ES2627274T3 - Polimerasa - Google Patents

Abstract

Una polimerasa obtenida por ingeniería genética que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NO 2, 4, 6, 8 o 10.

Description

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principalmente ácido carboxílico, que confieren a estas moléculas la capacidad de quelar cationes multivalentes como Mg2+, Ca2+, y Fe2+. El ácido húmico contiene un conjunto de entidades de peso molecular relativamente bajo que incluye metales, ácidos alifáticos, éteres, ésteres, alcoholes, fenoles (ácidos carboxílicos), compuestos fenólicos, fragmentos derivados de lignina aromáticos, polisacáridos y polipéptidos (Simpson A J et al. 2002). Otras referencias para su consulta incluyen Flaig, Soil Components pp. 1-219 (Gieseking Ed., Springer, Berlin 1975) y Humic Substances II Hays et al. Ed., Wiley Interscience, John Wiley, Nueva York (1989), así como Humus Chemistry, Genesis Composition Reactions, autor F. J. Stevenson, John Wiley & Sons, Nueva York (1994).

Las muestras del entorno en las que está presente ácido húmico incluyen, pero sin limitarse a ellas, suelo, sedimento, barros, materia biológica en descomposición, restos arqueológicos, ciénagas de turba, compost y agua, de origen terrestre o subterráneo. La ADN polimerasa obtenida por ingeniería genética de la presente invención puede ser particularmente útil para reacciones de replicación o amplificación como PCR, en las que el ácido nucleico que se ha de replicar o amplificar está comprendido o ha sido expuesto a dicha muestra del entorno. Entre los usos se incluyen por ejemplo, analíticas, clonación, diagnóstico y reacciones de detección en los campos de agricultura, horticultura, forestación, forense, investigación biológica, así como en la identificación de organismos y composiciones demuestra.

Aislamiento y uso de ácido húmico

El ácido húmico se extrae normalmente de humus en virtud de su solubilidad en álcali fuerte y la posterior precipitación de ácido fuerte (Swift, R.S. in "Methods of soil analysis. Parte 3: Chemical methods", Sparks, D. L. (Ed.), Soil Sci. Soc. Am., Madison, 1996, pp.1018-1020). El material solubilizado que queda es en cierto modo una versión refinada de ácido húmico, denominado ácido fúlvico. Las preparaciones solubles de ácidos húmicos también están disponibles en el mercado, especialmente como suplementos de nutrientes para las plantas. Se puede obtener ácido húmico de calidad técnica, por ejemplo de Sigma-Alrich Company Ltd, Gillingham, RU, número de producto 53680, número CAS 1415-93-6. Tal como se ilustra en el Ejemplo 1, más adelante, las soluciones de ácido húmico se pueden preparar y utilizar para analizar la ADN polimerasa obtenida por ingeniería genéticas candidata en cuanto a su resistencia al ácido húmico. Las ADN polimerasas candidatas se pueden someter a ensayo en cualquier reacción de replicación o amplificación, por ejemplo, PCR. Preferentemente, las ADN polimerasas candidatas se seleccionan por evolución dirigida de ADN polimerasas en presencia de ácido húmico como presión de selección Se puede añadir el ácido húmico a cada uno de los compartimentos o microcápsulas durante la auto-replicación compartimentalizada, por ejemplo, o en cualquier otro método de evolución dirigida. Se puede emplear la adición de ácido húmico a cada compartimento para seleccionar ADN polimerasas que tengan actividad en dichas condiciones.

La resistencia o una mejor capacidad para procesar ácido nucleico se expresa convenientemente en lo que se refiere a la concentración de ácido húmico que según las observaciones inhibe la actividad de la ADN polimerasa seleccionada obtenida por ingeniería genética, en comparación con la concentración que según las observaciones inhibe la enzima ADN polimerasa de tipo silvestre. Por tanto, las ADN polimerasas obtenidas por ingeniería genética seleccionadas de acuerdo con la divulgación pueden tener 2X, 4X, 6X, 8X, 10X, 12X, 14X, 15X, 16X, 18X, 20X, 22X, 25X, 30X, o más resistencia o mejor capacidad para procesar ácido nucleico, en comparación con la enzima ADN polimerasa de tipo silvestre. De forma sobre todo preferente, las ADN polimerasas obtenidas por ingeniería genética de la presente divulgación tienen capacidad para procesar ácido nucleico 16x mejor cuando se comparan de esta forma. Las ADN polimerasas obtenidas por ingeniería genética seleccionadas tienen preferentemente 50 % o más, 60 % o más, 70 % o más, 80 % o más, 90 % o más, o incluso 100 % de actividad a la concentración del factor de inhibición.

Compuestos fenólicos

El ácido húmico consiste en una mezcla de macromoléculas complejas que tienen estructuras fenólicas poliméricas (Índice Merck 13ª edición).

El término “compuestos fenólicos” o polifenoles se refiere a una gama de sustancias que poseen un anillo aromático que lleva una o más sustituciones hidroxilo. Compuestos fenólicos son productos del metabolismo secundario de las plantas y están muy extendidos en el reino vegetal. Las principales clases de compuestos fenólicos de las plantas incluyen fenoles simples, ácidos fenólicos, ácidos fenilacéticos, cumarinas, naftoquinonas, estilbenos/antraquinonas, flavonoides/isoflavonoides y ligninas (para mayor detalle, véase Harbone JB 1980, "Plant Phenolics in Encyclopedia of Plant Physiology, volumen 8, páginas 329-395, editado por Bell EA and Charlwood BV, publicado por Springer-Verlag, Berlín Heidelberg Nueva York). La detección y extracción de compuestos fenólicos del suelo y otras muestras biológicas es muy conocida entre las personas especializadas en la técnica (Mahugo Santana et al Anal Bioanal Chem (2005) 382(1):125-33, Shin et al J Biotechnol (2005) 119(1):36-43).

El término “ácidos fenólicos” se refiere a derivados ácidos de fenol, incluyendo, pero sin limitarse ellos, ácido caféico, vanilina, ácido ferúlico, ácido gálico, ácido elágico y ácido cumárico. Los ácidos fenólicos forman un grupo diverso que incluye dos categorías principales: los ácidos hidroxibenzoicos y los ácidos hidroxicinámicos (King and Young, J Am Diet Assoc. (1999) 99(2):213-8). “Ácidos fitofenólicos” se refiere a ácidos fenólicos derivados de material vegetal. Los ácidos fenólicos pueden darse en las plantas en forma de ésteres o glucósidos conjugados con otros

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compuestos naturales como flavonoides, alcoholes, ácidos grasos hidroxilados, esteroles y glucósidos. Los compuestos de ácido cinámico hidroxilados se dan con más frecuencia sobre todo como ésteres simples con ácidos hidroxi carboxílicos o glucosa. Los compuestos de ácido hidroxibenzoico están presentes principalmente en forma de glucósidos. Los métodos para la extracción de ácidos fenólicos a partir de muestras bilógicas se explican en Luthria and Mukhopadhyay (2006) J. Agric. Food Chem 54:41-47.

Polimerasas

Las enzimas polimerasas son capaces de catalizar la producción de ADN o ARN nuevos a partir de una matriz de ADN o ARN existente, un proceso denominado polimerización. Existen muchos tipos diferentes de polimerasas incluyendo ADN polimerasas, ARN polimerasas y transcriptasas inversas. Los métodos descritos en la presente divulgación pueden utilizarse para generar polimerasas por ingeniería genética, incluyendo ARN polimerasas, ADN polimerasas o transcriptasas inversas que son resistentes a ácido húmico o compuestos fenólicos.

ARN polimerasas

Las ARN polimerasas (ARNP) catalizan la polimerización de una cadena de ARN a partir de una matriz de ADN en un proceso de transcripción. ARNP puede iniciar la transcripción en secuencias de ADN específicas conocidas como promotores. A continuación, produce una cadena de ADN que es complementaria para la cadena de ADN utilizada como matriz. El proceso de adición de nucleótidos a la cadena de ARN se conoce como elongación. Al contrario que las ADN polimerasas, ARNP incluye una actividad helicasa, de manera que no se necesita una enzima por separado para desenrollar ADN. No obstante, las RNP sí que funcionan en asociación con una serie de factores accesorios. Dichos factores pueden controlar diversos procesos relacionados con polimerasas como temporalización y especificidad de la expresión génica. (Kaiser et al Trends Biochem Sci. (1996) 21(9):325-6) o reparación acoplada a transcripción (Lane TF, Cancer Biol Ther. (2004) 3(6):528-33).

En eucariotas, la transcripción de genes que codifican núcleo es llevada a cabo por tres ARN polimerasas diferenciadas denominadas I, II y III (Archambault J et al; Microbiol Rev. (1993) 57(3):703-24). ARN polimerasa I participa en la síntesis de ARN ribosómico, ARN polimerasa II participa en la síntesis de precursores de ARNm y ARNsn y ARN polimerasa III sintetiza ARNt y otros ARNs pequeños. En las bacterias, la misma enzima cataliza la síntesis de tres tipos de ARN: ARNm, ARNr y ARNt. La enzima nuclear tiene 5 subunidades (dos subunidades α, β, β1 y ω) entre las cuales, la subunidad β cataliza la síntesis de RNA. En Mooney et al Cell, (1999), Vol. 98:687-690 and Cramer P (2002) Curr Opin Struct Biol 12(1):89-97, se proporciona además una explicación de la estructura, la función y la regulación de otras ARN polimerasas en eucariotas y procariotas

ADN polimerasas

Las ADN polimerasas obtenidas por ingeniería genética de acuerdo con la presente divulgación presentan al menos alguna resistencia a ácido húmico o compuestos fenólicos.

Las enzimas ADN polimerasas son enzimas intracelulares de origen natural y son utilizadas por una célula para replicar cadenas de ácido nucleico. Durante el proceso de replicación, se copia una secuencia de nucleótidos de una cadena de ADN por apareamiento de bases complementario en una secuencia de ácidos nucleicos complementaria. Cada nucleótido en la cadena de ADN es reconocido por un nucleótido complementario sin polimerizar y requiere que las dos cadenas de la hélice de ADN se separan, al menos transitoriamente, para que los grupos donador y aceptor de enlace de hidrogeno de cada base quede expuesto para el apareamiento de bases. Los nucleótidos sueltos de entrada apropiados se alinean así para su polimerización catalizada por enzima en una nueva cadena de ácidos nucleicos.

Las enzimas que tienen actividad ADN polimerasa catalizan la formación de un enlace entre el grupo 3’-hidroxilo en el extremo en crecimiento de una secuencia de cebador de ácido nucleico y el grupo 5’-fosfato del nucleótido trifosfato. Estos nucleótidos trifosfato se seleccionan normalmente entre desoxiadenosina trifosfato (A, desoxitimidina trifosfato (T), desoxicitidina trifosfato (C) y dexosiguanosina trifosfato (G). Sin embargo, las ADN polimerasas pueden incorporar versiones modificadas o alteradas de estos nucleótidos. El orden en el que se añadan los nucleótidos está dictado por el apareamiento de bases para una cadena de la matriz de ADN; dicho apareamiento de bases se lleva a cabo a través de la unión hidrógeno “canónica” (unión de hidrógeno entre nucleótidos A y T y entre nucleótidos G y C de cadenas de ADN opuestas), si bien en la técnica se conoce el apareamiento de bases no canónico, como por ejemplo apareamiento de bases G:U. Véase, p.ej., Adams et al., The Biochemistry of the Nucleic Acids 14-32 (11th ed. 1992). El uso in vitro¸ de enzimas que tienen actividad ADN polimerasa se está haciendo habitual en los últimos años en diversas aplicaciones bioquímicas, incluyendo la síntesis de ADNc y reacciones de secuenciación de ADN (véase, Sambrook et al., (2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)), y la amplificación de ácidos nucleicos a través de métodos como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Mullis et al., Patentes estadounidenses Nos. 4.683.195, 4.683.202, y 4.800.159) y métodos de amplificación mediada por transcripción de ARN (p.ej., Kacian et al., Publicación PCT No. WO91/01384).

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Los métodos como PCR hacen uso de ciclos de la extensión del cebador aprovechando la actividad de ADN polimerasa, seguido de desnaturalización térmica del ácido nucleico de doble cadena resultante para proporcionar una nueva matriz para otra ronda de hibridación y extensión de cebador. Dado que las altas temperaturas necesarias para la desnaturalización de cadena tienen como resultado inactivaciones irreversibles de muchas ADN polimerasas, el descubrimiento y uso de ADN polimerasas capaces de seguir activas a temperaturas por encima de aproximadamente 37 °C a 42 °C (enzimas ADN polimerasa termoestables) proporciona ventajas desde el punto de vista de los costes y la eficiencia del trabajo. Se han descubierto ADN polimerasas termoestables en una serie de organismos termófilos entre los que se incluyen, sin limitarse sólo a ellos, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, y especies de los géneros Bacillus, Thermococcus, Sulfolobus, Pyrococcus. Las ADN polimerasas se pueden purificar directamente a partir de estos organismos termófilos. No obstante, se pueden conseguir sustanciales aumentos del rendimiento de ADN polimerasa clonando primero el gen que codifica la enzima en un vector de expresión multicopia a través de métodos de tecnología de ADN recombinante, insertando el vector en una cepa de célula huésped capaz de expresar la enzima, desarrollando el cultivo de las células huésped que contienen el vector, y extrayendo después la ADN polimerasa desde la cepa de la célula huésped que ha expresado la enzima.

Preferentemente, la DNA polimerasa de la presente divulgación es una polimerasa termoestable. Una ADN polimerasa "termoestable" tal como se utiliza en el presente documento es una polimerasa que presenta una significativa resistencia a la desnaturalización térmica a temperaturas elevadas, normalmente por encima de la temperatura corporal (37 °C). Preferentemente, dicha temperatura se encuentra en el intervalo de 42 °C a 160 °C, más preferentemente, entre 60 y 100 °C, de forma sobre todo preferente, por encima de 90 °C. En comparación con una polimerasa no termoestable, la polimerasa termoestable presenta un significativo aumento de su vida media (tiempo de incubación a temperatura elevada que tiene como resultado un 50 % de pérdida de la actividad). Preferentemente, la polimerasa termoestable retiene un 30 % o más de su actividad tras la incubación a una temperatura elevada, más preferentemente, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % o 80 % o más de su actividad. Con mayor preferencia aún, la polimerasa retiene un 80 % de la actividad. De forma sobre todo preferente, se retiene 90 %, 95 % o más, incluso 100 % de la actividad. Las polimerasas no termoestables podrían presentar una escasa retención,

o ninguna retención de la actividad tras incubaciones similares a temperatura elevada.

Las ADN polimerasas bacterianas que se han caracterizado hasta la fecha presentan ciertos patrones de similitudes y diferencias que han llevado a algunos a dividir estas enzimas en dos grupos: aquellas cuyos genes contienen intrones/inteínas (ADN polimerasas clase B) y aquellas cuyos genes ADN polimerasa son prácticamente similares a ADN polimerasa I de E. coli y no contienen intrones (ADN polimerasas Clase A). Se han clonado y expresado varias ADN polimerasas termoestables Clase A y Clase B derivadas de organismos termófilos. Entre las enzimas de clase

A: Lawyer, et al., J. Biol. Chem. 264:6427-6437 (1989) y Gelfund et al, patente estadounidense No. 5.079.352, notifican la clonación y expresión de ADN polimerasas termoestables de longitud completa derivadas de Thermus aquaticus (Taq). Lawyer et al., en PCR Methods and Applications, 2:275-287 (1993), y Barnes, publicación PCT No. WO92/06188 (1992), divulgan la clonación y expresión de versiones truncadas de la misma ADN polimerasa, mientras que Sullivan, publicación EPO No. 0482714A1 (1992), notifica la clonación de una versión mutada de la Taq ADN polimerasa. Asakura et al., J. Ferment. Bioeng. (Japón), 74:265-269 (1993), aparentemente, han clonado y expresado ADN polimerasa a partir de Thermus thermophilus. Gelfund et al., publicación PCT No. WO92/06202 (1992), han divulgado una ADN polimerasa termoestable purificada a partir de Thermosipho africanus. Akhmetzjanov y Vakhitov, Nucleic Acids Res., 20:5839 (1992) han notificado una ADN polimerasa termoestable a partir de Thermus flavus. Uemori et al., J. Biochem. 113:401-410 (1993) y la publicación EPO No. 0517418A2 (1992) han notificado la clonación y expresión de ADN polimerasas a partir de la bacteria termófila Bacillus caldotenax. Ishino et al., solicitud de patente japonesa No. HEI 4[1992]-131400 (fecha de publicación Nov. 19, 1993) notifican la clonación de una ADN polimerasa a partir de Bacillus stearothermophilus. Entre las enzimas de Clase B: Comb et al., publicación EPO No. 0 455 430 A3 (1991), Comb et al., publicación EPO No. 0547920A2 (1993), y Perler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (Estados Unidos), 89:5577-5581 (1992), notifican una ADN polimerasa termoestable recombinante a partir de Thermococcus litoralis. En Pisani et al., Nucleic Acids Res. 20:2711-2716 (1992) y en la publicación PCT WO93/25691 (1993) se divulga una ADN polimerasa termoestable clonada a partir de Sulfolobus solofatarius. En Uemori et al., Nucleic Acids Res., 21:259-265 (1993), se describe una enzima termoestable de Pyrococcus furiosus, mientras que en Comb et al., publicación EPO No. 0547359A1 (1993), se divulga una enzima termoestable recombinante de Pyrococcus sp.

Muchas ADN polimerasas termoestables poseen actividades adicionales aparte de la actividad ADN polimerasa; entre ellas se incluyen actividad 5’-3’-exonucleasa y/o actividad 3’-5’ exonucleasa. Las actividades 5’-3’-exonucleasa y 3’-5’ exonucleasa son conocidas entre las personas especializadas en la técnica. La actividad 3’-5’ exonucleasa mejora la precisión de la cadena recién sintetizada eliminando las bases incorrectas que puedan incorporarse; las ADN polimerasas en las que dicha actividad es baja o está ausente, que incluyen aparentemente Taq ADN polimerasa (véase Lawyer et al., J. Biol Chem. 264:6427-6437), tienen tasas de error elevadas en la incorporación de restos de nucleótidos en la cadena de extensión de cebador. En aplicaciones como los procedimientos de amplificación de ácido nucleico en los que la replicación de ADN suele ser geométrica en relación con el número de ciclos de extensión de cebador, dichos errores pueden conducir a serios problemas artifactuales como la heterogeneidad de la secuencia del producto de amplificación de ácido nucleico (amplicón). Por tanto la actividad 3’5’ exonucleasa es una característica deseable de una ADN polimerasa termoestable utilizada para estos propósitos.

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Alternativamente, se puede compartimentalizar la genoteca de ácidos nucleicos junto con los componentes de un sistema de transcripción/traducción in vitro (tal como se describe con mayor detalle en el presente documento) y la variante de polimerasa expresada in vitro dentro del compartimento.

Cada compartimento comprende también ácido húmico. Es deseable añadir el ácido húmico a una concentración suficiente para proporcionar una presión de selección, de manera que las ADN polimerasas resistentes a ácido húmico se puedan seleccionar. Hay que subrayar que la concentración de ácido húmico no deberá ser tan alta como para que se produzca la total inhibición de la actividad de polimerasa y, en consecuencia, no se pueda seleccionar polimerasas resistentes a ácido húmico.

Cada compartimento comprende también componentes para la reacción PCR, por ejemplo, nucleótido trifosfatos (dNTP), tampón, magnesio y cebadores de oligonucleótido. Los cebadores de oligonucleótido pueden tener secuencias que corresponden a las secuencias que flanquean el gen polimerasa (es decir, dentro del ADN genómico

o vector) o secuencias dentro del gen polimerasa. El ciclo térmico de PCR se inicia entonces para permitir que cualquiera de las variantes de polimerasa que tengan actividad polimerasa amplíe la secuencia de ácido nucleico.

Las polimerasas activas pueden amplificar sus secuencias de ácidos nucleicos correspondientes, al mismo tiempo que las secuencias de ácidos nucleicos que codifican polimerasas débilmente activas o inactivas se repliquen débilmente o no se repliquen en absoluto. En general, el número de copias final de cada miembro de la genoteca de ácidos nucleicos será según lo esperado proporcional al nivel de actividad de la variante de polimerasa que codifica. Los ácidos nucleicos que codifican polimerasas activas se sobre expresarán y los ácidos nucleicos que codifican polimerasas inactivas o débilmente activas se infra-representarán. A continuación, se pueden clonar y secuenciar, etc. las secuencias amplificadas resultantes, y determinar la capacidad de replicación de cada miembro.

PCR de transcriptasa inversa

La RT-PCR se utiliza para amplificar dianas de ARN. En este proceso, se utiliza la enzima transcriptasa inversa para convertir ARN a ADN complementario (ADNc), que se puede amplificar después utilizando PCR. Se ha demostrado que este método es útil para la detección de virus de ARN.

Los métodos de la divulgación pueden emplear RT-PCR y la ADN polimerasa obtenida por ingeniería genética de la presente invención se puede utilizar en RT-PCR. La agrupación de ácidos nucleicos que codifica la ADN polimerasas y sus variantes se puede proporcionar en forma de genoteca de ARN. Esta genoteca podría generarse in vivo en bacterias, células de mamífero, levaduras, etc., que están compartimentalizadas, o por transcripción in vitro de ADN compartimentalizado. El ARN podría codificar la ADN polimerasa co-compartimentalizada que ha sido expresada in vivo (y liberada en emulsión junto con ARN a través de los medios que se describen más adelante) o in vitro. Otros componentes necesarios para la amplificación (polimerasas y/o transcriptasa inversas, dNTP, cebadores) están también compartimentalizados. A la presión seleccionada de ácido húmico, el producto de ADNc de la reacción de transcripción inversa sirve como matriz para amplificación por PCR.

Otras técnicas de amplificación

En la presente divulgación se pueden explotar otras tecnologías de amplificación alternativas. Por ejemplo, la amplificación por círculo rodante (Lizardi et al., (1998) Nat Genet 19:225) es una tecnología de amplificación disponible en el mercado (RCAT™) que se activa mediante ADN polimerasa y que puede replicar sondas de oligonucleótido circulares con cinética lineal o geométrica en condiciones isotérmicas.

En presencia de dos cebadores adecuadamente diseñados, tiene lugar una amplificación geométrica a través del desplazamiento e hiper ramificación de la cadena de ADN para generar 1012 o más copias de cada círculo en 1 hora.

Si se utiliza un único cebador, RCAT genera en pocos minutos una cadena lineal de miles de copias de ADN unidas en tándem de una diana unida covalentemente a esa diana.

Otra técnica más, la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA; Walker et al., (1992) PNAS (USA) 80:392) comienza con una secuencia única definida específicamente para una diana específica. Pero a diferencia de otras técnicas que se basan en el ciclo térmico, SDA es un proceso isotérmico en el que se utiliza una serie de cebadores, ADN polimerasas y una enzima de restricción para amplificar exponencialmente la secuencia de ácido nucleico única.

SDA comprende tanto una fase de generación de diana como una fase de amplificación exponencial.

En la generación de diana, el ADN de doble cadena se desnaturaliza térmicamente creando dos copias monocatenarias. Una serie de cebadores especialmente fabricados se combinan con ADN polimerasas (cebadores de amplificación para copiar la secuencia base y cebadores de interposición para desplazar las cadenas recién creadas) para formar dianas alteradas con capacidad de amplificación exponencial.

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El proceso de amplificación exponencial empieza con dianas alteradas (cadenas de ADN parciales monocatenarias con sitios de reconocimiento de enzima restringidos) desde la fase de generación de diana. Se une un cebador de amplificación a cada cadena en su secuencia de ADN complementaria. La ADN polimerasa utiliza entonces el cebador para identificar una localización para extender el cebador desde su extremo 3’ utilizando la diana alterada como matriz para añadir nucleótidos individuales. El cebador extendido forma así un segmento de ADN de doble cadena que contiene un sitio de reconocimiento de enzima de restricción completo en cada extremo.

A continuación, se une una enzima de restricción al segmento de ADN de doble cadena en su sitio de reconocimiento. La enzima de restricción se disocia desde el sitio de reconocimiento después de haber segmentado solamente una cadena del segmento de doble cara, formando una mella. La ADN polimerasa reconoce la mella y extiende la cadena desde el sitio desplazando la cadena creada previamente. El sitio de reconocimiento se mella y se restaura repetidamente de esta forma con la enzima de restricción y la ADN polimerasa con desplazamiento continuo de las cadenas de ADN que contienen el segmento diana.

Cada cadena desplazada queda disponible entonces para hibridarse con cebadores de amplificación como se ha descrito. El proceso continúa con la repetición de mellas, extensión y desplazamiento de nuevas cadenas de ADN con el resultado de amplificación exponencial de la diana de ADN original.

Evolución dirigida

En una realización preferente, la presente divulgación proporciona un método para generar una ADN polimerasa por ingeniería genética que comprende las etapas de:

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proporcionar una agrupación de ácidos nucleicos que comprende miembros que codifican cada uno de ellos individualmente una ADN polimerasa o variante de ADN polimerasa;

(b)

proporcionar ácido húmico;

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subdividir la agrupación de ácidos nucleicos en compartimentos, de manera que cada compartimento comprende esencialmente un miembro ácido nucleico de la agrupación junto con la ADN polimerasas o variante codificada por el miembro de ácido nucleico, y ácido húmico;

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dejar que tenga lugar el procesamiento del miembro de ácido nucleico, y

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detectar el procesamiento del miembro de ácido nucleico mediante la ADN polimerasa; y opcionalmente, repetir la serie de las etapas (a) a (f) una o más veces.

Las técnicas de evolución dirigida y autorreplicación compartimentalizada se detallan en las patentes británicas GB 97143002 y GB 98063936 y GB 01275643, a nombre de los autores de la presente invención.

En su forma más simple CSR implica la segregación de genes que codifican y dirigen la producción de ADN polimerasas dentro de compartimentos acuosos diferenciados, espacialmente separados de una nueva emulsión agua en aceite térmicamente estable. Provista con nucleótido trifosfatos y cebadores flanqueantes apropiados, las polimerasas replican únicamente sus propios genes. En consecuencia, solamente se replican genes que codifican las polimerasas activas, mientras que las variantes inactivas que no pueden copiar sus genes desaparecen de la agrupación de genes. Por analogía con los sistemas biológicos, entre las variantes adaptadas de forma diferenciada, las más activas (las más idóneas) producen la mayoría de “vástagos”, según lo cual se correlaciona directamente el número de copias post-selección con la productividad enzimática.

Por tanto, al exponer repertorios de genes de ADN polimerasa (diversificados a través de mutación dirigida y aleatoria) a autoamplificación y alterando las condiciones en las que puede tener lugar la autoamplificación, se puede utilizar el sistema para aislar y obtener por ingeniería genética polimerasas con una mejor resistencia al ácido húmico.

La encapsulación de PCR ha sido descrita anteriormente para vesículas lípídicas (Oberholzer, T., Albrizio, M. & Luisi, P. L. (1995) Chem. Biol. 2, 677-82) y células y tejido fijos (Haase, A. T., Retzel, E. F. & Staskus, K. A. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4971-5; Embleton, M. J., Gorochov, G., Jones, P. T. & Winter, G. (1992) Nucleic Acids) pero de baja eficiencia.

Principios que subyacen bajo la tecnología CST

Microcápsulas

Los compartimentos o “microcápsulas” utilizados de acuerdo con el método de la divulgación requieren propiedades físicas apropiadas para permitir que funcione dicha divulgación.

En primer lugar, para asegurar que los ácidos nucleicos y los productos génicos no se difunden entre las microcápsulas, se debe aislar el contenido de cada microcápsula del entorno de que rodea a las microcápsulas, de manera que no exista ningún cambio o muy pocos cambios en los ácidos nucleicos y los productos génicos entre las microcápsulas a lo largo de la escala de tiempo del experimento.

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La porción del ácido nucleico del ácido nucleico puede comprender secuencias reguladoras adecuadas, como por ejemplo las requeridas para la expresión eficiente del producto génico, por ejemplo promotores, potenciadores, secuencias de inicio de la traducción, secuencias de poliadenilación, sitios de empalme, y similares.

Selección de producto

Se puede conectar un ligando o sustrato al ácido nucleico a través de diversos medios, que serán evidentes para las personas especializadas en la técnica (véase, por ejemplo, Hermanson, 1996). Cualquier marca será suficiente para permitir la posterior selección del ácido nucleico. La clasificación se puede realizar a través de cualquier método que permita una separación preferencial, amplificación o supervivencia de los ácidos nucleicos marcados. Entre los ejemplos se incluyen selección por unión (incluyendo técnicas basadas en separación magnética, como por ejemplo, utilizando Dynabeads™), y por resistencia a la degradación (por ejemplo por nucleasas, incluyendo endonucleasas de restricción).

Una forma en la que se puede unir la molécula de ácido nucleico a un ligando o sustrato es a través de biotinilación. Esto se puede realizar por amplificación por PCR con un cebador 5’-biotinilación, de manera que se unan covalentemente biotina y ácido nucleico.

El ligando o sustrato que se seleccione se puede unir al ácido nucleico modificado a través de diversos medios que serán evidentes para las personas especializadas en la técnica. Un ácido nucleico biotinilado puede acoplarse a una microperla de poliestireno (0,035 a 0,2 um de diámetro) que está revestida con avidina o estreptavidina, que se unirá por tanto al ácido nucleico con una afinidad muy alta. Esta perla se puede derivar con sustrato o ligando a través de un método adecuado, como adición de sustrato biotinilado o acoplamiento covalente.

Alternativamente, el ácido nucleico biotinilado se puede acoplar a avidina o estreptavidina formando complejo con una molécula de proteína grande como tiroglobulina (669 Kd) o ferritina (440 Kd). Este complejo se puede derivar con sustrato o ligando, por ejemplo, por acoplamiento covalente con el grupo alfa-amino de lisinas o a través de interacción no covalente, como biotina-avidina. El sustrato puede estar presente en forma no unida al ácido nucleico, pero conteniendo una “marca” inactiva que requiere una posterior etapa para su activación, como por ejemplo fotoactivación (p.ej. de un análogo de biotina “enjaulado” (Sundberg et al., 1995; Pirrung and Huang, 1996)). El catalizador que se selecciona entonces convierte el sustrato en el producto. La “marca” podría activarse entonces y el sustrato “marcado” y/o producto unido a la molécula de unión a marca (p.ej., avidina o estreptavidina) formar complejo con el ácido nucleico. La relación entre sustrato y producto unido al ácido nucleico a través de la “marca” por tanto reflejará la proporción del sustrato y el producto en solución.

Cuando se detienen todas las reacciones y se combinan las microcápsulas, los ácidos nucleicos que codifican enzimas activas pueden enriquecerse utilizando un anticuerpo u otra molécula que se une, o que reacciona específicamente con la “marca” Aunque tanto los sustratos como el producto tienen la marca molecular, únicamente los ácidos nucleicos que codifican el producto génico activo se co-purificarán.

Los términos “aislamiento”, “clasificación” y “selección” así como las variaciones de los mismos, se utilizan el presente documento. Aislamiento, de acuerdo con la presente divulgación se refiere al proceso de separar una entidad de una población heterogénea, por ejemplo una muestra, de manera que quede libre de al menos una sustancia con la que estaba asociada antes del proceso de aislamiento. En una realización preferente, el aislamiento se refiere a la purificación de una entidad esencialmente para homogeneidad. La clasificación de una entidad se refiere a un proceso para aislar preferentemente las entidades deseadas en relación con las entidades no deseadas. En la medida en que esto se refiera al aislamiento de las entidades deseadas, los términos “aislamiento” y “clasificación” son equivalentes. El método de la presente divulgación permite la clasificación de los ácidos nucleicos deseados a partir de agrupaciones (genotecas o repertorios) de ácidos nucleicos que contienen el ácido nucleico deseado. Selección se utiliza para referirse al proceso (incluyendo el proceso de clasificación) de aislar una entidad de acuerdo con una propiedad del mismo en particular.

Microcápsulas /clasificación

Además de los ácidos nucleicos que se han descrito, las microcápsulas de acuerdo con la divulgación comprenderán además los componentes requeridos para que tenga lugar el proceso de clasificación. Otros componentes del sistema comprenderán por ejemplo los necesarios para la transcripción y/o traducción del ácido nucleico. Estos se seleccionan para los requisitos para un sistema específico entre los siguientes: un tampón adecuado, un sistema de transcripción/replicación in vitro y/o un sistema de traducción in vitro que contiene todos los ingredientes necesarios, enzimas y co-factores, ARN polimerasas, nucleótidos, ácidos nucleicos (naturales o sintéticos), ARN de transferencia, ribosomas y aminoácidos y los sustratos de la reacción de interés para permitir la selección del producto génico modificado.

Un tampón adecuado será aquel en el que todos los componentes deseados del sistema biológico estén activos y por tanto dependerá de los requisitos de cada sistema de reacción concreto. Los tampones adecuados para

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Las agrupaciones de ácidos nucleicos de origen natural se pueden clonar desde ADN genómico o ADNc (Sambrook et al., 1989); por ejemplo, se ha demostrado que genotecas de mutante Taq u otras genotecas de ADN polimerasa obtenidas por amplificación por PCR de repertorios de Taq o ADN polimerasas son fuentes muy eficaces de fragmentos de ADN polimerasa.

Las genotecas de genes también se pueden obtener por codificación de todos (véase por ejemplo Smith, 1985; Parmley and Smith, 1988) o parte de los genes (véase por ejemplo Lowman et al., 1991) o agrupaciones de genes (véase por ejemplo Nissim et al., 1994) mediante un oligonucleótido sintético adulterado o aleatorizado. Las genotecas se pueden obtener también introduciendo mutaciones en un ácido nucleico o agrupación de ácidos nucleicos “aleatorizados” a través de diversas técnicas in vivo, incluyendo, el uso de “cepas de mutación” de bacterias como E. coli mutD5 (Liao et al., 1986; Yamagishi et al., 1990; Low et al., 1996). Se pueden introducir también mutaciones aleatorias tanto in vivo como in vitro por mutágenos químicos e ionización o irradiación de UV (véase Friedberg et al., 1995), o incorporación de análogos de base mutagénica (Freese, 1959; Zaccolo et al., 1996). También se pueden introducir mutaciones “al azar” en genes in vitro durante la polimerización, por ejemplo, utilizando polimerasas propensas a error. La PCR propensa a error introduce errores de copia aleatorios imponiendo condiciones de reacción imperfectas y por tanto mutagénicas o “descuidadas (por ejemplo, añadiendo Mn2+ o Mg2+ a la mezcla de reacción (Cadwell and Joyce, 1991, PCR Meth. Appl. 2:28-33; Leung et al., 1989, Technique 1:11-13). Se ha demostrado que este método es útil para generar genotecas aleatorizadas de secuencias de nucleótidos. De acuerdo con el método de la divulgación, el término “aleatorio” puede referirse a posiciones aleatorias con un repertorio aleatorio de aminoácidos en esas posiciones o puede ser posiciones seleccionadas (predeterminadas) con un repertorio aleatorio de aminoácidos en las posiciones seleccionadas.

Se puede introducir una mayor diversificación utilizando recombinación de homólogo ya sea in vivo (véase Kowalczykowski et al., 1994) o in vitro (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b)). Un ejemplo de una técnica de recombinación homóloga in vitro para generar diversidad génica es barajado génico.

El barajado génico implica la fragmentación aleatoria de varios ADN mutantes seguido de su re-ensamblaje por PCR en moléculas de longitud completa (Smith, Nature, 370: 324 [1994]). Entre los ejemplos de los diversos procedimientos de barajado génico se incluyen sin limitarse a ellos, ensamblaje seguido de tratamiento con ADNasa, el proceso de extensión escalonado (STEP) y recombinación in vitro con cebado aleatorio. En el método mediado por ADNasa, se segmentan segmentos de ADN aislada de una agrupación de mutantes positivos en fragmentos aleatorios con ADNasa I y se somete a múltiples rondas de PCR sin añadir cebador. Las longitudes de los fragmentos aleatorios se aproximan a las del segmento sin segmentar a medida que prosiguen los ciclos de PCR con el resultado de que las mutaciones presentes en diferentes clones se mezclan y se acumulan en algunas de las secuencias resultantes. Los múltiples ciclos de selección y el barajado han llevado a un potenciamiento funcional de varias enzimas (Stemmer, Nature, 370: 398 [1994]; Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10747 [1994]; Crameri et al., Nat. Biotech., 14: 315 [1996]; Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 4504 [1997]; and Crameri et al., Nat. Biotech., 15: 436 [1997]).

Se ha descrito una modificación del barajado génico, el protocolo de extensión escalonada (StEP) (WO 98/42832; Shao et al., 1998; Zhao et al., 1997; Zhao et al., 1998). StEP implica el cebado de polinucleótidos matriz con cebadores aleatorios o flanqueantes. Se re-ensamblan los cebadores extendidos en ciclos extremadamente rápidos de PCR, que generan productos de extensión cada vez más largos. En cada ciclo, los productos de cebador/extensión se pueden hibridar con diferentes matrices sobre la base de la complementariedad de secuencia. La matriz que conecta diferentes secuencias crea “casetes de recombinación”. Se continúa el proceso hasta que se crean genes de longitud completa.

Se ha descrito asimismo una modificación de la tecnología StEP (patente estadounidense No. 5.965.408). Al igual que StEP, los cebadores aleatorios se hibridan con una(s) diana(s) para barajado. Se extienden los cebadores aleatorios hasta que se detienen por “impedimentos” como dímeros de purina. La terminación prematura se facilita por bloqueo de la polimerasa con aductos asociados con la matriz. Se aíslan los fragmentos y se utilizan en una reacción de PCR por separado para crear fragmentos que se solapan más largos.

Se conoce una amplia gama de técnicas en la especialidad para rastrear productos génicos de genotecas combinatorias obtenidas por mutaciones puntuales y para rastrear genotecas de ADNc para productos génicos que tienen una propiedad determinada. Dichas técnicas serán por lo general adaptables para un rastreo rápido de las genotecas generadas por la mutagénesis combinatoria o recombinación de homólogos o variantes de ADN polimerasa. Las técnicas más usadas para rastrear genotecas grandes comprenden normalmente la clonación de la genoteca en vectores de expresión replicables, la transformación de células apropiadas con la librería de vectores resultantes y la expresión de los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita un aislamiento relativamente fácil del vector que codifica el gen cuyo producto ha sido detectado. Las técnicas de evolución dirigida para detección y selección de la actividad de ADN polimerasa deseada han sido descritas ya.

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Vectores y células huésped

Se pueden utilizar vectores y células huésped adecuados para hospedar el ácido nucleico que codifica las ADN polimerasa candidato o sus genotecas, o la ADN polimerasa obtenida por ingeniería genéticas de la presente divulgación. Las células huésped y los vectores se pueden utilizar también para expresar y aislar polipéptidos de ADN polimerasas candidatos o ADN polimerasa obtenida por ingeniería genéticas de la presente divulgación. La célula huésped adecuada puede emplearse también para aislar genes de ADN polimerasa de tipo silvestre y, alternativamente, o adicionalmente, para expresar polipéptidos de ADN polimerasa de tipo silvestre para su uso en los métodos de la presente divulgación.

Vectores

Los vectores de expresión se pueden construir a partir de un vector de partida como por ejemplo un vector disponible en el mercado. Los vectores preferentes son aquellos que son compatibles con la célula huésped, bacteriana, de insecto o de mamífero. Entre dichos vectores se incluyen, entre otros, pCRII, pCR3, y pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene, La Jolla, Calif.), pET15 (Novagen, Madison, Wis.), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Calif.), pETL (BlueBacII, Invitrogen), pDSRalfa (PCT Pub. No. WO 90/14363) y pFastBacDual (Gibco-BRL, Grand Island, N.Y.).

Otros vectores adecuados incluyen, pero sin limitarse a ellos, cósmidos, plásmidos, o virus modificados, pero se podrá apreciar que el sistema de vectores debe ser compatible con la célula huésped seleccionada. Dichos virus incluyen, sin limitarse a ellos plásmidos como derivados de plásmido Bluescript® (un fagémido a base de CoIE1 de un alto número de copias, Stratagene Cloning Systems, La Jolla Calif.), plásmidos de clonación por PCR diseñados para clonación de productos de PCR Taq-amplificados (p.ej. TOPO™ TA Cloning® Kit, derivados de plásmido PCR2.1®, Invitrogen, Carlsbad, Calif.), pASK75, y vectores de mamífero, levaduras o virus como sistema de expresión de baculovirus (derivados de plásmido pBacPAK, Clontech, Palo Alto, Calif.).

Los vectores pueden incluir también un elemento regulador de transcripción (un promotor) unido operativamente a la secuencia de ADN polimerasa. El promotor puede contener opcionalmente porciones de operador y/o sitios de unión a ribosoma. Los ejemplos no exhaustivos de promotores bacterianos compatibles con E. coli incluyen: promotor trc, promotor alfa-lactamasa (penicilinasa); promotor lactosa; promotor triptifano (trp), promotor arabinosa BAD operon; promotor PI lambda derivado y sitio de unión a ribosoma gen N; y el promotor tac híbrido derivado de secuencias de los promotores trp y lac UV5.

Una vez construido el vector e insertado la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de ADN polimerasa en el sitio apropiado del vector, el vector completado puede insertarse en una célula huésped adecuada para amplificación y/o expresión de polipéptido. La transformación de un vector de expresión para polipéptido de ADN polimerasa en una célula huésped seleccionada, se puede llevar a cabo a través de métodos muy conocidos, incluyendo métodos como transfección, infección, cloruro de calcio, electroporación, micro-inyección, lipofección, método DEAE-dextrano u otras técnicas conocidas. El método seleccionado dependerá en parte del tipo de células huésped que se utilice. Estos métodos y otros métodos adecuados son conocidos entre las persones especializadas en la técnica y se exponen por ejemplo en Sambrook et al., supra.

Células huésped

Se entiende por “célula huésped” o “célula obtenida por ingeniería genética recombinante” una célula que contiene un vector y que soporta la replicación y/o expresión del vector de expresión. Las células huésped pueden ser células huésped procariotas (como E. coli) o células huésped eucariotas (como célula de levadura, insecto o vertebrado). La célula huésped, cuando se cultiva en condiciones apropiadas sintetiza un polipéptido de ADN polimerasa que se puede recoger posteriormente desde el medio de cultivo (si la célula huésped lo secreta al medio) o directamente desde la célula huésped que lo produce (si no lo secreta). La selección de la célula huésped apropiada dependerá de diversos factores, como los niveles de expresión deseada, las modificaciones de polipéptido que son deseables o necesarias para la actividad (como glucosilación o fosforilación) y la facilidad de plegamiento en una molécula biológicamente activa.

Son de particular interés como células huésped las células bacterianas. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli (p.ej. HB101, DH5α, DH10, y MC1061) son células huésped conocidas en el campo de la biotecnología. Se pueden emplear asimismo varias cepas de B. subtilis, Pseudomonas spp., otras Bacillus spp., Streptomyces spp., y similares, en los métodos empleados en la presente divulgación.

Las células huésped se pueden utilizar para expresar el candidato heterólogo o la ADN polimerasa obtenida por ingeniería genéticas de la presente divulgación. Tal como se utiliza en el presente documento “heterólogo” haciendo referencia a un ácido nucleico es un ácido nucleico que se origina a partir de una especie extraña, o si lo hace a partir de la misma especie, está sustancialmente modificado desde su forma nativa en cuanto a la composición y/o el locus genómico por intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor unido operativamente a un gen estructural heterólogo es de una especie diferente a aquella de la que se deriva el gen estructural, o, si es de la

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misma especie, uno o ambos están sustancialmente modificados desde su forma original. Una proteína heterogénea se puede originar a partir de especies extrañas, o, si lo hace desde la misma especie, está sustancialmente modificada desde su forma original por intervención humana deliberada.

Los sistemas de replicación preferibles incluyen M13, ColEl, SV40, baculovirus, lambda, adenovirus, y similares. Se ha aislado un gran número de regiones reguladoras de iniciación y terminación de la transcripción y se ha demostrado que son eficaces en la transcripción y traducción de proteínas heterólogas de varios huéspedes. En la técnica se conocen ejemplos de dichas regiones, métodos de aislamiento, formas de manipulación, etc. En las condiciones de expresión apropiadas, se pueden utilizar las células huésped como fuente de ADN polimerasas producidas por recombinación o péptidos y polipéptidos derivados.

Ejemplos

Ejemplo 1: Genotecas de quimeras de polimerasa

Se construyeron genotecas de variantes génicas de polimerasa quimérica utilizando la técnica de barajado Step de PCR (Zhao et al., (1998) Nature Biotechnol. 16, 258-261).

Para una primera genoteca 3T: Se amplificaron genes de polimerasa de tipo silvestre de Thermus aquaticus (Taq) y T8 (una variante Taq 11 veces más termoestable seleccionada previamente (Ghadessy et al. Proc Natl Acad Sci U S

A. 2001 Abr 10; 98(8):4552-7), Thermus thermophilus (Tth) y Thermus flavus (Tfl) desde ADN genómico y se clonaron en pASK75 (Skerra 1994) y se sometieron a ensayo para determinar su actividad. Se barajaron estos genes utilizando Step, después se volvieron a clonar en pASK75 y se transformaron en E. coli TG1 para dar la genoteca 3T.

Para una segunda genoteca más diversa 8T, se amplificaron genes Pol I de ADN genómico de Thermus brockianus, Thermus filiformis, Thermus scotoductus y Thermus oshimai por PCR y se clonaron en el vector pAsk75 vector.

Se generó T8 por Step como en el caso anterior incluyendo los genes Pol I de Thermus thermophilus, Thermus aquaticus, Thermus flavus, Thermus brockianus, Thermus filiformis, Thermus scotoductus y Thermus oshimai así como Deinococcus radiodurans (una bacteria resistente a radiación) que había sido clonada previamente en pAsk75 en el laboratorio de los autores de la invención.

Se puntuó el tamaño de la genoteca por ensayos de dilución y determinando la proporción de clones que contenían inserto por rastreo de PCR y fue aproximadamente 1x108 en ambos casos. Un digesto de restricción de diagnóstico de 20 clones produjo 20 patrones de restricción únicos, lo que indica que la genoteca era diversa.

El posterior secuenciado de quimeras seleccionadas demostró una media de 4 a 6 cruzados por gen.

Ejemplo 2: Producción de ácido húmico

Se rompió una muestra de suelo de turba en pequeños trozos y se añadió agua. A continuación, se calentó la muestra a 50 ºC durante 1 hora para ayudar a la solubilización.

Se centrifugaron las muestras resultantes a 13.000 rpm durante 30 minutos y se recuperó la fase acuosa. A continuación, se redujo el volumen 10 veces utilizando un concentrador.

Se sometió a ensayo la actividad inhibidora del ácido húmico resultante realizando 30 ciclos de PCR (94 °C 10 min), después 30 ciclos de 94 °C 30 s, 50 °C 30 s, 72 °C 1 min después 65 °C 10 min en presencia de una serie de doble dilución de ácido húmico en 60 % ácido húmico a 0,03 % (12 puntos). Se llevó a cabo la PCR (tampón 1xSuperTaq, 0,2 mM dNTP, 1 µM cebadores (AAA AAT CTA GAT AAC GAG GGC AA y ACC ACC GAA CTG CGG GTG ACG CCA AGC G), 1 µl SuperTaq, 2,5 µl de un crecimiento durante toda la noche de células E.coli y 0,01 µl de pAsk75 como matriz (100 µm de reserva), agua y ácido húmico según se necesitó) en presencia de residuo celular de E. coli ya que se sabe que ADN y proteína contrarrestan hasta cierto punto el efecto inhibidor que tiene el ácido húmico sobre las polimerasas.

Se observó que el ácido húmico inhibió totalmente la PCR a una concentración de 5 % y superior.

Ejemplo 3: Selección de clones resistentes a ácido húmico

Se llevó a cabo la emulsificación CSR y la selección en la genoteca StEP Taq, Tht y Tfl descrita esencialmente (Ghadessy et al. 2001), pero con la adición de ácido húmico a la fase acuosa de la emulsión como fuente de presión selectiva. La cantidad máxima de ácido húmico que produce una selección positiva fue 20 %.

Los cebadores utilizados fueron (5'-GTA AAA CGA CGG CCA GTA CCA CCG AAC TGC GGG TGA CGC CAA GCG-3', and 5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACA AAA ATC TAG ATA ACG AGG GCA A-3').

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