서 발현될 수 있다.
추가로, DNASE1L3 및 DNASE1L3 변이체에서 쌍을 이룬 염기성 아미노산의 돌연변이는 단편화가 감소된 CHO 및 피키아 파스토리스에서의 발현을 가능하게 한다. DNASE1L3 단편의 분석은 서열 번호: 2에서 K50/R51, R80/R81, K114/R115, K199/K200, K226/K227, K291/K292, R297/K298/K299 및 K303/R304 위치에서 쌍을 이룬는 염기성 아미노산을 특징으로 하는 것으로 확인되었습니다.
미국 임시 특허 출원 제62/800,790호 (전체 내용이 여기에 참조로 포함됨)에 개시된 바와 같이, 다른 종의 DNASE1L3은 R114T (마우스), R114A (쥐), R114D (기니 피그), R114Q (소), K227S (개) 및 K227E (코끼리)를 포함하는 이러한 절단 부위에서 아미노산 치환을 특징으로 한다. 이러한 아미노산 치환은 인간 DNASE1L3에 적용되어 효소가 CHO 세포 및 피키아 파스토리스에서의 발현 동안을 포함하여 단백질 분해에 내성을 갖게 할 수 있다.
켁신은 바람직하게는 KR 및 RR 잔기 다음에 절단된다. K50/R51, R80/R81, K114/R115 및 K303/R304의 DNASE1L3 특성은 4 개의 KEX2-절단 부위다. 이러한 잔기의 아미노산 치환은 DNASE1L3이 KEX2에 내성을 갖게 하고 피키아 파스토리스 및 CHO 세포에서 DNASE1L3 및 DNASE1L3 변이체의 발현을 가능하게 한다. 이러한 아미노산 치환은 보존적일 수 있다, 예를 들어, R51K, R81K, R115K 및 R304K.
실시예 5: 고 분자량 응집체를 방지하기 위한 D1L3 변이체 엔지니어링
CHO 세포에서 D1L3의 cGMP-호환성 발현 동안 (도 12A), D1L3의 고 분자량 응집체의 축적이 관찰되어, D1L3의 임상적 제조에 대한 추가적인 도전을 지적했다. 고 분자량 응집체는 피키아 파스토리스에서 훨씬 낮은 정도로 관찰되었다.
환원 조건을 생물 반응기 물질의 단백질에 적용하면 D1L3 응집체가 용해되었다. 데이터는 D1L3 응집체 형성이 단백질 발현동안 다이설파이드 브릿지를 통한 분자 내 및/또는 분자 간 가교에 의해 발생된다는 것을 예시한다. 구체적으로, 도 12b에 도시된 바와 같이, 겔은 비-환원 조건 하에서 실행되었고 시간에 따른 D1L3의 고 분자량 응집체의 축적을 보여준다. 겔은 환원 조건 하에서 실행되었으며 응집체는 검출되지 않았다. 이 데이터는 잘못된 분자 내 및 분자 간 다이설파이드 결합이 제조 조건에서 인간 D1L3의 미스폴딩을 유발한다는 것을 보여준다.
도 13은 인간 D1 (서열 번호: 1) 및 인간 D1L3 (서열 번호: 4)의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 신호 펩티드, 보존된 아미노산, 가변 아미노산, 비보존된 시스테인 잔기 및 보존된 시스테인 잔기가 강조 표시된다. 비보존된 시스테인 잔기의 돌연변이는 단백질 발현 동안 분자 내 및 분자 간 다이설파이드 결합 가능성을 감소시킨다. D1L3 (서열 번호: 4)의 아미노산 서열 분석은 5 개의 시스테인 (C) 잔기: C24, C52, C68, C194 및 C231 (도 14)의 존재를 나타냈다. 시스테인 잔기 C194 및 C231은 DNASE1 단백질 패밀리의 모든 구성원 사이에서 보존되며 DNASE1의 효소 활성에 필요한 다이설파이드 결합을 형성한다. D1L3에서 시스테인 잔기의 기능은 본 개시 내용 전에 알려지지 않았다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같이, 이들 시스테인 잔기의 돌연변이는 다이설파이드 브릿지를 통한 가교를 감소시켜 단백질 생산 수율을 증가시킨다.
시스테인 잔기는 특히 다른 작은 아미노산, 즉 알라닌 (A), 세린 (S) 및 글리신 (G)으로 대체될 수 있다. 이러한 치환은 다음과 같은 아미노산 돌연변이 C24A/S/G, C52A/S/G, C68A/S/G, C194A/S/G 및 C231A/S/G를 유발한다. 추가로, 보존된 시스테인 잔기를 포함하는 빌딩 블록은 DNASE1- 단백질 패밀리 (예를 들어, D1 및 D1L3)의 공여자 DNase의 빌딩 블록으로 대체될 수 있다. 다음 D1의 빌딩 블록은 비보존된 않은 시스테인 잔기 C24, C52 및 C68: C24_S25delinsAA, C52Y 및 N64_I70delinsHLTAVGK을 포함하는 D1L3의 빌딩 블록을 대체하는 데 사용되었다. PCT/US18/4708에 기재된 바와 같이, D1L3 변이체의 크로마틴 분해 활성이 정량화되었다. 기존의 아미노산 치환 (C24A, C52A) 및 빌딩 블록 치환 (C24_S25delinsAA, C52Y) 모두 크로마틴 분해를 완전히 제거하여 D1L3 활성에 C24 및 C52가 필요함을 나타낸다 (도 15). 중요한 것은, 통상적인 아미노산 치환 [C68A (서열 번호: 13)] 또는 BB 돌연변이 (N64_I70delinsHLTAVGK)에 의한 시스테인 C68의 돌연변이는 크로마틴 분해 활성을 초래하는 D1L3 변이체를 생성했다 (도 15). 아미노산 서열 정렬은 시스테인 C68이 다른 DNASE1- 단백질 패밀리 구성원들 사이에서 보존되지 않음을 보여주었으며, C68이 효소 활성에 필요하지 않다는 개념을 뒷받침한다. 더욱이, 고도로 보존된 시스테인 C194의 알라닌 (C194A)으로의 아미노산 치환이 관찰되었으나, 고도로 보존된 시스테인 C231의 알라닌 (C231A)으로의 돌연변이가 아니라 효소적으로 활성인 D1L3 변이체가 생성되었다 (도 15). 따라서, 시스테인 C68 및 C194는 D1L3 생산 중에 잘못된 다이설파이드 결합의 위험을 줄이기 위해 돌연변이될 수 있다.
유사한 접근 방식을 적용하여 DNase1 단백질 패밀리의 다른 구성원인: D1, DNase1-유사 1 (D1L1) 및 DNase1-유사 2 (D1L2)에서 비보존된 시스테인 잔기를 돌연변이시킬 수 있다. D1에는 C123과 C126의 두 가지 비보존 시스테인이 있다. D1L1은 D1L2의 C24 및 C52에 상응하는 두 개의 비보존 시스테인 잔기 (C22, C50)가 한 개의 비보존 시스테인 잔기인 C43만 가지고 있음을 보여준다. DNASE1 단백질 패밀리 구성원의 비보존된 시스테인 잔기의 돌연변이는 단백질 발현 중에 잘못된 다이설파이드 브릿지 통한 가교를 감소시켜 치료적 용도로 D1, D1L1, D1L2 및 D1L3의 제조를 허용한다.
실시예 6: 피키아 파스토리스에서 D1L3 및 알부민-D1L3 융합 단백질의 구축 및 발현
D1L3을 포함하는 재조합 인간 세포외 DNASES의 피키아 파스토리스 발현이 테스트되었다. 도 16a에 도시된 바와 같이, D1L3의 N-말단은 피키아 파스토리스에서 이종 단백질 발현을 위한 일반적인 도구인 사카로마이세스 세레비지애 (서열 번호: 46)의 알파-메이팅 인자 (aMF) 프리-프로 분비 리더에 의해 유도되었다. 본원에 개시된 바와 같이, aMF와 D1L3의 조합은 글리코실화로 인해 예상치 못한 aMF의 비-처리를 일으켰다 (도 16b). D1L3 단백질의 글리코실화는 D1L3의 임상적 제조를 위한 피키아 파스토리스의 사용을 예방한다. D1L3의 N-말단이 D1L3의 천연 분비 신호 펩티드에 의해 유도되었을 때, D1L3은 적절하게 처리되었다 [도16b, (서열 번호: 48)]. 중요한 것은 aMF가 D1L3의 천연 신호 펩티드와 비교할 때, D1L3 발현을 3-5 -폴드 증가시켰다는 것이다. 따라서 우리는 D1L3 융합 단백질의 처리를 테스트했다. 파일럿 연구에서, aMF와 인간 혈청 알부민 [HSA, (서열 번호: 39)]의 D1L3에 대한 N-말단 융합이 생성되었다 (도 17a). 일부 변이체에는 HSA와 D1L3 사이에 링커 펩티드가 포함되어 있다 [예를 들어, (GSSSS)3]. 도 17b 및 도 17c에 도시된 바와 같이, 피키아 파스토리스에서 융합 단백질의 발현은 비-당화 및 효소 활성 D1L3을 생성하였다. 더욱이, 발현 수준은 D1L3의 천연 분비 신호 펩티드-유도 발현에 비해 5-10-폴드 증가했다. 종합적으로, 데이터는 D1L3와 알부민의 융합은 피키아 파스토리스에서 제조할 수 있음을 예시한다.
이러한 파일럿 연구에 기초하여, 야생형 D1L3 및 BDD-D1l3의 다양한 HSA 융합 구조물을 설계하고 표적 단백질의 발현 수준 (서열 번호: 17 내지 28)에 대해 스크리닝했다. 도 18에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 인간 혈청 알부민 (서열 번호: 17)과 BDD-D1l3 변이체 (서열 번호: 16)의 N-말단 융합은 발현 수준을 실질적으로 증가시키지 않는다는 것을 관찰했다. 그러나, 주목할 점은, 본 발명자들은 HSA와 BDD-D1L3 사이에 글리신 (G)과 세린 (S) 잔기로 구성된 유연한 링커를 삽입했을 때 발현 수준의 강한 증가를 검출했다. 더욱이, 링커 서열의 길이는 증가된 발현과 상관 관계가 있었다. 예를 들어, 5 개 아미노산 링커 (서열 번호: 18)를 사용하여 12 ± 1.9 상대 발현 단위를 얻었고, 15 개 아미노산 링커 (서열 번호: 19)를 사용하여 발현의 상대적인 단위는 32 ± 3.2 상대 단위, 링커가 없는 HAS-융합에 비해 약 7.5-폴드 향상이었다. 더욱이, 링커-HSA 구조물의 C-말단 융합이 낮은 수준 (서열 번호: 20, 서열 번호: 21)에서 발현되기 때문에 N-말단 위치는 개선된 발현 수준에 중요했다. 참고로, 유연한 링커를 통한 HSA의 N-말단 융합은 또한 야생형 D1L3 (서열 번호: 22)의 발현을 천연 D1L3 (서열 번호: 4)보다 약 20배 강하게 증가시켰다. 결론적으로, 링커를 통한 HSA의 N-말단 융합은 D1L3 및 BDD-D1L3 변이체의 생산을 가능하게 한다.
다음으로 링커 서열의 특성이 D1L3 발현의 개선에 중요한지 여부를 테스트했다. 두 개의 추가 서열인 APAPAPAPAPAPAP (서열 번호: 33, 14 개 아미노산, 경질 링커) 및 AEAAAKEAAAKA (서열 번호: 34, 12 개 아미노산, 경질 나선형 링커)를 테스트했다. 도 19에 도시된 바와 같이, 두 시험 구조물 (서열 번호 : 23, 서열 번호 : 24)에서, 본 발명자들은 발현의 강한 증가를 관찰했지만, 경질 나선형 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS 링커에 대해 관찰된 것과 유사한 강한 발현 수준을 달성하지 못했다. 따라서 링커의 길이와 산 조성물은 D1L3 발현 수준에 영향을 미쳤다.
다음으로 링커 길이, 발현 수준 및 효소 활성 간의 관계를 분석했다. 이들 시험을 위해, HSA와 GS-링커의 N-말단 융합을 포함하는 설계된 발현 벡터는 BDD-D1L3 변이체 (서열 번호: 25 내지 27)에 대한 것이다. 세 가지 서로 다른 링커 길이가 SGGSGSS [7 개 아미노산 (서열 번호: 35)], SGGSGGSGGSGGSGSS [16 개 아미노산, (서열 번호: 36)] 및 SGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGSS [31 개 아미노산 (서열 번호: 37)]로 테스트되었다. 도 20에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 7 개 아미노산에서 16 개 아미노산으로 링커 서열의 연신이 발현 수준의 증가를 초래함을 관찰했다. 16 개 아미노산에서 31 개 아미노산으로의 추가 연신은 단백질 발현을 증가시키지 않았지만 HMW-크로마틴이 LMW-크로마틴으로 분해됨으로써 검출된 효소 활성을 증가시켰다. 알부민 융합에 융합된 생물의약품은 알부민이 기질 및 리간드와의 상호 작용을 입체적으로 방해하기 때문에 종종 감소된 활성을 나타낸다. 따라서, 펩티드 링커는 알부민과 융합 단백질 또는 펩티드 사이의 거리를 증가시키는 데 사용될 수 있다. 그러나 HSA와 D1L3 사이에 링커 서열의 삽입은 효소 활성과 발현 수준이 동시에 향상된다는 관찰은 예상치 못한 것이었다.
본 발명자들은 BDD-D1L3 (서열 번호: 14)의 크로마틴 분해 활성을 알부민-융합 대응물 (서열 번호: 19)과 비교했다. 간단히 말해서, Dnase1-/-Dnase1l3-/- 마우스에 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 19를 주입시켰다. 주사 후 15 분에 혈청이 수집되었다. 도 21a에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 두 동물 모두에서 유사한 혈청 크로마틴 분해 활성을 관찰했다. 중요한 것은 알부민과 D1L3의 N-말단 및 다른 인간 세포외 DNASES의 융합이 반감기 연장된 DNASE 치료제를 제공한다는 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 상업적으로 입수 가능한 설치류 모델에서 15 개 아미노산의 유연한 GS-링커를 갖는 HSA-BDD-D1L3 융합 단백질인 서열 번호: 19의 반감기를 결정하였다. 동물 모델은 순환에서 알부민의 긴 반감기를 담당하는 인간 FcRn의 형질 전환 발현을 특징으로 한다. 비접합 D1L3 (예를 들어, 서열 번호: 4)은 순환 반감기가 매우 짧지만 (<30 분), 알부민 융합은 반감기를 3.3 일로 연장하여 전신 노출을 실질적으로 개선하는 동시에 5 분의 tmax와 함께 빠른 흡수를 제공한다(도 21b). 종합적으로, 데이터는 링커 서열을 통해 HSA의 D1L3에 대한 N-말단 융합이 제조를 용이하게 할 뿐만 아니라 D1L3의 생체 내 약동학적 특성을 개선함을 입증한다.
마지막으로, 본 발명자들은 D1L3의 N-및 C-말단에 HSA의 이중 융합을 테스트했다. 우선, D1L3의 C-말단에서 잠재적인 부착 부위를 분석했다. 본 발명자들은 BD (RAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS)를 D1L3의 코어 바디에 유연한 연결을 제공하는 위치 283 및 284에서 두 개의 세린 잔기를 확인했다. 따라서, BD를 결실시키고 유연한 GS- 링커 (서열 번호: 38)를 통해 HSA를 S284에 부착하기로 선택했다. 도 22에 도시된 바와 같이, BDD-D1L3 (서열 번호: 28)의 N-및 C-말단에 대한 HSA의 융합은 N-말단 HSA 융합 (서열 번호: 27)에서 관찰된 높은 발현 수준을 유지하였다.
실시예 7: 절단 가능한 링커 서열의 디자인
본원에 개시된 발견은 제조 이외의 의미를 가지고 있다. 예를 들어, 서열 번호: 9에서 서열 번호: 12로 예시된 바와 같이 크로마틴 및/또는 NET을 분해하는 효소적 활성을 유지하는 C-말단 아미노산 결실을 갖는 D1L3 변이체는, D1L3 치료에 사용될 수 있다. 추가로, 짝을 이루지 않은 시스테인 티올의 부위별 알킬화는 보통 치료적 응용을 위한 반감기 연장된 생물의약품를 생성하는데 사용된다. 구체적으로, D1L3의 비필수적 시스테인 C68 및 C194는 부위별 페길화 (PEG, 폴리에틸렌 글리콜)에 사용될 수 있다. 또한, K180_A181delinsGL, P198_A201delinsRPSQ, K259A 및 R285A와 같은 돌연변이로 인해 플라스민에 의한 불활성화에 내성이 있는 D1L3 변이체는 개선된 반감기를 가질 것으로 예상되며, 따라서 치료적 적용에서 효능이 있을 것으로 예상된다.
중요하게도, D1L3 및 다른 인간 세포외 DNASES의 N-말단에 알부민의 융합은 반감기 연장된 DNASE 치료제를 제공한다 (도 23A). 알부민에 의한 D1L3의 입체 억제를 감소시키기 위해 여러 링커 서열이 사용되었다. 추가로, 생리학적으로 절단 가능한 펩티드 링커가 개발되었다. 링커 펩티드는 융합 단백질이 호중구 세포외 트랩 (NET)에 매우 근접할 때 절단되도록 디자인되었다. 호중구 엘라스타 제, 카텝신 G 및 프로테아제 3과 같은 호중구 특이적 프로테아제에 의해 표적화된 펩티드 서열은 절단 가능한 링커 서열의 후보물질이다.
혈관 내로 절단되어 정맥내 및 동맥내 적용되는 DNASE 치료제에 최적인 절단 가능한 링커 서열이 개발되었다. 펩티드를 디자인하기 위해, 본 발명자들은 NET이 혈액 응고 인자, 특히 응고 인자 XII (FXII)를 활성화하는 능력을 가지고 있다고 생각했다. 활성화된 FXII (FXIIa)는 응고 인자 XI (FXI, 서열 번호: 40) 및 프레칼리크레인 (PK, 서열 번호: 41)의 두 가지 주요 기질을 가지고 있다. 아미노산 서열 정렬은 FXIIa 절단 부위가 FXI 및 PK에서 보존된다는 것을 보여주었다 (도 23b). FXI에서 절단 부위는 아르기닌 387과 이소류신 388 사이에 있다. PK에서 절단 부위는 아르기닌 390과 이소류신 391 사이에 있다. 실제로, FXI와 PK는 상동 단백질이다. 본원에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 FXI 서열 위치 380 내지 위치 403 (서열 번호: 42, 서열 번호: 43) 또는 PK 서열 위치 383 내지 위치 406 (서열 번호: 44)의 전부 또는 일부를 포함하는 여러 링커 펩티드를 설계했다.
마지막으로, FXIIa-절단 가능한 링커는 다른 세포외 DNASE의 변이체, 인간 응고 인자 (예를 들어, 인자 VII, 인자 VIII, 및 인자 IX) 및 보체 인자 (예를 들어, 인자 H)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 생물의약품의 반감기 연장된 버전을 제조하기 위해 사용될 수 있다(도 24).
본원에서 인용된 모든 특허 및 특허 공보는 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
야생형 인간 DNASES
서열 번호: 1
DNASE1 (NP_005212.2): 신호 펩티드, 성숙 단백질:
MRGMKLLGALLALAALLQGAVSLKIAAFNIQTFGETKMSNATLVSYIVQILSRYDIALVQEVRDSHLTAVGKLLDNLNQDAPDTYHYVVSEPLGRNSYKERYLFVYRPDQVSAVDSYYYDDGCEPCGNDTFNREPAIVRFFSRFTEVREFAIVPLHAAPGDAVAEIDALYDVYLDVQEKWGLEDVMLMGDFNAGCSYVRPSQWSSIRLWTSPTFQWLIPDSADTTATPTHCAYDRIVVAGMLLRGAVVPDSALPFNFQAAYGLSDQLAQAISDHYPVEVMLK
서열 번호: 2
DNASE1-유사 1 (NP_006721.1): 신호 펩티드; 성숙 단백질:
MHYPTALLFLILANGAQAFRICAFNAQRLTLAKVAREQVMDTLVRILARCDIMVLQEVVDSSGSAIPLLLRELNRFDGSGPYSTLSSPQLGRSTYMETYVYFYRSHKTQVLSSYVYNDEDDVFAREPFVAQFSLPSNVLPSLVLVPLHTTPKAVEKELNALYDVFLEVSQHWQSKDVILLGDFNADCASLTKKRLDKLELRTEPGFHWVIADGEDTTVRASTHCTYDRVVLHGERCRSLLHTAAAFDFPTSFQLTEEEALNISDHYPVEVELKLSQAHSVQPLSLTVLLLLSLLSPQLCPAA
서열 번호: 3
DNASE1-유사 2 (NP_001365.1): 신호 펩티드, 성숙 단백질:
MGGPRALLAALWALEAAGTAALRIGAFNIQSFGDSKVSDPACGSIIAKILAGYDLALVQEVRDPDLSAVSALMEQINSVSEHEYSFVSSQPLGRDQYKEMYLFVYRKDAVSVVDTYLYPDPEDVFSREPFVVKFSAPGTGERAPPLPSRRALTPPPLPAAAQNLVLIPLHAAPHQAVAEIDALYDVYLDVIDKWGTDDMLFLGDFNADCSYVRAQDWAAIRLRSSEVFKWLIPDSADTTVGNSDCAYDRIVACGARLRRSLKPQSATVHDFQEEFGLDQTQALAISDHFPVEVTLKFHR
서열 번호: 4
DNASE1-유사 3; 이소폼 1 (NP_004935.1): 신호 펩티드, 성숙 단백질:
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS
서열 번호: 5
DNASE1-유사 3, 이소폼 2 (NP_001243489.1): 신호 펩티드; 성숙 단백질:
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNREKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS
서열 번호: 6
DNASE2A (O00115): 신호 펩티드; 성숙 단백질:
MIPLLLAALLCVPAGALTCYGDSGQPVDWFVVYKLPALRGSGEAAQRGLQYKYLDESSGGWRDGRALINSPEGAVGRSLQPLYRSNTSQLAFLLYNDQPPQPSKAQDSSMRGHTKGVLLLDHDGGFWLVHSVPNFPPPASSAAYSWPHSACTYGQTLLCVSFPFAQFSKMGKQLTYTYPWVYNYQLEGIFAQEFPDLENVVKGHHVSQEPWNSSITLTSQAGAVFQSFAKFSKFGDDLYSGWLAAALGTNLQVQFWHKTVGILPSNCSDIWQVLNVNQIAFPGPAGPSFNSTEDHSKWCVSPKGPWTCVGDMNRNQGEEQRGGGTLCAQLPALWKAFQPLVKNYQPCNGMARKPSRAYKI
서열 번호: 7
DNASE2B (Q8WZ79): 신호 펩티드; 성숙 단백질:
MKQKMMARLLRTSFALLFLGLFGVLGAATISCRNEEGKAVDWFTFYKLPKRQNKESGETGLEYLYLDSTTRSWRKSEQLMNDTKSVLGRTLQQLYEAYASKSNNTAYLIYNDGVPKPVNYSRKYGHTKGLLLWNRVQGFWLIHSIPQFPPIPEEGYDYPPTGRRNGQSGICITFKYNQYEAIDSQLLVCNPNVYSCSIPATFHQELIHMPQLCTRASSSEIPGRLLTTLQSAQGQKFLHFAKSDSFLDDIFAAWMAQRLKTHLLTETWQRKRQELPSNCSLPYHVYNIKAIKLSRHSYFSSYQDHAKWCISQKGTKNRWTCIGDLNRSPHQAFRSGGFICTQNWQIYQAFQGLVLYYESCK
인간 DNASE1L3 변이체
서열 번호: 8
DNASE1-유사 3, Q101R (신호 펩티드; 성숙 단백질)
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKE R YAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS
서열 번호: 9
DNASE1L3, Q282_S305delinksK (신호 펩티드; 성숙 단백질):
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLK
서열 번호: 10
DNASE1L3, S305delinsK (신호 펩티드; 성숙 단백질):
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWGLENFIFMGDFNAGCSYVRPSQWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQAAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNS
서열 번호: 11
DNASE1L3, K292_S305del (신호 펩티드; 성숙 단백질):
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWGLENFIFMGDFNAGCSYVRPSQWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQAAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSK
서열 번호: 12
DNASE1L3, S293_S305del (신호 펩티드; 성숙 단백질):
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWGLENFIFMGDFNAGCSYVRPSQWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQAAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKK
서열 번호: 13
DNASE1L3, C68A (신호 펩티드; 성숙 단백질):
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRI A PILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS
서열 번호: 14
DNASE1L3, F275Y/F279_K280delinsVM/Q282_S305delinsK (신호 펩티드; 성숙 단백질):
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHYPVEVMLK
서열 번호: 15
DNASE1L3, S283_S305del (신호 펩티드; 성숙 단백질):
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQ
서열 번호: 16
DNASE1L3, R285_S305del (신호 펩티드; 성숙 단백질):
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNREKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSS
DNASE1L3 및 변이체와 알부민 융합 (Albumin Fusions with DNASE1L3 and Variants)
서열 번호: 17
알부민 - DNASE1L3 변이체 - 융합 단백질. (알부민, DNASE1L3 변이체):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL MRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHYPVEVMLK
서열 번호: 18
알부민 - DNASE1L3 변이체 - 융합 단백질. (알부민, DNASE1L3 변이체):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHYPVEVMLK
서열 번호: 19
알부민 - DNASE1L3 변이체 - 융합 단백질. (알부민, DNASE1L3 변이체):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSGGGGSMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHYPVEVMLK
서열 번호: 20
DNASE1L3 변이체 - 알부민 - 융합 단백질. (알부민, DNASE1L3 변이체):
MRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHYPVEVMLKGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
서열 번호: 21
DNASE1L3 변이체 - 알부민 - 융합 단백질. (알부민, DNASE1L3 변이체):
MRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHYPVEVMLKGGGGSGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
서열 번호: 22
알부민 - DNASE1L3 - 융합 단백질. (알부민, DNASE1L3):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSGGGGSMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS
서열 번호: 23
알부민 - DNASE1L3 - 융합 단백질. (알부민, DNASE1L3):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAPAPAPAPAPAPAPMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS
서열 번호: 24
알부민 - DNASE1L3 - 융합 단백질. (알부민, DNASE1L3):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAEAAAKEAAAKAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS
서열 번호: 25
알부민 - DNASE1L3 변이체 - 융합 단백질. (알부민, DNASE1L3 변이체):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLSGGSGSSMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQ
서열 번호: 26
알부민 - DNASE1L3 변이체 - 융합 단백질. (알부민, DNASE1L3 변이체):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLSGGSGGSGGSGGSGSSMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQ
서열 번호: 27
알부민 - DNASE1L3 변이체 - 융합 단백질. (알부민, DNASE1L3 변이체):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGSSMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQ
서열 번호: 28
알부민 - DNASE1L3 변이체 - 알부민 - 융합 단백질. (알부민, DNASE1L3 변이체):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGSSMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
서열 번호: 29
알부민 - DNASE1L3 이소폼 2 - 융합 단백질. (알부민, DNASE1L3 이소폼 2):
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서열 번호: 30
알부민 - DNASE1L3 이소폼 2 - 융합 단백질. (알부민, DNASE1L3 이소폼 2):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGSSMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNREQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQ
링커 서열
서열 번호: 31
GGGGS
서열 번호: 32
GGGGSGGGGSGGGGS
서열 번호: 33
APAPAPAPAPAPAP
서열 번호: 34
AEAAAKEAAAKA
서열 번호: 35
SGGSGSS
서열 번호: 36
SGGSGGSGGSGGSGSS
서열 번호: 37
SGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGS
서열 번호: 38
GGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGS
다른 서열
서열 번호: 39
인간 혈청 알부민 (성숙 단백질):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
서열 번호: 40
인간 인자 XI:
MIFLYQVVHFILFTSVSGECVTQLLKDTCFEGGDITTVFTPSAKYCQVVCTYHPRCLLFTFTAESPSEDPTRWFTCVLKDSVTETLPRVNRTAAISGYSFKQCSHQISACNKDIYVDLDMKGINYNSSVAKSAQECQERCTDDVHCHFFTYATRQFPSLEHRNICLLKHTQTGTPTRITKLDKVVSGFSLKSCALSNLACIRDIFPNTVFADSNIDSVMAPDAFVCGRICTHHPGCLFFTFFSQEWPKESQRNLCLLKTSESGLPSTRIKKSKALSGFSLQSCRHSIPVFCHSSFYHDTDFLGEELDIVAAKSHEACQKLCTNAVRCQFFTYTPAQASCNEGKGKCYLKLSSNGSPTKILHGRGGISGYTLRLCKMDNECTTKIKPRIVGGTASVRGEWPWQVTLHTTSPTQRHLCGGSIIGNQWILTAAHCFYGVESPKILRVYSGILNQSEIKEDTSFFGVQEIIIHDQYKMAESGYDIALLKLETTVNYTDSQRPICLPSKGDRNVIYTDCWVTGWGYRKLRDKIQNTLQKAKIPLVTNEECQKRYRGHKITHKMICAGYREGGKDACKGDSGGPLSCKHNEVWHLVGITSWGEGCAQRERPGVYTNVVEYVDWILEKTQAV
서열 번호: 41
인간 프레칼리크레인:
MILFKQATYFISLFATVSCGCLTQLYENAFFRGGDVASMYTPNAQYCQMRCTFHPRCLLFSFLPASSINDMEKRFGCFLKDSVTGTLPKVHRTGAVSGHSLKQCGHQISACHRDIYKGVDMRGVNFNVSKVSSVEECQKRCTNNIRCQFFSYATQTFHKAEYRNNCLLKYSPGGTPTAIKVLSNVESGFSLKPCALSEIGCHMNIFQHLAFSDVDVARVLTPDAFVCRTICTYHPNCLFFTFYTNVWKIESQRNVCLLKTSESGTPSSSTPQENTISGYSLLTCKRTLPEPCHSKIYPGVDFGGEELNVTFVKGVNVCQETCTKMIRCQFFTYSLLPEDCKEEKCKCFLRLSMDGSPTRIAYGTQGSSGYSLRLCNTGDNSVCTTKTSTRIVGGTNSSWGEWPWQVSLQVKLTAQRHLCGGSLIGHQWVLTAAHCFDGLPLQDVWRIYSGILNLSDITKDTPFSQIKEIIIHQNYKVSEGNHDIALIKLQAPLNYTEFQKPICLPSKGDTSTIYTNCWVTGWGFSKEKGEIQNILQKVNIPLVTNEECQKRYQDYKITQRMVCAGYKEGGKDACKGDSGGPLVCKHNGMWRLVGITSWGEGCARREQPGVYTKVAEYMDWILEKTQSSDGKAQMQSPA
활성화 가능한 링커 서열
서열 번호: 42
FXIIa-민감한 링커 (인자 XI 펩티드):
CTTKIKPRIVGGTASVRGEWPWQVT
서열 번호: 43
FXIIa-민감한 링커
GGGGSPRIGGGGS
서열 번호: 44
FXIIa-민감한 링커 (프레칼리크레인 펩티드):
VCTTKTSTRIVGGTNSSWGEWPWQVS
서열 번호: 45
FXIIa-민감한 링커 (프레칼리크레인 펩티드):
STRIVGG
신호 펩티드
서열 번호: 46
알파 결합 인자 (P01149):
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVS
서열 번호: 47
인간 알부민 분비 신호 펩티드 + Propeptide (P02768):
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR
서열 번호: 48
인간 DNASE1L3 신호 펩티드 (Q13609):
MSRELAPLLLLLLSIHSALA

Claims (101)

  1. DNase1-유사 3 (D1L3) 변이체에 있어서, 상기 D1L3 단백질 변이체는 단백질 분해에 대한 증가된 내성; 증가된 순환 반감기(circulation half-life); 시험관내 발현 시스템에 대한 더 높은 생산 수준; 및 시험관내에서 실질적으로 적지 않거나, 동일하거나, 또는 더 우수한 크로마틴(chromatin) 및/또는 NET-분해 활성 중 하나 이상을 갖고, 각 경우는 서열 번호: 4 및/또는 서열 번호: 5의 야생형 D1L3 단백질과 비교된 것인, DNase1-유사 3 (D1L3) 변이체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 D1L3 변이체는, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 5로 정의된 성숙 효소와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열, 상기 성숙 효소의 N-말단 측의 알부민 아미노산 서열, 및 상기 알부민 아미노산 서열과 상기 성숙 효소의 아미노산 서열 사이의 연결 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질인 것인, D1L3 변이체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 D1L3 변이체는, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 5로 정의된 성숙 효소와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, D1L3 변이체.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 D1L3 변이체는, C-말단 염기성 도메인의 적어도 5 개의 아미노산의 결실, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 5의 23 개의 C-말단 아미노산에 의해 정의된 상기 C-말단 염기성 도메인을 갖는 것인, D1L3 변이체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 D1L3은, 상기 C-말단 염기성 도메인의 적어도 10 개의 아미노산의 결실을 갖는 것인, D1L3 변이체.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 D1L3은, 상기 C-말단 염기성 도메인의 적어도 15 개의 아미노산의 결실을 갖는 것인, D1L3 변이체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 D1L3은, 전체 C-말단 염기성 도메인의 결실을 갖는 것인, D1L3 변이체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 D1L3은, 서열 번호: 4의 101 번 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 갖는 것인, D1L3 변이체.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 D1L3은, Q101R 인 아미노산 치환을 갖는 것인, D1L3 변이체.
  10. 제2항에 있어서,
    상기 링커는, 가요성, 경질이거나 프로테아제 절단 부위를 포함하는 것인, D1L3 변이체.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 링커는, 가요성 링커인 것인, D1L3 변이체.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 링커는, 적어도 10 개의 아미노산, 또는 적어도 15 개의 아미노산을 갖는 것인, D1L3 변이체.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 링커는, 15 개 내지 35 개의 아미노산을 갖는 것인, D1L3 변이체.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 변이체는, 서열 번호: 8 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 각각의 경우 선택적으로 삽입, 결실 또는 치환으로부터 독립적으로 선택된 1 개 내지 20 개의 아미노산 변형을 갖는 것인, D1L3 변이체.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 변이체는, 서열 번호: 19, 서열 번호: 22, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 또는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열을 갖는 것인, D1L3 변이체.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    D1로부터의 하나 이상의 빌딩 블록 치환, 및/또는 서열 번호: 4의 효소와 비교하여 시스테인 잔기의 하나 이상의 결실 또는 치환을 포함하는 것인, D1L3 변이체.
  17. 제16항에 있어서,
    서열 번호: 4의 C68에 상응하는 아미노산이 치환된 것인, D1L3 변이체.
  18. 제17항에 있어서,
    서열 번호: 4의 C68에 상응하는 아미노산은, Ala, Ser 및 Gly로부터 선택된 아미노산으로 치환된 것인, D1L3 변이체.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 변이체는, 1 개, 2 개 또는 3 개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 선택적으로 변형되는 것인 치환 N64_I70delinsHLTAVGK를 포함하고, 단(with the proviso), 빌딩 블록 치환은 시스테인 잔기을 포함하도록 변형되지 않는 것인, D1L3 변이체.
  20. 제1항에 있어서,
    C68 및/또는 C194에 상응하는 아미노산에 대한 PEG 접합을 포함하는 것인, D1L3 변이체.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    서열 번호: 4 및/또는 서열 번호: 5에 존재하는 아르기닌 및 라이신 잔기의 하나 이상의 치환을 갖고, 서열 번호: 4의 단백질 또는 서열 번호: 5의 단백질과 비교하여, 상기 치환은 상기 D1L3 변이체가 플라스민, 트롬빈 및/또는 트립신에 의한 단백질 분해에 덜 민감하게 만드는 것인, D1L3 변이체.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 아르기닌 및 라이신 치환 중 하나 이상은, 서열 번호: 4의 위치(들)인: K180, K200, K259 및 R285에 상응하는 것인, D1L3 변이체.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 아르기닌 또는 라이신 치환은, 서열 번호: 4에 대하여 K180A, K200A, K259A 및 R285A 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인, D1L3 변이체.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 변이체는, 서열 번호: 4에 대하여 K180_A181delinsGL, P198_A201delinsRPSQ 및 K259A로부터 선택된 치환을 포함하는 것인, D1L3 변이체.
  25. 제21항에 있어서,
    상기 변이체는, 서열 번호: 4의 K50/R51, R80/R81, K114/R115, K199/K200, K226/K227, K291/K292, R297/K298/K299, 및 K303/R304로부터 선택된 위치에 상응하는 쌍을 이룬 염기성 잔기의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인, D1L3 변이체.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 쌍을 이룬 염기성 잔기의 하나 이상의 돌연변이는, 서열 번호: 4에 대하여 R114T, R114A, R114D, R114Q, K227S 및 K227E로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하는 것인, D1L3 변이체.
  27. 제25항에 있어서,
    상기 쌍을 이룬 염기성 잔기의 하나 이상의 돌연변이는, 서열 번호: 4에 대하여 R51K, R81K, R115K 및 R304K로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하는 것인, D1L3 변이체.
  28. 제10항에 있어서,
    상기 링커는 응고 경로 프로테아제에 의해 절단 가능한 것인, D1L3 변이체.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 링커는, 인자 XII 또는 호중구 프로테아제에 의해 절단 가능한 것인, D1L3 변이체.
  30. 시스테인 잔기의 하나 이상의 결실 또는 치환과 함께, 서열 번호: 1로 정의된 효소와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, DNase 1 (D1) 변이체.
  31. 제30항에 있어서,
    서열 번호: 1의 C123 및 C126에 상응하는 하나 이상의 아미노산이 결실되거나 치환된 것인, D1 변이체.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 시스테인(들)은, Ala, Ser 및 Gly로부터 독립적으로 선택된 아미노산으로 치환되는 것인, D1 변이체.
  33. 제30항에 있어서,
    상기 변이체는, 치환 G122_N128delinsYQGDA를 포함하는 것인, D1 변이체.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 D1 변이체는, 알부민 아미노산 서열 및 선택적으로 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질인 것인, D1 변이체.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 알부민 도메인은, D1 도메인의 N-말단 측에 위치하는 것인, D1 변이체.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서,
    상기 펩티드 링커는, 상기 알부민 도메인과 상기 D1 도메인 사이에 개재된 것인, D1 변이체 단백질.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 펩티드 링커는, 가요성 링커, 경질 링커 또는 프로테아제 절단 가능한 링커인 것인, D1 변이체.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 링커는, 적어도 10 개의 아미노산 또는 적어도 15 개의 아미노산을 갖는 것인, D1 변이체.
  39. 제37항에 있어서,
    상기 링커는, 15 개 내지 35 개의 아미노산을 갖는 것인, D1 변이체.
  40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 D1 도메인은, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 5로 정의된 성숙 효소와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, D1 변이체.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 D1 변이체는, 서열 번호: 1의 야생형 D1 단백질과 비교하여 적어도 80%의 DNA 분해 활성을 갖는 것인, D1 변이체.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서,
    상기 D1 변이체는, 서열 번호: 1의 효소와 적어도 85% 이상, 또는 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, D1 변이체.
  43. 서열 번호: 1로 정의된 효소와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, C123 및/또는 C126에 상응하는 아미노산에 PEG 접합을 갖는 것인, D1 변이체.
  44. 하나 이상의 결실 또는 치환된 시스테인 잔기와 함께, 서열 번호: 2로 정의된 효소와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, DNase1-유사 1 (D1L1) 변이체.
  45. 제44항에 있어서,
    적어도 하나의 치환 또는 결실된 시스테인 잔기는, 서열 번호: 2의 C22 또는 C50에 상응하는 위치인 것인, D1L1 변이체.
  46. 제45항에 있어서,
    하나 이상의 치환된 시스테인 잔기는, Gly, Arg 또는 Ser인 아미노산으로 치환된 것인, D1L1 변이체.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 D1L1 변이체는, 서열 번호: 2의 효소와 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, D1L1 변이체.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변이체는, 알부민 아미노산 서열 및 선택적으로 D1L1 도메인과 알부민 도메인 사이의 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질인 것인, D1L1 변이체.
  49. 제48항에 있어서,
    상기 알부민 도메인은, D1L1 도메인의 N-말단 측에 위치하는 것인, D1L1 변이체.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서,
    상기 융합 단백질은, 펩티드 링커를 포함하고, 상기 펩티드 링커는, 가요 성 링커, 경질 링커 또는 프로테아제 절단 가능한 링커인 것인, D1L1 변이체.
  51. 서열 번호: 2로 정의된 효소와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, C22 및/또는 C50에 상응하는 아미노산에 PEG 접합을 갖는 것인, D1L1 변이체.
  52. 하나 이상의 치환 또는 결실된 시스테인 잔기와 함께, 서열 번호: 3으로 정의된 효소와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, DNase1-유사 2 (D1L2) 변이체.
  53. 제52항에 있어서,
    서열 번호: 3의 C43에 상응하는 시스테인 잔기가 치환되거나 결실된 것인, D1L2 변이체.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서,
    하나 이상의 치환된 시스테인 잔기는, Gly, Arg 또는 Ser인 아미노산으로 치환된 것인, D1L2 변이체.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 D1L2 변이체는, 서열 번호: 2의 효소와 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, D1L2 변이체.
  56. 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변이체는, 알부민 아미노산 서열, 및 선택적으로 D1L2 도메인과 알부민 도메인 사이의 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질인 것인, D1L2 변이체.
  57. 제56항에 있어서,
    상기 알부민 도메인은, 상기 D1L2 도메인의 N-말단 측에 위치하는 것인, D1L2 변이체.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서,
    상기 펩티드 링커는, 상기 알부민 도메인과 상기 D1L2 도메인 사이에 개재된 것인, D1L2 변이체.
  59. 제58항에 있어서,
    상기 펩티드 링커는, 가요성 링커, 경질 링커 또는 프로테아제 절단 가능한 링커인 것인, D1L2 변이체.
  60. 서열 번호: 3에 의해 정의된 효소와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, C43에 상응하는 아미노산에 PEG 접합을 갖는 것인, D1L2 변이체.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항의 D1, D1L1, D1L2, 또는 D1L3 변이체를 암호화하는 단리된 폴리 뉴클레오티드.
  62. 제61항에 있어서,
    상기 폴리 뉴클레오티드는 mRNA인 것인, 단리된 폴리 뉴클레오티드.
  63. 제61항에 있어서,
    상기 폴리 뉴클레오티드는 DNA인 것인, 단리된 폴리 뉴클레오티드.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항의 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 벡터.
  65. 제64항의 벡터를 포함하는 것인, 숙주 세포.
  66. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항의 D1, D1L1, D1L2 또는 D1L3 변이체를 발현하도록 변형된 것인, 숙주 세포.
  67. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항의 D1, D1L1, D1L2 또는 D1L3 변이체, 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따른 폴리 뉴클레오티드, 제64항에 따른 벡터, 또는 제65항 또는 제66항에 따른 숙주 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  68. 제67항에 있어서,
    국소, 비경구 또는 폐 투여용으로 제형화된 것인, 약학적 조성물.
  69. 제68항에 있어서,
    피 내(intradermal), 근육 내, 복강 내, 관절 내, 정맥 내, 피하, 동맥 내, 경구, 설하, 폐 또는 경피 투여용으로 제형화된 것인, 약학적 조성물.
  70. 세포외 DNA 분해, 세포외 크로마틴 분해, 세포외 트랩 (ET) 분해 및/또는 호중구 세포외 트랩 (NET) 분해를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 있어서, 치료적 유효량의 제67항 내지 제69항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서,
    상기 대상체는, D1L3 유전자에서 기능 돌연변이의 상실을 갖는 것인, 방법.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서,
    상기 대상체는, 만성 호중구, 호중구 응집 또는 백혈구울혈, 혈전증 또는 혈관 폐색, 허혈-재관류 손상, 외과적 또는 외상성 조직 손상, 급성 또는 만성 염증 반응 또는 질환, 자가 면역 질환, 심혈관 질환, 대사 질환, 전신 염증, 호흡기 염증 질환, 신장 염증 질환, 이식 조직 및 암과 관련된 염증 질환 으로부터 선택된 병태를 갖는 것인, 방법.
  73. 제70항 또는 제71항에 있어서,
    상기 대상체가 관(ductal) 시스템을 폐색하는 NET을 갖거나 가질 위험이 있고, 상기 병태는, 췌장염, 담관염, 결막염, 유방염, 안구 건조증, 정관의 폐쇄 및 신장 질환으로부터 선택되는 것인, 방법.
  74. 제70항 또는 제71항에 있어서,
    상기 대상체는, 내피 표면에 축적되는 NET을 갖거나 가질 위험이 있는 것인, 방법.
  75. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 D1L3 변이체는, 알부민 아미노산 서열을 포함하고, 대상체에게 비경 구적으로 투여되는 융합 단백질이고, 상기 투여는, 대략 매주인 것인, 방법.
  76. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항의 재조합 DNase 변이체의 생산 방법에 있어서, 상기 DNase 변이체를 암호화하는 폴리 뉴클레오티드를 발현하는 세포를 배양하는 단계, 및 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 세포는, 피키아 파스토리스인 것인, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 피키아 파스토리스 세포는, 아스파르트산 프로테아제 3 및/또는 켁신의 유전적 결실 또는 불활성화, 또는 약리학적 억제를 갖는 것인, 방법.
  79. 제76항에 있어서,
    상기 세포는, CHO 세포인 것인, 방법.
  80. 제79항에 있어서,
    상기 CHO 세포는, 푸린 프로테아제의 유전적 결실 또는 불활성화, 또는 약리학적 억제를 갖는 것인, 방법.
  81. 제76항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 DNase 변이체는, 쌍을 이룬 염기성 잔기의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 D1L3 변이체이고, 상기 쌍을 이룬 염기성 잔기는, 서열 번호: 4의 K50/R51, R80/R81, K114/R115, K199/K200, K226/K227, K291/K292, R297/K298/K299 및 K303/R304로부터 선택된 위치에 상응하는 것인, 방법.
  82. 제81항에 있어서,
    쌍을 이룬 염기성 잔기의 하나 이상의 돌연변이는, R114T, R114A, R114D, R114Q, K227S 및 K227E로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하는 것인, 방법.
  83. 제81항에 있어서,
    쌍을 이룬 염기성 잔기의 하나 이상의 돌연변이는, R51K, R81K, R115K 및 R304K로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하는 것인, 방법.
  84. 이의 변이체의 재조합 D1 단백질 패밀리 구성원을 생산하는 방법에 있어서, 다가 음이온 화합물의 존재 하에 DNase 변이체를 암호화하는 폴리 뉴클레오티드를 발현하는 세포를 배양하는 단계, 및 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 그의 변이체의 재조합 D1 단백질 패밀리 구성원을 생산하는 방법.
  85. 제84항에 있어서,
    상기 재조합 D1 단백질 패밀리 구성원은, D1, D1L3, D1L1, 또는 D1L2의 변이체인 것인, 방법.
  86. 제84항 또는 제85항에 있어서,
    상기 다가 음이온은, 덱스트란 설페이트, 헤파린, 시트르산철 및 EDTA 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인, 방법.
  87. 제86항에 있어서,
    상기 다가 음이온은, 덱스트란 설페이트인 것인, 방법.
  88. 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는, 원핵 또는 진핵 세포인 것인, 방법.
  89. 제88항에 있어서,
    상기 DNase는, 선택적으로 피키아 파스토리스, 사카로미세스속(Saccharomyces spp), 또는 대장균(Escherichia coli)인 비-포유류 발현 시스템을 사용하여 발현되는 것인, 방법.
  90. 제89항에 있어서,
    상기 발현 시스템은, 피키아 파스토리스인 것인, 방법.
  91. 제90항에 있어서,
    상기 피키아 파스토리스 세포는, 아스파르트산 프로테아제 3 및/또는 켁신의 유전적 결실 또는 불활성화, 또는 약리학적 억제를 갖는 것인, 방법.
  92. 제88항에 있어서,
    상기 세포는, CHO 세포인 것인, 방법.
  93. 제92항에 있어서,
    상기 CHO 세포는 푸린 프로테아제의 유전적 결실 또는 불활성화, 또는 약리학적 억제를 갖는 것인, 방법.
  94. 제84항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 D1 패밀리 구성원은, 펩티드 링커를 통해 N-말단에서 알부민의 융합을 포함하는, 방법.
  95. 제94항에 있어서,
    상기 링커는 가요성 링커인 것인, 방법.
  96. 제95항에 있어서,
    상기 링커는, 절단 가능한 링커이고, 선택적으로 응고 경로 프로테아제 또는 호중구 프로테아제에 의해 절단 가능한 것인, 방법.
  97. 제96항에 있어서,
    상기 응고 인자 프로테아제는, 인자 XII인 것인, 방법.
  98. 제97항에 있어서,
    상기 펩티드 링커는, 인자 XI 또는 프레칼리크레인에서 FXII-절단 부위의 전부 또는 일부로부터 선택되는 것인, 방법.
  99. 제84항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 D1 패밀리 구성원 또는 변이체는, 세포로부터 재조합 단백질의 분비를 지시하는 신호 펩티드를 암호화하는 구조물로 발현되는 것인, 방법.
  100. 제84항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 D1 패밀리 구성원 또는 변이체는, 음이온 교환 수지를 사용하여 다가 음이온 화합물로부터 정제되는 것인, 방법.
  101. 제100항에 있어서,
    상기 재조합 D1 패밀리 구성원 또는 변이체는, 양이온 교환 수지를 사용하여 추가로 정제되는 것인, 방법.
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