JP2017000144A - 第vii因子活性を有する融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】第VII因子(FVII)およびトランスフェリンを含む融合タンパク質であって、前記トランスフェリンが、前記FVIIのC-末端に連結され、前記FVIIのC-末端と前記トランスフェリンとの間に制限酵素認識配列を含み、前記FVIIと前記トランスフェリンとの間にリンカーを含む、融合タンパク質。
【選択図】図1
Description
本発明の目的は、天然型FVIIの生物学的活性を有する融合タンパク質を提供することである。
本発明の一つの側面に従って、第VII因子(FVII)およびトランスフェリンを含む融合タンパク質であって、前記トランスフェリンが、前記FVIIのC-末端に連結されている融合タンパク質が提供される。
本発明による融合タンパク質は、FVIIの高い生物学的活性を保持したまま、天然型FVIIと比較して改良されたインビボ半減期を有するため、FVIIを用いた療法において効果的に使用することができる。
Hep G2細胞(KCLB No. 88065)から精製された全RNAを、逆転写のための鋳型として使用した。相補的DNA(cDNA)転写産物を、FVII遺伝子特異的プライマー、FVII-FおよびFVII-R(配列番号25および26)を用いてPCRにより増幅し、ヒトFVII遺伝子のオープンリーディングフレームを得た。PCRは、50μLの反応溶液(0.5μLのcDNA、0.4μM(10 pmol/μL)の配列番号25および26のプライマー、0.2 mMのdNTP、5ユニットのTaq DNAポリメラーゼおよび水)を以下の条件下で処理することにより行った:94℃で5分間の1サイクルの変性、94℃で1分間、60℃で1分間、および72℃で2.5分間の35サイクルの増幅、並びに72℃で5分間の1サイクルの最終伸長。精製されたPCR産物を、pGEM-T easyベクター(Promega, Cat #: A1360)にクローニングした。ポジティブなクローンを、EcoRIおよびNcoIを用いて制限酵素消化により選択した。選択されたクローンを、DNA配列決定により更に検証した。FVIIのORF(FVII-ORF)を発現ベクターに移すために、NotIで切断されたFVII-ORFを、T4 DNAポリメラーゼにより平滑末端化し、HindIII/XbaIで消化され平滑末端化されたpcDNA3.1-hygroベクター(Invitrogen)とライゲートした。ライゲートされたベクターを、ApaI、XbaI、EcoRI、NcoI、PstIでの制限酵素消化およびDNA配列決定により確認した。このベクターを、「pcDNA3.1-hygro-FVII」と名付けた。
例1で調製されたFVII cDNAを、動物細胞で単一のチモーゲンとして発現させるために、ヒトトランスフェリン(Tf)cDNA に融合した。ヒトトランスフェリンcDNAは、Origene(Cat #: SC322130)から購入し、GenBankアクセッション#: NM_001063.2の配列と等しいかどうか検証した。融合で使用されるプライマーは、FVIIの終止コドンおよびトランスフェリンのシグナルペプチドを除くように設計した。FVIIとTfの間への可変サイズのリンカーの挿入を容易にするために、AgeI部位(ACCGGT)(これは、トレオニン(Thr)およびグリシン(Gly)に翻訳される)を、連結プライマーに加えた。得られた融合タンパク質は、以下の構造を有する:(リーダーペプチド)-(成熟FVII)-(Thr-Gly)-(成熟Tf)(ここで、リーダーペプチドは、成熟FVIIに存在しないシグナルペプチド(プレペプチド)およびプロセシング酵素により切断されるプロペプチドからなり、これは、38個のアミノ酸から構成され、配列番号1のアミノ酸配列の1〜38位にわたるアミノ酸に相当する)。FVIIおよびTfのcDNAを、プライマーFVII-S1、FVII-AS1、Tf-S1およびTf-AS1(配列番号27〜30)を用いることにより増幅し、例1に記載されるベクターを使用した。配列番号27〜30のプライマーは、それぞれNheIおよびXhoI部位を含有する。
グリシンおよびセリンを含む5個のアミノ酸からなるペプチドを、基本リンカーユニットとして使用した。基本リンカーユニットは、以下の配列:「GGGGS」を備え4個のグリシンおよび1個のセリンを含む。基本リンカーユニット(以下、“GS-Xリンカー”と称し、ここでXは、基本GSリンカーユニットの繰返し数である)を、より長いGSリンカーを構成するために利用した。この例では、GS-1 〜 GS-15の範囲のリンカーを構築した。
基本GSリンカーユニットを含有する1セットのプライマー、GS-FV-AS1およびGS-Tf-S1(配列番号31および32)を合成し、オーバーラッピングPCRによりFVIIとTfとの間に挿入した(図2参照)。
GS-3およびAgeI部位を含有するプライマーセットGS3-SおよびGS3-AS(配列番号33および34)を合成した。プライマーを、GS-3二本鎖リンカーを作成するため、混合液(5μLのGS3-S(100 pmole/μL)、5μLのGS3-AS(100 pmole/μL)、2μLの10×アニーリングバッファー(100 mM Tris-Cl [pH 8.0]、1 M NaCl、10 mM EDTA)および8 μLの水)を98℃で10分間加熱し、25℃で1時間冷却することによりアニーリングした。アニーリングされたリンカーをAgeIで消化し、例2で調製されたpcDNA3.1-hygro-FVII-TfベクターもAgeIで消化した。消化されたべクターを、1μLのCIP(仔ウシ腸ホスファターゼ; NEB、#M0290S)により37℃で1時間処理し、ゲル抽出手順(QIAGEN, #28704)を行い、次いで、T4 DNAリガーゼ(TAKARA, #2011A)を用いて1:3のモル比(ベクター:挿入物)でライゲーションを行った。
GS-5リンカーを含有する融合タンパク質発現ベクターを構築するために、新しいストラテジーを実施した。伸長したリンカーを含有するFVII-Tf融合ベクターを、以下の2つのステップにより構築した。
トロンビン切断部位を含有するリンカーを、トロンビン認識配列の両端にGS-1ユニットを隣接させることにより調製した(以下、“GS1-Tリンカー”と称する)。配列番号36のdsGS1-Tリンカー(センス)を、両端にAgeI部位を含有するように設計し、合成した。dsGS1-TリンカーをAgeIで消化し、PCR精製キット(Qiagen, cat #: 28104)を用いて精製した。精製されたリンカーを、CIP/AgeIで処理されたpcDNA3.1-hygro-FVII-Tfベクターにライゲートした。
ヘリックスリンカーDNAを、U.S公開公報No. 2009/0170163に開示される方法により調製した。AgeI部位を、調製されたヘリックスリンカーDNAの両端に、プライマー、ヘリックスリンカーSおよびヘリックスリンカーAS(配列番号37および38)を用いることにより加えた。プライマー、ヘリックスリンカーSおよびヘリックスリンカーASをアニーリングし、AgeIで消化し、次いで、AgeIおよびCIPで処理されたpcDNA3.1-hygro-FVII-Tfベクターに挿入した。構築されたベクターを、DNA配列決定により確認した。
EP特許No. 1816201に開示されるFVII-アルブミン融合タンパク質を構築した。ヒトアルブミンcDNAを、鋳型としてのヒト肝臓mRNA(Clontech)およびアルブミン遺伝子特異的プライマー、アルブミン-Sおよびアルブミン-AS(配列番号39および40)を用いたRT-PCRにより得た。RT-PCRは、AccuScript High Fideleity RT-PCRシステムキット(Cat# 600180)を用いることにより製造者のマニュアルに従って行った。まず、10μLの逆転写反応溶液(1μLの10×リバーストランスクリプターゼバッファー、0.6μLのオリゴ-dTプライマー、1μLのdNTP、0.4μLの水、5μLのヒト肝臓mRNA(10 ng/μL))を、65℃で5分間、室温で5分間維持し、1μLの100 mM DTTおよび1μLのリバーストランスクリプターゼと42℃で1時間反応させた。ヒトアルブミン配列は、鋳型としての合成cDNAおよびプライマー、アルブミン-Sおよびアルブミン-ASを用いたPCRにより得た。PCRは、50μLの反応溶液(1μLのcDNA、10μLの5×Phusion HFバッファー、1μLのプライマー、それぞれアルブミン-Sおよびアルブミン-AS、1μLの10 mM dNTP、0.5μLのPhusion DNAポリメラーゼ(FINNZYMES, #F-530S; 2ユニット/μL)および35.5μLの水)を以下の条件下で処理することにより行った:98℃で1分間の1サイクルの変性、98℃で10秒間、62℃で30秒間、および72℃で60秒間の30サイクルの増幅、並びに72℃で7分間の1サイクルの最終伸長。配列番号41および42の合成されたオリゴヌクレオチドを、EP特許No. 1816201に開示されるGSリンカー [SS(GGS)9GS](配列番号45)にアニーリングした。例1で調製されたFVII cDNAを上記リンカーに連結するために、pcDNA3.1-hygro-FVIIベクター中のFVII終止コドンを、プライマーmut FVII(XhoI)-Sおよび mut FVII(XhoI)-AS(配列番号43および44)を用いたPCRベースの突然変異誘発により、XhoI部位と置き換えた。XhoI/ApaI部位を用いて、GSリンカー [SS(GGS)9GS] を、pcDNA3.1-hygro-FVIIベクター中のFVII cDNAの3’端に融合した。最後に、BamHIで消化されたヒトアルブミンcDNAを、pcDNA3.1-hygro-FVII-GS-リンカーベクターに挿入した。調製されたpcDNA3.1-hygro-FVII-GS-リンカー-アルブミン発現ベクターを、DNA配列決定により検証した。
例2〜5および比較例1で構築されたFVII-融合タンパク質を、VKORC1(ビタミンKエポキシドレダクターゼ複合体サブユニット1)を安定に発現するCHO細胞(CHO(VK2))で発現させた。
この例では、融合タンパク質における融合の方向による特徴の変化を調査するために、ヒトトランスフェリン(Tf)がFVIIのN−末端に連結された融合タンパク質を調製し、トランスフェリンがFVIIのC−末端に連結された融合タンパク質と比較した。詳細な手順は、以下のとおりである。
TfがFVIIのN−末端に連結された2種の融合タンパク質を以下のとおり設計した:(1) (Tfのリーダーペプチド)-(成熟Tf)-(Thr-Gly)-(成熟FVII);および(2) (Tfのリーダーペプチド)-(成熟Tf)-(Thr)-(GS1-T;配列番号12)-(Thr-Gly)-(成熟FVII)。
TfがFVIIのN−末端に連結された融合タンパク質を特徴づけるために、その発現ベクター、すなわち、pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf、pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1-Tf-VII、pcDNA3.1-hygro-Tf-FVIIおよびpcDNA3.1-hygro-Tf-GS1-T-FVIIを、CHO細胞で一過性発現させた。
例2において、FVIIとTfの間への種々のリンカーの挿入を容易にするために、制限酵素(AgeI)認識配列を使用した。その結果、幾つかの融合タンパク質は、リンカーの両端に、上述の制限酵素によりコードされるThrおよびGlyをもつようになった。この例では、融合タンパク質の特性が、制限酵素(AgeI)認識配列の存在により変化するか否か調べた。
PCRベース突然変異誘発を行った。PCRは、反応溶液(1μLのpcDNA3.1-hygro-FVII-GS1-T-Tfベクター、0.2μLのセンスプライマー(TG del-S 10μM)、0.2μLのアンチセンスプライマー(TG del-AS 10μM)、1μLの10 mM dNTP、4μLの5×PCRバッファー、14μLの水、および0.2μLのPhusion DNAポリメラーゼ(FINNZYMES, #F-530S))を以下の条件下で処理することにより行った: 98℃で30秒間の1サイクルの変性、98℃で10秒間、58℃で30秒間、および72℃で3分間の18サイクルの増幅、並びに72℃で7分間の1サイクルの最終伸長。元の鋳型DNAを除去するために、増幅されたPCR産物を、1μLのDpnI(NEB, #R0176S)で処理し、37℃で1時間インキュベートした。50μLのHITコンピテント細胞(DH5α, RH617)を、10μLのDpnI処理DNAを用いて形質転換し、LB+amp(10 mg/mL)固体培地で一晩インキュベートした。このようにして得られた4つのクローンを、DNA配列決定により分析し、2つのクローンを突然変異体として検証した。
Thrを欠失させるために、例<7-1>に記載されるのと同様の方法を、異なるプライマーを用いることにより行った。簡単にいうと、PCRベース突然変異誘発は、鋳型として、例<7-1>で変異が確認されたクローンの1μLのプラスミドDNAを用い、1μLのセンスプライマー(T del-S; 10 pmole)および1μLのアンチセンスプライマー(T del-AS; 10 pmole)を用いることにより、同じ条件下で行った。選択された4つのクローンのDNA配列決定により、3つのクローンが、変異を有することが確認された。獲得された発現ベクターを、“pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1-T-Tf(M3)”と名付けた。
CHO細胞を、FVII-GS1-T-TfおよびFVII-GS1-T-Tf(M3)発現ベクター、並びにコントロールとしてのFVII-Alb発現ベクターによりトランスフェクトし、培地の上清を得た。得られた上清に、クロモジェニックアッセイ(Chromogenix)およびFVII ELISA(cedarlane)を行い、活性/抗原の比の変化を検証した。表5に示されるとおり、FVII-GS1-T-TfおよびFVII-GS1-T-Tf(M3)融合タンパク質の抗原量および活性は、互いにほぼ同じで、その比(比活性)も相違しなかった。加えて、比活性は、FVII-Alb融合タンパク質のものより有意に高いことが確認された。
本発明の融合タンパク質の半減期の増大を調べるため、FVII-Tf、FVII-GS1-Tf、FVII-GS3-Tf、FVII-GS15-TfおよびFVII-GS1-T-Tfを実験グループとして使用し、野生型FVIIおよび商業的に入手可能なFVIIa(NovoSeven(登録商標); Novo Nordisk)をコントロールグループとして使用した。
1)発現培地の獲得
野生型FVIIタンパク質および5つのTf-融合FVII融合タンパク質を、FreeStyleTM CHO-S細胞株(Invitrogen, Cat. no. R800-07)において発現させた。CHO-S細胞を、8 mM L-glu(GIBCO, L-グルタミン 200 mM (100X), Cat. No. 25030-081)を補充したフリースタイルCHO発現培地を含むスピナーフラスコで懸濁培養した。培養細胞を、トランスフェクションの24時間前に4×105 細胞/mLの密度で播き、密度が1×106 細胞/mLになったときにトランスフェクトした。トランスフェクションで使用したDNAは、Endo-free maxi prep キット(QIAGEN, Cat. No.12362)またはEndo-free plasmid mega prepキット(QIAGEN, 12381)を用いることにより調製し、トランスフェクションは、FreeStyle MAX Reagent(Invitrogen, Cat. No. 16447-100)のトランスフェクションプロトコールを参照して行った。500μgのDNAを、8 mLのOptiPRO SFM(Invitrogen, Cat. No. 12309-019)に添加し、混合した。別のチューブに、8 mLのOptiPRO SFM(Invitrogen, Cat. No. 12309-019)および500μLのFreeStyle Max Reagentを添加し、その後、上述の2つの混合物をゆっくり混合し、室温で10分間保存した。10分後、FreeStyleTM CHO-S細胞を、その混合物によりトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、37℃、5% CO2インキュベーターで3〜5日間培養し、その後、上清を得た。
スピナーフラスコ培養により得られた培地を、0.22μmのフィルター(Corning)を通して濾過し、残存する細胞および破片を除去した。濾過された培地を、タンジェンシャルフロー膜(satorious, 30Kda)を用いた限外濾過により10倍濃縮した。濃縮された培地を、Ceramic Hydroxyapatite(BIO-RAD, 157-0040)樹脂で充填されたXK16/20カラム(GE healthcare)に適用した。Ceramic Hydroxyapatiteカラムは、10カラム体積以上の平衡バッファー(25 mMイミダゾール、0.02% Tween 80および150 mM NaCl、pH 6.5)で平衡化した。濃縮された培地をロードした後、カラムを、平衡バッファー、並びに洗浄バッファー-1(25 mMイミダゾール、0.02% Tween 80、100 mMリン酸ナトリウム、pH 6.3)および洗浄バッファー-2(25 mMイミダゾール、0.02% Tween 80、100 mMリン酸ナトリウム、1M NaCl、pH 6.3)で洗浄した。洗浄後、カラムに捕捉された融合タンパク質を、溶出バッファー(25 mMイミダゾール、0.02% Tween 80、500 mMリン酸ナトリウム、pH 6.3)で溶出した。溶出されたタンパク質を、FVII-クロモジェニックアッセイ、FVII ELISAアッセイおよびSDS-PAGE/ウェスタンブロットにより分析した。
2ステップカラムにより部分精製されたFVIIおよびFVII/Tf融合タンパク質は、SDS-PAGE/Coomassie Blue染色により45%以上の純度を有することが確認された。精製された融合タンパク質中のフラグメント化されたFVIIは、完全な融合タンパク質より短い半減期を有し、各々のFVII融合タンパク質の半減期の決定を誤らせるかもしれないため、精製されたタンパク質中のFVII由来フラグメントの存在を、ウェスタンブロットにより評価した。NovoSeven(登録商標)(Novo Nordisk、1.2 mg/バイアル、60 KIU)および精製サンプルを、0.1 IU(FVII活性)/10μLで調製し、その後、SDS-PAGEを、NuPage 4-12% bis-Tri gel(Invitrogen)を用いることにより行った。電気泳動の完了後、ゲルをPVDFメンブレンに移し、10 mLのブロッキングバッファー(25 mM Tris、150 mM NaCl(pH 7.2)、5%スキムミルクおよび0.1% Tween 80)を添加することにより、メンブレンを室温で1時間ブロックした。ブロッキング溶液を流し、10 mL(PBS-T中5%スキムミルク)の抗-FVII抗体(Cat. No. F8146, Sigma)またはマウス抗-トランスフェリン抗体(sc52256, santa cruz)を、1:5000および1:500の比で添加し、ロッキングシェーカーで1時間インキュベートした。メンブレンを、洗浄溶液(25 mM Tris、150 mM NaCl、pH 7.2)で4回洗浄し、二次抗体としてヤギ抗-マウスIgG-HRP抗体(Cat. No. G21040, Invitrogen)を1:50,000の比で添加した10 mL(PBS-T中5%スキムミルク)の溶液中で、1時間インキュベートした。メンブレンを、洗浄溶液(25 mM Tris、150 mM NaCl、pH 7.2)で4回洗浄した後、それに、2 mlのSuper-signal west Femto mix(Thermo)を5分間にわたって添加した。反応の完了後、フィルムを現像した。
リンカーを有していない融合タンパク質、4つのリンカー(GS1、GS1-T、GS3およびGS15)を有する融合タンパク質、並びにコントロールとしての、同じ条件下で発現させ精製した野生型FVIIおよび商業的に入手可能なNovoSevenの半減期を、ラットで測定し、互いに比較した。投与されるサンプルおよび動物実験から回収されたサンプルにおけるFVII量の定量分析を、ヒトFVII ELISA(Cedarlane, Paired Antibodies for ELISA factor VII, #CL20030K)により、製造者の使用説明書に従って行った。投与されるサンプルの濃度は、サンプルの3つの異なる希釈物から値を平均することにより決定した。投与希釈溶液(NaCl 3 mg/mL、CaCl2二水和物 1.5 mg/mL、グリシルグリシン 1.3 mg/mL、ポリソルベート80 0. 1 mg/mLおよびマンニトール 30 mg/mL、pH 5.5) を、希釈剤として使用した。FVII ELISA定量の後、各々のタンパク質を投与希釈溶液で希釈し、希釈されたサンプルを、実験の日に測定されたラットの体重に基づいて150 IU/kgで、尾静脈を介してラット(250〜300 gのSprague Dawley、グループにつき3匹)に静脈投与した。血液を、全部で11時点、すなわち、薬の投与から0分、5分、15分、30分、60分、1.5時間、2時間、4時間、6時間、8時間および24時間後に採取した。225μLの血液および25μLの3.2% クエン酸ナトリウムを混合し、4℃および13,000 rpmで1分間遠心分離し、次いで、上清を-70℃で保存した。ラットの血漿を、FVII ELISAキット(cedarlane)で使用される洗浄バッファーでの1/50または1/100の希釈により分析した。回帰曲線は、サンプリングの時点に対して、ヒトFVII抗原濃度の対数をプロットすることにより得た。各々のFVIIの半減期を、式「半減期 = ln2 / 回帰曲線の傾き」から計算することにより決定した。表6に示されるとおり、本発明の融合タンパク質は、野生型FVIIと比較して3〜4倍の改良された半減期を示した。
リンカーを有していない融合タンパク質、4つのリンカー(GS1、GS1-T、GS3およびGS15)を有する融合タンパク質、並びにコントロールとしての、同じ条件下で発現させ精製した野生型FVIIおよび商業的に入手可能なNovoSevenの半減期を、ラットで測定し、互いに比較した。投与されるサンプルおよび動物実験から回収されたサンプルにおけるFVII量の定量分析を、ヒトFVII ELISA(Cedarlane, Paired Antibodies for ELISA factor VII, #CL20030K)により、製造者の使用説明書に従って行った。投与されるサンプルの濃度は、サンプルの3つの異なる希釈物から値を平均することにより決定した。投与希釈溶液(NaCl 3 mg/mL、CaCl2二水和物 1.5 mg/mL、グリシルグリシン 1.3 mg/mL、ポリソルベート80 0. 1 mg/mLおよびマンニトール 30 mg/mL、pH 5.5) を、希釈剤として使用した。FVII ELISA定量の後、各々のタンパク質を投与希釈溶液で希釈し、希釈されたサンプルを、実験の日に測定されたラットの体重に基づいて150 IU/kgで、尾静脈を介してラット(250〜300 gのSprague Dawley、グループにつき3匹)に静脈投与した。血液を、全部で11時点、すなわち、薬の投与から0分、5分、15分、30分、60分、1.5時間、2時間、4時間、6時間、8時間および24時間後に採取した。225μLの血液および25μLの3.2% クエン酸ナトリウムを混合し、4℃および13,000 rpmで1分間遠心分離し、次いで、上清を-70℃で保存した。ラットの血漿を、FVII ELISAキット(cedarlane)で使用される洗浄バッファーでの1/50または1/100の希釈により分析した。回帰曲線は、サンプリングの時点に対して、ヒトFVII抗原濃度の対数をプロットすることにより得た。各々のFVIIの半減期を、式「半減期 = ln2 / 回帰曲線の傾き」から計算することにより決定した。表6に示されるとおり、本発明の融合タンパク質は、野生型FVIIと比較して3〜4倍の改良された半減期を示した。
[1]
第VII因子(FVII)およびトランスフェリンを含む融合タンパク質であって、前記トランスフェリンが、前記FVIIのC-末端に連結されている融合タンパク質。
[2]
前記FVIIが、配列番号1のアミノ酸配列により表されるポリペプチドまたはその機能的等価物である、[1]に記載の融合タンパク質。
[3]
前記機能的等価物が、前記FVIIの機能活性と実質的に等価な機能活性を有し、配列番号1により表されるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有する、[2]に記載の融合タンパク質。
[4]
前記トランスフェリンが、配列番号2のアミノ酸配列により表されるポリペプチドまたはその機能的等価物である、[1]に記載の融合タンパク質。
[5]
前記機能的等価物が、前記FVIIの機能活性と実質的に等価な機能活性を有し、配列番号2により表されるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有する、[4]に記載の融合タンパク質。
[6]
前記FVIIのC-末端と前記トランスフェリンとの間に制限酵素認識配列を更に含む、[1]に記載の融合タンパク質。
[7]
前記FVIIと前記トランスフェリンとの間にリンカーを更に含む、[1]に記載の融合タンパク質。
[8]
前記リンカーが、1〜100個のアミノ酸からなる、[7]に記載の融合タンパク質。
[9]
前記リンカーが、1〜75個のアミノ酸からなる、[7]に記載の融合タンパク質。
[10]
前記リンカーが、5〜25個のアミノ酸からなる、[7]に記載の融合タンパク質。
[11]
制限酵素認識部位から翻訳された1個以上のアミノ酸が、前記リンカーの一端または両端に存在する、[7]に記載の融合タンパク質。
[12]
前記リンカーが、配列番号3〜11のアミノ酸配列の何れか一つにより表されるペプチドである、[7]に記載の融合タンパク質。
[13]
前記リンカーが、プロテアーゼ切断部位を含み、前記プロテアーゼ切断部位が、トロンビン、第Xa因子、第IXa因子および第VIIa因子からなる群より選択されるプロテアーゼにより切断され得る、[7]に記載の融合タンパク質。
[14]
前記リンカーが、配列番号12のアミノ酸配列により表されるペプチドである、[13]に記載の融合タンパク質。
[15]
前記融合タンパク質が、融合していない天然型FVIIと比較して0.7以上のFVII比活性を有する、[1]〜[14]の何れか1に記載の融合タンパク質。
[16]
[1]〜[14]の何れか1に記載の融合タンパク質をコードするDNA。
[17]
前記DNAが、配列番号13〜24の塩基配列の何れか一つにより表される、[16]に記載のDNA。
[18]
[16]に記載のDNAを含む組換えベクター。
[19]
[18]に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
[20]
CHO細胞、BHK21細胞、HEK293細胞およびHep G2細胞からなる群より選択される、[19]に記載の宿主細胞。
Claims (20)
- 第VII因子(FVII)およびトランスフェリンを含む融合タンパク質であって、前記トランスフェリンが、前記FVIIのC-末端に連結されている融合タンパク質。
- 前記FVIIが、配列番号1のアミノ酸配列により表されるポリペプチドまたはその機能的等価物である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記機能的等価物が、前記FVIIの機能活性と実質的に等価な機能活性を有し、配列番号1により表されるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有する、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 前記トランスフェリンが、配列番号2のアミノ酸配列により表されるポリペプチドまたはその機能的等価物である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記機能的等価物が、前記FVIIの機能活性と実質的に等価な機能活性を有し、配列番号2により表されるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有する、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 前記FVIIのC-末端と前記トランスフェリンとの間に制限酵素認識配列を更に含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記FVIIと前記トランスフェリンとの間にリンカーを更に含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記リンカーが、1〜100個のアミノ酸からなる、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 前記リンカーが、1〜75個のアミノ酸からなる、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 前記リンカーが、5〜25個のアミノ酸からなる、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 制限酵素認識部位から翻訳された1個以上のアミノ酸が、前記リンカーの一端または両端に存在する、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 前記リンカーが、配列番号3〜11のアミノ酸配列の何れか一つにより表されるペプチドである、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 前記リンカーが、プロテアーゼ切断部位を含み、前記プロテアーゼ切断部位が、トロンビン、第Xa因子、第IXa因子および第VIIa因子からなる群より選択されるプロテアーゼにより切断され得る、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 前記リンカーが、配列番号12のアミノ酸配列により表されるペプチドである、請求項13に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が、融合していない天然型FVIIと比較して0.7以上のFVII比活性を有する、請求項1〜14の何れか1項に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜14の何れか1項に記載の融合タンパク質をコードするDNA。
- 前記DNAが、配列番号13〜24の塩基配列の何れか一つにより表される、請求項16に記載のDNA。
- 請求項16に記載のDNAを含む組換えベクター。
- 請求項18に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
- CHO細胞、BHK21細胞、HEK293細胞およびHep G2細胞からなる群より選択される、請求項19に記載の宿主細胞。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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