EA046216B1 - РАЗРАБОТКА ДНКаз ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА И ТЕРАПИИ - Google Patents
РАЗРАБОТКА ДНКаз ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА И ТЕРАПИИ Download PDFInfo
- Publication number
- EA046216B1 EA046216B1 EA202190940 EA046216B1 EA 046216 B1 EA046216 B1 EA 046216B1 EA 202190940 EA202190940 EA 202190940 EA 046216 B1 EA046216 B1 EA 046216B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- variant
- linker
- protein
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 40
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 title description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 110
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 103
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 102
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 88
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 88
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 84
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 84
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 84
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 69
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 59
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 59
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 59
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 43
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 43
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 43
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 40
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 36
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 36
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 35
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 26
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 26
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 25
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 claims description 25
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 21
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 21
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 16
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 claims description 16
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 claims description 16
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 15
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 15
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 15
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 14
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 13
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 11
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 11
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 11
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Chemical group NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004472 Lysine Chemical group 0.000 claims description 6
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 6
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 6
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 102220515709 Interferon regulatory factor 8_R81K_mutation Human genes 0.000 claims description 3
- 102220353580 c.911G>A Human genes 0.000 claims description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 3
- 102200112766 rs111902263 Human genes 0.000 claims description 3
- 102220230803 rs370983323 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010080865 Factor XII Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000429 Factor XII Human genes 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 105
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 105
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 77
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 76
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 62
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 62
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 60
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 60
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 52
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 40
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 40
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 39
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 31
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 27
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 27
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 25
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 24
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 24
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 22
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 21
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 20
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 9
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- -1 dextran sulfate Polymers 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 7
- 108090000113 Plasma Kallikrein Proteins 0.000 description 7
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 102100030563 Coagulation factor XI Human genes 0.000 description 6
- 108010071241 Factor XIIa Proteins 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 6
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 6
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 5
- 101710172072 Kexin Proteins 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 5
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 5
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 5
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 5
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 5
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 5
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-5-amino-2-[[2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N 0.000 description 4
- CYWHLOXWVAWMFO-UHFFFAOYSA-N 3-sulfanyl-1h-pyridine-2-thione Chemical compound SC1=CC=CN=C1S CYWHLOXWVAWMFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710171433 Aspartic proteinase 3 Proteins 0.000 description 4
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 4
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 4
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150044878 US18 gene Proteins 0.000 description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 4
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical compound C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 4
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 102220283780 rs1555750712 Human genes 0.000 description 4
- 102200037604 rs879254418 Human genes 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 4
- 238000009121 systemic therapy Methods 0.000 description 4
- LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 4-[[1-[[1-[2-[[1-(4-nitroanilino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)NC(C)C(=O)NC(C)C(=O)N1CCCC1C(=O)NC(C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 3
- 108090000617 Cathepsin G Proteins 0.000 description 3
- 102100025975 Cathepsin G Human genes 0.000 description 3
- 101150063735 DNASE1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102220606133 E3 ubiquitin-protein ligase RNF135_C24A_mutation Human genes 0.000 description 3
- 108010028275 Leukocyte Elastase Proteins 0.000 description 3
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 102100033174 Neutrophil elastase Human genes 0.000 description 3
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 3
- 102000012335 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Human genes 0.000 description 3
- 108010022233 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Proteins 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 229960002413 ferric citrate Drugs 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K iron(III) citrate Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 3
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 102220006254 rs267606667 Human genes 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- RVLOMLVNNBWRSR-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-aminopropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O RVLOMLVNNBWRSR-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 2
- 102220561378 4-galactosyl-N-acetylglucosaminide 3-alpha-L-fucosyltransferase FUT5_N86H_mutation Human genes 0.000 description 2
- 101150041872 DNASE1L3 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000003556 Dry Eye Syndromes Diseases 0.000 description 2
- 206010013774 Dry eye Diseases 0.000 description 2
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 2
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 2
- 102100039869 Histone H2B type F-S Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001035372 Homo sapiens Histone H2B type F-S Proteins 0.000 description 2
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 101150045458 KEX2 gene Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102220539880 Lymphocyte antigen 6 complex locus protein G6d_S34T_mutation Human genes 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 2
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 102220393123 c.290C>G Human genes 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 201000009266 primary ciliary dyskinesia Diseases 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 102200005671 rs1013940 Human genes 0.000 description 2
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000012609 strong anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 2
- 108091064702 1 family Proteins 0.000 description 1
- DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropane-1,3-dithiol Chemical compound SCC(N)CS DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102300046275 Albumin isoform 2 Human genes 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 206010003011 Appendicitis Diseases 0.000 description 1
- 206010003598 Atelectasis Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- 206010006458 Bronchitis chronic Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010007882 Cellulitis Diseases 0.000 description 1
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 208000025678 Ciliary Motility disease Diseases 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 102000016550 Complement Factor H Human genes 0.000 description 1
- 108010053085 Complement Factor H Proteins 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 102100031149 Deoxyribonuclease gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 208000034706 Graft dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010018852 Haematoma Diseases 0.000 description 1
- 206010019027 Haemothorax Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 101000845618 Homo sapiens Deoxyribonuclease gamma Proteins 0.000 description 1
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 1
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022680 Intestinal ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 208000003892 Kartagener syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000005230 Leg Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000032514 Leukocytoclastic vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 206010024404 Leukostasis Diseases 0.000 description 1
- 241000406668 Loxodonta cyclotis Species 0.000 description 1
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 description 1
- 208000005777 Lupus Nephritis Diseases 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 206010027253 Meningitis pneumococcal Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 206010062575 Muscle contracture Diseases 0.000 description 1
- 206010029379 Neutrophilia Diseases 0.000 description 1
- 206010058105 Neutrophilic dermatosis Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000011623 Obstructive Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 206010048685 Oral infection Diseases 0.000 description 1
- 201000007100 Pharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 102100038124 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 206010061351 Pleural infection Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 229920000037 Polyproline Polymers 0.000 description 1
- 208000004530 Primary Graft Dysfunction Diseases 0.000 description 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical group OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 208000007123 Pulmonary Atelectasis Diseases 0.000 description 1
- 206010037596 Pyelonephritis Diseases 0.000 description 1
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 1
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 1
- 201000010789 Spermatic Cord Torsion Diseases 0.000 description 1
- 206010065805 Spermatic cord obstruction Diseases 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010043356 Testicular torsion Diseases 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 206010069363 Traumatic lung injury Diseases 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 1
- 206010053648 Vascular occlusion Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002744 anti-aggregatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000001483 arginine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000009267 bronchiectasis Diseases 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000011965 cell line development Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 208000003167 cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 201000001352 cholecystitis Diseases 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 208000007451 chronic bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 208000006111 contracture Diseases 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 201000003146 cystitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001804 debridement Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 201000001981 dermatomyositis Diseases 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 108010067396 dornase alfa Proteins 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 208000002296 eclampsia Diseases 0.000 description 1
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000011200 hepatorenal syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 206010023332 keratitis Diseases 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 201000002818 limb ischemia Diseases 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004777 loss-of-function mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 208000004593 pneumococcal meningitis Diseases 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010026466 polyproline Proteins 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 201000011461 pre-eclampsia Diseases 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000003331 prothrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002435 rhinoplasty Methods 0.000 description 1
- 238000011808 rodent model Methods 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 201000009890 sinusitis Diseases 0.000 description 1
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 1
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004533 streptodornase Drugs 0.000 description 1
- 239000012607 strong cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 206010044008 tonsillitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 208000021331 vascular occlusion disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 230000003462 zymogenic effect Effects 0.000 description 1
Description
Родственные заявки
Заявка на данное изобретение испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/742682, поданной 8 октября 2018 г.; 62/775563, поданной 5 декабря 2018 г.; 62/779104, поданной 13 декабря 2018 г.; 62808601, поданной 21 февраля 2019 г.; и 62/846904, поданной 13 мая 2019 г., содержание каждой из которых полностью включено в данный документ посредством ссылки.
Область техники
Это изобретение относится к области разработки ферментов - ДНКаз.
Уровень техники
Воспаление представляет собой необходимый ответ хозяина для контроля проникающих микробов и заживления поврежденных тканей. Неконтролируемое и персистентное воспаление вызывает повреждение тканей при большом количестве воспалительных заболеваний. Нейтрофилы при остром воспалении являются доминирующими лейкоцитами. Во время инфекции, нейтрофилы генерируют нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET), решетки филаментов ДНК, декорированных токсичными гистонами и ферментами, которые иммобилизируют и нейтрализуют бактерии. Тем не менее высвобожденные по ошибке NET могут нанести вред клеткам-хозяевам в соответствии с их цитотоксической, противовоспалительной и протромботической активностью.
ДНКаза 1 (D1) образует вместе с ДНКаза 1-подобным белком 1 (D1L1), ДНКаза 1-подобным белком 2 (D1L2) и ДНКаза 1-подобным белком 3 (D1L3) семейство белков ДНКазы 1, группу гомологичных секретируемых ферментов ДНКаз. ДНКаза 2A и ДНКаза 2B образуют дополнительную группу гомологичных внеклеточных ферментов ДНКаз. Члены семейства белков ДНКаза 1 и ДНКаза 2 эволюционно консервативны и экспрессируются у различных видов, включая человека. Рекомбинантные члены семейства человеческих белков ДНКаза 1 и ДНКаза 2 являются кандидатами в лекарственные препараты для лечения заболеваний, связанных с NET. Хотя белок D1 был разработан для некоторых терапевтических применений у пациентов, условия для крупномасштабного производства других членов семейства белков ДНКаза 1 не описаны. Кроме того физические, ферментативные и фармакокинетические свойства этих ферментов являются не идеальными для клинических применений. Таким образом, существует потребность в определении процесса производства ферментов D1L1, D1L2 и D1L3, а также в разработке ДНКаз для использования в терапии, в том числе для деградации NET.
Сущность изобретения
В данном изобретении предложены сконструированные внеклеточные белки ДНКазы человека (например, варианты ДНКазы 1 (D1), ДНКаза1-подобный белок 1 (D1L1), ДНКаза1-подобный белок 2 (D1L2), изоформа 1 ДНКаза1-подобного белка 3 (D1L3), изоформа 2 ДНКаза1-подобного белка 3 (D1L3-2), ДНКаза 2A (D2A) и ДНКаза 2B (D2B)), которые можно использовать для лечения патологических состояний, характеризующихся накоплением и/или высвобождением внеклеточной ДНК, внеклеточного хроматина и нейтрофильной внеклеточной ловушки (NET). В соответствии с аспектами изобретения варианты ДНКазы, описанные в данном документе, более пригодные для терапии и/или более подходят для крупномасштабного производства. В некоторых вариантах осуществления варианты ДНКазы, описанные в данном документе, имеют преимущества для медикаментозной терапии, включая системную терапию. Такие преимущества включают более медленное выведение лекарственного средства, например, увеличенный период полужизни в кровотоке (например, период полувыведения из сыворотки), увеличенную продолжительность фармакодинамической активности, высокую активность по деградации хроматина и устойчивость к действию протеаз.
В некоторых аспектах изобретения предложен вариант D1L3, где вариант D1L3 имеет один или более из следующих элементов: повышенная стабильность белка, более медленное выведение лекарственного средства и увеличенная продолжительность фармакодинамической активности, устойчивость к протеолитической деградации, более высокие уровни продукции в системах экспрессии in vitro, лучшая пригодность для очистки, но не существенно меньшая, такая же или лучшая активность по деградации хроматина и/или NET по сравнению с изоформой 1 D1L3 фермента дикого типа с SEQ ID NO:4 или изоформой 2 D1L3 фермента дикого типа с SEQ ID NO:5.
В некоторых вариантах осуществления вариант D1L3 представляет собой слитый белок, который содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична зрелому ферменту, определенному SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, аминокислотную последовательность альбумина на N-конце зрелого фермента и необязательно связывающую аминокислотную последовательность между аминокислотной последовательностью альбумина (домен альбумина) и аминокислотной последовательностью D1L3 (домен D1L3). В этих вариантах осуществления D1L3 демонстрирует более медленное выведение (например, улучшенный период полувыведения из кровообращения или период полувыведения из сыворотки) и увеличенную продолжительность фармакодинамической активности, в том числе для системной терапии. В некоторых вариантах осуществления слияние альбумина со связывающей последовательностью с доменом D1L3 существенно не влияет на активность фермента по деградации хроматина (например, измеренную с помощью анализа in vitro) по сравнению с ферментом без слияния с альбумином.
В этих вариантах осуществления домен D1L3 слитого белка имеет делецию всего или части
- 1 046216
C-концевого основного домена, который присутствует в ферменте D1L3 дикого типа. Делеция или инактивация С-концевого основного домена существенно улучшает активность по деградации хроматина. То есть удаление С-концевого основного домена (BD) активирует фермент D1L3 дикого типа для деградации хроматина.
В некоторых вариантах осуществления вариант D1L3 имеет одну или более замен структурными блоками из D1. Например, вариант D1L3 может иметь замену структурного блока Q282_S305delinsK, которая включает удаление C-концевого основного домена, который отсутствует в D1. В некоторых вариантах осуществления вариант D1L3 имеет аминокислотную замену в положении, соответствующем положению 101 SEQ ID NO: 4. Заменой может быть Arg на основе соответствующего структурного блока из D1 или в некоторых вариантах осуществления может быть Lys. Замены в этом положении могут усиливать активность варианта D1L3 по деградации хроматина.
Линкер, если он присутствует, может быть гибким линкером, жестким линкером или физиологически расщепляемым линкером, таким как линкер, расщепляемый протеазой. Например, линкером может быть гидрофильная аминокислотная последовательность, и он может быть сконструирован преимущественно из аминокислот, выбранных из Gly, Ala, Ser, Thr и Pro. В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой гибкий линкер, который состоит преимущественно из остатков глицина и серина (например, линкер (GyS)n, где y обозначает число от 1 до 5, а n - от 1 до 20). В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой α-спиральный линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит по меньшей мере 15 аминокислот или по меньшей мере 25 аминокислот. В различных вариантах осуществления более длинные линкеры, содержащие по меньшей мере 15 аминокислот, могут обеспечивать улучшение продуктивности при экспрессии в системах экспрессии млекопитающих и не млекопитающих, таких как клетки СНО или Pichia pastoris. Кроме того, что неожиданно, более длинные линкерные последовательности показали улучшенную активность по деградации хроматина в анализе деградации хроматина in vitro по сравнению с более короткими линкерными последовательностями.
В различных вариантах осуществления вариант D1L3 содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-30, в каждом случае необязательно имеющую от одной до двадцати аминокислотных модификаций, независимо выбранных из вставок, делеций или замен. Эти последовательности обеспечивают примеры слитых белков D1L3 (или варианты D1L3) с последовательностями альбумина, в том числе с различными конструкциями линкеров. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные модификации находятся в домене D1L3, домене альбумина или обоих доменах. В некоторых вариантах осуществления вариант имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. В этих вариантах осуществления вариант D1L3 содержит от N-конца до C-конца: аминокислотную последовательность альбумина, средний или длинный гибкий линкер и аминокислотную последовательность D1L3 (т.е. включая варианты D1L3). SEQ ID NO: 28 дополнительно включает слияние альбумина на С-конце через длинный гибкий пептидный линкер.
В других вариантах осуществления линкер расщепляется протеазой, такой как протеаза системы коагуляции, например активированным фактором XII. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность фактора XI и/или прекалликреина. В других вариантах осуществления линкер содержит пептидную последовательность, которая расщепляется нейтрофильной специфической протеазой, такой как эластаза нейтрофилов, катепсин G или протеиназа 3.
В некоторых аспектах изобретения предложены варианты внеклеточных ДНКаз, сконструированные так, чтобы иметь преимущества при производстве, обеспечивая продуцирование рекомбинантного фермента, подходящего для применения в терапии. В различных вариантах осуществления изобретения предложены рекомбинантные варианты D1, D1L1, D1L2 и D1L3, содержащие одну или более аминокислотных замен по остаткам цистеина (или пегилирование остатков Cys), что приводит к снижению внутри- и межмолекулярного поперечного сшивания через дисульфидные мостики во время экспрессии белка.
В других аспектах изобретения предложены варианты внеклеточных ДНКаз, сконструированные так, чтобы иметь преимущества в устойчивости к действию протеаз, для улучшения воздействия in vivo, например, замедления элиминации, например, продление периода полужизни (например, периода полужизни в сыворотке) и увеличение продолжительности фармакодинамической активности, а также снижение протеолиза во время продуцирования рекомбинантных ферментов. В данном изобретении идентифицированы, например, остатки D1L3, которые чувствительны к протеолизу плазмином, тромбином и/или трипсином, а также остатки (например, парные основные аминокислоты), которые чувствительны к действию протеаз, продуцируемым линиями клеток млекопитающих и других. Сконструированная мутация этих остатков может обеспечить эти преимущества в устойчивости к действию протеаз.
В других аспектах изобретения предложен способ рекомбинантного продуцирования внеклеточных белков ДНКаз, включая их варианты, описанные в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в способе используется экспрессионная система, не относящаяся к млекопитающим, например эукариотическая экспрессионная система, не относящаяся к млекопитающим, такая как Pichia pastoris. В некоторых вариантах осуществления Pichia pastoris кодирует фермент ДНКазу своим нативным сигналь
- 2 046216 ным пептидом, обеспечивающим секрецию из клеток-хозяев. В некоторых вариантах осуществления система экспрессии представляет собой систему экспрессии клеток млекопитающих, такую как клетки яичника китайского хомячка (СНО).
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная система экспрессии имеет делецию или инактивацию одной или более протеаз, которые расщепляют парные основные аминокислоты. Примеры ферментов включают фурин (экспрессируемый клетками СНО) и аспарагиновую протеиназу 3 (Ysp1) и кексин (Kex2), экспрессируемые Pichia pastoris. В некоторых вариантах осуществления эти ферменты не являются генетически удаленными или инактивированными, но их активность ингибируется ингибитором протеазы во время продуцирования рекомбинантного белка.
В некоторых вариантах осуществления среда для выращивания клеток экспрессионной системы, не относящейся к млекопитающим, или экспрессионной системы млекопитающих, дополнена полианионами, такими как сульфат декстрана, гепарины, цитрат железа и ЭДТА. В дополнительных вариантах осуществления среда для выращивания Pichia pastoris или другой экспрессионной системы дополнена сульфатом декстрана, который имеет среднюю молекулярную массу от 5 до 100 кДа. Например, полианион может быть добавлен к культуре в количестве, достаточном для образования комплекса с продуцируемым рекомбинантным белком. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные внеклеточные белки ДНКазы и их варианты из культуральной среды системы экспрессии не млекопитающих или системы экспрессии млекопитающих очищают способом, который включает диссоциацию рекомбинантных внеклеточных белков и вариантов ДНКазы из полианионов, таких как сульфат декстрана, гепарины и ЭДТА.
В других аспектах изобретения предложены выделенные полинуклеотиды, кодирующие варианты D1, D1L1, D1L2 или D1L3, а также векторы и клетки-хозяева. Полинуклеотиды могут кодировать мРНК или ДНК. Клетки-хозяева могут быть клетками рекомбинантной системы экспрессии, включая бактериальные или эукариотические, независимо от того, относятся ли они к не млекопитающим, такие как Pichia pastoris, или млекопитающим, такие как клетки CHO. В других вариантах осуществления клеткахозяин может быть доставлена для терапии ДНКазой. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения предложены клетки-хозяева, например клетки человека, например лейкоциты, модифицированные для секреции одного или более внеклеточных белков ДНКазы, описанных в данном документе, и предназначенные для введения в качестве лекарственного средства.
В изобретении также предложены фармацевтические композиции, содержащие внеклеточный белок ДНКазы или его вариант, как описано в данном документе, или, необязательно, полинуклеотид или вектор, как описано, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция может быть составлена для любого пути введения.
В других аспектах изобретения предложен способ лечения субъекта, нуждающегося в деградации внеклеточной ДНК, деградации внеклеточного хроматина, деградации внеклеточной ловушки (ЕТ) и/или деградации внеклеточной ловушки нейтрофилов (NET), путем введения терапевтически эффективного количества внеклеточной ДНКазы или ее варианта или композиции, описанной в данном документе.
Другие аспекты и варианты осуществления данного изобретения будут очевидны из следующего подробного описания.
Описание графических материалов
На фиг. 1 показано, что мутации Q101R и Q282_S305delinsK в SEQ ID NO: 4 увеличивают активность ДНКаза1Е3 по деградации высокомолекулярного хроматина. Клетки СНО временно трансфицировали с помощью ДНКаза1Е3 или ДНКаза1Ь3 дикого типа с заменами структурных блоков. Супернатанты трансфицированных клеток инкубировали с очищенными ядрами (высокомолекулярный хроматин) или буфером. ДНК выделяли и анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. На фигуре показан агарозный гель, окрашенный красителем для выявления ДНК.
На фиг. 2 показана характеристика двух вариантов ДНКаза1Ь3. Различные концентрации супернатантов клеток СНО, трансфицированных ДНКазаГЕ3 или ДНКаза1Е3 дикого типа с мутацией Q101R или Q282_S305delinsK, анализировали с помощью вестерн-блот анализа (WB) с использованием антител к ДНКаза1Ь3. Более широкая (вариант 1) и более тонкая (вариант 2) полосы были обнаружены в образцах с ДНКаза1Ь3 дикого типа и мутантом Q101R. В образцах с мутантом Q282_S305delinsK была обнаружена только более тонкая полоса (вариант 2). Параллельно анализировали активность по деградации хроматина при различных концентрациях супернатантов. На фигуре показана ДНК, проанализированная с помощью электрофореза в агарозном геле. Обе мутации, Q101R или Q282_S305delinsK, увеличивали активность по деградации хроматина по сравнению с ДНКаза1Ь3 дикого типа.
На фиг. 3 показано присутствие вариантов 1 и 2 ДНКаза1Ь3 в супернатантах клеток СНО, которые были стабильно трансфицированы с помощью ДНКаза1Ь3 дикого типа. Образцы анализировали с помощью вестерн-блот анализа (WB) с использованием антител к ДНКаза1Ь3. Более широкая (вариант 1) и более тонкая (вариант 2) полосы были обнаружены в 5 клонах.
На фиг. 4 показаны С-концевые аминокислотные последовательности рекомбинантно экспрессируемого D1L3 дикого типа в Pichia pastoris для идентификации часто встречающихся сайтов расщепления. Аминокислотное секвенирование очищенного D1L3 дикого типа выявило три мутанта с делецией
- 3 046216
С-конца: K291_S305del, K292_S305del и S293_S305del. С-конец D1L3 дикого типа не был обнаружен. Параллельно анализировали активность по деградации хроматина при различных концентрациях очищенного белка и сравнивали с очищенным белком ДНКаза1 (D1) и ДНКаза1Ь3 с удаленным основным доменом (BDD-D1L3) с мутацией F275Y/F279_K280delinsVM/Q282_S305delinsK. На фигуре показана ДНК, проанализированная с помощью электрофореза в агарозном геле.
На фиг. 5 показано, что добавление сульфата декстрана к среде выращивания CHO улучшает выход белка. Стабильные пулы клеток СНО, экспрессирующих D1L3 дикого типа, инкубировали в стандартной среде выращивания СНО или среде выращивания СНО с добавлением сульфата декстрана. Супернатант анализировали с помощью вестерн-блот анализа (WB) с использованием антител к ДНКаза1Ь3. На фигуре показано, что D1L3 плохо экспрессируется в клетках СНО с низким выходом белка. Добавление сульфата декстрана увеличивает выход, но не предотвращает фрагментацию продуктов.
На фиг. 6 показано использование поверхности анионного обмена и поверхности катионного обмена для аффинной очистки комплекса D1L3 с сульфатом декстрана.
На фиг. 7 перечислены стратегии мутации сайта расщепления трипсином для ограничения деградации D1L3.
На фиг. 8 показано сравнение аминокислотных последовательностей D1 человека (SEQ ID NO: 1) и D1L3 человека (SEQ ID NO: 4) с показанными плазмин-чувствительными остатками KR.
На фиг. 9 показаны стратегии мутации сайта расщепления плазмином для ограничения деградации D1L3.
На фиг. 10 показано, что D1L3 с мутированными сайтами расщепления плазмином сохраняет ферментативную активность. Супернатанты с клеток, которые были временно трансфицированы с помощью ДНКаза1Ь3, содержащие мутации в четырех предполагаемых сайтах расщепления плазмином (K180_A181delinsGL, P198_A201delinsRPSQ, K259A, R285A), инкубировали с очищенными ядрами (высокомолекулярный хроматин) или буфером. ДНК выделяли и анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. На фигуре показан агарозный гель, окрашенный красителем для выявления ДНК.
На фиг. 11 перечислены сайты расщепления плазмином, на основе их расщепления плазмином, и показаны стратегии мутации для ограничения деградации D1L3.
На фиг. 12A, B показано, что D1L3 имеет склонность к неправильной укладке при экспрессии в клетках СНО. На фиг. 12A показан простой вектор экспрессии для экспрессии D1L3 с использованием природного секреторного сигнального пептида. Супернатанты стабильных пулов анализировали с помощью вестерн-блот анализа с использованием антитела к ДНКаза1Ь3. и на фиг. 12B показано присутствие агрегатов с высокой молекулярной массой в невосстанавливающих условиях, которые разделяются в восстанавливающих условиях.
На фиг. 13 показано сравнение аминокислотных последовательностей D1 человека (SEQ ID NO: 1) и D1L3 человека (SEQ ID NO: 4) с показанными консервативными и неконсервативными остатками цистеина.
На фиг. 14 перечислены остатки цистеина в D1L3 и показаны стратегии мутаций для ограничения образования высокомолекулярных агрегатов во время экспрессии белка.
На фиг. 15 показано, что мутации C68A и C194A в D1L3 не влияют на активность по деградации хроматина. Мутации C24A и C52A подавляли активность по деградации хроматина. Супернатанты с клеток, которые были временно трансфицированы мутированными вариантами ДНКазаГЬЗ, инкубировали с очищенными ядрами или буфером. ДНК выделяли и анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. На фигуре показан агарозный гель, окрашенный красителем для выявления ДНК.
На фиг. 16A показана экспрессия D1L3 в Pichia pastoris с использованием либо нативного секреторного сигнала, либо α-фактора спаривания из Saccharomyces cerevisiae (aMF). Секреторный сигнал aMF привел к гликозилированию и непроцессингу сигнального пептида (фиг. 16B).
На фиг. 17A показаны гибридная конструкция aMF, альбумина сыворотки человека (HSA), линкерной последовательности и D1L3. Гибридная конструкция не поддавалась гликозилированию в системе экспрессии P. pastoris (фиг. 17В) и сохраняет активность по деградации хроматина (фиг. 17С).
На фиг. 18 показано уровни экспрессии слитых конструкций альбумина сыворотки человека (HSA) с ДНКазаШЗ с удаленным основным доменом (BDD-D1L3) или ДНКазаШЗ дикого типа (D1L3) в Pichia pastoris. HSA сливается либо с N-, либо с C-концом BDD-D1L3 или D1L3. Две линкерные последовательности, L1 и L2, помещали между HSA и BDD-D1L3 или D1L3.
На фиг. 19 показано уровни экспрессии слитых конструкций альбумина сыворотки человека (HSA) с ДНКазаШ.З дикого типа (D1L3) в Pichia pastoris. HSA сливается с N-концом D1L3. Три разные линкерные последовательности (L2, L3, L4) помещали между HSA и D1L3.
На фиг. 20 показано уровни экспрессии и активность по деградации хроматина слитых конструкций альбумина сыворотки человека (HSA) с основным доменом DNASE1L3 (BDD-D1L3), продуцируемых в Pichia pastoris. HSA сливается с N-концом BDD-D1L3. Три разные линкерные последовательности (L5, L6, L7) помещали между HSA и D1L3.
На фиг. 21А показано, что мышей Dnase1-/-Dnase1l3-/-, инъецированных SED ID NO: 14 и SEQ ID NO: 19, проявлялась аналогичная активность по деградации хроматина в сыворотке.
- 4 046216
На фиг. 21B показано, что период полувыведения SEQ ID NO: 19 в кровотоке у мышей, экспрессирующих человеческий рецептор FcRn, составляет 3,3 дня.
На фиг. 22 показано уровни экспрессии и активность по деградации хроматина слитых конструкций альбумина сыворотки человека (HSA) с основным доменом ДНКазаН3 (BDD-D1L3), продуцируемых в Pichia pastoris. HSA сливается с N- и C-концом BDD-D1L3. Две разные линкерные последовательности (L7 и L8) помещали между HSA и BDD-D1L3.
На фиг. 23 показана гибридная конструкция HSA и линкер, расщепляемый фактором XIIa. Показаны последовательности линкера, содержащего последовательность человеческого фактора XI (SEQ ID NO: 42), и линкера, содержащего последовательность человеческого прекаллекреина (SEQ ID NO: 44).
На фиг. 24 показаны другие конструкции, в которых используются линкеры, расщепляемые фактором XIIa, для слитых белков с увеличенным периодом полувыведения, в том числе внеклеточных ДНКаз человека, факторов свертывания крови человека и факторов комплемента человека.
Описание изобретения
В данном изобретении предложены кандидаты для конструирования внеклеточных белков ДНКаз человека (например, варианты ДНКазы 1 (D1), ДНКаза1-подобный белок 1 (D1L1), ДНКаза1-подобный белок 2 (D1L2), изоформа 1 ДНКаза1-подобного белка 3 (D1L3), изоформа 2 ДНКаза1-подобного белка 3 (D1L3-2), ДНКаза 2A (D2A) и ДНКаза 2B (D2B)), которые можно использовать для лечения патологических состояний, характеризующихся накоплением и/или высвобождением внеклеточной ДНК, внеклеточного хроматина и нейтрофильной внеклеточной ловушки (NET). В соответствии с аспектами изобретения варианты ДНКазы, описанные в данном документе, более пригодные/или эффективны для терапии и/или более подходят для крупномасштабного производства. В некоторых вариантах осуществления варианты ДНКазы, описанные в данном документе, имеют преимущества для системной терапии. Такие преимущества включают более длительное воздействие (например, более медленное выведение, более длительный период полувыведения из кровообращения), увеличенную продолжительность фармакодинамического действия, улучшенную активность по деградации хроматина и устойчивость к действию протеаз.
Определения
Использование в данном описании и в формуле изобретения форм единственного числа включает ссылку на единственное и множественное число, если в контексте явно не указано иное. Таким образом, например, обозначение агент включает как один агент, так и множество таких агентов.
Термин хроматиназа относится к классу ферментов дезоксирибонуклеаз, которые проявляют более чем незначительную способность разрезать, расщеплять или перерабатывать хроматин, т.е. ДНК, связанную с одним или более гистоновыми белками. ДНКаза1Ь3 человека представляет собой хроматиназу. Обычно различные варианты белка ДНКаза1Ь3. описанные в данном документе, представляют собой хроматиназы. Не все ферменты ДНКазы являются хроматиназами. Например, ДНКаза1 человека практически не имеет способности разрезать, расщеплять или перерабатывать хроматин и не является хроматиназой.
Используемый в данном документе термин время полужизни в отношении лекарственного средства относится к периоду полувыведения концентрации лекарственного средства у животного, измеренной в представляющей интерес матрице, например, в сыворотке или плазме. Специалисту в данной области техники понятно, что не все лекарственные средства демонстрируют кинетику первого порядка или проявляют ее на всех этапах выведения. В таких случаях специалисту в данной области техники понятно, что термины продление периода полувыведения или увеличенный период полувыведения являются выражениями, которые относятся к более медленной скорости выведения.
Выделенный означает измененное или удаленное из естественного состояния. Например, нуклеиновая кислота или пептид, естественно присутствующие в живом существе, не являются выделенными, однако эта же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от сосуществующих материалов в естественном состоянии, будут выделенными. Выделенная нуклеиновая кислота или белок могут существовать по существу в очищенной форме или могут существовать в чужеродной среде, такой как, например, клетка-хозяин.
В контексте данного описания термин внеклеточная ловушка нейтрофилов и аббревиатура NET относятся к сети внеклеточных волокон, содержащих ядерное содержимое, например ДНК, связанную с гистоновыми белками, которые выделяются из иммунной клетки, обычно нейтрофила, запрограммированным образом.
Если не указано иное, нуклеотидная последовательность или нуклеиновая кислота, кодирующая аминокислотную последовательность, включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными версиями друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Фраза нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок или РНК, также может включать в себя интроны в той мере, что нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, может в некоторых версиях содержать интрон(ы).
Термины примерно и приблизительно включают количество, которое составляет ±10% от соот
- 5 046216 ветствующего числового значения.
Термин внеклеточная ДНКаза относится к внеклеточным белкам ДНКазам семейства ДНКаза 1 и ДНКаза 2 (например, ДНКаза 1 (D1), ДНКаза1-подобный белок 1 (D1L1), ДНКаза1-подобный белок 2 (D1L2), изоформа 1 ДНКаза1-подобного белка 3 (D1L3), изоформа 2 ДНКаза1-подобного белка 3 (D1L3-2), ДНКаза 2A (D2A) и ДНКаза 2B (D2B)).
В некоторых аспектах и вариантах осуществления внеклеточная ДНКаза или ее вариант являются гибридными, необязательно посредством вставленного линкера, с фрагментом, увеличивающим периодом полувыведения, таким как альбумин, трансферрин, Fc или эластиноподобный белок, или его вариант. См., например, патент США № 9458218, который включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная ДНКаза или ее вариант димеризуется шарнирной областью иммуноглобулина. Например, сконструированные ферменты, описанные в данном документе, могут также включать слияние с Fc-доменом (например, шарнирным доменом и доменами CH2 и доменами CH3 иммуноглобулина). В некоторых вариантах осуществления ДНКаза (например, вариант D1L3) слита с аминокислотной последовательностью или доменом альбумина, например с альбумином человека или его фрагментом или вариантом. См., например, WO 2015/066550 и патент США № 9221896, которые в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки. Альбумин может быть присоединен к ДНКазе, необязательно с помощью вставленного линкера, на N-конце и/или С-конце сконструированной внеклеточной ДНКазы или ее варианта. Типичная аминокислотная последовательность альбумина представлена в виде SEQ ID NO: 39. В некоторых вариантах осуществления D1L3 и D1 или варианты, описанные в данном документе, вместе димеризуются шарнирной Fc-областью, создавая димерную молекулу с синергетическими функциональными свойствами для деградации NET. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная ДНКаза или ее вариант слит на N-конце с аминокислотной последовательностью альбумина через пептидный линкер. Пептидный линкер может быть гибким линкером, жестким линкером или в некоторых вариантах осуществления физиологически расщепляемым линкером (например, линкером, расщепляемым протеазой). В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину от 5 до 100 аминокислот или от 5 до 50 аминокислот. В других вариантах осуществления линкер представляет собой органическую молекулу, группу, полимер (например, ПЭГ) или химический фрагмент, который ковалентно связан с внеклеточной ДНКазой и фрагментом, увеличивающим период полувыведения (например, альбумином).
В некоторых аспектах изобретение относится к варианту D1L3, где вариант D1L3 имеет один или более из следующих элементов: повышенная стабильность белка, более медленное выведение лекарственного средства и увеличенная продолжительность фармакодинамической активности, устойчивость к протеолитической деградации, более высокие уровни продукции в системах экспрессии in vitro, лучшая пригодность для очистки, но не существенно меньшая, такая же или лучшая активность по деградации хроматина и/или NET по сравнению с изоформой 1 D1L3 фермента дикого типа с SEQ ID NO:4 или изоформой 2 D1L3 фермента дикого типа с SEQ ID NO:5. В контексте данного описания, если не указано иное, термин D1L3 включает как изоформу 1, так и изоформу 2.
Активность фермента по деградации ДНК, и/или хроматина, и/или NET, например, варианта D1L3 можно измерить in vitro, например, путем инкубации фермента с ДНК, хроматином или NET, полученными, например, из очищенных ядер, ДНК или крови ex vivo или нейтрофилов, индуцированных к образованию NET. В качестве альтернативы активность фермента по деградации ДНК, и/или хроматина, и/или NET, например, варианта D1L3 может быть измерена in vivo, например, введением фермента субъекту, при этом субъект продуцирует внеклеточную ДНК, хроматин или NET или индуцирует их продуцирование и измерения влияния фермента на концентрации ДНК, хроматина или уровней NET в матрице, например в сыворотке, предпочтительно с параллельным отрицательным контролем, или путем временного сравнения концентраций до и после введения фермента.
В некоторых вариантах осуществления вариант D1L3 имеет примерно такую же активность по деградации хроматина и/или NET по сравнению с изоформой 1 фермента D1L3 дикого типа с SEQ ID NO: 4 или изоформой 2 фермента D1L3 дикого типа с SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления вариант D1L3 обладает более высокой активностью по деградации хроматина и/или NET по сравнению с изоформой 1 фермента D1L3 дикого типа с SEQ ID NO: 4 или изоформой 2 фермента D1L3 дикого типа с SEQ ID NO: 5.
В некоторых вариантах осуществления вариант D1L3 представляет собой слитый белок, содержащий домен альбумина, необязательный линкер и домен D1L3. В некоторых вариантах осуществления домен альбумина и необязательный линкер расположены на N-концевой стороне домена D1L3. В некоторых вариантах осуществления домен альбумина и необязательный линкер расположены на C-концевой стороне домена D1L3. Во всех таких вариантах осуществления необязательный линкер расположен между доменом альбумина и доменом D1L3.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность или домен слитого белка альбумина по меньшей мере примерно на 75%, или по меньшей мере примерно на 80%, или по меньшей мере примерно на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична эталонной последовательности
- 6 046216 альбумина, определенной SEQ ID NO: 39. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность или домен альбумина содержит или состоит из эталонной последовательности альбумина, определенной SEQ ID NO: 39. В различных вариантах осуществления аминокислотная последовательность альбумина связывается с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), например FcRn человека. Аминокислотная последовательность альбумина может быть вариантом HSA дикого типа (например, представленным SEQ ID NO: 39). В различных вариантах осуществления варианты альбумина могут иметь от одной до двадцати или от одной до десяти аминокислотных модификаций, независимо выбранных из делеций, замен и вставок по отношению к SEQ ID NO: 39. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность альбумина представляет собой любую аминокислотную последовательность альбумина млекопитающего.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность или домен альбумина представляет собой фрагмент полноразмерного альбумина, представленного SEQ ID NO: 39. Термин фрагмент, при применении в контексте альбумина, относится к любому фрагменту полноразмерного альбумина или его варианту (как описано выше), который продлевает время полужизни фермента ДНКазы, с которым он слит или конъюгирован, относительно соответствующей неслитой ДНКазы. В некоторых вариантах осуществления фрагмент альбумина может относиться к аминокислотной последовательности, содержащей слияние нескольких доменов альбумина (см., например, WO 2011/124718), таких как домены I и III, а также домены II и III. Обычно фрагмент альбумина содержит по меньшей мере примерно 100 аминокислот или по меньшей мере примерно 200 или по меньшей мере примерно 300 аминокислот полноразмерной последовательности. В различных вариантах осуществления фрагмент альбумина сохраняет способность связывать FcRn человека.
В некоторых вариантах осуществления D1L3-подобный домен слитого белка по меньшей мере примерно на 85%, или по меньшей мере примерно на 90%, или по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 97%, или по меньшей мере примерно на 98%, или по меньшей мере примерно на 99% идентичен эталонной последовательности зрелого фермента D1L3, определенной SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления домен D1L3 содержит или состоит из эталонной последовательности, определенной SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления эталонная последовательность не содержит С-концевой основной домен SEQ ID NO: 4 или 5, определяемый С-концевыми 23 аминокислотами.
В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит домен D1L3, где аминокислотная последовательность домена D1L3 по меньшей мере примерно на 80% идентична зрелому ферменту, определенному SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5. Слитый белок может дополнительно содержать аминокислотную последовательность или домен альбумина на N-конце зрелого фермента и связывающую аминокислотную последовательность между аминокислотной последовательностью альбумина и аминокислотной последовательностью зрелого фермента. В некоторых вариантах осуществления домен D1L3 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 90% идентична эталонной последовательности зрелого фермента, определенной SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления эталонная последовательность не содержит С-концевой основной домен SEQ ID NO: 4 или 5, определяемый С-концевыми 23 аминокислотами. Слитый белок, содержащий домен D1L3, демонстрирует улучшенное время полужизни в кровотоке и продолжительность фармакодинамического эффекта, в том числе для системной терапии. Кроме того, слияние альбумина со связывающей последовательностью не оказывает существенного влияния (или в некоторых вариантах осуществления не оказывает какого-либо отрицательного воздействия) на активность по деградации хроматина, как определено с помощью анализа деградации хроматина in vitro, по сравнению с вариантом без слияния с альбумином.
Подразумевается, что идентичность последовательностей с ферментами ДНКазы дикого типа, и если не указано иное, относится к зрелым ферментам, лишенным сигнального пептида. Кроме того, если не указано иное, для ясности положения аминокислот пронумерованы относительно полностью транслируемой последовательности ДНКазы, включая сигнальный пептид. Соответственно, например, ссылка на идентичность последовательности фермента SEQ ID NO: 4 (D1L3 человека, изоформа 1) относится к процентной идентичности со зрелым ферментом, имеющим M21 на N-конце. Точно так же ссылка на идентичность последовательности фермента SEQ ID NO: 1 (D1 человека) относится к процентной идентичности со зрелым ферментом, имеющим L23 на N-конце.
В некоторых вариантах осуществления D1L3 имеет делецию всего или части С-концевого основного домена. C-концевой основной домен определяется как C-концевые 23 аминокислоты SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5. Делеция или инактивация С-концевого основного домена D1L3 существенно улучшает активность по деградации хроматина. См. фиг. 1, 2 и 4. В некоторых вариантах осуществления вариант D1L3 имеет делецию С-концевых аминокислот основного домена, например по меньшей мере 5 аминокислот, или в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 10 аминокислот, или в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 15 аминокислот, или в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 20 аминокислот С-концевого основного домена. В некоторых вариантах осуществления вариант D1L3 имеет делецию всего С-концевого основного домена, определяемого 23 С-концевыми
- 7 046216 аминокислотами SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5. Примеры делеций BD включают Q282_S305delinsK (см. SEQ ID NO: 9), S305delinsK (см. SEQ ID NO: 10), K292_S305del (см. SEQ ID NO: 11) и S293_S305del (см. SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах осуществления C-конец домена D1L3 (имеющий делецию BD) содержит от 1 до 10 или от 1 до 5 аминокислот на C-конце, которые не совпадают с C-концом BD и не влияют отрицательно на активность по деградации хроматина в анализе in vitro.
В некоторых вариантах осуществления вариант D1L3 представляет собой сконструированный слитый белок, содержащий: домен ДНКАзи1Ь3 последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 16; линкер последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 31 - SEQ ID NO: 38; и домен альбумина, имеющий последовательность SEQ ID NO: 39 или варианты или фрагмент, как описано. В некоторых вариантах осуществления вариант D1L3 имеет одну или более замен структурными блоками D1, которые описаны в PCT/US2018/04708, который включен в данный документ посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления последовательность или домен D1L3 содержит замену структурным блоком D1, которая может быть выбрана из одного или нескольких из: M21_R22delinsLK, C24_S25delinsAA, V28_S30delinsIQT, S34T, Q36_V44delinsMSNATLVSY, K47_K50delinsQILS, C52Y, I55_M58delinsIALVQE, I60_K61delinsVR, N64_I70delinsHLTAVGK, M72_K74delinsLDN, R77_I83delinsQDAPD, N86H, I89V, S91_R92delinsEP, T97S, Q101R, A103L, L105V,
K107_L110delinsRPDQ, V113_R115delinsAVD, H118Y, H120D, Y122_A127delinsGCEPCGN, V129T, S131N, F135_V136delinsAI, W138R, Q140_H143delinFSRF, A145_D148delinsEVRE, V150A, I152V, T156_T157delinsAA, E159_S161delinsGDA, K163A, E167A, V169_E170delinsYD, T173L,
K176_R178delinsQEK, K180_A181delinsGL, N183_F186delinsDVML, P198_A201delinsRPSQ, K203_N204delinsSS, R208W, D210S, R212T, V214Q, G218P, Q220_E221delinsSA, V225_S228delinsATP, N230H, L238_R239delinsVA, Q241_S246delinsMLLRGA, K250D, N252_V254delinsALP, D256N, K259A, K262G, T264_E267delinsSDQL, L269_V271delinsQAI, F275Y, F279_K280delinsVM, Q282_S205delinsK, где каждая из вышеуказанных замен пронумерована в соответствии с SEQ ID NO: 4.
Например, вариант D1L3 может иметь замену структурным блоком D1 Q282_S305delinsK, которая включает удаление C-концевого основного домена, который отсутствует в D1. В некоторых вариантах осуществления фермент D1L3 имеет аминокислотную замену в положении, соответствующем положению 101 SEQ ID NO: 4. Замена может быть Arg на основе соответствующего структурного блока из D1 или в некоторых вариантах осуществления может быть Lys. Замены в этом положении могут усиливать активность D1L3 по деградации хроматина. Другие замены в этой позиции, вероятно, будут иметь аналогичные свойства.
Линкеры, если они присутствуют, могут быть выбраны из гибких, жестких и расщепляемых пептидных линкеров. Гибкие линкеры преимущественно или полностью состоят из остатков небольших, неполярных или полярных аминокислот, таких как Gly, Ser и Thr. Типичный гибкий линкер содержит (GlyySer)n линкеры, где y обозначает число от 1 до 10 (например, от 1 до 5) и n обозначает число от 1 до примерно 10, а в некоторых вариантах осуществления обозначает число от 3 до примерно 6. В примерных вариантах осуществления y обозначает число от 2 до 4, а n обозначает число от 3 до 8. Из-за своей гибкости эти линкеры неструктурированы. Более жесткие линкеры включают мотивы полипролина или поли Pro-Ala и α-спиральные линкеры. Типичным примером α-спирального линкера является A(EAAAK)nA, где n имеет значения, указанные выше (например, от 1 до 10 или от 2 до 6). Обычно линкеры могут состоять преимущественно из аминокислот, выбранных из Gly, Ser, Thr, Ala и Pro. Типичные линкерные последовательности содержат по меньшей мере 10 аминокислот и могут находиться в диапазоне от 15 до 35 аминокислот. Типичные конструкции линкеров представлены как SEQ ID NO: 31-38.
В некоторых вариантах осуществления вариант содержит линкер, где аминокислотная последовательность линкера состоит преимущественно из остатков глицина и серина или состоит в основном из остатков глицина и серина. В некоторых вариантах осуществления соотношение Ser и Gly в линкере составляет, соответственно, от примерно 1:1 до примерно 1:10, от примерно 1:2 до примерно 1:6 или примерно 1:4. Типичные линкерные последовательности содержат S(GGS)4GSS (SEQ ID NO: 36), S(GGS)9GS (SEQ ID NO: 37), (GGS)9GS (SEQ ID NO: 39). В некоторых вариантах осуществления линкер содержит по меньшей мере 10 аминокислот, или по меньшей мере 15 аминокислот, или по меньшей мере 20 аминокислот, или по меньшей мере 25 аминокислот. Например, линкер может иметь длину от 15 до 30 аминокислот. В различных вариантах осуществления более длинные линкеры, содержащие по меньшей мере 15 аминокислот, могут обеспечивать улучшение продуктивности при экспрессии в Pichia pastoris. См. фиг. 20. Кроме того, что неожиданно, более длинные линкерные последовательности показали улучшенную активность по деградации хроматина по сравнению с более короткими линкерными последовательностями. См. фиг. 20.
В различных вариантах осуществления вариант D1L3 представляет собой слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-30. В других вариантах осуществления вариант D1L3 представляет собой слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-30 и имеющий от одной до двадцати, или от одной до десяти, или от одной до пяти аминокислотных модификаций, независимо выбранных из аминокислотных вставок, делеций или замен относительно эталонной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 17-30. В некоторых вари
- 8 046216 антах осуществления аминокислотные модификации находятся в домене D1L3, домене альбумина или в обоих доменах слитого белка. В некоторых вариантах осуществления вариант имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. В этих вариантах осуществления аминокислотная последовательность альбумина слита с N-концом или N-концевой стороной D1L3 (или варианта) через средний или длинный гибкий линкер.
В других вариантах осуществления линкер представляет собой физиологически расщепляемый линкер, такой как линкер, расщепляемый протеазой. Например, протеаза может быть протеазой системы коагуляции, такой как активированный фактор XII. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность фактора XI (SEQ ID NO:42) и/или прекалликреина (SEQ ID NO:44 или 45) или его физиологически расщепляемый фрагмент. В выбранных вариантах осуществления линкерная аминокислотная последовательность из фактора XI содержит всю или части SEQ ID NO: 42 (например, части SEQ ID NO: 42, включая модификации SEQ ID NO: 42, которые допускают расщепление фактором XIIa). В некоторых вариантах осуществления линкерная аминокислотная последовательность из прекалликреина содержит всю или части SEQ ID NO: 44 (например, части SEQ ID NO: 44, включая модификации SEQ ID NO: 44, которые допускают расщепление фактором XIIa). В других вариантах осуществления линкер содержит пептидную последовательность, которая расщепляется нейтрофильной специфической протеазой, такой как эластаза нейтрофилов, катепсин G и протеиназа 3.
Некоторые примерные варианты осуществления слитых белков D1L3 содержат комбинацию трех аминокислотных последовательностей, которые могут быть независимо выбраны из последовательностей, раскрытых в данном документе, и такие последовательности, расположенные в порядке от N-конца до C-конца:
Слияние 1: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:39;
Слияние 2: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:39;
Слияние 3: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:39;
Слияние 4: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:39;
Слияние 5: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:39;
Слияние 6: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:39;
Слияние 7: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:39;
Слияние 8: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:39;
Слияние 9: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:39;
Слияние 10: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39;
Слияние 11: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39;
Слияние 12: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39;
Слияние 13: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39;
Слияние 14: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39;
Слияние 15: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39;
Слияние 16: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39;
Слияние 17: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39;
Слияние 18: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39;
Слияние 19: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39;
Слияние 20: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39;
Слияние 21: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39;
Слияние 22: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39;
Слияние 23: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39;
Слияние 24: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39;
Слияние 25: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39;
Слияние 26: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39;
Слияние 27: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39;
Слияние 28: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39;
Слияние 29: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39;
Слияние 30: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39;
Слияние 31: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39;
Слияние 32: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39;
Слияние 33: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39;
Слияние 34: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39;
Слияние 35: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39;
Слияние 36: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39;
Слияние 37: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39;
Слияние 38: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39;
Слияние 39: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39;
- 9 046216
| Слияние 40 | SEQ ID NO | 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 41 | SEQ ID NO | 13, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 42 | SEQ ID NO | 14, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 43 | SEQ ID NO | 15, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 44 | SEQ ID NO | 16, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 45 | SEQ ID NO | 4, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 46 | SEQ ID NO | 5, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 47 | SEQ ID NO | 8, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 48 | SEQ ID NO | 9, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 49 | SEQ ID NO | 10, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 50 | SEQ ID NO | 11, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 51 | SEQ ID NO | 12, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 52 | SEQ ID NO | 13, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 53 | SEQ ID NO | 14, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 54 | SEQ ID NO | 15, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 55 | SEQ ID NO | 16, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 56 | SEQ ID NO | 4, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 57 | SEQ ID NO | 5, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 58 | SEQ ID NO | 8, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 59 | SEQ ID NO | 9, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 60 | SEQ ID NO | 10, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 61 | SEQ ID NO | 11, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 62 | SEQ ID NO | 12, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 63 | SEQ ID NO | 13, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 64 | SEQ ID NO | 14, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 65 | SEQ ID NO | 15, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 66 | SEQ ID NO | 16, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 67 | SEQ ID NO | 4, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 68 | SEQ ID NO | 5, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 69 | SEQ ID NO | 8, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 70 | SEQ ID NO | 9, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 71 | SEQ ID NO | 10, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 72 | SEQ ID NO | 11, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 73 | SEQ ID NO | 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 74 | SEQ ID NO | 13, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 75 | SEQ ID NO | 14, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 76 | SEQ ID NO | 15, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 77 | SEQ ID NO | 16, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 78 | SEQ ID NO | 4, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 79 | SEQ ID NO | 5, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 80 | SEQ ID NO | 8, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 81 | SEQ ID NO | 9, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 82 | SEQ ID NO | 10, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 83 | SEQ ID NO | 11, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 84 | SEQ ID NO | 12, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 85 | SEQ ID NO | 13, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 86 | SEQ ID NO | 14, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 87 | SEQ ID NO | 15, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 88 | SEQ ID NO | 16, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 89 | SEQ ID NO | 4, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 90 | SEQ ID NO | 5, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 91 | SEQ ID NO | 8, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 92 | SEQ ID NO | 9, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 93 | SEQ ID NO | 10, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 94 | SEQ ID NO | 11, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 95 | SEQ ID NO | 12, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 96 | SEQ ID NO | 13, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 97 | SEQ ID NO | 14, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 98 | SEQ ID NO | 15, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; |
| Слияние 99 | SEQ ID NO | 16, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39; |
Слияние 100: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39;
Слияние 101: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39;
- 10 046216
Слияние 102: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39;
Слияние 103: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39;
Слияние 104: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39;
Слияние 105: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39;
Слияние 106: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39;
Слияние 107: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39;
Слияние 108: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39;
Слияние 109: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39;
Слияние 110: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39;
Слияние 111: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39;
Слияние 112: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39;
Слияние 113: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39;
Слияние 114: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39;
Слияние 115: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39;
Слияние 116: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39;
Слияние 117: SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39;
Слияние 118: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39;
Слияние 119: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39;
Слияние 120: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39;
Слияние 121: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 39;
Слияние 122: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39;
Слияние 123: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39;
Слияние 124: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39;
Слияние 125: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39;
Слияние 126: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39;
Слияние 127: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39;
Слияние 128: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39;
Слияние 129: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39;
Слияние 130: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39;
Слияние 131: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39;
Слияние 132: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 39;
В некоторых вариантах осуществления слитый белок синтезируется с сигнальным пептидом. Сигнальный пептид может быть удален во время секреции из клетки-хозяина. Типичные сигнальные пептиды показаны в SEQ ID NO: 4-16 и SEQ ID NO: 44-46. В некоторых вариантах осуществления слитый белок представляет собой зрелый белок, т.е. без сигнального пептида.
В различных вариантах осуществления слитый белок выбран из слитых белков от 1 до 132, и выбранный слитый белок может необязательно иметь до 20 (или до 10) аминокислотных модификаций, независимо выбранных из аминокислотных делеций, вставок и замен.
В некоторых аспектах изобретения предложены варианты внеклеточных ферментов ДНКазы, сконструированные так, чтобы иметь преимущества при производстве, обеспечивая производство рекомбинантного фермента, подходящего для использования в терапии и который необязательно может быть использован в связи с вариантами осуществления слитого белка (включая варианты осуществления слияния с альбумином), как уже было описано. В различных вариантах осуществления изобретения предложены рекомбинантные варианты D1, D1L1, D1L2 и D1L3, содержащие одну или более аминокислотных замен или делеций по остаткам цистеина, что приводит к снижению внутри- и межмолекулярного поперечного сшивания через дисульфидные мостики во время экспрессии белка. Например, вариант ДНКазы может не иметь одного, двух или трех остатков цистеина, присутствующих в последовательности дикого типа (например, один, два или три остатка цистеина удалены), или может содержать один или более таких цистеиновых остатков, замещенных другой аминокислотой(ами). В некоторых вариантах осуществления один или более остатков цистеина заменены аминокислотой, независимо выбранной из Ala, Gly и Ser, или один или более остатков цистеина заменены как часть замены структурного блока. В некоторых вариантах осуществления один или более замещенных остатков цистеина являются не консервативными между другими членами семейства белков D1 (например, D1, D1L1, D1L2 и D1L3). В некоторых вариантах осуществления сконструированный фермент содержит или дополнительно содержит по меньшей мере одну замену структурного блока из другого члена семейства белков D1 и/или другую точечную мутацию, которая повышает стабильность белка, устойчивость к расщеплению протеазами, биодоступность и, по существу, такая же или лучшая активность по деградации ДНК и/или хроматина и/или NET (in vitro или in vivo) по сравнению с ферментом дикого типа. В некоторых вариантах осуществления замены и/или модификации включают, среди других модификаций, только единственную модификацию остатков цистеина. В некоторых вариантах осуществления удаления одного остатка цистеина достаточно для получения значительных преимуществ при производстве.
В других аспектах изобретения предложены варианты внеклеточных ДНКаз сконструированные
- 11 046216 так, чтобы иметь преимущества в устойчивости к протеазам, для улучшения периода полувыведения in vivo, а также для снижения протеолиза во время продуцирования рекомбинантного фермента. В данном изобретении идентифицировано, например, остатки D1L3, которые чувствительны к протеолизу плазмином, тромбином и/или трипсином, а также остатки (например, парные основные аминокислоты), которые чувствительны к действию протеаз, продуцируемых линиями клеток млекопитающих и других.
Описанные в данном документе рекомбинантные внеклеточные варианты ДНКазы могут иметь комбинацию точечных мутаций, включая замены по остаткам цистеина, замены по остаткам, чувствительных к протеазе, и/или могут содержать одну или более замен на основании блоков. Конструирование структурных блоков белков (BBPE) описано в PCT/US18/47084 и US 62/800790, описания которых включены в данный документ посредством ссылки. BBPE включает обеспечивание выравнивания белок-белок донорных и реципиентных внеклеточных ферментов ДНКазы и идентификацию вариабельных аминокислотных последовательностей для переноса (структурный блок). Вариабельную аминокислоту(ы) фланкируют одной или более консервативными аминокислотами в донорных и реципиентных ферментах внеклеточных ДНКаз (против хода транскрипции и по ходу транскрипции структурного блока). Эти структурные блоки можно менять местами между реципиентным и донорским белками для получения химерного фермента.
В других аспектах изобретения предложен способ рекомбинантного продуцирования внеклеточных белков ДНКаз, включая их варианты, описанные в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в способе используется экспрессионная система, не относящаяся к млекопитающим, такая как Pichia pastoris. В отдельных вариантах осуществления Pichia pastoris кодирует фермент ДНКазу с нативным сигнальным пептидом, делая возможной секрецию из клеток-хозяев. В некоторых вариантах осуществления система экспрессии представляет собой систему экспрессии клеток млекопитающих, такую как клетки яичника китайского хомячка (СНО). В некоторых вариантах осуществления изобретения, удаляя остатки цистеина, ненужные для активности, изобретение позволяет избежать межмолекулярных и внутримолекулярных дисульфидных связей, которые в противном случае образуются и препятствуют рекомбинантному продуцированию. В некоторых вариантах осуществления значительное уменьшение ошибочных межмолекулярных и внутримолекулярных дисульфидных связей может быть достигнуто за счет замены одного остатка цистеина.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная система экспрессии имеет делецию или инактивацию одной или более протеаз, которые расщепляют парные основные аминокислоты. Примеры ферментов включают фурин (экспрессируемый клетками СНО) и аспарагиновую протеиназу 3 (Ysp1) и кексин (Kex2), экспрессируемые Pichia pastoris. В некоторых вариантах осуществления эти ферменты не являются генетически удаленными или инактивированными, но их активность ингибируется ингибитором протеазы во время продуцирования рекомбинантного белка.
В некоторых вариантах осуществления среда для выращивания клеток экспрессионной системы, не относящейся к млекопитающим, или экспрессионной системы млекопитающих, дополнена полианионами, такими как сульфат декстрана, гепарины, цитрат железа и ЭДТА. В дополнительных вариантах осуществления среда для выращивания Pichia pastoris или другой экспрессионной системы дополнена сульфатом декстрана, который имеет среднюю молекулярную массу от 5 до 100 кДа. В некоторых вариантах осуществления сульфат декстрана имеет среднюю молекулярную массу, которая составляет примерно 10 кДа или меньше, или примерно 20 кДа или меньше, или примерно 30 кДа или меньше, или примерно 40 кДа или меньше, или примерно 50 кДа или меньше, или примерно 75 кДа или меньше, или примерно 100 кДа или меньше. В различных вариантах осуществления полианион добавляют к культуре в количестве, достаточном для образования комплекса с продуцируемым рекомбинантным белком.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные внеклеточные белки ДНКазы и их варианты из культуральной среды системы экспрессии не млекопитающих или системы экспрессии млекопитающих очищают способом, который включает диссоциацию рекомбинантных внеклеточных белков и вариантов ДНКазы из полианионов, таких как сульфат декстрана, гепарины, ЭДТА. В некоторых вариантах осуществления способ очистки включает сильные анионообменные смолы, такие как триэтиламиноэтил. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный белок ДНКаза, продуцируемый в соответствии со способом, представляет собой D1L3 или его вариант.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретения предложен вариант D1L3, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична ферменту, определенному SEQ ID NO: 4 (D1L3 человека, изоформа 1) или SEQ ID NO: 5 (D1L3 человека, изоформа 2), и имеющий одну или более замен остатков цистеина и/или одну или более замен аминокислот, которые чувствительны к протеолизу, например протеолизу in vivo. В некоторых вариантах осуществления вариант белка D1L3 содержит одну или более дополнительных модификаций, которые приводят к повышенной стабильности белка (например, устойчивости к протеазам), более высоким уровням продукции в системах экспрессии in vitro и/или не существенно меньшей, такой же или лучшей активности по деградации ДНК и/или хроматина и/или NET по сравнению с белком D1L3 дикого типа с SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5. Например, вариант D1L3 может содержать по меньшей мере одну дополнительную замену структурного блока или точечную мутацию, описанную в PCT/US2018/47084 (которая
- 12 046216 полностью включена в данное описание посредством ссылки), или может содержать одну или более замен, описанных в данном документе, для повышения устойчивости к действию протеаз.
В некоторых вариантах осуществления вариант D1L3 имеет замену Cys 68, которая необязательно замещена аминокислотой, выбранной из Ala, Ser и Gly. В некоторых вариантах осуществления вариант содержит замену N64_I70delinsHLTAVGK. В некоторых вариантах осуществления последовательность HLTAVGK может быть дополнительно модифицирована одной, двумя или тремя заменами, делециями и/или вставками (вместе) при условии, что остаток Cys не включен. В некоторых вариантах осуществления вариант D1L3 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 85%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 95% или по меньшей мере примерно на 98% идентична с эталонной SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO: 5.
В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен фермент D1L3, содержащий фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ), конъюгированный в положении, соответствующем Cys 68, который, как полагают, является неспаренным цистеином. В некоторых вариантах осуществления вариант D1L3 имеет конъюгацию ПЭГ с аминокислотой, соответствующей C194. В этих вариантах осуществления фрагмент ПЭГ будет обеспечивать продление времени полужизни, избегая при этом дисульфидного скремблирования и/или неправильного сворачивания белка. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ПЭГ конъюгирован с использованием химической реакции с малеимидом, которая может быть выполнена в мягких условиях. Известны и могут быть использованы другие химические составы конъюгации, такие как химические составы активации винилсульфона, дитиопиридина и йодацетамида. Фрагмент ПЭГ может быть линейным или разветвленным и обычно может находиться в диапазоне от 10 до 40 кДа или в диапазоне от 20 до 30 кДа.
В качестве альтернативы или в дополнение к этому, в изобретении предложен вариант D1L3, содержащий один или более замещенных остатков аргинина и/или лизина, приводящих к повышенной устойчивости к действию протеаз. В некоторых вариантах осуществления вариант D1L3 имеет замену в одном или более положениях, соответствующих K180, K200, K259 и/или R285 в SEQ ID NO: 4. В соответствии с этим раскрытием такие остатки лизина и аргинина идентифицируются как потенциально чувствительные сайты к действию протеаз. Таким образом, один или более (например, 1, 2, 3 или 4) из этих остатков могут быть модифицированы незаряженным остатком, таким как остаток, независимо выбранный из Ala, Gly, Leu, Ile, Val, Thr, Ser и Pro. В некоторых вариантах осуществления чувствительные к протеазе остатки лизина или аргинина заменяются как часть замены структурного блока. Например, вариант D1L3 может содержать одну или более замен, выбранных из K180_A181delinsGL, P198_A201delinsRPSQ и K259A. В некоторых вариантах осуществления вариант D1L3 содержит одну или обе замены: K180_A181delinsGL и/или P198_A201delinsRPSQ, каждая из которых необязательно модифицирована одной или двумя аминокислотными заменами, делециями или вставками, при условии, что замена структурного блока не модифицируется заменой или вставкой остатком R или K. В некоторых вариантах осуществления вариант D1L3 обладает повышенной устойчивостью к протеолизу одной или более протеазами, выбранными из плазмина, тромбина и/или трипсина.
В качестве альтернативы или в дополнение к этому, вариант D1L3 содержит одну или более мутаций парного основного остатка. В некоторых вариантах осуществления парный основной остаток соответствует положению, выбранному из K50/R51, R80/R81, K114/R115, K199/K200, K226/K227, K291/K292, R297/K298/K299 и K303/R304 из SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления вариант D1L3 содержит одну или более замен, выбранных из замены, соответствующей R114T, R114A, R114D, R114Q, K227S и K227E из SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления одна или более мутаций парного основного остатка включают аминокислотную замену, соответствующую R51K, R81K, R115K и R304K. В некоторых вариантах осуществления парный основной остаток заменяется с использованием замены соответствующего структурного блока. В соответствии с этими вариантами осуществления вариант D1L3, экспрессируемый системой экспрессии рекомбинантного белка (например, CHO и Pichia pastoris), будет более устойчивым к действию протеаз.
В некоторых аспектах изобретения предложен вариант ДНКазы 1 (D1), содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична ферменту, определенному SEQ ID NO: 1, с одной или более заменами остатков цистеина. В некоторых вариантах осуществления вариант белка D1 содержит одну или более дополнительных модификаций, которые приводят к повышенной стабильности белка, более высоким уровням продукции в системах экспрессии in vitro и/или не существенно меньшей, такой же или лучшей активности по деградации ДНК и/или хроматина и/или NET по сравнению с белком D1 дикого типа с SEQ ID NO:1. Например, вариант D1 может содержать по меньшей мере одну дополнительную замену структурного блока или точечную мутацию, описанную в PCT/US2018/47084, которая полностью включена в данное описание посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления вариант D1 имеет замену одного или обоих из C123 и C126, которые необязательно замещены Ala, Ser и Gly. В некоторых вариантах осуществления вариант D1 содержит замену G122_N128delinsYQGDA. В некоторых вариантах осуществления вариант D1 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична с SEQ ID NO:1.
- 13 046216
В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен фермент D1, содержащий фрагмент ПЭГ, конъюгированный в положении, соответствующем C123 и/или C126. В этих вариантах осуществления фрагмент ПЭГ будет обеспечивать продление времени полужизни, избегая при этом дисульфидного скремблирования и/или неправильного сворачивания белка. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ПЭГ конъюгирован с использованием химической реакции с малеимидом, которая может быть выполнена в мягких условиях. Известны и могут быть использованы другие химические составы конъюгации, такие как химические составы активации винилсульфона, дитиопиридина и йодацетамида. Фрагмент ПЭГ может быть линейным или разветвленным и обычно может находиться в диапазоне от 10 до 40 кДа или в диапазоне от 20 до 30 кДа.
В других аспектах изобретения предложен вариант D1L1, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична ферменту, определенному SEQ ID NO: 2, с одним или более замещенными остатками цистеина. Остаток(и) цистеина необязательно являются неконсервативными в пределах семейства D1 (например, C22 и/или C50) и необязательно замещены Gly, Arg или Ser или замещены как часть замены структурного блока. В некоторых вариантах осуществления вариант D1L1 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична с SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен фермент D1L1, содержащий фрагмент ПЭГ, конъюгированный в положении, соответствующем C22 и/или C50. В этих вариантах осуществления фрагмент ПЭГ будет обеспечивать продление времени полужизни, избегая при этом дисульфидного скремблирования и/или неправильного сворачивания белка. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ПЭГ конъюгирован с использованием химической реакции с малеимидом, которая может быть выполнена в мягких условиях. Известны и могут быть использованы другие химические составы конъюгации, такие как химические составы активации винилсульфона, дитиопиридина и йодацетамида. Фрагмент ПЭГ может быть линейным или разветвленным и обычно может находиться в диапазоне от 10 до 40 кДа или в диапазоне от 20 до 30 кДа.
В некоторых аспектах изобретения предложен вариант D1L2, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична ферменту, определенному SEQ ID NO: 3, с одним или более замещенными остатками цистеина. Остатки цистеина могут быть неконсервативными в семейства D1 (например, C43) и необязательно замещены Gly, Arg или Ser или замещены как часть замены структурного блока. В некоторых вариантах осуществления вариант D1L2 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична с SEQ ID NO:3.
В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен фермент D1L2, содержащий фрагмент ПЭГ, конъюгированный в положении, соответствующем C43. В этих вариантах осуществления фрагмент ПЭГ будет обеспечивать продление времени полужизни, избегая при этом дисульфидного скремблирования и/или неправильного сворачивания белка. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ПЭГ конъюгирован с использованием химической реакции с малеимидом, которая может быть выполнена в мягких условиях. Известны и могут быть использованы другие химические составы конъюгации, такие как химические составы активации винилсульфона, дитиопиридина и йодацетамида. Фрагмент ПЭГ может быть линейным или разветвленным и обычно может находиться в диапазоне от 10 до 40 кДа или в диапазоне от 20 до 30 кДа.
В других аспектах изобретения предложены выделенные полинуклеотиды, кодирующие варианты D1, D1L1, D1L2 или D1L3, описанные в данном документе, а также векторы и клетки-хозяева. Клеткихозяева могут быть клетками любой системы экспрессии, включая бактериальные или эукариотические, независимо от того, относятся ли они к не млекопитающим, такие как Pichia pastoris, или млекопитающим, такие как клетки CHO.
В некоторых вариантах осуществления для терапии используется доставка полинуклеотидов. Кодирующие полинуклеотиды могут быть доставлены в виде мРНК или в виде конструкций ДНК с использованием известных процедур, например электропорации или сжатия клеток, и/или векторов (включая вирусные векторы). Полинуклеотиды мРНК могут включать известные модификации (мРНК), чтобы избежать активации врожденной иммунной системы. См. WO 2014/028429, который включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид доставляется в организм субъекта. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды доставляются в клетку in vitro, а клетка доставляется в организм субъекта. Клетка может представлять собой, например, лейкоцит (например, Т-клетку или макрофаг), эндотелиальную клетку, эпителиальную клетку, гепатоцит или стволовую клетку.
В других аспектах изобретения предложен способ продуцирования внеклеточных вариантов ДНКазы, описанных в данном документе. Способ включает культивирование клеток, экспрессирующих полинуклеотид, кодирующий внеклеточную ДНКазу, и выделение рекомбинантного белка ДНКазы. Клетки могут быть прокариотическими или эукариотическими. В некоторых вариантах осуществления ДНКаза экспрессируется с использованием системы экспрессии, не относящейся к млекопитающим, которая необязательно представляет собой Pichia pastoris или Saccharomyces spp. В некоторых вариантах
- 14 046216 осуществления используется экспрессионная система млекопитающего, такая как клетки СНО.
В изобретении также предложены фармацевтические композиции, содержащие внеклеточную ДНКазу или ее вариант, как описано в данном документе, или, необязательно, полинуклеотид или вектор, как описано, и фармацевтически приемлемый носитель.
Вектор обычно содержит выделенную нуклеиновую кислоту, которая может использоваться для доставки выделенной нуклеиновой кислоты внутрь клетки. Многочисленные векторы известны в данной области техники, включая, помимо прочего, линейные полинуклеотиды, полинуклеотиды, связанные с ионными или амфифильными соединениями, плазмиды и вирусы. Типичные векторы включает автономно реплицирующуюеся плазмиды или вирус. Термин также следует воспринимать как такой, который включает в себя неплазмидные и невирусные соединения, которые способствуют переносу нуклеиновой кислоты в клетки, такие как, например, полилизиновое соединение, липосомы и т.п. Примеры вирусных векторов включают, но не ограничиваются ими, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы и т.п.
Фармацевтическая композиция может быть составлена для любого пути введения, включая местное, парентеральное или ингаляционное введение. В различных вариантах осуществления композиция составлена для внутрикожного, внутримышечного, внутрибрюшинного, внутрисуставного, внутривенного, подкожного, внутриартериального, перорального, сублингвального, ингаляционного или трансдермального введения. В некоторых вариантах осуществления композицию составляют для внутривенного или подкожного введения.
В других аспектах изобретения предложен способ лечения субъекта, нуждающегося в деградации внеклеточной ДНК, деградации внеклеточного хроматина, деградации внеклеточной ловушки (ЕТ) и/или деградации внеклеточной ловушки нейтрофилов (NET). Способ включает введение терапевтически эффективного количества внеклеточной ДНКазы или ее варианта или композиции, описанных в данном документе. Примеры показаний, когда субъект нуждается в деградации внеклеточной ДНК или хроматина (включая деградацию ET или NET), раскрыты в PCT/US18/47084, описание которого включено в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ лечения нуждающегося в этом субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества белка, который представлен любой из последовательностей от SEQ ID NO: 8 до SEQ ID NO: 30.
В каждом случае, когда описан способ лечения субъекта, в изобретении также предложено использование одного или более внеклеточных белков ДНКазы для лечения или профилактики заболеваний, связанных с ET и/или NET.
В различных вариантах осуществления данного изобретения предложен способ лечения, предотвращения или сдерживания заболеваний или патологических состояний, характеризующихся присутствием или накоплением NET. Такие заболевания или патологические состояния включают, но не ограничиваются ими, заболевания, связанные с хронической нейтрофилией, агрегацией нейтрофилов и лейкостазом, тромбозом и окклюзией сосудов, ишемическим реперфузионным повреждением, хирургическим и травматическим повреждением ткани, острой или хронической воспалительной реакцией или заболеванием, аутоиммунные заболевания, сердечно-сосудистым заболевания, метаболические заболевания, системное воспаление, воспалительные заболевания дыхательных путей, воспалительные заболевания почек, воспалительные заболевания, связанные с трансплантированной тканью (например, болезнь трансплантат против хозяина) и рак (включая лейкоз).
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к лечению болезней или патологических состояний, характеризующихся дефицитом D1L3 или дефицитом D1. В некоторых случаях субъект имеет мутацию (например, мутацию с потерей функции) в гене Dnase1l3 или гене Dnase1. У таких субъектов может проявляться аутоиммунное заболевание (например, системная красная волчанка (СКВ) (включая волчаночный нефрит), склеродермия или системный склероз, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника (включая болезнь Крона и язвенный колит) и уртикарный васкулит). В некоторых случаях субъект имеет приобретенный ингибитор D1 (например, антитело к ДНКазе 1 и актин) и/или D1L3 (например, антитело к ДНКазе 1l3). Такие субъекты также могут иметь аутоиммунное или воспалительное заболевание (например, СКВ, системный склероз).
В некоторых вариантах осуществления субъект имеет или подвержен риску окклюзии NET в системе протоков. Например, описанные в данном документе ферменты ДНКазы можно вводить субъекту для лечения панкреатита, холангита, конъюнктивита, мастита, синдрома сухого глаза, нарушения проходимости семявыносящего протока и заболевания почек.
В некоторых вариантах осуществления субъект имеет или подвержен риску накапливания NET на эндотелиальных поверхностях (например, спайки, вызванные хирургическим вмешательством), коже (например, раны/рубцы) или в синовиальных соединениях (например, подагра и артрит, например, ревматоидный артрит). Описанные в данном документе ферменты ДНКазы можно вводить субъекту для лечения патологического состояния, характеризующегося накоплением NET на эндотелиальных поверхностях, таких как, но не ограничиваясь этим, спайки, вызванные хирургическим вмешательством.
Другие заболевания и патологические состояния, связанные с NET, которые можно лечить или предотвращать, используя ферменты ДНКазы, описанные в данном документе, включают
- 15 046216
АНЦА-ассоциированный васкулит, астму, хроническое обструктивное заболевание легких, нейтрофильный дерматоз, дерматомиозит, ожоги, целлюлит, менингит, энцефалит, средний отит, фарингит, тонзиллит, пневмонию, эндокардит, цистит, пиелонефрит, аппендицит, холецистит, панкреатит, увеит, кератит, диссеминированное внутрисосудистое свертывание, острое повреждение почек, острый респираторный дистресс-синдром, шоковую печень, гепаторенальный синдром, инфаркт миокарда, инсульт, ишемию кишечника, ишемию конечностей, перекрут яичка, преэклампсию, эклампсию и трансплантацию солидных органов (например, трансплантацию почки, сердца, печени и/или легких). Кроме того, описанные в данном документе ферменты ДНКазы могут быть использованы для предотвращения образования рубца или контрактуры, например, путем местного нанесения на кожу индивидуума, подверженного этому риску, например у человека с хирургическим разрезом, разрывом или ожогом.
В различных вариантах осуществления субъект страдает заболеванием, которое лечится или будет лечится ДНКазами дикого типа, включая D1 и стрептодорназою. Подобные болезни или патологические состояния включают тромбоз, инсульт, сепсис, повреждение легких, атеросклероз, вирусная инфекция, серповидно-клеточная болезнь, инфаркт миокарда, воспаление среднего уха, заживление ран, поражение печени, эндокардит, печень инфекция, панкреатит, первичная дисфункция трансплантата, ишемии/реперфузии конечностей, поражение почек, коагуляция крови, индуцированное квасцами воспаление, гепаторенальное повреждение, плевральные экссудации, гемоторакс, внутрипеченочные тромбы, постпневматическая анемия, язвы, отоларингологические состояния, инфекции ротовой полости, незначительные повреждения, синусит, послеоперационные ринопластики, бесплодие, мочевой катетер, обработка раны, тест кожной реакции, пневмококковый менингит, подагра, ножные язвы, муковисцидоз, синдром Картагенера, астма, лобарный ателектаз, хроничный бронхит, бронхоэктаз, волчанка, первичная цилиарная дискинезия, бронхиолит, эпмиема, плевральные инфекции, рак, синдром сухого глаза, инфекции нижних дыхательных путей, хронические гематомы, болезнь Альцгеймера и обструктивное заболевание легких.
Другие аспекты и варианты осуществления данного изобретения будут очевидны из следующих примеров.
Примеры
Почти 70% всех биопрепаратов производятся с использованием клеток яичника китайского хомячка (СНО). Действительно, ДНКаза 1 дикого типа (D1; дорназа альфа) обычно продуцируется в клетках СНО. Несмотря на значительные преимущества в разработке клеточных линий и крупномасштабном производстве с использованием клеток СНО, все еще остается серьезная проблема в производстве ферментов ДНКаз из-за значительной степени вариабельности и отсутствия надежных способов прогнозирования или моделирования характеристик роста клеток. Важно отметить, что клетки CHO не были способны стабильно продуцировать гиперактивные варианты D1, что препятствовало их клиническому производству, и до данного раскрытия производственные свойства других членов семейства белков ДНКаза 1, включая ДНКаза1-подобный белок 3 (D1L3), были неизвестны.
Используя СНО и системы микробной экспрессии, при производстве D1L3 было выявлено несколько проблем, включая низкий выход продукции, протеолитическую деградацию, неправильную укладку белка и ошибочное или нежелательное гликозилирование. В этом изобретении предложены технические решения этих и других проблем производства, которые также могут улучшить терапевтические свойства D1L3.
Пример 1. Экспрессия и характеристика D1L3 с делецией основного домена (BDD) в клетках яичников китайского хомячка (CHO) и в Pichia pastoris.
ДНКаза 1 и ДНКаза1Ь3 предпочтительно расщепляют ДНК без белка и комплексы ДНК-гистон (т.е. хроматин) соответственно. Предыдущие исследования позволяют предположить, что основной домен (BD) на С-конце ДНКазы1Ь3, который отсутствует в ДНКазе1, отвечает за различные субстратные специфичности обоих ферментов (Sisirak et al., Cell, 2016; Keyel, Developmental Biology, 2017).
Технология белковой инженерии, называемая конструирование структурных блоков белков, описана в PCT/US18/47084 и US 62/800790, описания которых полностью включены в данное описание посредством ссылки. Этот подход может быть применен к членам семейства белков ДНКаза 1 и ДНКаза 2. Способ основан на следующих этапах: обеспечение выравнивания белок-белок донорных и реципиентных ферментов ДНКазы; определение вариабельных аминокислотных последовательностей для переноса, при этом вариабельные аминокислоты фланкируются одной или несколькими консервативными аминокислотами в ферментах донорных и реципиентных ферментах ДНКазы; замена вариабельных аминокислот реципиентной ДНКазы на вариабельные аминокислоты донорной ДНКазы для создания химерной ДНКазы и рекомбинантное продуцирование химерной ДНКазы.
Чтобы охарактеризовать аминокислоты, которые ответственны за активность по деградации хроматина (активность хроматиназы), в D1L3 дикого типа была проведена замена структурными блоками из D1, как описано в PCT/US2018/047084. Замены структурных блоков D1L3 выбирают из D1 человека и приводят к образованию вариантов D1L3 человека, которые имеют следующие мутации: M21_R22delinsLK, C24_S25delinsAA, V28_S30delinsIQT, S34T, Q36_V44delinsMSNATLVSY, K47_K50delinsQILS, C52Y, I55_M58delinsIALVQE, I60_K61delinsVR, N64_I70delinsHLTAVGK,
- 16 046216
M72_K74delinsLDN, R77_I83delinsQDAPD, N86H, I89V, S91_R92delinsEP, T97S, Q101R, A103L, L105V, K107_L110delinsRPDQ, V113_R115delinsAVD, H118Y, H120D, Y122_A127delinsGCEPCGN, V129T, S131N, F135_V136delinsAI, W138R, Q140_H143delinFSRF, A145_D148delinsEVRE, V150A, I152V, T156_T157delinsAA, E159_S161delinsGDA, K163A, E167A, V169_E170delinsYD, T173L,
K176_R178delinsQEK, K180_A181delinsGL, N183_F186delinsDVML, P198_A201delinsRPSQ, K203_N204delinsSS, R208W, D210S, R212T, V214Q, G218P, Q220_E221delinsSA, V225_S228delinsATP, N230H, L238_R239delinsVA, Q241_S246delinsMLLRGA, K250D, N252_V254delinsALP, D256N, K259A, K262G, T264_E267delinsSDQL, L269_V271delinsQAI, F275Y, F279_K280delinsVM, Q282_S205delinsK относительно SEQ ID NO: 4.
Эти 63 варианта D1L3 были проверены на потерю или усиление активности по деградации хроматина. Вкратце, варианты D1L3 временно экспрессировались в клетках СНО с использованием вектора экспрессии in vitro. Супернатанты культур собирали и тестировали на активность по деградации хроматина с использованием очищенных ядер в качестве источника хроматина. Как показано на фиг. 1, замена структурными блоками № 17 и № 63 из D1 значительно улучшили деградацию высокомолекулярного (ВМ) хроматина до небольших фрагментов по сравнению с D1L3 дикого типа. Замена структурного блока № 7 вызывает миссенс-мутацию Q101R, которая заменяет глутамин в положении 101 на аргинин (SEQ ID NO: 8). Замена структурного блока № 63 вызывает мутацию Q282_S305delinsK, которая удаляет полный C-концевой BD D1L3 в аминокислотных положениях с 283 по 305 и заменяет глутамин (Q) в положении 282 на лизин (SEQ ID NO: 9). Затем был выполнен вестерн-блот анализ супернатантов для определения уровней экспрессии D1L3 дикого типа и обоих мутантов (фиг. 2). К удивлению авторов изобретения, было обнаружено два варианта D1L3 разного размера в образцах с D1L3 дикого типа и мутантом Q101R. Образцы с Q282_S305delinsK содержали только меньший вариант D1L3. Данные позволяют предположить, что BD D1L3 дикого типа спонтанно удаляется (например, протеолизируется) во время экспрессии или пост-секреции в клетках CHO. Два варианта D1L3 также были обнаружены в супернатантах клеток СНО, которые стабильно экспрессируют WT-D1L3 (фиг. 3). Следует отметить, что основной домен D1L3 с удаленным доменом (BDD-D1L3) показал существенно повышенную активность хроматиназы по сравнению с D1L3 дикого типа.
Затем была протестирована Pichia pastoris как альтернативная система микробной экспрессии относительно клеток СНО. Обычно авторы изобретения наблюдали более высокие уровни экспрессии с BDD-D1L3 по сравнению с D1L3 дикого типа. На этом этапе были очищены и охарактеризованы D1L3 и BDD-D1L3 дикого типа из супернатантов ферментации Pichia pastoris (фиг. 4). Неожиданно авторы изобретения обнаружили, что D1L3 дикого типа был протеолитически усечен внутри BD в аминокислотных положениях K291, K291 или S293, что привело к гетерогенной смеси вариантов D1L3 после очистки. В отличие от D1L3 дикого типа, экспрессия BDD-D1L3 из-за трех замен структурных блоков (F275Y, F279_K280delinsVM, Q282_S205delinsK) создавала чистый белок.
Затем сравнили хроматиназную активность D1L3 после обеих очисток. Авторы изобретения наблюдали, что гетерогенная смесь вариантов D1L3 с усечением BD в положениях K291, K291 или S293 имела примерно в 10 раз более низкую хроматиназную активность по сравнению с вариантом D1L3 с полной делецией BD из-за F275Y/F279_K280delinsVM/Q282_S205delinsK. В совокупности данные показывают, что протеолитическое расщепление BD может происходить естественным образом в системах экспрессии микробов и млекопитающих (например, CHO и P. pastoris), и удаление BD, по-видимому, активирует активность D1L3 по деградации хроматина.
Пример 2. Экспрессия D1L3 в клетках CHO в биореакторах.
В данном документе раскрывается разработка стабильных клеточных линий СНО, продуцирующих D1L3 дикого типа (SEQ ID NO: 4). Клеточные линии культивировали в биореакторах с использованием стандартной культуральной среды для СНО. В частности, на фиг. 5 показан вестерн-блот анализ D1L3 человека, экспрессируемого и секретируемого клетками СНО в биореакторе в условиях, совместимых с cGMP. Образцы были собраны в разные моменты времени (t1-t3). Были обнаружены только минорные уровни фрагментов D1L3 и D1L3. Данные показывают, что низкий выход продукции D1L3 является проблемой при производстве D1L3.
Как описано в данном документе, высокие уровни продукции D1L3 дикого типа были достигнуты путем добавления полианионов в культуральную среду. Такие полианионы могут содержать один или более остатков из гепарина, сульфата декстрана, цитрата железа и этилендиаминтетрауксусной кислоты и представлять собой биологически активный ингредиент в реагентах против слипания клеток. В частности, авторы изобретения добавили сульфат декстрана в культуральную среду для CHO и наблюдали сильное увеличение фрагментов D1L3, а также D1L3 (фиг. 5). Данные показывают, что полианионы увеличивают выход продукции D1L3, но не предотвращают протеолитическую деградацию.
На фиг. 6A показано, что полианионы, такие как сульфат декстрана (DS), образуют комплекс с D1L3. Комплекс D1L3-DS предотвращает взаимодействие и поглощение D1L3 отрицательно заряженными поверхностями во время производственного процесса. Такие отрицательно заряженные поверхности включают, но не ограничиваются ими, клеточную поверхность продуцирующих клеток (например, клетки СНО, Pichia pastoris, Saccharomyces spp.), ДНК, экспонируемую умирающими клетками, и по
- 17 046216 верхности биореакторов. На фиг. 6B и 6С показан двухэтапный процесс очистки D1L3 от комплексов DS-D1L3. Как показано на фиг. 6, первый этап направлен на диссоциацию комплекса DS-D1L3. Диссоциация может быть достигнута путем инкубации комплекса DS-D1L3 с сильными анионообменными поверхностями, которые связывают DS и, таким образом, высвобождают D1L3. В частности, процесс очистки может включать пропускание культуральной среды, содержащей DS-D1L3, через хроматографическую колонку, заполненную сильной анионообменной смолой, с последующим сбором потока, который содержит D1L3 без DS. Второй этап процесса очистки показан на фиг. 6C и включает аффинную очистку D1L3 из потока без DS посредством применения сильной катионообменной смолы. В заключение, выход продукции D1L3 может быть существенно увеличен за счет добавления полианионов, таких как сульфат декстрана.
Пример 3. Конструирование D1L3 устойчивого к действию протеаз.
D1L3 дикого типа содержит 50 остатков аргинина и лизина, что делает фермент особенно чувствительным к таким протеазам, как трипсин, тромбин и плазмин. В этом примере были идентифицированы сайты расщепления трипсином и плазмином в D1L3. Сайты могут быть мутированы с получением вариантов D1L3, устойчивых к действию протеаз.
Вкратце, очищенный D1L3 обрабатывали трипсином. Были выделены фрагменты D1L3 и аминокислотная последовательность фрагментов определена с использованием комбинаций жидкостной хроматографии (ЖХ) и масс-спектрометрии (МС). Было определено, что трипсин расщепляет D1L3 по следующим остаткам аргинина и лизина: R22, R29, R51, R66, R80, R81, R95, K99, R115, K147, K163, K180, R208, R212, R235, R239, K250 и K262. Эти остатки аргинина и лизина можно заменить небольшими аминокислотами, такими как аланин, валин и серин, или аминокислотами, которые имеют аналогичные свойства в соответствии с оценкой расстояния Грэнтэма (например, гистидином, глутамином и глутаматом; фиг.7). D1, устойчивый к протеазам, содержит остатки аргинина и лизина, соответствующие R51, R95, K99 и R235, что позволяет предположить, что эти остатки не несут основную ответственность за протеолитическую деградацию D1L3.
Конструирование структурных блоков белков применялось для переноса следующих структурных блоков из D1 для замены структурных блоков D1L3, которые содержат сайты расщепления трипсином (фиг. 7): R22 (Мутация: M21_R22delinsLK), R29 (V28_S30delinsIQT), R66 (N64_I70delinsHLTAVGK), R80 (R77_I83delinsQDAPD), R81 (R77_I83delinsQDAPD), R115 (V113_R115delinsAVD), K163 (K163A), K180 (K180_A181delinsGL), R208 (R208W) MR212 (R212T), R239 (L238_R239delinsVA), K250 (K250D) и K262 (K262G).
Плазмин являет собою протеазу плазмы, которая образуется при активации ее зимогенного плазминогена. Ингибитор активатора плазминогена 1 (PAI-1) подавляет активацию плазмина. Интересно, что PAI-1 увеличивает ферментативную активность D1L3 в сыворотке, предполагая, что плазмин может протеолитически инактивировать D1L3. Однако сайты расщепления плазмином в D1L3 не идентифицированы.
Анализ in silico показал, что комбинация аминокислот лизин-аланин (КА) или аргинин-аланин (RA), как полагают, предпочтительно расщепляется протеазой плазмином или протеазами, которые обладают плазминоподобной активностью. D1L3 содержит всего четыре предполагаемых сайта расщепления плазмином (фиг.8): (сайт 1) K180/A181 (K160/A161 без сигнального пептида), (сайт 2) K200/A201 (K180/A181 без сигнального пептида), (сайт 3) K259/A260 (K239/A240 без сигнального пептида) и (сайт 4) R285/A286 (R270/A250 без сигнального пептида). Используя парное выравнивание D1 и D1L3, было обнаружено, что ни один из сайтов расщепления плазмином не присутствует в D1 (фиг. 8). Эти данные согласуются с тем фактом, что на активность D1 не влияет инактивации протеазами сыворотки, такими как тромбин и плазмин. Конструирование структурных блоков белков применялось для переноса следующих структурных блоков из D1 для замены структурных блоков D1L3, которые содержат сайты расщепления плазмином (фиг.9): (сайт 1) K180_A181delinsGL, (сайт 2) P198_A201delinsRPSQ и (сайт 3) K259A. R285/A286 (сайт 4) находится в C-концевом удлинении, которое отсутствует в D1. Следовательно, авторы изобретения создали вариант D1L3, в котором были мутированы все четыре предполагаемых сайта расщепления плазмином: K180_A181delinsGL, P198_A201delinsRPSQ, K259A и R285A. Затем была проанализирована деградация хроматина вариантом D1L3, при этом наблюдалась сильная активность по деградации хроматина в мутированном D1L3 (фиг. 10). В совокупности данные показывают, что четыре остатка аргинина и лизина, K180, K200, K259 и R285, могут быть мутированы для снижения риска протеолитической деградации без ущерба для ферментативной активности.
Затем очищенный D1L3 обрабатывали очищенным плазмином. Были выделены фрагменты D1L3 и аминокислотная последовательность фрагментов определена с использованием комбинаций ЖХ и МС. Авторы изобретения определили, что плазмин расщепляет D1L3 по следующим остаткам аргинина и лизина: R22, R29, K45, K47, K74, R81, R92, K107, K176, R212, R226, R227, K250, K259 и K262. Эти остатки аргинина и лизина можно заменить небольшими аминокислотами, такими как аланин, валин и серин, или аминокислотами, которые имеют аналогичные свойства в соответствии с оценкой расстояния Грэнтэма (например, гистидином, глутамином и глутаматом; фиг.11). D1, устойчивый к протеазам, содержит остатки лизина, соответствующие K45, что позволяет предположить, что эти остатки не несут
- 18 046216 основную ответственность за протеолитическую деградацию D1L3 плазмином. Конструирование структурных блоков белков применялось для переноса следующих структурных блоков из D1 для замены структурных блоков D1L3, которые содержат сайты расщепления трипсином in silico (фиг. 11): R22 (Мутация: M21_R22delinsLK), R29 (V28_S30delinsIQT), K47 (K47_K50delinsQILS), K74 (M72_K74delinsLDN), R81 (R77_I83delinsQDAPD), R92 (S91_R92delinsEP), K107 (K107_L110delinsRPDQ), K176 (K176_R178delinsQEK), R212 (R212T), K226 (V225_S228delinsATP), K227 (V225_S228delinsATP), K250 (K250D), K259 (K259A) и K262 (K262G).
Наконец, был выделен рекомбинантно экспрессированный D1L3 дикого типа и секвенирован его С-конец. Были идентифицированы три различные аминокислотные последовательности, оканчивающиеся на S290 (SEQ ID NO: 10), K291 (SEQ ID NO: 11) и K292 (SEQ ID NO: 12) соответственно (фиг. 4, пример 1). Эти данные идентифицируют остатки лизина 291 и 292 как значимые сайты протеолитического расщепления D1L3 во время крупномасштабного производства.
Пример 4. Конструирование D1L3 для избежания деградации.
Авторы изобретения наблюдали фрагментацию D1L3 после гетерологичной экспрессии у Pichia pastoris. Анализ фрагментов, характеризуемых парными основными аминокислотами, остатками аргинина (R) и лизина (K) в качестве сайтов протеолитического расщепления. Подобную особенность деградации наблюдали после экспрессии D1L3 в клетках СНО. Эти наблюдения показывают, что клетки Pichia pastoris и CHO имеют общие гомологичные протеазы, которые расщепляют D1L3 по парным основным аминокислотам, хотя эффект был более значительным в клетках CHO.
Было определено, что фермент, расщепляющий парные основные аминокислоты (PACE), способствовал фрагментации ДНКазы1Ь3. PACE, также известный как фурин (Uniprot ID: P09958), экспрессируется у человека и млекопитающих. Pichia pastoris экспрессирует два фермента, нацеленных на парные основные аминокислоты, а именно аспарагиновую протеиназу 3 (ген: Ysp1; Uniprot ID: P32329) и кексин (ген: Kex2; Uniprot ID: P13134). Таким образом, варианты ДНКаза1Ь3 и ДНКазаНЗ могут экспрессироваться в Pichia pastoris и в клетках СНО, в которых фурин, аспарагиновая протеиназа 3 и кексин фармакологически ингибированы или генетически истощены.
Кроме того, мутации парных основных аминокислот в вариантах ДНКазаРЬ3 и ДНКазаРЬ3 делают возможной их экспрессию в CHO и Pichia pastoris с пониженной фрагментацией. Анализ фрагментов ДНКазаРЬ3 выявил особенности парных основных аминокислот в положениях: K50/R51, R80/R81, K114/R115, K199/K200, K226/K227, K291/K292, R297/K298/K299 и K303/R304 в SEQ ID NO: 2
Как раскрыто в предварительной заявке на патент США № 62/800790 (которая полностью включена в данный документ посредством ссылки), ДНКазаРЬ3 других видов содержит аминокислотные замены в этих сайтах расщепления, включая R114T (мышь), R114A (крыса), R114D (морская свинка), R114Q (корова), K227S (собака) и K227E (слон). Эти аминокислотные замены могут быть применены к ДНКаза1Ь3 человека для придания ферменту устойчивости к протеолитической деградации, в том числе во время экспрессии в клетках СНО и Pichia pastoris.
Кексин предпочтительно расщепляется в сайтах после остатков KR и RR. ДНКаза1Р3 в положениях K50/R51, R80/R81, K114/R115 и K303/R304 имеет 4 сайта расщепления KEX2. Аминокислотные замены этих остатков делают ДНКазаРЬ3 устойчивым к действию KEX2 и делают возможной экспрессию вариантов ДНКаза1Ь3 и ДНКаза1Ь3 в Pichia pastoris и в клетках CHO. Эти аминокислотные замены могут быть консервативными, например R51K, R81K, R115K и R304K.
Пример 5. Конструирование вариантов D1L3 для предотвращения образования высокомолекулярных агрегатов.
Во время cGMP-совместимой экспрессии D1L3 в клетках CHO (фиг. 12A) наблюдали накопление высокомолекулярных агрегатов D1L3, указывая на дополнительную проблему для клинического производства D1L3. Образование агрегатов с высоким молекулярным весом наблюдалось у Pichia pastoris в гораздо меньшей степени.
Применение восстанавливающих условий к белкам материала биореактора привело к растворению агрегатов D1L3. Данные показывают, что образование агрегатов D1L3 вызывается внутри- и/или межмолекулярным перекрестным связыванием через дисульфидные мостики во время экспрессии белка. В частности, как показано на фиг. 12B, гель прогоняли в невосстанавливающих условиях, и показано накопление высокомолекулярных агрегатов D1L3 с течением времени. Гель прогоняли в восстанавливающих условиях, и агрегаты не были обнаружены. Данные показывают, что ошибочные внутри- и межмолекулярные дисульфидные связи вызывают неправильную укладку D1L3 человека в производственных условиях.
На фиг. 13 показано выравнивание аминокислотной последовательностей D1 (SEQ ID NO:1) человека и D1L3 (SEQ ID NO: 4) человека. Показаны сигнальный пептид, консервативные аминокислоты, вариабельные аминокислоты, неконсервативные остатки цистеина и консервативные остатки цистеина. Мутации в неконсервативных остатках цистеина уменьшают возможности образования внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей во время экспрессии белка. Анализ аминокислотной последовательности D1L3 (SEQ ID NO: 4) показал присутствие пяти остатков цистеина (C): C24, C52, C68, C194 и C231 (фиг. 14). Остатки цистеина C194 и C231 консервативны среди всех членов семейства белков
- 19 046216
ДНКаза 1 и образуют дисульфидные связи, которые необходимы для ферментативной активности ДНКазы 1. Функция остатков цистеина в D1L3 не была известна до данного раскрытия. Соответственно, как описано в данном документе, мутация этих остатков цистеина снижает перекрестное сшивание через дисульфидные мостики и, таким образом, увеличивает выход продукции белка.
Остатки цистеина могут быть заменены другими небольшими аминокислотами, а именно аланином (A), серином (S) и глицином (G), среди прочего. Такие замены вызывают следующие аминокислотные мутации C24A/S/G, C52A/S/G, C68A/S/G, C194A/S/G и C231A/S/G. Кроме того, структурные блоки, которые содержат консервативные остатки цистеина, могут быть заменены структурными блоками из донорной ДНКазы семейства белков ДНКаза 1 (например, D1 и D1L3). Следующие структурные блоки из D1 были использованы для замены структурных блоков D1L3, которые содержат неконсервативные остатки цистеина C24, C52 и C68: C24_S25delinsAA, C52Y и N64_I70delinsHLTAVGK. Активность вариантов D1L3 по деградации хроматина определяли количественно, как описано в PCT/US18/4708. Как обычные замены аминокислот (C24A, C52A), так и замены структурных блоков (C24_S25delinsAA, C52Y) вызвали полное отсутствие деградации хроматина, что указывает на то, что C24 и C52 необходимы для активности D1L3 (фиг. 15). Важно отметить, что мутация цистеина C68 либо путем обычной аминокислотной замены [C68A, (SEQ ID NO: 13)], либо путем мутации BB (N64_I70delinsHLTAVGK) привела к образованию варианта D1L3 с активностью по деградации хроматина (фиг. 15). Выравнивание аминокислотных последовательностей показало, что цистеин C68 не консервативен среди других членов семейства белков ДНКаза 1, подтверждая мнение о том, что C68 не требуется для ферментативной активности. Кроме того, было обнаружено, что аминокислотная замена высококонсервативного цистеина C194 на аланин (C194A), но не мутация высококонсервативного цистеина C231 на аланин (C231A), привела к образованию ферментативно активного варианту D1L3 (фиг. 15). Таким образом, цистеин C68 и C194 можно мутировать, чтобы снизить риск образования ошибочных дисульфидных связей во время продукции D1L3.
Аналогичный подход может быть применен для мутации неконсервативных остатков цистеина в других членах семейства белков ДНКаза 1: D1, ДНКаза 1-подобный белок 1 (D1L1) и ДНКаза 1-подобный белок 2 (D1L2). D1 имеет два неконсервативных цистеина: C123 и C126. D1L1 показывает два неконсервативных остатка цистеина (C22, C50), которые соответствуют C24 и C52, D1L2 имеет только один неконсервативный остаток цистеина: C43. Мутация неконсервативных остатков цистеина членов семейства белков ДНКаза1 уменьшит перекрестное связывание через ошибочные дисульфидные мостики во время экспрессии белка и, таким образом, позволит производить D1, D1L1, D1L2 и D1L3 для терапевтического применения.
Пример 6. Конструирование и экспрессия D1L3 и слитого белка альбумин-Э^3 в Pichia pastoris.
Была протестирована экспрессия рекомбинантных внеклеточных ДНКаз человека, включая D1L3, с использованием Pichia pastoris. Как показано на фиг. 16A, первой на N-конце D1L3 находится лидерная последовательность пре-про-секреции α-фактора спаривания (aMF) Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 46), обычного инструмента для экспрессии гетерологичного белка в Pichia pastoris. Как раскрыто в данном документе, комбинация aMF с D1L3 вызвала неожиданное непроцессирование aMF из-за гликозилирования (фиг. 16B). Гликозилирование белка D1L3 ограничивает использование P. pastoris для клинического производства D1L3. D1L3 правильно процессируется, когда первым на N-конце находится нативный секреторный сигнальный пептид D1L3 [фиг. 16B, (SEQ ID NO: 48)]. Важно отметить, что aMF увеличивал экспрессию D1L3 в 3-5 раз по сравнению с нативным сигнальным пептидом D1L3. Поэтому был проанализирован процессинг слитых белков D1L3. В пилотных исследованиях было получено Nконцевое слияние aMF и альбумина сыворотки человека [HSA, (SEQ ID NO: 39)] с D1L3 (фиг. 17A). Некоторые варианты содержали линкерный пептид [например, (GSSSS)3] между HSA и D1L3. Как показано на фиг. 17B и 17C, экспрессия слитого белка в P. pastoris генерировала негликозилированный и ферментативно активный D1L3. Кроме того, уровни экспрессии были увеличены в 5-10 раз по сравнению с экспрессией D1L3, управляемой природным секреторным сигнальным пептидом. В совокупности данные показывают, что слияние D1L3 с альбумином делает возможным производство в Pichia pastoris.
На основе этих пилотных исследований были сконструированы различные слитые конструкции HSA с D1L3 дикого типа и BDD-D113 и подвергнуты скринингу на уровни экспрессии целевого белка (SEQ ID NO: 17-28). Как показано на фиг. 18, N-концевое слияние альбумина сыворотки человека (SEQ ID: NO: 17) с вариантом BDD-D113 (SEQ ID NO: 16) существенно не увеличивало уровни экспрессии. Однако следует отметить, что авторы изобретения действительно обнаружили сильное увеличение уровней экспрессии после вставки гибкого линкера, состоящего из остатков глицина (G) и серина (S) между HSA и BDD-D1L3. Кроме того, длина линкерной последовательности коррелировала с повышенной экспрессией. Например, хотя 12±1,9 относительных единиц экспрессии были получены с линкером из 5 аминокислот (SEQ ID NO: 18), а с линкером из 15 аминокислот (SEQ ID NO: 19) уровень экспрессии составил 32±3,2 относительных единиц, приблизительно 7,5-кратное улучшение наблюдалось при слиянии с HSA без линкера. Кроме того, N-концевое расположение было критическим для улучшенных уровней экспрессии, поскольку C-концевое слияние конструкций линкер-HSA привело к экспрессии на низких уровнях (SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21). Следует отметить, что N-концевое слияние HSA через
- 20 046216 гибкий линкер также значительно увеличивало экспрессию D1L3 дикого типа (SEQ ID NO: 22), примерно в 20 раз по сравнению с нативным D1L3 (SEQ ID NO: 4). В заключение, слияние HSA через линкер с N-концом позволяет продуцировать варианты D1L3, а также BDD-D1L3.
Затем авторы изобретения проверили, является ли природа линкерной последовательности критической для улучшения экспрессии D1L3. Было протестировано две дополнительные последовательности: APAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 33, 14 аминокислот, жесткий линкер) и AEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 34, 12 аминокислот, жесткий, спиральный линкер). Как показано на фиг. 19, в обеих тестовых конструкциях (SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24) наблюдалось сильное увеличение экспрессии, но при жестком спиральном линкере не было достигнуто такого же сильного увеличения уровней экспрессии, как при линкере GGGGSGGGGSGGGGS. Таким образом, длина и кислотный состав линкера влияют на уровни экспрессии D1L3.
Затем била проанализирована взаимосвязь между длиной линкера, уровнем экспрессии и ферментативной активностью. Для этих тестов были сконструированы экспрессионные векторы, содержащие Nконцевое слияние HSA с GS-линкером с вариантами BDD-D1L3 (SEQ ID NO: 25-27). Были протестированы три линкера различной длины:
SGGSGSS [7 аминокислот, (SEQ ID NO: 35)],
SGGSGGSGGSGGSGSS [16 аминокислот, (SEQ ID NO: 36)] и SGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGSS [31 аминокислота: (SEQ ID NO: 37)].
Как показано на фиг. 20, наблюдалось, что удлинение линкерной последовательности с 7 до 16 аминокислот приводит к увеличению уровня экспрессии. Дальнейшее удлинение с 16 до 31 аминокислоты не увеличивало экспрессию белка, но увеличивало ферментативную активность, что определялось по разложению ВМ-хроматина на НМ-хроматин. Биопрепараты, слитые с альбумином, часто демонстрируют пониженную активность, поскольку альбумин стерически препятствует взаимодействию с субстратами и лигандами. Таким образом, пептидные линкеры можно использовать для увеличения расстояния между альбумином и гибридным белком или пептидом. Однако наблюдение, что вставка линкерной последовательности между HSA и D1L3 одновременно улучшает ферментативную активность и уровни экспрессии, было неожиданным.
Было проведено сравнение активности BDD-D1L3 (SEQ ID NO: 14) по деградации хроматина с его гибридным аналогом (SEQ ID NO: 19). Вкратце, мышам Dnase1-/-Dnase113-/- инъецировали SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 19. Сыворотку собирали через 15 мин после инъекции. Как показано на фиг. 21А, сходную активность по деградации хроматина сыворотки наблюдали у обоих животных. Важно отметить, что слияние альбумина с N-концом D1L3 и других внеклеточных ДНК человека обеспечивает терапевтические препараты с увеличенным временем полужизни в отношении ДНКазы. Как описано в данном документе, определили время полужизни SED ID NO: 19, слитого белка HSA-BDD-D1L3 с гибким GS-линкером из 15 аминокислот, на коммерчески доступной модели грызунов. Животная модель характеризуется трансгенной экспрессией FcRn человека, который отвечает за длительное время полужизни альбумина в кровотоке. В то время как неконъюгированный D1L3 (например, SEQ ID NO: 4) имеет очень короткое время полужизни в кровотоке (<30 мин), слияние с альбумином продлило время полужизни до 3,3 дня, тем самым существенно улучшив системное воздействие, а также обеспечив быстрое всасывание с tmax 5 мин (фиг. 21B). В совокупности данные демонстрируют, что N-концевое слияние HSA с D1L3 через линкерную последовательность не только облегчает производство, но также улучшает фармакокинетические свойства D1L3 in vivo.
Наконец, было протестировано двойное слияние HSA с N- и C-концом D1L3. Сперва было проанализировано C-конец D1L3 на предмет потенциальных сайтов прикрепления. Авторы изобретения идентифицировали два остатка серина в положениях 283 и 284, которые обеспечивают гибкое соединение BD (RAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS) с центральной частью D1L3. Таким образом, авторы изобретения удалили BD и решили присоединить HSA через гибкий GS-линкер (SEQ ID NO: 38) к S284. Как показано на фиг. 22, слияние HSA с N- и C-концом BDD-D1L3 (SEQ ID NO: 28) поддерживало высокие уровни экспрессии, которые наблюдались при слиянии HSA с N-концом (SEQ ID NO: 27).
Пример 7. Разработка расщепляемых линкерных последовательностей.
Раскрытые в данном документе результаты имеют значение не только для производства. Например, варианты D1L3 с C-концевыми аминокислотными делециями, которые сохраняют свою ферментативную активность по деградации хроматина и/или NET, как показано с помощью SEQ ID NO: 9-SEQ ID NO: 12, можно использовать для терапии D1L3. Кроме того, сайт-специфическое алкилирование неспаренного цистеинтиола обычно используется для создания биопрепаратов с увеличенным временем полужизни для терапевтических применений. В частности, несущественные цистеины C68 и C194 из D1L3 можно использовать для сайт-специфичного ПЭГилирования (ПЭГ, полиэтиленгликоль). Кроме того, ожидается, что варианты D1L3, устойчивые к инактивации плазмином из-за мутаций, таких как K180_A181delinsGL, P198_A201delinsRPSQ, K259A и R285A, будут иметь улучшенное время полужизни и, следовательно, эффективность в терапевтических применениях.
Важно отметить, что слияние альбумина с N-концом D1L3 и другими внеклеточными ДНК человека обеспечивает терапевтические препараты с увеличенным временем полужизни в отношении ДНКазы
- 21 046216 (фиг. 23А). Несколько линкерных последовательностей использовали для уменьшения стерического ингибирования D1L3 альбумином. Кроме того, был разработан физиологически расщепляемый пептидный линкер. Пептидный линкер был разработан для расщепления, когда слитый белок находится в непосредственной близости от внеклеточных ловушек нейтрофилов (NET). Пептидные последовательности, на которые нацелены специфические для нейтрофилов протеазы, такие как эластаза нейтрофилов, катепсин G и протеиназа 3, являются кандидатами для расщепляемой линкерной последовательности.
Была разработана расщепляемая линкерная последовательность, которая расщепляется внутрисосудисто и, таким образом, оптимальна для внутривенного и внутриартериального применения терапевтических средств на основе ДНКаз. При разработке пептида было учтено, что NET обладают способностью активировать факторы свертывания крови, в частности фактор свертывания XII (FXII). Активированный FXII (FXIIa) имеет два основных субстрата: фактор свертывания крови XI (FXI, SEQ ID NO: 40) и прекалликреин (PK, SEQ ID NO:41). Выравнивание аминокислотной последовательности показало, что сайт расщепления FXIIa консервативен для FXI и PK (фиг. 23B). В FXI сайт расщепления находится между аргинином 387 и изолейцином 388. В PK сайт расщепления находится между аргинином 390 и изолейцином 391. Действительно, FXI и PK являются гомологичными белками. Как описано в данном документе, авторы изобретения разработали несколько пептидных линкеров, которые содержат все или части последовательности FXI с положения от 380 до положения 403 (SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43) или последовательности PK с положения от 383 до положения 406 (SEQ ID NO: 44).
В конечном итоге, линкер, расщепляемый FXIIa, можно использовать для производства варианта других биопрепаратов с увеличенным временем полужизни (фиг. 24), включая, помимо прочего, варианты другой внеклеточной ДНКазы, факторов свертывания крови человека (например, фактора VII, фактора VIII, и фактора IX), а также факторы комплемента (например, фактора H).
Все патенты и патентные публикации, цитируемые в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
ДНКазы человека дикого типа.
SEQ ID NO: 1
ДНКаза1 (NP_005212.2): сигнальный пептид, зрелый белок:
MRGMKLLGALLALAALLQGAVSLKIAAFNIQTFGETKMSNATLVSYIVQILSRYDIALVQEVRDS HLTAVGKLLDNLNQDAPDTYHYVVSEPLGRNSYKERYLFVYRPDQVSAVDSYYYDDGCEPCGNDTFN REPAIVRFFSRFTEVREFAIVPLHAAPGDAVAEIDALYDVYLDVQEKWGLEDVMLMGDFNAGCSYVRP SQWSSIRLWTSPTFQWLIPDSADTTATPTHCAYDRIVVAGMLLRGAVVPDSALPFNFQAAYGLSDQLAQ AISDHYPVEVMLK
SEQ ID NO: 2
ДНКаза1-подобный белок 1 (NP_006721.1): сигнальный пептид; зрелый белок:
MHYPTALLFLILANGAQAFRICAFNAQRLTLAKVAREQVMDTLVRILARCDIMVLQEVVDSSGSA IPLLLRELNRFDGSGPYSTLSSPQLGRSTYMETYVYFYRSHKTQVLSSYVYNDEDDVFAREPFVAQFSLP SNVLPSLVLVPLHTTPKAVEKELNALYDVFLEVSQHWQSKDVILLGDFNADCASLTKKRLDKLELRTEP GFHWVIADGEDTTVRASTHCTYDRVVLHGERCRSLLHTAAAFDFPTSFQLTEEEALNISDHYPVEVELK LSQAHSVQPLSLTVLLLLSLLSPQLCPAA
SEQ ID NO: 3
ДНКаза1-подобный белок 2 (NP_001365.1): сигнальный пептид, зрелый белок:
MGGPRALLAALWALEAAGTAALRIGAFNIQSFGDSKVSDPACGSIIAKILAGYDLALVQEVRDPDL SAVSALMEQINSVSEHEYSFVSSQPLGRDQYKEMYLFVYRKDAVSVVDTYLYPDPEDVFSREPFVVKFS APGTGERAPPLPSRRALTPPPLPAAAQNLVLIPLHAAPHQAVAEIDALYDVYLDVIDKWGTDDMLFLGD FNADCSYVRAQDWAAIRLRSSEVFKWLIPDSADTTVGNSDCAYDRIVACGARLRRSLKPQSATVHDFQ EEFGLDQTQALAISDHFPVEVTLKFHR
SEQ ID NO: 4
ДНКаза1-подобный белок 3, изоформа 1 (NP_004935.1): сигнальный пептид, зрелый белок:
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRI CPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFV VWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNI RLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDH FPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS
SEQ ID NO: 5
ДНКаза1-подобный белок 3, изоформа 2 (NP_001243489.1): сигнальный пептид; зрелый белок:
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRI CPILMEKLNREKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDE LVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYD RIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKR S
SEQ ID NO: 6
ДНКаза 2А (O00115): сигнальный пептид; зрелый белок:
- 22 046216
MIPLLLAALLCVPAGALTCYGDSGQPVDWFVVYKLPALRGSGEAAQRGLQYKYLDESSGGWRD GRALINSPEGAVGRSLQPLYRSNTSQLAFLLYNDQPPQPSKAQDSSMRGHTKGVLLLDHDGGFWLVHS VPNFPPPASSAAYSWPHSACTYGQTLLCVSFPFAQFSKMGKQLTYTYPWVYNYQLEGIFAQEFPDLENV VKGHHVSQEPWNSSITLTSQAGAVFQSFAKFSKFGDDLYSGWLAAALGTNLQVQFWHKTVGILPSNCS DIWQVLNVNQIAFPGPAGPSFNSTEDHSKWCVSPKGPWTCVGDMNRNQGEEQRGGGTLCAQLPALWK AFQPLVKNYQPCNGMARKPSRAYKI
SEQ ID NO: 7
ДНКаза 2В (Q8WZ79): сигнальный пептид; зрелый белок:
MKQKMMARLLRTSFALLFLGLFGVLGAATISCRNEEGKAVDWFTFYKLPKRQNKESGETGLEYL YLDSTTRSWRKSEQLMNDTKSVLGRTLQQLYEAYASKSNNTAYLIYNDGVPKPVNYSRKYGHTKGLL LWNRVQGFWLIHSIPQFPPIPEEGYDYPPTGRRNGQSGICITFKYNQYEAIDSQLLVCNPNVYSCSIPATF HQELIHMPQLCTRASSSEIPGRLLTTLQSAQGQKFLHFAKSDSFLDDIFAAWMAQRLKTHLLTETWQRK RQELPSNCSLPYHVYNIKAIKLSRHSYFSSYQDHAKWCISQKGTKNRWTCIGDLNRSPHQAFRSGGFICT QNWQIYQAFQGLVLYYESCK
Вариант ДНКазаЩ3 человека
SEQ ID NO: 8
ДНКаза1-подобный белок 3, Q101R( сигнальный пептид; зрелый белок)
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRI CPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKERYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFV VWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNI RLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDH FPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS
SEQ ID NO: 9
ДНКазаШЗ, Q282_S305delinksK (сигнальный пептид; зрелый белок):
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRI CPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFV VWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNI RLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDH FPVEFKLK
SEQ ID NO: 10
ДНКазаШЗ, S305delinsK (сигнальный пептид; зрелый белок):
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRI CPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFV VWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWGLENFIFMGDFNAGCSYVRPSQWKNI RLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQAAYKLTEEEALDVSDH FPVEFKLQSSRAFTNS
SEQ ID NO: 11
ДНКаза1Ь3, K292_S305del (сигнальный пептид; зрелый белок):
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRI CPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFV VWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWGLENFIFMGDFNAGCSYVRPSQWKNI RLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQAAYKLTEEEALDVSDH FPVEFKLQSSRAFTNSK
SEQ ID NO: 12
ДНКаза1Ь3, S293_S305del (сигнальный пептид; зрелый белок):
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRI CPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFV VWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWGLENFIFMGDFNAGCSYVRPSQWKNI RLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQAAYKLTEEEALDVSDH FPVEFKLQSSRAFTNSKK
SEQ ID NO: 13
ДНКаза1Ь3, C68A (сигнальный пептид; зрелый белок):
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRI APILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPF VVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWK NIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVS DHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS
SEQ ID NO: 14
ДНКаза1Ь3, F275Y/F279_K280delinsVM/Q282_S305delinsK (сигнальный пептид; зрелый белок):
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRI CPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFV VWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNI
- 23 046216
RLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDH YPVEVMLK
SEQ ID NO: 15
ДНКазаШЗ, S283_S305del (сигнальный пептид; зрелый белок):
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRI CPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFV VWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNI RLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDH FPVEFKLQ
SEQ ID NO: 16
ДНКазаШЗ, R285_S305del (сигнальный пептид; зрелый белок):
MSRELAPLLLLLLSIHSALAMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRI CPILMEKLNREKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDE LVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYD RIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSS
ДНКаза1Ь3, слитая с альбумином, и варианты
SEQ ID NO: 17
Альбумин - вариант ДНКаза1Ь3 - слитый белок. (Альбумин, вариант ДНКаза1Ь3):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDK SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNE ETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLK CASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICEN QDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQN ALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDR VTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKE QLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMD VIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVK RSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAE NFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKS NSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHYPVEVMLK
SEQ ID NO: 18
Альбумин - вариант ДНКаза1Ь3 - слитый белок. (Альбумин, вариант ДНКаза1Ь3):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDK SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNE ETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLK CASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICEN QDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQN ALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDR VTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKE QLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSMRICSFNVRSFGESKQEDK NAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEK LVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHR WKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSS VVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHYPVEVMLK
SEQ ID NO: 19
Альбумин - вариант ДНКаза1Ь3 - слитый белок. (Альбумин, вариант ДНКаза1Ь3):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDK SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNE ETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLK CASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICEN QDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQN ALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDR VTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKE QLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSGGGGSMRICSFNV RSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYK EQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDEL VEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDR IVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHYPVEVMLK
SEQ ID NO: 20
- 24 046216
Вариант ДНКазаШЗ - Альбумин - слитый белок. (Альбумин, вариант ДНКазаШЗ):
MRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNY VISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHT TPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTT VKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHYPVEVMLKGGGGSDAHKS EVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDK LCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLY EIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGE RAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLK ECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVV LLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTK KVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESL VNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDD FAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO: 21
Вариант ДНКазаШЗ - Альбумин - слитый белок. (Альбумин, вариант ДНКазаШ3):
MRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNY VISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHT TPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTT VKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHYPVEVMLKGGGGSGGGGS GGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCD KSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDN EETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLK CASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICEN QDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQN ALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDR VTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKE QLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO: 22
Альбумин - ДНКазаШ3 - слитый белок. (Альбумин, ДНКазаШ3):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDK SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNE ETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLK CASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICEN QDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQN ALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDR VTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKE QLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSGGGGSMRICSFNV RSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYK EQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDEL VEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDR IVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS
SEQ ID NO: 23
Альбумин - ДНКазаШ3 - слитый белок. (Альбумин, ДНКазаШ3):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDK SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNE ETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLK CASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICEN QDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQN ALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDR VTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKE QLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAPAPAPAPAPAPAPMRICSFNVRSF GESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQ YAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVE VYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIV LRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS
SEQ ID NO: 24
Альбумин - ДНКазаШ3 - слитый белок. (Альбумин, ДНКазаШ3):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDK
- 25 046216
SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNE ETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLK CASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICEN QDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQN ALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDR VTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKE QLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAEAAAKEAAAKAMRICSFNVRSF GESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQ YAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVE VYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIV LRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS
SEQ ID NO: 25
Альбумин - вариант ДНКазаШЗ - слитый белок. (Альбумин, варианты ДНКаза1Ь3):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDK SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNE ETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLK CASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICEN QDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQN ALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDR VTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKE QLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLSGGSGSSMRICSFNVRSFGESKQED KNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKE KLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKH RWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVS SVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQ
SEQ ID NO: 26
Альбумин - вариант ДНКаза1Ь3 - слитый белок. (Альбумин, вариант ДНКаза1Ь3):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDK SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNE ETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLK CASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICEN QDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQN ALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDR VTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKE QLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLSGGSGGSGGSGGSGSSMRICSFNV RSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGITYNYVISSRLGRNTYK EQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDEL VEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDR IVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQ
SEQ ID NO: 27
Альбумин - вариант ДНКаза1Ь3 - слитый белок. (Альбумин, вариант ДНКаза1Ь3):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDK SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNE ETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLK CASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICEN QDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQN ALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDR VTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKE QLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSG GSGGSGSSMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGI TYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVI IPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQ EDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQ
SEQ ID NO: 28
Альбумин - вариант ДНКаза1Ь3 - Альбумин - слитый белок. (Альбумин, вариант ДНКазаШ3):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDK SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNE ETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLK
- 26 046216
CASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICEN QDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQN ALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDR VTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKE QLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSG GSGGSGSSMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNRNSRRGI TYNYVISSRLGRNTYKEQYAFLYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVI IPLHTTPETSVKEIDELVEVYTDVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQ EDTTVKKSTNCAYDRIVLRGQEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSGGSGG SGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVN EVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNL PRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCH GDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVC KNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEP QNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDY LSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQ IKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO: 29
Альбумин - изоформа 2 ДНКаза1Ь3 - слитый белок. (Альбумин, изоформа 2 ДНКаза1Ь3):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDK SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNE ETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLK CASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICEN QDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQN ALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDR VTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKE QLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSG GSGGSGSSMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNREQYAF LYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYT DVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRG QEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQSSRAFTNSKKSVTLRKKTKSKRS
SEQ ID NO: 30
Альбумин - вариант изоформы 2 ДНКаза1Ь3 - слитый белок. (Альбумин, ДНКазаШЗ изоформа 2):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDK SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNE ETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLK CASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICEN QDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQN ALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDR VTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKE QLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSG GSGGSGSSMRICSFNVRSFGESKQEDKNAMDVIVKVIKRCDIILVMEIKDSNNRICPILMEKLNREQYAF LYKEKLVSVKRSYHYHDYQDGDADVFSREPFVVWFQSPHTAVKDFVIIPLHTTPETSVKEIDELVEVYT DVKHRWKAENFIFMGDFNAGCSYVPKKAWKNIRLRTDPRFVWLIGDQEDTTVKKSTNCAYDRIVLRG QEIVSSVVPKSNSVFDFQKAYKLTEEEALDVSDHFPVEFKLQ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ЛИНКЕРА
SEQ ID NO: 31
GGGGS
SEQ ID NO: 32
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 33
APAPAPAPAPAPAP
SEQ ID NO: 34
AEAAAKEAAAKA
SEQ ID NO: 35
SGGSGSS
SEQ ID NO: 36
SGGSGGSGGSGGSGSS
- 27 046216
SEQ ID NO: 37
SGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGS
SEQ ID NO: 38
GGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGS
ДРУГИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
SEQ ID NO: 39
Альбумин сыворотки человека (зрелый белок):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDK SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNE ETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLK CASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICEN QDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQN ALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDR VTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKE QLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO: 40
Фактор XI человека:
MIFLYQVVHFILFTSVSGECVTQLLKDTCFEGGDITTVFTPSAKYCQVVCTYHPRCLLFTFTAESPS EDPTRWFTCVLKDSVTETLPRVNRTAAISGYSFKQCSHQISACNKDIYVDLDMKGINYNSSVAKSAQEC QERCTDDVHCHFFTYATRQFPSLEHRNICLLKHTQTGTPTRITKLDKVVSGFSLKSCALSNLACIRDIFPN TVFADSNIDSVMAPDAFVCGRICTHHPGCLFFTFFSQEWPKESQRNLCLLKTSESGLPSTRIKKSKALSGF SLQSCRHSIPVFCHSSFYHDTDFLGEELDIVAAKSHEACQKLCTNAVRCQFFTYTPAQASCNEGKGKCY LKLSSNGSPTKILHGRGGISGYTLRLCKMDNECTTKIKPRIVGGTASVRGEWPWQVTLHTTSPTQRHLC GGSIIGNQWILTAAHCFYGVESPKILRVYSGILNQSEIKEDTSFFGVQEIIIHDQYKMAESGYDIALLKLET TVNYTDSQRPICLPSKGDRNVIYTDCWVTGWGYRKLRDKIQNTLQKAKIPLVTNEECQKRYRGHKITH KMICAGYREGGKDACKGDSGGPLSCKHNEVWHLVGITSWGEGCAQRERPGVYTNVVEYVDWILEKT QAV
SEQ ID NO: 41
Прекалликреин человека:
MILFKQATYFISLFATVSCGCLTQLYENAFFRGGDVASMYTPNAQYCQMRCTFHPRCLLFSFLPAS SINDMEKRFGCFLKDSVTGTLPKVHRTGAVSGHSLKQCGHQISACHRDIYKGVDMRGVNFNVSKVSSV EECQKRCTNNIRCQFFSYATQTFHKAEYRNNCLLKYSPGGTPTAIKVLSNVESGFSLKPCALSEIGCHMN IFQHLAFSDVDVARVLTPDAFVCRTICTYHPNCLFFTFYTNVWKIESQRNVCLLKTSESGTPSSSTPQENT ISGYSLLTCKRTLPEPCHSKIYPGVDFGGEELNVTFVKGVNVCQETCTKMIRCQFFTYSLLPEDCKEEKC KCFLRLSMDGSPTRIAYGTQGSSGYSLRLCNTGDNSVCTTKTSTRIVGGTNSSWGEWPWQVSLQVKLT AQRHLCGGSLIGHQWVLTAAHCFDGLPLQDVWRIYSGILNLSDITKDTPFSQIKEIIIHQNYKVSEGNHDI ALIKLQAPLNYTEFQKPICLPSKGDTSTIYTNCWVTGWGFSKEKGEIQNILQKVNIPLVTNEECQKRYQD YKITQRMVCAGYKEGGKDACKGDSGGPLVCKHNGMWRLVGITSWGEGCARREQPGVYTKVAEYMD WILEKTQSSDGKAQMQSPA
АКТИВИРУЕМЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЛИНКЕРА
SEQ ID NO: 42
FXIIa-чувствительный линкер (пептид фактора XI):
CTTKIKPRIVGGTASVRGEWPWQVT
SEQ ID NO: 43
FXIIa-чувствительный линкер
GGGGSPRIGGGGS
SEQ ID NO: 44
FXIIa-чувствительный линкер (прекалликреиновый пептид):
VCTTKTSTRIVGGTNSSWGEWPWQVS
EQ ID NO: 45
FXIIa-чувствительный линкер (прекалликреиновый пептид):
STRIVGG
СИГНАЛЬНЫЕ ПЕПТИДЫ
SEQ ID NO: 46 α-фактор спаривания (P01149):
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFIN TTIASIAAKEEGVS
SEQ ID NO: 47
Пептид секреторного сигнала альбумина человека+пропептид (P02768):
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR
SEQ ID NO: 48
-
Claims (11)
- Сигнальный пептид ДНКазаШЗ человека (Q13609):MSRELAPLLLLLLSIHSALAФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Вариант ДНКаза1-подобного белка 3 (D1L3), где вариант D1L3 представляет собой слитый белок, который содержит:аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична зрелому ферменту, определенному аминокислотами 21-282 SEQ ID NO: 4;аминокислотную последовательность альбумина на N-концевой стороне зрелого фермента, где указанный альбумин имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 39; и линкерную аминокислотную последовательность между аминокислотной последовательностью альбумина и аминокислотной последовательностью зрелого фермента, где указанная линкерная аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 15 аминокислот и состоит из остатков серина и глицина, где вариант D1L3 имеет делецию по меньшей мере 5 аминокислот С-концевого основного домена, причем С-концевой основной домен определяется 23 С-концевыми аминокислотами SEQ ID NO: 4.
- 2. Вариант D1L3 по п.1, где вариант D1L3 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична зрелому ферменту, определенному SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.
- 3. Вариант D1L3 по п.1, где D1L3 имеет делецию по меньшей мере 10 аминокислот или по меньшей мере 15 аминокислот С-концевого основного домена или делецию всего С-концевого основного домена.
- 4. Вариант D1L3 по любому из пп.1-3, где D1L3 имеет аминокислотную замену в положении, соответствующем положению 101 SEQ ID NO: 4, необязательно, где D1L3 имеет аминокислотную замену, которая представляет собой Q101R.
- 5. Вариант D1L3 по п.1, где линкер представляет собой гибкий линкер, жесткий линкер или содержит сайт расщепления протеазой, необязательно, где линкер имеет по меньшей мере 10 аминокислот или по меньшей мере 15 аминокислот, необязательно, где линкер имеет от 15 до 35 аминокислот.
- 6. Вариант D1L3 по п.1, где вариант содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 8-30, в каждом случае необязательно имеющую от одной до двадцати аминокислотных модификаций, независимо выбранных из вставок, делеций или замен, необязательно, где вариант имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30.
- 7. Вариант D1L3 по любому из пп.1-6, содержащий одну или более замен структурных блоков из D1 и/или одну или более делеций или замен остатков цистеина по сравнению с ферментом SEQ ID NO: 4, необязательно, где заменена аминокислота, соответствующая С68 в SEQ ID NO: 4, необязательно, где аминокислота, соответствующая С68 в SEQ ID NO: 4, заменена аминокислотой, выбранной из Ala, Ser и Gly, необязательно, где вариант содержит замену N64_I70delinsHLTAVGK, которая необязательно модифицирована одной, двумя или тремя аминокислотными заменами, делециями или вставками, при условии, что замена структурного блока не модифицирована для включения остатка цистеина.
- 8. Вариант D1L3 по п.1, содержащий конъюгацию ПЭГ с аминокислотой, соответствующей С68 и/или С194.
- 9. Вариант D1L3 по п.1, имеющий одну или более замен остатков аргинина и лизина, которые присутствуют в SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5, где замена делает вариант D1L3 менее чувствительным к протеолизу плазмином, тромбином и/или трипсином по сравнению с белком SEQ ID NO: 4 или белком SEQ ID NO: 5, необязательно, где одна или более замен аргинина и лизина соответствуют следующему(им) положению(ям) SEQ ID NO: 4: K180, K200, K259 и R285;необязательно, где замена аргинина или лизина выбрана из одного или более из К18ОА, К2ООА, К259А и R285A в отношении SEQ ID NO: 4;необязательно, где вариант содержит замену, выбранную из K180_A181delinsGL, P198_A201delinsRPSQ и К259А в отношении SEQ ID NO: 4, где вариант содержит одну или более мутаций парного основного остатка, причем парный основной остаток соответствует положению, выбранному из K50/R51, R80/R81, K114/R115, K199/K200, K226/K227, K291/K292, R297/K298/K299 и K303/R304 из SEQ ID NO: 4;необязательно, где одна или более мутаций парного основного остатка включают аминокислотную замену, выбранную из R114T, R114A, R114D, R114Q, K227S и К227Е в отношении SEQ ID NO: 4, необязательно, где одна или более мутаций парного основного остатка включают аминокислотную замену, выбранную из R51K, R81K, R115K и R304K в отношении SEQ ID NO: 4.
- 10. Вариант D1L3 по п.6, где линкер расщепляется протеазой системы коагуляции, необязательно, где линкер расщепляется фактором XII или протеазой нейтрофилов.
- 11. Выделенный полинуклеотид, кодирующий вариант D1L3 по любому из пп.1-10.-
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/742,682 | 2018-10-08 | ||
| US62/775,563 | 2018-12-05 | ||
| US62/779,104 | 2018-12-13 | ||
| US62/808,601 | 2019-02-21 | ||
| US62/846,904 | 2019-05-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA046216B1 true EA046216B1 (ru) | 2024-02-16 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10988746B2 (en) | Manufacturing and engineering of DNASE enzymes for therapy | |
| US11578314B2 (en) | Engineering of DNASE enzymes for manufacturing and therapy | |
| US6468731B1 (en) | Enzyme-mediated modification of fibrin for tissue engineering: incorporation of proteins | |
| US20080227691A1 (en) | Blood Coagulation FVIII Analogues | |
| AU2021225156B2 (en) | UTI fusion proteins | |
| CZ20031718A3 (cs) | Polypeptidická proteáza štěpící von Willebrandův faktor (vWF), nukleová kyselina kódující tento polypeptid a použití tohoto polypeptidu | |
| JP2738428B2 (ja) | トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進する作用を有するペプチド | |
| US20210299178A1 (en) | Methods of using dnase1-like 3 in therapy | |
| EP1863910A1 (en) | Targeted plasminogen activator fusion proteins as thrombolytic agents | |
| RU2109816C1 (ru) | Рекомбинантный полипептид, способ ингибирования агрегации тромбоцитов, рекомбинантная плазмидная днк (варианты), рекомбинантный штамм e.coli (варианты), способ получения полипептида | |
| WO2023164034A2 (en) | Dnase enzymes engineered for improved stability | |
| EA046216B1 (ru) | РАЗРАБОТКА ДНКаз ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА И ТЕРАПИИ | |
| US20220259579A1 (en) | Engineered human extracellular dnase enzymes | |
| CA2247998C (en) | Fragments of cr1 and their use | |
| AU645077C (en) | Cloning and production of human von willebrand factor GPIb binding domain polypeptides and methods of using same | |
| AU2022223409A9 (en) | Dnase fusion polypeptides and related compositions and methods | |
| JPH02231083A (ja) | 組換ナチュラルキラー細胞活性化因子 | |
| JPH02268689A (ja) | プロテアーゼ発現ベクターおよびそれを用いたプロテアーゼの生産方法 |