KR101331101B1 - 인자 ｖｉｉ 활성을 갖는 융합 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인자 VII(FVII) 및 트랜스페린을 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FVII 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 트랜스페린을 포함하는 본 발명에 따른 융합 단백질은 기존의 다른 융합 파트너에 결합된 FVII과 비교하여 증가된 비활성을 가지므로 FVII을 이용한 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 인자 VII(FVII) 활성을 갖는 융합 단백질에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 비융합된 천연형 FVII과 비교하여 0.7 이상의 FVII 비활성(specific activity)을 갖는, FVII 및 트랜스페린을 포함하는 융합 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
혈액 응고 인자의 결핍을 원인으로 하는 출혈 장애는 종류가 다양하다. 가장 일반적인 장애는 혈액 응고 인자 VIII 및 IX의 결핍으로부터 각각 초래되는 혈우병 A 및 B이다.
A형 혈우병은 유전성 출혈 질환이다. 이는 혈액 응고 인자 VIII의 염색체 X-연관된 결함으로 인한 것이며, A형 혈우병의 치료를 위해 혈장 유래의 인자 VIII 농축물 또는 인자 VIII의 재조합 형태의 농축물이 사용되었다. B형 혈우병은 비기능성 인자 IX 또는 인자 IX의 결여로 인해 유발되며, 혈장 유래의 인자 IX 농축물 또는 인자 IX의 재조합 형태로 치료된다. 그러나, A형 혈우병 및 B형 혈우병의 치료에서 심각한 의학적 문제는 대체 인자에 대한 알로항체(alloantibody)의 발생이다. A형 혈우병 환자의 최대 30%에서 인자 VIII에 대한 항체가 형성된다. 인자 IX에 대한 항체는 보다 덜 발생하지만, 이들 항체가 면역 내성 유도 치료법에 대해 덜 감수성이기 때문에 보다 심각한 결과를 초래한다.
응고는 혈관벽의 손상 후에 순환하는 혈액에 노출되는 조직 인자(Tissue Factor)와 인자 VII(FVII)의 활성화 형태인 인자 VIIa(FVIIa)의 복합체 형성에 의해 개시된다. 이러한 복합체는 인자 IX 및 인자 X을 활성화시켜 일부 트롬빈을 생성시킨다. 양성 피드백 루프에서, 트롬빈은 혈액 응고 캐스케이드(blood coagulation cascade)의 여러 인자(인자 VIII, 인자 V, 인자 XI 등)를 활성화시키고, 이들은 완전한 트롬빈 발생을 위해 필수적인 인자 Xase 복합체(Factor Xase complex) 및 프로트롬비나아제 복합체(prothrombinase complex)의 성분을 이루거나 그 성분을 생성하여, 충분한 양의 트롬빈 생성을 유도한다. 생성된 고농도의 트롬빈은 응고과정에서 여러 다른 중요한 역할을 수행하며 최종적으로는 출혈부위의 피브리노젠을 피브린으로 전환시킴으로써 완전히 지혈시킨다. 그러나 인자 VIII 및 인자 IX에 대한 고농도의 중화항체를 지닌 혈우병 환자들의 경우는 언급한 복합체들의 생성이 이뤄지지 않음으로써 충분한 지혈이 이뤄지지 않게 된다. FVIIa는 인자 VIII 및 인자 IX 없이도(혹은 포함된 경로를 거치지 않고도) 인자 X을 활성화 시켜 궁극적으로 치료효과를 얻을 수 있는 양의 트롬빈을 생성시킴으로써 인자 VIII 및 인자 IX에 대한 중화항체를 지닌 환자들에게 주요한 치료제로 사용되었다.
FVII은 406개 아미노산으로 구성된 단일쇄 당단백질이고 분자량이 약 50kDa이며 불활성 자이모겐(zymogen)으로서 간세포에 의해 혈류로 분비된다. FVII은 아미노말단-카복시글루탐산(Gla) 도메인, 두 개의 상피성장인자 유사(EGF-like) 도메인 및 세린 프로테아제 도메인의 네 개의 도메인으로 이루어져 있다(Hagen FS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83(8):2412-2416, 1986). FVII은 Arg152-Ile153에서의 단일 펩타이드 결합이 단백질 분해되어, 이황화결합에 의해 연결되어 있는 2개의 폴리펩타이드 쇄, 즉 N-말단 경쇄(24kDa) 및 C-말단 중쇄(28kDa)를 형성함으로써 활성 형태의 FVIIa로 전환된다. FVII은 혈장에 500 ng/ml의 농도로 존재하는데, 이의 1%, 즉 5 ng/ml의 FVII은 FVIIa로서 존재한다.
한편, FVII의 혈장 반감기는 약 4시간(3~6시간)이고 FVIIa의 반감기는 약 2.5시간인 것으로 밝혀졌다. FVIIa의 반감기가 2.5시간 밖에 되기 않기 때문에 지혈을 위해 다중 정맥내 주사 또는 연속 주입을 필요로 하며, 이는 치료 비용을 높이고 환자를 불편하게 하기 때문에 FVIIa의 치료학적 용도를 위해서는 심각한 결점이다.
이러한 문제점을 극복하고자, FVII에 단백질 융합 파트너를 결합한 융합 단백질을 제조하는 방안이 제시되었으나, 비융합된 단백질과 비교하여 짧은 생체내 반감기는 어느 정도 개선된 반면, FVII의 생물학적 활성을 잃게 되는 문제점이 있었다.
따라서, FVII의 광범위한 적용을 위하여 증가된 생체내 반감기를 가지면서도 천연형 FVII의 생물학적 활성을 보유하는 FVII 융합 단백질의 제공 및 확보가 요구되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 천연형 FVII의 생물학적 활성을 보유하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 인자 VII(FVII) 및 트랜스페린을 포함하며, 상기 트랜스페린은 상기 FVII의 C-말단에 연결된 융합 단백질을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 융합 단백질 서열을 코딩하는 유전자를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명에 따른 FVII 활성을 갖는 융합 단백질은 천연형 FVII에 비해 증가된 생체내 반감기를 가지면서도 높은 FVII의 생물학적 활성을 보유하므로, FVII을 이용한 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 FVII 서열을 코딩하는 cDNA를 포함하는 벡터 및 트랜스페린(Tf) 서열을 코딩하는 cDNA를 포함하는 벡터로부터 FVII-Tf 발현 벡터를 제조하기 위한 클로닝 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 중첩 PCR(overlapping PCR)을 이용하여 FVII-GS1(링커)-Tf 발현 벡터를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 링커로서 GS3, GS5, GS7, GS9, GS11, GS13, GS15 또는 GS-1-T를 포함하는 FVII-GS 링커-Tf 발현 벡터를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본원발명의 융합 단백질인 FVII-Tf, FVII-GS1-Tf, FVII-GS3-Tf, FVII-GS5-Tf, FVII-GS7-Tf, FVII-GS9-Tf, FVII-GS11-Tf, FVII-GS13-Tf, FVII-GS15-Tf, FVII-GS1-T-Tf 및 FVII-Helix-Tf, FVII-알부민 융합 단백질(FVII-Alb) 및 FVII(NovoSevenTM)을 웨스턴 블랏(Western blot)으로서 확인한 결과이다.
도 5는 본원발명의 융합 단백질인 FVII-Tf, FVII-GS1-Tf, FVII-GS3-Tf, FVII-GS5-Tf, FVII-GS7-Tf, FVII-GS9-Tf, FVII-GS11-Tf, FVII-GS13-Tf, FVII-GS15-Tf, FVII-GS1-T-Tf 및 FVII-Helix-Tf와 FVII-알부민 융합 단백질(FVII-Alb)의 비활성을 비교한 그래프이다.
도 6은 본원발명의 융합 단백질인 FVII-GS1-T-Tf의 링커 및 양 말단의 제한효소 인식서열의 구조를 나타낸 것이다.
도 7은 본원발명의 정제된 융합 단백질인 FVII-Tf, FVII-GS1-Tf, FVII-GS1-T-Tf, FVII-GS3-Tf, 및 FVII-GS15-Tf와 노보세븐(NovoSevenTM) 및 FVII의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 중첩 PCR(overlapping PCR)을 이용하여 FVII-GS1(링커)-Tf 발현 벡터를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 링커로서 GS3, GS5, GS7, GS9, GS11, GS13, GS15 또는 GS-1-T를 포함하는 FVII-GS 링커-Tf 발현 벡터를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본원발명의 융합 단백질인 FVII-Tf, FVII-GS1-Tf, FVII-GS3-Tf, FVII-GS5-Tf, FVII-GS7-Tf, FVII-GS9-Tf, FVII-GS11-Tf, FVII-GS13-Tf, FVII-GS15-Tf, FVII-GS1-T-Tf 및 FVII-Helix-Tf, FVII-알부민 융합 단백질(FVII-Alb) 및 FVII(NovoSevenTM)을 웨스턴 블랏(Western blot)으로서 확인한 결과이다.
도 5는 본원발명의 융합 단백질인 FVII-Tf, FVII-GS1-Tf, FVII-GS3-Tf, FVII-GS5-Tf, FVII-GS7-Tf, FVII-GS9-Tf, FVII-GS11-Tf, FVII-GS13-Tf, FVII-GS15-Tf, FVII-GS1-T-Tf 및 FVII-Helix-Tf와 FVII-알부민 융합 단백질(FVII-Alb)의 비활성을 비교한 그래프이다.
도 6은 본원발명의 융합 단백질인 FVII-GS1-T-Tf의 링커 및 양 말단의 제한효소 인식서열의 구조를 나타낸 것이다.
도 7은 본원발명의 정제된 융합 단백질인 FVII-Tf, FVII-GS1-Tf, FVII-GS1-T-Tf, FVII-GS3-Tf, 및 FVII-GS15-Tf와 노보세븐(NovoSevenTM) 및 FVII의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 인자 VII(FVII) 및 트랜스페린을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 융합 단백질의 FVII 잔기 및 트랜스페린 잔기는 임의의 포유동물, 바람직하게는 인간 FVII 및 인간 트랜스페린으로부터 유래할 수 있다. 보다 바람직하게는, 인간의 혈액에서 발견되는 각각의 천연형 단백질과 95% 이상의 서열 상동성을 갖는다. 가장 바람직하게는, FVII은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지며, 트랜스페린은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다.
또한, 본 발명의 융합 단백질에는 실질적으로 동등한 기능적인 활성을 갖는 기능적 동등물 또는 기능적 유도체가 포함된다. 이러한 기능적 동등물의 예로서, 서열번호 1 및 2로 표시되는 각 아미노산 서열에서의 임의의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환되거나 또는 이들의 조합에 의해 변이된 변이체를 예시할 수 있으며, 이 때 당해 변화는 FVII의 생물학적 활성을 부여하는 활성 부위 또는 활성 도메인을 실질적으로 변화시키지 않는다.
경우에 따라, 본 발명의 융합 단백질은 이들의 물리, 화학적 성질을 증가 또는 감소시키는 변형을 가질 수 있어 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수 있으며, 이러한 수식에 의해 FVII의 활성이 실질적으로 유지되는 한, 이러한 기능적 유도체도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 융합 단백질은 트랜스페린이 FVII의 C-말단에 연결되는 것이 바람직하다. 상기 FVII-트랜스페린의 순서로 연결된 융합 단백질의 경우 FVII의 N 말단이 드러나 트랜스페린-FVII의 순서로 연결된 융합 단백질에 비해 치료제로서의 효과가 뛰어나다(표 3 참조).
본 발명의 융합 단백질은 하기 설명될 링커의 삽입을 용이하게 하기 위하여, FVII와 트랜스페린 사이에 제한효소 인식 서열을 포함할 수 있다. 상기 제한효소로는 당해 기술분야에 알려진 다양한 제한효소 인식 서열이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 Age I 인식 서열(A/CCGGT)을 포함할 수 있다. 즉, FVII의 C-말단에 제한효소 인식 서열이 연결되고, 이에 트랜스페린이 연결된 융합 단백질이 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명은 상기 융합 단백질의 FVII 잔기와 트랜스페린 잔기의 사이에 링커를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
링커는 1 내지 100개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 75개의 아미노산, 보다 바람직하게는 5 내지 25개의 아미노산을 가질 수 있는데, FVII 잔기와 트랜스페린 잔기를 분리시킬 수 있는 어떠한 펩타이드라도 가능하다. 링커는 나선형과 같은 안정한 2차 구조를 갖거나 IgG 힌지(hinge) 부분으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 링커는 수용액 상에서 자유롭게 회전 가능하고 고정된 구조를 갖지 않아, 비면역원성이며, 두 융합 파트너의 잠재적 간섭을 최소화하여 융합 단백질의 FVII 활성을 증가시킨다. 이러한 링커로서, 상기 링커는 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 나선형 링커일 수 있다. 또한, 이러한 유연한 링커는 글라이신(G) 및 세린(S)을 반복적으로 또는 무작위적 패턴으로 포함할 수 있다. 링커의 예는, (GGGGS)N을 포함하고(N은 1 내지 20의 정수임), 바람직하게는, 상기 링커는 서열번호 3 내지 10의 아미노산 서열을 갖는다(표 1 참조). 또한, 상기 링커의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 바람직하게는 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 역시 본 발명의 융합 단백질에 사용될 수 있다.
나아가, 상기 링커는 손상된 조직에 풍부하게 존재하는 프로테아제에 의해 인식될 수 있는, 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 상기 절단 부위는 트롬빈, 인자 Xa, 인자 IXa 및 인자 VIIa로 이루어진 군에서 선택되는 프로테아제에 의해 절단되는 부위일 수 있다. 이러한 프로테아제 절단 부위를 포함하는 융합 단백질은 작용 부위(working site)에서 FVII 및 트랜스페린의 각각의 단백질로 분리되어 개별 단백질로서 기능하게 된다. 바람직하게는, 상기 링커는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는다(표 1 참조).
상기 링커는 FVII과 트랜스페린 사이에 삽입되어 있는 제한효소 인식 서열을 통해 보다 용이하게 삽입될 수 있다. 따라서, 상기 링커의 앞이나 뒷부분, 또는 이들 모두에 제한효소 인식 서열이 존재할 수 있으며, 이들은 상기 서열에 해당하는 아미노산으로 번역될 수 있다. 일례로, Age I 제한효소 인식 서열이 사용되는 경우, 상기 링커의 앞에 Thr이 존재하고, 상기 링커의 뒤에 Thr-Gly이 존재할 수 있다. 즉, (GGGGS)3과 같은 링커가 사용되는 경우, --T(GGGGS)3TG--의 형태로 존재한다. 상기 링커 앞뒤에 번역되는 아미노산은 사용되는 제한효소 인식 서열에 따라 달라질 수 있으나, 이의 존재로 인하여 융합 단백질이 활성에 변화가 생기지는 않는다(표 5 참조).
상기 융합 단백질은 비융합된 천연형 FVII과 비교하여 0.7 이상의 FVII 비활성(specific activity)을 나타낸다.
본 발명의 하나의 실시 태양에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FVII 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 트랜스페린을 포함하는 융합 단백질은, 비융합된 천연형 FVII과 비교하여 약 0.82 내지 0.92의 FVII 비활성을 갖는다(표 2 및 3 참조).
또한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FVII, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 링커 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 트랜스페린을 포함하는 융합 단백질은, 비융합된 천연형 FVII과 비교하여 약 0.97의 FVII 비활성을 갖는다(표 2 참조).
이외 다른 링커를 FVII과 트랜스페린 사이에 삽입시킨 융합 단백질도 비융합된 천연형 FVII과 비교하여 약 0.74 내지 1의 FVII 비활성을 갖는다(표 2 참조).
나아가, 본 발명의 융합 단백질은 트랜스페린이 결합되지 않은 FVII에 비해 3~4배 정도 긴 반감기를 갖는다(표 6 참조).
본 발명은 또한, 상기 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 제공한다.
상기 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 융합 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 DNA 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명에서 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 바람직하게는 서열번호 13 내지 24의 염기서열로 표시되는 DNA이다. 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 이를 발현하는 벡터에 의해 제공될 수 있다.
본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 "벡터"는 숙주 세포에 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 도입하여 융합 단백질을 발현시키기 위한 수단을 말하며, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함하고, 바람직하게는 플라스미드 벡터이다.
적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 세포 DNA에 통합될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 pcDNA3.1-hygro 벡터에 상기 융합 단백질 서열을 코딩하는 DNA를 삽입하여 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환되어 융합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 제공한다.
숙주 세포에 따라서 단백질의 발현양과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주 세포를 선택하여 사용한다. 숙주 세포로는, 포유동물 세포, 예컨대, 차이니스 햄스터 난소 세포(CHO), 인간 배아 신장 세포(HEK293), 햄스터 신장 세포(BHK 21), 인간 간암 세포(Hep G2) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키기 위하여 당 분야에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 이러한 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합법, 인산 칼슘(CaPO4) 침전법 및 염화 칼슘(CaCl2) 침전법 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인자 VII(FVII) 플라스미드 벡터(pcDNA3.1-hygro-FVII)의 제조
Hep G2 세포(KCLB No. 88065)로부터 정제한 RNA를 역전사를 위한 주형으로 사용하였다. cDNA 전사체를 PCR을 통해 FVII 유전자 특이적인 프라이머 FVII-F 및 FVII-R(서열번호 25 및 26)를 이용하여 인간 FVII 유전자의 ORF(open reading frame)를 증폭하였다. 상기 PCR은 50μL의 반응액(0.5μL의 cDNA, 각 0.4μM의 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머(10pmol/μL), 0.2mM dNTP, 5unit Taq DNA 폴리머라아제 및 물)을 94℃에서 5분 반응시키고, 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 2.5분 반응시키는 것을 1 사이클로 하여 35 사이클 반응시킨 후, 72℃에서 5분 반응시킴으로써 종결시켰다. 정제한 PCR 생성물을 pGEM-T easy 벡터(Promega, Cat #: A1360)에 클로닝하였다. 제한효소 EcoRI 및 NcoI을 처리하여 양성 클론을 선별하였다. 선별한 클론을 DNA 시퀀싱(sequencing)으로 확인하였다. 상기 FVII의 ORF(FVII-ORF)를 발현 벡터로 전달하기 위해, pGEM-T easy 벡터의 FVII-ORF를 제한효소 NotI으로 절단하였다. NotI으로 절단한 FVII-ORF를 T4 DNA 폴리머라아제로 블런트 엔드(blunt end)로 만들어 제한효소 HindIII/XbaI으로 처리한 pcDNA3.1-hygro 벡터(Invitrogen)와 라이게이션(ligation)시켰다. 라이게이션한 벡터를 제한효소 ApaI, XbaI, EcoRI, NcoI 및 PstI을 처리하여 확인하고 DNA 시퀀싱으로도 확인하였다. 이 벡터를 "pcDNA3.1-hygro-FVII"로 명명하였다.
실시예 2: FVII-Tf 발현 벡터(pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf)의 제조
실시예 1에서 제조한 FVII cDNA를 인간 트랜스페린(Tf) cDNA와 연결시켜 동물 세포에서 단일 자이모겐으로서 발현시키고자 하였다. 인간 트랜스페린 cDNA는 오리젠사(Origene, Cat #: SC322130)로부터 구입하여, GenBank accession #: NM_001063.2와 동일한 서열의 cDNA를 확보하였다. 연결에 사용한 프라이머는 FVII의 종결 코돈 및 Tf의 신호 펩타이드를 제거하도록 디자인하였다. 이후, 다양한 크기의 링커를 FVII 와 Tf 사이에 삽입시키기 위해, 트레오닌(Thr) 및 글라이신(Gly)으로 번역되는 AgeI 부위(ACCGGT)를 링킹(linking) 프라이머에 추가하였다. 융합 단백질은 (리더 펩타이드)-(mature FVII)-(Thr-Gly)-(mature Tf)의 구조를 가지게 된다(상기 리더 펩타이드(leader peptide)는 mature FVII에는 존재하지 않는 신호 펩타이드(prepeptide)와 가공 효소(processing enzyme)에 의해 잘리는 펩타이드(propeptide)가 합해진 것으로 38개 아미노산으로 구성되고, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 1위치 내지 38위치의 아미노산에 해당함). FVII 및 Tf의 cDNA를 프라이머 FVII-S1, FVII-AS1, Tf-S1 및 Tf-AS1(서열번호 27 내지 30)를 이용하여 증폭하였으며, 벡터는 실시예 1에 기재된 벡터를 사용하였다. 서열번호 27 및 30의 프라이머는 NheI 및 XhoI 부위를 각각 포함한다.
FVII cDNA와 Tf cDNA를 연결하는 클로닝 도식은 도 1에 묘사되어 있다. 먼저, FVII cDNA를 실시예 1에서 제조한 pcDNA3.1-hygro-FVII 벡터에서 PCR 반응으로 증폭하였다. 상기 PCR은 50μL의 반응액(1 μL 혼합한 벡터 주형, 1 μL 프라이머 FVII-S1 및 FVII-AS1(각 10 μM), 10 μL 5x Phusion HF 완충액, 200 μM dNTP, 0.5 μL Phusion DNA 폴리머라아제(FINNZYMES, #F-530S, 2 units/μL) 및 35.5 μL 물)을 98℃에서 30초 반응시키고, 98℃에서 10초, 60℃에서 45초, 72℃에서 30초 반응시키는 것을 1 사이클로 하여 30 사이클 반응시킨 후, 72℃에서 7분 반응시킴으로써 종결시켰다.
다음으로, Tf를 인간 트랜스페린 cDNA를 주형으로 하여 증폭시켰다. 프라이머 Tf-S1(10 μM) 및 프라이머 Tf-AS1(10 μM)을 사용한 것을 제외하고는 상기 FVII PCR 반응 조건과 동일하게 수행하였다.
증폭한 FVII 및 Tf cDNA를 일련의 제한효소 절단 및 라이게이션에 의해 연결하였다. 각각의 PCR로 증폭된 DNA를 제한효소 AgeI 및 XhoI 또는 NheI으로 처리하였다. 제한효소로 처리한 DNA를 정제하여 1:1 몰비로 라이게이션하였다. 라이게이션한 DNA를 제한효소 NheI/ShoI으로 처리한 pcDNA3.1-hygro 벡터(Invitrogen)에 서브클로닝하였다. 삽입 부위의 크기 및 서열은 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다.
실시예 3: FVII-GS 링커-Tf 발현 벡터의 제조
글라이신 및 세린을 포함하는 5개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 기본 링커 유닛으로 사용하였다. 기본 링커 유닛은 4개의 글라이신 및 하나의 세린을 'GGGGS'로서 포함한다. 상기 기본 GS 링커 유닛(이하, "GS-X 링커"라 함, X는 기본 GS 링커 유닛의 반복 숫자임)은 더 긴 길이의 GS 링커를 만드는 데 사용되었다. 본 발명에서는 GS-1부터 GS-15에 이르는 링커를 제조하였다.
1) FVII-GS-1 링커-Tf 발현 벡터의 제조
기본 GS 링커 유닛 서열을 포함하는 프라이머 GS-FV-AS1 및 GS-Tf-S1(서열번호 31 및 32)을 합성하고, 중첩(overlapping) PCR에 의해 FVII과 Tf 사이에 GS-1 링커를 삽입하였다(도 2 참조).
프라이머 FVII-S1 및 GS-FV-AS1(서열번호 27 및 31)을 사용하여 Phusion DNA 폴리머라아제(FINNZYMES, #F-530S)에 의해 PCR을 수행하여 FVII에 GS-1 링커를 연결하였다. 상기 PCR은 50ul의 반응액(1 μL pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf 벡터, 1 μL FⅦ-S1(10 pmole/1μL), 1 μL GS-FV-AS1(10 pmole/μL), 1 μL의 10 mM dNTP, 10 μL 5x Phusion HF 완충액, 35.5 μL의 물, 0.5 μL의 Phusion DNA 폴리머라아제(2 unit/μL)를 98℃에서 30초 반응시키고, 98℃에서 10초, 64℃에서 30초, 72℃에서 45초 반응시키는 것을 1 사이클로 하여 30 사이클 반응시킨 후, 72℃에서 7분 반응시킴으로써 종결시켰다. 한편, GS-1 링커에 Tf를 연결시킴에 있어서는 상기 반응액의 프라이머 대신 GS-Tf-S1 및 Tf-AS1의 프라이머(서열번호 32 및 30)를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 생성물들을 주형으로 하여 중첩 PCR을 수행하였다. 상기 중첩 PCR은 1 μL 씩의 증폭된 PCR 생성물, 1 μL FⅦ-S1 (10 pmole/μL, 서열번호 27), 1 μL 안티센스 프라이머(Tf-AS1 10 pmole/μL, 서열번호 30), 10 μL 5x Phusion HF 완충액, 1 μL 10 mM dNTP, 34.5 μL의 물, 0.5 μL의 Phusion DNA 폴리머라아제(2 units/μL)로 구성된 반응액을 98℃에서 1분 반응시키고, 98℃에서 10초, 66/68℃에서 30초, 72℃에서 45초 반응시키는 것을 1 사이클로 하여 45 사이클 반응시킨 후, 72℃에서 7분 반응시킴으로써 종결시켰다. 증폭된 중첩 PCR 생성물은 제한효소 NheI 및 XhoI을 이용하여 pcDNA3.1-hygro-lacZ 벡터에 클로닝하였다.
2) FVII-GS-3 링커-Tf 발현 벡터의 제조
GS-3 및 AgeI 부위를 포함하는 프라이머 GS3-S 및 GS3-AS(서열번호 33 및 34)를 합성하였다. GS-3 이중 나선 링커를 만들기 위해 5 μL GS3-S(100 pmole/μL), 5 μL GS3-AS(100 pmole/μL), 2 μL 10X 어닐링 완충액(100 mM Tris-Cl[pH8.0], 1M NaCl, 10 mM EDTA) 및 8 μL의 물을 섞은 후 98℃에서 10분 가열시키고 25℃에서 1시간 동안 냉각시켜 어닐링하였다. 어닐링한 링커를 제한효소 AgeI으로 절단하고 실시예 2에서 제조한 pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf 벡터 역시 AgeI으로 절단하였다. 절단한 벡터에 1 μL의 CIP(Calf intestinal phosphatase; NEB, #M0290S)를 37℃ 1시간 처리하고 젤 추출 과정(QIAGEN, #28704)을 거친 뒤 1:3(vector:insert)의 몰비로 T4 DNA 라이게이즈(TAKARA, #2011A)를 이용하여 라이게이션하였다
3) FVII-GS-5 링커-Tf 발현 벡터 내지 FVII-GS-15 링커-Tf 발현 벡터의 제조
GS-5 링커를 포함하는 융합 단백질 발현 벡터의 제조를 위해 새로운 방법을 도입하였다. 다음의 두 단계에 의해 연장된 링커를 갖는 FVII-Tf 융합 벡터를 제조하였다.
첫 번째 단계는 상기에서 수득한 GS-3 링커에 합성한 이중 사슬(ds) GS-2 링커를 추가하는 단계이다. 링커가 연장된 것을 확인한 후, 링커를 절단하여 pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf 벡터의 FVII 와 Tf 유전자 사이에 삽입하였다. 예컨대, GS-3 링커를 GS-5링커로 연장하기 위하여, 서열번호 35의 합성된 dsGS-2 유닛을 BglII로 처리한 후, 제한효소 BamHI 및 StuI으로 처리한 pcDNA3.1-hygro-FVII-GS-3-Tf 벡터에 라이게이션하였다. 다음으로, BamHI 및 AgeI의 처리에 의해 링커의 연장을 확인한 후, 연장된 링커를 AgeI으로 절단하여 AgeI 및 CIP로 처리한 pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf 벡터에 서브클로닝하였다. GS-7, GS-9, GS-11, GS-13 및 GS-15 링커를 포함하는 FVII-Tf 융합 발현 벡터 또한 같은 방법으로 제조하였다(도 3 참조).
실시예 4: 트롬빈 절단 부위를 포함하는 링커를 포함하는 FVII-Tf 발현 벡터(pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1-T-Tf)의 제조
트롬빈 절단부위를 포함하는 GS1-T 링커는 GS-1 유닛을 트롬빈 인식 서열의 양쪽에 하나씩 연결하여 제작하였다. 서열번호 36(센스)의 dsGS1-T 링커를 양 말단에 AgeI 부위를 포함하도록 합성하였다. dsGS1-T 링커를 AgeI으로 처리하고 PCR 정제 키트(Qiagen, cat #: 28104)를 이용하여 정제하였다. 정제된 링커를 CIP/AgeI 처리한 pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf 벡터에 라이게이션하였다.
실시예 5: 나선형 링커를 포함하는 FVII-Tf 발현 벡터(pcDNA3.1-hygro-FVII-Helix-Tf)의 제조
나선형 링커 DNA를 미국특허공개 제2009/0170163호에 개시된 방법으로 제조하였다. 프라이머 Helix linker S 및 Helix linker AS(서열번호 37 및 38)를 이용하여, 상기 제조한 나선형 링커(Helix linker) DNA의 양쪽에 AgeI 부위를 추가하였다. 프라이머 Helix linker S 및 Helix linker AS(서열번호 37 및 38)를 어닐링한 헬릭스 링커를 AgeI으로 처리한 후, AgeI 및 CIP로 처리한 pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf 벡터에 삽입하였다. 제조한 pcDNA-hygro-FVII-Helix-Tf 벡터를 DNA 시퀀싱으로서 확인하였다.
비교예 1: FVII-알부민 융합 발현 벡터(FVII-Alb)의 제조
유럽 특허 제1816201호에 개시된 FVII-알부민 융합 단백질을 제조하였다. 인간 알부민 cDNA는 인간 간 mRNA(Clontech)를 주형으로 하여 알부민 유전자 특이 프라이머 Albumin-S 및 Albumin-AS(서열번호 39 및 40)를 이용하여 RT-PCR에 의해 수득하였다. RT-PCR은 Stratagene사의 AccuScript High Fideleity RT-PCR system kit (Cat# 600180)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 먼저 키트에 포함된 10 μL 역전사(Reverse transcription) 반응액(1 μL 10X Reverse Transcriptase 완충액, 0.6 μL oligo-dT 프라이머, 1 μL dNTP, 0.4 μL 물, 5 μL 인간 간 mRNA(10 ng/μL))을 65℃ 5분, 상온 5분 반응시킨 후 100mM DTT 1μL 및 Reverse Transcriptase 1uL를 넣어 42℃에서 1시간 반응시켰다. 합성된 cDNA를 주형으로 프라이머 Albumin-S 및 Albumin-AS을 이용하여 인간 알부민 서열을 확보하였다. PCR은 50 μL 반응액(1 μL cDNA, 10 μL 5x Phusion HF 완충액, 프라이머 Albumin-S 및 Albumin-AS 각각 1 μL, 1 μL 10 mM dNTP, 0.5 μL Phusion DNA polymerase (FINNZYMES, #F-530S; 2 units/μL) 및 35.5 μL 물)을 98℃에서 1분 반응시키고, 98℃에서 10초, 62℃에서 30초, 72℃에서 60초 반응시키는 것을 1 사이클로 하여 30 사이클 반응시킨 후, 72℃에서 7분 반응시킴으로써 종결시켰다. 유럽 특허 제1816201호에 개시된 GS 링커[SS(GGS)9GS](서열번호 45)에 서열번호 41 및 42의 합성된 올리고뉴클레오티드를 어닐링하였다. 실시예 1에서 제조한 FVII cDNA와 상기 링커를 연결하기 위해 pcDNA3.1-hygro-FVII 벡터의 FVII 종결 코돈을 프라이머 mut FVII(XhoI)-S 및 mut FVII(XhoI)-AS(서열번호 43 및 44)를 이용하여 PCR-기반 돌연변이법에 의해 XhoI 부위로 대체하였다. XhoI/ApaI 부위를 이용하여, GS 링커[SS(GGS)9GS]를 pcDNA3.1-hygro-FVII 벡터의 FVII cDNA의 3'말단에 연결하였다. 마지막으로, BamHI으로 처리한 인간 알부민 cDNA를 BamHI/CIP로 처리한 pcDNA3.1-hygro-FVII-GS-링커 벡터에 삽입하였다. DNA 시퀀싱에 의해, 제조한 pcDNA3.1-hygro-FVII-GS-링커-알부민 발현 벡터를 확인하였다.
실시예 2 내지 5 및 비교예 1에서 제조한 발현 벡터의 특징을 하기 표 1에 나타내었다.
| FVII 융합 단백질 | FVII의 C-말단 |
링커 서열 (서열번호) | 융합 파트너의 N-말단 |
링커의 아미노산 개수 |
| FVII-Tf | APFP | - | VPDKTV | 0 |
| FVII-GS1-Tf | APFP | GGGGS (서열번호 3) | VPDKTV | 5 |
| FVII-GS3-Tf | APFP | (GGGGS)3 (서열번호 4) | VPDKTV | 15 |
| FVII-GS5-Tf | APFP | (GGGGS)5 (서열번호 5) | VPDKTV | 25 |
| FVII-GS7-Tf | APFP | (GGGGS)7 (서열번호 6) | VPDKTV | 35 |
| FVII-GS9-Tf | APFP | (GGGGS)9 (서열번호 7) | VPDKTV | 45 |
| FVII-GS11-Tf | APFP | (GGGGS)11 (서열번호 8) | VPDKTV | 55 |
| FVII-GS13-Tf | APFP | (GGGGS)13 (서열번호 9) | VPDKTV | 65 |
| FVII-GS15-Tf | APFP | (GGGGS)15 (서열번호 10) | VPDKTV | 75 |
| FVII-GS1-T-Tf | APFP | GGGGSLVPRGSGGGS (서열번호 12) | VPDKTV | 15 |
| FVII-Helix-Tf | APFP | GA(EAAAK)4A (서열번호 11) | VPDKTV | 23 |
| FVII-Alb | APFP | SS(GGS)9GS (서열번호 45) | DAHK | 31 |
| * 상기 FVII-Tf의 경우 Age I으로부터 유래된 Thr-Gly이 존재함 * 상기 서열번호 4 내지 12의 링커 서열 앞에는 Age I으로부터 유래된 Thr이 존재하며, 상기 링커 서열 뒤에는 Age I으로부터 유래된 Thr-Gly이 존재함 |
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실험예 1: FVII-융합 단백질의 비활성 측정
실시예 2 내지 5 및 비교예 1에서 제조한 FVII-융합 단백질을 VKORC1(비타민 K 에폭사이드 환원복합체 서브유닛 1)을 안정적으로 발현하는 CHO 세포주인 CHO(VK2)에서 발현시켰다.
실시예 2 내지 5 및 비교예 1에서 제조한 발현 벡터를 엔도-프리 플라스미드 맥시 키트(Endo-free plasmid maxi kit; Qiagen, #27104)를 이용하여 정제하였다. β-갈락토시다아제를 형질감염의 대조군으로 사용하였다. CHO(VK2) 세포를 6-웰 플레이트에 농도 1.5×106/웰로 시딩(seeding)하였다. 상기 세포를 10% FBS(Lonza, #14-501F), 1X HT(Invitrogen,#11067-030), 4 mM L-글루타민(Lonza, #17-605E) 및 200 μg/ml 하이그로마이신(Invitrogen, #10687-010)을 추가한 α-MEM(Lonza, #12-169F)에서 24시간 배양한 후, 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 공급자의 매뉴얼에 따라 형질감염시켰다. 형질감염 4시간 후, 상기 배양액을 무혈청 배양액(OptiMEM)으로 대체하고, 5 μg/ml 비타민 K를 추가하였다. 배양 48시간 후, 배양액을 샘플링하여 -70℃에 저장하였다.
발현된 FVII-융합 단백질의 색소형성능(chromogenic activity) 및 항원의 양을 각각 COATEST Factor VII 분석 키트(Chrmogenix, #821900-63) 및 FVII ELISA 키트(Cedarlene Lab, #CL20030K)를 이용하여 분석하였다. 분석은 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. WHO 표준에 대해 표준화된 표준 인간 혈장을 양 분석에서 대조군 FVII으로 사용하였다. 단백질의 발현은 FVII 및 Tf 항체를 사용하여 웨스턴 블랏 기법을 통해 확인하였다. ELISA 결과에 기초하여 FVII 융합 단백질의 동일한 양을 로딩하였고, 상기 발현된 FVII-융합 단백질은 단편화되지 않고 예상한 크기를 가짐을 알 수 있었다(도 4 참조).
한편, FVII-트랜스페린 융합 단백질의 비활성은 0.74 내지 1로서 FVII-알부민 융합 단백질의 비활성인 0.52와 비교하여 높은 비활성을 나타내었다(표 2 참조). 링커를 포함한 FVII-트랜스페린 융합 단백질 또한 70% 이상의 FVII 활성을 보유하였다. 링커의 길이와 FVII 융합 단백질의 비활성은 일정한 관계를 보이지 않았으나, 링커의 길이가 짧은 FVII 융합 단백질이 링커의 길이가 긴 FVII 융합 단백질과 비교하여 다소 높은 비활성을 보였다. 특히, FVII-GS1-Tf 및 FVII-GS1-T-Tf 융합 단백질의 경우 상당히 높은 비활성을 나타내었다(도 5 참조).
| FVII 융합 단백질 | 항원 (%) | 활성 (%) | 비활성 (활성/항원) |
| FVII-Tf | 53.2 ± 5.0 | 43.9 ± 0.3 | 0.82 |
| FVII-GS1-Tf | 53.4 ± 3.1 | 52.0 ± 0.5 | 0.97 |
| FVII-GS3-Tf | 61.9 ± 8.0 | 57.7 ± 0.2 | 0.93 |
| FVII-GS5-Tf | 69.3 ± 5.6 | 55.9 ± 1.4 | 0.81 |
| FVII-GS7-Tf | 70.9 ± 8.2 | 59.3 ± 1.1 | 0.84 |
| FVII-GS9-Tf | 64.2 ± 8.6 | 47.5 ± 0.7 | 0.74 |
| FVII-GS11-Tf | 59.1 ± 3.9 | 45.3 ± 0.9 | 0.77 |
| FVII-GS13-Tf | 59.7 ± 5.1 | 49.1 ± 0.8 | 0.82 |
| FVII-GS15-Tf | 59.2 ± 6.0 | 50.2 ± 0.5 | 0.85 |
| FVII-GS1-T-Tf | 70.8 ± 8.7 | 71.0 ± 2.6 | 1.00 |
| FVII-Helix-Tf | 89.0 ± 5.7 | 78.9 ± 2.2 | 0.89 |
| FVII-Alb | 106.6 ± 5.4 | 54.9 ± 3.3 | 0.52 |
실시예 6: Tf 융합 방향에 따른 FVII 융합 단백질 특성 분석
융합 단백질의 융합 방향에 따른 특성 변화를 살펴보기 위하여, 인간 트랜스페린(Tf)을 FVII의 N-말단(terminus)에 연결한 융합 단백질을 제조하고, 이를 FVII의 C-말단(terminus)에 연결한 융합 단백질과 비교하고자 하였다. 구체적인 과정은 하기와 같다.
<6-1> Tf-FVII 및 Tf-GS1T-FVII 발현 벡터 제조
Tf이 FVII의 N-말단에 연결된, 하기 구조를 갖는 2종의 융합 단백질을 제조하였다: 1) (Tf의 리더 펩타이드)-(mature Tf)-(Thr-Gly)-(mature FVII); 및 2) (Tf의 리더 펩타이드)-(mature Tf)-(Thr)-(GS1-T; 서열번호 12)-(Thr-Gly)-(mature FVII).
먼저, 리더 펩타이드를 포함하는 Tf의 유전자 서열을 얻기 위해 증폭에 사용된 정방향 프라이머(Nhe-Tf: 서열번호 46)는 클로닝 목적으로 Nhe I 부위를 포함하도록 고안하였고, 역방향 프라이머(Tf-Age: 서열번호 47)는 트랜스페린의 종결 코돈을 제거하는 동시에 클로닝 목적으로 Age I 부위를 포함하도록 고안하였다. 리더 펩타이드가 제거된 mature FVII을 클로닝하기 위한 정방향 프라이머(Age-FVII: 서열번호 48)는 제한효소 Age I을 포함하도록 고안하였고, 역방향 프라이머(VII-Xho: 서열번호 49)는 제한효소 Xho I을 포함하도록 고안하였다.
Tf 유전자의 경우 실시예 2에서와 같이 오리젠사(Origene, Cat #: SC322130)로부터 구입한 cDNA를 PCR 주형으로 사용하였다. 상기 PCR은 50㎕의 반응액(1㎕ 벡터 주형, 2 ㎕ 프라이머 Nhe-Tf 및 Tf-Age I(각 10μM), 10 ㎕ 5x Phusion HF 완충액, 1 ㎕ 10 mM dNTP, 0.5 ㎕ Phusion DNA 폴리머라아제(FINNZYMES, #F-530S, 2 units/㎕) 및 33.5 ㎕ 물)을 98℃에서 30초간 반응시키고, 98℃에서 10초, 70℃에서 30초, 72℃에서 36초간 반응시키는 것을 1 사이클로 하여 25 사이클을 반응시킨 후, 72℃에서 10분간 반응시킴으로써 종결시켰다. FVII의 경우 실시예 4에서 pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1-T-Tf 벡터를 주형으로 PCR 반응으로 증폭하였다. 프라이머 Age-FVII(10 μM) 및 프라이머 VII-Xho(10 μM)을 사용한 것을 제외하고는 상기 Tf PCR 반응 조건과 동일하게 수행하였다.
상기 PCR로 증폭된 Tf 유전자를 Nhe I/Age I 제한효소를 이용하여 pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1T-Tf 벡터에 삽입하여 pcDNA3.1-hygro-Tf-Tf 벡터를 얻었다. 얻어진 pcDNA3.1-hygro-Tf-Tf 벡터 및 상기 FVII PCR 산물을 Age I/Xho I 제한효소로 처리한 후 라이게이션(ligation)을 수행하여 pcDNA3.1-hygro-Tf-FVII 융합 단백질을 포함하는 발현벡터를 구축하였다. pcDNA3.1-hygro-Tf-GS1-T-FVII 발현 벡터는 얻어진 pcDNA3.1-hygro-Tf-FVII에 실시예 4에서와 같이 합성한 dsGS1-T 서열을 Age I 제한효소로 처리하여 삽입함으로써 구축하였다. 제작된 발현 벡터들은 제한효소 지도작성 및 염기서열 분석을 통해 목적한 대로 제작되었음을 확인하였다.
<6-2> 융합 단백질의 발현 및 특성 분석
Tf이 FVII의 C-말단에 융합된 단백질과 Tf이 FVII의 N-말단에 융합된 단백질들의 특성을 파악하기 위해 각각의 발현벡터(pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf, pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1T-FVII, pcDNA3.1-hygro-Tf-FVII, pcDNA3.1-hygro-Tf-GS1-T-FVII)를 CHO 세포에서 일시적으로 발현시켰다.
구축된 4종의 플라스미드 DNA를 엔도프리-맥시 프렙 키트(Endofree-maxi prep kit; Qiagen)로 분리하였다. 형질감염 실행 하루 전에 T75 플라스크에서 배양한 CHO(DG44) 세포를 트립신으로 처리하여 떼어낸 후, 1.5×106 세포/웰 농도로 6-웰 플레이트에 시딩(seeding)하였다. 24시간 후, 제조사 매뉴얼에 따라 형질감염시켰다. 형질감염 4 시간 후에 각 웰의 배지를 제거하고 비타민 K 5㎍/mL이 포함된 성장배지 2 mL로 교환하여 주었다. 형질감염 후, 6-웰 플레이트를 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였고, 48시간 후 배지를 원심분리하여 상층액을 1.5 mL 튜브에 분주하여 -70℃에 보관해 두었다가 FVII 색소형성 분석(Chromogenic assay) 및 FVII ELISA 시 이용하였으며, 배지를 제거한 플레이트는 웰 당 2 mL 의 HBSS로 세척한 다음 용해액(lysis solution; Tropix, #ABX210LM, 1 mM DTT 첨가) 250㎕를 넣고 골고루 퍼지게 한 다음 β-갈락토시다아제 분석을 위해 -70℃에 보관해 두었다.
FVII 색소형성 분석(chromogenic assay) 및 FVII ELISA는 실험예 1과 동일하게 수행하였다. 분석할 시료는 형질감염 이후 냉동 저장한 배지를 실험 직전에 녹여 원심분리로 상층액을 얻어 사용하였다. 분석법의 표준품은 표준 인간 혈장(standard human plasma; Dade Behring, # ORKL13, Lot#503216F)을 사용하였다.
측정 결과를 하기 표 3에 나타내었다. FVII의 N-말단에 Tf를 결합시킨 Tf-FVII 및 Tf-GS1T-Tf의 경우 FVII의 C-말단에 결합시킨 FVII-Tf 및 FVII-GS1T-Tf와 달리 전혀 활성이 측정되지 않았다. 또한, FVII ELISA로 융합 단백질의 양을 측정한 결과 FVII의 N-말단에 Tf를 결합시킨 융합 단백질들의 경우 낮은 양이 검출 되었다. 하지만, Tf의 다클론 항체(polyclonal antibody)를 이용하여 웨스턴 블랏으로 확인한 결과, 융합 방향에 관계없이 비슷한 검출 감도를 나타내었다. 상기 결과들은 Tf을 FVII의 N-말단에 융합시키는 경우, 번역(translation)은 정상적으로 이루어지지만, FVII의 활성이 없는 융합 단백질이 생성됨을 보여준다.
| 융합 단백질 | FVII 활성 (%) | FVII 항원 (%) | 비활성 (활성/항원) |
| FVII-Tf | 33.8 ± 0.73 | 37.0 ± 2.17 | 0.92 |
| Tf-FVII | 활성측정 불가 | 8.0 ± 1.51 | - |
| FVII-GS-1-T-Tf | 46.6 ± 0.29 | 43.0 ± 4.75 | 1.08 |
| Tf-GS-1-T-Tf | 활성측정 불가 | 13.5 ± 1.01 | - |
실시예 7: 융합시 사용된 제한효소 인식 서열의 제거에 따른 특성 분석
실시예 2에서는 FVII과 Tf을 융합시 그 사이에 다양한 링커의 삽입을 용이하게 하기 위해 제한효소(Age I) 인식 서열을 사용하였다. 이로 인해 몇몇 융합 단백질은 링커의 양 옆에 상기 제한효소에 의해 암호화되는 Thr과 Gly을 가지게 되었다. 이에 본 실시예에서는 제한효소(Age I) 인식 서열의 유무에 따라 융합 단백질의 성질이 변화하는지를 살펴보고자 하였다.
본 실시예에서는 GS1-T 링커를 포함하는 FVII-GS1-T-Tf 융합 단백질을 대상으로, 돌연변이 유발(mutagenic) 프라이머를 이용하는 PCR 기반의 부위-특이적 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)을 수행하여 제한효소 인식 서열을 제거하였다. 도 6에서 보는 바와 같이, 링커 앞쪽의 Thr과 뒤쪽의 Thr-Gly을 제거하고자 하였으며, 사용된 프라이머는 하기 표 4와 같다.
| 프라이머 종류 | 서열 (5’->3’) | 서열번호 |
| TG del-S | CAG CGG AGG CGG TTC AGT CCC TGA TAA AAC TG | 50 |
| TG del-AS | CAG TTT TAT CAG GGA CTG AAC CGC CTC CGC TG | 51 |
| T del-S | CGA GCC CCA TTT CCC GGT GGA GGC GGA TC | 52 |
| T del-AS | GAT CCG CCT CCA CCG GGA AAT GGG GCT CG | 53 |
<7-1> Thr-Gly 제거
PCR 방법으로 돌연변이 유발을 수행하였다. PCR 조건은 pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1T-Tf 벡터 1 μL, 센스 프라이머(TG del-S 10 μM) 0.2 μL, 안티센스 프라이머(TG del-AS 10 μM) 0.2 μL, 1 μL의 10 mM dNTP, 4 μL의 5X PCR 완충액, 14 μL의 증류수, 0.2 μL의 Phusion DNA 중합효소(FINNZYMES, #F-530S)를 첨가하여 98℃에서 30초간의 반응을 1 사이클 실시한 후, 98℃에서 10초, 58℃ 에서 30초, 72℃에서 3분간의 반응을 18 사이클 실시하고 72℃에서 7분간의 반응을 1 사이클 실시하였다. 원래의 주형 DNA를 제거하기 위해 앞서 증폭된 PCR 산물에 DpnI(NEB, #R0176S) 1 μL를 첨가한 뒤 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 DpnI으로 처리된 DNA 10 μL를 HIT 컴피턴트 세포(DH5α, RH617) 50 μL에 형질전환시킨 뒤, LB+amp(10 mg/ml) 고체 배지에 하룻밤동안 배양하였다. 형질전환 결과 얻은 4개의 클론에 대해 염기서열 분석을 의뢰하여 그 중 2 개의 클론에서 돌연변이가 확인되었다.
<7-2> Thr 제거
실시예 <7-1>과 유사한 방법으로 프라이머의 종류를 달리하여 수행하였다. 즉, 실시예 <7-1>에서 돌연변이가 확인된 클론의 플라스미드 DNA 1 μL를 주형으로 사용하고, 1 μL의 센스 프라이머(T del-S 10 pmole) 및 1 μL의 안티센스 프라이머(T del-AS 10pmole)를 사용하여 동일한 조건으로 PCR 방식의 돌연변이 유발을 수행하였다. 선택된 4개의 클론에 대해서 염기서열 분석을 수행하여 그 중 3개의 클론에서 돌연변이가 확인되었다. 확보된 발현 벡터를 pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1-T-Tf(M3)으로 명명하였다.
<7-3> 제한효소 인식 서열이 제거된 융합 단백질의 특성 확인
FVII-GS1-T-Tf와 FVII-GS1-T-Tf(M3) 발현 벡터 및 대조군으로 FVII과 알부민을 융합시킨 FVII-Alb 발현벡터를 CHO 세포에 형질감염시켜 배지 상층액을 확보하였다. 확보한 상층액을 FVII 색소형성 분석(Chromogenix) 및 FVII ELISA 분석(cedarlane)을 수행하여 활성/항원 비율 변화를 확인하였다. 그 결과, 표 5에서 보는 바와 같이, FVII-GS1T-Tf 및 FVII-GS1T-Tf(M3) 융합 단백질의 항원량 및 활성은 거의 동일하였으며 그 비율(비활성) 역시 변화가 없는 것으로 나타났다. 또한 상기 비활성은 FVII-Alb 융합 단백질보다 모두 유의하게 높은 것으로 확인되었다.
| FVII 항원(%) | FVII 활성(%) | 비활성(활성/항원) | |
| FVII-GS1-T-Tf | 34.1 ± 2.1 | 39.6 ± 2.2 | 1.16 |
| FVII-GS1-T-Tf(M3) | 33.5 ± 4.7 | 38.0 ± 0.7 | 1.14 |
| FVII-Alb | 50.1 ± 1.2 | 26.3 ± 0.8 | 0.53 |
실시예 8: 융합 단백질의 반감기 측정
본 발명에 따른 융합 단백질의 반감기 증가효과를 확인하고자 하였다. 본 실시예에서 사용한 융합 단백질은 FVII-Tf, FVII-GS1-Tf, FVII-GS3-Tf, FVII-GS15-Tf, FVII-GS1-T-Tf을 사용하였으며 대조 물질로 융합 단백질이 없는 원형 FVII과 상용화된 FVIIa인 노보세븐(NovoSeven; Novo Nordisk)을 사용하였다.
<8-1> 시료 준비
1) 발현 배지 확보
융합 단백질이 없는 FVII 및 Tf이 융합된 5종의 FVII 융합 단백질의 발현 벡터를 프리스타일 CHO-S 세포주(FreeStyle CHO-S Cell line; invitrogen, Cat.no. R800-07)에서 발현시켰다. 상기 CHO-S 세포는 8 mM L-glu(GIBCO, L-글루타민 200 mM(100X), Cat. no. 25030-081)이 첨가된 프리스타일 CHO 발현 배지가 담긴 스피너 플라스크(spinner flask)에서 현탁배양시켰다. 상기 배양된 세포를 형질전환 24시간 전에 4×105 세포/ml로 시딩(seeding)하고 1×106 세포/ml이 되었을 때 형질 감염을 수행하였다. 형질 감염에 사용된 DNA는 엔도-프리 맥시 프렙 키트(QIAGEN, Cat no.12362) 또는 엔도-프리 플라스미드 프렙 키트(QIAGEN, 12381)를 이용하여 준비하였고, 프리스타일 맥스 시약(FreeStyle MAX Reagent; Invitrogen, Cat no.16447-100) 형질감염 프로토콜을 참고하여 수행하였다. OptiPRO SFM(Invitrogen, Cat no.12309-019) 8 ml에 500 μg DNA를 넣어준 후 혼합하였다. 또 다른 튜브에 OptiPRO SFM(Invitrogen, Cat no.12309-019) 8 ml에 프리스타일 맥스 시약 500 μL를 넣어준 후 상기 두 혼합물을 조심스럽게 섞어 상온에서 10분간 보관하였다. 10분 후, 상기 혼합물로 프리스타일 CHO-S 세포를 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 37℃, 5% CO2 배양기에서 3일~5일간 배양한 다음 상층액을 분획하였다.
2) 발현 배지의 정제
스피너 플라스크 배양을 통해 얻은 배양액 내에 잔존하는 세포 및 세포의 파편을 제거하기 위해 0.22 μm 필터(corning)로 여과시켰다. 여과된 배양액을 접선 유동 막(tangential-flow membrane; satorious, 30KDa)을 이용하여 한외여과시켜 10배로 농축하였다. 농축된 배지를 세라믹 수산화인회석(Ceramic Hydroxyapatite; BIO-RAD, 157-0040) 레진이 충진된 XK16/20(GE healthcare) 컬럼에 적용하였다. 수산화인회석 컬럼은 배지의 적용 전에 10배 컬럼 부피 이상의 평형 완충액(equilibration buffer: 25 mM imidazole, 0.02% Tween 80, 150 mM NaCl, pH 6.5)으로 평형시켰다. 상기 농축 배지를 흘려준 후 평형 완충액과 세척 완충액-1 (25 mM imidazole, 0.02% Tween 80, 100 mM sodium phosphate, pH 6.3) 및 세척 완충액-2(25mM imidazole, 0.02% Tween 80, 100 mM sodium phosphate, 1M NaCl, pH 6.3)를 흘려주어 불순물을 세척하였다. 세척이 완료되면, 컬럼에 결합된 융합 단백질을 용출 완충액(25 mM imidazole, 0.02% Tween 80, 500 mM sodium phosphate, pH 6.3)으로 용출시켰다. 용출액을 정용여과(diafiltration) 방법으로 Q-평형 완충액(25 mM Histidine, 0.02% Tween 80, 25 mM NaCl, pH 6.0)으로 교환한 후 미리 충진된 Hitrap Q HP(1.6×2.5cm, 5 mL) 컬럼에 적용하였다. 이후, Q-평형 완충액으로 세척시킨 다음, 컬럼에 결합된 FVII/융합 단백질을 Q-용출 완충액(25 mM histidine, 0.02% Tween 80, 0.025 mM CaCl2, 1M NaCl pH 6.0)으로 용출시켰다. 용출된 단백질을 FVII-색소형성 분석, FVII ELISA 분석 및 SDS-PAGE/웨스턴 블랏 방법을 통해 분석하였다.
<8-2> 웨스턴 블랏 분석
2단계 컬럼을 통해 부분 정제된 FVII 및 FVII/Tf 융합 단백질들을 SDS-PAGE/쿠마시 염색을 통해 45% 이상의 순도를 가짐을 확인하였다. 동물 실험을 통해 잔존하는 인간 FVII을 ELISA 방법으로 분석해야 하므로 정제된 단백질 내에 FVII 유래 단편(fragment)의 존재 여부를 웨스턴 블랏으로 확인하고자 하였다. 노보세븐(NovoSeven; Novo Nordisk, 1.2 mg/vial, 60 KIU) 및 정제된 시료를 0.1 IU(FVII 활성도)/10 μL로 준비한 후 NuPage 4-12% bis-Tri 겔(invitrogen)을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 전기영동이 끝난 후, PVDF 막으로 이전시킨 후, 상기 막을 블로킹 완충액(25 mM Tris, 150 mM NaCl(pH 7.2), 5% skin milk 및 0.1% Tween 80) 10 mL를 첨가하여 1 시간 동안 상온에서 블로킹하였다. 상기 블로킹 용액을 버리고, 막에 항-FVII 항체(Cat. No F8146, Sigma) 또는 마우스 항-트랜스페린 항체(sc52256, santa cruz)를 각각 1:5000과 1:500 비율로 10 ml(PBS-T 중에 5% skim milk)를 첨가하여 1 시간 동안 교반하였다. 상기 막을 세척액(25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.2)으로 4회 세척한 후 이차 항체인 염소 항-마우스 IgG-HRP 항체(Cat. No G21040, Invitrogen)가 1:50,000 비율로 첨가된 용액 10 mL(PBS-T 중에 5% skim milk)에서 1시간 동안 흔들어 주었다. 세척액(25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.2)으로 막을 4회 세척한 후 수퍼-시그날 웨스트 펨토 믹스(Super-signal west Femto mix; Thermo) 2 mL를 첨가하여 5분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 필름을 현상하였다.
상기 웨스턴 블랏 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 보는 바와 같이, 정제된 단백질 내에 FVII 유래 절편은 확인되지 않았다. 트랜스페린 블랏도 역시 절편이 확인되지 않았다.
<8-3> 반감기 측정
링커가 없는 융합 단백질 및 4가지 링커(GS1, GS1-T, GS3, GS15)를 갖는 융합 단백질 5종과 동일 조건으로 발현 및 정제된 원형 FVII 및 상용화된 노보세븐 2종의 대조물질의 반감기를 랫트에서 비교하였다. 투여할 시료 및 채취된 시료의 분석은 제조사의 지침에 따라 인간 FVII ELISA(Cedarlane, Paired Antibodies for ELISA Factor VII, #CL20030K)에 의해 수행하였다. 투여할 시료의 농도는 투여희석용액(NaCl 3 mg/mL, CaCl2 이수화물 1.5 mg/mL, 글리실글리신 1.3 mg/mL, 폴리소르베이트 80 0.1 mg/mL, 만니톨 30 mg/mL, pH 5.5)에 희석하여 3회 측정한 값의 평균값으로 정하였다. FVII ELISA 정량 후 각 단백질을 투여희석용액에 희석하여 실험 당일 측정한 랫트(체중 250~300g의 스프라구에 다울레이)의 체중을 기준으로 150 IU/kg으로 꼬리 정맥에 투여하였다(FVII 종류별로 3마리). 약물 투여 전, 약물 투여 후 5분, 15분, 30분, 60분, 1.5시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 24시간, 총 11회로 채혈하였으며, 채혈된 혈액 225 μL와 3.2% 시트르산나트륨 25 μL를 섞어 4℃, 13,000 rpm에서 1분간 원심분리한 후 상층액을 -70℃에 보관하였다. 랫트 혈장 분석은 FVII ELISA 키트(cedarlane)에 사용되는 세척 완충액에 1/50 또는 1/100으로 희석하여 수행하였다. 측정된 시간대별로 잔존하는 인간 FVII 항원량을 이용하여 추세선 수식을 얻었다. 최종적으로 ‘반감기 = LN(2) / 추세선 기울기’로 계산하여 각 실험 개체들을 비교하였다. 하기 표 6에서 보는 바와 같이, 본 발명의 융합 단백질들은 융합되지 않은 FVII에 비해서 3~4배의 증가된 반감기를 나타내었다.
| 종류 | 반감기 (분) |
| FVII-GS1-Tf | 254.2 ±19.1 |
| FVII-GS3-Tf | 227.4 ±23.5 |
| FVII-GS1-T-Tf | 235.4 ±27.4 |
| FVII-GS15-Tf | 257.0 ±23.9 |
| FVII-Tf | 277.0 ±24.5 |
| 노보세븐 | 80.3 ±27.4 |
| 원형 FVII | 59.6 ± 2.9 |
서열목록 전자파일 첨부
Claims (20)
- 인자 VII(FVII) 및 트랜스페린을 포함하며, 상기 트랜스페린은 상기 FVII의 C-말단에 연결된 융합 단백질.
- 제 1 항에 있어서,
상기 FVII이 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 트랜스페린이 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 FVII의 C-말단과 상기 트랜스페린 사이에 제한효소 인식 서열이 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 1 항에 있어서,
상기 융합 단백질이 FVII과 트랜스페린의 사이에 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 7 항에 있어서,
상기 링커가 1 내지 100개의 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 7 항에 있어서,
상기 링커가 1 내지 75개의 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 7 항에 있어서,
상기 링커가 5 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 7 항에 있어서,
상기 링커의 앞, 뒤 또는 이들 모두에 제한효소 인식 서열로부터 번역된 아미노산이 존재하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 7 항에 있어서,
상기 링커가 서열번호 3 내지 11 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 7 항에 있어서,
상기 링커가 트롬빈, 인자 Xa, 인자 IXa 및 인자 VIIa로 이루어진 군에서 선택되는 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 절단 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 13 항에 있어서,
상기 링커가 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 및 제 6 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 융합 단백질이 비융합된 천연형 FVII과 비교하여 0.7 이상의 FVII 비활성을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 및 제 6 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 DNA.
- 제 16 항에 있어서,
상기 DNA가 서열번호 13 내지 24 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 DNA.
- 제 16 항에 따른 DNA를 포함하는 재조합 벡터.
- 제 18 항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제 19 항에 있어서,
상기 숙주 세포가 CHO 세포, BHK21 세포, HEK293 세포 및 Hep G2 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
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