JP2022504400A - 製造及び治療のためのｄｎａｓｅ酵素の操作 - Google Patents

Abstract

本開示は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の蓄積及び／または放出を特徴とする状態を治療するために有用である、操作されたヒト細胞外ＤＮＡＳＥタンパク質（例えば、ＤＮＡＳＥ１（Ｄ１）、ＤＮＡＳＥ１様１（Ｄ１Ｌ１）、ＤＮＡＳＥ１様２（Ｄ１Ｌ２）、ＤＮＡＳＥ１様３アイソフォーム１（Ｄ１Ｌ３）、ＤＮＡＳＥ１様３アイソフォーム２（Ｄ１Ｌ３－２）、ＤＮＡＳＥ２Ａ（Ｄ２Ａ）、及びＤＮＡＳＥ２Ｂ（Ｄ２Ｂ）のバリアント）を提供する。本発明に従って、ＤＮａｓｅバリアントは、治療及び／または大規模製造のための利点を有する。
【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は、２０１８年１０月８日に出願された米国仮出願第６２／７４２，６８２号、２０１８年１２月５日に出願された同第６２／７７５，５６３号、２０１８年１２月１３日に出願された同第６２／７７９，１０４号、２０１９年２月２１日に出願された同第６２，８０８，６０１号、及び２０１９年５月１３日に出願された同第６２／８４６，９０４号の利益及び優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、操作されたＤＮＡＳＥ酵素の分野に関する。

炎症は、侵入する微生物を制御し、損傷した組織を治癒させるために不可欠な宿主応答である。非制御性及び持続的な炎症は、多数の炎症性障害において組織損傷を引き起こす。好中球は、急性炎症における主な白血球である。感染中、好中球は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）、毒性ヒストンで装飾されたＤＮＡフィラメントの格子、ならびに細菌を固定及び中和する酵素を生成する。しかしながら、不適切に放出されたＮＥＴは、それらの細胞傷害性、炎症促進性、及び血栓形成促進性活性に起因して宿主細胞に害を及ぼし得る。

ＤＮＡＳＥ１（Ｄ１）は、ＤＮＡＳＥ１様１（Ｄ１Ｌ１）、ＤＮＡＳＥ１様２（Ｄ１Ｌ２）、及びＤＮＡＳＥ１様３（Ｄ１Ｌ３）と共に、相同分泌型ＤＮａｓｅ１タンパク質酵素の群であるＤＮＡＳＥ１タンパク質ファミリーを形成する。ＤＮＡＳＥ２Ａ及びＤＮＡＳＥ２Ｂは、相同な細胞外ＤＮａｓｅ酵素の追加の群を形成する。ＤＮＡＳＥ１－及びＤＮＡＳＥ２－タンパク質ファミリーメンバーは、進化的に保存され、ヒトを含む様々な種において発現される。組換えヒトＤＮＡＳＥ１及びＤＮＡＳＥ２タンパク質ファミリーメンバーは、ＮＥＴ関連疾患の薬物候補を提供する。Ｄ１は、患者におけるいくつかの治療用途のために開発されているが、ＤＮＡＳＥ１タンパク質ファミリーの他のメンバーの大規模製造の条件は記載されていない。さらに、これらの酵素の物理的、酵素的、及び薬物動態特性は、臨床応用には理想的ではない。したがって、Ｄ１Ｌ１、Ｄ１Ｌ２、及びＤ１Ｌ３酵素の製造プロセスを定義し、ＮＥＴを分解することを含む、治療で使用するためのＤＮａｓｅを操作する必要がある。

本発明は、細胞外ＤＮＡ、細胞外クロマチン、及び好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の蓄積及び／または放出を特徴とする状態を治療するために有用である、操作されたヒト細胞外ＤＮＡＳＥタンパク質（例えば、ＤＮＡＳＥ１（Ｄ１）、ＤＮＡＳＥ１様１（Ｄ１Ｌ１）、ＤＮＡＳＥ１様２（Ｄ１Ｌ２）、ＤＮＡＳＥ１様３アイソフォーム１（Ｄ１Ｌ３）、ＤＮＡＳＥ１様３アイソフォーム２（Ｄ１Ｌ３－２）、ＤＮＡＳＥ２Ａ（Ｄ２Ａ）、及びＤＮＡＳＥ２Ｂ（Ｄ２Ｂ）のバリアント）を提供する。本発明の態様に従って、本明細書に記載されるＤＮａｓｅバリアントは、治療により好適であり、及び／または大規模製造により適している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＮａｓｅバリアントは、全身療法を含む医療療法に対する利点を有する。かかる利点としては、より遅い薬物排出、例えば、増加した循環半減期（例えば、血清半減期）、延長した薬力学的活性の持続時間、高クロマチン分解活性、及びプロテアーゼ抵抗性が含まれる。

いくつかの態様では、本発明は、Ｄ１Ｌ３バリアントであって、Ｄ１Ｌ３バリアントが、配列番号４の野生型Ｄ１Ｌ３アイソフォーム１酵素または配列番号５の野生型Ｄ１Ｌ３アイソフォーム２酵素と比較して、増加したタンパク質安定性、より遅い薬物排出、増加した薬力学的活性の持続時間、タンパク質分解に対する抵抗性、インビトロ発現系でのより高い産生レベル、精製のためのより良好な適合性、ならびに実質的に低くはなく、同一の、またはより良好なクロマチン及び／またはＮＥＴ分解活性のうちの１つ以上を有する、Ｄ１Ｌ３バリアントを提供する。

いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号４または配列番号５によって定義される成熟酵素と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、成熟酵素のＮ末端側のアルブミンアミノ酸配列、及び任意選択で、アルブミンアミノ酸配列（アルブミンドメイン）とＤ１Ｌ３アミノ酸配列（Ｄ１Ｌ３ドメイン）との間の連結アミノ酸配列を含む、融合タンパク質である。これらの実施形態では、Ｄ１Ｌ３は、全身療法を含む、より遅い排出（例えば、改善された循環半減期または血清半減期）及び延長した薬力学的活性の持続時間を示す。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３ドメインへの連結配列を有するアルブミンの融合は、アルブミン融合を有しない酵素と比較して、酵素のクロマチン分解活性（例えば、インビトロアッセイを使用して測定される）に実質的に影響を及ぼさない。

これらの実施形態では、融合タンパク質のＤ１Ｌ３ドメインは、野生型Ｄ１Ｌ３酵素に存在するＣ末端塩基性ドメインのすべてまたは一部の欠失を有する。Ｃ末端塩基性ドメインの欠失または不活性化は、クロマチン分解活性を実質的に改善する。すなわち、Ｃ末端塩基性ドメイン（ＢＤ）の除去は、クロマチンを分解するための野生型Ｄ１Ｌ３酵素を活性化する。

いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、Ｄ１からの１つ以上の構成要素置換を有する。例えば、Ｄ１Ｌ３バリアントは、Ｑ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫの構成要素置換を有し得、それは、Ｃ末端塩基性ドメインの欠失を含み、そのドメインがＤ１において欠如する。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号４の１０１位に対応する位置にアミノ酸置換を有する。置換は、Ｄ１からの対応する構成要素に基づくＡｒｇであり得るか、またはいくつかの実施形態では、Ｌｙｓである。この位置での置換は、Ｄ１Ｌ３バリアントのクロマチン分解活性を増強することができる。

存在するリンカーは、柔軟性リンカー、剛性リンカー、またはプロテアーゼ切断可能リンカーなどの生理学的に切断可能なリンカーであり得る。例えば、リンカーは、親水性アミノ酸配列であり得、主に、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＰｒｏから選択されるアミノ酸から構築され得る。いくつかの実施形態では、バリアントは、主にグリシン及びセリン残基である柔軟性リンカー（例えば、（Ｇ_ｙＳ）_ｎリンカーであり、ｙは１～５であり、ｎは１～２０である）である。いくつかの実施形態では、リンカーは、α－ヘリックスリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１５個のアミノ酸、または少なくとも２５個のアミノ酸を有する。様々な実施形態では、少なくとも１５個のアミノ酸のより長いリンカーは、ＣＨＯ細胞またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどの哺乳動物及び非哺乳動物発現系における発現時の収率の改善を提供することができる。さらに、驚くべきことに、より長いリンカー配列は、より短いリンカー配列と比較して、インビトロクロマチン分解アッセイにおいて改善されたクロマチン分解活性を示した。

様々な実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号１７～３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、各事例において、任意選択で、独立して挿入、欠失、または置換から選択される１～２０個のアミノ酸修飾を有する。これらの配列は、Ｄ１Ｌ３（またはＤ１Ｌ３バリアント）とアルブミン配列との間の例示的な融合タンパク質を提供し、様々なリンカー設計を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾が、Ｄ１Ｌ３ドメイン、アルブミンドメイン、または両方のドメイン内にある。いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、または配列番号３０のアミノ酸配列を有する。これらの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、Ｎ末端からＣ末端の順序で、アルブミンアミノ酸配列、中程度または長い柔軟性リンカー、及びＤ１Ｌ３アミノ酸配列（すなわち、Ｄ１Ｌ３バリアントを含む）を含む。配列番号２８は、長い柔軟性ペプチドリンカーを介したＣ末端でのアルブミン融合をさらに含む。

他の実施形態では、リンカーは、プロテアーゼ、例えば、凝固経路プロテアーゼ、例えば、活性化第ＸＩＩ因子によって切断可能である。特定の実施形態では、リンカーは、第ＸＩ因子及び／またはプレカリクレインのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、リンカーは、好中球エラスターゼ、カテプシンＧ、またはプロテイナーゼ３などの好中球特異的プロテアーゼによる切断のために標的化されるペプチド配列を含む。

いくつかの態様では、本発明は、製造において利点を有するように操作された細胞外ＤＮＡＳＥ酵素のバリアントを提供し、治療に使用するのに好適な組換え酵素の産生を提供する。様々な実施形態では、本発明は、システイン残基における１つ以上のアミノ酸置換（またはＣｙｓ残基のＰＥＧ化）を含む組換えＤ１、Ｄ１Ｌ１、Ｄ１Ｌ２、及びＤ１Ｌ３バリアントを提供し、タンパク質発現中のジスルフィド架橋を介した分子内及び分子間架橋の減少をもたらす。

他の態様では、本発明は、インビボでの曝露を改善するために、例えば、排出を遅らせる、例えば、半減期（例えば、血清半減期）を延長する、及び薬力学的活性の持続時間を延長する、ならびに組換え酵素産生中のタンパク質分解を低減させるために、プロテアーゼ抵抗性において利点を有するように操作された細胞外ＤＮＡＳＥ酵素のバリアントを提供する。本開示は、例えば、プラスミン、トロンビン、及び／またはトリプシンによるタンパク質分解に感受性のあるＤ１Ｌ３残基、ならびに哺乳動物及び非哺乳動物細胞株によって産生されるプロテアーゼに感受性のある残基（例えば、対塩基性アミノ酸）を特定する。これらの残基の操作された変異は、プロテアーゼ抵抗性においてこれらの利点を付与することができる。

他の態様では、本発明は、細胞外ＤＮＡＳＥタンパク質の組換え産生のための方法を提供し、本明細書に記載されるそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、非哺乳動物発現系、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどの真核性非哺乳動物発現系を利用する。いくつかの実施形態では、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、宿主細胞からの分泌を可能にするその天然シグナルペプチドを有するＤＮａｓｅ酵素をコードする。いくつかの実施形態では、発現系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞発現系である。

いくつかの実施形態では、組換え発現系は、対塩基性アミノ酸で切断する１つ以上のプロテアーゼの欠失または不活性化を有する。例示的な酵素としては、フューリン（ＣＨＯ細胞によって発現される）、ならびにＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現されるアスパラギン酸プロテイナーゼ３（Ｙｓｐ１）及びケキシン（Ｋｅｘ２）が含まれる。いくつかの実施形態では、これらの酵素は、遺伝子的に欠失または不活性化されないが、組換えタンパク質産生中に、それらの活性がプロテアーゼ阻害剤で阻害される。

いくつかの実施形態では、非哺乳動物発現系または哺乳動物発現系についての成長培地は、デキストラン硫酸、ヘパリン、クエン酸第二鉄、ＥＤＴＡなどのポリアニオンで補充される。さらなる実施形態では、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓまたは他の発現系の成長培地は、５ｋＤａ～１００ｋＤａの平均分子量を有するデキストラン硫酸で補充される。例えば、ポリアニオンは、産生された組換えタンパク質と複合体化するのに十分な量で培養物に追加され得る。いくつかの実施形態では、非哺乳動物発現系または哺乳動物発現系の培養培地からの組換え細胞外ＤＮＡＳＥタンパク質及びそのバリアントは、デキストラン硫酸、ヘパリン、及びＥＤＴＡなどのポリアニオンからの組換え細胞外ＤＮＡＳＥタンパク質及びバリアントの解離を含む方法を通じて精製される。

他の態様では、本発明は、Ｄ１、Ｄ１Ｌ１、Ｄ１Ｌ２、またはＤ１Ｌ３バリアントをコードする単離ポリヌクレオチド、ならびにベクター及び宿主細胞を提供する。ポリヌクレオチドは、コードするｍＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどの非哺乳動物であるか、またはＣＨＯ細胞などの哺乳動物であるかを問わず、細菌または真核生物を含む組換え発現系の細胞であり得る。他の実施形態では、宿主細胞は、ＤＮＡＳＥ治療のために送達され得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される細胞外ＤＮＡＳＥタンパク質のうちの１つ以上を分泌するように修飾され、治療剤としての投与を意図する、宿主細胞、例えば、ヒト細胞、例えば、白血球を提供する。

本発明は、本明細書に記載される細胞外ＤＮＡＳＥタンパク質もしくはそのバリアント、または任意選択で、記載されるポリヌクレオチドもしくはベクター、及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物をさらに提供する。薬学的組成物は、任意の投与経路のために製剤化され得る。

他の態様では、本発明は、治療有効量の本明細書に記載の細胞外ＤＮＡＳＥもしくはそのバリアントまたは組成物を投与することによる、細胞外ＤＮＡ分解、細胞外クロマチン分解、細胞外トラップ（ＥＴ）分解、及び／または好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）分解を必要とする対象を治療するための方法を提供する。

本発明の他の態様及び実施形態は、以下の詳細な記載から明らかとなるであろう。

配列番号４の変異Ｑ１０１Ｒ及びＱ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫが、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３の高分子量クロマチンを分解する活性を増加させることを示す。ＣＨＯ細胞は、野生型ＤＮＡＳＥ１Ｌ３または構成要素置換を有するＤＮＡＳＥ１Ｌ３で一過性トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞の上清を、精製した核（高分子量クロマチン）または緩衝液と共にインキュベートした。ＤＮＡを単離し、アガロースゲル電気泳動によって分析した。図は、ＤＮＡ色素で染色したアガロースゲルを示す。 ２つのＤＮＡＳＥ１Ｌ３バリアントの特徴を示す。野生型ＤＮＡＳＥ１Ｌ３またはＱ１０１ＲもしくはＱ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫ変異を有するＤＮＡＳＥ１Ｌ３でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の異なる濃度の上清を、抗ＤＮＡＳＥ１Ｌ３抗体を使用するウエスタンブロット（ＷＢ）によって分析した。野生型ＤＮＡＳＥ１Ｌ３及びＱ１０１Ｒ変異を有する試料において、より大きい（バリアント１）及びより小さい（バリアント２）バンドを検出した。より小さいバンド（バリアント２）のみが、Ｑ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫ変異を有する試料中に示された。並行して、異なる濃度の上清におけるクロマチン分解活性を分析した。図は、アガロースゲル電気泳動によって分析したＤＮＡを示す。Ｑ１０１ＲまたはＱ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫ変異の両方が、野生型ＤＮＡＳＥ１Ｌ３と比較してクロマチン分解活性を増加させた。 野生型ＤＮＡＳＥ１Ｌ３で安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の上清中のＤＮＡＳＥ１Ｌ３バリアント１及び２の存在を示す。試料を、抗ＤＮＡＳＥ１Ｌ３抗体を使用するウエスタンブロット（ＷＢ）によって分析した。より大きい（バリアント１）及びより小さい（バリアント２）バンドを、５個のクローンにおいて検出した。 高頻度な切断部位を特定するために、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて組換え発現した野生型Ｄ１Ｌ３のＣ末端アミノ酸配列を示す。精製した野生型Ｄ１Ｌ３のアミノ酸配列決定により、３つのＣ末端欠失変異体：Ｋ２９１＿Ｓ３０５ｄｅｌ、Ｋ２９２＿Ｓ３０５ｄｅｌ、及びＳ２９３＿Ｓ３０５ｄｅｌを特定した。野生型Ｄ１Ｌ３のＣ末端は、検出されなかった。並行して、異なる濃度の精製したタンパク質におけるクロマチン分解活性を分析し、精製したＤＮＡＳＥ１（Ｄ１）及びＦ２７５Ｙ／Ｆ２７９＿Ｋ２８０ｄｅｌｉｎｓＶＭ／Ｑ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫ変異を有する塩基性ドメイン欠失ＤＮＡＳＥ１Ｌ３（ＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３）と比較した。図は、アガロースゲル電気泳動によって分析したＤＮＡを示す。 ＣＨＯ培地にデキストラン硫酸を追加すると、タンパク質収率を改善することを示す。野生型Ｄ１Ｌ３を発現するＣＨＯ細胞の安定したプールを、標準ＣＨＯ培地またはデキストラン硫酸を補充したＣＨＯ培地でインキュベートした。上清を、抗ＤＮＡＳＥ１Ｌ３抗体を使用するウエスタンブロット（ＷＢ）によって分析した。図は、Ｄ１Ｌ３がＣＨＯ細胞において不十分な発現であり、低収率であることを示す。デキストラン硫酸の追加は収率を増加させるが、産生断片化を防止しない。 デキストラン硫酸複合Ｄ１Ｌ３の親和性精製のためのアニオン交換表面及びカチオン交換表面の使用を示す。Ａは、デキストラン硫酸（ＤＳ）などのポリアニオンが、Ｄ１Ｌ３と複合体を形成することを示す。Ｄ１Ｌ３－ＤＳ複合体は、生産プロセス中に、負に帯電した表面によって、Ｄ１Ｌ３の相互作用と除去が防止される。Ｂ及びＣは、ＤＳ－Ｄ１Ｌ３複合体からＤ１Ｌ３を精製する２ステップのプロセスを示す。 Ｄ１Ｌ３分解を制限するためのトリプシン切断部位変異戦略を列挙する。 ヒトＤ１（配列番号１）及びヒトＤ１Ｌ３（配列番号４）アミノ酸配列の、示されるプラスミン感受性ＫＲ残基とのアライメントである。 Ｄ１Ｌ３分解を制限するためのプラスミン切断部位変異戦略を示す。 変異したプラスミン切断部位を有するＤ１Ｌ３が、酵素活性を保持することを示す。４つの推定プラスミド切断部位（Ｋ１８０＿Ａ１８１ｄｅｌｉｎｓＧＬ、Ｐ１９８＿Ａ２０１ｄｅｌｉｎｓＲＰＳＱ、Ｋ２５９Ａ、Ｒ２８５Ａ）において変異を含むＤＮＡＳＥ１Ｌ３を一過性にトランスフェクトした細胞からの上清を、精製した核（高分子量クロマチン）または緩衝液と共にインキュベートした。ＤＮＡを単離し、アガロースゲル電気泳動によって分析した。図は、ＤＮＡ色素で染色したアガロースゲルを示す。 プラスミン消化に基づくプラスミン切断部位を列挙し、Ｄ１Ｌ３分解を制限するための変異戦略を示す。 Ｄ１Ｌ３が、ＣＨＯ細胞内で発現した際にミスフォールドする傾向を有することを示す。Ａは、天然分泌シグナルペプチドを使用したＤ１Ｌ３発現のための単純な発現ベクターを示す。安定したプールの上清を、抗ＤＮＡＳＥ１Ｌ３抗体を使用するウエスタンブロットによって分析し、Ｂは、非還元条件下で高分子量の凝集体の存在を示し、これは還元条件下で分解される。 ヒトＤ１（配列番号１）及びヒトＤ１Ｌ３（配列番号４）アミノ酸配列の、示される保存及び非保存システイン残基とのアライメントである。 Ｄ１Ｌ３におけるシステイン残基を列挙し、タンパク質発現中に高分子量の凝集体を制限するための変異戦略を示す。 Ｄ１Ｌ３におけるＣ６８Ａ及びＣ１９４Ａ変異がクロマチン分解活性に影響を及ぼさないことを示す。変異Ｃ２４Ａ及びＣ５２Ａは、クロマチン分解活性を無効にした。変異ＤＮＡＳＥ１Ｌ３バリアントで一過性にトランスフェクトした細胞からの上清を、精製した核または緩衝液と共にインキュベートした。ＤＮＡを単離し、アガロースゲル電気泳動によって分析した。図は、ＤＮＡ色素で染色したアガロースゲルを示す。 天然分泌シグナルまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのα接合因子（αＭＦ）のいずれかを使用する、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＤ１Ｌ３の発現を示す。Ａは、Ｄ１Ｌ３のＮ末端がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのα接合因子（αＭＦ）のプレ－プロ分泌リーダーによって誘導されることを示す。Ｂは、αＭＦからの分泌シグナルが、シグナルペプチドのグリコシル化及び非プロセシングをもたらすことを示す。 αＭＥ、ヒト血清アルブモン（ＨＳＡ）、リンカー配列、及びＤ１Ｌ３の融合構築物が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現系においてグリコシル化されず、クロマチン分解活性を維持することを示す。Ａは、αＭＦ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、リンカー配列、及びＤ１Ｌ３の融合構築物を示す。この融合構築物は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現系においてグリコシル化されておらず（Ｂ）、クロマチン分解活性を保持する（Ｃ）。 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける塩基性ドメイン欠失ＤＮＡＳＥ１Ｌ３（ＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３）または野生型ＤＮＡＳＥ１Ｌ３（Ｄ１Ｌ３）のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合構築物の発現レベルを示す。ＨＳＡを、ＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３またはＤ１Ｌ３のＮまたはＣ末端のいずれかに融合した。２つのリンカー配列、Ｌ１及びＬ２を、ＨＳＡとＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３またはＤ１Ｌ３との間に配置した。 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける野生型ＤＮＡＳＥ１Ｌ３（Ｄ１Ｌ３）のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合構築物の発現レベルを示す。ＨＳＡを、Ｄ１Ｌ３のＮ末端に融合した。３つの異なるリンカー配列（Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４）を、ＨＳＡとＤ１Ｌ３との間に配置した。 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて産生された塩基性ドメイン欠失ＤＮＡＳＥ１Ｌ３（ＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３）のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合構築物の発現レベル及びクロマチン分解活性を示す。ＨＳＡを、ＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３のＮ末端に融合した。３つの異なるリンカー配列（Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７）を、ＨＳＡとＤ１Ｌ３との間に配置した。 血清クロマチン分解活性及びアルブミンＤ１Ｌ３融合タンパク質の循環半減期を示す。Ａは、配列番号１４及び配列番号１９を注入したＤｎａｓｅ１^－／－Ｄｎａｓｅ１ｌ３^－／－マウスが、血清中で同様のクロマチン分解活性を示すことを示す。Ｂは、配列番号１９が、ヒトＦｃＲｎ受容体を発現するマウスにおいて３．３日の循環半減期を有することを示す。 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて産生された塩基性ドメイン欠失ＤＮＡＳＥ１Ｌ３（ＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３）のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合構築物の発現レベル及びクロマチン分解活性を示す。ＨＳＡを、ＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３のＮ末端及びＣ末端に融合した。２つの異なるリンカー配列（Ｌ７及びＬ８）を、ＨＳＡとＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３との間に配置した。 切断可能なリンカーの設計を示す。Ａは、ＨＳＡとリンカーの融合構築物を示す。Ｂは、第ＸＩＩａ因子によって切断可能なリンカーの融合構築物を示す。ヒト第ＸＩ因子配列（配列番号４２）を含むリンカー及びヒトプレカリクレイン（配列番号４４）を含むリンカーを示す。 ヒト細胞外ＤＮａｓｅ、ヒト凝固因子、及びヒト補体因子を含む、半減期延長融合タンパク質に第ＸＩＩａ因子切断可能リンカーを利用する他の構築物を示す。

本発明は、細胞外ＤＮＡ、細胞外クロマチン、及び好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の蓄積及び／または放出を特徴とする状態を治療するために有用である、操作されたヒト細胞外ＤＮＡＳＥタンパク質（例えば、ＤＮＡＳＥ１（Ｄ１）、ＤＮＡＳＥ１様１（Ｄ１Ｌ１）、ＤＮＡＳＥ１様２（Ｄ１Ｌ２）、ＤＮＡＳＥ１様３アイソフォーム１（Ｄ１Ｌ３）、ＤＮＡＳＥ１様３アイソフォーム２（Ｄ１Ｌ３－２）、ＤＮＡＳＥ２Ａ（Ｄ２Ａ）、及びＤＮＡＳＥ２Ｂ（Ｄ２Ｂ）のバリアント）の候補を提供する。本発明の態様に従って、本明細書に記載されるＤＮａｓｅバリアントは、治療により好適であり、及び／または有効であり、及び／または大規模製造により適している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＮａｓｅバリアントは、全身療法に対する利点を有する。かかる利点は、より長い曝露（例えば、より遅い排出、より長い循環半減期）、延長した薬力学的作用の持続時間、改善されたクロマチン分解活性、及びプロテアーゼ抵抗性を含む。

定義
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上別途明確に指示されない限り、単数及び複数の参照を含む。したがって、例えば、「薬剤」への言及は、単一の薬剤及び複数のかかる薬剤を含む。

「クロマチン酵素」という用語は、クロマチン、すなわち、１つ以上のヒストンタンパク質に関連するＤＮＡを切る、切断する、または消化する軽微な能力を超えるデオキシリボヌクレアーゼ酵素のクラスを指す。ヒトＤＮＡＳＥ１Ｌ３は、クロマチン酵素である。一般に、本明細書に開示される様々なＤＮＡＳＥ１Ｌ３バリアントは、クロマチン酵素である。すべてのＤＮＡＳＥがクロマチン酵素ではない。例えば、ヒトＤＮＡＳＥ１は、クロマチンを切る、切断する、または消化する能力を本質的に有さず、クロマチン酵素ではない。

薬物に関して本明細書で使用される場合、「半減期」は、対象のマトリックス、例えば、血清または血漿で測定される、動物における薬物の濃度の排出半減期を指す。当業者は、すべての薬物が一次動態を示すわけではないこと、または排出のすべての段階でそれを行うわけではないことを理解するであろう。かかる事例では、当業者は、「半減期延長」または「延長した半減期」という用語は、より遅い排出速度を指す表現であることを当業者は理解するであろう。

「単離」とは、自然状態から改変または除去されることを意味する。例えば、生体動物において天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離」されているのではなく、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドが「単離」されている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば、宿主細胞などの非天然環境で存在し得る。

本明細書で使用される場合、「好中球細胞外トラップ」及び頭字語「ＮＥＴ」は、核内容物、例えば、プログラムされた様式で免疫細胞、典型的には好中球から放出されるヒストンタンパク質と結合したＤＮＡを含む細胞外線維のネットワークを指す。

別途明記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または核酸」は、互いに縮重した形式であり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかの形式でイントロン（複数可）を含み得る範囲でイントロンを含み得る。

「約」及び「およそ」という用語は、関連する数値の±１０％である量を含む。

「細胞外ＤＮＡＳＥ」という用語は、ＤＮＡＳＥ１及びＤＮＡＳＥ２ファミリー（例えば、ＤＮＡＳＥ１（Ｄ１）、ＤＮＡＳＥ１様１（Ｄ１Ｌ１）、ＤＮＡＳＥ１様２（Ｄ１Ｌ２）、ＤＮＡＳＥ１様３アイソフォーム１（Ｄ１Ｌ３）、ＤＮＡＳＥ１様３アイソフォーム２（Ｄ１Ｌ３－２）、ＤＮＡＳＥ２Ａ（Ｄ２Ａ）、及びＤＮＡＳＥ２Ｂ（Ｄ２Ｂ））の細胞外ＤＮＡＳＥタンパク質を指す。

いくつかの態様及び実施形態では、細胞外ＤＮＡＳＥまたはそのバリアントは、任意選択で、挿入リンカーによって、アルブミン、トランスフェリン、Ｆｃもしくはエラスチン様タンパク質、またはそのバリアントなどの半減期延長部分に融合される。例えば、ＵＳ９，４５８，２１８を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、細胞外ＤＮＡＳＥまたはそのバリアントは、免疫グロブリンヒンジ領域によって二量体化される。例えば、本明細書に記載される操作された酵素は、Ｆｃ融合ドメイン（例えば、免疫グロブリンのヒンジ及びＣＨ２ドメイン及びＣ Ｈ３ドメイン）も含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡＳＥ（例えば、Ｄ１Ｌ３バリアント）は、アルブミンアミノ酸配列またはドメイン、例えば、ヒトアルブミンまたはその断片もしくはバリアントに融合される。例えば、ＷＯ２０１５／０６６５５０及びＵＳ９，２２１，８９６を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。アルブミンは、操作された細胞外ＤＮＡＳＥまたはそのバリアントのＮ末端及び／またはＣ末端に、任意選択で、挿入リンカーを用いてＤＮＡＳＥと連結することができる。例示的なアルブミンアミノ酸配列は、配列番号３９によって提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤ１Ｌ３及びＤ１、またはバリアントは、Ｆｃヒンジ領域によって一緒に二量体化され、ＮＥＴを分解するための相乗的機能特性を有する二量体分子を作製する。いくつかの実施形態では、細胞外ＤＮＡＳＥまたはそのバリアントは、ペプチドリンカーを介してＮ末端でアルブミンアミノ酸配列と融合される。ペプチドリンカーは、柔軟性リンカー、剛性リンカー、またはいくつかの実施形態では、生理学的に切断可能リンカー（例えば、プロテアーゼ切断可能リンカー）であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、５～１００アミノ酸長、または５～５０アミノ酸長である。さらに他の実施形態では、リンカーは、細胞外ＤＮＡＳＥ及び半減期延長部分（例えば、アルブミン）と共有結合した有機分子、基、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、または化学部分である。

いくつかの態様では、本発明は、Ｄ１Ｌ３バリアントであって、Ｄ１Ｌ３バリアントが、配列番号４の野生型Ｄ１Ｌ３アイソフォーム１酵素または配列番号５の野生型Ｄ１Ｌ３アイソフォーム２酵素と比較して、増加したタンパク質安定性、増加した薬物動態曝露及び薬力学的活性の持続時間、タンパク質分解に対する抵抗性、インビトロ発現系でのより高い産生レベル、精製のためのより良好な適合性、ならびに実質的に低くはなく、同一の、またはより良好なクロマチン及び／またはＮＥＴ分解活性のうちの１つ以上を有する、Ｄ１Ｌ３バリアントを提供する。本明細書で使用される場合、反して記載されない限り、「Ｄ１Ｌ３」という用語は、アイソフォーム１またはアイソフォーム２のいずれかを含む。

酵素、例えば、Ｄ１Ｌ３バリアントのＤＮＡ及び／またはクロマチン及び／またはＮＥＴ分解活性は、例えば、ＮＥＴを形成するように誘導された精製された核、ＤＮＡ、またはエクスビボ血液もしくは好中球から得られたＤＮＡ、クロマチン、またはＮＥＴとの酵素のインキュベーションによって、インビトロで測定することができる。代替的に、酵素、例えば、Ｄ１Ｌ３バリアントのＤＮＡ及び／またはクロマチン及び／またはＮＥＴ分解活性は、例えば、酵素を対象に投与することによって、インビボで測定することができ、対象は、細胞外ＤＮＡ、クロマチン、またはＮＥＴを産生するか、または産生するように誘導され、マトリックス中のＤＮＡ、クロマチン、またはＮＥＴレベルの濃度に対する酵素の効果を、例えば、血清、好ましくは並行陰性対照を用いて、または酵素の投与前及び後の濃度を時間的に比較することによって測定する。

いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号４の野生型Ｄ１Ｌ３アイソフォーム１酵素または配列番号５の野生型Ｄ１Ｌ３アイソフォーム２酵素と比較して、ほぼ同じクロマチン及び／またはＮＥＴ分解活性を有する。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号４の野生型Ｄ１Ｌ３アイソフォーム１酵素または配列番号５の野生型Ｄ１Ｌ３アイソフォーム２酵素と比較して、より高いクロマチン及び／またはＮＥＴ分解活性を有する。

いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、アルブミンドメイン、任意のリンカー、及びＤ１Ｌ３ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、アルブミンドメイン及び任意のリンカーは、Ｄ１Ｌ３ドメインのＮ末端側に位置する。いくつかの実施形態では、アルブミンドメイン及び任意のリンカーは、Ｄ１Ｌ３ドメインのＣ末端側に位置する。すべてのかかる実施形態では、任意のリンカーは、アルブミンドメインとＤ１Ｌ３ドメインとの間に挿入される。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のアルブミンアミノ酸配列またはドメインは、配列番号３９によって定義される参照アルブミン配列と少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、アルブミンアミノ酸配列またはドメインは、配列番号３９によって定義される参照アルブミン配列を含むか、またはそれからなる。様々な実施形態では、アルブミンアミノ酸配列は、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）、例えば、ヒトＦｃＲｎと結合する。アルブミンアミノ酸配列は、野生型ＨＳＡのバリアント（例えば、配列番号３９によって表される）であり得る。様々な実施形態では、アルブミンバリアントは、配列番号３９に関して、独立して欠失、置換、及び挿入から選択される１～２０個、または１～１０個のアミノ酸修飾を有し得る。いくつかの実施形態では、アルブミンアミノ酸配列は、任意の哺乳動物アルブミンアミノ酸配列である。

いくつかの実施形態では、アルブミンアミノ酸配列またはドメインは、配列番号３９で表される全長アルブミンの断片である。「断片」という用語は、アルブミンの文脈で使用される場合、それが融合または複合されるＤＮＡＳＥ酵素の半減期を、対応する非融合ＤＮＡＳＥと比較して延長する、全長アルブミンまたはそのバリアントの任意の断片を指す。いくつかの実施形態では、アルブミンの断片は、ドメインＩ及びＩＩＩ、ならびにドメインＩＩ及びＩＩＩなどのアルブミンの複数のドメインの融合を含むアミノ酸配列を指し得る（例えば、ＷＯ２０１１／１２４７１８を参照されたい）。一般に、アルブミンの断片は、全長配列の少なくとも約１００個のアミノ酸、または少なくとも約２００個もしくは少なくとも約３００個のアミノ酸を有する。様々な実施形態では、アルブミン断片は、ヒトＦｃＲｎと結合する能力を維持する。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＤ１Ｌ３様ドメインは、配列番号４または配列番号５によって定義される成熟Ｄ１Ｌ３酵素参照配列と少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３ドメインは、配列番号４または配列番号５によって定義される参照配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、参照配列は、Ｃ末端の２３個のアミノ酸によって定義される配列番号４または５のＣ末端の塩基性ドメインを含まない。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｄ１Ｌ３ドメインを含み、Ｄ１Ｌ３ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４または配列番号５によって定義される成熟酵素と少なくとも約８０％同一である。融合タンパク質は、成熟酵素のＮ末端にアルブミンアミノ酸配列またはドメイン、ならびにアルブミンアミノ酸配列と成熟酵素のアミノ酸配列との間の連結アミノ酸配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３ドメインは、配列番号４または配列番号５によって定義される成熟酵素参照配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、参照配列は、Ｃ末端の２３個のアミノ酸によって定義される配列番号４または５のＣ末端の塩基性ドメインを含まない。Ｄ１Ｌ３ドメインを含む融合タンパク質は、全身療法を含む、改善された循環半減期及び薬力学的効果の持続時間を示す。加えて、アルブミンと連結配列との融合は、アルブミン融合を有しないバリアントと比較して、インビトロクロマチン分解アッセイを使用して決定されるように、クロマチン分解活性に実質的に影響を及ぼさない（またはいくつかの実施形態では、負の影響を及ぼさない）。

野生型ＤＮａｓｅ酵素との配列同一性を指す場合、特に明記しない限り、配列はシグナルペプチドを欠く成熟酵素を指す。さらに、特に明記しない限り、明確にするために、シグナルペプチドを含む、完全翻訳ＤＮａｓｅ配列に関してアミノ酸位置に番号付けされる。したがって、例えば、配列番号４の酵素（ヒトＤ１Ｌ３、アイソフォーム１）に対する配列同一性への言及は、Ｎ末端にＭ２１を有する成熟酵素とのパーセント同一性を指す。同様に、配列番号１の酵素（ヒトＤ１）に対する配列同一性への言及は、Ｎ末端にＬ２３を有する成熟酵素とのパーセント同一性を指す。

いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３は、Ｃ末端塩基性ドメインのすべてまたは一部の欠失を有する。Ｃ末端塩基性ドメインは、配列番号４または配列番号５のＣ末端の２３個のアミノ酸として定義される。Ｄ１Ｌ３のＣ末端塩基性ドメインの欠失または不活性化は、クロマチン分解活性を実質的に改善する。図１、２、及び４を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、Ｃ末端塩基性ドメインの少なくとも５個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態では、少なくとも１０個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態では、少なくとも１５個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態では、少なくとも２０個のアミノ酸などのＣ末端塩基性ドメインアミノ酸の欠失を有する。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号４または配列番号５のＣ末端の２３個のアミノ酸によって定義されるＣ末端塩基性ドメイン全体の欠失を有する。例示的なＢＤ欠失には、Ｑ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫ（配列番号９を参照されたい）、Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫ（配列番号１０を参照されたい）、Ｋ２９２＿Ｓ３０５ｄｅｌ（配列番号１１を参照されたい）、及びＳ２９３＿Ｓ３０５ｄｅｌ（配列番号１２を参照されたい）が含まれる。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３ドメインのＣ末端（ＢＤ欠失を有する）は、Ｃ末端に、Ｃ末端ＢＤと整列せず、インビトロアッセイにおいてクロマチン分解活性に悪影響を及ぼさない１～１０個または１～５個のアミノ酸を有する。

いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号８～配列番号１６から選択される配列のＤＮＡＳＥ１Ｌ３ドメイン、配列番号３１～配列番号３８から選択される配列のリンカー、及び配列番号３９の配列または記載されるバリアントまたは断片を有するアルブミンドメインを含む、操作された融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４７０８に記載される、Ｄ１からの１つ以上の構成要素置換を有し、参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３配列またはドメインは、Ｄ１からの構成要素置換を含み、それは、Ｍ２１＿Ｒ２２ｄｅｌｉｎｓＬＫ、Ｃ２４＿Ｓ２５ｄｅｌｉｎｓＡＡ、Ｖ２８＿Ｓ３０ｄｅｌｉｎｓＩＱＴ、Ｓ３４Ｔ、Ｑ３６＿Ｖ４４ｄｅｌｉｎｓＭＳＮＡＴＬＶＳＹ、Ｋ４７＿Ｋ５０ｄｅｌｉｎｓＱＩＬＳ、Ｃ５２Ｙ、Ｉ５５＿Ｍ５８ｄｅｌｉｎｓＩＡＬＶＱＥ、Ｉ６０＿Ｋ６１ｄｅｌｉｎｓＶＲ、Ｎ６４＿Ｉ７０ｄｅｌｉｎｓＨＬＴＡＶＧＫ、Ｍ７２＿Ｋ７４ｄｅｌｉｎｓＬＤＮ、Ｒ７７＿Ｉ８３ｄｅｌｉｎｓＱＤＡＰＤ、Ｎ８６Ｈ、Ｉ８９Ｖ、Ｓ９１＿Ｒ９２ｄｅｌｉｎｓＥＰ、Ｔ９７Ｓ、Ｑ１０１Ｒ、Ａ１０３Ｌ、Ｌ１０５Ｖ、Ｋ１０７＿Ｌ１１０ｄｅｌｉｎｓＲＰＤＱ、Ｖ１１３＿Ｒ１１５ｄｅｌｉｎｓＡＶＤ、Ｈ１１８Ｙ、Ｈ１２０Ｄ、Ｙ１２２＿Ａ１２７ｄｅｌｉｎｓＧＣＥＰＣＧＮ、Ｖ１２９Ｔ、Ｓ１３１Ｎ、Ｆ１３５＿Ｖ１３６ｄｅｌｉｎｓＡＩ、Ｗ１３８Ｒ、Ｑ１４０＿Ｈ１４３ｄｅｌｉｎＦＳＲＦ、Ａ１４５＿Ｄ１４８ｄｅｌｉｎｓＥＶＲＥ、Ｖ１５０Ａ、Ｉ１５２Ｖ、Ｔ１５６＿Ｔ１５７ｄｅｌｉｎｓＡＡ、Ｅ１５９＿Ｓ１６１ｄｅｌｉｎｓＧＤＡ、Ｋ１６３Ａ、Ｅ１６７Ａ、Ｖ１６９＿Ｅ１７０ｄｅｌｉｎｓＹＤ、Ｔ１７３Ｌ、Ｋ１７６＿Ｒ１７８ｄｅｌｉｎｓＱＥＫ、Ｋ１８０＿Ａ１８１ｄｅｌｉｎｓＧＬ、Ｎ１８３＿Ｆ１８６ｄｅｌｉｎｓＤＶＭＬ、Ｐ１９８＿Ａ２０１ｄｅｌｉｎｓＲＰＳＱ、Ｋ２０３＿Ｎ２０４ｄｅｌｉｎｓＳＳ、Ｒ２０８Ｗ、Ｄ２１０Ｓ、Ｒ２１２Ｔ、Ｖ２１４Ｑ、Ｇ２１８Ｐ、Ｑ２２０＿Ｅ２２１ｄｅｌｉｎｓＳＡ、Ｖ２２５＿Ｓ２２８ｄｅｌｉｎｓＡＴＰ、Ｎ２３０Ｈ、Ｌ２３８＿Ｒ２３９ｄｅｌｉｎｓＶＡ、Ｑ２４１＿Ｓ２４６ｄｅｌｉｎｓＭＬＬＲＧＡ、Ｋ２５０Ｄ、Ｎ２５２＿Ｖ２５４ｄｅｌｉｎｓＡＬＰ、Ｄ２５６Ｎ、Ｋ２５９Ａ、Ｋ２６２Ｇ、Ｔ２６４＿Ｅ２６７ｄｅｌｉｎｓＳＤＱＬ、Ｌ２６９＿Ｖ２７１ｄｅｌｉｎｓＱＡＩ、Ｆ２７５Ｙ、Ｆ２７９＿Ｋ２８０ｄｅｌｉｎｓＶＭ、Ｑ２８２＿Ｓ２０５ｄｅｌｉｎｓＫのうちの１つ以上から選択でき、前述の置換の各々が、配列番号４に関して番号付けされる。

例えば、Ｄ１Ｌ３バリアントは、Ｑ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫのＤ１からの構成要素置換を有し得、それは、Ｃ末端塩基性ドメインの欠失を含み、Ｄ１において欠如する。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３酵素は、配列番号４の１０１位に対応する位置にアミノ酸置換を有する。置換は、Ｄ１からの対応する構成要素に基づくＡｒｇであり得るか、またはいくつかの実施形態では、Ｌｙｓである。この位置での置換は、Ｄ１Ｌ３のクロマチン分解活性を増強することができる。この位置での他の置換は、同様の特性を示す可能性が高い。

存在する場合のリンカーは、柔軟性、剛性、及び切断可能ペプチドリンカーから選択することができる。柔軟性リンカーは、主にまたは完全に、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒなどの小さい、非極性、または極性残基から構成される。例示的な柔軟性リンカーは、（Ｇｌｙ_ｙＳｅｒ）_ｎリンカーを含み、ｙは１～１０（例えば、１～５）であり、ｎは１～約１０であり、いくつかの実施形態では、３～約６である。例示的な実施形態では、ｙは２～４であり、ｎは３～８である。それらの柔軟性のために、これらのリンカーは非構造性である。より剛性なリンカーとしては、ポリプロリンまたはポリＰｒｏ－Ａｌａモチーフ及びα－ヘリックスリンカーが含まれる。例示的なα－ヘリックスリンカーは、Ａ（ＥＡＡＡＫ）_ｎＡであり、ｎは、上記で定義されたとおりである（例えば、１～１０、または２～６）。一般に、リンカーは、主に、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、及びＰｒｏから選択されるアミノ酸から構成され得る。例示的なリンカー配列は、少なくとも１０個のアミノ酸を含み、１５～３５個のアミノ酸の範囲であり得る。例示的なリンカー設計は、配列番号３１～３８として提供される。

いくつかの実施形態では、バリアントは、リンカーを含み、リンカーのアミノ酸配列は、主にグリシン及びセリン残基であるか、またはグリシン及びセリン残基から本質的になる。いくつかの実施形態では、リンカーにおけるＳｅｒ及びＧｌｙの比率は、それぞれ、約１：１～約１：１０、約１：２～約１：６、または約１：４である。例示的なリンカー配列は、Ｓ（ＧＧＳ）_４ＧＳＳ（配列番号３６）、Ｓ（ＧＧＳ）_９ＧＳ（配列番号３７）、（ＧＧＳ）_９ＧＳ（配列番号３９）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１０個のアミノ酸、または少なくとも１５個のアミノ酸、または少なくとも２０個のアミノ酸、または少なくとも２５個のアミノ酸を有する。例えば、リンカーは、１５～３０個のアミノ酸の長さを有し得る。様々な実施形態では、少なくとも１５個のアミノ酸のより長いリンカーは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現時の収率の改善を提供することができる。図２０を参照されたい。さらに、驚くべきことに、より長いリンカー配列は、より短いリンカー配列と比較して、改善されたクロマチン分解活性を示した。図２０を参照されたい。

様々な実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号１７～３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む融合タンパク質である。他の実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号１７～３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む融合タンパク質であり、配列番号１７～３０から選択される参照配列に関して独立して、アミノ酸の挿入、欠失、または置換から選択される１～２０個、または１～１０個、または１～５個のアミノ酸修飾を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、融合タンパク質のＤ１Ｌ３ドメイン、アルブミンドメイン、または両方のドメインにある。いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、または配列番号３０のアミノ酸配列を有する。これらの実施形態では、アルブミンアミノ酸配列は、Ｄ１Ｌ３（またはバリアント）のＮ末端またはＮ末端側で、中程度または長い柔軟性リンカーを介して融合される。

他の実施形態では、リンカーは、生理学的に切断可能リンカー、例えばプロテアーゼ切断可能リンカーである。例えば、プロテアーゼは、活性化第ＸＩＩ因子などの凝固経路プロテアーゼであり得る。特定の実施形態では、リンカーは、第ＸＩ因子（配列番号４２）及び／もしくはプレカリクレイン（配列番号４４または４５）のアミノ酸配列、またはその生理学的に切断可能な断片を含む。選択される実施形態では、第ＸＩ因子からのリンカーアミノ酸配列は、配列番号４２のすべてまたは一部（例えば、第ＸＩＩａ因子による切断を可能にする配列番号４２の修飾を含む配列番号４２の一部）を含む。いくつかの実施形態では、プレカリクレインからのリンカーアミノ酸配列は、配列番号４４のすべてまたは一部（例えば、第ＸＩＩａ因子による切断を可能にする配列番号４４の修飾を含む配列番号４４の一部）を含む。他の実施形態では、リンカーは、好中球エラスターゼ、カテプシンＧ、及びプロテイナーゼ３などの好中球特異的プロテアーゼによる切断のために標的化されるペプチド配列を含む。

Ｄ１Ｌ３融合タンパク質のいくつかの例示的な実施形態は独立して、本明細書に開示される配列から選択され得る３個のアミノ酸配列の組み合わせを含み、かかる配列は、以下のようにＮ末端からＣ末端の順に配置される：

融合１：配列番号４、配列番号３１、配列番号３９；
融合２：配列番号５、配列番号３１、配列番号３９；
融合３：配列番号８、配列番号３１、配列番号３９；
融合４：配列番号９、配列番号３１、配列番号３９；
融合５：配列番号１０、配列番号３１、配列番号３９；
融合６：配列番号１１、配列番号３１、配列番号３９；
融合７：配列番号１２、配列番号３１、配列番号３９；
融合８：配列番号１３、配列番号３１、配列番号３９；
融合９：配列番号１４、配列番号３１、配列番号３９；
融合１０：配列番号１５、配列番号３１、配列番号３９；
融合１１：配列番号１６、配列番号３１、配列番号３９；
融合１２：配列番号４、配列番号３２、配列番号３９；
融合１３：配列番号５、配列番号３２、配列番号３９；
融合１４：配列番号８、配列番号３２、配列番号３９；
融合１５：配列番号９、配列番号３２、配列番号３９；
融合１６：配列番号１０、配列番号３２、配列番号３９；
融合１７：配列番号１１、配列番号３２、配列番号３９；
融合１８：配列番号１２、配列番号３２、配列番号３９；
融合１９：配列番号１３、配列番号３２、配列番号３９；
融合２０：配列番号１４、配列番号３２、配列番号３９；
融合２１：配列番号１５、配列番号３２、配列番号３９；
融合２２：配列番号１６、配列番号３２、配列番号３９；
融合２３：配列番号４、配列番号３３、配列番号３９；
融合２４：配列番号５、配列番号３３、配列番号３９；
融合２５：配列番号８、配列番号３３、配列番号３９；
融合２６：配列番号９、配列番号３３、配列番号３９；
融合２７：配列番号１０、配列番号３３、配列番号３９；
融合２８：配列番号１１、配列番号３３、配列番号３９；
融合２９：配列番号１２、配列番号３３、配列番号３９；
融合３０：配列番号１３、配列番号３３、配列番号３９；
融合３１：配列番号１４、配列番号３３、配列番号３９；
融合３２：配列番号１５、配列番号３３、配列番号３９；
融合３３：配列番号１６、配列番号３３、配列番号３９；
融合３４：配列番号４、配列番号３４、配列番号３９；
融合３５：配列番号５、配列番号３４、配列番号３９；
融合３６：配列番号８、配列番号３４、配列番号３９；
融合３７：配列番号９、配列番号３４、配列番号３９；
融合３８：配列番号１０、配列番号３４、配列番号３９；
融合３９：配列番号１１、配列番号３４、配列番号３９；
融合４０：配列番号１２、配列番号３４、配列番号３９；
融合４１：配列番号１３、配列番号３４、配列番号３９；
融合４２：配列番号１４、配列番号３４、配列番号３９；
融合４３：配列番号１５、配列番号３４、配列番号３９；
融合４４：配列番号１６、配列番号３４、配列番号３９；
融合４５：配列番号４、配列番号３５、配列番号３９；
融合４６：配列番号５、配列番号３５、配列番号３９；
融合４７：配列番号８、配列番号３５、配列番号３９；
融合４８：配列番号９、配列番号３５、配列番号３９；
融合４９：配列番号１０、配列番号３５、配列番号３９；
融合５０：配列番号１１、配列番号３５、配列番号３９；
融合５１：配列番号１２、配列番号３５、配列番号３９；
融合５２：配列番号１３、配列番号３５、配列番号３９；
融合５３：配列番号１４、配列番号３５、配列番号３９；
融合５４：配列番号１５、配列番号３５、配列番号３９；
融合５５：配列番号１６、配列番号３５、配列番号３９；
融合５６：配列番号４、配列番号３６、配列番号３９；
融合５７：配列番号５、配列番号３６、配列番号３９；
融合５８：配列番号８、配列番号３６、配列番号３９；
融合５９：配列番号９、配列番号３６、配列番号３９；
融合６０：配列番号１０、配列番号３６、配列番号３９；
融合６１：配列番号１１、配列番号３６、配列番号３９；
融合６２：配列番号１２、配列番号３６、配列番号３９；
融合６３：配列番号１３、配列番号３６、配列番号３９；
融合６４：配列番号１４、配列番号３６、配列番号３９；
融合６５：配列番号１５、配列番号３６、配列番号３９；
融合６６：配列番号１６、配列番号３６、配列番号３９；
融合６７：配列番号４、配列番号３７、配列番号３９；
融合６８：配列番号５、配列番号３７、配列番号３９；
融合６９：配列番号８、配列番号３７、配列番号３９；
融合７０：配列番号９、配列番号３７、配列番号３９；
融合７１：配列番号１０、配列番号３７、配列番号３９；
融合７２：配列番号１１、配列番号３７、配列番号３９；
融合７３：配列番号１２、配列番号３７、配列番号３９；
融合７４：配列番号１３、配列番号３７、配列番号３９；
融合７５：配列番号１４、配列番号３７、配列番号３９；
融合７６：配列番号１５、配列番号３７、配列番号３９；
融合７７：配列番号１６、配列番号３７、配列番号３９；
融合７８：配列番号４、配列番号３８、配列番号３９；
融合７９：配列番号５、配列番号３８、配列番号３９；
融合８０：配列番号８、配列番号３８、配列番号３９；
融合８１：配列番号９、配列番号３８、配列番号３９；
融合８２：配列番号１０、配列番号３８、配列番号３９；
融合８３：配列番号１１、配列番号３８、配列番号３９；
融合８４：配列番号１２、配列番号３８、配列番号３９；
融合８５：配列番号１３、配列番号３８、配列番号３９；
融合８６：配列番号１４、配列番号３８、配列番号３９；
融合８７：配列番号１５、配列番号３８、配列番号３９；
融合８８：配列番号１６、配列番号３８、配列番号３９；
融合８９：配列番号４、配列番号４２、配列番号３９；
融合９０：配列番号５、配列番号４２、配列番号３９；
融合９１：配列番号８、配列番号４２、配列番号３９；
融合９２：配列番号９、配列番号４２、配列番号３９；
融合９３：配列番号１０、配列番号４２、配列番号３９；
融合９４：配列番号１１、配列番号４２、配列番号３９；
融合９５：配列番号１２、配列番号４２、配列番号３９；
融合９６：配列番号１３、配列番号４２、配列番号３９；
融合９７：配列番号１４、配列番号４２、配列番号３９；
融合９８：配列番号１５、配列番号４２、配列番号３９；
融合９９：配列番号１６、配列番号４２、配列番号３９
融合１００：配列番号４、配列番号４３、配列番号３９；
融合１０１：配列番号５、配列番号４３、配列番号３９；
融合１０２：配列番号８、配列番号４３、配列番号３９；
融合１０３：配列番号９、配列番号４３、配列番号３９；
融合１０４：配列番号１０、配列番号４３、配列番号３９；
融合１０５：配列番号１１、配列番号４３、配列番号３９；
融合１０６：配列番号１２、配列番号４３、配列番号３９；
融合１０７：配列番号１３、配列番号４３、配列番号３９；
融合１０８：配列番号１４、配列番号４３、配列番号３９；
融合１０９：配列番号１５、配列番号４３、配列番号３９；
融合１１０：配列番号１６、配列番号４３、配列番号３９；
融合１１１：配列番号４、配列番号４４、配列番号３９；
融合１１２：配列番号５、配列番号４４、配列番号３９；
融合１１３：配列番号８、配列番号４４、配列番号３９；
融合１１４：配列番号９、配列番号４４、配列番号３９；
融合１１５：配列番号１０、配列番号４４、配列番号３９；
融合１１６：配列番号１１、配列番号４４、配列番号３９；
融合１１７：配列番号１２、配列番号４４、配列番号３９；
融合１１８：配列番号１３、配列番号４４、配列番号３９；
融合１１９：配列番号１４、配列番号４４、配列番号３９；
融合１２０：配列番号１５、配列番号４４、配列番号３９；
融合１２１：配列番号１６、配列番号４４、配列番号３９；
融合１２２：配列番号４、配列番号４５、配列番号３９；
融合１２３：配列番号５、配列番号４５、配列番号３９；
融合１２４：配列番号８、配列番号４５、配列番号３９；
融合１２５：配列番号９、配列番号４５、配列番号３９；
融合１２６：配列番号１０、配列番号４５、配列番号３９；
融合１２７：配列番号１１、配列番号４５、配列番号３９；
融合１２８：配列番号１２、配列番号４５、配列番号３９；
融合１２９：配列番号１３、配列番号４５、配列番号３９；
融合１３０：配列番号１４、配列番号４５、配列番号３９；
融合１３１：配列番号１５、配列番号４５、配列番号３９；
融合１３２：配列番号１６、配列番号４５、配列番号３９；

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、シグナルペプチドと合成される。シグナルペプチドは、宿主細胞からの分泌中に除去され得る。例示的なシグナルペプチドは、配列番号４～１６及び配列番号４４～４６に示される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、成熟タンパク質であり、すなわちシグナルペプチドを欠く。

様々な実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質１～１３２から選択され、選択された融合タンパク質は、任意選択で、独立してアミノ酸の欠失、挿入、及び置換から選択される最大２０個（または最大１０個）のアミノ酸修飾を有し得る。

いくつかの態様では、本発明は、製造において利点を有するように操作された細胞外ＤＮＡＳＥ酵素のバリアントを提供し、治療での使用に好適な組換え酵素の生産を提供し、すでに記載されているように、任意選択で、融合タンパク質の実施形態（アルブミン融合の実施形態を含む）に関連して使用することができる。様々な実施形態では、本発明は、システイン残基の１つ以上のアミノ酸置換または欠失を含む組換えＤ１、Ｄ１Ｌ１、Ｄ１Ｌ２、及びＤ１Ｌ３バリアントを提供し、タンパク質発現中のジスルフィド架橋を介した分子内及び分子間の架橋の低減をもたらす。例えば、ＤＮａｓｅバリアントは、野生型配列に存在する１つ、２つ、もしくは３つのシステイン残基を欠くことができる（例えば、１つ、２つ、もしくは３つのシステイン残基が欠失される）、または他のアミノ酸（複数可）で置換されたかかるシステイン（複数可）のうちの１つ以上を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のシステイン残基は独立して、Ａｌａ、Ｇｌｙ、及びＳｅｒから選択されるアミノ酸で置換されるか、またはシステイン残基のうちの１つ以上は、構成要素置換の一部として置換される。いくつかの実施形態では、置換される１つ以上のシステイン残基は、Ｄ１タンパク質ファミリーの他のメンバー（例えば、Ｄ１、Ｄ１Ｌ１、Ｄ１Ｌ２、及びＤ１Ｌ３）間で保存されない。いくつかの実施形態では、操作された酵素は、野生型酵素と比較して、増加したタンパク質安定性、増加したプロテアーゼによる分解に対する抵抗性、増加した生物学的利用率、ならびに実質的に同じまたはより良いＤＮＡ及び／またはクロマチン及び／またはＮＥＴ分解活性（インビトロまたはインビボ）をもたらすＤ１タンパク質ファミリーの別のメンバーからの少なくとも１つの構成要素置換及び／または他の点変異を含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態では、置換及び／または修飾は、他の修飾の中でも、システイン残基における単一の修飾のみを含む。いくつかの実施形態では、単一のシステイン残基の除去は、製造における重要な利点のために十分である。

他の態様では、本発明は、インビボ半減期を改善し、組換え酵素産生中のタンパク質分解を低減するために、プロテアーゼ耐性において利点を有するように操作された細胞外ＤＮＡＳＥ酵素のバリアントを提供する。本開示は、例えば、プラスミン、トロンビン、及び／またはトリプシンによるタンパク質分解に感受性のあるＤ１Ｌ３残基、ならびに哺乳動物及び非哺乳動物細胞株によって産生されるプロテアーゼに感受性のある残基（例えば、対塩基性アミノ酸）を特定する。

本明細書に記載される組換え細胞外ＤＮＡＳＥバリアントは、システイン残基における置換、プロテアーゼ感受性残基における置換を含む点変異の組み合わせを有し得、及び／または１つ以上の要素置換を含み得る。構成要素タンパク質操作（ＢＢＰＥ）は、ＰＣＴ／ＵＳ１８／４７０８４及びＵＳ ６２／８００，７９０に記載されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＢＢＰＥは、ドナー及びレシピエント細胞外ＤＮＡＳＥ酵素のタンパク質－タンパク質アライメントを提供すること、及び移行のための可変アミノ酸配列（「構成要素」）を特定することを伴う。可変アミノ酸（複数可）は、ドナー及びレシピエント細胞外ＤＮＡＳＥ酵素（構成要素の上流及び下流）における１つ以上の保存されたアミノ酸に隣接している。これらの構築要素は、キメラ酵素を生成するために、レシピエントタンパク質とドナータンパク質との間で交換することができる。

他の態様では、本発明は、細胞外ＤＮＡＳＥタンパク質の組換え産生のための方法を提供し、本明細書に記載されるそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、方法は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどの非哺乳動物発現系を利用する。いくつかの実施形態では、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、宿主細胞からの分泌を可能にする天然シグナルペプチドを有するＤＮＡｓｅ酵素をコードする。いくつかの実施形態では、発現系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞発現系である。いくつかの実施形態では、活性に不要なシステイン残基を除去することにより、本発明は、分子間及び分子内ジスルフィド結合を回避する。そうしなければ、結合が形成されて組換え生産を妨げる。いくつかの実施形態では、誤った分子間及び分子内ジスルフィド結合の実質的な低減は、単一のシステイン残基の置換によって達成され得る。

いくつかの実施形態では、組換え発現系は、対塩基性アミノ酸で切断する１つ以上のプロテアーゼの欠失または不活性化を有する。例示的な酵素としては、フューリン（ＣＨＯ細胞によって発現される）、ならびにＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現されるアスパラギン酸プロテイナーゼ３（Ｙｓｐ１）及びケキシン（Ｋｅｘ２）が含まれる。いくつかの実施形態では、これらの酵素は、遺伝子的に欠失または不活性化されないが、組換えタンパク質産生中に、それらの活性がプロテアーゼ阻害剤で阻害される。

いくつかの実施形態では、非哺乳動物発現系または哺乳動物発現系についての成長培地は、デキストラン硫酸、ヘパリン、クエン酸第二鉄、ＥＤＴＡなどのポリアニオンで補充される。さらなる実施形態では、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓまたは他の発現系の成長培地は、５ｋＤａ～１００ｋＤａの平均分子量を有するデキストラン硫酸で補充される。いくつかの実施形態では、デキストラン硫酸は、約１０ｋＤａ以下、または約２０ｋＤａ以下、または約３０ｋＤａ以下、または約４０ｋＤａ以下、または約５０ｋＤａ以下、または約７５ｋＤａ以下、または約１００ｋＤａ以下の平均分子量を有する。様々な実施形態では、ポリアニオンは、産生された組換えタンパク質と複合体化するのに十分な量で培養物に追加される。

いくつかの実施形態では、非哺乳動物発現系または哺乳動物発現系の培養培地からの組換え細胞外ＤＮＡＳＥタンパク質及びそのバリアントは、デキストラン硫酸、ヘパリン、ＥＤＴＡなどのポリアニオンからの組換え細胞外ＤＮＡＳＥタンパク質及びバリアントの解離を含む方法を通じて精製される。特定の実施形態では、精製方法は、トリエチルアミノエチルなどの強力なアニオン交換樹脂を含む。いくつかの実施形態では、本方法に従って産生される細胞外ＤＮＡＳＥタンパク質は、Ｄ１Ｌ３またはそのバリアントである。

したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号４（ヒトＤ１Ｌ３、アイソフォーム１）または配列番号５（ヒトＤ１Ｌ３、アイソフォーム２）によって定義される酵素と少なくとも８０％同一であり、タンパク質分解、例えばインビボタンパク質分解に感受性である、システイン残基の１つ以上の置換及び／またはアミノ酸の１つ以上の置換を有する、アミノ酸配列を含むＤ１Ｌ３バリアントを提供する。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３タンパク質バリアントは、配列番号４または配列番号５の野生型Ｄ１Ｌ３タンパク質と比較して、増加したタンパク質安定性（例えば、プロテアーゼ抵抗性）、インビトロ発現系での高い産生レベル、及び／または実質的に低くはなく、同一の、またはより良好なクロマチン及び／またはＮＥＴ分解活性をもたらす１つ以上の追加の修飾を含む。例えば、Ｄ１Ｌ３バリアントは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／４７０８４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される少なくとも１つの追加の構成要素置換もしくは点変異を含み得るか、またはプロテアーゼ抵抗性を増加させるために本明細書に記載される１つ以上の置換を含み得る。

いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、Ｃｙｓ６８の置換を有し、任意選択で、Ａｌａ、Ｓｅｒ、及びＧｌｙから選択されるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態では、このバリアントは、置換Ｎ６４＿Ｉ７０ｄｅｌｉｎｓＨＬＴＡＶＧＫを含む。いくつかの実施形態では、配列ＨＬＴＡＶＧＫは、Ｃｙｓ残基が含まれないことを条件として、１つ、２つ、もしくは３つの置換、欠失、及び／または挿入（合わせて）によってさらに修飾され得る。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、参照配列番号４または配列番号５と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、非対システインであると考えられるＣｙｓ ６８に対応する位置に複合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を有するＤ１Ｌ３酵素を提供する。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、Ｃ１９４に対応するアミノ酸とのＰＥＧ複合を有する。これらの実施形態では、ＰＥＧ部分は、ジスルフィドスクランブル及び／またはタンパク質ミスフォールディングを回避しながら、半減期延長特性を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、穏やかな条件下で行うことができるマレイミド化学を通して複合される。ビニルスルホン、ジチオピリジン、及びヨードアセトアミド活性化化学などの他の複合化学が既知であり、使用することができる。ＰＥＧ部分は、直鎖状または分枝状であり得、概して１０ｋＤａ～４０ｋＤａの範囲、または２０～３０ｋＤａの範囲であり得る。

代替的に、または加えて、本発明は、プロテアーゼ抵抗性の増加をもたらす１つ以上の置換アルギニン及び／またはリジン残基を含む、Ｄ１Ｌ３バリアントを提供する。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号４のＫ１８０、Ｋ２００、Ｋ２５９、及び／またはＲ２８５に対応する１つ以上の位置に置換を有する。本開示によれば、かかるリジン及びアルギニン残基は、潜在的なプロテアーゼ感受性部位として特定される。したがって、これらの残基のうちの１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ）は独立して、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、及びＰｒｏから選択される残基などの非荷電残基で修飾され得る。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ感受性リジンまたはアルギニン残基は、構成要素置換の一部として置換される。例えば、Ｄ１Ｌ３バリアントは、Ｋ１８０＿Ａ１８１ｄｅｌｉｎｓＧＬ、Ｐ１９８＿Ａ２０１ｄｅｌｉｎｓＲＰＳＱ、及びＫ２５９Ａから選択される１つ以上の置換を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、Ｋ１８０＿Ａ１８１ｄｅｌｉｎｓＧＬ、及び／またはＰ１９８＿Ａ２０１ｄｅｌｉｎｓＲＰＳＱの置換の一方または両方を含み、そのいずれも、構成要素置換が、ＲまたはＫ残基での置換または挿入によって修飾されないことを条件として、任意選択で、１つまたは２つのアミノ酸置換、欠失、または挿入によって修飾される。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、プラスミン、トロンビン、及び／またはトリプシンから選択される１つ以上のプロテアーゼによるタンパク質分解に対する増加した抵抗性を有する。

代替的に、または加えて、Ｄ１Ｌ３バリアントは、対塩基性残基の１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、対塩基性残基は、配列番号４のＫ５０／Ｒ５１、Ｒ８０／Ｒ８１、Ｋ１１４／Ｒ１１５、Ｋ１９９／Ｋ２００、Ｋ２２６／Ｋ２２７、Ｋ２９１／Ｋ２９２、Ｒ２９７／Ｋ２９８／Ｋ２９９、及びＫ３０３／Ｒ３０４から選択される位置に対応する。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号４のＲ１１４Ｔ、Ｒ１１４Ａ、Ｒ１１４Ｄ、Ｒ１１４Ｑ、Ｋ２２７Ｓ、及びＫ２２７Ｅに対応する置換から選択される１つ以上の置換を有する。いくつかの実施形態では、対塩基性残基の１つ以上の変異には、Ｒ５１Ｋ、Ｒ８１Ｋ、Ｒ１１５Ｋ、及びＲ３０４Ｋに対応するアミノ酸置換が含まれる。いくつかの実施形態では、対塩基性残基は、対応する構成要素置換を使用して置換される。これらの実施形態によれば、Ｄ１Ｌ３バリアントは、組換えタンパク質発現系（例えば、ＣＨＯ及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）によって発現されるプロテアーゼに対してより抵抗性があるであろう。

いくつかの態様では、本発明は、システイン残基の１つ以上の置換を有する、配列番号１によって定義される酵素と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＤＮａｓｅ１（Ｄ１）バリアントを提供する。いくつかの実施形態では、Ｄ１タンパク質バリアントは、配列番号１の野生型Ｄ１タンパク質と比較して、増加したタンパク質安定性、インビトロ発現系での高い産生レベル、及び／または実質的に低くはなく、同一の、またはより良好なクロマチン及び／またはＮＥＴ分解活性をもたらす１つ以上の追加の修飾を有する。例えば、Ｄ１バリアントは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／４７０８４に開示される少なくとも１つの追加の構成要素置換もしくは点変異を含み得る。

いくつかの実施形態では、Ｄ１バリアントは、Ｃ１２３及びＣ１２６のうちの一方または両方の置換を有し、任意選択で、Ａｌａ、Ｓｅｒ、及びＧｌｙで置換される。いくつかの実施形態では、Ｄ１バリアントは、置換Ｇ１２２＿Ｎ１２８ｄｅｌｉｎｓＹＱＧＤＡを含む。いくつかの実施形態では、Ｄ１バリアントは、配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、Ｃ１２３及び／またはＣ１２６に対応する位置に複合されたＰＥＧ部分を有するＤ１酵素を提供する。これらの実施形態では、ＰＥＧ部分は、ジスルフィドスクランブル及び／またはタンパク質ミスフォールディングを回避しながら、半減期延長特性を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、穏やかな条件下で行うことができるマレイミド化学を通して複合される。ビニルスルホン、ジチオピリジン、及びヨードアセトアミド活性化化学などの他の複合化学が既知であり、使用することができる。ＰＥＧ部分は、直鎖状または分枝状であり得、概して１０ｋＤａ～４０ｋＤａの範囲、または２０～３０ｋＤａの範囲であり得る。

他の態様では、本発明は、１つ以上の置換システイン残基を有する、配列番号２によって定義される酵素と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＤ１Ｌ１バリアントを提供する。システイン残基（複数可）は、任意選択で、Ｄ１ファミリー（例えば、Ｃ２２及び／またはＣ５０）内で非保存性であり、任意選択で、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、もしくはＳｅｒで置換されるか、または構築要素置換の一部として置換される。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ１バリアントは、配列番号２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、Ｃ２２及び／またはＣ５０に対応する位置に複合されたＰＥＧ部分を有するＤ１Ｌ１酵素を提供する。これらの実施形態では、ＰＥＧ部分は、ジスルフィドスクランブル及び／またはタンパク質ミスフォールディングを回避しながら、半減期延長特性を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、穏やかな条件下で行うことができるマレイミド化学を通して複合される。ビニルスルホン、ジチオピリジン、及びヨードアセトアミド活性化化学などの他の複合化学が既知であり、使用することができる。ＰＥＧ部分は、直鎖状または分枝状であり得、概して１０ｋＤａ～４０ｋＤａの範囲、または２０～３０ｋＤａの範囲であり得る。

いくつかの態様では、本発明は、１つ以上の置換システイン残基を有する、配列番号３によって定義される酵素と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＤ１Ｌ２バリアントを提供する。システイン残基は、Ｄ１ファミリー（例えば、Ｃ４３）内で非保存性であり得、任意選択で、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、もしくはＳｅｒで置換されるか、または構築要素置換の一部として置換される。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ２バリアントは、配列番号３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、Ｃ４３に対応する位置に複合されたＰＥＧ部分を有するＤ１Ｌ２酵素を提供する。これらの実施形態では、ＰＥＧ部分は、ジスルフィドスクランブル及び／またはタンパク質ミスフォールディングを回避しながら、半減期延長特性を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、穏やかな条件下で行うことができるマレイミド化学を通して複合される。ビニルスルホン、ジチオピリジン、及びヨードアセトアミド活性化化学などの他の複合化学が既知であり、使用することができる。ＰＥＧ部分は、直鎖状または分枝状であり得、概して１０ｋＤａ～４０ｋＤａの範囲、または２０～３０ｋＤａの範囲であり得る。

他の態様では、本発明は、本明細書に開示されるＤ１、Ｄ１Ｌ１、Ｄ１Ｌ２、またはＤ１Ｌ３バリアントをコードする単離ポリヌクレオチド、ならびにベクター及び宿主細胞を提供する。宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどの非哺乳動物であるか、またはＣＨＯ細胞などの哺乳動物であるかを問わず、細菌または真核生物を含む任意の発現系の細胞であり得る。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの送達は、治療に使用される。コード化ポリヌクレオチドは、既知の手順、例えば、電気穿孔法もしくは細胞スクイージング、及び／またはベクター（ウイルスベクターを含む）を使用して、ｍＲＮＡとして、またはＤＮＡ構築物として送達することができる。ｍＲＮＡポリヌクレオチドは、自然免疫系の活性化を回避するための既知の修飾（ ｍｍＲＮＡ ）を含むことができる。ＷＯ２０１４／０２８４２９号を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、対象の身体に送達される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、インビトロで細胞内に送達され、細胞は、対象の身体に送達される。細胞は、例えば、白血球（例えば、Ｔ細胞またはマクロファージ）、内皮細胞、上皮細胞、肝細胞、または幹細胞であり得る。

他の態様では、本発明は、本明細書に記載される細胞外ＤＮＡＳＥバリアントを産生するための方法を提供する。本方法は、細胞外ＤＮＡＳＥをコードするポリヌクレオチドを発現する細胞を培養することと、組換えＤＮａｓｅタンパク質を回収することと、を含む。細胞は、原核性または真核性であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅは、任意選択で、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種などの非哺乳動物発現系を使用して発現される。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物発現系が使用される。

本発明は、本明細書に記載される細胞外ＤＮＡＳＥもしくはそのバリアント、または任意選択で、記載されるポリヌクレオチドもしくはベクター、及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物をさらに提供する。

ベクターは、一般に、単離された核酸を含み、これを使用して、単離された核酸を細胞の内部に送達することができる。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むがこれらに限定されない、多数のベクターが当該技術分野で既知である。例示的なベクターには、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスが含まれる。この用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソーム等の、核酸の細胞への移入を促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれる。

薬学的組成物は、局所、非経口、または肺投与を含む任意の投与経路のために製剤化することができる。様々な実施形態では、組成物は、皮内、筋肉内、腹腔内、関節内、静脈内、皮下、動脈内、経口、舌下、肺、または経皮投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は静脈内または皮下投与のために製剤化される。

他の態様では、本発明は、細胞外ＤＮＡ分解、細胞外クロマチン分解、細胞外トラップ（ＥＴ）分解、及び／または好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）分解を必要とする対象を治療するための方法を提供する。本方法は、治療有効量の本明細書に記載される細胞外ＤＮＡＳＥもしくはそのバリアント、または組成物を投与することを含む。対象が細胞外ＤＮＡまたはクロマチン分解（ＥＴまたはＮＥＴ分解を含む）を必要とする例示的な適応症は、ＰＣＴ／ＵＳ１８／４７０８４に開示されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、方法が、治療有効量の配列番号８～配列番号３０の配列のいずれか１つによって表されるタンパク質を投与することを含む、それを必要とする対象を治療するための方法を提供する。

対象を治療するための方法が記載される各例において、本発明は同様に、ＥＴ及び／またはＮＥＴに関連する疾患の治療または予防のための細胞外ＤＮＡＳＥタンパク質のうちの１つ以上の使用を提供する。

様々な実施形態では、本発明は、ＮＥＴの存在もしくは蓄積を特徴とする疾患または状態を治療、予防、または管理するための方法を提供する。かかる疾患または状態には、これらに限定されないが、慢性好中球増加、好中球凝集及び白血球停滞、血栓症及び血管閉塞、虚血再灌流障害、外科的及び外傷性組織損傷、急性もしくは慢性炎症性反応または疾患、自己免疫疾患、循環器疾患、代謝疾患、全身性炎症、呼吸器の炎症性疾患、腎炎症性疾患、移植組織に関連する炎症性疾患（例えば、移植片対宿主疾患）、ならびにがん（白血病を含む）に関連する疾患が含まれる。

特定の実施形態では、本発明は、Ｄ１Ｌ３の欠損もしくはＤ１の欠損を特徴とする疾患または状態の治療に関する。いくつかの事例では、対象は、Ｄｎａｓｅ１ｌ３遺伝子またはＤｎａｓｅ１遺伝子に変異（例えば、機能喪失変異）を有する。かかる対象は、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（ループス腎炎を含む）、強皮症または全身性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、及び蕁麻疹性血管炎）を示し得る。いくつかの事例では、対象は、Ｄ１（例えば、抗ＤＮａｓｅ１抗体及びアクチン）、及び／またはＤ１Ｌ３（例えば、抗ＤＮａｓｅ１ｌ３抗体）の後天性阻害因子を有する。かかる対象はまた、自己免疫疾患または炎症性疾患（例えば、ＳＬＥ、全身性硬化症）を有し得る。

いくつかの実施形態では、対象は、管系を閉塞するＮＥＴを有するか、またはその危険性がある。例えば、本明細書に開示されるＤＮＡＳＥ酵素は、膵炎、胆管炎、結膜炎、乳腺炎、乾性眼疾患、血管閉塞、または腎疾患を治療するために対象に投与することができる。

いくつかの実施形態では、対象は、内皮表面（例えば、外科的癒着）、皮膚（例えば、創傷／瘢痕）、または滑膜関節（例えば、痛風及び関節炎、例えば、関節リウマチ）上に蓄積するＮＥＴを有するか、またはその危険性がある。本明細書に記載されるＤＮＡＳＥ酵素は、外科用癒着などであるがこれらに限定されない内皮表面上のＮＥＴの蓄積を特徴とする状態を治療するために対象に投与することができる。

本明細書に開示されるＤＮＡＳＥ酵素を使用して治療または予防することができるＮＥＴに関連する他の疾患及び状態としては、ＡＮＣＡ関連血管炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、好中球性皮膚症、皮膚筋炎、火傷、蜂巣炎、髄膜炎、脳炎、中耳炎、咽頭炎、扁桃炎、肺炎、心内膜炎、膀胱炎、腎盂腎炎、虫垂炎、胆嚢炎、膵炎、ブドウ膜炎、角膜炎、播種性血管内凝固症候群、急性腎障害、急性呼吸窮迫症候群、ショック肝臓、肝腎症候群、心筋梗塞、脳卒中、虚血性腸、四肢虚血、精巣捻転、子癇前症、子癇、及び固形臓器移植（例えば、腎臓、心臓、肝臓、及び／または肺移植）が含まれる。さらに、本明細書に開示されるＤＮＡＳＥ酵素は、例えば、皮膚に局所的に適用することによって、その危険性がある個体、例えば、外科的切開、裂傷、または火傷を有する個体において瘢痕または拘縮を予防するために使用され得る。

様々な実施形態では、対象は、Ｄ１及びストレプトドルナーゼを含む野生型ＤＮａｓｅで治療されたか、または治療されている疾患を有する。かかる疾患または状態としては、血栓症、脳卒中、敗血症、肺損傷、アテローム性動脈硬化症、ウイルス感染症、鎌状赤血球症、心筋梗塞、耳感染症、創傷治癒、肝障害、心内膜炎、肝感染症、膵炎、原発性移植片機能不全、四肢虚血再灌流、腎臓障害、血液凝固、アルム誘発性炎症、肝腎損傷、胸膜滲出、血胸、胆管内血栓、空気圧貧血後、潰瘍、耳鼻咽喉科疾患、口腔感染症、軽傷、副鼻腔炎、術後鼻形成術、不妊症、膀胱カテーテル、創傷洗浄、皮膚反応検査、肺炎球菌性髄膜炎、痛風、下肢潰瘍、嚢胞性線維症、カルタゲナー症候群、喘息、大葉性無気肺、慢性気管支炎、気管支拡張症、狼瘡、原発性線毛機能不全、細気管支炎、膿胸、胸膜感染症、がん、乾性眼疾患、下気道感染症、慢性血腫、アルツハイマー病、閉塞性肺疾患が含まれる。

本発明の他の態様及び実施形態は、以下の実施例から明らかとなるであろう。

すべての生物学的製剤のおよそ７０％は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用して産生されている。実際に、野生型ＤＮＡＳＥ１（Ｄ１；ドルナーゼアルファ）は典型的にはＣＨＯ細胞内で産生される。ＣＨＯ細胞を使用した細胞株の開発及び大規模産生において顕著な利点があるにもかかわらず、かなりの変動性、及び細胞成長特性を予測またはモデル化するための信頼できる方法がないため、Ｄｎａｓｅ酵素の産生において依然として顕著な課題がある。重要なことに、ＣＨＯ細胞は、Ｄ１の活動亢進バリアントを安定して産生することができず、臨床的製造を妨げ、本開示以前では、ＤＮＡＳＥ１様３（Ｄ１Ｌ３）を含む他のＤＮＡＳＥ１タンパク質ファミリーメンバーの製造特性は不明であった。

ＣＨＯ及び微生物発現系を使用して、Ｄ１Ｌ３の製造における、低産生収率、タンパク質分解、タンパク質ミスフォールディング、ならびに誤ったまたは望ましくないグリコシル化を含む、いくつかの課題を特定した。本開示は、製造におけるこれら及び他の課題に対する技術的解決策を提供し、それはまた、Ｄ１Ｌ３の治療特性を改善することができる。

実施例１：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、塩基性ドメイン欠失（ＢＤＤ）を有するＤ１Ｌ３の発現及び特徴付け
ＤＮＡＳＥ１及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３はそれぞれ、無タンパク質性ＤＮＡ及びＤＮＡ－ヒストン複合体（すなわち、クロマチン）を優先的に切断する。以前の研究では、ＤＮＡＳＥ１において欠如する、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３のＣ末端の塩基性ドメイン（ＢＤ）が、両方の酵素の異なる基質特異性に関与することが示唆されている（Ｓｉｓｉｒａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１６；Ｋｅｙｅｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１７）。

構成要素タンパク質工学と称されるタンパク質工学技術は、ＰＣＴ／ＵＳ１８／４７０８４及びＵＳ６２／８００，７９０に記載されており、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。このアプローチをＤＮＡＳＥ１及びＤＮＡＳＥ２タンパク質ファミリーのメンバーに適用することができる。本方法は、ドナー及びレシピエントＤｎａｓｅ酵素のタンパク質－タンパク質アライメントを提供する；可変アミノ酸が、ドナー及びレシピエントＤｎａｓｅ酵素における１つ以上の保存されたアミノ酸に隣接する、移行のための可変アミノ酸配列を特定する；レシピエントＤｎａｓｅの可変アミノ酸をドナーＤｎａｓｅの可変アミノ酸で置き換えてキメラＤｎａｓｅを作製する；及びキメラＤｎａｓｅを組み換えて産生する、ステップに基づく。

クロマチン分解活性（「クロマチン酵素」活性）を担うアミノ酸を特徴付けるために、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４７０８４に開示されるように、野生型Ｄ１Ｌ３をＤ１からの構成要素置換で置換した。Ｄ１Ｌ３への構成要素置換は、ヒトＤ１から選択され、配列番号４に関して、Ｍ２１＿Ｒ２２ｄｅｌｉｎｓＬＫ、Ｃ２４＿Ｓ２５ｄｅｌｉｎｓＡＡ、Ｖ２８＿Ｓ３０ｄｅｌｉｎｓＩＱＴ、Ｓ３４Ｔ、Ｑ３６＿Ｖ４４ｄｅｌｉｎｓＭＳＮＡＴＬＶＳＹ、Ｋ４７＿Ｋ５０ｄｅｌｉｎｓＱＩＬＳ、Ｃ５２Ｙ、Ｉ５５＿Ｍ５８ｄｅｌｉｎｓＩＡＬＶＱＥ、Ｉ６０＿Ｋ６１ｄｅｌｉｎｓＶＲ、Ｎ６４＿Ｉ７０ｄｅｌｉｎｓＨＬＴＡＶＧＫ、Ｍ７２＿Ｋ７４ｄｅｌｉｎｓＬＤＮ、Ｒ７７＿Ｉ８３ｄｅｌｉｎｓＱＤＡＰＤ、Ｎ８６Ｈ、Ｉ８９Ｖ、Ｓ９１＿Ｒ９２ｄｅｌｉｎｓＥＰ、Ｔ９７Ｓ、Ｑ１０１Ｒ、Ａ１０３Ｌ、Ｌ１０５Ｖ、Ｋ１０７＿Ｌ１１０ｄｅｌｉｎｓＲＰＤＱ、Ｖ１１３＿Ｒ１１５ｄｅｌｉｎｓＡＶＤ、Ｈ１１８Ｙ、Ｈ１２０Ｄ、Ｙ１２２＿Ａ１２７ｄｅｌｉｎｓＧＣＥＰＣＧＮ、Ｖ１２９Ｔ、Ｓ１３１Ｎ、Ｆ１３５＿Ｖ１３６ｄｅｌｉｎｓＡＩ、Ｗ１３８Ｒ、Ｑ１４０＿Ｈ１４３ｄｅｌｉｎＦＳＲＦ、Ａ１４５＿Ｄ１４８ｄｅｌｉｎｓＥＶＲＥ、Ｖ１５０Ａ、Ｉ１５２Ｖ、Ｔ１５６＿Ｔ１５７ｄｅｌｉｎｓＡＡ、Ｅ１５９＿Ｓ１６１ｄｅｌｉｎｓＧＤＡ、Ｋ１６３Ａ、Ｅ１６７Ａ、Ｖ１６９＿Ｅ１７０ｄｅｌｉｎｓＹＤ、Ｔ１７３Ｌ、Ｋ１７６＿Ｒ１７８ｄｅｌｉｎｓＱＥＫ、Ｋ１８０＿Ａ１８１ｄｅｌｉｎｓＧＬ、Ｎ１８３＿Ｆ１８６ｄｅｌｉｎｓＤＶＭＬ、Ｐ１９８＿Ａ２０１ｄｅｌｉｎｓＲＰＳＱ、Ｋ２０３＿Ｎ２０４ｄｅｌｉｎｓＳＳ、Ｒ２０８Ｗ、Ｄ２１０Ｓ、Ｒ２１２Ｔ、Ｖ２１４Ｑ、Ｇ２１８Ｐ、Ｑ２２０＿Ｅ２２１ｄｅｌｉｎｓＳＡ、Ｖ２２５＿Ｓ２２８ｄｅｌｉｎｓＡＴＰ、Ｎ２３０Ｈ、Ｌ２３８＿Ｒ２３９ｄｅｌｉｎｓＶＡ、Ｑ２４１＿Ｓ２４６ｄｅｌｉｎｓＭＬＬＲＧＡ、Ｋ２５０Ｄ、Ｎ２５２＿Ｖ２５４ｄｅｌｉｎｓＡＬＰ、Ｄ２５６Ｎ、Ｋ２５９Ａ、Ｋ２６２Ｇ、Ｔ２６４＿Ｅ２６７ｄｅｌｉｎｓＳＤＱＬ、Ｌ２６９＿Ｖ２７１ｄｅｌｉｎｓＱＡＩ、Ｆ２７５Ｙ、Ｆ２７９＿Ｋ２８０ｄｅｌｉｎｓＶＭ、Ｑ２８２＿Ｓ２０５ｄｅｌｉｎｓＫの変異を特徴とするヒトＤ１Ｌ３のバリアントをもたらす。

これら６３個のＤ１Ｌ３バリアントを、クロマチン分解活性の喪失または増加についてスクリーニングした。簡潔には、インビトロ発現ベクターを使用して、Ｄ１Ｌ３バリアントをＣＨＯ細胞内で一過性に発現させた。培養上清を収集し、精製した核をクロマチン源として使用してクロマチン分解活性について試験した。図１に示すように、Ｄ１からの構成要素置換＃１７及び＃６３は、野生型Ｄ１Ｌ３と比較して、高分子量（ＨＭＷ）クロマチンの小断片への分解を有意に改善した。構成要素置換＃７はミスセンス変異Ｑ１０１Ｒを引き起こし、１０１位のグルタミンをアルギニンに置き換える（配列番号８）。構成要素置換＃６３は、変異Ｑ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫを引き起こし、Ｄ１Ｌ３の完全なＣ末端ＢＤをアミノ酸２８３～３０５位から欠失させ、２８２位のグルタミン（Ｑ）をリジンに置き換える（配列番号９）。次に、上清のウエスタンブロット分析を行い、野生型Ｄ１Ｌ３及び両方の変異の発現レベルを検出した（図２）。驚いたことに、野生型Ｄ１Ｌ３及びＱ１０１Ｒ変異を有する試料において、異なるサイズの２つのＤ１Ｌ３バリアントを検出した。Ｑ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫを有する試料は、より小さいＤ１Ｌ３バリアントのみを含んだ。データは、野生型Ｄ１Ｌ３のＢＤが、ＣＨＯ細胞での発現中または分泌後に自発的に除去される（例えば、タンパク質分解される）ことを示唆する。２つのＤ１Ｌ３バリアントはまた、ＷＴ－Ｄ１Ｌ３を安定して発現するＣＨＯ細胞からの上清中で検出した（図３）。注目すべきことに、塩基性ドメイン欠失Ｄ１Ｌ３（ＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３）は、野生型Ｄ１Ｌ３と比較して、実質的に増加したクロマチン酵素活性を示した。

次に、ＣＨＯ細胞に対する代替の微生物発現系としてのＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを試験した。一般に、野生型Ｄ１Ｌ３と比較した場合、ＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３でより高い発現レベルを観察した。ここでは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ発酵上清から野生型Ｄ１Ｌ３及びＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３を精製し、特徴付けする（図４）。予期せぬことに、野生型Ｄ１Ｌ３は、アミノ酸Ｋ２９１位、Ｋ２９１位、またはＳ２９３位においてＢＤ内でタンパク質分解的に切断され、精製後にＤ１Ｌ３バリアントの異種混合物が生じることを観察した。野生型Ｄ１Ｌ３とは異なり、３つの構成要素置換（Ｆ２７５Ｙ、Ｆ２７９＿Ｋ２８０ｄｅｌｉｎｓＶＭ、Ｑ２８２＿Ｓ２０５ｄｅｌｉｎｓＫ）によるＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３の発現は、純粋なタンパク質を生成した。

次に、両方のＤ１Ｌ３精製のクロマチン酵素活性を比較した。Ｋ２９１、Ｋ２９１、またはＳ２９３位でのＢＤ切断を有するＤ１Ｌ３バリアントの異種混合は、Ｆ２７５Ｙ／Ｆ２７９＿Ｋ２８０ｄｅｌｉｎｓＶＭ／Ｑ２８２＿Ｓ２０５ｄｅｌｉｎｓＫによる完全なＢＤ欠失を有するＤ１Ｌ３バリアントと比較して、およそ１０倍低いクロマチン酵素活性を有することを観察した。まとめると、データは、ＢＤのタンパク質分解切断が微生物及び哺乳動物発現系（すなわち、ＣＨＯ及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において自然に生じることができ、ＢＤの除去がＤ１Ｌ３活性を活性化してクロマチンを分解するようにして現れることを示す。

実施例２：バイオリアクターにおけるＣＨＯ細胞のＤ１Ｌ３の発現
野生型Ｄ１Ｌ３（配列番号４）を産生する安定なＣＨＯ細胞株の開発を本明細書に開示する。細胞株を、標準的なＣＨＯ培養培地を使用してバイオリアクターで培養した。詳細には、図５は、ｃＧＭＰ適合条件下でバイオリアクターにおいてＣＨＯ細胞によって発現及び分泌されたヒトＤ１Ｌ３のウエスタンブロットを示す。試料を異なる時点（ｔ１～ｔ３）で収集した。わずかなレベルのＤ１Ｌ３及びＤ１Ｌ３断片のみを検出した。データは、Ｄ１Ｌ３の低い生産収率がＤ１Ｌ３の製造における課題であることを示唆する。

本明細書に開示されるように、野生型Ｄ１Ｌ３の高い生産レベルは、培養培地へのポリアニオンの追加によって達成した。かかるポリアニオンは、ヘパリン、デキストラン硫酸、クエン酸第二鉄、及びエチレンジアミン四酢酸のうちの１つ以上を含み得、「抗細胞凝集試薬」中の生物学的に活性な成分を表す。詳細には、ＣＨＯ培養培地にデキストラン硫酸を追加し、Ｄ１Ｌ３及びＤ１Ｌ３断片の強い増加を観察した（図５）。データは、ポリアニオンがＤ１Ｌ３の産生収率を増加させたが、タンパク質分解を防止しなかったことを示す。

図６Ａは、デキストラン硫酸（ＤＳ）などのポリアニオンがＤ１Ｌ３と複合体を形成することを示す。Ｄ１Ｌ３－ＤＳ複合体は、生産プロセス中に負に帯電した表面によりＤ１Ｌ３の相互作用及び除去が防止される。かかる負に帯電した表面には、これらに限定されないが、産生細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種）の細胞表面、染色細胞によって曝露されたＤＮＡ、及びバイオリアクター表面を含む。図６Ｂ及び図６Ｃは、ＤＳ－Ｄ１Ｌ３複合体からのＤ１Ｌ３の２段階精製プロセスを示す。図６に示すように、第１のステップは、ＤＳ－Ｄ１Ｌ３複合体を解離することを目的とする。解離は、ＤＳ－Ｄ１Ｌ３複合体を強力なアニオン交換表面とインキュベートすることによって達成することができ、これはＤＳと結合し、したがってＤ１Ｌ３を遊離する。詳細には、精製プロセスは、ＤＳ－Ｄ１Ｌ３を含む培養培地を強力なアニオン交換樹脂で満たされたクロマトグラフィカラムに通し、続いて、ＤＳフリーＤ１Ｌ３を含有するフロースルーの収集を含むことができる。精製プロセスの第２のステップを図６Ｃに示し、強力なカチオン交換樹脂の適用を介したＤＳフリーフローからのＤ１Ｌ３の親和性精製を含む。結論として、Ｄ１Ｌ３の産生収率は、デキストラン硫酸などのポリアニオンの追加によって大幅に増加させることができる。

実施例３：プロテアーゼ抵抗性について操作したＤ１Ｌ３
野生型Ｄ１Ｌ３は、５０個のアルギニン及びリジン残基を含み、これにより、酵素はトリプシン、トロンビン、及びプラスミンなどのプロテアーゼに特に感受性となる。この実施例では、トリプシン及びプラスミン切断部位をＤ１Ｌ３において特定した。部位は、Ｄ１Ｌ３のプロテアーゼ抵抗性バリアントを生成するように変異させることができる。

簡潔には、精製したＤ１Ｌ３をトリプシンで消化した。Ｄ１Ｌ３断片を単離し、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）及び質量分析（ＭＳ）の組み合わせを使用して断片のアミノ酸配列を決定した。トリプシンが、Ｒ２２、Ｒ２９、Ｒ５１、Ｒ６６、Ｒ８０、Ｒ８１、Ｒ９５、Ｋ９９、Ｒ１１５、Ｋ１４７、Ｋ１６３、Ｋ１８０、Ｒ２０８、Ｒ２１２、Ｒ２３５、Ｒ２３９、Ｋ２５０、及びＫ２６２のアルギニン及びリジン残基でＤ１Ｌ３を切断したことを特定した。これらのアルギニン及びリジン残基は、アラニン、バリン、及びセリンなどの小アミノ酸で置換され得るか、またはグランサムの距離スコアに従って同様の特性を有するアミノ酸で置換され得る（例えば、ヒスチジン、グルタミン、及びグルタミン酸；図７）。プロテアーゼ抵抗性であるＤ１は、Ｒ５１、Ｒ９５、Ｋ９９、及びＲ２３５に対応するアルギニン及びリジン残基を特徴とし、これらの残基が主にＤ１Ｌ３のタンパク質分解に関与しないことを示唆する。

構成要素タンパク質工学を適用して、Ｒ２２（変異：Ｍ２１＿Ｒ２２ｄｅｌｉｎｓＬＫ）、Ｒ２９（Ｖ２８＿Ｓ３０ｄｅｌｉｎｓＩＱＴ）、Ｒ６６（Ｎ６４＿Ｉ７０ｄｅｌｉｎｓＨＬＴＡＶＧＫ）、Ｒ８０（Ｒ７７＿Ｉ８３ｄｅｌｉｎｓＱＤＡＰＤ）、Ｒ８１（Ｒ７７＿Ｉ８３ｄｅｌｉｎｓＱＤＡＰＤ）、Ｒ１１５（Ｖ１１３＿Ｒ１１５ｄｅｌｉｎｓＡＶＤ）、Ｋ１６３（Ｋ１６３Ａ）、Ｋ１８０（Ｋ１８０＿Ａ１８１ｄｅｌｉｎｓＧＬ）、Ｒ２０８（Ｒ２０８Ｗ）、ＭＲ２１２（Ｒ２１２Ｔ）、Ｒ２３９（Ｌ２３８＿Ｒ２３９ｄｅｌｉｎｓＶＡ）、Ｋ２５０（Ｋ２５０Ｄ）、及びＫ２６２（Ｋ２６２Ｇ）の構成要素をＤ１から移行し、トリプシン切断部位を含むＤ１Ｌ３の構成要素を置き換えた（図７）。

プラスミンは、その酵素前駆体プラスミノーゲンの活性化によって生成される血漿プロテアーゼである。プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ－１）は、プラスミンの活性化を阻害する。興味深いことに、ＰＡＩ－１は、血清中のＤ１Ｌ３の酵素活性を増加させ、プラスミンがＤ１Ｌ３をタンパク質分解的に不活性化し得ることを示唆する。しかしながら、Ｄ１Ｌ３におけるプラスミン切断部位は特定されていない。

コンピューター分析では、アミノ酸の組み合わせリジン－アラニン（ＫＡ）またはアルギニン－アラニン（ＲＡ）は、好ましくはプラスミンまたはプラスミン様活性を有するプロテアーゼによって切断されると考えられることが示された。Ｄ１Ｌ３は、合計４個の推定プラスミン切断部位を含む（図８）：（部位１）Ｋ１８０／Ａ１８１（シグナルペプチドを含まないＫ１６０／Ａ１６１）、（部位２）Ｋ２００／Ａ ２０１（シグナルペプチドを含まないＫ１８０／Ａ１８１）、（部位３）Ｋ２５９／Ａ２６０（シグナルペプチドを含まないＫ２３９／Ａ２４０）、及び（部位４）Ｒ２８５／Ａ ２８６（シグナルペプチドを含まないＲ２７０／Ａ２５０）。Ｄ１及びＤ１Ｌ３の対アライメントを使用して、プラスミン切断部位のいずれもＤ１に存在しないことを見出した（図８）。データは、Ｄ１活性がトロンビン及びプラスミンなどの血清プロテアーゼによる不活性化に対して抵抗性であるという事実と一致する。構成要素タンパク質工学を適用して、（部位１）Ｋ１８０＿Ａ１８１ｄｅｌｉｎｓＧＬ、（部位２）Ｐ１９８＿Ａ２０１ｄｅｌｉｎｓＲＰＳＱ、及び（部位３）Ｋ２５９Ａの構成要素をＤ１から移行し、プラスミン切断部位を含むＤ１Ｌ３の構成要素を置き換えた（図９）。Ｒ２８５／Ａ２８６（部位４）は、Ｄ１において欠如するＣ末端延長部に位置する。したがって、Ｋ１８０＿Ａ１８１ｄｅｌｉｎｓＧＬ、Ｐ１９８＿Ａ２０１ｄｅｌｉｎｓＲＰＳＱ、Ｋ２５９Ａ、及びＲ２８５Ａの４つすべての推定プラスミン切断部位が変異したＤ１Ｌ３バリアントを作製した。次に、Ｄ１Ｌ３バリアントによるクロマチン分解を分析し、変異したＤ１Ｌ３で強力なクロマチン分解活性を観察した（図１０）。まとめると、データは、４つのアルギニン及びリジン残基、Ｋ１８０、Ｋ２００、Ｋ２５９、及びＲ２８５を変異させて、酵素活性を損なうことなくタンパク質分解のリスクを低減できることを示す。

次に、精製したＤ１Ｌ３を精製したプラスミンで消化した。Ｄ１Ｌ３断片を単離し、ＬＣ及びＭＳの組み合わせを使用して断片のアミノ酸配列を決定した。プラスミンが、Ｒ２２、Ｒ２９、Ｋ４５、Ｋ４７、Ｋ７４、Ｒ８１、Ｒ９２、Ｋ１０７、Ｋ１７６、Ｒ２１２、Ｒ２２６、Ｒ２２７、Ｋ２５０、Ｋ２５９、及びＫ２６２のアルギニン及びリジン残基でＤ１Ｌ３を切断したことを特定した。これらのアルギニン及びリジン残基は、アラニン、バリン、及びセリンなどの小アミノ酸で置換され得るか、またはグランサムの距離スコアに従って同様の特性を有するアミノ酸で置換され得る（例えば、ヒスチジン、グルタミン、及びグルタミン酸；図１１）。プロテアーゼ耐性であるＤ１は、Ｋ４５に対応するリジン残基を特徴とし、この残基が主にプラスミンによるＤ１Ｌ３のタンパク質分解に関与しないことを示唆する。構成要素タンパク質工学を適用して、Ｒ２２（変異：Ｍ２１＿Ｒ２２ｄｅｌｉｎｓＬＫ）、Ｒ２９（Ｖ２８＿Ｓ３０ｄｅｌｉｎｓＩＱＴ）、Ｋ４７（Ｋ４７＿Ｋ５０ｄｅｌｉｎｓＱＩＬＳ）、Ｋ７４（Ｍ７２＿Ｋ７４ｄｅｌｉｎｓＬＤＮ）、Ｒ８１（Ｒ７７＿Ｉ８３ｄｅｌｉｎｓＱＤＡＰＤ）、Ｒ９２（Ｓ９１＿Ｒ９２ｄｅｌｉｎｓＥＰ）、Ｋ１０７（Ｋ１０７＿Ｌ１１０ｄｅｌｉｎｓＲＰＤＱ）、Ｋ１７６（Ｋ１７６＿Ｒ１７８ｄｅｌｉｎｓＱＥＫ）、Ｒ２１２（Ｒ２１２Ｔ）、Ｋ２２６（Ｖ２２５＿Ｓ２２８ｄｅｌｉｎｓＡＴＰ）、Ｋ２２７（Ｖ２２５＿Ｓ２２８ｄｅｌｉｎｓＡＴＰ）、Ｋ２５０（Ｋ２５０Ｄ）、Ｋ２５９（Ｋ２５９Ａ）、及びＫ２６２（Ｋ２６２Ｇ）の構成要素をＤ１から移行し、コンピューター分析でのトリプシン切断部位を含むＤ１Ｌ３の構成要素を置き換えた（図１１）。

最後に、組換え発現野生型Ｄ１Ｌ３を単離し、そのＣ末端を配列決定した。それぞれＳ２９０（配列番号１０）、Ｋ２９１（配列番号１１）、及びＫ２９２（配列番号１２）で終わる３つの異なるアミノ酸配列を特定した（図４、実施例１）。データは、大規模製造中のＤ１Ｌ３の顕著なタンパク質分解切断部位としてリジン残基２９１及び２９２を特定する。

実施例４：分解を防止するために操作したＤ１Ｌ３
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける異種発現後のＤ１Ｌ３の断片化を観察した。断片の分析は、対塩基性アミノ酸、アルギニン（Ｒ）、及びリジン（Ｋ）残基をタンパク質分解切断部位として特徴付けた。ＣＨＯ細胞でＤ１Ｌ３を発現した後に同様の分解パターンを観察した。これらの観察結果は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ及びＣＨＯ細胞が、対塩基性アミノ酸でのＤ１Ｌ３を切断する相同プロテアーゼを共有していることを示唆するが、その効果はＣＨＯ細胞でより顕著であった。

対塩基性アミノ酸切断酵素（ＰＡＣＥ）がＤＮＡＳＥ１Ｌ３断片化に寄与することを決定した。フューリン（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０９９５８）としても知られるＰＡＣＥは、ヒト及び哺乳動物において発現する。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、対塩基性アミノ酸を標的とする２つの酵素、すなわち、アスパラギン酸プロテイナーゼ３（遺伝子：Ｙｓｐ１；Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ３２３２９）、及びケキシン（遺伝子：Ｋｅｘ２；Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ１３１３４）を発現する。したがって、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３バリアントは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ及びＣＨＯ細胞で発現させることができ、フューリン、アスパラギン酸プロテイナーゼ３、及びケキシンが薬理学的に阻害されるか、または遺伝的に枯渇される。

加えて、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３バリアントにおける対塩基性アミノ酸の変異は、断片化が減少したＣＨＯ及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるそれらの発現を可能にする。特定したＤＮＡＳＥ１Ｌ３断片は、分析により、配列番号２のＫ５０／Ｒ５１、Ｒ８０／Ｒ８１、Ｋ１１４／Ｒ１１５、Ｋ１９９／Ｋ２００、Ｋ２２６／Ｋ２２７、Ｋ２９１／Ｋ２９２、Ｒ２９７／Ｋ２９８／Ｋ２９９、及びＫ３０３／Ｒ３０４の位置での対塩基性アミノ酸を特徴とする。

米国仮特許出願第６２／８００，７９０号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるように、他の種からのＤＮＡＳＥ１Ｌ３は、Ｒ１１４Ｔ（マウス）、Ｒ１１４Ａ（ラット）、Ｒ１１４Ｄ（モルモット）、Ｒ１１４Ｑ（ウシ）、Ｋ２２７Ｓ（イヌ）、及びＫ２２７Ｅ（ゾウ）を含むこれらの切断部位でのアミノ酸置換を特徴とする。これらのアミノ酸置換をヒトＤＮＡＳＥ１Ｌ３に適用して、ＣＨＯ細胞及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓでの発現中を含め、酵素をタンパク質分解に対して抵抗性とすることができる。

ケキシンは、ＫＲ及びＲＲ残基の後に切断することが好ましい。Ｋ５０／Ｒ５１、Ｒ８０／Ｒ８１、Ｋ１１４／Ｒ１１５、及びＫ３０３／Ｒ３０４におけるＤＮＡＳＥ１Ｌ３特徴は、４個のＫＥＸ２切断部位である。これらの残基のアミノ酸置換は、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３をＫＥＸ２に対して抵抗性とし、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ及びＣＨＯ細胞におけるＤＮＡＳＥ１Ｌ３及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３バリアントの発現を可能にする。これらのアミノ酸置換は、例えば、Ｒ５１Ｋ、Ｒ８１Ｋ、Ｒ１１５Ｋ、及びＲ３０４Ｋなど、保存的であり得る。

実施例５：高分子量凝集体を防止するために操作したＤ１Ｌ３バリアント
ＣＨＯ細胞におけるＤ１Ｌ３のｃＧＭＰ適合性発現の間に（図１２Ａ）、Ｄ１Ｌ３の高分子量凝集体の蓄積を観察し、Ｄ１Ｌ３を分析的に製造するための追加の課題を指摘する。高分子量凝集体は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてはるかに低い程度で観察した。

バイオリアクター物質のタンパク質への還元条件の適用がＤ１Ｌ３凝集体を溶解した。データは、Ｄ１Ｌ３凝集体形成が、タンパク質発現中にジスルフィド架橋を介した分子内及び／または分子間架橋によって引き起こされることを示す。詳細には、図１２Ｂに示すように、ゲルを非還元条件下で実行し、経時的なＤ１Ｌ３の高分子量凝集体の蓄積を示す。ゲルを還元条件下で実行し、凝集体を検出しなかった。データは、誤った分子内及び分子間ジスルフィド結合が製造条件下でヒトＤ１Ｌ３のミスフォールディングを引き起こすことを示す。

図１３は、ヒトＤ１（配列番号１）及びヒトＤ１Ｌ３（配列番号４）のアミノ酸配列アラインメントを示す。シグナルペプチド、保存アミノ酸、可変アミノ酸、非保存システイン残基、及び保存システイン残基を強調表示した。非保存システイン残基における変異は、タンパク質発現中の分子内及び分子間ジスルフィド結合の可能性を低減する。Ｄ１Ｌ３（配列番号４）のアミノ酸配列の分析は、Ｃ２４、Ｃ５２、Ｃ６８、Ｃ１９４、及びＣ２３１（図１４）の５個のシステイン（Ｃ）残基の存在を示した。システイン残基Ｃ１９４及びＣ２３１は、ＤＮＡＳＥ１タンパク質ファミリーのすべてのメンバー間で保存され、ＤＮＡＳＥ１の酵素活性に必要なジスルフィド結合を形成する。Ｄ１Ｌ３におけるシステイン残基の機能は、本開示の前には知られていなかった。したがって、本明細書に開示されるように、これらのシステイン残基の変異は、ジスルフィド架橋を介した架橋を減少させ、したがってタンパク質産生の収率を増加させる。

システイン残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、及びグリシン（Ｇ）などの他の小アミノ酸で置換され得る。かかる置換は、アミノ酸変異Ｃ２４Ａ／Ｓ／Ｇ、Ｃ５２Ａ／Ｓ／Ｇ、Ｃ６８Ａ／Ｓ／Ｇ、Ｃ１９４Ａ／Ｓ／Ｇ、及びＣ２３１Ａ／Ｓ／Ｇを引き起こす。加えて、保存システイン残基を含む構成要素は、ＤＮＡＳＥ１タンパク質ファミリーのドナーＤＮａｓｅ（例えば、Ｄ１及びＤ１Ｌ３）からの構成要素によって置き換えることができる。以下のＤ１からの構成要素を使用して、非保存システイン残基Ｃ２４、Ｃ５２、及びＣ６８を含むＤ１Ｌ３の構成要素を置き換えた：Ｃ２４＿Ｓ２５ｄｅｌｉｎｓＡＡ、Ｃ５２Ｙ、及びＮ６４＿Ｉ７０ｄｅｌｉｎｓＨＬＴＡＶＧＫ。Ｄ１Ｌ３バリアントのクロマチン分解活性を、ＰＣＴ／ＵＳ１８／４７０８に記載されるように定量化した。従来のアミノ酸置換（Ｃ２４Ａ、Ｃ５２Ａ）及び構成要素置換（Ｃ２４＿Ｓ２５ｄｅｌｉｎｓＡＡ、Ｃ５２Ｙ）の両方が、クロマチン分解の完全な欠如を引き起こし、Ｃ２４及びＣ５２がＤ１Ｌ３活性に必要であることを示した（図１５）。重要なことに、従来のアミノ酸置換［Ｃ６８Ａ、（配列番号１３）］またはＢＢ変異（Ｎ６４＿Ｉ７０ｄｅｌｉｎｓＨＬＴＡＶＧＫ）のいずれかによるシステインＣ６８の変異は、クロマチン分解活性を有するＤ１Ｌ３バリアントをもたらした（図１５）。アミノ酸配列アラインメントは、システインＣ６８が他のＤＮＡＳＥ１タンパク質ファミリーメンバー間で保存されていないことを示し、Ｃ６８が酵素活性に必要とされないという考えを支持する。さらに、高度保存システインＣ１９４をアラニンでアミノ酸置換（Ｃ１９４Ａ）したが、高度保存システインＣ２３１をアラニンで変異（Ｃ２３１Ａ）しなかったことを観察し、酵素的に活性なＤ１Ｌ３バリアントをもたらした（図１５）。したがって、システインＣ６８及びＣ１９４を変異させ、Ｄ１Ｌ３産生中の誤ったジスルフィド結合のリスクを減少させることができる。

同様のアプローチを適用して、Ｄ１、ＤＮａｓｅ１様１（Ｄ１Ｌ１）、及びＤＮａｓｅ１様２（Ｄ１Ｌ２）のＤＮａｓｅ１タンパク質ファミリーの他のメンバー内の非保存システイン残基を変異させることができる。Ｄ１は、Ｃ１２３及びＣ１２６の２つの非保存システインを有する。Ｄ１Ｌ１は、Ｄ１Ｌ２におけるＣ２４及びＣ５２に対応する２つの非保存システイン残基（Ｃ２２、Ｃ５０）が１つの非保存システイン残基：Ｃ４３のみを有することを示す。ＤＮＡＳＥ１タンパク質ファミリーのメンバーの非保存システイン残基の変異は、タンパク質発現中に誤ったジスルフィド架橋を介した架橋を低減し、したがって、治療用途のためのＤ１、Ｄ１Ｌ１、Ｄ１Ｌ２、及びＤ１Ｌ３の製造を可能とする。

実施例６：Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＤ１Ｌ３及びアルブミン－Ｄ１Ｌ３融合タンパク質の構築及び発現
Ｄ１Ｌ３を含む組換えヒト細胞外ＤＮＡＳＥＳのＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ発現を試験した。図１６Ａに示すように、Ｄ１Ｌ３のＮ末端を、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける異種タンパク質発現のための一般的なツールであるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（配列番号４６）からのアルファ接合因子（ａＭＦ）プレ－プロ分泌リーダーによって導いた。本明細書に開示されるように、ａＭＦとＤ１Ｌ３との組み合わせは、グリコシル化に起因するａＭＦの予期しない非プロセシングを引き起こした（図１６Ｂ）。Ｄ１Ｌ３タンパク質のグリコシル化は、Ｄ１Ｌ３の分析的製造に対してＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓを使用することを妨げた。Ｎ末端がＤ１Ｌ３の天然分泌シグナルペプチドによって導かれた場合に、Ｄ１Ｌ３は適切にプロセシングされた［図１６Ｂ、（配列番号４８）］。重要なことに、ａＭＦは、Ｄ１Ｌ３の天然シグナルペプチドと比較してＤ１Ｌ３発現を３～５倍増加させた。したがって、Ｄ１Ｌ３融合タンパク質のプロセシングを試験した。予備試験では、ａＭＦ及びヒト血清アルブミン［ＨＳＡ（配列番号３９）］のＤ１Ｌ３とのＮ末端融合を生成した（図１７Ａ）。いくつかのバリアントは、ＨＳＡとＤ１Ｌ３との間にリンカーペプチド［例えば、（ＧＳＳＳＳ）_３］を含有した。図１７Ｂ及び図１７Ｃに示すように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける融合タンパク質の発現は、非グリコシル化及び酵素活性Ｄ１Ｌ３を生成した。更に、発現レベルは、Ｄ１Ｌ３の天然分泌シグナルペプチド駆動発現と比較して５～１０倍増加した。まとめると、データは、Ｄ１Ｌ３のアルブミンとの融合が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓでの製造を可能にすることを示している。

これらの予備試験に基づいて、野生型Ｄ１Ｌ３及びＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３の様々なＨＳＡ融合構築物を設計し、標的タンパク質（配列番号１７～２８）の発現レベルについてスクリーニングした。図１８に示すように、ヒト血清アルブミン（配列番号１７）のＢＤＤ－Ｄ１ｌ３バリアント（配列番号１６）とのＮ末端融合が、発現レベルを実質的に増加させなかったことを観察した。しかしながら、ＨＳＡとＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３との間にグリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基からなる柔軟性リンカーを挿入した際に、発現レベルの強い増加を検出した。さらに、リンカー配列の長さは、発現の増加と相関した。例えば、１２±１．９相対単位の発現が５個のアミノ酸リンカー（配列番号１８）で得られた一方で、１５個のアミノ酸リンカー（配列番号１９）発現が３２±３．２相対単位であり、リンカーなしのＨＳＡ融合よりも約７．５倍改善した。さらに、リンカー－ＨＳＡ構築物のＣ末端融合が低レベルで発現されたため、Ｎ末端位置は、発現レベルの改善に重要であった（配列番号２０、配列番号２１）。注目すべきことに、柔軟性リンカーを介したＨＳＡのＮ末端融合は、野生型Ｄ１Ｌ３（配列番号２２）の発現を、天然Ｄ１Ｌ３（配列番号４）の約２０倍も強力に増加させた。結論として、リンカーを介したＨＳＡのＮ末端との融合は、Ｄ１Ｌ３及びにＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３バリアントの産生を可能とする。

次に、リンカー配列の性質がＤ１Ｌ３発現の改善に重要であるかを試験した。２つの追加の配列、ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ（配列番号３３、１４個のアミノ酸、剛性リンカー）、及びＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３４、１２個のアミノ酸、剛性らせん状リンカー）を試験した。図１９に示すように、両方の試験構築物（配列番号２３、配列番号２４）において、発現の強い増加を観察したが、剛性らせんリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカーについて観察したのと同様の強い発現レベルを達成しなかった。したがって、リンカーの長さ及び酸組成は、Ｄ１Ｌ３発現のレベルに影響を及ぼした。

次に、リンカー長、発現レベル、及び酵素活性の関係を分析した。これらの試験のために、ＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３バリアント（配列番号２５～２７）に対するＧＳ－リンカーとのＨＳＡのＮ末端融合を含む発現ベクターを設計した。３つの異なるリンカー長を、ＳＧＧＳＧＳＳ［７個のアミノ酸、（配列番号３５）］、ＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＳ［１６個のアミノ酸、（配列番号３６）］、ＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＳ［３１個のアミノ酸、（配列番号３７）］で試験した。図２０に示すように、７個のアミノ酸から１６個のアミノ酸へのリンカー配列の伸長は、発現レベルの増加をもたらした。１６から３１個へのアミノ酸のさらなる伸長は、タンパク質発現を増加させなかったが、ＨＭＷ－クロマチンのＬＭＷ－クロマチンへの分解によって検出されるように酵素活性を増加させた。アルブミン融合に融合された生物学的製剤は、アルブミンが基質及びリガンドとの相互作用を立体的に阻害するため、活性の低下を示すことが多い。したがって、ペプチドリンカーを使用して、アルブミンと融合タンパク質またはペプチドとの間の距離を増加させることができる。しかしながら、ＨＳＡとＤ１Ｌ３との間にリンカー配列を挿入すると、酵素活性及び発現レベルが同時に改善するという観察は予想外であった。

ＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３（配列番号１４）のクロマチン分解活性を、そのアルブミン融合対応物（配列番号１９）と比較した。簡潔には、Ｄｎａｓｅ１^－／－Ｄｎａｓｅ１ｌ３^－／－マウスに配列番号４または配列番号１９を注入した。注入の１５分後に血清を収集した。図２１Ａに示すように、両方の動物において同様の血清クロマチン分解活性を観察した。重要なことに、Ｄ１Ｌ３及び他のヒト細胞外ＤＮＡＳＥＳのＮ末端へのアルブミンの融合は、半減期が延長されたＤＮＡＳＥ治療薬を提供する。本明細書に開示されるように、市販のげっ歯類モデルにおいて、１５個のアミノ酸の柔軟性ＧＳリンカーを有するＨＳＡ－ＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３融合タンパク質である配列番号１９の半減期を決定した。動物モデルは、循環中のアルブミンの長い半減期を担うヒトＦｃＲｎのトランスジェニック発現を特徴とする。非複合Ｄ１Ｌ３（例えば、配列番号４）は、循環中の非常に短い半減期を有するが（３０分未満）、アルブミン融合物は、半減期を３．３日まで延長し、それによって全身曝露を実質的に改善し、同時に５分のｔ_ｍａｘで急速な吸収をもたらした（図２１Ｂ）。まとめると、データは、リンカー配列を介したＨＳＡのＤ１Ｌ３へのＮ末端融合が、製造を容易にするだけでなく、Ｄ１Ｌ３のインビボ薬物動態特性も改善することを示す。

最後に、Ｄ１Ｌ３のＮ及びＣ末端へのＨＳＡの二重融合を試験した。まず、潜在的な付着部位についてＤ１Ｌ３のＣ末端を分析した。ＢＤ（ＲＡＦＴＮＳＫＫＳＶＴＬＲＫＫＴＫＳＫＲＳ）のＤ１Ｌ３のコアボディへの柔軟な接続を提供する、２８３位及び２８４位の２つのセリン残基を特定した。したがって、ＢＤを削除し、柔軟性ＧＳリンカー（配列番号３８）を介してＨＳＡをＳ２８４に接続することを選択した。図２２に示すように、ＢＤＤ－Ｄ１Ｌ３（配列番号２８）のＮ及びＣ末端へのＨＳＡの融合は、Ｎ末端ＨＳＡ融合（配列番号２７）で観察した高い発現レベルを維持した。

実施例７：切断可能リンカー配列の設計
本明細書に開示される発見は、製造を超える意味を有する。例えば、配列番号９～配列番号１２によって例示されるように、クロマチン及び／またはＮＥＴを分解するためのそれらの酵素活性を保持するＣ末端アミノ酸欠失を有するＤ１Ｌ３バリアントをＤ１Ｌ３治療に使用することができる。加えて、非対システインチオールの部位特異的アルキル化は、治療用途のための半減期延長生物学的製剤を生成するために一般的に使用される。詳細には、Ｄ１Ｌ３の非必須システインＣ６８及びＣ１９４は、部位特異的ＰＥＧ化（ＰＥＧ、ポリエチレングリコール）に使用できる。さらに、Ｋ１８０＿Ａ１８１ｄｅｌｉｎｓＧＬ、Ｐ１９８＿Ａ２０１ｄｅｌｉｎｓＲＰＳＱ、Ｋ２５９Ａ、及びＲ２８５Ａなどの変異に起因するプラスミンによる不活性化に抵抗性のＤ１Ｌ３バリアントは、改善された半減期を有し、したがって、治療用途において有効性が期待される。

重要なことに、Ｄ１Ｌ３及び他のヒト細胞外ＤＮＡＳＥＳのＮ末端へのアルブミンの融合は、半減期が延長されたＤＮＡＳＥ治療薬を提供する（図２３Ａ）。いくつかのリンカー配列を使用して、アルブミンによるＤ１Ｌ３の立体阻害を低減した。さらに、生理学的に切断可能ペプチドリンカーを開発した。融合タンパク質が好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）に近接しているときに、リンカーペプチドを切断するように設計した。好中球エラスターゼ、カテプシンＧ、及びプロテイナーゼ３などの好中球特異的プロテアーゼによって標的とされるペプチド配列は、切断可能リンカー配列の候補である。

血管内で切断され、したがって静脈内及び動脈内に適用されるＤＮＡＳＥ治療薬に最適な切断可能リンカー配列を開発した。ペプチドを設計するために、ＮＥＴは、血液凝固因子、特に凝固因子ＸＩＩ（ＦＸＩＩ）を活性化する能力を有すると考えた。活性化ＦＸＩＩ（ＦＸＩＩａ）は、２つの主要基質：凝固因子ＸＩ（ＦＸＩ、配列番号４０）及びプレカリクレイン（ＰＫ、配列番号４１）を有する。アミノ酸配列アライメントは、ＦＸＩＩａ切断部位がＦＸＩ及びＰＫ中で保存されていることを示した（図２３Ｂ）。ＦＸＩにおいて、切断部位は、アルギニン３８７とイソロイシン３８８との間にある。ＰＫにおいて、切断部位は、アルギニン３９０とイソロイシン３９１との間にある。実際に、ＦＸＩ及びＰＫは相同タンパク質である。本明細書に開示されるように、ＦＸＩ配列３８０位～４０３位（配列番号４２、配列番号４３）またはＰＫ配列３８３位～４０６位（配列番号４４）のすべてまたは一部を含むいくつかのリンカーペプチドを設計した。

最後に、ＦＸＩＩａ切断可能なリンカーは、他の細胞外ＤＮＡＳＥ、ヒト凝固因子（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、及び第ＩＸ因子）、及び補体因子（例えば、第Ｈ因子）のバリアントを含むがこれらに限定されない、他の生物学的製剤の半減期を延長する形式（図２４）を製造するために使用することができる。

本明細書に引用される全ての特許及び特許刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
野生型ヒトＤＮＡＳＥ
配列番号１

配列番号２

配列番号３

配列番号４

配列番号５

配列番号６

配列番号７

ヒトＤＮＡＳＥ１Ｌ３バリアント
配列番号８

配列番号９

配列番号１０

配列番号１１

配列番号１２

配列番号１３

配列番号１４

配列番号１５

配列番号１６

ＤＮＡＳＥ１Ｌ３及びバリアントを有するアルブミン融合物
配列番号１７

配列番号１８

配列番号１９

配列番号２０

配列番号２１

配列番号２２

配列番号２３

配列番号２４

配列番号２５

配列番号２６

配列番号２７

配列番号２８

配列番号２９

配列番号３０

リンカー配列
配列番号３１
ＧＧＧＧＳ
配列番号３２
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＧＧＧＳ
配列番号３３
ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ
配列番号３４
ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ
配列番号３５
ＳＧＧＳＧＳＳ
配列番号３６
ＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＳ
配列番号３７
ＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＧＳ
配列番号３８
ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳ
他の配列
配列番号３９
ヒト血清アルブミン（成熟タンパク質）：
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ
配列番号４０
ヒト第ＸＩ因子：
ＭＩＦＬＹＱＶＶＨＦＩＬＦＴＳＶＳＧＥＣＶＴＱＬＬＫＤＴＣＦＥＧＧＤＩＴＴＶＦＴＰＳＡＫＹＣＱＶＶＣＴＹＨＰＲＣＬＬＦＴＦＴＡＥＳＰＳＥＤＰＴＲＷＦＴＣＶＬＫＤＳＶＴＥＴＬＰＲＶＮＲＴＡＡＩＳＧＹＳＦＫＱＣＳＨＱＩＳＡＣＮＫＤＩＹＶＤＬＤＭＫＧＩＮＹＮＳＳＶＡＫＳＡＱＥＣＱＥＲＣＴＤＤＶＨＣＨＦＦＴＹＡＴＲＱＦＰＳＬＥＨＲＮＩＣＬＬＫＨＴＱＴＧＴＰＴＲＩＴＫＬＤＫＶＶＳＧＦＳＬＫＳＣＡＬＳＮＬＡＣＩＲＤＩＦＰＮＴＶＦＡＤＳＮＩＤＳＶＭＡＰＤＡＦＶＣＧＲＩＣＴＨＨＰＧＣＬＦＦＴＦＦＳＱＥＷＰＫＥＳＱＲＮＬＣＬＬＫＴＳＥＳＧＬＰＳＴＲＩＫＫＳＫＡＬＳＧＦＳＬＱＳＣＲＨＳＩＰＶＦＣＨＳＳＦＹＨＤＴＤＦＬＧＥＥＬＤＩＶＡＡＫＳＨＥＡＣＱＫＬＣＴＮＡＶＲＣＱＦＦＴＹＴＰＡＱＡＳＣＮＥＧＫＧＫＣＹＬＫＬＳＳＮＧＳＰＴＫＩＬＨＧＲＧＧＩＳＧＹＴＬＲＬＣＫＭＤＮＥＣＴＴＫＩＫＰＲＩＶＧＧＴＡＳＶＲＧＥＷＰＷＱＶＴＬＨＴＴＳＰＴＱＲＨＬＣＧＧＳＩＩＧＮＱＷＩＬＴＡＡＨＣＦＹＧＶＥＳＰＫＩＬＲＶＹＳＧＩＬＮＱＳＥＩＫＥＤＴＳＦＦＧＶＱＥＩＩＩＨＤＱＹＫＭＡＥＳＧＹＤＩＡＬＬＫＬＥＴＴＶＮＹＴＤＳＱＲＰＩＣＬＰＳＫＧＤＲＮＶＩＹＴＤＣＷＶＴＧＷＧＹＲＫＬＲＤＫＩＱＮＴＬＱＫＡＫＩＰＬＶＴＮＥＥＣＱＫＲＹＲＧＨＫＩＴＨＫＭＩＣＡＧＹＲＥＧＧＫＤＡＣＫＧＤＳＧＧＰＬＳＣＫＨＮＥＶＷＨＬＶＧＩＴＳＷＧＥＧＣＡＱＲＥＲＰＧＶＹＴＮＶＶＥＹＶＤＷＩＬＥＫＴＱＡＶ
配列番号４１
ヒトプレカリクレイン：
ＭＩＬＦＫＱＡＴＹＦＩＳＬＦＡＴＶＳＣＧＣＬＴＱＬＹＥＮＡＦＦＲＧＧＤＶＡＳＭＹＴＰＮＡＱＹＣＱＭＲＣＴＦＨＰＲＣＬＬＦＳＦＬＰＡＳＳＩＮＤＭＥＫＲＦＧＣＦＬＫＤＳＶＴＧＴＬＰＫＶＨＲＴＧＡＶＳＧＨＳＬＫＱＣＧＨＱＩＳＡＣＨＲＤＩＹＫＧＶＤＭＲＧＶＮＦＮＶＳＫＶＳＳＶＥＥＣＱＫＲＣＴＮＮＩＲＣＱＦＦＳＹＡＴＱＴＦＨＫＡＥＹＲＮＮＣＬＬＫＹＳＰＧＧＴＰＴＡＩＫＶＬＳＮＶＥＳＧＦＳＬＫＰＣＡＬＳＥＩＧＣＨＭＮＩＦＱＨＬＡＦＳＤＶＤＶＡＲＶＬＴＰＤＡＦＶＣＲＴＩＣＴＹＨＰＮＣＬＦＦＴＦＹＴＮＶＷＫＩＥＳＱＲＮＶＣＬＬＫＴＳＥＳＧＴＰＳＳＳＴＰＱＥＮＴＩＳＧＹＳＬＬＴＣＫＲＴＬＰＥＰＣＨＳＫＩＹＰＧＶＤＦＧＧＥＥＬＮＶＴＦＶＫＧＶＮＶＣＱＥＴＣＴＫＭＩＲＣＱＦＦＴＹＳＬＬＰＥＤＣＫＥＥＫＣＫＣＦＬＲＬＳＭＤＧＳＰＴＲＩＡＹＧＴＱＧＳＳＧＹＳＬＲＬＣＮＴＧＤＮＳＶＣＴＴＫＴＳＴＲＩＶＧＧＴＮＳＳＷＧＥＷＰＷＱＶＳＬＱＶＫＬＴＡＱＲＨＬＣＧＧＳＬＩＧＨＱＷＶＬＴＡＡＨＣＦＤＧＬＰＬＱＤＶＷＲＩＹＳＧＩＬＮＬＳＤＩＴＫＤＴＰＦＳＱＩＫＥＩＩＩＨＱＮＹＫＶＳＥＧＮＨＤＩＡＬＩＫＬＱＡＰＬＮＹＴＥＦＱＫＰＩＣＬＰＳＫＧＤＴＳＴＩＹＴＮＣＷＶＴＧＷＧＦＳＫＥＫＧＥＩＱＮＩＬＱＫＶＮＩＰＬＶＴＮＥＥＣＱＫＲＹＱＤＹＫＩＴＱＲＭＶＣＡＧＹＫＥＧＧＫＤＡＣＫＧＤＳＧＧＰＬＶＣＫＨＮＧＭＷＲＬＶＧＩＴＳＷＧＥＧＣＡＲＲＥＱＰＧＶＹＴＫＶＡＥＹＭＤＷＩＬＥＫＴＱＳＳＤＧＫＡＱＭＱＳＰＡ
活性可能リンカー配列
配列番号４２
ＦＸＩＩａ感受性リンカー（第ＸＩ因子ペプチド）：
ＣＴＴＫＩＫＰＲＩＶＧＧＴＡＳＶＲＧＥＷＰＷＱＶＴ
配列番号４３
ＦＸＩＩａ感受性リンカー
ＧＧＧＧＳＰＲＩＧＧＧＳ
配列番号４４
ＦＸＩＩａ感受性リンカー（プレカリクレインペプチド）：
ＶＣＴＴＫＴＳＴＲＩＶＧＴＮＳＳＷＧＥＷＰＷＱＶＳ
配列番号４５
ＦＸＩＩａ感受性リンカー（プレカリクレインペプチド）：
ＳＴＲＩＶＧＧ
シグナルペプチド
配列番号４６
アルファ接合因子（Ｐ０１１４９）：
ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳ
配列番号４７
ヒトアルブミン分泌シグナルペプチド＋プロペプチド（Ｐ０２７６８）：
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ
配列番号４８
ヒトＤＮＡＳＥ１Ｌ３シグナルペプチド（Ｑ１３６０９）：
ＭＳＲＥＬＡＰＬＬＬＬＬＬＳＩＨＳＡＬＡ

Claims (101)

1. ＤＮａｓｅ１様３（Ｄ１Ｌ３）バリアントであって、前記Ｄ１Ｌ３タンパク質バリアントが、各事例において、配列番号４及び／または配列番号５の野生型Ｄ１Ｌ３タンパク質と比較して、タンパク質分解に対する増加した抵抗性、増加した循環半減期、インビトロ発現系でのより高い産生レベル、ならびにインビトロでの実質的に低くはなく、同一の、またはより良好なクロマチン及び／またはＮＥＴ分解活性のうちの１つ以上を有する、前記ＤＮａｓｅ１様３（Ｄ１Ｌ３）バリアント。
2. 前記Ｄ１Ｌ３バリアントが、配列番号４または配列番号５によって定義される成熟酵素と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、前記成熟酵素のＮ末端側のアルブミンアミノ酸配列、及び前記アルブミンアミノ酸配列と前記成熟酵素のアミノ酸配列との間の連結アミノ酸配列を含む、融合タンパク質である、請求項１に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
3. 前記Ｄ１Ｌ３バリアントが、配列番号４または配列番号５によって定義される成熟酵素と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
4. 前記Ｄ１Ｌ３バリアントが、Ｃ末端塩基性ドメインの少なくとも５個のアミノ酸の欠失を有し、前記Ｃ末端塩基性ドメインが、配列番号４または配列番号５の２３個のＣ末端アミノ酸によって定義される、請求項２に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
5. 前記Ｄ１Ｌ３が、前記Ｃ末端塩基性ドメインの少なくとも１０個のアミノ酸の欠失を有する、請求項４に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
6. 前記Ｄ１Ｌ３が、前記Ｃ末端塩基性ドメインの少なくとも１５個のアミノ酸の欠失を有する、請求項４に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
7. 前記Ｄ１Ｌ３が、前記Ｃ末端塩基性ドメイン全体の欠失を有する、請求項６に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
8. 前記Ｄ１Ｌ３が、配列番号４の１０１位に対応する位置にアミノ酸置換を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
9. 前記Ｄ１Ｌ３が、Ｑ１０１Ｒであるアミノ酸置換を有する、請求項８に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
10. リンカーが、柔軟性、剛性である、またはプロテアーゼ切断部位を含む、請求項２に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
11. 前記リンカーが、柔軟性リンカーである、請求項１０に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
12. 前記リンカーが、少なくとも１０個のアミノ酸、または少なくとも１５個のアミノ酸を有する、請求項１０または１１に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
13. 前記リンカーが、１５～３５個のアミノ酸を有する、請求項１２に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
14. 前記バリアントが、配列番号８～３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、各事例において、任意選択で、独立して挿入、欠失、または置換から選択される１～２０個のアミノ酸修飾を有する、請求項１に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
15. 前記バリアントが、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、または配列番号３０のアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
16. 配列番号４の酵素と比較して、Ｄ１からの１つ以上の構成要素置換、及び／またはシステイン残基の１つ以上の欠失もしくは置換を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
17. 配列番号４のＣ６８に対応するアミノ酸が置換される、請求項１６に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
18. 前記配列番号４のＣ６８に対応するアミノ酸が、Ａｌａ、Ｓｅｒ、及びＧｌｙから選択されるアミノ酸で置換される、請求項１７に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
19. 前記バリアントが、置換Ｎ６４＿Ｉ７０ｄｅｌｉｎｓＨＬＴＡＶＧＫを含み、それは、前記構成要素置換が、システイン残基を含むように修飾されないことを条件として、任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、または挿入によって修飾される、請求項１６に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
20. Ｃ６８及び／またはＣ１９４に対応するアミノ酸へのＰＥＧ複合を含む、請求項１に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
21. 配列番号４及び／または配列番号５に存在するアルギニン及びリジン残基の１つ以上の置換を有し、前記置換により、前記Ｄ１Ｌ３バリアントが、配列番号４のタンパク質または配列番号５のタンパク質と比較して、プラスミン、トロンビン、及び／またはトリプシンによるタンパク質分解に対する感受性が低下する、請求項１または２に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
22. 前記アルギニン及びリジン置換のうちの１つ以上が、配列番号４：Ｋ１８０、Ｋ２００、Ｋ２５９、及びＲ２８５の位置（複数可）に対応する、請求項２１に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
23. 前記アルギニンまたはリジン置換が、配列番号４に関して、Ｋ１８０Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｋ２５９Ａ、及びＲ２８５Ａのうちの１つ以上から選択される、請求項２２に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
24. 前記バリアントが、配列番号４に関して、Ｋ１８０＿Ａ１８１ｄｅｌｉｎｓＧＬ、Ｐ１９８＿Ａ２０１ｄｅｌｉｎｓＲＰＳＱ、及びＫ２５９Ａから選択される置換を含む、請求項２２に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
25. 前記バリアントが、対塩基性残基の１つ以上の変異を含み、前記対塩基性残基が、配列番号４のＫ５０／Ｒ５１、Ｒ８０／Ｒ８１、Ｋ１１４／Ｒ１１５、Ｋ１９９／Ｋ２００、Ｋ２２６／Ｋ２２７、Ｋ２９１／Ｋ２９２、Ｒ２９７／Ｋ２９８／Ｋ２９９、及びＫ３０３／Ｒ３０４から選択される位置に対応する、請求項２１に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
26. 前記対塩基性残基の１つ以上の変異が、配列番号４に関して、Ｒ１１４Ｔ、Ｒ１１４Ａ、Ｒ１１４Ｄ、Ｒ１１４Ｑ、Ｋ２２７Ｓ、及びＫ２２７Ｅから選択されるアミノ酸置換を含む、請求項２５に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
27. 前記対塩基性残基の１つ以上の変異が、配列番号４に関して、Ｒ５１Ｋ、Ｒ８１Ｋ、Ｒ１１５Ｋ、及びＲ３０４Ｋから選択されるアミノ酸置換を含む、請求項２５に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
28. 前記リンカーが、凝固経路プロテアーゼによって切断可能である、請求項１０に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
29. 前記リンカーが、第ＸＩＩ因子または好中球プロテアーゼによって切断可能である、請求項２８に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
30. ＤＮａｓｅ１（Ｄ１）バリアントであって、システイン残基の１つ以上の欠失または置換を有する、配列番号１によって定義される酵素と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、前記ＤＮａｓｅ１（Ｄ１）バリアント。
31. 配列番号１のＣ１２３及びＣ１２６に対応する１つ以上のアミノ酸が、欠失または置換される、請求項３０に記載のＤ１バリアント。
32. 前記システイン（複数可）が、Ａｌａ、Ｓｅｒ、及びＧｌｙから、独立して選択されるアミノ酸で置換される、請求項３１に記載のＤ１バリアント。
33. 前記バリアントが、置換Ｇ１２２＿Ｎ１２８ｄｅｌｉｎｓＹＱＧＤＡを含む、請求項３０に記載のＤ１バリアント。
34. 前記Ｄ１バリアントが、アルブミンアミノ酸配列、及び任意選択で、ペプチドリンカーを含む、融合タンパク質である、請求項３０～３３のいずれか１項に記載のＤ１バリアント。
35. 前記融合タンパク質のアルブミンドメインが、前記Ｄ１ドメインのＮ末端側に位置する、請求項３４に記載のＤ１バリアント。
36. 前記ペプチドリンカーが、前記アルブミンドメインと前記Ｄ１ドメインとの間に挿入される、請求項３４または３５に記載のＤ１バリアントタンパク質。
37. 前記ペプチドリンカーが、柔軟性リンカー、剛性リンカー、またはプロテアーゼ切断可能リンカーである、請求項３６に記載のＤ１バリアント。
38. 前記リンカーが、少なくとも１０個のアミノ酸、または少なくとも１５個のアミノ酸を有する、請求項３７に記載のＤ１バリアント。
39. 前記リンカーが、１５～３５個のアミノ酸を有する、請求項３７に記載のＤ１バリアント。
40. 前記融合タンパク質の前記Ｄ１ドメインが、配列番号４または配列番号５によって定義される成熟酵素と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３４～３９のいずれか１項に記載のＤ１バリアント。
41. 前記Ｄ１バリアントが、配列番号１の野生型Ｄ１タンパク質と比較して少なくとも８０％のＤＮＡ分解活性を有する、請求項４０に記載のＤ１バリアント。
42. 前記Ｄ１バリアントが、配列番号１の酵素と少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４０または４１に記載のＤ１バリアント。
43. Ｄ１バリアントであって、配列番号１によって定義される酵素と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、Ｃ１２３及び／またはＣ１２６に対応するアミノ酸へのＰＥＧ複合を有する、前記Ｄ１バリアント。
44. ＤＮａｓｅ１様１（Ｄ１Ｌ１）バリアントであって、１つ以上の欠失または置換システイン残基を有する、配列番号２によって定義される酵素と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、前記ＤＮａｓｅ１様１（Ｄ１Ｌ１）バリアント。
45. 少なくとも１つの置換または欠失システイン残基が、配列番号２のＣ２２またはＣ５０に対応する位置である、請求項４４に記載のＤ１Ｌ１バリアント。
46. 前記置換システイン残基のうちの１つ以上が、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、またはＳｅｒであるアミノ酸によって置換される、請求項４５に記載のＤ１Ｌ１バリアント。
47. 前記Ｄ１Ｌ１バリアントが、配列番号２の酵素と少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４４～４６のいずれか１項に記載のＤ１Ｌ１バリアント。
48. 前記バリアントが、アルブミンアミノ酸配列、及び任意選択で、Ｄ１Ｌ１ドメインとアルブミンドメインとの間のペプチドリンカーを含む、融合タンパク質である、請求項４４～４７のいずれか１項に記載のＤ１Ｌ１バリアント。
49. 前記アルブミンドメインが、前記Ｄ１Ｌ１ドメインのＮ末端側に位置する、請求項４８に記載のＤ１Ｌ１バリアント。
50. 前記融合タンパク質が、ペプチドリンカーを含み、前記ペプチドリンカーが、柔軟性リンカー、剛性リンカー、またはプロテアーゼ切断可能リンカーである、請求項４８または４９に記載のＤ１Ｌ１バリアント。
51. Ｄ１Ｌ１バリアントであって、配列番号２によって定義される酵素と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、Ｃ２２及び／またはＣ５０に対応するアミノ酸へのＰＥＧ複合を有する、前記Ｄ１Ｌ１バリアント。
52. ＤＮａｓｅ１様２（Ｄ１Ｌ２）バリアントであって、１つ以上の置換または欠失システイン残基を有する、配列番号３によって定義される酵素と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、前記ＤＮａｓｅ１様２（Ｄ１Ｌ２）バリアント。
53. 配列番号３のＣ４３に対応するシステイン残基が、置換または欠失される、請求項５２に記載のＤ１Ｌ２バリアント。
54. 前記置換システイン残基のうちの１つ以上が、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、またはＳｅｒであるアミノ酸によって置換される、請求項５２または５３に記載のＤ１Ｌ２バリアント。
55. 前記Ｄ１Ｌ２バリアントが、配列番号２の酵素と少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５２～５４のいずれか１項に記載のＤ１Ｌ２バリアント。
56. 前記バリアントが、アルブミンアミノ酸配列、及び任意選択で、Ｄ１Ｌ２ドメインとアルブミンドメインとの間のペプチドリンカーを含む、融合タンパク質である、請求項５２～５５のいずれか１項に記載のＤ１Ｌ２バリアント。
57. 前記アルブミンドメインが、前記Ｄ１Ｌ２ドメインのＮ末端側に位置する、請求項５６に記載のＤ１Ｌ２バリアント。
58. ペプチドリンカーが、前記アルブミンドメインと前記Ｄ１Ｌ２ドメインとの間に挿入される、請求項５６または５７に記載のＤ１Ｌ２バリアント。
59. 前記ペプチドリンカーが、柔軟性リンカー、剛性リンカー、またはプロテアーゼ切断可能リンカーである、請求項５８に記載のＤ１Ｌ２バリアント。
60. Ｄ１Ｌ２バリアントであって、配列番号３によって定義される酵素と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、Ｃ４３に対応するアミノ酸へのＰＥＧ複合を有する、前記Ｄ１Ｌ２バリアント。
61. 請求項１～６０のいずれか１項に記載のＤ１、Ｄ１Ｌ１、Ｄ１Ｌ２、またはＤ１Ｌ３バリアントをコードする、単離ポリヌクレオチド。
62. 前記ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡである、請求項６１に記載の単離ポリヌクレオチド。
63. 前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項６１に記載の単離ポリヌクレオチド。
64. 請求項６１～６３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
65. 請求項６４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
66. 請求項１～６０のいずれか１項に記載のＤ１、Ｄ１Ｌ１、Ｄ１Ｌ２、またはＤ１Ｌ３バリアントを発現するように修飾された、宿主細胞。
67. 薬学的組成物であって、請求項１～６０のいずれか１項に記載のＤ１、Ｄ１Ｌ１、Ｄ１Ｌ２、またはＤ１Ｌ３バリアント、請求項６１～６３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項６４に記載のベクター、または請求項６５もしくは６６に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む、前記薬学的組成物。
68. 局所、非経口、または肺投与のために製剤化される、請求項６７に記載の薬学的組成物。
69. 皮内、筋肉内、腹腔内、関節内、静脈内、皮下、動脈内、経口、舌下、肺、または経皮投与のために製剤化される、請求項６８に記載の薬学的組成物。
70. 細胞外ＤＮＡ分解、細胞外クロマチン分解、細胞外トラップ（ＥＴ）分解、及び／または好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）分解を必要とする対象を治療するための方法であって、前記方法が、治療有効量の請求項６７～６９のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
71. 前記対象が、Ｄ１Ｌ３遺伝子内に機能喪失変異を有する、請求項７０に記載の方法。
72. 前記対象が、慢性好中球増加、好中球凝集または白血球停滞、血栓症または血管閉塞、虚血再灌流障害、外科的または外傷性組織損傷、急性もしくは慢性炎症性反応または疾患、自己免疫疾患、循環器疾患、代謝疾患、全身性炎症、呼吸器の炎症性疾患、腎炎症性疾患、移植組織に関連する炎症性疾患、及びがんから選択される状態を有する、請求項７０または７１に記載の方法。
73. 前記対象が、管系を閉塞するＮＥＴを有するか、またはその危険性があり、前記状態が、任意選択で、膵炎、胆管炎、結膜炎、乳腺炎、乾性眼疾患、血管閉塞、及び腎疾患から選択される、請求項７０または７１に記載の方法。
74. 前記対象が、内皮表面にＮＥＴの蓄積を有するか、またはその危険性がある、請求項７０または７１に記載の方法。
75. 前記Ｄ１Ｌ３バリアントが、アルブミンアミノ酸配列を含む融合タンパク質であり、前記対象に非経口的に投与され、前記投与が、およそ週１回である、請求項７０～７４のいずれか１項に記載の方法。
76. 請求項１～６０のいずれか１項に記載の組換えＤＮａｓｅバリアントを産生するための方法であって、前記ＤＮａｓｅバリアントをコードするポリヌクレオチドを発現する細胞を培養することと、組換えタンパク質を回収することと、を含む、前記方法。
77. 前記細胞が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項７６に記載の方法。
78. 前記Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞が、アスパラギン酸プロテイナーゼ３及び／またはケキシンの遺伝的欠失もしくは不活性化、または薬理学的阻害を有する、請求項７７に記載の方法。
79. 前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項７６に記載の方法。
80. 前記ＣＨＯ細胞が、フューリンプロテアーゼの遺伝的欠失もしくは不活性化、または薬理学的阻害を有する、請求項７９に記載の方法。
81. 前記ＤＮａｓｅバリアントが、対塩基性残基の１つ以上の変異を含むＤ１Ｌ３バリアントであり、前記対塩基性残基が、配列番号４のＫ５０／Ｒ５１、Ｒ８０／Ｒ８１、Ｋ１１４／Ｒ１１５、Ｋ１９９／Ｋ２００、Ｋ２２６／Ｋ２２７、Ｋ２９１／Ｋ２９２、Ｒ２９７／Ｋ２９８／Ｋ２９９、及びＫ３０３／Ｒ３０４から選択される位置に対応する、請求項７６～８０のいずれか１項に記載の方法。
82. 前記対塩基性残基の１つ以上の変異が、Ｒ１１４Ｔ、Ｒ１１４Ａ、Ｒ１１４Ｄ、Ｒ１１４Ｑ、Ｋ２２７Ｓ、及びＫ２２７Ｅから選択されるアミノ酸置換を含む、請求項８１に記載の方法。
83. 前記対塩基性残基の１つ以上の変異が、Ｒ５１Ｋ、Ｒ８１Ｋ、Ｒ１１５Ｋ、及びＲ３０４Ｋから選択されるアミノ酸置換を含む、請求項８１に記載の方法。
84. 組換えＤ１タンパク質ファミリーメンバーまたはそのバリアントを産生する方法であって、ポリアニオン化合物の存在下でＤＮａｓｅバリアントをコードするポリヌクレオチドを発現する細胞を培養することと、組換えタンパク質を回収することと、を含む、前記方法。
85. 前記組換えＤ１タンパク質ファミリーメンバーが、Ｄ１、Ｄ１Ｌ３、Ｄ１Ｌ１、またはＤ１Ｌ２のバリアントである、請求項８４に記載の方法。
86. 前記ポリアニオンが、デキストラン硫酸、ヘパリン、クエン酸第二鉄、及びＥＤＴＡのうちの１つ以上から選択される、請求項８４または８５に記載の方法。
87. 前記ポリアニオンが、デキストラン硫酸である、請求項８６に記載の方法。
88. 前記細胞が、原核性または真核性である、請求項８４～８７のいずれか１項に記載の方法。
89. 前記ＤＮａｓｅが、非哺乳動物発現系を使用して発現され、それが任意選択で、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、請求項８８に記載の方法。
90. 前記発現系が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項８９に記載の方法。
91. 前記Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞が、アスパラギン酸プロテイナーゼ３及び／またはケキシンの遺伝的欠失もしくは不活性化、または薬理学的阻害を有する、請求項９０に記載の方法。
92. 前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項８８に記載の方法。
93. 前記ＣＨＯ細胞が、フューリンプロテアーゼの遺伝的欠失もしくは不活性化、または薬理学的阻害を有する、請求項９２に記載の方法。
94. 前記組換えＤ１ファミリーメンバーが、ペプチドリンカーを介したＮ末端でのアルブミンの融合を含む、請求項８４～９３のいずれか１項に記載の方法。
95. 前記リンカーが、柔軟性リンカーである、請求項９４に記載の方法。
96. 前記リンカーが、切断可能リンカーであり、任意選択で、凝固経路プロテアーゼまたは好中球プロテアーゼによって切断可能である、請求項９５に記載の方法。
97. 凝固因子プロテアーゼが、第ＸＩＩ因子である、請求項９６に記載の方法。
98. 前記ペプチドリンカーが、第ＸＩ因子またはプレカリクレインにおけるＦＸＩＩ切断部位のすべてまたは一部から選択される、請求項９７に記載の方法。
99. 前記組換えＤ１ファミリーメンバーまたはバリアントが、前記細胞からの前記組換えタンパク質の分泌を指示するシグナルペプチドをコードする構築物で発現される、請求項８４～９８のいずれか１項に記載の方法。
100. 前記組換えＤ１ファミリーメンバーまたはバリアントが、アニオン交換樹脂を使用して前記ポリアニオン化合物から精製される、請求項８４～９９のいずれか１項に記載の方法。
101. 前記組換えＤ１ファミリーメンバーまたはバリアントが、カチオン交換樹脂を使用してさらに精製される、請求項１００に記載の方法。

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