CN114222590A - 用于因子vii疗法的组合物、装置和方法 - Google Patents

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M.博雷加德
G.卡莫纳
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R.海德布雷赫特
E.E.约翰斯顿
R.J.米勒
O.奥康纳
M.A.奥伯利
D.佩里特
J.A.塞韦尔
D.M.史密斯
O.维塞
P.K.沃顿
Z.伊恩
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Abstract

本文描述了被工程化以分泌FVII蛋白的RPE细胞，以及包含这些工程化的RPE细胞的组合物、药物制剂、和可植入装置，以及制备和使用它们用于治疗患有血友病或FVII缺乏症的患者的方法。

Description

用于因子VII疗法的组合物、装置和方法
优先权要求
本申请要求2019年3月27日提交的美国临时申请号62/824,963以及2019年9月27日提交的美国临时申请号62/907,386的优先权。将前述申请中的每一个的披露内容通过引用以其全文并入本文。
序列表
本申请含有一份已经以ASCII格式电子递交的序列表并且将该序列表通过引用以其全文特此并入。于2020年3月25日创建的所述ASCII副本命名为S2225-7029WO_SL.txt且大小为122,698字节。
背景技术
因子VII(FVII)在凝血中起着关键作用，这是一系列反应，其中血浆无活性酶原转化为活性酶，并导致形成不溶性纤维蛋白凝块。FVII的无活性形式在肝脏中表达并作为单链酶原分泌到血液中。在对血管造成损伤后，组织因子(TF)暴露于循环的FVII，并且当与TF复合时，通过几种不同的蛋白酶将FVII活化为FVIIa，并且因子FVIIa:TF复合物将催化因子IX(FIX)和因子X(FX)两者分别转化为其活化的形式FIXa和FXa，这导致凝血酶产生且随后形成纤维蛋白凝块。
因子VII缺乏症是一种罕见的出血障碍，其特征在于FVII的缺乏或活性降低，估计发病率为300,000之一至500,000之一人。先天性FVII缺乏症是由F7基因的突变引起的。获得性FVII缺乏症可能是由严重的肝病、败血症或维生素K缺乏导致的，也可能是由某些药物(诸如华法林)导致的。
重组活化FVII蛋白(rFVIIa)被批准用于促进具有针对FVIII和FIX的抗体抑制剂的患有血友病的个体、患有获得性血友病的患者和患有先天性FVII缺乏症的患者的止血。然而，rFVIIa具有短半衰期，因此在血友病患者中在短时间段内需要多剂量以管理活动性出血发作。因此，额外的FVII疗法是理想的。
发明内容
本文描述了经工程化以表达和分泌FVII的视网膜色素上皮(RPE)细胞，以及包含该工程化的RPE细胞的组合物、药物产品、医疗装置，以及制备和使用它们的方法。在一些实施例中，包含工程化的RPE细胞的这些组合物、产品和装置被配置为减轻当施用于(例如放置在体内)哺乳动物受试者时的异物反应。
在一方面，本披露的特征在于包含启动子的分离的多核苷酸，该启动子与前体FVII编码序列可操作地连接。在实施例中，该启动子序列基本上由以下的核苷酸序列组成，该核苷酸序列与SEQ ID NO:10(图6B中显示的序列的核苷酸337-2069)相同或基本上相同。在实施例中，该前体FVII编码序列对于在哺乳动物细胞中的表达是密码子优化的。在实施例中，该前体FVII编码序列编码FVII融合蛋白。在实施例中，该FVII融合蛋白包含与FVII氨基酸序列的C端可操作地连接的编码非FVII多肽的氨基酸序列。在实施例中，该非FVII多肽赋予融合蛋白有益的特性，例如，增加表达和/或分泌的蛋白质的量，或延长体内半衰期。在实施例中，该FVII融合蛋白包含哺乳动物白蛋白(例如，人白蛋白)的氨基酸序列，其通过肽接头连接到FVII氨基酸序列的C端。在实施例中，该肽接头是蛋白水解可裂解的。在实施例中，该前体FVII密码子优化的编码序列是SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。在实施例中，该密码子优化的FVII序列(例如，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4)可操作地连接到SEQ ID NO:6或SEQID NO:8。在实施例中，该分离的多核苷酸作为双链DNA分子中的一条链提供，例如，在表达载体中。
在另一方面，本披露提供了包含外源核苷酸序列的工程化的RPE细胞，该细胞包含与前体FVII编码序列可操作地连接的启动子序列。在实施例中，该外源核苷酸序列包含染色体外的表达载体。在实施例中，该外源核苷酸序列整合到RPE细胞(例如，ARPE-19细胞)基因组中的至少一个位置中。
在又另一个实施例中，本披露提供了包含至少一个细胞容纳隔室的装置，该细胞容纳隔室包含本文所述的工程化的RPE细胞或多个此类细胞。在一些实施例中，这些组合物、产物和装置包含包封一个或多个工程化的RPE细胞的聚合物组合物。在实施例中，该包封聚合物组合物包含至少一种细胞结合物质(CBS)，例如细胞结合肽，如RGD(SEQ ID NO:33)或RGDSP(SEQ ID NO:48)。在实施例中，该包封聚合物组合物包含用GRGDSP(SEQ ID NO:49)共价修饰的藻酸盐。在一些实施例中，该装置进一步包含至少一种用于减轻当该装置被放置于受试者体内时的异物反应(FBR)的器件。在实施例中，用于减轻FBR的器件包括如本文所定义的去纤维化化合物，其设置在装置的外表面上和/或环绕细胞容纳隔室的屏障隔室内。在实施例中，该去纤维化化合物是具有式(I)的化合物：
Figure BDA0003279416310000031
或其药学上可接受的盐，其中变量A、L1、M、L2、P、L3和Z以及相关的子变量如本文所定义。在一些实施例中，具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐(例如，式(I-a)、(I-b)、(I-c)、(I-d)、(I-e)、(I-f)、(II)、(II-a)、(III)、(III-a)、(III-b)、(III-c)、或(III-d))是本文所述的化合物，包括例如，本文表3中显示的化合物之一。在实施例中，该去纤维化化合物是表3中所示的化合物100、化合物101或化合物102。
在一方面，本披露的装置是2隔室水凝胶胶囊(例如，微胶囊(直径小于1mm)或毫胶囊(直径至少1mm))，其中包含多个活的工程化的RPE细胞(以及任选地一种或多种细胞结合物质)的细胞容纳隔室(例如，内隔室)被包含去纤维化聚合物(例如，外隔室)的屏障隔室环绕。在实施例中，该去纤维化化合物是具有式(I)的化合物。在实施例中，该水凝胶胶囊是球形胶囊。
在另一方面，本披露的特征在于包含多个(3、6、12、25、50或更多个中至少任一个)本文所述的RPE细胞容纳装置的制品(例如，组合物)。在一些实施例中，制品是药学上可接受的组合物。
在另一方面，本披露的特征在于制备和制造装置的方法，该装置包含多个被工程化以表达和分泌FVII的RPE细胞。在一些实施例中，该方法包括提供多个工程化的RPE细胞并将该多个RPE细胞放置于封闭组分(例如，如本文所述的装置的细胞容纳隔室)中。在一些实施例中，封闭组分包括柔性聚合物(例如，PLA、PLG、PEG、CMC或多糖，例如藻酸盐)。在一些实施例中，封闭组分包括非柔性聚合物或金属外壳。在一些实施例中，该装置的表面是例如经如本文所述的具有式(I)的化合物化学修饰的。
在另一方面，本披露的特征在于评价本文所述的工程化的RPE细胞或装置的方法。在一些实施例中，该方法包括提供工程化的RPE细胞或装置，并且评价该RPE细胞或装置的结构或功能参数。在一些实施例中，该方法包括针对以下中的一个或多个评价该工程化的RPE细胞或装置：a)细胞存活力和b)产生的FVII的量。在一些实施例中，在(i)装置(或装置制品)形成或(ii)施用装置(或装置的制品)至受试者后至少1、5、10、20、30、60、90或120天进行评价。在实施例中，该评价进一步包括在向受试者施用后至少30、60、90或120天评估装置(或制品中的装置)的纤维化的量和/或结构完整性。在一些实施例中，该受试者是哺乳动物(例如，小鼠、人)。
在另一方面，本披露的特征在于治疗需要FVII替代疗法的受试者(例如，患有FVII缺乏症的患者、具有针对FVIII和FIX的抑制剂的患有血友病的患者)的方法，该方法包括向该受试者施用如本文所述的装置或装置制品，该装置或装置制品包含被工程化以表达和分泌FVII的RPE细胞。在一些实施例中，施用步骤包括向受试者体内放置包含多个装置的药学上可接受的制品，每个装置都具有产生FVII的能力。在一些实施例中，将该装置或装置制品施用于、放置于、或提供到除中枢神经系统、脑、脊柱、眼睛、或视网膜以外的部位。在一些实施例中，将可植入元件施用于或放置于或注射到受试者的腹膜腔(例如，小网膜囊)、网膜或皮下脂肪中。在实施例中，该方法进一步包括测量取自受试者的组织样品(例如，分离自血样的血浆、肝活检)中存在的FVII的量或活性。在实施例中，将组织样品在15、30、60或120天去除。在一些实施例中，该受试者是人。
在此阐述了本披露的一个或多个实施例的细节。根据具体实施方式、附图、实例和权利要求，本披露的其他特征、目的和优点将显而易见。
附图说明
图1显示由本披露的示例性工程化的人RPE细胞表达的野生型人前体FVII蛋白的氨基酸序列(图1A，SEQ ID NO:1)和核苷酸编码序列(图1B，SEQ ID NO:2)，其中加下划线的指示该信号肽的氨基酸序列和编码序列。
图2显示编码图1中示出的野生型前体人FVII蛋白的示例性密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)，其中加下划线的指示该信号肽的编码序列。
图3显示编码图1中示出的野生型前体人FVII蛋白的另一个示例性密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)，其中加下划线的指示该信号肽的编码序列。
图4显示由本披露的示例性工程化的人RPE细胞表达的示例性FVII融合蛋白的白蛋白部分的氨基酸序列(图4A，SEQ ID NO:5)和核苷酸编码序列(图4B，SEQ ID NO:6)，其中该接头肽的氨基酸和核苷酸序列以粗体显示。
图5显示由本披露的示例性工程化的人RPE细胞表达的另一种示例性FVII融合蛋白的蛋白水解可裂解白蛋白部分的氨基酸序列(图5A，SEQ ID NO:7)和核苷酸编码序列(图5B，SEQ ID NO:8)，其中该接头肽的氨基酸和核苷酸序列以粗体显示。
图6说明了可用于产生表达本文所述FVII蛋白的工程化RPE细胞的示例性PiggyBac转座子表达载体，其中图6A显示载体图，并且图6B显示载体的核苷酸序列(SEQ IDNO:9)，其中启动子序列加下划线(SEQ ID NO:10)。
图7显示Cbh启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO:21)。
图8说明了本披露的示例性两隔室水凝胶胶囊，其中线指示：包封在第一内隔室中的工程化的RPE细胞，该第一内隔室由形成水凝胶的聚合物和共价附接到细胞结合肽的形成水凝胶的聚合物的混合物形成；第二隔室；以及设置在第二隔室内和胶囊表面上两者的去纤维化化合物。图8将“GRGDSP”披露为SEQ ID NO:49。
图9是显示由示例性RPE细胞体外分泌的FVII蛋白的量(按皮克/细胞/天(y轴)定量)的条形图，这些RPE细胞用本文所述的8种不同的FVII表达构建体工程化。
图10是柱状图，其描绘了在植入含有用本文所述的FVII表达构建体之一工程化的RPE细胞的示例性2隔室水凝胶胶囊后13天，裸鼠(2或3只小鼠/组)中FVII蛋白的血浆水平。图10将“GRGDSP”披露为SEQ ID NO:49。
图11是柱状图，其描绘了在植入含有使用本文所述的两种不同的FVII表达载体之一工程化的RPE细胞的示例性2隔室水凝胶胶囊后6天，裸鼠(4只小鼠/组)中FVII蛋白的血浆水平。
具体实施方式
本披露的特征在于被工程化以表达和分泌FVII的视网膜色素上皮(RPE)细胞及其组合物；包含此类工程化的RPE细胞的装置，以及包含它们的装置制品。在一些实施例中，这些装置包括细胞容纳隔室，其包含细胞结合物质以及工程化的RPE细胞。在一些实施例中，将这些装置配置为减轻当放置于受试者(例如，人受试者)体内时的FBR。在一些实施例中，这些工程化的RPE细胞、组合物、和装置可用于向有需要的受试者(例如，患有FVII缺乏症的患者或另外有rFVIIa疗法指征的患者)提供FVII替代疗法。
缩写和定义
贯穿本披露的详细描述和实例，将使用以下缩写。
CBP 细胞结合肽
CBPP 细胞结合多肽
CBP-聚合物 经由接头经CBP共价修饰的聚合物
CBS 细胞结合物质
CM-Alg 经化学修饰的藻酸盐
CM-LMW-Alg 经化学修饰的低分子量藻酸盐
CM-LMW-Alg-101 用表3中所示的化合物101化学修饰的低分子量藻酸盐
CM-HMW-Alg 经化学修饰的高分子量藻酸盐
CM-HMW-Alg-101 用表3中所示的化合物101化学修饰的高分子量藻酸盐
CM-MMW-Alg 经化学修饰的中等分子量藻酸盐
CM-MMW-Alg-101 用表3中所示的化合物101化学修饰的中等分子量藻酸盐
HMW-Alg 高分子量藻酸盐
MMW-Alg 中等分子量藻酸盐
RGD-藻酸盐 用包含氨基酸序列RGD(“RGD”披露为SEQ ID NO:33)的肽共价修饰的藻酸盐。
RPE 视网膜色素上皮
U-Alg 未经修饰的藻酸盐
U-HMW-Alg 未经修饰的高分子量藻酸盐
U-LMW-Alg 未经修饰的低分子量藻酸盐
U-MMW-Alg 未经修饰的中等分子量藻酸盐
70:30CM-Alg:U-Alg 经化学修饰的藻酸盐和未经修饰的藻酸盐的70:30混合物(V:V)，例如，如以下实例中所述的
因此，可以更容易地理解本披露，本文使用的某些技术和科学术语在下面具体定义。除非在本文件的其他地方具体定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本披露所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
如本文所用，包括所附权利要求，诸如“一个/种(a/an)”和“该”的单数形式包括它们相应的复数指代，除非上下文另有明确说明。
“约”或“大约”当在本文中用来修改数值定义的参数(例如，由RPE细胞分泌的FVII的量，装置(例如水凝胶胶囊)的物理描述，例如直径、球度、包封在其中的细胞数量，制品中的装置的数量)时是指所列举的数值在如本领域普通技术人员所确定的所定义的参数的可接受的功能范围内，这将部分取决于如何测量或确定该数值，例如，测量系统的局限性，包括该测量系统可接受的误差范围。例如，“约”可以表示在所列举的数值之上和之下的20％的范围。作为非限制性实例，定义为具有约1.5毫米(mm)直径并包封约500万(M)个细胞的装置可具有1.2至1.8mm的直径，并可包封4M至6M个细胞。作为另一个非限制性实例，约100个装置(例如，水凝胶胶囊)包括具有80至120个装置制品。在一些实施例中，术语“约”意味着修改的参数可以在该参数的所述数值之上或之下变化多达15％、10％或5％。可替代地，特别是关于本文所述的装置的某些特性，例如细胞生产力或CBP或去纤维化化合物的密度，术语“约”可以表示在所述值的上下数量级内，例如，5倍、4倍、3倍、2倍或1倍内。
如本文所用，“获得(acquire或acquiring)”是指通过“直接获得”或“间接获得”值或物理实体来获得值(例如，数值)或图像或物理实体(例如，样品)。“直接获得”意指执行一个过程(例如，执行分析方法或方案)来获得值或物理实体。“间接获得”是指从另一方或来源(例如，直接获得物理实体或值的第三方实验室)接收值或物理实体。直接获取值或物理实体包括执行包括实物的物理变化的过程或使用机器或装置。直接获取值的实例包括从人受试者获得样品。直接获得值包括执行使用机器或装置的过程，例如使用荧光显微镜以获取荧光显微镜数据。
如本文所用，术语“施用(administer、administering或administration)”是指将本文所述的实体(例如，装置或装置制品)植入、吸收、摄取、注射或以其他方式引入至受试者，或向受试者提供用于施用的这样一种实体。
如本文所用，“去纤维化(Afibrotic)”是指减轻异物反应(FBR)的化合物或材料。例如，通过植入包含去纤维化化合物(例如，包含经表3中列出的化合物共价修饰的聚合物的水凝胶胶囊)的装置(例如，水凝胶胶囊)的组织诱导的生物组织中的FBR的量低于通过植入去纤维化无效参比装置(即，缺乏任何去纤维化化合物但具有基本相同的组成(例如，相同的CBP-聚合物、相同的细胞类型)和结构(例如，尺寸、形状、隔室的数量)的装置)诱导的FBR。在实施例中，通过含有植入装置(例如，水凝胶胶囊)的组织中的免疫应答来评估FBR的程度，其可以包括例如蛋白质吸附、巨噬细胞、多核异物巨细胞、成纤维细胞和血管生成，该评估使用本领域已知的测定，例如，如WO 2017/075630中所述，或使用Vegas,A.等人.,Nature Biotechnol[自然生物技术](同上)中描述的一种或多种测定/方法(例如，植入胶囊的皮下组织蛋白酶测量，Masson三色(MT)，组织切片苏木精或伊红染色，胶原密度定量，细胞染色和巨噬细胞共聚焦显微镜检查(CD68或F4/80)，肌成纤维细胞(α-肌肉肌动蛋白，SMA)或一般细胞沉积，已知炎症因子和免疫细胞标志物的79个RNA序列的定量，或在合适的受试者(例如免疫活性小鼠)的腹膜内空间中14天后对回收的装置(例如胶囊)上的巨噬细胞和中性粒细胞进行FACS分析。在实施例中，通过测量含有一种或多种免疫应答生物标志物(例如组织蛋白酶、TNF-α、IL-13、IL-6、G-CSF、GM-CSF、IL-4、CCL2、或CCL4)的植入物在组织中的水平来评估FBR。在一些实施例中，由本发明的装置(例如，包含置于外表面上的去纤维化化合物的水凝胶胶囊)诱导的FBR比由FBR无效参比装置(例如，与测试或要求保护的装置基本相同的装置(除了缺少用于减轻FBR的器件(例如，不含去纤维化化合物，但在其他方面基本上与要求保护的胶囊相同的水凝胶胶囊))诱导的FBR低至少约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。在一些实施例中，FBR(例如，一种或多种生物标志物的水平)是在约30分钟、约1小时、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约1周、约2周、约1个月、约2个月、约3个月、约6个月或更长时间后测量的。
如本文所用，“细胞”是指工程化的细胞或未经工程化的细胞。在实施例中，细胞是永生化细胞或衍生自永生化细胞的工程化的细胞。在实施例中，该细胞是活细胞，例如，如通过本文所述或本领域已知的任何技术测量的是活的。
如本文所用，“细胞结合肽(CBP)”意指包含如下氨基酸序列的线性肽或环状肽，该氨基酸序列衍生自用于细胞粘附分子(CAM)的配体(例如，介导细胞基质连接或细胞间连接)的细胞结合结构域。CBP的长度为少于50、40、30、25、20、15或10个氨基酸。在实施例中，该CBP的长度在3和12个氨基酸之间，长度为4和10个氨基酸之间，或长度为3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。该CBP氨基酸序列可以与天然存在的结合结构域序列相同或可以是其保守取代的变体。在实施例中，该CAM配体是哺乳动物蛋白。在实施例中，该CAM配体是选自下文表1中所列蛋白的组的人蛋白。在实施例中，该CBP包含以下表1中列出的细胞结合序列或其保守取代的变体，基本上由组成，或由其组成。在实施例中，该CBP是RGD肽，这意味着该肽包含氨基酸序列RGD(SEQ ID NO:33)，并且任选地包含位于N端和C端之一或两者处的一个或多个另外的氨基酸。在实施例中，该CBP是包含RGD的环状肽，例如，在Vilaca,H.等人,Tetrahedron[四面体]70(35):5420-5427(2014)中描述的环状RGD肽之一(SEQ ID NO:33)。在实施例中，该CBP是包含RGD(SEQ ID NO:33)的线性肽并且长度少于6个氨基酸。在实施例中，该CBP是基本上由RGD(SEQ ID NO:33)或RGDSP(SEQ ID NO:48)组成的线性肽。
表1：示例性CAM配体蛋白和细胞结合序列
Figure BDA0003279416310000091
Figure BDA0003279416310000101
如本文所用，“CBP-聚合物”意指包含至少一个细胞结合肽分子的聚合物，该分子经由接头共价附接到聚合物。在实施例中，该CBP-聚合物中的聚合物不是肽或多肽。在实施例中，CBP-聚合物中的聚合物是合成的或天然存在的多糖，例如藻酸盐，例如藻酸钠。在实施例中，该接头是氨基酸接头(即，基本上由单个氨基酸或具有几个相同或不同氨基酸的肽组成)，其经由肽键连接至CBP的N端或C端。在实施例中，氨基酸接头的C端连接至CBP的N端，并且氨基酸接头的N端经由酰胺键连接至多糖中的至少一个侧羧基基团。在实施例中，该接头-CBP的结构表示为G(1-4)-CBP，意味着该接头具有一个、两个、三个或四个甘氨酸残基。在实施例中，CBP-多糖(例如，CBP-藻酸盐)中的一个或多个单糖部分不被CBP修饰，例如，未经修饰的部分具有游离羧基或缺乏可修饰的侧羧基基团。在实施例中，具有共价附接的CBP的多糖部分的数量小于以下值中任一个：99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％。
在实施例中，该CBP-聚合物中CBP修饰的密度通过氮百分比燃烧分析(例如，如下文实例中所述)来估计。在实施例中，该CBP-聚合物是RGD-聚合物(例如，RGD-藻酸盐)，其是用接头-RGD分子(例如，基本上由GRGD(SEQ ID NO:50)或GRGDSP(SEQ ID NO:49)组成的肽)共价修饰的聚合物(例如，藻酸盐)，并且如使用本文所述的测定确定的，用接头-RGD分子修饰的密度是约0.05％氮(N)至1.00％N、约0.10％N至约0.75％N、约0.20％N至约0.50％N、或约0.30％N至约0.40％N。在实施例中，RGD-藻酸盐(例如，经GRGDSP(SEQ ID NO:49)共价修饰的MMW藻酸盐)中的接头-RGD修饰的缀合密度为0.2至2.0、0.2至1.5、0.2至1.0、0.3至0.7、0.3至0.6、或0.4至0.6微摩尔的接头-RGD部分每克在粘度为80-120cP的溶液(如盐溶液)中的RGD-聚合物，如通过能够定量与聚合物缀合的肽的测定，例如本文所述的定量肽缀合测定测量的。除非另有明确说明或从上下文中显而易见，否则CBP-聚合物组合物中CBP的具体列举的数字浓度、浓度范围、密度或密度范围是指CBP-聚合物组合物中缀合的CBP分子的浓度，即，它不包括CBP-聚合物中可能存在的任何残留游离(例如未缀合的)CBP。
如本文所用，“细胞结合多肽(CBPP)”意指如下多肽，其长度为至少50、至少75、或至少100个氨基酸并且包含CAM配体的细胞结合结构域的氨基酸序列或其保守取代的变体。在实施例中，该CAM配体是哺乳动物蛋白。在实施例中，该CBPP氨基酸包含全长CAM配体的天然存在的氨基酸序列，例如表1中列出的蛋白质之一或其保守取代的变体。
如本文所用，除非本文另外明确指出，否则“CBP密度”是指CBP-聚合物组合物(例如用G1-3RGD(SEQ ID NO:53)或G1-3RGDSP(SEQ ID NO:54)修饰的藻酸盐)中接头-CBP部分的浓度。
如本文所用，“细胞结合物质(CBS)”意指任何化学、生物学或其他类型的物质(例如，小的有机化合物、肽、多肽)，其能够模仿用于细胞粘附分子(CAM)的配体或介导细胞基质连接或细胞间连接或其他受体介导的信号传导的其他细胞表面分子的至少一种活性。在实施例中，当存在于包封活细胞的聚合物组合物时，该CBS能够形成瞬时或永久性键或与一个或多个细胞接触。在实施例中，该CBS促进包封在聚合物组合物中的两个或更多个活细胞之间的相互作用。在实施例中，当将经包封的细胞植入测试受试者(例如，小鼠)时，CBS在包封多个细胞(例如，活细胞)的聚合物组合物中的存在与增加的细胞生产力(例如，治疗剂的表达)和增加的细胞存活力之一或两者有关。在实施例中，该CBS物理附接到聚合物组合物中的一个或多个聚合物分子上。在实施例中，如本文定义的，CBS是细胞结合肽或细胞结合多肽。
如本文所用，“保守修饰的变体”或“保守取代”是指参比肽或与参比分子相同的多肽的变体，除了在其氨基酸序列中具有一个或多个保守氨基酸取代。在实施例中，保守修饰的变体由与参比氨基酸序列至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列组成。保守氨基酸取代是指用具有相似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、骨架构象和刚性等)的氨基酸取代氨基酸，并且对得到的取代肽或多肽的生物活性的影响最小。功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的，并且通过功能特征分组的示例性取代列于下表2中。
表2.示例性保守氨基酸取代基团。
Figure BDA0003279416310000121
Figure BDA0003279416310000131
如在整个说明书和权利要求书中所用，“基本上由……组成(基本上由组成)”，并且诸如“基本上由……组成(consist essentially of)”或“基本上由……组成(consisting essentially of)”的变体表示包括任何列举的要素或要素组，以及可任选地包括与所述元素具有相似或不同的性质的其他要素(其不会实质上改变特定分子、组合物、装置或方法的基本或新颖性质)。作为非限制性实例，基本上由该氨基酸序列组成的细胞结合肽或FVII蛋白还可以包括一个或多个氨基酸，该一个或多个氨基酸包括所列举氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基的取代，其各自不会实质上影响细胞结合肽或FVII蛋白的相关生物活性。
如本文所用，关于一个或多个细胞，“衍生自”是指从组织、细胞系或细胞获得的一个或多个细胞，其任选然后被培养、传代、永生化、分化和/或诱导等以产生一个或多个衍生的细胞。
如本文所用，“装置”是指任何可植入的物体(例如，颗粒、水凝胶胶囊、植入物、医疗装置)，其包含在植入该装置后能够表达和分泌FVII蛋白的活的工程化的RPE细胞，并具有通过允许细胞营养物进入该装置来支持RPE细胞的存活力的配置。在一些实施例中，该装置允许从装置释放由活细胞产生的代谢副产物。
如本文所用，“微分体积”是指本文所述装置内的一个隔室的体积，其排除由另一个或多个隔室占据的空间。例如，具有内、外隔室的2隔室装置中的第二(例如，外)隔室的微分体积是指第二隔室内的排除第一(内)隔室占据的空间的体积。
如本文所用，“有效量”是指以下任何一项的量：分泌FVII的工程化的RPE细胞、含有此类FVII分泌细胞的装置组合物或装置制品、或装置的组分(例如，装置中工程化的RPE细胞的数量、装置中CBS和/或去纤维化化合物的量)足以引起所希望的生物反应。在一些实施例中，术语“有效量”是指装置的组分的量(例如，装置中的细胞数、设置在装置表面和/或屏障隔室中的去纤维化化合物的密度、细胞容纳隔室中CBS的密度)。在实施例中，所希望的生物反应是从用工程化的RPE细胞、含有此类细胞的装置或装置制品治疗(例如，植入)的受试者中取出的组织样品中FVII水平的增加。如本领域的普通技术人员将理解的，有效量可以根据诸如以下的因素变化：所希望的生物学终点、分泌的FVII、组合物或装置的药物代谢动力学、所治疗的病症、给药方式以及受试者的年龄和健康。有效量涵盖治疗性和预防性治疗。在实施例中，设置在装置上或其中的具有式(I)的化合物的有效量是与参比装置相比，降低对所植入的装置的FBR，例如，降低所植入的装置上或附近的纤维化或者纤维化组织的量。在实施例中，在细胞容纳隔室中设置有工程化的RPE细胞时CBS的有效量是与参比装置相比增强这些细胞的存活力(例如，活细胞的数量)的量，和/或与参比装置相比增加RPE细胞的FVII产生(例如，在植入该装置的受试者的血浆中FVII水平增加)的量。可以通过本文所述的本领域已知的任何技术测定装置、组合物、或组分(例如，去纤维化化合物、CBS、工程化的细胞)的有效量。
在实施例中，细胞容纳隔室中CBS(例如，用RGD肽修饰的藻酸盐，如GRGDSP-藻酸盐(SEQ ID NO:49))以在将装置植入免疫受损或免疫活性动物后的某个时间点，与如下文中定义的CBS无效的参比装置相比，有效增加细胞的存活力和/或增加细胞的生产力的量存在，该免疫活性动物是例如免疫活性小鼠(例如，可从美国缅因州巴港的杰克逊实验室(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME USA)获得的C57BL/6J小鼠品系)。在实施例中，在植入后的希望时间点，例如在1天、3天、5天、1周、2周、4周、8周、12周、24周、36周和48周中的一个或多个处，可检测到细胞存活力和/或生产力的增加。在实施例中，CBS的有效量导致(i)当在植入后1周、2周、4周或12周测量时，细胞存活力增加至少10％、25％、50％或100％和(ii)当在植入后1周、2周、4周或12周测量时，细胞生产力增加至少1.25倍、1.5倍、2倍、5倍、8倍或10倍。在实施例中，该细胞容纳隔室中的CBS的有效量落在最小有效量和较高量之间的范围内，在该范围，与CBS无效参比装置相比或与细胞容纳隔室中包含最大有效量(例如最佳量)的CBS的装置相比细胞的存活力和/或生产力降低。在实施例中，细胞容纳隔室中的CBS的量高于或低于最佳量不超过50％、25％、10％或5％，例如，导致与CBS无效参比装置相比细胞存活力和/或生产力最大增加的量。
可以使用本领域已知的任何技术来估计本文描述的装置中的存活(和任选地死亡)细胞的数量，包括用两种荧光染料差异标记活细胞和死细胞，然后使用荧光显微镜检查来检测和任选定量标记的细胞的测定法。细胞存活力也可以通过评估其他细胞存活力指标来评价，包括测量酯酶活性或定量细胞中ATP的量。
在实施例中，通过测定体内或离体细胞表达的FVII蛋白水平来检测植入后细胞生产力的增加(例如，已从动物中取出装置后的细胞表达)。可以在细胞外但在装置内部和/或例如在从经本文所述的装置或装置制品治疗的动物(例如，非人类动物)中取出的组织样品中测量FVII表达。在实施例中，将细胞生产力表示为FVII蛋白或FVII活性的测量量除以所施用的装置的数量(例如，放置于动物中的胶囊的数量)和/或除以所施用的工程化的RPE细胞的数量(例如，在所施用的胶囊制品中大约细胞数/胶囊)。在实施例中，通过将确定的FVII的量或活性除以两个目的时间点之间的时间(例如在施用和测量之间，例如小时数、天数或周数)来进一步标准化细胞生产力的增加。在实施例中，生产力的增加通过测量从动物中取出的组织样品(例如，从动物收集的血液样品中分离的血浆)中FVII蛋白的量和/或活性)，将测得的量和/或活性除以所施用装置的数量(例如植入的2隔室胶囊的数量)，并任选地将结果除以施用与组织样品取出之间的天数来确定。
如本文所用，“内源核酸”是天然存在于受试细胞中的核酸。
如本文所用，“内源多肽”是天然存在于受试细胞中的多肽。
如本文所用，“工程化的RPE细胞”是具有非天然存在的改变并且典型地包含在未工程化(外源核酸序列)的类似条件下在其他类似的RPE细胞中不存在(或以不同水平存在)的核酸序列(例如，DNA或RNA)或多肽的RPE细胞。在实施例中，工程化的RPE细胞包含编码FVII蛋白的外源核酸(例如，载体或改变的染色体序列)。在实施例中，工程化的RPE细胞分泌包含人野生型FVII氨基酸序列或其变体的FVII蛋白。在实施例中，该外源核酸序列是染色体的(例如，该外源核酸序列是设置在内源染色体序列中的外源序列)或是染色体外的(例如，未整合的表达载体)。在实施例中，该外源核酸序列包含RNA序列，例如mRNA。在实施例中，该外源核酸序列包含染色体或染色体外外源核酸序列，其包含表达为RNA例如mRNA或调节性RNA的序列。在实施例中，该外源核酸序列包含第一染色体或染色体外外源核酸序列，其调节第二核酸序列(例如，FVII编码序列)的构象或表达，其中该第二氨基酸序列可以是外源的或内源的。例如，工程化的RPE细胞可以包含控制内源序列表达的外源核酸。在实施例中，该工程化的RPE细胞包含外源核酸序列，其包含编码FVII的密码子优化的序列，并且相比天然存在的FVII编码序列实现FVII的更高表达。密码子优化的序列可以使用可商购的算法生成，例如，GeneOptimizer(赛默飞世尔公司(ThermoFisher Scientific))、OptimumGeneTM(金斯瑞公司(GenScript)，美国新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway，NJUSA))、
Figure BDA0003279416310000161
(ATUM，美国新泽西州纽瓦克市(Newark，CA USA))或Java密码子适应工具(JCat,www.jcat.de,Grote,A.等人,Nucleic Acids Research[核酸研究],第33卷,增刊2期,页码W526-W531(2005)。在实施例中，从稳定转染的细胞群或单克隆细胞系培养工程化的RPE细胞(例如，工程化的ARPE-19细胞)。
如本文所用，“外源核酸”是不天然存在于受试细胞中的核酸。
如本文所用，“外源多肽”是不天然存在于受试细胞，例如工程化细胞中的多肽。提及特定序列的氨基酸位置是指所述氨基酸在参比氨基酸序列，例如全长成熟(在信号肽切割后)野生型蛋白的序列(除非另有说明)中的位置，且不排除在参比氨基酸序列中其他位置上存在变异，例如缺失、插入和/或取代。
如本文所用，“因子VII蛋白”或“FVII蛋白”是指包含天然存在的因子VII蛋白或其具有如通过本领域内公认的测定而确定的FVII生物活性例如促进血液凝固的变体的氨基酸序列的多肽(除非另有说明)。天然存在的FVII作为单链酶原、酶原样双链多肽和完全活化的双链形式(FVIIa)存在。可以通过本文所述的工程化的RPE细胞产生的FVII蛋白包括野生型灵长类(例如，人)、猪、犬和鼠蛋白，以及此类野生型蛋白的变体，包括片段、突变体、具有一个或多个氨基酸取代和/或缺失的变体。人FVII用前导序列表达，并且成熟的循环单链酶原含有406个氨基酸。人因子VII向活化因子VIIa的转化是归因于Arg152和Ile153之间的键的丝氨酸蛋白酶切割。人FVIIa由含有γ-羧基谷氨酸残基的20-kD 152-残基的轻链和含有催化结构域的30-kD 254-残基重链组成；该轻链和重链通过二硫键保持在一起。一些实施例中，对FVII的提及包括其单链和双链形式，包括酶原样和FVIIa。在一些实施例中，变体FVII蛋白能够被激活成完全激活的双链形式(因子VIIa)，其具有野生型因子VIIa的至少50％、75％、90％或更多(包括>100％)的活性。FVII和FVIIa的变体是已知的，例如，marzeptacog alfa(激活的)(MarzAA)和欧洲专利号1373493、美国专利号7771996、美国专利号9476037和美国公开申请号US 20080058255中描述的变体。
“FVII缺乏症”、“F7缺乏症”、“亚历山大病(Alexander’sDisease)”、“低前转化素血症”、“前转化素缺乏症”、“凝血酶原转化加速因子缺乏症”和“血清凝血酶原转化加速因子缺乏症”可以互换使用，并且是指先天性或获得性病症，其特征在于低于正常的FVII水平和/或低于正常的FVII活性。FVII缺乏症的症状可以根据功能性FVII的水平而从轻度到严重变化。轻度症状包括挫伤和软组织出血、创伤或拔牙后出血时间更长、关节出血、流鼻血、牙龈出血、月经量过多。患有更严重FVII缺乏症的患者可以经历因肠、胃、肌肉或头部的出血发作和出血而致的关节软骨破坏。婴儿通常在出生后6个月内，在中枢神经系统(诸如颅内出血)或胃肠道持续出血之后，被诊断出FVII缺乏症。因子VII缺乏症的诊断是基于特征性症状的鉴定、详细患者病史、全面的临床评估和测量血液多长时间凝结的凝血试验(即，活化部分凝血活素时间(aPTT)试验和凝血酶原时间(PT)试验)。患有FVII缺乏症的个体具有正常的aPTT和延长的PT。另外的确认FVII诊断的试验包括用以测量血液中的FVII活性的FVII测定。
如本文所用，“FVII缺乏症患者”是指已被诊断出或怀疑患有FVII缺乏症的个体。在实施例中，缺乏FVII的患者具有突变的F7基因。人F7基因包含9个外显子并在染色体13q34上跨越约12.8kb。
如本文所用，“聚合物组合物”是包含一种或多种聚合物的组合物(例如，溶液、混合物)。作为一类，“聚合物”包括均聚物、杂聚物、共聚物、嵌段聚合物、嵌段共聚物，可以是天然的也可以是合成的。均聚物包含一种类型的结构单元或单体，而共聚物包含超过一种类型的单体。
如本文所用，“多肽”是指包含通过肽键连接的氨基酸残基并具有至少两个并且在一些实施例中至少3、4、5、10、50、75、100、150或200个氨基酸残基的聚合物。
如本文所用，“预防(Prevention、prevent和preventing)”是指包括在FVII缺乏症的一种或多种症状发作之前，施用或应用FVII替代疗法(例如，施用包封工程化的RPE细胞(例如，如本文所述的)的装置的组合物)以排除一种或多种症状的身体表现的治疗。在一些实施例中，“预防(prevention、prevent和preventing)”需要尚未发展或尚未观察到FVII缺乏症的体征或症状。在一些实施例中，治疗包括预防，而在其他实施例中则不包括。
如本文所用，关于要求保护的装置(例如，水凝胶胶囊)，“参比装置”是指如下装置(例如，水凝胶胶囊)，其(i)缺乏所要求保护的装置的特定特征，例如特异性的外源核苷酸序列，例如增强mRNA或蛋白质表达的元件(例如，启动子序列、信号肽序列)，减轻FBR的器件(例如，包含去纤维化化合物(如本文所定义)或CBS(如本文所定义)(例如RGD聚合物)的屏障隔室)，(ii)在细胞容纳隔室包封约相同数量的与所要求保护的装置中相同的细胞类型的细胞，以及(iii)除缺少特定特征(例如，去纤维化化合物或CBS)外具有与所要求保护的装置中的基本上相似的聚合物组成和结构。在实施例中，参比装置的细胞容纳隔室中活的工程化的RPE细胞的数量是在所要求保护的装置的细胞容纳隔室中活的工程化的RPE细胞的数量的80％至120％内，或在90％至110％内。在实施例中，参比装置和所要求保护的装置中的工程化的细胞获得自相同的细胞培养物。在实施例中，基本上相似的聚合物组成是指参比装置和所要求保护的装置中的所有聚合物，包括任何CBP-聚合物和去纤维化聚合物的聚合物组分(如果适用)具有相同的化学和分子量类别(例如，具有高G含量和相同分子量范围的藻酸盐)。例如，在实施例中，CBP无效参比装置中细胞容纳隔室由用于形成所要求保护的装置的细胞容纳隔室的CBP-聚合物中的聚合物(例如，藻酸盐)的未经修饰形式形成。在其中要求保护的两隔室水凝胶毫微胶囊具有(i)由包封多个细胞的CBP-聚合物形成的内隔室和(ii)由经化学修饰的聚合物(例如，如本文所述的CM-LMW-藻酸盐)和未经修饰的聚合物(例如本文所述的U-HMW-藻酸盐)的混合物形成的外隔室的一些实施例中，则参比胶囊和要求保护的胶囊的外隔室由相同的聚合物混合物形成，而参比胶囊的内隔室由细胞在用于外隔室的相同聚合物混合物中的悬浮液形成。在实施例中，基本上相似的结构意味着参比装置器件和要求保护的装置具有相同数量的隔室(例如，一个、两个、三个等)并且具有大约相同的尺寸和形状。
如本文所用，“RPE细胞”是指具有以下特征中的一种或多种的细胞：a)它包含视网膜色素上皮细胞(RPE)(例如，使用ARPE-19细胞系(
Figure BDA0003279416310000192
CRL-2302TM)培养)或由其衍生的或工程化的细胞(例如，通过用编码FVII蛋白的外源序列稳定转染由ARPE-19细胞系培养的细胞，或以其他方式工程化此类培养的ARPE-19细胞以表达FVII蛋白)，衍生自RPE细胞的原代细胞培养物的细胞，从天然存在的RPE细胞(例如，来自人或其他哺乳动物)直接分离的细胞(无需长期培养，例如自分离后少于5或10代或轮的细胞分裂)，由转化的、永生的或长期的(例如，超过5或10代或轮的细胞分裂)RPE细胞培养物衍生的细胞；b)已经从低分化的细胞获得的细胞，例如发育、编程或重新编程(例如在体外)为RPE细胞的细胞，或除了任何基因工程外基本上与以下的一种或多种细胞相似的细胞：自然存的RPE细胞或来自RPE细胞的原代或长期培养的细胞(例如，细胞可以衍生自IPS细胞)；或c)具有以下的一种或多种特性的细胞：i)表达生物标志物CRALBP、RPE-65、RLBP、BEST1或αB-晶体蛋白中的一种或多种；ii)不表达生物标志物CRALBP、RPE-65、RLBP、BEST1或αB-晶体蛋白中的一种或多种；iii)天然存在于视网膜中并在布鲁赫氏膜(Bruch’s membrane)中的脉络膜血管上方形成单层；iv)负责视网膜中的上皮转运、光吸收、分泌和免疫调节；或v)它已经合成产生，或由天然存在的细胞修饰，以具有相同或基本上相同的遗传内容物，以及任选地相同或基本上相同的表观遗传内容物，如永生化RPE细胞系(例如，ARPE-19细胞系(
Figure BDA0003279416310000191
CRL-2302TM))。在实施例中，将本文所述的RPE工程化，例如，以具有新的特性，例如将细胞工程化以表达和分泌FVII。在其他实施例中，RPE细胞未经工程化。
除非另有说明，否则如本文所用“盐水溶液”是指生理盐水，即含有0.9％NaCl的水。
“序列同一性”或“相同百分比”，当在本文中用于指代两个核苷酸序列或两个氨基酸序列时，意指当比较两个序列并对齐以在比较窗口或特定区域上进行最大对应时，两个序列在特定区域内相同，或在特定区域内在特定百分比的核苷酸或氨基酸位置具有相同核苷酸或氨基酸。序列同一性可以使用本领域已知的标准技术确定，包括但不限于美国专利申请公开号2017/02334455 A1描述的任何算法。在实施例中，相同核苷酸或氨基酸位置的特定百分比为至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
如本文所用，“球形”是指具有形成球形(例如，完全圆形球)或球形形状的弯曲表面(例如，在表面上可以具有波和起伏)的装置(例如，水凝胶胶囊或其他颗粒)。球体和球状物体可以通过围绕三个垂直轴a、b和c中的每一个的圆形、椭圆形或组合的旋转来数学地定义。对于球体，三个轴的长度相同。通常，球状形状是具有彼此在10％、或5％或2.5％之内的半主轴的椭圆体(对于其平均表面)。球形或球状形状的直径是平均直径，例如半主轴的平均值。
如本文所用，术语“球状体”是指装置(例如，水凝胶胶囊或其他颗粒)，是指该装置具有(i)完美或经典的扁球形或长球形，或(ii)具有粗略地形成一个球体的表面，例如可能具有波浪和起伏，和/或可能是半主轴彼此在100％之内的椭圆形(对于其平均表面)。
如本文所用，“受试者”是指人或非人动物。在实施例中，该受试者是人(即，男性或女性)，任何年龄组的，例如，儿科受试者(例如，婴儿、儿童、青少年)或成年人受试者(例如，年轻成人、中年成人、或老年成人))。在实施例中，该受试者是非人动物，例如哺乳动物(例如小鼠、狗、灵长类动物(例如食蟹猴或恒河猴))。在实施例中，该受试者是商业上相关的哺乳动物(例如，牛、猪、马、绵羊、山羊、猫或狗)或禽(例如，商业相关的禽，例如鸡、鸭、鹅或火鸡)。在某些实施例中，该动物是哺乳动物。该动物可以是雄性的或雌性的并且处于任何发育阶段。非人的动物可以是转基因动物。
如本文所用，“总体积”是指多隔室装置的一个隔室内的体积，其包括被另一个隔室占据的空间。例如，两隔室装置的第二(例如，外)隔室的总体积是指第二隔室内的体积，其包括被第一隔室占据的空间。
“转录单位”意指例如存在于外源核酸中的DNA序列，其包含至少一个与编码序列可操作地连接的启动子序列，并且还可以包含控制或增强编码序列转录成RNA分子或RNA分子翻译成多肽分子的一个或多个附加元件。在一些实施例中，转录单位还包含聚腺苷酸化(聚A)信号序列和聚A位点。在实施例中，转录单位存在于外源的染色体外表达载体中，例如，如图6所示，或作为整合在本文所述的工程化RPE细胞的染色体中的外源序列存在。
如本文所用，“治疗(Treatment、treat和treating)”是指减轻、逆转、缓解、延迟FVII缺乏症的一种或多种症状、表现或潜在病因的发作或抑制其进展中的一种或多种。在实施例中，治疗包括减轻、逆转、缓解、延迟与FVII缺乏症相关的症状或病症的发作或抑制其进展。在实施例中，治疗包括在有需要的受试者中增加FVII血浆水平。在一些实施例中，“治疗(treatment、treat和treating)”需要已经发展或已经观察到与FVII缺乏症相关的体征或症状。在其他实施例中，可以在没有FVII缺乏症的体征或症状时施用治疗，例如在预防性治疗中。例如，可以在症状发作之前向易感个体施用治疗(例如，根据症状史和/或根据遗传因素或其他易感性因素)。症状已经解决后也可以继续治疗，例如，以延迟或防止复发。在一些实施例中，治疗包括预防，而在其他实施例中则不包括。
选定的化学定义
下面更详细地描述了特定官能团和化学术语的定义。化学元素根据the PeriodicTable of the Elements[化学元素周期表],CAS版,Handbook of Chemistry and Physics[化学和物理手册],第75版,封二来鉴定，并且特定官能团总体上如其中所述来定义。另外，有机化学的通用原理以及特定的官能部分和反应性描述于Thomas Sorrell,OrganicChemistry[有机化学],University Science Books[大学科学书籍],索萨利托(Sausalito),1999；Smith和March，March’s Advanced Organic Chemistry,[March高级有机化学],第5版,约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.),纽约,2001；Larock,Comprehensive Organic Transformations[综合有机转化],VCH出版社(VCH Publishers,Inc.),纽约,1989；和Carruthers,Some Modern Methods of Organic Synthesis,[一些现代有机合成方法],第3版,剑桥大学出版社(Cambridge University Press),剑桥,1987。
本文所用的缩写具有它们在化学和生物学领域中的常规含义。本文所阐述的化学结构和式是根据化学领域中已知的化学价的标准规则构建的。
当列举数值范围时，意图涵盖该范围内的每个数值和子范围。例如，“C1-C6烷基”旨在涵盖C1、C2、C3、C4、C5、C6、C1-C6、C1-C5、C1-C4、C1-C3、C1-C2、C2-C6、C2-C5、C2-C4、C2-C3、C3-C6、C3-C5、C3-C4、C4-C6、C4-C5、和C5-C6烷基。
如本文所用，“烷基”是指具有1至24个碳原子(“C1-C24烷基”)的直链或支链的饱和烃基团。在一些实施例中，烷基基团具有1至12个碳原子(“C1-C12烷基”)、1至10个碳原子(“C1-C10烷基”)、1至8个碳原子(“C1-C8烷基”)、1至6个碳原子(“C1-C6烷基”)、1至5个碳原子(“C1-C5烷基”)、1至4个碳原子(“C1-C4烷基”)、1至3个碳原子(“C1-C3烷基”)、1至2个碳原子(“C1-C2烷基”)、或1个碳原子(“C1烷基”)。在一些实施例中，烷基基团具有2至6个碳原子(“C2-C6烷基”)。C1-C6烷基基团的实例包括甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、异丙基(C3)、正丁基(C4)、叔丁基(C4)、仲丁基(C4)、异丁基(C4)、正戊基(C5)、3-戊基(C5)、戊基(C5)、新戊基(C5)、3-甲基-2-丁基(C5)、叔戊基(C5)以及正己基(C6)。烷基基团的另外的实例包括正庚基(C7)、正辛基(C8)等等。烷基基团的每个实例可以是独立地任选取代的，即，未取代的(“未取代的烷基”)或被一个或两个取代基取代的(“取代的烷基”)；例如，例如1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基。
如本文所用，“烯基”是指具有2至24个碳原子、一个或多个碳碳双键并且没有碳碳三键的直链或支链的烃基团(“C2-C24烯基”)。在一些实施例中，烯基基团具有2至12个碳原子(“C2-C12烯基”)、2至10个碳原子(“C2-C10烯基”)、2至8个碳原子(“C2-C8烯基”)、2至6个碳原子(“C2-C6烯基”)、2至5个碳原子(“C2-C5烯基”)、2至4个碳原子(“C2-C4烯基”)、2至3个碳原子(“C2-C3烯基”)、或2个碳原子(“C2烯基”)。该一个或多个碳碳双键可以是内部的(诸如在2-丁烯基中)或末端的(诸如在1-丁烯基中)。C2-C4烯基基团的实例包括乙烯基(C2)、1-丙烯基(C3)、2-丙烯基(C3)、1-丁烯基(C4)、2-丁烯基(C4)、丁二烯(C4)等等。C2-C6烯基基团的实例包括上述C2-4烯基，以及戊烯基(C5)、戊二烯基(C5)、己烯基(C6)等。烯基基团的每个实例可以是独立地任选取代的，即，未取代的(“未取代的烯基”)或被一个或多个取代基(例如，诸如从1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基)取代的(“取代的烯基”)。
如本文所用，术语“炔基”是指具有2至24个碳原子、一个或多个碳碳三键的直链或支链的烃基团(“C2-C24烯基”)。在一些实施例中，炔基基团具有2至12个碳原子(“C2-C12炔基”)、2至10个碳原子(“C2-C10炔基”)、2至8个碳原子(“C2-C8炔基”)、2至6个碳原子(“C2-C6炔基”)、2至5个碳原子(“C2-C5炔基”)、2至4个碳原子(“C2-C4炔基”)、2至3个碳原子(“C2-C3炔基”)、或2个碳原子(“C2炔基”)。该一个或多个碳碳三键可以是内部的(诸如在2-丁炔基中)或末端的(诸如在1-丁炔基中)。C2-C4炔基基团的实例包括乙炔基(C2)、1-丙炔基(C3)、2-丙炔基(C3)、1-丁炔基(C4)、2-丁炔基(C4)等。炔基基团的每个实例可以是独立地任选取代的，即，未取代的(“未取代的炔基”)或被一个或多个取代基(例如，诸如从1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基)取代的(“取代的炔基”)。
如本文所用，术语“杂烷基”是指包括至少一个碳原子和至少一个选自由O、N、P、Si和S组成的组的杂原子的非环状稳定的直链或支链或其组合，并且其中氮和硫原子可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化。一个或多个杂原子O、N、P、S和Si可被置于杂烷基基团的任意位置处。示例性杂烷基基团包括但不限于：-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3、-CH＝CH-N(CH3)-CH3、-O-CH3和-O-CH2-CH3。多达两个或三个杂原子可以是连续的，例如像-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。当列举“杂烷基”然后列举特定的杂烷基基团例如-CH2O、-NRCRD等时，应理解术语杂烷基和-CH2O或-NRCRD不是冗余或相互排斥的。而是，列举特定的杂烷基基团以增加清晰度。因此，术语“杂烷基”在本文中不应解释为排除特定的杂烷基基团，诸如-CH2O、-NRCRD等。杂烷基基团的每个实例可以是独立地任选取代的，即，未取代的(“未取代的杂烷基”)或被一个或多个取代基(例如，诸如从1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基)取代的(“取代的杂烷基”)。
除非另有说明，术语“亚烷基”、“亚烯基”、“亚炔基”或“亚杂烷基”单独或作为另一取代基的一部分分别表示衍生自烷基、烯基、炔基或杂烷基的二价基团。亚烷基、亚烯基、亚炔基或亚杂烷基可描述为例如C1-C6元亚烷基、C2-C6元亚烯基、C2-C6元亚炔基、或C1-C6元亚杂烷基，其中术语“元”是指该部分内的非氢原子。在杂亚烷基基团的情况下，杂原子也可占据链末端中的任一个或两个(例如亚烷氧基，亚烷二氧基，亚烷基氨基，亚烷基二氨基等)。仍进一步地，对于亚烷基和亚杂烷基连接基团，所书写的连接基团的式的方向不暗示连接基团的取向。例如，式-C(O)2R’-可以代表-C(O)2R’-和-R’C(O)2-。
如本文所用，“芳基”是指具有6-14个环碳原子以及提供在芳香族环系统中的零个杂原子的单环的或多环的(例如，二环的或三环的)4n+2芳香族环系统(例如，在环阵列中具有6、10、或14个π电子)的基团(“C6-C14芳基”)。在一些实施例中，芳基基团具有六个环碳原子(“C6芳基”；例如，苯基)。在一些实施例中，芳基基团具有是个环碳原子(“C10芳基”；例如，萘基，诸如1-萘基和2-萘基)。在一些实施例中，芳基基团具有十四个环碳原子(“C14芳基”；例如，蒽基)。芳基基团可以描述为例如C6-C10元芳基，其中术语“元”是指该部分内的非氢环原子。芳基基团包括苯基、萘基、茚基和四氢萘基。芳基基团的每个实例可以是独立地任选取代的，即，未取代的(“未取代的芳基”)或被一个或多个取代基取代的(“取代的芳基”)。
如本文所用，“杂芳基”是指具有环碳原子以及提供在该芳香族环系统中的1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫)的5-10元单环的或二环的4n+2芳香族环系统(例如，在环阵列中具有6或10个π电子)的基团(“5-10元杂芳基”)。在包含一个或多个氮原子的杂芳基基团中，附接点可以是碳或氮原子，只要化合价允许。杂芳基二环环系统可以在一个或两个环中包括一个或多个杂原子。“杂芳基”也包括环系统，其中该杂芳基环，如以上定义的，是与一个或多个芳基基团稠合的(其中附接点或者在芳基上或者在杂芳基环上)，并且在此类情况下，环成员的数量继续称作在该稠合(芳基/杂芳基)环系统中的环成员的数量。在其中一个环不包括杂原子的二环杂芳基基团(例如，吲哚基、喹啉基、咔唑基等)中附接点可以是在其中一环上，即，或者该环承载杂原子(例如，2-吲哚基)或该环不包含杂原子(例如，5-吲哚基)。杂芳基基团可以描述为例如6-10元杂芳基，其中术语“元”是指该部分内的非氢环原子。
在一些实施例中，杂芳基基团是具有环碳原子以及提供在该芳香族环系统中的1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫)的5-10元芳香族环系统(“5-10元杂芳基”)。在一些实施例中，杂芳基基团是具有环碳原子以及提供在该芳香族环系统中的1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫)的5-8元芳香族环系统(“5-8元杂芳基”)。在一些实施例中，杂芳基基团是具有环碳原子以及提供在该芳香族环系统中的1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫)的5-6元芳香族环系统(“5-6元杂芳基”)。在一些实施例中，该5-6元杂芳基具有1-3个选自氮、氧以及硫的环杂原子。在一些实施例中，该5-6元杂芳基具有1-2个选自氮、氧以及硫的环杂原子。在一些实施例中，该5-6元杂芳基具有1个选自氮、氧以及硫的环杂原子。杂芳基基团的每个实例可以是独立地任选取代的，即，未取代的(“未取代的杂芳基”)或被一个或两个取代基取代的(“取代的杂芳基”)。
含有一个杂原子的示例性5元杂芳基基团包括但不限于吡咯基、呋喃基和苯硫基。包含两个杂原子的示例性5元杂芳基基团包括但不限于咪唑基、吡唑基、噁唑啉基、异噁唑基、噻唑基以及异噻唑基。包含三个杂原子的示例性5元杂芳基基团包括但不限于三唑基、噁二唑基以及噻二唑基。包含四个杂原子的示例性5元杂芳基基团包括但不限于四唑基。包含一个杂原子的示例性6元杂芳基基团包括但不限于吡啶基。包含两个杂原子的示例性6元杂芳基基团包括但不限于哒嗪基、嘧啶基以及吡嗪基。包含三或四个杂原子的示例性6元杂芳基基团包括但不限于独自地三嗪基以及四嗪基。包含一个杂原子的示例性7元杂芳基基团包括但不限于氮杂卓基、氧杂卓基以及硫杂卓基。示例性5,6-二环杂芳基基团包括但不限于吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并三唑基、苯并苯硫基、异苯并苯硫基、苯并呋喃基、苯并异呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噻二唑基、吲嗪基以及嘌呤基。示例性6,6-二环杂芳基基团包括但不限于萘啶基、蝶啶基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹喔啉基、酞嗪基以及喹唑啉基。其他示例性杂芳基基团包括血红素和血红素衍生物。
如本文所用，术语“亚芳基”和“亚杂芳基”(单独或作为另一取代基的一部分)分别表示衍生自芳基和杂芳基的二价基团。
如本文所用，“环烷基”是指具有从3到10个环碳原子的非芳香族环状烃基(“C3-C10环烷基”)和该非芳香族环系统中的零个杂原子。在一些实施例中，环烷基基团具有3至8个环碳原子(“C3-C8环烷基”)、3至6环碳原子(“C3-C6环烷基”)、或5至10环碳原子(“C5-C10环烷基”)。环烷基基团可以描述为例如C4-C7元环烷基，其中术语“元”是指该部分内的非氢环原子。示例性C3-C6环烷基包括但不限于环丙基(C3)、环丙烯基(C3)、环丁基(C4)、环丁烯基(C4)、环戊基(C5)、环戊烯基(C5)、环己基(C6)、环己烯基(C6)、环己二烯基(C6)等。示例性C3-C8环烷基基团包括但不限于前面提到的C3-C6环烷基基团以及环庚基(C7)、环庚烯基(C7)、环庚二烯基(C7)、环庚三烯基(C7)、环辛基(C8)、环辛烯基(C8)、立方烷基(C8)、双环[1.1.1]戊烷基(C5)、双环[2.2.2]辛烷基(C8)、双环[2.1.1]己烷基(C6)、双环[3.1.1]庚烷基(C7)等。示例性C3-C10环烷基基团包括但不限于前面提到的C3-C8环烷基基团以及环壬基(C9)、环壬烯基(C9)、环癸基(C10)、环癸烯基(C10)、八氢-1H-茚基(C9)、十氢萘基(C10)、螺[4.5]癸烷基(C10)等。如前述实例所说明的，在某些实施例中，该环烷基是单环的(“单环环烷基”)或含有稠合的、桥联的或螺的环系统(诸如双环系统(“双环环烷基”))并且可以是饱和的或可以是部分不饱和的。“环烷基”还包括其中如上所定义的环烷基环与一个或多个芳基基团稠合的环系统，其中附接点在环烷基环上，并且在此类情况下，碳的数量继续指示该环烷基环系统中的碳的数量。环烷基基团的每个实例可以是独立地任选取代的，即，未取代的(“未取代的环烷基”)或被一个或多个取代基取代的(“取代的环烷基”)。
如本文所用，“杂环基”是指具有环碳原子以及1至4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧、硫、硼、磷以及硅)的3至10元非芳香族环系统的基团(“3-10元杂环基”)。在包含一个或多个氮原子的杂环基基团中，附接点可以是碳或氮原子，只要化合价许可。杂环基基团或者可以是单环的(“单环的杂环基”)或者是稠合的、桥联的或螺的环系统(例如二环系统(“二环的杂环基”))并且可以是饱和的或可以是部分不饱和的。杂环基二环的环系统可以在一个或两个环中包括一个或多个杂原子。“杂环基”还包括其中如上所定义的该杂环基环与一个或多个环烷基基团稠合的环系统，其中附接点是在该环烷基或杂环基环或者其中如上所定义的该杂环基环被一个或多个芳基或杂芳基基团稠合的环系统上，其中附接点是在该杂环基环上，并且在此类情况下，环成员的数量继续指示该杂环基环系统中的环成员的数量。杂环基基团可以描述为例如3-7元杂环基，其中术语“元”是指在该部分内的非氢环原子，即碳、氮、氧、硫、硼、磷和硅。杂环基的每个实例可以是独立地任选取代的，即，未取代的(“未取代的杂环基”)或被一个或多个取代基取代的(“取代的杂环基”)。在某些实施例中，该杂环基基团是未取代的3-10元杂环基。在某些实施例中，该杂环基基团是取代的3-10元杂环基。
在一些实施例中，杂环基基团是具有环碳原子以及1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧、硫、硼、磷以及硅)的5-10元非芳香族环系统(“5-10元杂环基”)。在一些实施例中，杂环基基团是具有环碳原子以及1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧、和硫)的5-8元非芳香族环系统(“5-8元杂环基”)。在一些实施例中，杂环基基团是具有环碳原子以及1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧、和硫)的5-6元非芳香族环系统(“5-6元杂环基”)。在一些实施例中，该5-6元杂环基具有1-3个选自氮、氧以及硫的环杂原子。在一些实施例中，该5-6元杂环基具有1-2个选自氮、氧以及硫的环杂原子。在一些实施例中，该5-6元杂环基具有一个选自氮、氧以及硫的环杂原子。
含有一个杂原子的示例性3元杂环基基团包括但不限于氮丙啶基、环氧乙烷基(oxiranyl)、环硫乙烷基(thiorenyl)。包含一个杂原子的示例性4元杂环基基团包括但不限于氮杂环丙基、环氧乙烷基以及硫杂环丙烷基。含有一个杂原子的示例性5元杂环基基团包括但不限于四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢苯硫基、二氢苯硫基、吡咯烷基、二氢吡咯基以及吡咯基-2,5-二酮。含有两个杂原子的示例性5元杂环基基团包括但不限于二氧戊环基、氧杂硫杂环戊烷基、二硫杂环戊烷基以及噁唑烷-2-酮。包含三个杂原子的示例性5元杂环基基团包括但不限于三唑啉基、噁二唑啉基以及噻二唑啉基。含有一个杂原子的示例性6元杂环基基团包括但不限于哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、二氢吡啶基以及硫杂环己烷基(thianyl)。含有两个杂原子的示例性6元杂环基基团包括但不限于哌嗪基、吗啉基、二硫杂环己烷基、二氧杂环己烷基。含有两个杂原子的示例性6元杂环基包括但不限于三嗪基或硫代吗啉基-1,1-二氧化物。包含一个杂原子的示例性7元杂环基基团包括但不限于氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基以及硫杂环庚烷基。含有一个杂原子的示例性8元杂环基基团包括但不限于氮杂环辛烷基、氧杂环辛烷基和硫杂环辛烷基。稠合至C6芳基环(本文中还称为5,6-二环杂环)的示例性5元杂环基基团包括但不限于吲哚啉基、异吲哚啉基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、苯并噁唑啉酮基等。稠合至芳基环的示例性6元杂环基基团(在此也称为6,6-二环杂环)包括但不限于四氢喹啉基、四氢异喹啉基等。
如本文所用，“氨基”是指基团-NR70R71，其中R70和R71各自独立地是氢、C1-C8烷基、C3-C10环烷基、C4-C10杂环基、C6-C10芳基、和C5-C10杂芳基。在一些实施例中，氨基指NH2。
如本文所用，“氰基”是指基团-CN。
除非另有说明，否则如本文所用“卤基”或“卤素”独立地或作为另一取代基的一部分，是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)原子。
如本文所用，“羟基”是指基团-OH。
如本文所定义的，烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、和杂芳基基团是任选地取代的(例如，“取代的”或“未取代的”烷基、“取代的”或“未取代的”烯基、“取代的”或“未取代的”炔基、“取代的”或“未取代的”杂烷基、“取代的”或“未取代的”环烷基、“取代的”或“未取代的”杂环基、“取代的”或“未取代的”芳基或“取代的”或“未取代的”杂芳基基团)。通常，术语“取代的”，无论是否在术语“任选地”之前，意味着存在于基团(例如，碳或氮原子)上的至少一个氢是被允许的取代基替换的，例如，取代后的取代基产生稳定的化合物，例如，不能自发地通过重排、环化、消除或其他反应进行转化的化合物。除非另作说明，“取代的”基团在该基团的一个或多个可取代的位置具有取代基，并且当在任何给出的结构中的多于一个位置被取代时，在每个位置的取代基或是相同的或是不同的。术语“取代的”预期包括被有机化合物的所有允许的取代基的取代，例如在此描述的导致稳定化合物的形成的取代基的任何一个。本披露涵盖任何和所有此类组合以便实现稳定化合物。出于本披露的目的，杂原子(例如氮)可以具有氢取代基和/或如在此描述的满足杂原子的化合价并且导致稳定部分的形成的任何合适的取代基。
两个或更多个取代基可任选地连接以形成芳基、杂芳基、环烷基或杂环基基团。这种所谓的成环取代基典型地但不一定与环状基础结构相附接。在一个实施例中，成环取代基附接到基础结构的相邻成员上。例如，附接到环状基础结构的相邻成员上的两个成环取代基产生稠合的环结构。在另一个实施例中，成环取代基附接到基础结构的单一成员上。例如，附接到环状基础结构的单一成员上的两个成环取代基产生螺环结构。在又另一个实施例中，成环取代基附接到基础结构的非相邻成员上。
在此描述的具有式(I)的化合物可以包含一个或多个不对称中心，并且因此可以呈不同异构体形式存在，例如对映异构体和/或非对映异构体。例如，本文所述的化合物可以呈单独的对映异构体、非对映异构体或几何异构体的形式，或可以呈立体异构体混合物的形式，这些立体异构体混合物包括外消旋混合物以及富含一种或多种立体异构体的混合物。可以通过本领域技术人员已知的方法(包括手性高压液相色谱(HPLC)和手性盐的形成和结晶)从混合物中分离异构体；或者优选的异构体可以通过不对称合成来制备。参见，例如，Jacques等人,Enantiomers,Racemates and Resolutions[对映异构体、外消旋体和拆分](威利国际科学出版社(Wiley Interscience),纽约,1981)；Wilen等人,Tetrahedron[四面体]33:2725(1977)；Eliel,Stereochemistry of Carbon Compounds[碳化合物的立体化学](McGraw-Hill,纽约,1962)；和Wilen,Tables of Resolving Agents and OpticalResolutions[拆分剂表和光学拆分]第268页(E.L.Eliel编辑,诺特丹大学出版社(Univ.ofNotre Dame Press),诺特丹,印第安纳州1972)。另外，本发明涵盖如在此描述的呈单一的异构体(基本上不含其他异构体)的化合物，并且可替代地，呈多种异构体的混合物。
如本文所用，纯对映体化合物基本上不含化合物的其他对映体或立体异构体(即，对映体过量)。换言之，化合物的“S”形式基本上不含该化合物的“R”形式，因此是“R”形式对映异构体过量的。术语“对映体纯的”或“纯的对映体”表示该化合物包含大于75重量％、大于80重量％、大于85重量％、大于90重量％、大于91重量％、大于92重量％、大于93重量％、大于94重量％、大于95重量％、大于96重量％、大于97重量％、大于98重量％、大于99重量％、大于99.5重量％、大于99.9重量％的对映体。在某些实施例中，重量基于化合物的所有对映异构体或立体异构体的总重量。
本文所述的具有式(I)化合物还可包含一个或多个同位素取代。例如，H可以是任何同位素形式，包括1H、2H(D或氘)和3H(T或氚)；C可以是任何同位素形式，包括12C、13C和14C；O可以是任何同位素形式，包括16O和18O；等。
术语“药学上可接受的盐”意指包括活性化合物的盐，这些活性化合物取决于在此描述的化合物上发现的特定取代基用相对无毒的酸或碱制备。当本披露中使用的用于制备装置的具有式(I)的化合物含有相对酸性的官能团时，碱加成盐可以通过使这些化合物的中性形式与足量的所需碱(纯净的或在合适的惰性溶剂中)接触而获得。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐，或类似的盐。当本披露中使用的化合物含有相对碱性的官能团时，酸加成盐可以通过使这些化合物的中性形式与足量的所需酸(纯净的或在合适的惰性溶剂中)接触而获得。药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸(如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等)的那些，以及衍生自有机酸(如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等)的盐。还包括氨基酸盐如精氨酸盐等，以及有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见例如Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science[药物科学杂志]66:1-19(1977))。本披露的装置(例如，颗粒、水凝胶胶囊)中使用的某些特定化合物含有碱性和酸性官能团，其允许化合物转化成碱或酸加成盐。可以通过本领域技术人员已知的方法制备这些盐。本领域技术人员已知的其他药学上可接受的载体适用于本披露。
本披露的装置可以包含前药形式的具有式(I)的化合物。前药是那些在生理条件下容易发生化学变化以提供可用于减轻对本披露装置的FBR的化合物。另外，前药可以通过化学或生物化学方法在离体环境中转化为有用的具有式(I)的化合物。
本文所述的某些具有式(I)的化合物可以非溶剂化形式以及溶剂化形式存在，包括水合形式。通常，溶剂化形式等效于非溶剂化形式并且包括在本披露的范围中。本文所述的某些具有式(I)的化合物可以以多种结晶或无定形形式存在。通常，所有物理形式对于本披露所考虑的用途是等同的，并且旨在落入本披露的范围内。
术语“溶剂化物”是指通常通过溶剂分解反应与溶剂相缔合的化合物的形式。这种物理缔合可以包括氢键结合。常规的溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙酸、DMSO、THF、乙醚等。本文所述的化合物可以制备为例如结晶的形式，并且可以是被溶剂化的。适合的溶剂化物包括药学上可接受的溶剂化物并且进一步包括化学计量的溶剂化物和非化学计量的溶剂化物。
术语“水合物”是指与水相缔合的化合物。典型地，在化合物的水合物中所含的水分子的数量与水合物中的化合物分子的数量呈一定的比率。因此，化合物的水合物可以例如由通式R x H2O表示，其中R是化合物并且其中x是大于0的数字。
如本文所用，术语“互变异构体”是指以下化合物，其具有可互换形态的化合物结构并且在氢原子和电子移位方面变化。因此，两种结构可以通过π电子和原子(通常是H)的运动处于平衡。例如，烯醇和酮是互变异构体，因为通过用酸或碱的处理它们快速地相互转化。互变异构形式可以与获得目的化合物的最优化学反应性和生物活性相关。
如文本所用，符号
Figure BDA0003279416310000311
是指与实体(例如聚合物(例如，形成的水凝胶聚合物，例如藻酸盐)或可植入元件(例如，颗粒、装置(例如，水凝胶胶囊)、材料)的表面的连接。由
Figure BDA0003279416310000312
表示的连接可以指与实体(例如聚合物或可植入元件)的直接附接，或者可以指通过连接基团与实体的连接。如本文所述，“附接基团”是指用于将具有式(I)化合物与实体(例如，如本文所述的聚合物或可植入元件)连接的部分，并且可包括在本领域中已知的任何附接化学。示例性附接基团的列表概述在Bioconjugate Techniques[生物缀合技术](第3版，Greg T.Hermanson,马萨诸塞州沃尔瑟姆市(Waltham,MA):爱思唯尔公司(Elsevier,Inc),2013)，其通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，附接基团包括烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-C(O)-、-OC(O)-、-N(RC)-、-N(RC)C(O)-、-C(O)N(RC)-、-N(RC)N(RD)-、-NCN-、-C(＝N(RC)(RD))O-、-S-、-S(O)x-、-OS(O)x-、-N(RC)S(O)x-、-S(O)xN(RC)-、-P(RF)y-、-Si(ORA)2-、-Si(RG)(ORA)-、-B(ORA)-、或金属，其中RA、RC、RD、RF、RG、x和y各自独立地如本文所述。在一些实施例中，附接基团包含胺、酮、酯、酰胺、烷基、烯基、炔基或硫醇。在一些实施例中，附接基团是交联剂。在一些实施例中，附接基团是-C(O)(C1-C6-亚烷基)-，其中亚烷基被R1取代，并且R1如本文所述。在一些实施例中，附接基团是-C(O)(C1-C6-亚烷基)-，其中亚烷基被1-2个烷基(例如1-2个甲基)取代。在一些实施例中，附接基团是-C(O)C(CH3)2-。在一些实施例中，附接基团是-C(O)(亚甲基)-，其中亚烷基被1-2个烷基(例如1-2个甲基)取代。在一些实施例中，附接基团是-C(O)CH(CH3)-。在一些实施例中，附接基团是-C(O)C(CH3)-。
FVII表达构建体
本披露提供了包含启动子的分离的多核苷酸，该启动子与编码人FVII前体蛋白或其变体(例如FVII融合蛋白)的核苷酸序列可操作地连接。在实施例中，该多核苷酸是双链多核苷酸。
在实施例中，相比与人FVII基因中的启动子可操作地连接的相同FVII编码序列，选择启动子以实现RPE细胞(例如，ARPE-19细胞)中FVII mRNA的更高表达。在实施例中，该启动子基本上由SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10基本上相同的核苷酸序列(例如，与SEQID NO:10至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同)组成，或由其组成。在实施例中，该启动子由SEQ ID NO:10组成。
在实施例中，该启动子基本上由SEQ ID NO:21或与SEQ ID NO:21基本上相同的核苷酸序列(例如，与SEQ ID NO:10至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同)组成，或由其组成。在实施例中，该启动子由SEQ ID NO:21组成。
在实施例中，该FVII前体蛋白包含来自野生型人FVII蛋白的氨基酸序列，例如SEQID NO:1或其保守取代的变体。在实施例中，该保守取代的变体具有不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个保守取代。在实施例中，该FVII前体蛋白由SEQ ID NO:1组成。
在实施例中，编码该前体FVII蛋白的核苷酸序列对于在哺乳动物细胞中FVII表达是密码子优化的。在实施例中，该密码子优化的序列是SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的核苷酸序列。在实施例中，该密码子优化的序列是SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的核苷酸序列。
在实施例中，该核苷酸序列编码FVII融合蛋白。在实施例中，该FVII融合蛋白包含前体人FVII的氨基酸序列或其可操作地连接到编码非FVII多肽的氨基酸序列的保守取代变体。非FVII多肽可以是赋予融合蛋白更长的半衰期或其他所希望的特性的任何蛋白质或蛋白质结构域，例如，白蛋白；IgG Fc；IgG轻链的恒定结构域；IgG重链的一个、两个或三个恒定结构域；纳米抗体；转铁蛋白；CTP(具有其4O-聚糖的人绒毛膜促性腺激素(hCG)的28氨基酸C端肽(CTP))；XTEN；同型氨基酸聚合物(HAP)；脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸(PAS)；或其任何组合。
在实施例中，FVII-白蛋白融合蛋白的白蛋白部分基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或者SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的保守取代变体。在实施例中，SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的保守取代变体具有不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个保守取代且在接头肽中无取代。在实施例中，该FVII融合蛋白包含氨基酸序列的以下组合之一：
i)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5(在本文中称为SEQ ID NO:11)或
ii)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7(在本文中称为SEQ ID NO:12)。
在实施例中，编码FVII融合蛋白的核苷酸序列包含FVII和白蛋白编码序列的以下组合之一：
i)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6(在本文中称为SEQ ID NO:13)；
ii)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8(在本文中称为SEQ ID NO:14)；
iii)SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6(在本文中称为SEQ ID NO:15)；
iv)SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:8(在本文中称为SEQ ID NO:16)；
v)SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6(在本文中称为SEQ ID NO:17)；以及
vi)SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:8(在本文中称为SEQ ID NO:18)。
在实施例中，该分离的多核苷酸包含转录单位，其进一步包含紧邻多肽编码序列中ATG起始密码子上游的Kozak翻译序列。在实施例中，该Kozak翻译序列基本上由SEQ IDNO:9(本文中称为SEQ ID NO:19)的核苷酸2094-2099、与SEQ ID NO:19基本上相同的(例如，与SEQ ID NO:19是至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的)核苷酸序列组成，或由其组成。在实施例中，该转录单位进一步包含聚A序列，该聚A序列基本上由SEQ ID NO:9(本文中称为SEQ ID NO:20)的核苷酸2163-2684或与SEQ ID NO:20基本上相同的(例如，与SEQ ID NO:20至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的)核苷酸序列组成，或由其组成。在实施例中，该分离的多核苷酸包含作为可操作地连接到SEQ ID NO:2、3、4、13、14、15、16、17或18中任一种的启动子的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:21。在实施例中，该分离的多核苷酸包含位于启动子和Kozak翻译序列之间的UTR序列。在实施例中，该UTR序列基本上由SEQ ID NO:22的核苷酸2094-2375组成或由其组成。在实施例中，该分离的多核苷酸包含插入在SEQ ID NO:9的核苷酸2100和2101之间的SEQ ID NO:2、3、4、13、14、15、16、17或18中任一种。在实施例中，该转录单位位于一对反向末端重复序列之间，例如，在5’ITR(例如，SEQID NO:9的核苷酸1至313)和3’ITR(例如，SEQ ID NO:9的核苷酸2894-3128)之间。在实施例中，该多核苷酸包含SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。
在实施例中，该分离的多核苷酸包含两个、三个或更多个转录单位。在实施例中，每个转录单位具有与相同或不同的FVII编码序列(其任选地与非FVII编码序列融合)可操作地连接的不同启动子。在实施例中，该多核苷酸包含两个转录单位，除了启动子之外是相同的。在实施例中，该多核苷酸包含两个转录单位，除了启动子和编码前体FVII蛋白的核苷酸序列之外是相同的。在实施例中，这些转录单位串联地位于末端反向重复序列对之间，例如5’ITR和3’ITR之间。
在实施例中，该分离的多核苷酸包含含有启动子和FVII编码序列的上游转录单位和含有启动子和FVII编码序列的下游转录单位的组合，其中该组合选自下组，该组由以下组成：
i)上游：可操作地连接到以下SEQ ID NO:2、3、4、13、14、15、16、17和18中任一种的SEQ ID NO:10
下游：可操作地连接到以下SEQ ID NO:2、3、4、13、14、15、16、17和18中任一种的SEQ ID NO:21；
ii)上游：可操作地连接到以下SEQ ID NO:2、3、4、13、14、15、16、17和18中任一种的SEQ ID NO:21
下游：可操作地连接到以下SEQ ID NO:2、3、4、13、14、15、16、17和18中任一种的SEQ ID NO:10；
iii)上游：可操作地连接到SEQ ID NO:2的SEQ ID NO:10；
下游：可操作地连接到SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:21；
iv)上游：可操作地连接到SEQ ID:3的SEQ ID NO:10；
下游：可操作地连接到SEQ ID NO:2的SEQ ID NO:21；
v)上游：可操作地连接到SEQ ID:2的SEQ ID NO:10；
下游：可操作地连接到SEQ ID NO:4的SEQ ID NO:21；
vi)上游：可操作地连接到SEQ ID:3的SEQ ID NO:10；
下游：可操作地连接到SEQ ID NO:2的SEQ ID NO:21；
vii)上游：可操作地连接到SEQ ID:3的SEQ ID NO:10；
下游：可操作地连接到SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:21。
在实施例中，该分离的多核苷酸包含(a)SEQ ID NO:25或(b)SEQ ID NO:22。
工程化的RPE细胞
以上所述的分离的多核苷酸可用于产生视网膜色素上皮(RPE)细胞或衍生自RPE细胞的细胞，将这些细胞工程化以表达和分泌FVII蛋白。在实施例中，工程化的(例如，重组)RPE细胞包含SEQ ID NO 2、3、4、13、14、15、16、17或18中的一种或多种。在实施例中，工程化的RPE细胞包含本文所述的转录单位，该转录单位可以存在于染色体外表达载体中或整合到细胞核中的一个或多个染色体位点中。在实施例中，该重组细胞包含两个、三个、四个或更多个拷贝的转录单位，这些拷贝串联地整合在细胞核中相同的基因组位点中。
本文所述的工程化的RPE细胞可以衍生自多种品系中的任何一种。RPE细胞的示例性品系包括ARPE-19细胞、ARPE-19-SEAP-2-neo细胞、RPE-J细胞和hTERT RPE-1细胞。在一些实施例中，该工程化的细胞衍生自ARPE-19(
Figure BDA0003279416310000351
CRL-2302TM)细胞系。在一些实施例中，该工程化的RPE(例如，ARPE-19)细胞由单克隆细胞系繁殖。
在实施例中，本文所述的工程化的细胞表达生物标志物，例如抗原，该生物标志物是RPE细胞(例如天然存在的RPE细胞)特有的。在一些实施例中，生物标志物(例如，抗原)是蛋白质。示例性的生物标志物包括CRALBP、RPE-65、RLBP、BEST1或αB-晶体蛋白。在实施例中，工程化的细胞表达CRALBP、RPE-65、RLBP、BEST1、或αB-晶体蛋白中的至少一种。在实施例中，工程化的细胞表达CRALBP和RPE-65中的至少一种。
用于在本文所述的装置、组合物和方法中使用的工程化的RPE细胞(例如，作为包含或包封在水凝胶胶囊中的多个工程化的细胞)可以处于细胞周期的不同阶段。在一些实施例中，多个工程化的细胞中的至少一种工程化的细胞正在进行细胞分裂。可以使用本领域已知的任何方法来测量细胞分裂，例如，如DeFazio A等人(1987)J Histochem Cytochem[组织化学与细胞化学杂志]35:571-577和Dolbeare F等人(1983)Proc Natl Acad SciUSA[美国国家科学院院刊]80:5573-5577，其中每一个通过引用以其全文并入本文。在实施例中，例如，正如通过5-乙炔基-2’脱氧尿苷(EdU)测定法或5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)测定法所测定的那样，至少1％、2％、3％、4％、5％、10％或20％的细胞正在进行细胞分裂。在一些实施例中，通过显微镜检查(例如，荧光显微镜检查(例如，纺锤体形成的延时或评价))或流式细胞术观察或定量细胞增殖。在一些实施例中，多个工程化的细胞中没有一种工程化的细胞正在进行细胞分裂而是静止的。在实施例中，通过5-乙炔基-2’脱氧尿苷(EdU)测定法、5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)测定法、显微镜检查(例如，荧光显微镜检查(例如，纺锤体形成的延时或评价)或流式细胞术测定，少于1％、2％、3％、4％、5％、10％或20％的细胞正在进行细胞分裂。
在实施例中，该多个工程化的RPE细胞中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、40％或80％是有活力的。可以使用本领域中已知的任何方法来测量细胞存活力，例如，如Riss,T.等人(2013)“Cell Viability Assays[细胞存活力测定]”在Assay GuidanceManual[测定指导手册](Sittapalam,G.S.等人编辑)中所述。例如，可以通过ATP测定法、5-乙炔基-2’脱氧尿苷(EdU)测定法、5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)测定法来测量或定量细胞存活力。在一些实施例中，通过显微镜检查(例如，荧光显微镜检查(例如，纺锤体形成的延时或评价))或流式细胞术观察或定量细胞存活力。在实施例中，该多个RPE细胞中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、40％或80％是有活力的，例如，正如通过ATP测定法、5-乙炔基-2’脱氧尿苷(EdU)测定法、5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)测定法、显微镜检查(例如，荧光显微镜检查(例如，纺锤体形成的延时或评价)或流式细胞术所测定的那样。
可以使用本领域技术人员已知的标准技术，诸如组织学方法、显微镜检查和各种功能测定法来评估本文所述的任何参数。
测量FVII活性
可以通过本领域已知的或在下文实例中描述的任何直接或间接的FVII活性测定来测量由本文所述的工程化的细胞或装置分泌的FVII的活性。
例如，可以通过以下方式来定量生物流体(例如血浆)样品中的FVII生物活性：(i)测量在包含嵌入脂质膜中的TF的系统中产生的因子Xa和因子X的量(Persson等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]272:19919-19924,1997)；(ii)测量含水体系中的因子X水解；(iii)使用基于表面等离子体共振的仪器测量其与组织因子(TF)的物理结合(Persson,FEBS Letts.[FEBS通讯]413:359-363,1997)；或(iv)测量合成基质的水解；和/或(v)在TF非依赖性体外系统中测量凝血酶的产生。在实施例中，通过市售的显色测定法(BIOPHENFVII,HYPHEN BioMed Neuville sur Oise,法国)评估FVII活性，其中含有FVII的生物样品与促凝血酶原激酶钙、因子X和SXa-11(因子Xa特异性的生色底物)混合。
装置
可以将本文所述的工程化的RPE细胞或多个此类细胞掺入可植入装置中，用于将FVII蛋白质提供给受试者，例如患有出血性障碍的患者(例如，具有针对FVIII或FIX替代疗法的抑制剂的血友病患者)、患有FVII缺乏症的患者。
示例性可植入装置包括诸如金属、金属合金、陶瓷、聚合物、纤维、惰性材料以及它们的组合的材料。该装置(例如，颗粒)可以具有适合于在植入到预期的目标位置之后支持包封的细胞的生存力和生产力的任何构造和形状。在一些实施例中，该装置是水凝胶胶囊，例如毫胶囊或微胶囊(例如，水凝胶毫胶囊或水凝胶微胶囊)。该装置(例如，胶囊，颗粒)可以包含(并且任选地配置为释放)工程化的RPE细胞不表达的一种或多种外源剂，并且可以包括例如核酸(例如，RNA或DNA分子)；蛋白质(例如激素、酶(例如，葡萄糖氧化酶、激酶、磷酸酶、加氧酶、氢化酶、还原酶)抗体、抗体片段、抗原或表位)；小分子；脂质；药物；疫苗或其任何衍生物；蛋白质或多肽的小分子、有活性或无活性片段。在一些实施例中，该装置包括至少一种用于减轻异物反应(FBR)的器件，例如，减轻当该装置被植入受试者体内或之上时的FBR。
可以作为用于植入或施用于受试者的制品或组合物提供本文所述的装置(即，装置制品或装置组合物)。在一些实施例中，装置制品或装置组合物包含至少2、4、8、16、32、64或更多个装置，并且制品或组合物中的至少20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的装置具有如本文所述的特征，例如平均胶囊直径或细胞容纳隔室中的细胞数量。
装置、装置制品或装置组合物可以被配置用于植入，或植入或设置在身体的任何位点或部位中或其之上。在一些实施例中，将可植入装置或装置制品配置为用于植入到腹膜腔(例如，小网膜囊，也称为网膜囊(omental bursa)或法氏囊网膜(bursalis omentum))中。可以经由注射或导管将装置、装置制品或装置组合物植入腹膜腔(例如，网膜，例如小网膜囊)中或者设置于腹膜腔内的表面(例如，网膜，例如小网膜囊)。将装置、装置制品或装置组合物植入或设置于网膜(例如小网膜囊)中的其他考虑因素提供于M.Pellicciaro等人.(2017)Cell[细胞]R4 5(3):e2410中。
在一些实施例中，该可植入装置包括至少一个细胞容纳隔室，该隔室包含被聚合物组合物包封的多个活细胞。在实施例中，该装置包含两个、三个、四个或更多个细胞容纳隔室。每个细胞容纳隔室包含多个活细胞，并且当将该装置植入受试者体内时，该隔室的至少一个中的细胞能够表达和分泌FVII蛋白。
在一些实施例中，在一个或多个细胞容纳隔室中的聚合物组合物包含多糖或其他形成水凝胶的聚合物(例如，藻酸盐、透明质酸盐、或软骨素)。在一些实施例中，该聚合物是藻酸盐，其是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)组成的多糖。在一些实施例中，该藻酸盐具有低分子量(例如，大约分子量为<75kD)并且G:M比率≥1.5；(ii)中等分子量藻酸盐，例如，具有的大约分子量为75-150kDa并且G:M比率≥1.5；(iii)高分子量藻酸盐，例如，具有的大约MW为150kDa-250kDa)并且G:M比率≥1.5；(iv)或这些藻酸盐中两种或更多种的共混物。
在一些实施例中，该一个或多个细胞容纳隔室进一步包含至少一种细胞结合物质(CBS)，例如细胞结合肽(CBP)或细胞结合多肽(CBPP)。在实施例中，该CBS包含经由接头(“CBP-聚合物”)共价附接到聚合物组合物中聚合物分子上的CBP。在实施例中，该CBP-聚合物中的聚合物是多糖(例如，藻酸盐)或其他形成水凝胶的聚合物。本文描述了用于在本披露装置中使用的多种细胞结合肽。在实施例中，该细胞结合肽长度为25个氨基酸或更少(例如，20、15、10或更少)并且包含用于细胞粘附分子(CAM)的配体的细胞结合序列。在实施例中，该细胞结合肽基本上由本文表1中所示的细胞结合序列组成。在实施例中，该细胞结合序列是RGD(SEQ ID NO:33)或RGDSP(SEQ ID NO:48)。在实施例中，该细胞结合肽的氨基端经由氨基酸接头共价附接到聚合物。在实施例中，该氨基酸接头基本上由一至三个甘氨酸残基组成。在实施例中，该细胞结合肽基本上由RGD(SEQ ID NO:33)或RGDSP(SEQ ID NO:48)组成，并且接头基本上由单个甘氨酸残基组成。
在实施例中，在该含细胞的隔室(例如，双隔室水凝胶胶囊的内隔室)中存在的每种CBP-聚合物具有的细胞结合肽密度(如通过如本文的实例中所述的燃烧分析测定的％氮)为至少0.05％、0.1％、0.2％、或0.3％但小于4％、3％、2％、或1％。在实施例中，如通过定量肽缀合测定(例如，本文所述的测定)所确定的，在细胞容纳隔室中接头-CBP的总密度为溶液中约0.1至约1.0微摩尔的CBP/g的CBP-聚合物(例如，用GRGD(SEQ ID NO:50)或GRGDSP(SEQ ID NO:49)共价修饰的MMW-藻酸盐)。在实施例中，该CBP是RGDSP(SEQ ID NO:48)，该接头是G，并且该聚合物是藻酸盐，分子量为75kDa至150kDa，并且G:M比率为高于或等于1.5。在实施例中，细胞容纳隔室还包含与CBP-聚合物中的聚合物相同或不同的、未经修饰的水凝胶形成聚合物。在实施例中，该CBP-聚合物中的聚合物和该未经修饰的聚合物是藻酸盐，分子量为75kDa至150kDa，并且G:M比率为高于或等于1.5。
在实施例中，定量肽缀合测定包括使CPB聚合物的样品经受酸水解以从缀合肽(和CBP-聚合物中的任何残留的未缀合肽)产生单个氨基酸，定量该单个氨基酸，取每种氨基酸的摩尔浓度的平均值，并计算样品中的总肽浓度。在实施例中，基本上与下文实例中描述的过程相似地进行定量肽缀合测定。在实施例中，该定量肽缀合测定还包括从总肽浓度中减去样品中任何残留的未缀合肽的浓度。可以使用本领域已知的任何合适的测定法，例如通过如下本所述的LC-MS，来确定CBP-聚合物组合物中的未缀合肽的浓度。典型地，定量肽缀合测定是在用于制备装置的CBP-聚合物的盐溶液的样品上进行的，但是也可以在CBP-聚合物的冻干样品上进行。
在一些实施例中，该装置还包括至少一种用于减轻异物反应(FBR)的器件，例如，减轻当该装置被植入受试者体内或之上时的FBR。本文描述了用于减轻这些装置的FBR的各种器件，但是与参比装置相比能够降低对所述装置的FBR的任何生物、化学或物理元素在本文中都被考虑。
例如，本披露的装置中用于减轻FBR的器件可以包括用半透性生物相容性膜环绕细胞，该膜的孔径经选择可允许氧气和其他对细胞存活并起重要作用的分子穿过该半透性膜，同时防止免疫细胞穿过孔。在实施例中，该半透性膜具有小于1000kD或在50-700kD、70-300kD之间或在70-150kD之间、或在70-130kD之间的分子量截留值。
另一种减轻FBR的器件包括用由无细胞生物相容性材料形成的屏障隔室环绕细胞容纳隔室，例如Ma,M等人,Adv.Healthc Mater.[医疗保健材料],2(5):667-672(2012)中描述的核-壳微胶囊。这种屏障隔室可以与半透性构件器件一起使用或不与之一起使用。减轻FBR的器件可包括在装置上或装置内放置从植入装置释放的抗炎药以抑制FBR，例如，如美国专利号9,867,781中所述。如WO 2017/176792和WO 2017/176804中所述，其他减轻FBR的器件采用CSF-1R抑制剂，其被设置在装置表面上或包封在装置内。如在Veiseh,O.等人,Nature Materials[自然材料]14:643-652(2015)中所述，其他FBR减轻器件采用将装置为直径大于1mm的球形的配置。在一些实施例中，用于减轻FBR的器件包括将去纤维化化合物设置在装置的外表面上和/或设置在环绕细胞容纳隔室的屏障隔室内。示例性去纤维化化合物包括下文所述的具有式(I)的化合物。在一些实施例中，该装置可以包括上述FBR减轻器件中的两个或更多个的组合。
在一些实施例中，装置具有两个水凝胶隔室，其中细胞容纳内隔室完全被第二外(例如，屏障)隔室环绕。在实施例中，该第二隔室的内边界与该第一隔室的外边界形成界面(例如，如图9说明的)。在此类实施例中，该第二(外)隔室的厚度表示该第二隔室的外边界与两个隔室之间的界面之间的平均距离。在一些实施例中，外隔室的厚度大于约10纳米(nm)，优选100nm或更大并且可以大至1毫米(mm)。例如，本文所述的水凝胶胶囊装置中的外隔室的厚度可以是10nm至1mm、100nm至1mm、500nm至1毫米、1微米(μm)至1mm、1μm至1mm、1μm至500μm、1μm至250μm、1μm至1mm、5μm至500μm、5μm至250μm、10μm至1mm、10μm至500μm、或10μm至250μm。在一些实施例中，外隔室的厚度为100nm至1mm、在1μm和1mm之间、在1μm和500μm之间、或在5μm和1mm之间。在一些实施例中，外隔室的厚度是在约50μm和约100μm之间。
在一些实施例中，装置中的一个或多个隔室包含去纤维化聚合物，例如共价附接到与CBP-聚合物中的聚合物相同或不同的聚合物的具有式(I)的去纤维化化合物。在实施例中，该去纤维化聚合物中的一些或所有单体用相同的具有式(I)的化合物修饰。在一些实施例中，去纤维化聚合物中的一些或所有单体用不同的具有式(I)的化合物修饰。在其中装置是两隔室水凝胶胶囊的一些实施例中，去纤维化聚合物仅存在于外屏障隔室(包括其外表面)中。
装置中的一个或多个隔室可以包含未经修饰的聚合物，该聚合物与CBP-聚合物中以及该装置中存在的任何去纤维化聚合物中的聚合物相同或不同。在实施例中，该装置中的第一隔室、第二隔室或所有隔室都包含未经修饰的聚合物。在一些实施例中，该未经修饰的聚合物是未经修饰的藻酸盐。在实施例中，该未经修饰的藻酸盐具有的分子量为150kDa-250kDa，并且G:M比率为≥1.5。
在一些实施例中，去纤维化聚合物包含用具有式(I)的化合物化学修饰的藻酸盐。去纤维化聚合物中的藻酸盐可以与本装置中存在的任何未经修饰的藻酸盐相同或不同。在一些实施例中，如以下实例中所述，如通过针对氮百分比的燃烧分析所测定的，将具有式(I)的化合物(例如，表3中的化合物101)按缀合密度至少2.0％和小于9.0％氮、或2.0％至5％氮、3.0％至8.0％氮、5％至8.0％氮、4.0％至7.0％氮、5.0％至7.0％氮、或约6.0％至约7.0％氮、或约6.8％氮共价附接到藻酸盐(例如，具有大约MW<75kDa，G:M比率≥1.5的藻酸盐)。在实施例中，化合物101产生约0.5％至2％2％至4％N、约4％至6％N、约6％至8％或约8％至10％N的％N增加(与未经修饰的藻酸盐相比)，其中％N通过燃烧分析确定并且对应于经修饰的藻酸盐中的化合物101的量。
在其他实施例中，去纤维化藻酸盐中具有式(I)的化合物(例如，化合物101)的密度(例如，浓度)定义为％w/w，例如胺的重量/溶液中去纤维化藻酸盐的重量的％，如通过合适的定量胺缀合测定(例如通过本文所述的测定)所确定的，并且在某些实施例中，具有式(I)的化合物(例如，化合物101)的密度在约1.0％w/w和约3.0％w/w之间、在约1.3％w/w和约2.5％w/w之间或在约1.5％w/w和2.2％w/w之间。在实施例中，该定量胺缀合测定包括使经化学修饰的聚合物(例如，用具有式(I)的化合物，例如CM-LMW-Alg-101修饰的藻酸盐)的样品进行酸水解以生成游离胺并定量样品中的总游离胺。在实施例中，该定量胺缀合测定还包括从总胺浓度中减去未水解样品中未缀合胺(例如，具有式(I)的化合物)的浓度。典型地，定量胺缀合测定是在用于制备装置的经化学修饰的藻酸盐的盐溶液的样品上进行的，但是也可以在经化学修饰的藻酸盐的冻干样品上进行。在实施例中，基本上与本文实例9中描述的过程相似地进行定量胺缀合测定。在实施例中，该具有式(I)的化合物是表3中所示的化合物101。
可以使用本领域已知的任何合适的方法用具有式(I)的化合物对去纤维化聚合物中的藻酸盐进行化学修饰。例如，可以活化藻酸盐羧酸部分以与一个或多个胺官能化化合物偶联，以获得用具有式(I)的化合物修饰的藻酸盐。可以将藻酸盐聚合物溶解在水(30mL/g聚合物)中并用2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(0.5当量)和N-甲基吗啉(1当量)处理。可向此混合物中添加具有式(I)的化合物于乙腈(0.3M)中的溶液。将反应温热至55℃保持16h，然后冷却至室温并且经由旋转蒸发轻轻浓缩，然后可将残余物溶于例如水中。然后可以将混合物过滤，例如通过氰基修饰的硅胶床(Silicycle)过滤，并且将滤饼用水洗涤。然后可将所得溶液用水进行透析(10,000MWCO膜)24小时，例如，水被更换两次。可以例如经由冷冻干燥浓缩所得溶液，得到所希望的经化学修饰的藻酸盐。
具有式(I)的化合物
在一些实施例中，本文所述的装置包含具有式(I)的化合物：
Figure BDA0003279416310000421
或者其药学上可接受的盐，其中：
A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-O-、-C(O)O-、-C(O)-、-OC(O)-、-N(RC)-、-N(RC)C(O)-、-C(O)N(RC)-、-N(RC)C(O)(C1-C6-亚烷基)-、-N(RC)C(O)(C1-C6-亚烯基)-、-N(RC)N(RD)-、-NCN-、-C(＝N(RC)(RD))O-、-S-、-S(O)x-、-OS(O)x-、-N(RC)S(O)x-、-S(O)xN(RC)-、-P(RF)y-、-Si(ORA)2-、-Si(RG)(ORA)-、-B(ORA)-、或金属，其各自任选地连接至附接基团(例如，本文所述的附接基团)，并且任选地被一个或多个R1取代；
L1和L3各自独立地是键、烷基或杂烷基，其中每个烷基和杂烷基任选被一个或多个R2取代；
L2是键；
M是不存在、烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自任选地被一个或多个R3取代；
P是不存在、环烷基、杂环基、或杂芳基，其各自任选地被一个或多个R4取代；
Z是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、-ORA、-C(O)RA、-C(O)ORA、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、和杂芳基任选地被一个或多个R5取代；
每个RA、RB、RC、RD、RE、RF和RG独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、叠氮基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、和杂芳基任选地被一个或多个R6取代；
或RC和RD与它们所附接的氮原子一起形成任选地被一个或多个R6取代的环(例如5-7元环)；
每个R1、R2、R3、R4、R5、和R6独立地是烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、氰基、叠氮基、氧代、-ORA1、-C(O)ORA1、-C(O)RB1、-OC(O)RB1、-N(RC1)(RD1)、-N(RC1)C(O)RB1、-C(O)N(RC1)、SRE1、S(O)xRE1、-OS(O)xRE1、-N(RC1)S(O)xRE1、-S(O)xN(RC1)(RD1)、-P(RF1)y、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、和杂芳基任选地被一个或多个R7取代；
每个RA1、RB1、RC1、RD1、RE1和RF1独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基任选地被一个或多个R7取代；
每个R7独立地是烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、氰基、氧代、羟基、环烷基、或杂环基；
x是1或2；并且
y是2、3或4。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-a)的化合物：
Figure BDA0003279416310000441
或者其药学上可接受的盐，其中：
A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-O-、-C(O)O-、-C(O)-、-OC(O)-、-N(RC)-、-N(RC)C(O)-、-C(O)N(RC)-、-N(RC)N(RD)-、-NCN-、-N(RC)C(O)(C1-C6-亚烷基)-、-N(RC)C(O)(C1-C6-亚烯基)-、-C(＝N(RC)(RD))O-、-S-、-S(O)x-、-OS(O)x-、-N(RC)S(O)x-、-S(O)xN(RC)-、-P(RF)y-、-Si(ORA)2-、-Si(RG)(ORA)-、-B(ORA)-、或金属，其各自任选地连接至附接基团(例如，本文所述的附接基团)，并且任选地被一个或多个R1取代；
L1和L3各自独立地是键、烷基或杂烷基，其中每个烷基和杂烷基任选被一个或多个R2取代；
L2是键；
M是不存在、烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自任选地被一个或多个R3取代；
P是任选被一个或多个R4取代的杂芳基；
Z是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基、其各自任选地被一个或多个R5取代；
每个RA、RB、RC、RD、RE、RF和RG独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、叠氮基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、和杂芳基任选地被一个或多个R6取代；
或RC和RD与它们所附接的氮原子一起形成任选地被一个或多个R6取代的环(例如5-7元环)；
每个R1、R2、R3、R4、R5、和R6独立地是烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、氰基、叠氮基、氧代、-ORA1、-C(O)ORA1、-C(O)RB1、-OC(O)RB1、-N(RC1)(RD1)、-N(RC1)C(O)RB1、-C(O)N(RC1)、SRE1、S(O)xRE1、-OS(O)xRE1、-N(RC1)S(O)xRE1、-S(O)xN(RC1)(RD1)、-P(RF1)y、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、和杂芳基任选地被一个或多个R7取代；
每个RA1、RB1、RC1、RD1、RE1和RF1独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基任选地被一个或多个R7取代；
每个R7独立地是烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、氰基、氧代、羟基、环烷基、或杂环基；
x是1或2；并且
y是2、3或4。
在一些实施例中，对于式(I)或(I-a)，A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-O-、-C(O)O-、-C(O)-、-OC(O)-、-N(RC)C(O)-、-N(RC)C(O)(C1-C6-亚烷基)-、-N(RC)C(O)(C1-C6-亚烯基)-、或-N(RC)-。在一些实施例中，A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-O-、-C(O)O-、-C(O)-、-OC(O)-、或-N(RC)-。在一些实施例中，A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、-O-、-C(O)O-、-C(O)-、-OC(O)-、或-N(RC)-。在一些实施例中，A是烷基、-O-、-C(O)O-、-C(O)-、-OC(O)、或-N(RC)-。在一些实施例中，A是-N(RC)C(O)-、-N(RC)C(O)(C1-C6-亚烷基)-、或-N(RC)C(O)(C1-C6-亚烯基)-。在一些实施例中，A是-N(RC)-。在一些实施例中，A是-N(RC)-，并且RC和RD独立地是氢或烷基。在一些实施例中，A是-NH-。在一些实施例中，A是-N(RC)C(O)(C1-C6-亚烷基)-、其中亚烷基被R1取代。在一些实施例中，A是-N(RC)C(O)(C1-C6-亚烷基)-、并且R1是烷基(例如甲基)。在一些实施例中，A是-NHC(O)C(CH3)2-。在一些实施例中，A是-N(RC)C(O)(亚甲基)-，并且R1是烷基(例如甲基)。在一些实施例中，A是-NHC(O)CH(CH3)-。在一些实施例中，A是-NHC(O)C(CH3)-。
在一些实施例中，对于式(I)或(I-a)，L1是键、烷基、或杂烷基。在一些实施例中，L1是键或烷基。在一些实施例中，L1是键。在一些实施例中，L1是烷基。在一些实施例中，L1是C1-C6烷基。在一些实施例中，L1是-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2CH2CH2、或-CH2CH2-。在一些实施例中，L1是-CH2-或-CH2CH2-。
在一些实施例中，对于式(I)或(I-a)，L3是键、烷基、或杂烷基。在一些实施例中，L3是键。在一些实施例中，L3是烷基。在一些实施例中，L3是C1-C12烷基。在一些实施例中，L3是C1-C6烷基。在一些实施例中，L3是-CH2-。在一些实施例中，L3是杂烷基。在一些实施例中，L3是任选地被一个或多个R2取代(例如氧代)的C1-C12杂烷基。在一些实施例中，L3是任选地被一个或多个R2取代(例如氧代)的C1-C6杂烷基。在一些实施例中，L3是-C(O)OCH2-、-CH2(OCH2CH2)2-、-CH2(OCH2CH2)3-、CH2CH2O-或-CH2O-。在一些实施例中，L3是-CH2O-。
在一些实施例中，对于式(I)或(I-a)，M是不存在、烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基。在一些实施例中，M是杂烷基、芳基、或杂芳基。在一些实施例中，M是不存在。在一些实施例中，M是烷基(例如C1-C6烷基)。在一些实施例中，M是-CH2-。在一些实施例中，M是杂烷基(例如C1-C6杂烷基)。在一些实施例中，M是(-OCH2CH2-)z，其中z是选自从1至10的整数。在一些实施例中，z是选自从1至5的整数。在一些实施例中，M是-OCH2CH2-、(-OCH2CH2-)2、(-OCH2CH2-)3、(-OCH2CH2-)4、或(-OCH2CH2-)5。在一些实施例中，M是-OCH2CH2-、(-OCH2CH2-)2、(-OCH2CH2-)3或(-OCH2CH2-)4。在一些实施例中，M是(-OCH2CH2-)3。在一些实施例中，M是芳基。在一些实施例中，M是苯基。在一些实施例中，M是未取代的苯基。在一些实施例中，M是
Figure BDA0003279416310000461
在一些实施例中，M是被R7(例如，1个R7)取代的苯基。在一些实施例中，M是
Figure BDA0003279416310000462
在一些实施例中，R7是CF3。
在一些实施例中，对于式(I)或(I-a)，P是不存在、杂环基、或杂芳基。在一些实施例中，P是不存在。在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，P是三环的、二环的或单环的杂芳基。在一些实施例中，P是单环的杂芳基。在一些实施例中，P是含氮杂芳基。在一些实施例中，P是单环的含氮杂芳基。在一些实施例中，P是5元杂芳基。在一些实施例中，P是5元含氮杂芳基。在一些实施例中，P是四唑基、咪唑基、吡唑基或三唑基、吡咯基、噁唑基或噻唑基。在一些实施例中，P是四唑基、咪唑基、吡唑基或三唑基，或吡咯基。在一些实施例中，P是咪唑基。在一些实施例中，P是
Figure BDA0003279416310000463
在一些实施例中，P是三唑基。在一些实施例中，P是1,2,3-三唑基。在一些实施例中，P是
Figure BDA0003279416310000464
在一些实施例中，P是杂环基。在一些实施例中，P是5元杂环基或6元杂环基。在一些实施例中，P是咪唑啉酮。在一些实施例中，P是
Figure BDA0003279416310000471
在一些实施例中，P是硫代吗啉基-1,1-二氧化物。
在一些实施例中，P是
Figure BDA0003279416310000472
在一些实施例中，对于式(I)或(I-a)，Z是烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基。在一些实施例中，Z是杂环基。在一些实施例中，Z为单环或双环杂环基。在一些实施例中，Z是含氧杂环基。在一些实施例中，Z是4元杂环基，5元杂环基或6元杂环基。在一些实施例中，Z是6元杂环基。在一些实施例中，Z是6元含氧杂环基。在一些实施例中，Z是四氢吡喃基。在一些实施例中，Z是
Figure BDA0003279416310000473
在一些实施例中，Z是4元含氧杂环基。在一些实施例中，Z是
Figure BDA0003279416310000474
在一些实施例中，Z是二环含氧杂环基。在一些实施例中，Z是邻苯二甲酸酐。在一些实施例中，Z是含硫杂环基。在一些实施例中，Z是6元含硫杂环基。在一些实施例中，Z是含氮原子和硫原子的6元杂环基。在一些实施例中，Z是硫代吗啉基-1,1-二氧化物。在一些实施例中，Z是
Figure BDA0003279416310000475
在一些实施例中，Z是含氮杂环基。在一些实施例中，Z是6元含氮杂环基。
在一些实施例中，Z是
Figure BDA0003279416310000476
在一些实施例中，Z是二环杂环基。在一些实施例中，Z是任选地被一个或多个R5取代的二环含氮杂环基。在一些实施例中，Z是2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬基。在一些实施例中，Z是
Figure BDA0003279416310000477
在一些实施例中，Z是1-氧杂-3,8-二氮杂螺[4.5]癸-2-酮。在一些实施例中，Z是
Figure BDA0003279416310000481
在一些实施例中，对于式(I)或(I-a)，Z是芳基。在一些实施例中，Z是单环芳基。在一些实施例中，Z是苯基。在一些实施例中，Z是单取代的苯基(例如，被1个R5取代)。在一些实施例中，Z是单取代的苯基，其中1个R5是含氮基团。在一些实施例中，Z是单取代的苯基，其中1个R5是NH2。在一些实施例中，Z是单取代的苯基，其中1个R5是含氧基团。在一些实施例中，Z是单取代的苯基，其中1个R5是含氧杂烷基。在一些实施例中，Z是单取代的苯基，其中1个R5是OCH3。在一些实施例中，Z是单取代的苯基，其中1个R5在邻位。在一些实施例中，Z是单取代的苯基，其中1个R5在间位。在一些实施例中，Z是单取代的苯基，其中1个R5在对位。
在一些实施例中，对于式(I)或(I-a)，Z是烷基。在一些实施例中，Z是C1-C12烷基。在一些实施例中，Z是C1-C10烷基。在一些实施例中，Z是C1-C8烷基。在一些实施例中，Z是被1-5个R5取代的C1-C8烷基。在一些实施例中，Z是被1个R5取代的C1-C8烷基。在一些实施例中，Z是被1个R5取代的C1-C8烷基，其中R5是烷基、杂烷基、卤素、氧代、-ORA1、-C(O)ORA1、-C(O)RB1、-OC(O)RB1或-N(RC1)(RD1)。在一些实施例中，Z是被1个R5取代的C1-C8烷基，其中R5是-ORA1或-C(O)ORA1。在一些实施例中，Z是被1个R5取代的C1-C8烷基，其中R5是-ORA1或-C(O)OH。在一些实施例中，Z是-CH3。
在一些实施例中，对于式(I)或(I-a)，Z是杂烷基。在一些实施例中，Z是C1-C12杂烷基。在一些实施例中，Z是C1-C10杂烷基。在一些实施例中，Z是C1-C8杂烷基。在一些实施例中，Z是C1-C6杂烷基。在一些实施例中，Z是任选地被一个或多个R5取代的含氮杂烷基。在一些实施例中，Z是被1-5个R5取代的含氮和含硫杂烷基。在一些实施例中，Z是N-甲基-2-(甲基磺酰基)乙-1-胺基。
在一些实施例中，Z是-ORA或-C(O)ORA。在一些实施例中，Z是-ORA(例如-OH或-OCH3)。在一些实施例中，Z是-OCH3。在一些实施例中，Z是-C(O)ORA(例如，-C(O)OH)。
在一些实施例中，Z是氢。
在一些实施例中，L2是键且P和L3独立地不存在。在一些实施例中，L2是键，P是杂芳基，L3是键，Z是氢。在一些实施例中，P是杂芳基，L3是杂烷基，并且Z是烷基。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-b)的化合物：
Figure BDA0003279416310000491
或其盐，其中环M1是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自任选被1-5个R3取代；环Z1是任选被1-5个R5取代的环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；R2a、R2b、R2c和R2d各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤基、氰基、硝基、氨基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，或者R2a和R2b或R2c和R2d的每一个一起形成氧代基团；X是不存在、N(R10)(R11)、O或S；RC是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基各自任选被1-6个R6取代；每个R3、R5、和R6独立地是烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、氰基、叠氮基、氧代、-ORA1、-C(O)ORA1、-C(O)RB1、-OC(O)RB1、-N(RC1)(RD1)、-N(RC1)C(O)RB1、-C(O)N(RC1)、SRE1、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基；R10和R11各自独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、-C(O)ORA1、-C(O)RB1、-OC(O)RB1、-C(O)N(RC1)、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基；每个RA1、RB1、RC1、RD1和RE1独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基各自任选地被1-6个R7取代；每个R7独立地是烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、氰基、氧代、羟基、环烷基、或杂环基；每个m和n独立地为1、2、3、4、5或6；并且
Figure BDA0003279416310000492
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。在一些实施例中，对于每个R3和R5，每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选地且独立地被卤素、氧代、氰基、环烷基或杂环基取代。
在一些实施例中，具有式(I-b)的化合物是具有式(I-b-i)的化合物：
Figure BDA0003279416310000501
或其药学上可接受的盐，其中环M2是任选地被一个或多个R3取代的芳基或杂芳基；环Z2是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；R2a、R2b、R2c和R2d各自独立地是氢、烷基或杂烷基，或者R2a和R2b或R2c和R2d各自一起形成氧代基团；Z是不存在、O或S；每个R3和R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、-ORA1、-C(O)ORA1或-C(O)RB1，其中每个烷基和杂烷基任选地被卤素取代；或两个R5一起形成与环Z2稠合的5-6元环；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基、或杂烷基；m和n各自独立地是1、2、3、4、5或6；p是0、1、2、3、4、5、或6；并且
Figure BDA0003279416310000502
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，具有式(I-b-i)的化合物是具有式(I-b-ii)的化合物：
Figure BDA0003279416310000503
或其药学上可接受的盐，其中环Z2是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；R2c和R2d各自独立地是氢、烷基或杂烷基，或者R2c和R2d一起形成氧代基团；每个R3和R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、-ORA1、-C(O)ORA1或-C(O)RB1，其中每个烷基和杂烷基任选地被卤素取代；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基、或杂烷基；p和q各自独立地是0、1、2、3、4、5或6；并且
Figure BDA0003279416310000504
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-c)的化合物：
Figure BDA0003279416310000505
或其药学上可接受的盐，其中环Z2是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；R2c和R2d各自独立地是氢、烷基或杂烷基，或者R2c和R2d一起形成氧代基团；每个R3和R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、-ORA1、-C(O)ORA1或-C(O)RB1，其中每个烷基和杂烷基任选地被卤素取代；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基、或杂烷基；m是1、2、3、4、5或6；p和q各自独立地是0、1、2、3、4、5或6；并且
Figure BDA0003279416310000516
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-d)的化合物：
Figure BDA0003279416310000511
或其药学上可接受的盐，其中环Z2是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；Z是不存在、O或S；R2a、R2b、R2c和R2d各自独立地是氢、烷基或杂烷基，或者R2a和R2b或R2c和R2d各自一起形成氧代基团；每个R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、-ORA1、-C(O)ORA1或-C(O)RB1，其中每个烷基和杂烷基任选地被卤素取代；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基、或杂烷基；m和n各自独立地是1、2、3、4、5或6；p是0、1、2、3、4、5、或6；并且
Figure BDA0003279416310000512
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-e)的化合物：
Figure BDA0003279416310000513
或其药学上可接受的盐，其中环Z2是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；Z是不存在、O或S；R2a、R2b、R2c和R2d各自独立地是氢、烷基或杂烷基，或者R2a和R2b或R2c和R2d各自一起形成氧代基团；每个R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、-ORA1、-C(O)ORA1、或-C(O)RB1；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基、或杂烷基；m和n各自独立地是1、2、3、4、5或6；p是0、1、2、3、4、5、或6；并且
Figure BDA0003279416310000514
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-f)的化合物：
Figure BDA0003279416310000515
或其药学上可接受的盐，其中M是任选地被一个或多个R3取代的烷基；环P是任选被一个或多个R4取代的杂芳基；L3是任选地被一个或多个R2取代的烷基或杂烷基；Z是烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基、其各自任选地被一个或多个R5取代；R2a和R2b各自独立地是氢、烷基或杂烷基，或者R2a和R2b一起形成氧代基团；每个R2、R3、R4和R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、-ORA1、-C(O)ORA1、或-C(O)RB1；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基、或杂烷基；n独立地是1、2、3、4、5或6；并且
Figure BDA0003279416310000521
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(II)的化合物：
Figure BDA0003279416310000522
或其药学上可接受的盐，其中M是键、烷基或芳基，其中烷基和芳基任选地被一个或多个R3取代；L3是任选地被一个或多个R2取代的烷基或杂烷基；Z是氢、烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或-ORA，其中烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个R5取代；RA是氢；R2a和R2b各自独立地是氢、烷基或杂烷基，或者R2a和R2b一起形成氧代基团；每个R2、R3和R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、-ORA1、-C(O)ORA1、或-C(O)RB1；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基、或杂烷基；n独立地是1、2、3、4、5或6；并且
Figure BDA0003279416310000523
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，具有式(II)的化合物是具有式(II-a)的化合物：
Figure BDA0003279416310000524
或其药学上可接受的盐，其中L3是烷基或杂烷基，其各自任选地被一个或多个R2取代；Z是氢、烷基、杂烷基或-ORA，其中烷基和杂烷基任选地被一个或多个R5取代；R2a和R2b各自独立地是氢、烷基或杂烷基，或者R2a和R2b一起形成氧代基团；每个R2、R3、和R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、-ORA1、-C(O)ORA1、或-C(O)RB1；RA是氢；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基、或杂烷基；n独立地是1、2、3、4、5或6；并且
Figure BDA0003279416310000525
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(III)的化合物：
Figure BDA0003279416310000531
或其药学上可接受的盐，其中Z1是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自任选被1-5个R5取代；R2a、R2b、R2c和R2d各自独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤基、氰基、硝基、氨基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基；或R2a和R2b或R2c和R2d一起形成氧代基团；RC是氢、烷基、烯基、炔基或杂烷基，其中烷基、烯基、炔基或杂烷基各自任选地被1-6个R6取代；每个R3、R5、和R6独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、-ORA1、-C(O)ORA1、或-C(O)RB1；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基、或杂烷基；m和n各自独立地是1、2、3、4、5或6；q是从0至25的整数；并且
Figure BDA0003279416310000532
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，具有式(III)的化合物是具有式(III-a)的化合物：
Figure BDA0003279416310000533
或其药学上可接受的盐，其中环Z2是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自任选地被1-5个R5取代；R2a、R2b、R2c和R2d各自独立地是氢、烷基、杂烷基、卤基；或R2a和R2b或R2c和R2d一起形成氧代基团；R3和R5各自独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、-ORA1、-C(O)ORA1、或-C(O)RB1；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基、或杂烷基；m和n各自独立地是1、2、3、4、5或6；o和p各自独立地是0、1、2、3、4或5；q是从0至25的整数；并且
Figure BDA0003279416310000534
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，具有式(III-a)的化合物是具有式(III-b)的化合物：
Figure BDA0003279416310000541
或其药学上可接受的盐，其中环Z2是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自任选地被1-5个R5取代；R2a、R2b、R2c和R2d各自独立地是氢、烷基、杂烷基、卤基；或R2a和R2b或R2c和R2d一起形成氧代基团；R3和R5各自独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、-ORA1、-C(O)ORA1、或-C(O)RB1；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基、或杂烷基；m和n各自独立地是1、2、3、4、5或6；o和p各自独立地是0、1、2、3、4或5；q是从0至25的整数；并且
Figure BDA0003279416310000542
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，具有式(III-a)的化合物是具有式(III-c)的化合物：
Figure BDA0003279416310000543
或其药学上可接受的盐，其中X是C(R’)(R”)、N(R’)、或S(O)x；R’和R”中的每个独立地是氢、烷基、卤素、或环烷基；R2a、R2b、R2c和R2d各自独立地是氢、烷基、杂烷基、或卤基；或R2a和R2b或R2c和R2d一起形成氧代基团；R3和R5各自独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、-ORA1、-C(O)ORA1、或-C(O)RB1；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基、或杂烷基；m和n各自独立地是1、2、3、4、5或6；p是0、1、2、3、4、或5；q是从0至25的整数；x是0、1或2；并且
Figure BDA0003279416310000544
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，具有式(III-c)的化合物是具有式(III-d)的化合物：
Figure BDA0003279416310000545
或其药学上可接受的盐，其中X是C(R’)(R”)、N(R’)、或S(O)x；R’和R”中的每个独立地是氢、烷基、卤素、或环烷基；R2a、R2b、R2c和R2d各自独立地是氢、烷基、杂烷基、或卤基；或R2a和R2b或R2c和R2d一起形成氧代基团；R3和R5各自独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、-ORA1、-C(O)ORA1、或-C(O)RB1；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基、或杂烷基；m和n各自独立地是1、2、3、4、5或6；p是0、1、2、3、4、或5；q是从0至25的整数；x是0、1或2；并且
Figure BDA0003279416310000551
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，该化合物是具有式(I)的化合物。在一些实施例中，L2是键且P和L3独立地不存在。
在一些实施例中，该化合物是具有式(I-a)的化合物。在式(II-a)的一些实施例中，L2是键，P是杂芳基，L3是键，Z是氢。在一些实施例中，P是杂芳基，L3是杂烷基，并且Z是烷基。在一些实施例中，L2是键且P和L3独立地不存在。在一些实施例中，L2是键，P是杂芳基，L3是键，Z是氢。在一些实施例中，P是杂芳基，L3是杂烷基，并且Z是烷基。
在一些实施例中，该化合物是具有式(I-b)的化合物。在一些实施例中，P不存在，L1是-NHCH2，L2是键，M是芳基(例如，苯基)，L3是-CH2O，并且Z是杂环基(例如，含氮杂环基，例如硫代吗啉基-1,1-二氧化物)。在一些实施例中，具有式(I-b)的化合物是化合物116。
在式(I-b)的一些实施例中，P不存在，L1是-NHCH2，L2是键，M不存在，L3是键，并且Z是杂环基(例如，含氧杂环基，例如四氢吡喃基、四氢呋喃基、氧杂环丁烷或环氧乙烷基)。在一些实施例中，具有式(I-b)的化合物是化合物105。
在一些实施例中，该化合物是具有式(I-b-i)的化合物。在式(I-b-i)的一些实施例中，R2a和R2b各自独立地是氢或CH3，R2c和R2d各自独立地是氢，m是1或2，n是1，X是O，p是0，M2是任选地被一个或多个R3取代的苯基，R3是-CF3，并且Z2是杂环基(例如，含氧杂环基，例如四氢吡喃基、四氢呋喃基、氧杂环丁烷基或环氧乙烷基)。在一些实施例中，具有式(I-b-i)的化合物是化合物100、化合物106、化合物107、化合物108、化合物109或化合物111。
在一些实施例中，该化合物是具有式(I-b-ii)的化合物。在式(I-b-ii)的一些实施例中，R2a、R2b、R2c和R2d各自独立地是氢，q是0，p是0，m是1，并且Z2是杂环基(例如，含氧杂环基，例如，四氢吡喃基)。在一些实施例中，具有式(I-b-ii)的化合物是化合物100。
在一些实施例中，该化合物是具有式(I-c)的化合物。在式(I-c)的一些实施例中，R2c和R2d各自独立地是氢，m是1，p是1，q是0，R5是-CH3，并且Z是杂环基(例如，含氮杂环基，例如哌嗪基)。在一些实施例中，具有式(I-c)的化合物是化合物113。
在一些实施例中，该化合物是具有式(I-d)的化合物。在式(I-d)的一些实施例中，R2a、R2b、R2c、和R2d中的每一个独立地是氢，m是1，n是3，X是O，p是0，并且Z是杂环基(例如，含氧杂环基，例如，四氢吡喃基、四氢呋喃基、氧杂环丁烷基或环氧乙烷基)。在一些实施例中，具有式(I-d)的化合物是化合物110或化合物114。
在一些实施例中，该化合物是具有式(I-f)的化合物。在式(I-f)的一些实施例中，R2a和R2b各自独立地是氢，n是1，M是-CH2-，P是含氮杂芳基(例如，咪唑基)，L3是-C(O)OCH2-，并且Z是CH3。在一些实施例中，具有式(I-f)的化合物是化合物115。
在一些实施例中，该化合物是具有式(II-a)的化合物。在式(II-a)的一些实施例中，R2a和R2b各自独立地是氢，n是1，q是0，L3是-CH2(OCH2CH2)2，并且Z是-OCH3。在一些实施例中，具有式(II-a)的化合物是化合物112。
在式(II-a)的一些实施例中，R2a和R2b各自独立地是氢，n是1，L3是键或-CH2并且Z是氢或-OH。在一些实施例中，具有式(II-a)的化合物是化合物103或化合物104。
在一些实施例中，该化合物是具有式(III)的化合物。在式(III)的一些实施例中，R2a、R2b、R2c和R2d各自独立地是氢，m是1，n是2，q是3，p是0，RC是氢，并且Z1是任选地被R5(例如，-N(CH3)(CH2CH2)S(O)2CH3)取代的杂烷基。在一些实施例中，具有式(III)的化合物是化合物120。
在一些实施例中，该化合物是具有式(III-b)的化合物。在式(III-b)的一些实施例中，R2a、R2b、R2c和R2d各自独立地是氢，m是0，n是2，q是3，p是0，并且Z2是被1个R5(例如-NH2)取代的芳基(例如，苯基)。在一些实施例中，具有式(III-b)的化合物是化合物102。
在一些实施例中，该化合物是具有式(III-b)的化合物。在式(III-b)的一些实施例中，R2a、R2b、R2c和R2d各自独立地是氢，m是1，n是2，q是3，p是0，RC是氢，并且Z2是杂环基(例如，含氮杂环基，例如含氮螺杂环基，例如2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬基)。在一些实施例中，式(III-a)的化合物是化合物121。
在一些实施例中，该化合物是具有式(III-d)的化合物。在式(III-d)的一些实施例中，R2a、R2b、R2c和R2d各自独立地是氢，m是1，n是2，q是1、2、3或4，p是0，并且X是S(O)2。在式(III-d)的一些实施例中，R2a和R2b各自独立地是氢，m是1，n是2，q是1、2、3或4，p是0，并且X是S(O)2。在一些实施例中，具有式(III-d)的化合物是化合物101、化合物117、化合物118或化合物119。
在一些实施例中，该化合物是具有式(I-b)、(I-d)、或(I-e)的化合物。在一些实施例中，该化合物是具有式(I-b)、(I-d)、或(II)的化合物。在一些实施例中，该化合物是具有式(I-b)、(I-d)、或(I-f)的化合物。在一些实施例中，该化合物是具有式(I-b)、(I-d)、或(III)的化合物。
在一些实施例中，具有式(I)化合物不是WO 2012/112982、WO 2012/167223、WO2014/153126、WO 2016/019391、WO 2017/075630、US 2012-0213708、US 2016-0030359或US2016-0030360中披露的化合物。
在一些实施例中，具有式(I)化合物包含表3中所示的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，本文所述的装置的外表面和/或其内的一个或多个隔室包含表3中所示的小分子化合物或其药学上可接受的盐。
表3：具有式(I)的示例性化合物
Figure BDA0003279416310000571
Figure BDA0003279416310000581
Figure BDA0003279416310000591
在一些实施例中，该化合物是具有式(I)的化合物(例如，式(I-a)、(I-b)、(I-c)、(I-d)、(I-e)、(I-f)、(II)、(II-a)、(III)、(III-a)、(III-b)、(III-c)、或(III-d))或其药学上可接受的盐，并且选自：
Figure BDA0003279416310000592
Figure BDA0003279416310000593
或所述化合物中任一种的药学上可接受的盐。
在一些实施例中，本文所述的装置包含
Figure BDA0003279416310000601
的化合物，或任一种化合物的药学上可接受的盐。
在实施例中，本文所述的装置包含与藻酸盐聚合物共价结合的具有式(I)的化合物(例如，表3中所示的化合物)。在实施例中，本文所述的颗粒包含与藻酸盐聚合物中的一种或多种古洛糖醛酸和/或甘露糖醛酸单体(例如，通过酰胺键)共价结合的具有式(I)的化合物(例如，表3中所示的化合物，例如化合物101)。
在一些实施例中，如以下实例中所述，如通过针对氮百分比的燃烧分析所测定的，将具有式(I)的化合物(例如，表3中的化合物101)按缀合密度至少2.0％和小于9.0％氮、或2.0％至5％氮、3.0％至8.0％氮、5％至8.0％氮、4.0％至7.0％氮、5.0％至7.0％氮、或6.0％至7.0％氮、或约6.8％氮共价附接到藻酸盐(例如，具有大约MW<75kDa，G:M比率≥1.5的藻酸盐)。
治疗方法
本文描述了如下方法，这些方法通过施用或植入能够表达和分泌如本文所述的FVII蛋白的多个工程化的RPE细胞来预防或治疗受试者的出血障碍。在实施例中，该多个RPE细胞包含在本文所述的可植入装置中。在一些实施例中，本文所述的方法直接或间接减少或缓解出血障碍的至少一种症状，或预防或减缓出血障碍的发作。在实施例中，该方法包括施用(例如，植入)有效量的具有两隔室藻酸盐水凝胶胶囊的组合物，该水凝胶胶囊在内隔室中包含工程化的RPE细胞和本文所述的细胞结合聚合物，并且在胶囊外表面上并且任选地在外隔室内包含具有式(I)的化合物(例如化合物101)。
列举的示例性实施例
1.一种包含因子VII(FVII)蛋白的编码序列的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸具有以下特征中的至少一个或多个：
(a)与该编码序列可操作地连接的启动子，其中该启动子基本上由以下的核苷酸序列组成或由其组成，该核苷酸序列与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:21相同或基本上相同；
(b)该编码序列包含选自下组的前体FVII编码序列，该组由以下组成：
(i)SEQ ID NO:3，
(ii)与SEQ ID NO:3至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的核苷酸序列，
(iii)SEQ ID NO:4，和
(iv)与SEQ ID NO:4至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的核苷酸序列。
2.如实施例1所述的分离的多核苷酸，其中该前体FVII编码序列包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。
3.如实施例2所述的分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含作为可操作地连接到该前体FVII编码序列的启动子的SEQ ID NO:10。
4.如实施例1至3中任一项所述的分离的多核苷酸，其中该FVII蛋白是FVII融合蛋白。
5.如实施例4所述的分离的多核苷酸，其中该FVII融合蛋白包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。
6.如实施例5所述的分离的多核苷酸，其中该编码序列包含SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18，基本上由其组成，或由其组成。
7.一种包含上游转录单位和下游转录单位的分离的多核苷酸，其中该上游转录单位包含可操作地连接到SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:10，并且该下游转录单位包含可操作地连接到SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:21。
8.如上述实施例中任一项所述的分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸作为分离的双链DNA分子提供，例如表达载体。
9.多个工程化的RPE细胞，其能够表达和分泌FVII蛋白(例如，人FVII蛋白或其变体)，其中该多个细胞中的每个包含含有该FVII蛋白的编码序列的外源核苷酸序列，其中该外源核苷酸序列具有以下特征中的至少一个或多个：
(a)与该编码序列可操作地连接的启动子，其中该启动子基本上由以下的核苷酸序列组成或由其组成，该核苷酸序列与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:21相同或基本上相同；
(b)该编码序列包含选自下组的前体FVII编码序列，该组由以下组成：
(i)SEQ ID NO:3，
(ii)与SEQ ID NO:3至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的核苷酸序列，
(iii)SEQ ID NO:4，和
(iv)与SEQ ID NO:4至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的核苷酸序列。
10.如实施例9所述的多个工程化的RPE细胞，其中该前体FVII编码序列包含SEQID NO:3或SEQ ID NO:4。
11.如实施例9或10所述的多个工程化的RPE细胞，其中该外源核苷酸序列包含至少一个转录单位，其包含作为可操作地连接到该FVII编码序列的启动子的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:21。
12.如实施例9至11中任一项所述的多个工程化的RPE细胞，其中该FVII蛋白是FVII融合蛋白。
13.如实施例12所述的多个工程化的RPE细胞，其中该FVII融合蛋白包含SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12。
14.如实施例9至13中任一项所述的多个工程化的RPE细胞，其中该外源核苷酸序列包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQID NO:18。
15.如实施例9至14中任一项所述的多个工程化的RPE细胞，其中该外源核苷酸序列包含染色体外的表达载体或被整合到这些RPE细胞的核基因组中的至少一个位置中。
16.如实施例9至15中任一项所述的多个工程化的RPE细胞，该多个工程化的RPE细胞衍生自用如实施例1至8中任一项所述的分离的多核苷酸转染的ARPE-19细胞。
17.如实施例9至16中任一项所述的多个工程化的RPE细胞，该多个工程化的RPE细胞作为多克隆细胞培养物或作为单克隆细胞系的培养物提供。
18.如实施例8至17中任一项所述的多个工程化的RPE细胞，其中该多个呈现出以下特征中的一个或多个：
a)分泌该FVII蛋白，持续至少5天、至少10天、至少一个月、或至少两个月，例如在体外细胞培养物中或当植入受试者体内时(例如，如通过本文所述的参比方法所评价)；或
b)与用编码前体FVII的野生型人核苷酸序列转染的参比多个工程化的RPE细胞相比，分泌至少2倍、3倍、4倍、5倍、或10倍量的FVII蛋白。
19.一种可植入装置，该可植入装置包含至少一个包含如实施例9至18中任一项所述的多个工程化的RPE细胞的细胞容纳隔室和至少一种用于减轻当该装置被植入该受试者体内时的异物反应(FBR)的器件。
20.如实施例19所述的装置，其中该至少一个细胞容纳隔室包含包封多个工程化的RPE细胞的聚合物组合物，并且任选地包含至少一种细胞结合物质(CBS)。
21.如实施例19或20所述的装置，其中该细胞容纳隔室包含海藻酸水凝胶，并且被屏障隔室环绕，该屏障隔室包含海藻酸水凝胶，并且任选地包含设置在该屏障隔室的外表面上的具有式(I)的化合物，例如表3中的化合物101。
22.如实施例20或21所述的装置，其中该聚合物组合物包含用肽共价修饰的藻酸盐，其中该肽基本上由GRGDSP(SEQ ID NO:49)、GGRGDSP(SEQ ID NO:51)、或GGGRGDSP(SEQID NO:52)组成或由其组成。
23.如任一实施例21或22所述的装置，其中该屏障隔室包含未经修饰的藻酸盐和用化合物101修饰的藻酸盐的混合物，其中：
(a)该未经修饰的藻酸盐具有的分子量为150kDa至250kDa，并且G:M比率为高于或等于1.5；并且
(b)在该经修饰的藻酸盐中该藻酸盐具有的分子量为<75kDa，并且G:M比率为高于或等于1.5。
24.如实施例23所述的装置，其中通过游离胺定量分析测定该经修饰的藻酸盐中化合物101的缀合密度，例如，如本文中以下实例9中所述，其中所测定的缀合密度是1.0％w/w至3.0％w/w、1.3％w/w至2.8％ww、1.3％w/w至2.6％w/w、1.5％w/w至2.4％w/w、1.5％w/w至2.2％w/w、或1.7％w/w至2.2％w/w。
25.一种水凝胶胶囊，该水凝胶胶囊包含：
(a)细胞容纳内隔室，其包含如实施例8至17中任一项所述的多个工程化的细胞，该多个工程化的细胞包封在包含第一RGD-聚合物的第一聚合物组合物中，任选地其中该多个细胞的浓度为4000万个细胞/ml该第一聚合物组合物，或为4000万至1亿个细胞/ml、6000万至1亿个细胞/ml、或8000万至1亿个细胞/ml该第一聚合物组合物中的任一个；和
(b)屏障隔室，该屏障隔室环绕该细胞容纳隔室并包含第二聚合物组合物，该第二聚合物组合物包含未经修饰的藻酸盐和用表3所示的至少一种化合物共价修饰的藻酸盐的混合物，该至少一种化合物选自下组，该组由以下组成：化合物100、化合物101、化合物110、化合物112、化合物113和化合物114，
其中该水凝胶胶囊具有球形形状，并具有0.5毫米至5毫米的直径，并且任选地该屏障隔室的平均厚度为约10至约300微米、约20至约150微米、或约40至约75微米。
26.如实施例25所述的水凝胶胶囊，该水凝胶胶囊包含有效量的用于增加该因子VII蛋白分泌的第一RGD-聚合物，并且其中该第一RGD-聚合物基本上由经由接头用RGD肽共价修饰的藻酸盐组成，该细胞容纳隔室基本上不含任何去纤维化化合物，并且该屏障隔室基本上不含任何细胞和该RGD肽，并且任选地其中该RGD-聚合物的有效量是最佳量。
27.如实施例25或26所述的水凝胶胶囊，其中该RGD肽基本上由RGD(SEQ ID NO:33)或RGDSP(SEQ ID NO:48)的氨基酸序列组成并且该接头基本上由附接到该RGD肽的N端的单个甘氨酸残基或单个β-丙氨酸残基组成。
28.如实施例25至27中任一项所述的水凝胶胶囊，其中：
(a)该第一RGD-聚合物中的聚合物是藻酸盐，并且具有的分子量为150至250kDa，并且G:M比率为高于或等于1.5，并且任选地由藻酸盐溶液形成该细胞容纳隔室，该藻酸盐溶液的粘度在约90cP和约230cP至约300、350或400cP之间，或在约80cP至约120cP之间；
(b)该屏障隔室中该经共价修饰的藻酸盐中的藻酸盐具有的分子量为<75kDa，并且G:M比率为高于或等于1.5；
(c)该屏障隔室中的该未经修饰的藻酸盐具有的分子量为150kDa至250kDa，并且G:M比率为高于或等于1.5；并且
(d)任选地该屏障隔室由藻酸盐溶液形成，该藻酸盐溶液包含共价修饰的藻酸盐和未经修饰的藻酸盐的混合物并且粘度为250-350cP。
29.如实施例28所述的水凝胶胶囊，其中：
(a)该胶囊的直径在1.0毫米和2.0毫米之间；
(b)该藻酸盐上的该RGD肽的缀合密度是通过冻干至恒重的该RGD-聚合物(SEQ IDNO:33)的燃烧分析所确定的氮百分比(例如，如下文实例1B中所述的)，其中所确定的氮百分比是约0.10％氮(N)至1.00％N、约0.20％N至约0.80％N、约0.30％N至约0.60％N、约0.30％至约0.50％、或0.33％N至0.46％N；并且
(c)该屏障隔室中的共价修饰的藻酸盐仅用化合物101修饰，并且共价修饰的藻酸盐中化合物101的密度是通过例如，如本文实例1A中所述的，对已冻干至恒重的共价修饰的藻酸盐的燃烧分析所确定的氮百分比，其中所确定的氮百分比在约氮之间，为至少2.0％且小于9.0％、或是3.0％至8.0％、4.0％至7.0％、5.0％至7.0％、或6.0％至7.0％或约6.8％。
30.如实施例29所述的水凝胶胶囊，其中：
(a)该胶囊的直径为约1.5毫米；
(b)该RGD肽基本上由RGDSP(SEQ ID NO:48)的氨基酸序列组成并且该接头是单个甘氨酸残基；
(c)该藻酸盐上的该RGD肽的缀合密度选自下组，该组由以下组成：
(i)有效增加这些工程化的RPE细胞的存活力的量，例如，如通过本文所述的测定确定的，
(ii)有效增加这些工程化的RPE细胞的生产力的量，例如，如通过本文所述的测定确定的，
(iii)通过冻干至恒重的该RGD-聚合物的燃烧分析所确定的氮百分比(例如，如下文实例1B中所述的)，其中所确定的氮百分比是约0.10％氮(N)至1.00％N、约0.20％N至约0.80％N、约0.30％N至约0.60％N、约0.30％至约0.50％、或0.33％N至0.46％N；
(iv)0.1至1.0、0.2至0.8、0.3至0.7、或0.3至0.6微摩尔的GRGDSP(SEQ ID NO:49)/克在溶液中的RGD-聚合物，例如，如本文实例7和任选地实例8中所述；以及
(v)c(i)、c(ii)、c(iii)和c(iv)中两个或更多个的任何组合；并且
(d)该屏障隔室中的共价修饰的藻酸盐仅用化合物101修饰，并且共价修饰的藻酸盐中化合物101的密度是：
(i)通过例如，如本文实例1A中所述的，对已冻干至恒重的共价修饰的藻酸盐的燃烧分析所确定的氮百分比，其中所确定的氮百分比在约氮之间，为至少2.0％且小于9.0％、或是3.0％至8.0％、4.0％至7.0％、5.0％至7.0％、或6.0％至7.0％或约6.8％；或
(ii)通过例如，如本文实例9中所述的游离胺定量分析所确定的基于重量/重量的％胺，其中所测定的密度是1.0％w/w至3.0％w/w、1.3％w/w至2.8％w/w、1.3％w/w至2.6％w/w、1.5％w/w至2.4％w/w、1.5％w/w至2.2％w/w、或1.7％w/w至2.2％w/w。
31.如实施例30所述的水凝胶胶囊，其中该RGD-聚合物中该藻酸盐上的该RGD肽的缀合密度是0.3至0.6微摩尔的GRGDSP(SEQ ID NO:49)/克的在溶液中的RGD-聚合物。
32.一种装置制品，其中该制品中的每个装置是如实施例18至23中任一项所述的装置。
33.一种包含多个水凝胶胶囊的组合物，其中该组合物中的每个胶囊是如实施例25至31中任一项所述的水凝胶胶囊。
34.如实施例33所述的组合物，其中每个胶囊是具有选自下组的直径的球形水凝胶胶囊，该组由以下组成：0.5毫米至2毫米；0.7毫米至1.8毫米、1.0毫米至1.8毫米；1.2毫米至1.7毫米；1.3毫米至1.7毫米；和1.4至1.6毫米。
35.如实施例33或34所述的组合物，该组合物是药学上可接受的组合物。
36.一种向有需要的患者递送FVII疗法的方法，其包括施用有效量的如实施例32所述的装置制品或如实施例33至35中任一项所述的组合物。
37.如实施例36所述的方法，其中该患者患有血友病。
38.如实施例37所述的方法，其中该患者已被诊断出患有先天性FVII缺乏症或获得性FVII缺乏症。
39.一种将多个RPE细胞工程化以产生FVII蛋白(例如，人FVII蛋白或其变体)的方法，该FVII蛋白具有本文所述的特性，包括用如实施例1至8中任一项所定义的多核苷酸稳定转染这些RPE细胞，并且任选地分离表达该FVII蛋白的单克隆细胞系。
40.如实施例39所述的方法，其中该多个RPE细胞衍生自ARPE-19细胞。
41.一种能够表达和分泌FVII蛋白的工程化的RPE细胞，其中该细胞包含含有编码该FVII蛋白的外源核苷酸序列，其中该编码序列包含选自下组的前体FVII编码序列，该组由以下组成：(i)SEQ ID NO:3，(ii)与SEQ ID NO:3至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的核苷酸序列，(iii)SEQ ID NO:4，和(iv)与SEQ ID NO:4至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的核苷酸序列。
42.如实施例41所述的工程化的RPE细胞，其中该外源核苷酸序列进一步包含与该编码序列可操作地连接的启动子，其中该启动子任选地基本上由以下的核苷酸序列组成或由其组成，该核苷酸序列与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:21相同或基本上相同。
43.如实施例42所述的工程化的RPE细胞，其中该编码序列包含SEQ ID NO:3，并且该启动子由SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:21组成。
44.如实施例41所述的工程化的RPE细胞，其中该FVII蛋白是FVII融合蛋白，并且任选地该FVII融合蛋白包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。
45.如实施例44所述的工程化的RPE细胞，其中该编码序列包含SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18。
46.如实施例41所述的工程化的RPE细胞，该工程化的RPE细胞包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25。
47.如实施例41所述的工程化的RPE细胞，该工程化的RPE细胞包含SEQ ID NO:22。
48.如实施例41至47中任一项所述的工程化的RPE细胞，其中该外源核苷酸序列包含染色体外表达载体或被整合到该RPE细胞中的至少一个染色体位置中。
49.如实施例41至48中任一项所述的工程化的RPE细胞，该工程化的RPE细胞衍生自ARPE-19细胞。
50.一种组合物，该组合物包含如实施例41至49中任一项所述的工程化的RPE细胞。
51.如实施例50所述的组合物，该组合物是多克隆细胞培养物或单克隆细胞系的培养物。
52.一种分离的双链DNA分子，该分离的双链DNA分子包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24和SEQ ID NO:25。
53.如实施例52所述的分离的DNA分子，该分离的DNA分子基本上由SEQ ID NO:22组成。
54.一种可植入装置，该可植入装置包含至少一个包含如实施例41至49中任一项所述的工程化的RPE细胞的细胞容纳隔室和至少一种用于减轻当该装置被植入该受试者体内时的异物反应(FBR)的器件。
55.如实施例54所述的可植入装置，其中该至少一个细胞容纳隔室包含包封多个工程化的RPE细胞的聚合物组合物，并且任选地包含至少一种细胞结合物质(CBS)。
56.如实施例54或55所述的可植入装置，其中该细胞容纳隔室被屏障隔室环绕，该屏障隔室包含海藻酸水凝胶和任选地设置在该屏障隔室外表面的具有式(I)的化合物。
57.如实施例55或56所述的可植入装置，其中该聚合物组合物包含用肽共价修饰的藻酸盐，其中该肽基本上由组成GRGDSP(SEQ ID NO:49)或GGRGDSP(SEQ ID NO:51)组成或由其组成，并且其中该屏障隔室包含用
Figure BDA0003279416310000691
或其药学上可接受的盐修饰的藻酸盐。
58.一种水凝胶胶囊，该水凝胶胶囊包含：
(a)内隔室，其包含包封在第一聚合物组合物中的如实施例41至49中任一项所述的工程化的细胞，其中该第一聚合物组合物包含形成水凝胶的聚合物；和
(b)屏障隔室，其环绕该内隔室并且包含第二聚合物组合物，其中该第二聚合物组合物包含用如表3所示的至少一种化合物共价修饰的藻酸盐，该至少一种化合物选自下组，该组由以下组成：化合物100、化合物101、化合物110、化合物112、化合物113、和化合物114。
59.如实施例58所述的水凝胶胶囊，其中所选的化合物是
Figure BDA0003279416310000692
60.如实施例58或59所述的水凝胶胶囊，其中该内隔室包含多个如实施例41至49中任一项所述的工程化的细胞，任选地其中该内隔室中的该工程化的细胞的浓度是至少4000万个细胞/ml该第一聚合物组合物。
61.如实施例58至60中任一项所述的水凝胶胶囊，其中该工程化的细胞衍生自ARPE-19并且包含SEQ ID NO:25。
62.一种组合物，该组合物包含多个如实施例19至22中任一项所述的水凝胶胶囊。
63.一种向有需要的患者递送FVII疗法的方法，该方法包括施用如实施例54至57中任一项所述的可植入装置、如实施例58或59中任一项所述的水凝胶胶囊、或如实施例62所述的组合物。
实例
为了使在此所述的本披露可以得到更完全的理解，列出了以下实例。提供本申请中描述的实例以说明本文提供的工程化的RPE细胞、可植入装置以及组合物和方法，并且不得以任何方式解释为限制其范围。
实例1：示例性工程化的ARPE-19细胞的产生和培养
使用图8所示的表达载体产生FVII分泌细胞，其中已经使用标准的克隆方法插入了编码前体FVII蛋白的外源核苷酸序列。为实现这一点，将ARPE-19细胞与含有转座酶质粒连同FVII表达载体的PiggyBac共转染，并将稳定转染的细胞在含有嘌呤霉素的完全生长培养基中培养。FVII表达载体与图6中的载体是相同的，除了在5’ITR和3’ITR之间插入了一个或两个转录单位。除了启动子序列和插入的FVII编码序列或FVII白蛋白融合序列，每个转录单位的骨架序列与图6A和图6B中所示的相应序列相同，例如，每个转录单位具有相同的Kozak序列和相同的rBG pA序列。FVII表达载体中存在的启动子和FVII编码序列组合在下文列出。
FVII-1载体：包含可操作地连接到SEQ ID NO:3(其是野生型人FVII前体的密码子优化的编码序列)的启动子(SEQ ID NO:10)的单个转录单位。
FVII-2载体：包含可操作地连接到SEQ ID NO:4(其是野生型人FVII前体的密码子优化的编码序列)的启动子(SEQ ID NO:10)的单个转录单位。
FVII-3载体：包含可操作地连接到SEQ ID NO:2(其是野生型人FVII前体的野生型编码序列)的启动子(SEQ ID NO:10)的单个转录单位。
FVII-4载体：两个转录单位，其中上游单位包含可操作地连接到SEQ ID NO:2的启动子(SEQ ID NO:10)且下游单位包含融合于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:21。
FVII-5载体：包含可操作地连接到融合于SEQ ID NO:8的SEQ ID NO:3的启动子(SEQ ID NO:10)的单个转录单位。SEQ ID NO:8由融合于成熟人血清白蛋白的密码子优化的编码序列的可切割的接头肽组成。
FVII-6载体：包含可操作地连接到融合于SEQ ID NO:6的SEQ ID NO:3的启动子(SEQ ID NO:10)的单个转录单位。SEQ ID NO:6由融合于在FVII-5载体中使用的成熟人血清白蛋白的相同密码子优化的编码序列的甘氨酸丝氨酸接头肽组成。
FVII-7载体：两个转录单位，其中上游单位包含可操作地连接到SEQ ID NO:3的启动子(SEQ ID NO:10)且下游单位包含可操作地连接到SEQ ID NO:2的不同启动子(SEQ IDNO:21)。
FVII-8载体：两个转录单位，其中上游包含可操作地连接到融合于SEQ ID NO:8的SEQ ID NO:3的启动子(SEQ ID NO:10)且下游单位包含可操作地连接到融合于SEQ ID NO:8的SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:21。
根据以下方案培养所得稳定转染的ARPE-19细胞。使细胞在150cm2细胞培养瓶中在完全生长培养基(DMEM:F12，含10％FBS)中生长。为传代细胞，吸出培养瓶中的培养基，并将细胞层用磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，8mM Na2HPO4，和2mM KH2PO4，吉博科公司)简单冲洗。将5-10mL 0.05％(w/v)胰蛋白酶/0.53mM EDTA溶液(“胰蛋白酶EDTA”)添加至烧瓶，并在倒置显微镜下观察细胞直至细胞层分散(通常在3-5分钟之间)。为了避免结块，小心处理细胞并在分散期间对烧瓶的击打或摇动最小化。如果细胞没有分离，则将烧瓶置于37℃，以促进分散。一旦细胞分散，添加10mL完全生长培养基并通过温和移液吸出细胞。将细胞悬浮液转移到离心管中并以约125x g离心5-10分钟以除去胰蛋白酶EDTA。弃去上清液，并将细胞重悬浮于新鲜生长培养基中。将适当的细胞悬浮液等分试样添加到新的培养皿中，在37℃下孵育这些细胞。将培养基每周更新。
实例2：从示例性工程化的ARPE-19细胞分泌FVII
为定量细胞的FVII蛋白分泌，如上所述将用实例1中所述的不同FVII表达构建体工程化的ARPE-19细胞的多克隆群体用胰蛋白酶消化，并且将500,000个细胞接种于6孔组织培养皿的单孔中2ml生长培养基中。在用新鲜的培养基更换生长培养基之前，使工程化的细胞沉降并附着于培养皿3-4小时。更换培养基后1天(24小时)，收集含有分泌的FVII的生长培养基并置于冰上。将细胞如先前所述用磷酸盐缓冲盐水洗涤并用0.05％胰蛋白酶EDTA进行胰蛋白酶消化。收集细胞并在Countess II细胞分析仪上使用台盼蓝进行计数。使用条件生长培养基测定上述工程化的细胞的FVII蛋白水平，并在可商购的FVII ELISA试剂盒上运行(Abcam#190810)。将总蛋白分泌相对于细胞总数归一化(皮克/细胞/天)，并且结果在图9中示出。
实例3：具有式(I)的示例性化合物的合成
通用方案
以下的程序描述了制备用于本文所述的可植入装置制品的示例性化合物的方法。本文提供的化合物可以使用对本领域技术人员熟知的下述具体合成方案的修改由容易获得的起始材料制备。应当认识到的是，在给出典型的或优选的工艺条件(即，反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)之处，除非另做说明，其他工艺条件也可以使用。最适宜的反应条件可以随着使用的具体的反应物或溶剂而变化，但是此类条件可以由本领域的技术人员通过常规优化程序进行决定。
此外，正如本领域的技术人员将清楚的，常规保护基团对于保护某些官能团免于经受不希望的反应可能是必需的。适合于具体的官能团的保护基团连同适合于保护以及脱保护的条件的选择是本领域熟知的。例如，许多保护基团，以及它们的引入和去除，描述于Greene等人，Protecting Groups in Organic Synthesis[在有机合成上的保护基团],第二版,威利出版社(Wiley),纽约,1991，以及其中引用的参考文献。
Huisgen环加成反应得到1,4-取代的三唑
铜催化的Huisgen[3+2]环加成用于制备基于三唑的化合物及其组合物、装置和材料。范围和典型的方案已经是许多综述的主题(例如，Meldal,M.和Tornoe,C.W.Chem.Rev.[化学评论](2008)108:2952-3015；Hein,J.E.和Fokin,V.V.Chem.Soc.Rev.[化学学会评论](2010)39(4):1302-1315；将这两者通过引用并入本文)。
Figure BDA0003279416310000721
在上面所示的实例中，叠氮化物是含有连接元件A的片段中的反应性部分，而炔烃是侧基Z的反应性组分。如下所述，这些功能性把手可以交换以产生结构上相关的三唑产物。这些替代品的制备是类似的，不需要特别考虑。
Figure BDA0003279416310000722
以碘化物开始的典型Huisgen环加成程序概述如下。在某些情况下，为了安全起见，碘化物在反应过程中转化为叠氮化物。
Figure BDA0003279416310000731
将叠氮化钠(1.1当量)，抗坏血酸钠，(0.1当量)反式-N,N’-二甲基环己烷-1,2-二胺(0.25当量)，碘化铜(I)在甲醇(1.0M，限量试剂)中的溶液用鼓泡氮气对进行脱气，并用乙炔(1当量)和芳基碘(1.2当量)处理。将该混合物在室温下搅拌5分钟，然后温热至55℃保持16小时。然后将反应物冷却至室温，通过漏斗过滤，并且用甲醇洗涤滤饼。将合并的滤液浓缩并通过硅胶快速色谱法纯化(120g二氧化硅，梯度为二氯甲烷中的0至40％(3％氢氧化铵水溶液，22％甲醇，余量为二氯甲烷)，以得到所希望的目标材料。
以叠氮化物开始的典型Huisgen环加成程序概述如下。
Figure BDA0003279416310000732
将三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(0.2当量)、三乙胺(0.5当量)、碘化铜(I)(0.06当量)在甲醇(0.4M，限量试剂)中的溶液用乙炔(1.0当量)处理并冷却至0℃。使反应经30分钟温热至室温，然后加热至55℃，保持16小时。将反应冷却至室温，浓缩，并用HPLC(C18柱，在二氯甲烷中0至100％梯度(3％氢氧化铵水溶液，22％甲醇，余量为二氯甲烷))纯化，得到所希望的目标材料。
Huisgen环加成反应得到1,5-取代的三唑
还使用钌催化剂进行Huisgen[3+2]环加成反应，优先获得1,5-二取代的产物(例如，如Zhang等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志],2005,127,15998-15999；Boren等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志],2008,130,8923-8930所述，其中每一个通过引用以其全文并入本文)。
Figure BDA0003279416310000733
如前所述，叠氮化物和炔烃基团可以交换形成如下所述的类似的三唑。
Figure BDA0003279416310000741
典型程序描述如下：将炔烃(1当量)和叠氮化物(1当量)在二噁烷(0.8M)中的溶液逐滴添加到五甲基环戊二烯基双(三苯基膦)氯化钌(II)(0.02当量)在二噁烷(0.16M)中的溶液中。将小瓶用氮气吹扫，密封并将混合物加热至60℃，保持12小时。浓缩所得混合物并通过硅胶快速色谱纯化，得到所需化合物。
(4-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(3)的实验程序
Figure BDA0003279416310000742
用氮气吹扫(4-碘苯基)甲胺(1，843mg，3.62mmol，1.0当量)、(1S,2S)-N1,N2-二甲基环己烷-1,2-二胺(74μL，0.47mmol，0.13当量)、抗坏血酸钠(72mg，0.36mmol，0.1当量)、碘化铜(69mg，0.36mmol，0.1当量)、叠氮化钠(470mg，7.24mmol，2.0当量)和1-甲基-4-(丙-2-炔-1-基)哌嗪(2，0.5g，3.62mmol，1.0当量)在甲醇(9mL)和水(1mL)中的混合物5分钟，并加热至55℃过夜。将反应混合物冷却至室温，减压浓缩，并且用二氯甲烷萃取褐色浆液。将硅藻土加入到合并的二氯甲烷相中，并在减压下除去溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，在硅胶(80g)上纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至7.5％，得到(4-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(3，0.45g，43％)。LCMS m/z:针对C15H22N6计算的[M+H]+是287.2；发现值是287.1。
N-(4-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(4)的实验程序
Figure BDA0003279416310000751
用冰浴将(4-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(3，1.2g，4.19mmol，1.0当量)和三乙胺(0.70mL，5.03mmol，1.2当量)在CH2Cl2(50mL)中的溶液冷却至0℃，并添加甲基丙烯酰氯(0.43mL，4.40mmol，1.05当量在5mL的CH2Cl2中)。将反应搅拌一天，同时用冰浴冷却。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱(80g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至7.5％。减压除去溶剂，并且将得到的固体用二乙醚研磨，过滤并用二乙醚洗涤多次，得到N-(4-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(4，0.41g，28％收率)，为白色固体。LCMSm/z:针对C19H26N6O计算的[M+H]+是355.2；发现值是355.2。
(4-(4-((2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(6)的实验程序
Figure BDA0003279416310000752
用氮气吹扫(4-碘苯基)甲胺(1，2.95g，12.64mmol，1.0当量)、(1S,2S)-N1,N2-二甲基环己烷-1,2-二胺(259μL，1.64mmol，0.13当量)、抗坏血酸钠(250mg，1.26mmol，0.1当量)、碘化铜(241mg，1.26mmol，0.1当量)、叠氮化钠(1.64g，25.29mmol，2.0当量)和1-甲基-4-(丙-2-炔-1-基)哌嗪(5，2.0g，12.64mmol，1.0当量)在甲醇(40mL)和水(4mL)中的混合物5分钟，并加热至55℃过夜。将反应混合物冷却至室温并减压浓缩。将残余物溶于二氯甲烷中，过滤，并用硅藻土(10g)进行浓缩。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱法(220g)纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至6.25％，得到(4-(4-((2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(6，1.37g，35％)。LCMS m/z:针对C15H22N4O3计算的[M+H]+是307.2；发现值是307.0。
N-(4-(4-((2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(7)的实验程序
Figure BDA0003279416310000761
用冰浴将4-(4-((2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(6，1.69g，5.52mmol，1.0当量)和三乙胺(0.92mL，6.62mmol，1.2当量)在CH2Cl2(50mL)中的溶液冷却至0℃，并以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.57mL，5.79mmol，1.05当量)。将反应在室温下搅拌4小时。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶(80g)色谱纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至1.25％，得到N-(4-(4-((2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(7，1.76g，85％产率)，为白色固体。LCMS m/z:针对C19H26N4O4计算的[M+H]+是375.2；发现值是375.0。
3-(丙-2-炔-1-基氧基)氧杂环丁烷(9)的实验程序
Figure BDA0003279416310000762
用冰浴冷却氢化钠(27.0g，675mmol，60％纯度)在THF(200mL)中的悬浮液。以逐滴方式添加氧杂环丁烷-3-醇(8，25g，337mmol)并在0℃下搅拌30分钟。然后以逐滴方式添加3-溴丙-1-炔(9，41.2mL，371mmol，80％纯度)。将混合物搅拌过夜，同时使其温热至室温。将混合物经硅藻土过滤，用THF洗涤，并在减压下用硅藻土浓缩。将粗产物在硅胶(220g)上纯化，并且用己烷/EtOAc洗脱。流动相中EtOAc的浓度从0增加至25％，得到黄色油状物(9，18.25g，48％)。
3-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙-1-胺(11)的实验程序
Figure BDA0003279416310000771
将3-(丙-2-炔-1-基氧基)氧杂环丁烷(9，7.96g，71mmol，1.0当量)、3-叠氮基丙-1-胺(10，7.82g，78mmol，1.1当量)、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]-胺(8.29g，15.6mmol，0.22当量)、碘化铜(1.35g，7.1mmol，0.1当量)和三乙胺(2.47mL，17.8mmol，0.25当量)将在甲醇(80mL)中的混合物加热至55℃，并在氮气气氛下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，添加硅藻土(20g)，并减压浓缩。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，在硅胶(220g)上纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至15％，得到3-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙-1-胺(11，11.85g，79％)，为黄色油状物。LCMS m/z:针对C9H16N4O2计算的[M+H]+是213.1；发现值是213.0。
N-(3-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基)甲基丙烯酰胺(12)的实验程序
Figure BDA0003279416310000772
用冰浴将3-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙-1-胺(11，3.94g，18.56mmol，1.0当量)和三乙胺(3.1mL，22.28mmol，1.2当量)在CH2Cl2(100mL)中的溶液冷却至0℃，并以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(1.99mL，20.42mmol，1.1当量)。将反应物搅拌过夜，同时使其温热至室温。添加20克硅藻土，并且减压除去溶剂。使用二氯甲烷/甲醇作为流动相，通过硅胶色谱(220g)纯化残余物。甲醇浓度从0％逐渐增加到5％，得到N-(3-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基)甲基丙烯酰胺(12，3.22g，62％收率)，为固体。LCMS m/z:针对C13H20N4O3计算的[M+H]+是281.2；发现值是281.0。
N-(4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(14)的实验程序
Figure BDA0003279416310000781
向(4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(13，从无锡(WuXi)获得，1.2g，5.70mmol，1.0当量)和三乙胺(15mL，107.55mmol，18.9当量)在CH2Cl2(100mL)中的溶液中以逐滴方式缓慢地添加甲基丙烯酰氯(893mg，8.54mmol，1.5当量)。搅拌反应物过夜。添加20克硅藻土，并且减压除去溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱法纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加到1.25％，得到N-(4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(14，1.38g，40％收率)。
(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(15)的实验程序
Figure BDA0003279416310000782
用氮气吹扫(4-碘苯基)甲胺盐酸盐(5.0g，18.55mmol，1.0当量)、(1S,2S)-N1,N2-二甲基环己烷-1,2-二胺(0.59mL 3.71mmol，0.2当量)、抗坏血酸钠(368mg，1.86mmol，0.1当量)、碘化铜(530mg，2.78mmol，0.15当量)、叠氮化钠(2.41g，37.1mmol，2.0当量)、Et3N(3.11mL，22.26mmol，1.2当量)和2-(丙-2-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃(2.6g，18.55mmol，1.0当量)在甲醇(50mL)和水(12mL)中的混合物5分钟，并加热至55℃过夜。将反应混合物冷却至室温并通过413滤纸过滤。添加硅藻土，并且减压除去溶剂，并且将残余物用硅胶(120g)纯化(用二氯甲烷/(含12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相)。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至6.25％，得到(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(15，3.54g，66％)，为白色固体。LCMS m/z:针对C15H20N4O2计算的[M+H]+是289.2；发现值是289.2。
N-(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(16)的实验程序
Figure BDA0003279416310000791
用冰浴将(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(15，3.46g，12.00mmol，1.0当量)和三乙胺(2.01mL，14.40mmol，1.2当量)在CH2Cl2(40mL)中的溶液冷却至0℃，并以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(1.23mL，12.60mmol，1.05当量，稀释于5mL的CH2Cl2中)。移去冷却浴，并将反应物搅拌4小时。添加20克硅藻土，并且减压除去溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱(80g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至3.75％，得到N-(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(16，2.74g，64％产率)，为白色固体。LCMS m/z:针对C19H24N4O3计算的[M+H]+是357.2；发现值是357.3。
N-(4-(4-(羟基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(17)的实验程序
Figure BDA0003279416310000792
将N-(4-(4-(羟甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(16，1.2g，3.37mmol，1.0当量)的溶液溶于甲醇(6mL)和HCl(1N，水溶液，9mL)中，保持在室温下过夜。添加硅藻土并且减压除去溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，在硅胶色谱(24g)上纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至12.5％，得到N-(4-(4-(羟基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(17，0.85g，92％产率)，为白色固体。LCMS m/z:针对C14H16N4O2计算的[M+H]+是273.1；发现值是273.1。
(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)苄基)氨基甲酸酯(19)的实验程序
Figure BDA0003279416310000801
将(4-(羟甲基)苄基)氨基甲酸苄酯(2.71g，10mmol，1当量)、3,4-二氢-2H-吡喃(1.81mL，20mmol，2当量)、对甲苯磺酸一水合物(285mg，1.5mmol，0.15当量)的二氯甲烷(100mL)溶液在室温下搅拌过夜。添加硅藻土并且减压除去溶剂。将粗产物在硅胶(24g)上纯化，使用己烷/EtOAc作为洗脱剂，从100％己烷开始，并将EtOAc的浓度逐渐增加至100％，得到苄基(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)苄基)-氨基甲酸酯(19，2.4g，68％)，为无色油状物。LCMS m/z:针对C21H25NO4计算的[M+Na]+是378.17，发现值是378.17。
(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-苯基)甲胺(20)的实验程序
Figure BDA0003279416310000802
将在EtOH中的(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)苄基)氨基甲酸酯(19，1.5g，4.2mmol，1当量)、钯碳(160mg，10wt％)短暂抽真空，并且然后通过气球添加氢气，并且将混合物在室温下搅拌1小时。添加硅藻土并且减压除去溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，在硅胶(12g)上纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至25％，得到(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)苯基)甲胺(20，890mg，95％)，为无色油状物。LCMS m/z:针对C13H19NO2计算的[M+H]+是222.15，发现值是222.14。
N-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)苄基)-甲基丙烯酰胺(21)的实验程序
Figure BDA0003279416310000811
将(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)苯基)甲胺(20，0.5g，2.26mmol，1.0当量)和三乙胺(0.47mL，3.39mmol，1.5当量)在CH2Cl2(10mL)中的溶液短暂抽真空并用氮气吹扫。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.33mL，3.39mmol，1.5当量)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(12g)纯化，使用己烷/EtOAc作为洗脱剂，从100％己烷开始，并将EtOAc的浓度逐渐增加至100％，得到N-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)苄基)甲基丙烯酰胺(21，0.47g，72％收率)，为无色固体。LCMS m/z:针对C17H23NO3计算的[M+Na]+是312.16；发现值是312.17。
(4-(4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(22)的实验程序
Figure BDA0003279416310000812
用氮气吹扫(4-碘苯基)甲胺(5.0g，21.45mmol，1.0当量)、(1S,2S)-N1,N2-二甲基环己烷-1,2-二胺(0.44mL 2.79mmol，0.13当量)、抗坏血酸钠(425mg，2.15mmol，0.1当量)、碘化铜(409mg，2.15mmol，0.1当量)、叠氮化钠(2.79g，42.91mmol，2.0当量)和2-(丁-3-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃(3.36mL，21.45mmol，1.0当量)在甲醇(20mL)和水(5mL)中的混合物5分钟，并加热至55℃过夜。将反应混合物冷却至室温并通过413滤纸过滤。添加硅藻土(10g)并且减压除去溶剂，并且将残余物用硅胶(220g)纯化，用二氯甲烷/(含12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至5％，得到(4-(4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(22，3.15g，49％)，为固体。LCMS m/z:针对C16H22N4O2计算的[M+H]+是303.18；发现值是303.18。
N-(4-(4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(23)的实验程序
Figure BDA0003279416310000821
用冰浴将(4-(4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(22，3.10g，10.25mmol，1.0当量)和三乙胺(1.71mL，12.30mmol，1.2当量)在CH2Cl2(55mL)中的溶液冷却至0℃，并且以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(1.05mL，12.30mmol，1.2当量，稀释于5mL CH2Cl2中)。移去冷却浴，并将反应物搅拌4小时。添加8克硅藻土，并且减压除去溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱(80g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至2.5％，得到N-(4-(4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(23，2.06g，54％产率)，为白色固体。LCMS m/z:针对C20H26N4O3计算的[M+H]+是371.2078；发现值是371.2085。
(4-(1-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯基)甲胺(24)的实验程序
Figure BDA0003279416310000822
用氮气吹扫(4-乙炔基苯基)甲胺(2.36g，18.00mmol，1.0当量)、(1S,2S)-N1,N2-二甲基环己烷-1,2-二胺(0.56mL，3.60mmol，0.2当量)、抗坏血酸钠(357mg，1.80mmol，0.1当量)、碘化铜(514mg，2.70mmol，0.15当量)和2-(2-叠氮基乙氧基)四氢-2H-吡喃(3.08，18.00mmol，1.0当量)在甲醇(24mL)和水(6mL)中的混合物5分钟，并加热至55℃过夜。将反应混合物冷却至室温，并用硅藻土过滤，并用MeOH(3x50mL)冲洗。减压除去溶剂并将残余物重新溶于二氯甲烷中，添加硅藻土(20g)并且减压除去溶剂，并将残余物用硅胶(120g)纯化，用二氯甲烷/(含12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至25％，得到(4-(1-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯基)甲胺(24，3.51g，64％)，为淡黄色固体。LCMS m/z:针对C16H22N4O2计算的[M+H]+是303.1816；发现值是303.1814。
N-(4-(1-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苄基)甲基丙烯酰胺(25)的实验程序
Figure BDA0003279416310000831
将(4-(1-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯基)甲胺(24，1.5g，4.96mmol，1.0当量)和三乙胺(1.04mL，7.44mmol，1.5当量)在CH2Cl2(30mL)中的溶液短暂抽真空并用氮气冲洗。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.72mL，7.44mmol，1.5当量)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(40g)纯化，使用己烷/EtOAc作为洗脱剂，从100％己烷开始，并将EtOAc的浓度逐渐增加至100％，得到N-(4-(1-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苄基)甲基丙烯酰胺(25，0.9g，49％收率)，为无色固体。LCMS m/z:针对C20H26N4O3计算的[M+Na]+是371.2078；发现值是371.2076。
1-(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)乙-1-胺(26)的实验程序
Figure BDA0003279416310000841
用氮气吹扫1-(4-碘苯基)乙-1-胺盐酸盐(1.0g，4.05mmol，1.0当量)、(1S,2S)-N1,N2-二甲基环己烷-1,2-二胺(0.08mL 0.53mmol，0.13当量)、抗坏血酸钠(80mg，0.40mmol，0.1当量)、碘化铜(77mg，0.40mmol，0.1当量)、叠氮化钠(526g，8.09mmol，2.0当量)和2-(丙-2-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃(0.57g，4.05mmol，1.0当量)在甲醇(9mL)和水(1mL)中的混合物5分钟，并加热至55℃过夜。将反应混合物冷却至室温，且减压除去溶剂。将残余物重新溶于二氯甲烷中，并通过硅藻土塞过滤。将硅藻土加入滤液中并且减压除去溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，在硅胶(40g)上纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至5％，得到1-(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)乙-1-胺(26，0.62g，51％)，为淡黄色固体。LCMS m/z:针对C16H22N4O2计算的[M+H]+是303.2；发现值是303.2。
N-(1-(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)乙基)甲基丙烯酰胺(27)的实验程序
Figure BDA0003279416310000842
用冰浴将1-(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)乙-1-胺(26，0.52g，1.7mmol，1.0当量)和三乙胺(0.29mL，2.1mmol，1.2当量)在CH2Cl2(11mL)中的溶液冷却至0℃，并且以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.18mL，1.8mmol，1.05当量，稀释于11mL CH2Cl2中)。移去冷却浴，并将反应物搅拌4小时。添加五(5)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱(40g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至2.5％，得到N-(1-(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)乙基)甲基丙烯酰胺(27，0.49g，76％产率)，为白色固体。LCMS m/z:针对C20H26N4O3计算的[M+H]+是371.2078；发现值是371.2087。
(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(三氟甲基)苯基)甲胺(28)的实验程序
Figure BDA0003279416310000851
用氮气吹扫(4-碘-2-(三氟甲基)苯基)甲胺(3.0g，9.97mmol，1.0当量)、(1S,2S)-N1,N2-二甲基环己烷-1,2-二胺(0.31mL 1.99mmol，0.2当量)、抗坏血酸钠(197mg，1.00mmol，0.1当量)、碘化铜(285mg，1.49mmol，0.15当量)、叠氮化钠(1.30g，19.93mmol，2.0当量)、Et3N(1.67mL，11.96mmol，1.2当量)和2-(丙-2-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃(1.40g，9.97mmol，1.0当量)在甲醇(24mL)和水(6mL)中的混合物5分钟，并加热至55℃过夜。将反应混合物冷却至室温，并通过硅藻土塞过滤，并用甲醇(3x50mL)冲洗。将硅藻土加入滤液中并且减压除去溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，用硅胶(120g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至25％，得到(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(三氟甲基)苯基)甲胺(28，2.53g，71％)，为绿色油状物。LCMS m/z:针对C16H19N4O2F3计算的[M+H]+是357.2；发现值是357.1。
N-(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2(三氟甲基)苄基)甲基丙烯酰胺(29)的实验程序
Figure BDA0003279416310000852
将(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(三氟甲基)苯基)甲胺(28，1.0g，2.81mmol，1.0当量)和三乙胺(0.59mL，4.21mmol，1.5当量)在CH2Cl2(25mL)中的溶液短暂抽真空并用氮气吹扫。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.41mL，4.21mmol，1.5当量)。将反应混合物在室温下搅拌6小时。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(40g)纯化，使用己烷/EtOAc作为洗脱剂，从100％己烷开始，并将EtOAc的浓度逐渐增加至100％，得到N-(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2(三氟甲基)苄基)甲基丙烯酰胺(29，0.65g，55％产率)，为无色固体。LCMS m/z:针对C20H23N4O3F3计算的[M+H]+是425.2；发现值是425.1。
3-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙-1-胺(30)的实验程序
Figure BDA0003279416310000861
将3-叠氮基丙-1-胺盐酸盐(1.5g，14.98mmol，1.0当量)、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]-胺(1.99g，3.75mmol，0.25当量)、碘化铜(0.29g，1.50mmol，0.1当量)和三乙胺(0.52mL，3.75mmol，0.25当量)在甲醇(50mL)和水(6mL)中的混合物用氮气吹扫5分钟后冷却至0℃。添加2-(丙-2-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃(2.10g，14.98mmol，1.0当量)，并将反应混合物温热至55℃，并在氮气气氛下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，用硅藻土塞过滤，并用甲醇(3x50mL)冲洗。将硅藻土(20g)加入到滤液中，减压除去溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，在硅胶(120g)上纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至20％，得到3-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙-1-胺(30，2.36g，66％)。LCMS m/z:针对C11H20N4O2计算的[M+H]+是241.2；发现值是241.2。
N-(3-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基)甲基丙烯酰胺(31)的实验程序
Figure BDA0003279416310000871
将3-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙-1-胺(30，1.0g，4.16mmol，1.0当量)和三乙胺(0.58mL，4.16mmol，1.0当量)在CH2Cl2(20mL)中的溶液短暂抽真空并用氮气吹扫。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.40mL，4.16mmol，1.0当量)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱(40g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加到20％，得到N-(3-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基)甲基丙烯酰胺(31，0.96g，75％产率)，为无色油状物。LCMS m/z:针对C15H24N4O3计算的[M+H]+是309.2；发现值是309.4。
(4-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(32)的实验程序
Figure BDA0003279416310000872
用氮气吹扫(4-碘苯基)甲胺盐酸盐(2.64g，9.80mmol，1.0当量)、(1S,2S)-N1,N2-二甲基环己烷-1,2-二胺(0.31mL 1.96mmol，0.2当量)、抗坏血酸钠(198mg，0.98mmol，0.1当量)、碘化铜(279mg，1.47mmol，0.15当量)、叠氮化钠(1.27g，19.59mmol，2.0当量)、Et3N(1.64mL，11.75mmol，1.2当量)和3-(丙-2-炔-1-基氧基)氧杂环丁烷(9，1.10g，9.80mmol，1.0当量)在甲醇(24mL)和水(6mL)中的混合物5分钟，并加热至55℃过夜。将反应混合物冷却至室温，并通过硅藻土塞过滤，并用甲醇(3x50mL)冲洗。将硅藻土加入滤液中并且减压除去溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，在硅胶(120g)上纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至25％，得到(4-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(32，1.43g，56％)，为油状物。LCMS m/z:针对C13H16N4O2计算的[M+H]+是261.1346；发现值是261.1342。
N-(4-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(33)的实验程序
Figure BDA0003279416310000881
将(4-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(32，0.58g，2.23mmol，1.0当量)和三乙胺(0.47mL，3.34mmol，1.5当量)在CH2Cl2(20mL)中的溶液短暂抽真空并用氮气吹扫。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.32mL，3.34mmol，1.5当量)。将反应混合物在室温下搅拌6小时。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(24g)纯化，使用己烷/EtOAc作为洗脱剂，从100％己烷开始，并将EtOAc的浓度逐渐增加至100％，得到N-(4-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(33，0.48g，66％产率)，为无色固体。LCMS m/z:针对C17H20N4O3计算的[M+H]+是329.1608；发现值是329.1611。
乙基1-(2-甲基丙烯酸酰胺乙基)-1H-咪唑-4-甲酸酯(35)的实验程序
Figure BDA0003279416310000882
将1-(2-氨基乙基)-1H-咪唑-4-甲酸乙酯(34，2.0g，10.91mmol，1.0当量)和三乙胺(3.80mL，27.29mmol，2.5当量)在CH2Cl2(20mL)中的溶液短暂抽真空并用氮气吹扫。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(1.60mL，16.37mmol，1.5当量)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。添加十五(15)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱(40g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至25％，得到乙基1-(2-甲基丙烯酸酰胺乙基)-1H-咪唑-4-甲酸酯(35，1.28g，47％产率，为无色固体。LCMS m/z:针对C12H17N3O3计算的[M+H]+是252.1；发现值是252.1。
N-(4-(1,1-二氧化硫代吗啉)苄基)甲基丙烯酰胺(37)的实验程序
Figure BDA0003279416310000891
向4-(4-(氨基甲基)苯基)硫代吗啉、1,1-二氧化物盐酸盐(36，1.15g，4.15mmol，1.0当量)和三乙胺(1.39mL，9.97mmol，2.4当量)在CH2Cl2(80mL)中的溶液，以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯溶液(0.43mL，4.36mmol，1.05当量，在CH2Cl2中，5mL)。将反应混合物在室温下搅拌22小时。添加八(8)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱(80g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至3.75％，得到N-(4-(1,1-二氧化硫代吗啉)苄基)甲基丙烯酰胺(37，0.32g，25％产率)，为固体。
N-甲基-N-(2-(甲基磺酰基)乙基)丙-2-炔-1-胺(38)的实验程序
Figure BDA0003279416310000892
向1-甲基磺酰基乙烯(4.99g，47.03mmol，4.13mL)和Amberlyst-15((30％w/w))的混合物中，以逐滴方式添加N-甲基丙-2-炔-1-胺(2.6g，37.62mmol)。将混合物在室温下搅拌12小时。过滤除去催化剂，并且减压浓缩滤液，得到：N-甲基-N-(2-(甲基磺酰基)乙基)丙-2-炔-1-胺(38，6.43g，98％)，为油状物。LCMS m/z:针对C7H13NSO2计算的[M+H]+是176.11；发现值是176.1。
N-((1-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-N-甲基-2-(甲基磺酰基)乙-1-胺(40)的实验程序
Figure BDA0003279416310000893
将N-甲基-N-(2-(甲基磺酰基)乙基)丙-2-炔-1-胺(38，5.02g，28.64mmol，1.25当量)、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]-胺(3.04g，5.73mmol，0.25当量)、碘化铜(436mg，2.29mmol，0.1当量)和三乙胺(0.8mL，5.7mmol，0.25当量)在甲醇(50mL)和水(6mL)中的混合物抽真空并用氮气冲洗(3次)并用冰浴冷却。以逐滴方式添加2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(39，5.02g，22.91mmol，1.0当量)，移去冷却浴，并且将混合物搅拌5分钟。将反应物温热至55℃，并在氮气气氛下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，添加硅藻土(20g)，并减压浓缩。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，在硅胶(220g)上纯化粗产物。(含有12％(v/v)水性氢氧化铵的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至25％，以得到呈油状物的N-((1-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-N-甲基-2-(甲基磺酰基)乙-1-胺(40，4.98g，55％)。LCMS m/z:针对C15H31N5O5S计算的[M+H]+是394.2；发现值是394.2。
N-(2-(2-(2-(2-(4-((甲基(2-(甲基磺酰基)乙基)氨基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)甲基丙烯酰胺(41)的实验程序
Figure BDA0003279416310000901
向N-((1-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-N-甲基-2-(甲基磺酰基)乙-1-胺(40，1.0g，2.54mmol，1.0当量)和三乙胺(0.43mL，3.05mmol，1.2当量)在CH2Cl2(15mL)中的溶液以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯溶液(0.30mL，3.05mmol，1.5当量)。将反应混合物在室温下搅拌5小时。添加硅藻土并且减压除去溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱(40g)纯化残余物。(含12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至12.5％，得到N-(2-(2-(2-(2-(4-((甲基(2-(甲基磺酰基)乙基)氨基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)甲基丙烯酰胺(41，0.86g，73％产率)，为油状物。LCMS m/z:针对C19H35N5O6S计算的[M+H]+是462.2；发现值是462.2。
7-(丙-2-炔-1-基)-2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬烷(42)的实验程序
Figure BDA0003279416310000911
将3-溴-1-炔(4.4mL，39.32mmol，1.0当量)加入到2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬烷(8.54g，39.32mmol，1.0当量)、碳酸钾(17.9g，129.7mmol，3.3当量)在甲醇(200mL)中的混合物中并在室温下搅拌过夜。过滤混合物，添加硅藻土，并且减压除去溶剂。使用二氯甲烷/甲醇作为流动相，通过硅胶色谱(220g)纯化残余物。甲醇浓度从0％逐渐增加至5％，得到7-(丙-2-炔-1-基)-2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬烷(42，4.44g，68％)，为油状物。
2-(2-(2-(2-(4-((2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(43)的实验程序
Figure BDA0003279416310000912
用冰浴冷却7-(丙-2-炔-1-基)-2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬烷(42，2.5g，15.13mmol，1.0当量)、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]-胺(1.77g，3.33mmol，0.22当量)、碘化铜(288mg，1.51mmol，0.1当量)和三乙胺(0.53mL，3.8mmol，0.25当量)在甲醇(50mL)中的混合物。以逐滴方式添加2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(39，3.86g，17.70mmol，1.17当量)，移去冷却浴，并且将混合物搅拌5分钟。将反应物温热至55℃，并在氮气气氛下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，添加硅藻土(10g)，并减压浓缩。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，在硅胶(220g)上纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至10％，得到2-(2-(2-(2-(4-((2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(43，4.76g，82％)，为油状物。LCMS m/z:针对C18H33N5O4计算的[M+H]+是384.3；发现值是384.2。
N-(2-(2-(2-(2-(4-((2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)甲基丙烯酰胺(44)的实验程序
Figure BDA0003279416310000921
在氮气气氛下用冰浴冷却2-(2-(2-(2-(4-((2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(43，2.65g，6.91mmol，1.0当量)和三乙胺(1.16mL，8.29mmol，1.2当量)在CH2Cl2(100mL)中的溶液。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.74mL，7.6mmol，1.1当量)。移去冷却浴，并且将反应混合物在室温下搅拌4小时。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/甲醇作为流动相，通过硅胶色谱(120g)纯化残余物。甲醇浓度从0％逐渐增加到10％，得到N-(2-(2-(2-(2-(4-((2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)甲基丙烯酰胺(44，1.50g，48％产率)，为无色油状物。LCMS m/z:针对C22H37N5O5计算的[M+H]+是452.29；发现值是452.25。
4-((1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)硫代吗啉1,1-二氧化物(45)的实验程序
Figure BDA0003279416310000922
将4-(丙-2-炔-1-基)硫代吗啉1,1-二氧化物(1.14g，6.58mmol，1.0当量)、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]-胺(768mg，1.45mmol，0.22当量)、碘化铜(125mg，0.66mmol，0.1当量)和三乙胺(0.23mL，1.65mmol，0.25当量)在甲醇(20mL)中的混合物用冰浴冷却。以逐滴方式添加2-(2-叠氮基乙氧基)乙-1-胺(1.00g，7.70mmol，1.17当量)，移去冷却浴，并且将混合物搅拌5分钟。将反应物温热至55℃，并在氮气气氛下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，添加硅藻土(10g)，并减压浓缩。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，在硅胶(40g)上纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至9.5％，得到4-((1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)硫代吗啉1,1-二氧化物(45，1.86g，93％)，为白色固体。LCMS m/z:针对C11H21N5O4S计算的[M+H]+是304.1438；发现值是304.1445。
N-(2-(2-(4-((1,1-二氧化硫代吗啉)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙基)甲基丙烯酰胺(46)的实验程序
Figure BDA0003279416310000931
在氮气气氛下用冰浴冷却4-((1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)硫代吗啉1,1-二氧化物(45，1.32g，4.35mmol，1.0当量)和三乙胺(0.73mL，5.22mmol，1.2当量)在CH2Cl2(100mL)中的溶液。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.47mL，4.8mmol，1.1当量)。移去冷却浴，并且将反应混合物在室温下搅拌4小时。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱(120g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至1.25％，得到N-(2-(2-(4-((1,1-二氧化硫代吗啉)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙基)-甲基丙烯酰胺(46，0.90g，56％产率)，为无色油状物。LCMS m/z:针对C15H25N5O4S计算的[M+H]+是372.17；发现值是372.15。
4-((1-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)硫代吗啉1,1-二氧化物(47)的实验程序
Figure BDA0003279416310000932
将4-(丙-2-炔-1-基)硫代吗啉1,1-二氧化物(4.6g，26.55mmol，1.0当量)、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]-胺(3.1g，5.84mmol，0.22当量)、碘化铜(506mg，2.66mmol，0.1当量)和三乙胺(0.93mL，6.64mmol，0.25当量)在甲醇(80mL)中的混合物用冰浴冷却。以逐滴方式添加2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(5.00g，28.68mmol，1.08当量)，移去冷却浴，并且将混合物搅拌5分钟。将反应物温热至55℃，并在氮气气氛下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，添加硅藻土，并减压浓缩。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，在硅胶(220g)上纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至10％，得到4-((1-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)硫代吗啉1,1-二氧化物(47，5.26g，57％)，为淡黄色固体。LCMS m/z:针对C13H25N5O4S计算的[M+H]+是348.1700；发现值是348.1700。
N-(2-(2-(2-(4-((1,1-二氧化硫代吗啉)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)甲基丙烯酰胺(48)的实验程序
Figure BDA0003279416310000941
在氮气气氛下用冰浴冷却4-((1-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)硫代吗啉1,1-二氧化物(47，1.49g，4.29mmol，1.0当量)和三乙胺(0.72mL，5.15mmol，1.2当量)在CH2Cl2(50mL)中的溶液。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.46mL，4.7mmol，1.1当量)。移去冷却浴，并且将反应混合物在室温下搅拌4小时。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/甲醇作为流动相，通过硅胶色谱(80g)纯化残余物。甲醇浓度从0％逐渐增加到5％，得到N-(2-(2-(2-(4-((1,1-二氧化硫代吗啉)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)-甲基丙烯酰胺(48，0.67g，38％产率)，为无色油状物。LCMS m/z:针对C17H29N5O5S计算的[M+H]+是416.20；发现值是416.20。
4-((1-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)硫代吗啉1,1-二氧化物(49)的实验程序
Figure BDA0003279416310000951
将4-(丙-2-炔-1-基)硫代吗啉1,1-二氧化物(5.0g，28.86mmol，1.0当量)、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]-胺(3.37g，6.35mmol，0.22当量)、碘化铜(550mg，2.89mmol，0.1当量)和三乙胺(1.01mL，7.22mmol，0.25当量)在甲醇(90mL)中的混合物用冰浴冷却。以逐滴方式添加14-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-胺(8.86g，33.77mmol，1.17当量)，移去冷却浴并将混合物搅拌5分钟。将反应物温热至55℃，并在氮气气氛下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，添加硅藻土(15g)，并减压浓缩。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，在硅胶(220g)上纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加到10％，得到4-((1-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)硫代吗啉1,1-二氧化物(49，7.56g，60％)，为油状物。LCMS m/z:针对C17H33N5O6S计算的[M+H]+是436.2224；发现值是436.2228。
N-(14-(4-((1,1-二氧化硫代吗啉)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十四基)甲基丙烯酰胺(50)的实验程序
Figure BDA0003279416310000952
在氮气气氛下用冰浴冷却4-((1-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)硫代吗啉1,1-二氧化物(49，1.95g，4.79mmol，1.0当量)和三乙胺(0.80mL，5.74mmol，1.2当量)在CH2Cl2(50mL)中的溶液。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.51mL，5.26mmol，1.1当量)。移去冷却浴，并且将反应混合物在室温下搅拌4小时。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/甲醇作为流动相，通过硅胶色谱(80g)纯化残余物。甲醇浓度从0％逐渐增加至5％，得到N-(14-(4-((1,1-二氧化硫代吗啉)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十四基)甲基丙烯酰胺(50，0.76g，32％产率)，为无色油状物。LCMS m/z:针对C21H37N5O7S计算的[M+H]+是504.25；发现值是504.20。
实例4A：制备示例性、修饰的聚合物
1A.经化学修饰的聚合物。在形成本文所述的装置(例如，水凝胶胶囊)之前，可以用具有式(I)的化合物(或其药学上可接受的盐)对聚合物材料进行化学修饰。以上在实例3中概述了用于修饰聚合物材料的示例性化合物的合成方案。这些化合物或其他化合物可用于化学修饰任何聚合物材料。
例如，在藻酸盐的情况下，藻酸盐羧酸被活化以与一个或多个胺官能化化合物偶联，以获得用去纤维化化合物(例如具有式(I)的化合物)修饰的藻酸盐。将藻酸盐聚合物溶于水(30mL/g聚合物)中，并用2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(0.5当量)和N-甲基吗啉(1当量)处理。向该混合物中添加目的化合物(例如，表3中所示的化合物101)在乙腈(0.3M)中的溶液。
添加的化合物和偶联试剂的量取决于与藻酸盐结合的化合物的所希望的浓度，例如缀合密度。化合物101的中等缀合密度典型地在从2％至5％N的范围，而化合物101的高缀合密度典型地在从5.1％至8％N的范围。为制备CM-LMW-Alg-101-中等聚合物溶液，将溶解的未经修饰的低分子量藻酸盐(大约MW<75kDa，G:M比率≥1.5)用2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(5.1mmol/g藻酸盐)和N-甲基吗啉(10.2mmol/g藻酸盐)和化合物101(5.4mmol/g藻酸盐)处理。为制备CM-LMW-Alg-101-高聚合物溶液，将溶解的未经修饰的低分子量藻酸盐(大约MW<75kDa，G:M比率≥1.5)用2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(5.1mmol/g藻酸盐)和N-甲基吗啉(10.2mmol/g藻酸盐)和化合物101(10.5mmol/g藻酸盐)处理。
将反应温热至55℃，保持16小时，然后冷却至室温，并且经由旋转蒸发轻轻浓缩，然后将残余物溶于水中。将混合物通过氰基修饰的硅胶床(Silicycle)过滤，并且将滤饼用水洗涤。然后将所得溶液彻底透析(10,000MWCO膜)并经由冷冻干燥浓缩藻酸盐溶液以提供所希望的作为固体的经化学修饰的藻酸盐或使用适于产生粘度为25cP至35cP的经化学修饰的藻酸盐溶液的任何技术浓缩。
通过对氮百分比进行燃烧分析来测量经化学修饰的藻酸盐的缀合密度。通过将经化学修饰的藻酸盐溶液对水(10,000MWCO膜)透析24小时，将水置换两次，然后冻干至恒重来制备样品。
用于在产生下文所述的包封工程化的ARPE-19细胞的示例性水凝胶胶囊中使用，用如下制备经化学修饰的藻酸盐聚合物：中等密度(2％至5％N)或高密度(5.1％至8％N)的缀合至低分子量藻酸盐(大约MW<75kDa，G:M比率≥1.5)的化合物101(显示在表3中)，如通过对氮百分比进行燃烧分析所测定的，并且在本文中被称为CM-LMW-Alg-101-中等和CM-LMW-Alg-101-高。
1B.CBP-藻酸盐。在形成本文所述的装置(例如，本文所述的水凝胶胶囊)之前，可以使用本领域已知的方法用细胞结合肽对聚合物材料进行共价修饰，参见例如Jeon O等人,Tissue Eng Part A.[组织工程部分A]16:2915-2925(2010)和Rowley,J.A.等人,Biomaterials[生物材料]20:45-53(1999)。
例如，在藻酸盐的情况下，用50mM的含0.5M NaCl的2-(N-吗啉代)-乙磺酸水合物缓冲溶液在pH 6.5下制备藻酸盐溶液(1％，w/v)，并依次与N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺(EDC)混合。N-羟基琥珀酰亚胺与EDC的摩尔比是0.5:1.0。将目的肽添加到藻酸盐溶液中。添加的肽和偶联试剂的量取决于与藻酸盐结合的肽的所希望的浓度，例如肽缀合密度。通过增加肽和偶联试剂的量，可以获得更高的缀合密度。反应24h后，将反应物通过超纯去离子水(diH2O)(MWCO 3500)透析3天进行纯化，用活性炭处理30min，过滤(0.22mm过滤器)，并浓缩至所希望的粘度。
通过对氮百分比进行燃烧分析来测量经肽修饰的藻酸盐的缀合密度。通过将经化学修饰的藻酸盐溶液对水(10,000MWCO膜)透析24小时，将水置换两次，然后冻干至恒重来制备样品。
在另一个实施例中，经肽修饰的藻酸盐的缀合密度是使用如实例7以及任选地实例8中描述的定量肽缀合测定测量的。
实例4B：制备用于制造水凝胶胶囊的示例性藻酸盐溶液
经化学修饰的和未经修饰的藻酸盐的70:30混合物。将低分子量藻酸盐(PRONOVATMVLVG藻酸盐，NovaMatrix，桑维卡，挪威(Sandvika,Norway)，目录号4200506，大约分子量<75kDa；G:M比率≥1.5)用表2中的化合物101进行化学修饰以产生经化学修饰的低分子量藻酸盐(CM-LMW-Alg-101)溶液，如通过下文所述的对氮百分比进行的燃烧分析所测定的，粘度为25cp至35cP，并且缀合密度为5.1％至8％N。通过在0.9％盐水中以3％重量:体积溶解未经修饰的藻酸盐(PRONOVATMSLG100，NovaMatrix，桑维卡，挪威，目录号4202106，近似分子量为150kDa-250kDa)制备高分子量的未经修饰的藻酸盐(U-HMW-Alg)的溶液。将CM-LMW-Alg溶液与U-HMW-Alg溶液以70％CM-LMW-Alg比30％U-HMW-Alg的体积比混合(此处称为70:30CM-Alg:UM-Alg溶液)。
未经修饰的藻酸盐溶液。将未经修饰的中等分子量藻酸盐(SLG20，NovaMatrix，桑维卡，挪威，目录号4202006，近似分子量为75-150kDa)以1.4％重量比体积溶解在0.9％盐水中以制备U-MMW-Alg溶液。
包含细胞结合位点的藻酸盐溶液。将SLG20藻酸盐的溶液用由GRGDSP(SEQ ID NO:49)组成的肽修饰，并且浓缩至如以上实例4A所述的约100cP粘度。在实施例中，如通过以上实例4A中所述的燃烧分析测量的，选择GRGDSP肽(SEQ ID NO:49)和偶联试剂的量以实现目标肽缀合密度为约0.2至0.3。在另一个实施例中，选择所用的中等分子量藻酸盐(大约分子量为75-150kDa，G:M比率为高于或等于1.5)、GRGDSP肽(SEQ ID NO:49)和偶联试剂的量以制备GRGDSP-MMW-Alg溶液(“GRGDSP”披露为SEQ ID NO:49)，其中目标肽缀合密度为在盐水中0.3至0.6微摩尔的GRGDSP(SEQ ID NO:49)/克的GRGDSP-MMW-Alg(“GRGDSP”披露为SEQID NO:49)，粘度为80-120cP。
实例5：示例性两隔室水凝胶胶囊的形成
根据以下所述的方案，将工程化的ARPE-19细胞的悬浮液作为单个细胞包封在两隔室水凝胶胶囊中。
临包封之前，将工程化的ARPE-19细胞以1,400r.p.m离心1min，并用无钙Krebs-Henseleit(KH)缓冲液(4.7mM KCl、25mM HEPES、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4×7H2O、135mMNaCl，pH≈7.4，≈290mOsm)洗涤。洗涤后，再次离心细胞，吸出所有上清液。按希望的细胞密度(例如，约5000万至1.5亿个悬浮的单个细胞/ml藻酸盐溶液)，将细胞沉淀重悬浮于实例4B所述的经GRGDSP修饰的藻酸盐溶液(“GRGDSP”披露为SEQ ID NO:49)中。
在制备水凝胶胶囊之前，通过使用无菌工艺通过0.2-μm过滤器过滤来对缓冲液和藻酸盐溶液进行灭菌。
为了制备配置为直径约1.5mm的两隔室水凝胶毫胶囊的颗粒，如下设置静电液滴发生器：ES系列0-100kV，20瓦高压发电机(EQ系列，松山(Matsusada)，北卡罗莱纳州，美国)连接到同轴针头的顶部和底部(内腔22G，外腔18G，Ramé-Hart仪器公司(Ramé-HartInstrument Co.)，Succasunna，新泽西州，美国)。将内腔附接到第一5ml Luer-lock注射器(BD公司，新泽西州，美国)，该注射器连接到垂直定向的注射泵(Pump 11Pico Plus，哈佛设备公司(Harvard Apparatus)，Holliston，马萨诸塞州，美国)。外腔经由鲁尔接头连接到第二5毫升Luer-lock注射器，该注射器连接到水平定向的第二注射泵(Pump 11Pico Plus)。将悬浮于经GRGDSP修饰的藻酸盐溶液(“GRGDSP”披露为SEQ ID NO:49)中的包含工程化的FVII-ARPE-19细胞(作为单个细胞)的第一藻酸盐溶液放置于该第一注射器中，并且将包含经化学修饰的藻酸盐和未经修饰的藻酸盐的混合物的无细胞藻酸盐溶液放置于该第二注射器中。两个注射泵使第一和第二藻酸盐溶液从注射器移动通过同轴针的两个腔，并且含有藻酸盐溶液的单个液滴从针头挤出到含有交联溶液的玻璃皿中。每个Pico Plus注射泵的设置直径为12.06mm，并且调节每个泵的流速以使两种藻酸盐溶液的流速比为1:1。因此，在总流速设置为10ml/h的情况下，每种藻酸盐溶液的流速约为5mL/h。以相同方式制备对照(空)胶囊，除了用于内隔室的藻酸盐溶液是无细胞溶液之外。
在挤出所希望的体积的藻酸盐溶液后，将藻酸盐液滴在交联溶液(包含25mMHEPES缓冲液、20mM BaCl2、0.2M甘露醇和0.01％泊洛沙姆188)中交联五分钟。通过移液到锥形管中收集落到交联容器底部的胶囊。在胶囊沉降在管中后，除去交联缓冲液，并洗涤胶囊。可将不含有细胞的胶囊用HEPES缓冲液(NaCl 15.428g，KCl 0.70g，MgCl2·6H2O0.488g，0ml HEPES(1M)缓冲溶液(吉博科生命技术公司(Gibco,Life Technologies)，加利福尼亚州，美国)，在2升去离子水中)洗涤4次并储存在4℃直至使用。可将包封细胞的胶囊在HEPES缓冲液中洗涤四次，在0.9％盐水中洗涤两次，在培养基中洗涤两次，并储存在37℃的培养箱中。
可以检查两隔室的组合物中胶囊的质量。例如，从组合物中取出含有至少200个胶囊的等分试样并转移到孔板中，并且通过光学显微镜通过计算总数中球形胶囊的数量检查整个等分试样的质量。
实例6A：用于递送FVII蛋白的示例性胶囊
基本上如实例5中所述，通过同轴针挤出第一和第二藻酸盐溶液来制备包封用编码FVII蛋白的转录单位稳定转染的ARPE-19细胞(ARPE19:FVII)的两隔室水凝胶毫胶囊的组合物。第二(外)隔室由70:30CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg溶液(实例4B)形成，并且第一(内)隔室由U-MMW-Alg溶液(实例4B)或GRGDSP-MMW-Alg溶液(“GRGDSP”披露为SEQ IDNO:49)形成，粘度为80至120cP，并且GRGDSP(SEQ ID NO:49)缀合密度范围是：0.12至1.98微摩尔(μmol)GRGDSP(SEQ ID NO:49)/克GRGDSP-MMW-Alg(“GRGDSP”披露为SEQ ID NO:49)(实例4B)。用于形成内隔室的未经修饰和GRGDSP-藻酸盐溶液(“GRGDSP”披露为SEQ ID NO:49)各自含有ARPE19:FVII细胞的悬浮液，按约4000万个细胞/ml藻酸盐溶液。
将每种胶囊组合物的0.5mL等分试样植入裸鼠的IP空间(每种组合物2或3只小鼠)。在植入后13天，处死动物，并从每只小鼠收集血液样品。通过ELISA测量这些样品中FVII的血浆水平；结果示于图10中。
植入了含有GRGDSP-藻酸盐(SEQ ID NO:49)的胶囊(缀合密度为0.38至1.98μmol/g)的小鼠中的血浆FVII水平高于植入了含有未经修饰的藻酸盐或GRGDSP-藻酸盐(SEQ IDNO:49)的胶囊(缀合密度为0.12或0.21μmol/g)的小鼠中的情况。
实例6B：在植入包封的用不同示例性FVII表达载体工程化的ARPE-19细胞后的体内FVII表达。
通过将ARPE-19细胞与含有转座酶质粒连同FVII表达载体的PiggyBac共转染来建立FVII分泌细胞，并将稳定转染的细胞(ARPE19:FVII细胞)在含有嘌呤霉素的完全生长培养基中培养。FVII表达载体是上述实例1中描述的FVII-7表达载体或下表4中描述的FVII-9表达载体。FVII-9表达载体具有两个核苷酸序列相同的串联转录单位，不同之处在于上游转录单位(相对于5’ITR)中的启动子由CAG启动子(SEQ ID NO:10)组成，并且下游转录单位中的启动子由CBh启动子(SEQ ID NO:21)组成。
表5：FVII-9表达载体(SEQ ID NO:22)
Figure BDA0003279416310001011
基本上如实例5中所述，通过同轴针挤出第一和第二藻酸盐溶液来制备包封ARPE19:FVII-7细胞或ARPE19:FVII-9细胞的两隔室水凝胶毫胶囊的组合物。第二(外)隔室由70:30CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg溶液(实例4B)形成，并且第一(内)隔室由U-MMW-Alg溶液(实例4B)或GRGDSP-MMW-Alg溶液(“GRGDSP”披露为SEQ ID NO:49)形成，粘度为80至120cP，并且GRGDSP(SEQ ID NO:49)缀合密度为0.44微摩尔(μmol)GRGDSP(SEQ ID NO:49)/克GRGDSP-MMW-Alg(“GRGDSP”披露为SEQ ID NO:49)(实例4B)。用于形成内隔室的GRGDSP-藻酸盐溶液(“GRGDSP”披露为SEQ ID NO:49)各自含有ARPE19:FVII细胞的悬浮液，按约4000万个细胞/ml藻酸盐溶液。
将每种胶囊组合物的0.250mL等分试样植入裸鼠的IP空间(每种组合物4只小鼠)。在植入后6天，处死动物，并从每只小鼠收集血液样品。通过ELISA测量这些样品中FVII的血浆水平；结果示于图11中。
植入了含有用FVII-9表达载体转染的ARPE-19细胞的胶囊的小鼠中的血浆FVII水平高于植入了含有用FVII-7表达载体转染的ARPE-19细胞的胶囊的小鼠中的情况。
实例7：示例性定量肽缀合测定。
该测定通过将CBP聚合物的样品进行酸水解来确定CBP聚合物中肽的量，该酸水解将CBP作为个体氨基酸切割。通过预柱在线衍生化和反相液相色谱-紫外-荧光(LC-UV-FLR)(改编自安捷伦(Agilent)Biocolumns氨基酸分析“How-To”指南，安捷伦科技公司(AgilentTechnologies,Inc.)，5991-7694EN，2018年3月1日发布)，使用氨基酸参比品对水解样品中的各个氨基酸进行分离和定量)。伯AA(例如除脯氨酸外的全部20个标准L-α氨基酸)用邻苯二醛(OPA)衍生，且仲AA(例如脯氨酸)用9-氯甲酸芴甲酯(FMOC)衍生。然后平均每种氨基酸的摩尔浓度以计算样品中总肽的浓度。可以通过使用任何合适的分析技术(例如，如实例8中所述)确定CBP-聚合物的未水解样品中的肽的量，并将该量从总肽量中减去，来针对CBP-聚合物中任何残留未缀合的CBP的存在校正浓度。
该测定在下文进一步描述，用于确定GRGDSP-藻酸盐(SEQ ID NO:49)中的肽缀合的密度；然而，本领域技术人员可以容易地修改该测定以确定GRGDSP-藻酸盐(SEQ ID NO:49)或其他肽修饰的聚合物中的肽浓度，条件是未经修饰的聚合物不包含任何氨基酸。同样，技术人员可以容易地用可以在测定中执行或提供基本上相同的功能或作用的不同的装备、材料或化学物质代替以下指定的任何装备、材料或化学物质。
定义
Figure BDA0003279416310001021
Figure BDA0003279416310001031
装备
·安捷伦1260LC系统
·安捷伦二极管阵列检测器(G1315D)：13μL/10mm流通池
·安捷伦荧光检测器(G1321B)
·AdvanceBio AA LC柱，2.7μm，4.6x100mm，安捷伦655950-80
·AdvanceBio AAA保护柱，2.7μm，4.6x5mm，安捷伦820750-931
AA标准品(17AA)：25pmol/μL n/a 安捷伦5061-3333 2℃-8℃
AA标准品(17AA)：100pmol/μL n/a 安捷伦5061-3332 2℃-8℃
AA标准品(17AA)：250pmol/μL n/a 安捷伦5061-3331 2℃-8℃
程序
制备10mM Na2HPO4/Na2B4O7/pH 8.2(水性流动相)和45/45/10ACN/MeOH/水(有机流动相)溶液，用于在LC/MS程序中使用。
示例性冻干肽-藻酸盐缀合物的样品的酸水解
·称量12至16mg冻干的肽-藻酸盐缀合物至微波反应小瓶中，确保该样品未被搅动。
·根据下面的步骤3.3.2-3.3.19水解
冻干的肽-藻酸盐缀合物的示例性样品在盐溶液中的酸水解
·称量1000±50mg在盐水中的肽-藻酸盐缀合物溶液至微波反应小瓶中
·使用10-mL移液管或容量吸管和搅拌棒将10.0mL 6N HCl添加至样品，并用压折器密封PTFE内衬盖
·将每个样品小瓶放置在热/搅拌板上的匹配加热块中
·在120℃加热，以400rpm搅拌，持续6小时
·去除加热并冷却至环境温度
·取下盖子并用一次性移液管将整个溶液从反应瓶中移至20mL容量瓶中
·用移液管吸取2mL的LCMS级水到空的反应瓶中，用相同的一次性移液管彻底冲洗内壁，然后将冲洗液完全移入同一20mL容量瓶中
·将以上步骤重复两次
·用LCMS级水加至容量瓶的刻度
·盖上盖子并颠倒烧瓶多次以混合均匀
·完全移入50mL离心管中
·以5000rpm离心10分钟
·准确吸取1mL上清液到LC小瓶中，并保存在2℃-8℃直到干燥(例如，第二天)(如果需要，将剩余的上清液保存在2℃-8℃以进行任何重复测试)
·在60℃的氮气下完全干燥1mL上清液，确保针不接触样品，但足够低以快速干燥样品
·吸取0.25mL的0.1μmol/mL内标混合物到装有干燥样品的小瓶中
·彻底涡旋
·用移液器转移到带有LC瓶插入件的LC小瓶中
·储存在2℃-8℃，直到HPLC分析(步骤3.6)
标准品制备
AA标准品储备溶液：10μmol/mL
·对于每种AA，基于MW计算制备10μmol/mL储备溶液所需的重量
·参见如下实例：
Figure BDA0003279416310001051
·将计算出的重量称入50mL容量瓶中
·溶解并用0.1N HCl标记
·通过加盖，倒置或涡旋以混合均匀
·储存在2℃-8℃，直到HPLC分析(步骤3.6)
内标混合物：1μmol/mL
·在相同的10mL容量瓶中，精确吸取1.0mL正缬氨酸储备溶液(10μmol/mL)和1.0mL肌氨酸储备溶液(10μmol/mL)
·用0.1N HCl标记
·通过加盖，倒置或涡旋以混合均匀
·储存在2℃-8℃，直到HPLC分析(步骤3.6)
内标混合物：0.1μmol/mL
注意：该溶液用于干燥后重构样品
·精确吸取1.0mL内标混合物(1μmol/mL)到10-mL容量瓶中
·用0.1N HCl标记
·通过加盖，倒置或涡旋以混合均匀
·储存在2℃-8℃，直到HPLC分析(步骤3.6)
5AA混合物(+iSTD 0.1):0.025/0.1/0.25μmol/mL
·精确吸取xxμL(参见下表)的D、S、G、R、N-iSTD、S-iSTD、和P(10μmol/mL)溶液到同一10-mL容量瓶中
·用0.1N HCl标记
·通过加盖，倒置或涡旋以混合均匀
·储存在2℃-8℃，直到HPLC分析(步骤3.6)
Figure BDA0003279416310001061
17AA标准品(+iSTD 0.1)混合物：0.1μmol/mL
·破开0.1μmol/mL 17AA标准品溶液的安瓿
·精确吸取0.9mL的AA标准品混合物到LC小瓶中
·Into the same LC vial，精确吸取100μL的iSTD混合物(1μmol/mL)到同一LC小瓶中
·涡旋混合均匀
·将NLT 100μL等分到带有LC瓶插入件的LC小瓶中
·储存在2℃-8℃，直到HPLC分析(步骤3.6)
HPLC条件
Figure BDA0003279416310001071
Figure BDA0003279416310001081
系统适用性标准
在标准进样中分析定量中使用的每种目的AA(D/S/G/R)和内标(诺华林和肌氨酸)的保留时间和峰面积(UV和FLR两者)。
Figure BDA0003279416310001082
Figure BDA0003279416310001091
数据分析-仅在系统适用性合格时才分析样品
目的AA的鉴定
·17AA(+iSTD)标准品混合物中目的AA和内标的RT应当与5AA(+iSTD)标准品混合物中的RT匹配
·每个样品中AA的RT应与标准品的RT相匹配(UV/FLR)
相对面积(D,S,G,R)＝面积(D,S,G,R)/面积(正缬氨酸)
相对面积(P)＝面积(P)/面积(肌氨酸)
标准校正曲线
·使用分析证书上的报告值或在标准品制备过程中通过稀释因子调整的实际重量计算标准品溶液的浓度。
·绘制标准进样中每种目的AA的平均面积或平均相对面积与浓度的关系图：0.025、0.1、和0.25μmol/mL。执行线性回归。
浓度＝m*面积或相对面积+b
其中，m是线性拟合曲线的斜率，且b是线性拟合曲线的Y轴截距。
·RSQ不应小于0.99。
·如果线性度失败，请准备新鲜的衍生化试剂/标准品溶液，并对系统故障进行故障排除并重复测试。
样品分析
·可以通过UV和FLR进行定量
·使用相对面积(相对于内标的面积比)进行定量
·使用线性拟合标准曲线计算每个样品中AA的浓度：G、R、D、S：
AA浓度(μmol/mL)＝(m*面积或相对面积+b)
·通过平均每种AA的浓度，计算总GRGDSP(SEQ ID NO:49)的浓度：
总GRGDSP(SEQ ID NO:49)浓度(μmol/mL)＝
(G/2浓度+R浓度+D浓度+S浓度+P浓度)/5
μmol(总GRGDSP(SEQ ID NO:49))/g(缀合物)＝
总GRGDSP(SEQ ID NO:49)浓度(μmol/mL)x0.25mL/1.0mL x20mL/重量(g)
μmol(缀合的GRGDSP(SEQ ID NO:49))/g(缀合物)＝
μmol(总GRGDSP(SEQ ID NO:49))/g(缀合物)-μmol(残留的游离GRGDSP(SEQ IDNO:49))/g(缀合物)
实例8：确定CBP-聚合物组合物中残留游离肽的示例性测定
这项测定使用液相色谱-质谱(LC-MS)来确定包含肽-聚合物缀合物的组合物中残留的未缀合肽的数量，例如典型地在执行一个或多个纯化步骤以去除大部分后，例如，大于95％、98％、99％或更多的未缀合的肽进行。简而言之，将盐溶液中的缀合物样品添加到分子量截断(MWCO)管中，MWCO高于肽的分子量，将管离心以从缀合物中分离出残留的肽，并且使用包含已知浓度的相同肽的参比组合物作为标准品，通过LC-MS对肽的量进行定量。
实例9：示例性定量胺测定以测量经具有式(I)的化合物修饰的去纤维化聚合物中的胺-缀合密度。
该测定确定了经胺化合物化学修饰的聚合物中含胺化合物(例如，具有式I的化合物，例如表3中的化合物101)的量。将经化学修饰的聚合物的样品进行裂解缀合胺的酸水解，并且使用非缀合胺化合物作为标准品通过反相液相色谱和紫外检测(LC-UV)定量分析水解的样品中总胺的重量％。LC峰的身份可以通过质谱法进一步确认。总胺的重量％可以用作经化学修饰的聚合物中胺化合物的％缀合。通过使用任何合适的方法(例如，如下所述)测定经化学修饰的聚合物的未水解样品中任何残留的未缀合的胺化合物的量并从总肽量中减去该量，可以获得更精确的结果。
该测定在下面进一步描述，用于测定用化合物101(即，CM-LMW-Alg-101)化学修饰的藻酸盐中的％缀合密度；然而，本领域技术人员可以容易地修改测定，以确定用于化学修饰多糖(例如，藻酸盐)或不包含胺的另一种聚合物的任何具有式I的化合物的缀合密度。同样，技术人员可以容易地用可以在测定中执行或提供基本上相同的功能或作用的不同的装备、材料或化学物质代替以下指定的任何装备、材料或化学物质。
定义
缩写 定义
LC-UV-MS 液相色谱-紫外-质谱分析
VLVG Pronova Ultrapure VLVG藻酸钠
SLG100 Pronova Ultrapure无菌藻酸盐
TIC 总离子色谱图
SST 系统适用性
RSD 相对标准差
m/z 质荷比
装备
·安捷伦1260LC系统(DAD:13μL/10mm流通池)
·安捷伦SQ MS检测器(G1956B)
·XBridge C18，2.5μm，4.6x50mm，沃特世(Waters)186006037
·小分子参比材料(表3中的未缀合的、游离胺形式的化合物101；>98.0％纯度)
程序
制备水溶液中0.1％氨(水性流动相)和ACN溶液中0.1％氨(有机流动相)，用于在LC程序中使用。
示例性固体小分子-藻酸盐缀合物样品的酸水解
·称量50±5mg冻干的小分子-藻酸盐缀合物固体至微波反应小瓶中，确保该样品未被搅动
·使用10-mL移液管或容量吸管和搅拌棒添加10.0mL 2N HCl，并用压折器密封PTFE内衬盖
·将每个样品小瓶放置在热/搅拌板上的匹配加热块中，并且在120℃下加热，以400rpm搅拌120分钟
·去除加热并冷却至环境温度
·用一次性移液管将整个溶液从反应瓶中移至25mL容量瓶中
·用移液管吸取5mL的LCMS级水到空的反应瓶中，用相同的一次性移液管彻底冲洗内壁，然后将冲洗液完全移入同一25mL容量瓶中
·将以上步骤重复两次
·用LCMS级水加至容量瓶的刻度
·完全移入50mL离心管中
·以3000rpm离心10分钟
·取上清液进行HPLC分析
·储存在2℃-8℃
盐水样品中示例性小分子-藻酸盐缀合物的酸水解
·称量1000±50mg在盐水中的小分子-藻酸盐缀合物溶液至微波反应小瓶中
·使用10-mL移液管或容量吸管和搅拌棒添加10.0mL 2N HCl，并用压折器密封PTFE内衬盖
·将每个样品小瓶放置在热/搅拌板上的匹配加热块中
·在120℃加热，以400rpm搅拌，持续120分钟
·去除加热并冷却至环境温度
·用一次性移液管将整个溶液从反应瓶中移至25mL容量瓶中
·用移液管吸取5mL的LCMS级水到空的反应瓶中，用相同的一次性移液管彻底冲洗内壁，然后将冲洗液完全移入同一25mL容量瓶中
·将以上步骤重复两次
·用LCMS级水加至容量瓶的刻度
·完全移入50mL离心管中
·以3000rpm离心10分钟
·取上清液进行HPLC分析
·储存在2℃-8℃
固体小分子-藻酸盐缀合物中残留的游离胺的样品制备
·称量50±5mg冻干的小分子-藻酸盐缀合物固体至闪烁瓶中
·吸取5.0mL的盐水到该闪烁瓶中
·摇动并涡旋10分钟以完全溶解
·完全移入MWCO管中
·以5000rpm离心60分钟
·去除MWCO管的顶部并丢弃
·将底部的样品完全转移到5mL容量瓶中
·用水或盐水标记并倒置以混合均匀
·转移至闪烁瓶中，储存在2℃-8℃
·转移等分试样用于HPLC分析
小分子-藻酸盐缀合物中残留的游离胺在盐水中的样品制备
·称量1000±50mg在盐水中的小分子-藻酸盐缀合物(或与未经修饰的藻酸盐的共混物)至MWCO管中
·吸取4.0mL的盐水到该MWCO管中
·将试管翻转并涡旋5次，或直到溶液充分混合以充分提取游离胺
·以5000rpm离心90分钟
·去除MWCO管的顶部并丢弃
·将底部的样品完全转移到5mL容量瓶中
·用水标记并倒置以混合均匀
·转移至闪烁瓶中，储存在2℃-8℃
·转移等分试样用于HPLC分析
标准品制备
标准品溶液：1mg/mL
·称量50.00±5.00mg小分子参比材料标准品至闪烁瓶中
·添加约10mL LCMS级水，通过摇动和涡旋将固体完全溶解
·通过使用一次性移液管用LCMS级水冲洗闪烁瓶两次，将溶液完全转移至50mL容量瓶中
·用LCMS级水稀释至刻度，充分混合
·储存在2℃-8℃
标准品溶液：0.01mg/mL
·吸取100μL的1mg/mL溶液至10mL容量瓶中
·用LCMS级水稀释至刻度
·翻转混匀
·储存在2℃-8℃
HPLC条件
Figure BDA0003279416310001141
Figure BDA0003279416310001151
系统适用性标准
Figure BDA0003279416310001152
数据分析-仅在系统适用性合格时才分析样品
胺鉴定
·(任选的)每个样品中游离胺峰的m/z应在392.1±0.5以内。
·每个样品中UV中胺峰的RT与标准品的RT相匹配。
标准品浓度(mg/mL)＝
重量(mg)/50mL/稀释因子，
其中1.0mg/mL标准品的稀释因子＝1；
其中0.01mg/mL标准品的稀释因子＝100；
游离胺浓度(mg/mL)＝
未水解样品面积/0.01标准品面积x0.01标准品浓度
％残留游离胺＝
游离胺浓度(mg/mL)x5mL/未水解缀合物重量(mg)x100
总胺浓度(mg/mL)＝
水解样品面积/1.0标准品面积x1.0标准品浓度
％总胺＝
总胺浓度(mg/mL)x25mL/水解缀合物重量(mg)x100
等效物和范围
本申请引用了各种发布的专利、出版的专利申请、杂志文章和其他出版物，将其全部通过引用并入本文。如果在任一个并入的参考文献和本说明书之间有冲突，以本说明书为准。另外，在现有技术之内的本披露的任何具体的实施例可以从任何一个或多个权利要求中明确排除。因为此类实施例被视为对于本领域的技术人员是已知的，因此它们可以被排除，即使该排除在本文没有被明确陈述。本披露的任何具体的实施例可以因为任何原因从任一权利要求中排除，不管是否与存在的现有技术相关。
本领域的普通技术人员只使用常规实验就将认识到或能够确定本文描述的具体实施例的许多等效形式。本文描述的实施例的范围不旨在限制以上说明书、附图或实例，而是如在所附权利要求中所陈述的。本领域的普通技术人员要认识到的是，在不脱离如在以下权利要求中所定义的本披露的精神或范围下，可以对本说明书进行各种改变和修改。
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序列表
<110> 西吉隆医疗股份有限公司
<120> 用于因子VII疗法的组合物、装置和方法
<130> S2225-7029WO
<140>
<141>
<150> 62/907,386
<151> 2019-09-27
<150> 62/824,963
<151> 2019-03-27
<160> 54
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 466
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr
20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gln
35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe
50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu
65 70 75 80
Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg
85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr
115 120 125
Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His
130 135 140
Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln
145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu
165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu
180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys
195 200 205
Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys
210 215 220
Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly
225 230 235 240
Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp
245 250 255
Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp
260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala
290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro
305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val
325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala
340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln
355 360 365
Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr
370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys
385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp
405 410 415
Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly
420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln
435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro
450 455 460
Phe Pro
465
<210> 2
<211> 1401
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct 60
gcaggcgggg tcgctaaggc ctcaggagga gaaacacggg acatgccgtg gaagccgggg 120
cctcacagag tcttcgtaac ccaggaggaa gcccacggcg tcctgcaccg gcgccggcgc 180
gccaacgcgt tcctggagga gctgcggccg ggctccctgg agagggagtg caaggaggag 240
cagtgctcct tcgaggaggc ccgggagatc ttcaaggacg cggagaggac gaagctgttc 300
tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcc 360
tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgc ttctgcctcc ctgccttcga gggccggaac 420
tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 480
tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 540
ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 600
ctagaaaaaa gaaatgccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgcccc 660
aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtgggggg 720
accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggcccact gtttcgacaa aatcaagaac 780
tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 840
cagagccggc gggtggcgca ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 900
cacgacatcg cgctgctccg cctgcaccag cccgtggtcc tcactgacca tgtggtgccc 960
ctctgcctgc ccgaacggac gttctctgag aggacgctgg ccttcgtgcg cttctcattg 1020
gtcagcggct ggggccagct gctggaccgt ggcgccacgg ccctggagct catggtcctc 1080
aacgtgcccc ggctgatgac ccaggactgc ctgcagcagt cacggaaggt gggagactcc 1140
ccaaatatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctgc 1200
aagggggaca gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacgggc 1260
atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1320
tcccagtaca tcgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtcctc 1380
ctgcgagccc catttcccta a 1401
<210> 3
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多核苷酸
<400> 3
atggtgtcac aggccctgag actgctgtgt ctgctgctgg gactgcaggg atgtttggct 60
gctggcggag tggctaaagc ctctggcgga gagacaagag acatgccctg gaagcctgga 120
cctcacagag tgttcgtgac ccaagaggaa gcccacggcg ttctgcacag aagaagaagg 180
gccaacgcct tcctggaaga actgaggcct ggctctctgg aacgcgagtg caaagaggaa 240
cagtgcagct tcgaggaagc cagagagatc ttcaaggacg ccgagcggac caagctgttc 300
tggatcagct acagcgacgg cgaccagtgt gccagctctc cttgtcagaa tggcggcagc 360
tgcaaggacc agctgcagag ctacatctgc ttttgcctgc ctgccttcga gggcagaaac 420
tgcgagacac acaaggacga ccagctgatc tgcgtgaacg agaacggcgg ctgcgagcag 480
tactgtagcg atcacacagg caccaagcgg agctgcagat gtcacgaggg ctattccctg 540
ctggccgatg gcgttagctg tacccctacc gtggaatacc cctgcggcaa gatccccatc 600
ctggaaaaga gaaacgccag caagccccag ggcagaatcg ttggcggcaa agtgtgccct 660
aagggcgagt gtccttggca ggttctgctg cttgtgaatg gcgctcagct gtgtggcggc 720
accctgatca ataccatctg ggtcgtgtcc gccgctcact gcttcgacaa gatcaagaac 780
tggcggaacc tgatcgccgt gctgggagag cacgatctgt ctgaacacga tggcgacgag 840
cagtctcgga gagtggccca agtgatcatc cccagcacct atgtgcccgg caccaccaat 900
cacgatatcg ccctgctcag actgcaccag cctgtggtgc tgacagatca cgtggtgcct 960
ctgtgcctgc cagagaggac ctttagcgag agaaccctgg ccttcgtgcg gttctctctg 1020
gtgtctggat ggggccagct gctggataga ggcgctacag ctctggaact gatggtgctg 1080
aacgtgccca gactgatgac ccaggattgc ctgcagcaga gcagaaaagt gggcgacagc 1140
cccaacatca ccgagtacat gttctgcgcc ggctactccg acggcagcaa ggatagctgt 1200
aaaggcgatt ctggcggccc tcacgccaca cactatagag gcacctggta tctgaccggc 1260
atcgtgtctt ggggacaggg ctgtgctaca gtgggccact ttggcgtgta caccagagtg 1320
tcccagtaca tcgagtggct gcagaaactc atgcggagcg agcctagacc tggcgtgttg 1380
ctgagagccc cttttcctta a 1401
<210> 4
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多核苷酸
<400> 4
atggtgagcc aggccctgcg cctgctgtgc ctgctgctgg gcctgcaggg ctgcctggcc 60
gccggcggcg tggccaaggc cagcggcggc gagacccgcg acatgccctg gaagcccggc 120
ccccaccgcg tgttcgtgac ccaggaggag gcccacggcg tgctgcaccg ccgccgccgc 180
gccaacgcct tcctggagga gctgcgcccc ggcagcctgg agcgcgagtg caaggaggag 240
cagtgcagct tcgaggaggc ccgcgagatc ttcaaggacg ccgagcgcac caagctgttc 300
tggatcagct acagcgacgg cgaccagtgc gccagcagcc cctgccagaa cggcggcagc 360
tgcaaggacc agctgcagag ctacatctgc ttctgcctgc ccgccttcga gggccgcaac 420
tgcgagaccc acaaggacga ccagctgatc tgcgtgaacg agaacggcgg ctgcgagcag 480
tactgcagcg accacaccgg caccaagcgc agctgccgct gccacgaggg ctacagcctg 540
ctggccgacg gcgtgagctg cacccccacc gtggagtacc cctgcggcaa gatccccatc 600
ctggagaagc gcaacgccag caagccccag ggccgcatcg tgggcggcaa ggtgtgcccc 660
aagggcgagt gcccctggca ggtgctgctg ctggtgaacg gcgcccagct gtgcggcggc 720
accctgatca acaccatctg ggtggtgagc gccgcccact gcttcgacaa gatcaagaac 780
tggcgcaacc tgatcgccgt gctgggcgag cacgacctga gcgagcacga cggcgacgag 840
cagagccgcc gcgtggccca ggtgatcatc cccagcacct acgtgcccgg caccaccaac 900
cacgacatcg ccctgctgcg cctgcaccag cccgtggtgc tgaccgacca cgtggtgccc 960
ctgtgcctgc ccgagcgcac cttcagcgag cgcaccctgg ccttcgtgcg cttcagcctg 1020
gtgagcggct ggggccagct gctggaccgc ggcgccaccg ccctggagct gatggtgctg 1080
aacgtgcccc gcctgatgac ccaggactgc ctgcagcaga gccgcaaggt gggcgacagc 1140
cccaacatca ccgagtacat gttctgcgcc ggctacagcg acggcagcaa ggacagctgc 1200
aagggcgaca gcggcggccc ccacgccacc cactaccgcg gcacctggta cctgaccggc 1260
atcgtgagct ggggccaggg ctgcgccacc gtgggccact tcggcgtgta cacccgcgtg 1320
agccagtaca tcgagtggct gcagaagctg atgcgcagcg agccccgccc cggcgtgctg 1380
ctgcgcgccc ccttccccta a 1401
<210> 5
<211> 591
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多肽
<400> 5
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg
1 5 10 15
Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala
20 25 30
Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu
35 40 45
Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser
50 55 60
Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu
65 70 75 80
Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys
85 90 95
Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys
100 105 110
Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val
115 120 125
Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr
130 135 140
Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu
145 150 155 160
Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln
165 170 175
Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg
180 185 190
Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser
195 200 205
Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg
210 215 220
Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu
225 230 235 240
Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu
245 250 255
Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu
260 265 270
Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro
275 280 285
Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met
290 295 300
Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp
305 310 315 320
Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe
325 330 335
Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu
340 345 350
Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala
355 360 365
Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys
370 375 380
Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu
385 390 395 400
Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg
405 410 415
Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val
420 425 430
Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu
435 440 445
Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn
450 455 460
Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr
465 470 475 480
Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala
485 490 495
Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr
500 505 510
Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln
515 520 525
Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys
530 535 540
Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe
545 550 555 560
Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu
565 570 575
Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585 590
<210> 6
<211> 1776
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多核苷酸
<400> 6
ggcggcagca gcggcggcga cgcccacaag agcgaggtgg cccaccgctt caaggacctg 60
ggcgaggaga acttcaaggc cctggtgctg atcgccttcg cccagtacct gcagcagtgc 120
cccttcgagg accacgtgaa gctggtgaac gaggtgaccg agttcgccaa gacctgcgtg 180
gccgacgaga gcgccgagaa ctgcgacaag agcctgcaca ccctgttcgg cgacaagctg 240
tgcaccgtgg ccaccctgcg cgagacctac ggcgagatgg ccgactgctg cgccaagcag 300
gagcccgagc gcaacgagtg cttcctgcag cacaaggacg acaaccccaa cctgccccgc 360
ctggtgcgcc ccgaggtgga cgtgatgtgc accgccttcc acgacaacga ggagaccttc 420
ctgaagaagt acctgtacga gatcgcccgc cgccacccct acttctacgc ccccgagctg 480
ctgttcttcg ccaagcgcta caaggccgcc ttcaccgagt gctgccaggc cgccgacaag 540
gccgcctgcc tgctgcccaa gctggacgag ctgcgcgacg agggcaaggc cagcagcgcc 600
aagcagcgcc tgaagtgcgc cagcctgcag aagttcggcg agcgcgcctt caaggcctgg 660
gccgtggccc gcctgagcca gcgcttcccc aaggccgagt tcgccgaggt gagcaagctg 720
gtgaccgacc tgaccaaggt gcacaccgag tgctgccacg gcgacctgct ggagtgcgcc 780
gacgaccgcg ccgacctggc caagtacatc tgcgagaacc aggacagcat cagcagcaag 840
ctgaaggagt gctgcgagaa gcccctgctg gagaagagcc actgcatcgc cgaggtggag 900
aacgacgaga tgcccgccga cctgcccagc ctggccgccg acttcgtgga gagcaaggac 960
gtgtgcaaga actacgccga ggccaaggac gtgttcctgg gcatgttcct gtacgagtac 1020
gcccgccgcc accccgacta cagcgtggtg ctgctgctgc gcctggccaa gacctacgag 1080
accaccctgg agaagtgctg cgccgccgcc gacccccacg agtgctacgc caaggtgttc 1140
gacgagttca agcccctggt ggaggagccc cagaacctga tcaagcagaa ctgcgagctg 1200
ttcgagcagc tgggcgagta caagttccag aacgccctgc tggtgcgcta caccaagaag 1260
gtgccccagg tgagcacccc caccctggtg gaggtgagcc gcaacctggg caaggtgggc 1320
agcaagtgct gcaagcaccc cgaggccaag cgcatgccct gcgccgagga ctacctgagc 1380
gtggtgctga accagctgtg cgtgctgcac gagaagaccc ccgtgagcga ccgcgtgacc 1440
aagtgctgca ccgagagcct ggtgaaccgc cgcccctgct tcagcgccct ggaggtggac 1500
gagacctacg tgcccaagga gttcaacgcc gagaccttca ccttccacgc cgacatctgc 1560
accctgagcg agaaggagcg ccagatcaag aagcagaccg ccctggtgga gctggtgaag 1620
cacaagccca aggccaccaa ggagcagctg aaggccgtga tggacgactt cgccgccttc 1680
gtggagaagt gctgcaaggc cgacgacaag gagacctgct tcgccgagga gggcaagaag 1740
ctggtggccg ccagccaggc cgccctgggc ctgtaa 1776
<210> 7
<211> 603
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多肽
<400> 7
Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro
1 5 10 15
Asp Val Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu
20 25 30
Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr
35 40 45
Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val
50 55 60
Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys
65 70 75 80
Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala
85 90 95
Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln
100 105 110
Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro
115 120 125
Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala
130 135 140
Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile
145 150 155 160
Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala
165 170 175
Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys
180 185 190
Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys
195 200 205
Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe
210 215 220
Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg
225 230 235 240
Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu
245 250 255
Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala
260 265 270
Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser
275 280 285
Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys
290 295 300
Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu
305 310 315 320
Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn
325 330 335
Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr
340 345 350
Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala
355 360 365
Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro
370 375 380
His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu
385 390 395 400
Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu
405 410 415
Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys
420 425 430
Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu
435 440 445
Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met
450 455 460
Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val
465 470 475 480
Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr
485 490 495
Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp
500 505 510
Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His
515 520 525
Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln
530 535 540
Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu
545 550 555 560
Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys
565 570 575
Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys
580 585 590
Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
595 600
<210> 8
<211> 1812
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多核苷酸
<400> 8
agcgtgagcc agaccagcaa gctgacccgc gccgagaccg tgttccccga cgtggacgcc 60
cacaagagcg aggtggccca ccgcttcaag gacctgggcg aggagaactt caaggccctg 120
gtgctgatcg ccttcgccca gtacctgcag cagtgcccct tcgaggacca cgtgaagctg 180
gtgaacgagg tgaccgagtt cgccaagacc tgcgtggccg acgagagcgc cgagaactgc 240
gacaagagcc tgcacaccct gttcggcgac aagctgtgca ccgtggccac cctgcgcgag 300
acctacggcg agatggccga ctgctgcgcc aagcaggagc ccgagcgcaa cgagtgcttc 360
ctgcagcaca aggacgacaa ccccaacctg ccccgcctgg tgcgccccga ggtggacgtg 420
atgtgcaccg ccttccacga caacgaggag accttcctga agaagtacct gtacgagatc 480
gcccgccgcc acccctactt ctacgccccc gagctgctgt tcttcgccaa gcgctacaag 540
gccgccttca ccgagtgctg ccaggccgcc gacaaggccg cctgcctgct gcccaagctg 600
gacgagctgc gcgacgaggg caaggccagc agcgccaagc agcgcctgaa gtgcgccagc 660
ctgcagaagt tcggcgagcg cgccttcaag gcctgggccg tggcccgcct gagccagcgc 720
ttccccaagg ccgagttcgc cgaggtgagc aagctggtga ccgacctgac caaggtgcac 780
accgagtgct gccacggcga cctgctggag tgcgccgacg accgcgccga cctggccaag 840
tacatctgcg agaaccagga cagcatcagc agcaagctga aggagtgctg cgagaagccc 900
ctgctggaga agagccactg catcgccgag gtggagaacg acgagatgcc cgccgacctg 960
cccagcctgg ccgccgactt cgtggagagc aaggacgtgt gcaagaacta cgccgaggcc 1020
aaggacgtgt tcctgggcat gttcctgtac gagtacgccc gccgccaccc cgactacagc 1080
gtggtgctgc tgctgcgcct ggccaagacc tacgagacca ccctggagaa gtgctgcgcc 1140
gccgccgacc cccacgagtg ctacgccaag gtgttcgacg agttcaagcc cctggtggag 1200
gagccccaga acctgatcaa gcagaactgc gagctgttcg agcagctggg cgagtacaag 1260
ttccagaacg ccctgctggt gcgctacacc aagaaggtgc cccaggtgag cacccccacc 1320
ctggtggagg tgagccgcaa cctgggcaag gtgggcagca agtgctgcaa gcaccccgag 1380
gccaagcgca tgccctgcgc cgaggactac ctgagcgtgg tgctgaacca gctgtgcgtg 1440
ctgcacgaga agacccccgt gagcgaccgc gtgaccaagt gctgcaccga gagcctggtg 1500
aaccgccgcc cctgcttcag cgccctggag gtggacgaga cctacgtgcc caaggagttc 1560
aacgccgaga ccttcacctt ccacgccgac atctgcaccc tgagcgagaa ggagcgccag 1620
atcaagaagc agaccgccct ggtggagctg gtgaagcaca agcccaaggc caccaaggag 1680
cagctgaagg ccgtgatgga cgacttcgcc gccttcgtgg agaagtgctg caaggccgac 1740
gacaaggaga cctgcttcgc cgaggagggc aagaagctgg tggccgccag ccaggccgcc 1800
ctgggcctgt aa 1812
<210> 9
<211> 6164
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多核苷酸
<400> 9
ttaaccctag aaagatagtc tgcgtaaaat tgacgcatgc attcttgaaa tattgctctc 60
tctttctaaa tagcgcgaat ccgtcgctgt gcatttagga catctcagtc gccgcttgga 120
gctcccgtga ggcgtgcttg tcaatgcggt aagtgtcact gattttgaac tataacgacc 180
gcgtgagtca aaatgacgca tgattatctt ttacgtgact tttaagattt aactcatacg 240
ataattatat tgttatttca tgttctactt acgtgataac ttattatata tatattttct 300
tgttatagat atcatcaact ttgtatagaa aagttgctcg acattgatta ttgactagtt 360
attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta 420
cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt 480
caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg 540
tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta 600
cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga 660
ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg 720
tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 780
ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 840
ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg 900
cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc 960
ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg cgctgccttc 1020
gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga ctgaccgcgt 1080
tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat tagcgcttgg 1140
tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg ctccgggagg 1200
gccctttgtg cggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc gtggggagcg 1260
ccgcgtgcgg ctccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg cgggcgcggc gcggggcttt 1320
gtgcgctccg cagtgtgcgc gaggggagcg cggccggggg cggtgccccg cggtgcgggg 1380
ggggctgcga ggggaacaaa ggctgcgtgc ggggtgtgtg cgtggggggg tgagcagggg 1440
gtgtgggcgc gtcggtcggg ctgcaacccc ccctgcaccc ccctccccga gttgctgagc 1500
acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgta cggggcgtgg cgcggggctc gccgtgccgg 1560
gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg gccggggagg 1620
gctcggggga ggggcgcggc ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc gcggcgagcc 1680
gcagccattg ccttttatgg taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct ttgtcccaaa 1740
tctgtgcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcggggcga 1800
agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg tcgccgcgcc 1860
gccgtcccct tctccctctc cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc tgccttcggg 1920
ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg 1980
ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg 2040
tgctgtctca tcattttggc aaagaattgc aagtttgtac aaaaaagcag gctgccaccg 2100
aattcgcggc cgctaaaccc agctttcttg tacaaagtgg caactttatt atacatagtt 2160
gatcctcagg tgcaggctgc ctatcagaag gtggtggctg gtgtggccaa tgccctggct 2220
cacaaatacc actgagatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc 2280
cttgagcatc tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg 2340
aattttttgt gtctctcact cggaaggaca tatgggaggg caaatcattt aaaacatcag 2400
aatgagtatt tggtttagag tttggcaaca tatgcccata tgctggctgc catgaacaaa 2460
ggttggctat aaagaggtca tcagtatatg aaacagcccc ctgctgtcca ttccttattc 2520
catagaaaag ccttgacttg aggttagatt ttttttatat tttgttttgt gttatttttt 2580
tctttaacat ccctaaaatt ttccttacat gttttactag ccagattttt cctcctctcc 2640
tgactactcc cagtcatagc tgtccctctt ctcttatgga gatccctcga cctgcagccc 2700
aagcttggat ccctcgagtt aattaacgag agcataatat tgatatgtgc caaagttgtt 2760
tctgactgac taataagtat aatttgtttc tattatgtat aggttaagct aattacttat 2820
tttataatac aacatgactg tttttaaagt acaaaataag tttatttttg taaaagagag 2880
aatgtttaaa agttttgtta ctttatagaa gaaattttga gtttttgttt ttttttaata 2940
aataaataaa cataaataaa ttgtttgttg aatttattat tagtatgtaa gtgtaaatat 3000
aataaaactt aatatctatt caaattaata aataaacctc gatatacaga ccgataaaac 3060
acatgcgtca attttacgca tgattatctt taacgtacgt cacaatatga ttatctttct 3120
agggttaaat aatagtttct aattttttta ttattcagcc tgctgtcgtg aataccgagc 3180
tccaattcgc cctatagtga gtcgtattac aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt 3240
gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc 3300
agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 3360
aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg 3420
cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct 3480
tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta 3540
gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt 3600
tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 3660
ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat 3720
tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt 3780
taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta ggtggcactt 3840
ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 3900
atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 3960
tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 4020
tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 4080
gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 4140
aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 4200
gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 4260
ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 4320
gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 4380
gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 4440
atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 4500
ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 4560
cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 4620
cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 4680
gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 4740
cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 4800
cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt 4860
taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 4920
ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 4980
aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 5040
caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 5100
taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag 5160
gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 5220
cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 5280
taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 5340
agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 5400
ttcccgaaga gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 5460
gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 5520
acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 5580
acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 5640
tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg 5700
ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag 5760
agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 5820
acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 5880
tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 5940
ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctcg 6000
aaattaaccc tcactaaagg gaacaaaagc tggtacctcg cgcgacttgg tttgccattc 6060
tttagcgcgc gtcgcgtcac acagcttggc cacaatgtgg tttttgtcaa acgaagattc 6120
tatgacgtgt ttaaagttta ggtcgagtaa agcgcaaatc tttt 6164
<210> 10
<211> 1733
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多核苷酸
<400> 10
ctcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 420
tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 480
cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc 540
ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt 600
ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg 660
cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc 720
cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc 780
ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg 840
aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg gagcggctcg gggggtgcgt 900
gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc gctgcccggc ggctgtgagc 960
gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt gcgcgagggg agcgcggccg 1020
ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg 1080
tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt cgggctgcaa ccccccctgc 1140
acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg tgcggggctc cgtacggggc 1200
gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg 1260
cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg 1320
gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg 1380
cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca 1440
ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg 1500
agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc tctccagcct cggggctgtc 1560
cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg 1620
tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 1680
tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt tggcaaagaa ttg 1733
<210> 11
<211> 1057
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多肽
<400> 11
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr
20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gln
35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe
50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu
65 70 75 80
Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg
85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr
115 120 125
Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His
130 135 140
Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln
145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu
165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu
180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys
195 200 205
Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys
210 215 220
Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly
225 230 235 240
Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp
245 250 255
Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp
260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala
290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro
305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val
325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala
340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln
355 360 365
Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr
370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys
385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp
405 410 415
Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly
420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln
435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro
450 455 460
Phe Pro Gly Gly Ser Ser Gly Gly Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
465 470 475 480
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
485 490 495
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
500 505 510
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
515 520 525
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
530 535 540
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
545 550 555 560
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
565 570 575
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
580 585 590
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
595 600 605
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
610 615 620
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
625 630 635 640
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
645 650 655
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
660 665 670
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
675 680 685
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
690 695 700
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
705 710 715 720
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
725 730 735
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
740 745 750
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
755 760 765
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
770 775 780
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
785 790 795 800
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
805 810 815
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
820 825 830
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
835 840 845
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
850 855 860
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
865 870 875 880
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
885 890 895
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
900 905 910
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
915 920 925
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
930 935 940
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
945 950 955 960
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
965 970 975
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
980 985 990
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
995 1000 1005
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe
1010 1015 1020
Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr
1025 1030 1035
Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala
1040 1045 1050
Ala Leu Gly Leu
1055
<210> 12
<211> 1069
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多肽
<400> 12
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr
20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gln
35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe
50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu
65 70 75 80
Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg
85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr
115 120 125
Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His
130 135 140
Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln
145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu
165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu
180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys
195 200 205
Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys
210 215 220
Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly
225 230 235 240
Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp
245 250 255
Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp
260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala
290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro
305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val
325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala
340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln
355 360 365
Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr
370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys
385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp
405 410 415
Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly
420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln
435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro
450 455 460
Phe Pro Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val
465 470 475 480
Phe Pro Asp Val Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys
485 490 495
Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala
500 505 510
Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn
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Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu
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Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr
545 550 555 560
Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala
565 570 575
Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp
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Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys
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Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr
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Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe
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Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu
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Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln
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Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser
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Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr
705 710 715 720
Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu
725 730 735
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Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys
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Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala
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Leu
<210> 13
<211> 3177
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多核苷酸
<400> 13
atggtgtcac aggccctgag actgctgtgt ctgctgctgg gactgcaggg atgtttggct 60
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cctcacagag tgttcgtgac ccaagaggaa gcccacggcg ttctgcacag aagaagaagg 180
gccaacgcct tcctggaaga actgaggcct ggctctctgg aacgcgagtg caaagaggaa 240
cagtgcagct tcgaggaagc cagagagatc ttcaaggacg ccgagcggac caagctgttc 300
tggatcagct acagcgacgg cgaccagtgt gccagctctc cttgtcagaa tggcggcagc 360
tgcaaggacc agctgcagag ctacatctgc ttttgcctgc ctgccttcga gggcagaaac 420
tgcgagacac acaaggacga ccagctgatc tgcgtgaacg agaacggcgg ctgcgagcag 480
tactgtagcg atcacacagg caccaagcgg agctgcagat gtcacgaggg ctattccctg 540
ctggccgatg gcgttagctg tacccctacc gtggaatacc cctgcggcaa gatccccatc 600
ctggaaaaga gaaacgccag caagccccag ggcagaatcg ttggcggcaa agtgtgccct 660
aagggcgagt gtccttggca ggttctgctg cttgtgaatg gcgctcagct gtgtggcggc 720
accctgatca ataccatctg ggtcgtgtcc gccgctcact gcttcgacaa gatcaagaac 780
tggcggaacc tgatcgccgt gctgggagag cacgatctgt ctgaacacga tggcgacgag 840
cagtctcgga gagtggccca agtgatcatc cccagcacct atgtgcccgg caccaccaat 900
cacgatatcg ccctgctcag actgcaccag cctgtggtgc tgacagatca cgtggtgcct 960
ctgtgcctgc cagagaggac ctttagcgag agaaccctgg ccttcgtgcg gttctctctg 1020
gtgtctggat ggggccagct gctggataga ggcgctacag ctctggaact gatggtgctg 1080
aacgtgccca gactgatgac ccaggattgc ctgcagcaga gcagaaaagt gggcgacagc 1140
cccaacatca ccgagtacat gttctgcgcc ggctactccg acggcagcaa ggatagctgt 1200
aaaggcgatt ctggcggccc tcacgccaca cactatagag gcacctggta tctgaccggc 1260
atcgtgtctt ggggacaggg ctgtgctaca gtgggccact ttggcgtgta caccagagtg 1320
tcccagtaca tcgagtggct gcagaaactc atgcggagcg agcctagacc tggcgtgttg 1380
ctgagagccc cttttcctta aggcggcagc agcggcggcg acgcccacaa gagcgaggtg 1440
gcccaccgct tcaaggacct gggcgaggag aacttcaagg ccctggtgct gatcgccttc 1500
gcccagtacc tgcagcagtg ccccttcgag gaccacgtga agctggtgaa cgaggtgacc 1560
gagttcgcca agacctgcgt ggccgacgag agcgccgaga actgcgacaa gagcctgcac 1620
accctgttcg gcgacaagct gtgcaccgtg gccaccctgc gcgagaccta cggcgagatg 1680
gccgactgct gcgccaagca ggagcccgag cgcaacgagt gcttcctgca gcacaaggac 1740
gacaacccca acctgccccg cctggtgcgc cccgaggtgg acgtgatgtg caccgccttc 1800
cacgacaacg aggagacctt cctgaagaag tacctgtacg agatcgcccg ccgccacccc 1860
tacttctacg cccccgagct gctgttcttc gccaagcgct acaaggccgc cttcaccgag 1920
tgctgccagg ccgccgacaa ggccgcctgc ctgctgccca agctggacga gctgcgcgac 1980
gagggcaagg ccagcagcgc caagcagcgc ctgaagtgcg ccagcctgca gaagttcggc 2040
gagcgcgcct tcaaggcctg ggccgtggcc cgcctgagcc agcgcttccc caaggccgag 2100
ttcgccgagg tgagcaagct ggtgaccgac ctgaccaagg tgcacaccga gtgctgccac 2160
ggcgacctgc tggagtgcgc cgacgaccgc gccgacctgg ccaagtacat ctgcgagaac 2220
caggacagca tcagcagcaa gctgaaggag tgctgcgaga agcccctgct ggagaagagc 2280
cactgcatcg ccgaggtgga gaacgacgag atgcccgccg acctgcccag cctggccgcc 2340
gacttcgtgg agagcaagga cgtgtgcaag aactacgccg aggccaagga cgtgttcctg 2400
ggcatgttcc tgtacgagta cgcccgccgc caccccgact acagcgtggt gctgctgctg 2460
cgcctggcca agacctacga gaccaccctg gagaagtgct gcgccgccgc cgacccccac 2520
gagtgctacg ccaaggtgtt cgacgagttc aagcccctgg tggaggagcc ccagaacctg 2580
atcaagcaga actgcgagct gttcgagcag ctgggcgagt acaagttcca gaacgccctg 2640
ctggtgcgct acaccaagaa ggtgccccag gtgagcaccc ccaccctggt ggaggtgagc 2700
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<210> 14
<211> 3213
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多核苷酸
<400> 14
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<210> 15
<211> 3177
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多核苷酸
<400> 15
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ggcatgttcc tgtacgagta cgcccgccgc caccccgact acagcgtggt gctgctgctg 2460
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gagtgctacg ccaaggtgtt cgacgagttc aagcccctgg tggaggagcc ccagaacctg 2580
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cgcaacctgg gcaaggtggg cagcaagtgc tgcaagcacc ccgaggccaa gcgcatgccc 2760
tgcgccgagg actacctgag cgtggtgctg aaccagctgt gcgtgctgca cgagaagacc 2820
cccgtgagcg accgcgtgac caagtgctgc accgagagcc tggtgaaccg ccgcccctgc 2880
ttcagcgccc tggaggtgga cgagacctac gtgcccaagg agttcaacgc cgagaccttc 2940
accttccacg ccgacatctg caccctgagc gagaaggagc gccagatcaa gaagcagacc 3000
gccctggtgg agctggtgaa gcacaagccc aaggccacca aggagcagct gaaggccgtg 3060
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ttcgccgagg agggcaagaa gctggtggcc gccagccagg ccgccctggg cctgtaa 3177
<210> 16
<211> 3213
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多核苷酸
<400> 16
atggtgagcc aggccctgcg cctgctgtgc ctgctgctgg gcctgcaggg ctgcctggcc 60
gccggcggcg tggccaaggc cagcggcggc gagacccgcg acatgccctg gaagcccggc 120
ccccaccgcg tgttcgtgac ccaggaggag gcccacggcg tgctgcaccg ccgccgccgc 180
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tgcgagaccc acaaggacga ccagctgatc tgcgtgaacg agaacggcgg ctgcgagcag 480
tactgcagcg accacaccgg caccaagcgc agctgccgct gccacgaggg ctacagcctg 540
ctggccgacg gcgtgagctg cacccccacc gtggagtacc cctgcggcaa gatccccatc 600
ctggagaagc gcaacgccag caagccccag ggccgcatcg tgggcggcaa ggtgtgcccc 660
aagggcgagt gcccctggca ggtgctgctg ctggtgaacg gcgcccagct gtgcggcggc 720
accctgatca acaccatctg ggtggtgagc gccgcccact gcttcgacaa gatcaagaac 780
tggcgcaacc tgatcgccgt gctgggcgag cacgacctga gcgagcacga cggcgacgag 840
cagagccgcc gcgtggccca ggtgatcatc cccagcacct acgtgcccgg caccaccaac 900
cacgacatcg ccctgctgcg cctgcaccag cccgtggtgc tgaccgacca cgtggtgccc 960
ctgtgcctgc ccgagcgcac cttcagcgag cgcaccctgg ccttcgtgcg cttcagcctg 1020
gtgagcggct ggggccagct gctggaccgc ggcgccaccg ccctggagct gatggtgctg 1080
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cccaacatca ccgagtacat gttctgcgcc ggctacagcg acggcagcaa ggacagctgc 1200
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atcgtgagct ggggccaggg ctgcgccacc gtgggccact tcggcgtgta cacccgcgtg 1320
agccagtaca tcgagtggct gcagaagctg atgcgcagcg agccccgccc cggcgtgctg 1380
ctgcgcgccc ccttccccta aagcgtgagc cagaccagca agctgacccg cgccgagacc 1440
gtgttccccg acgtggacgc ccacaagagc gaggtggccc accgcttcaa ggacctgggc 1500
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gacgagagcg ccgagaactg cgacaagagc ctgcacaccc tgttcggcga caagctgtgc 1680
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gtgcgccccg aggtggacgt gatgtgcacc gccttccacg acaacgagga gaccttcctg 1860
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ttcttcgcca agcgctacaa ggccgccttc accgagtgct gccaggccgc cgacaaggcc 1980
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gaccgcgccg acctggccaa gtacatctgc gagaaccagg acagcatcag cagcaagctg 2280
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ccccaggtga gcacccccac cctggtggag gtgagccgca acctgggcaa ggtgggcagc 2760
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ctgagcgaga aggagcgcca gatcaagaag cagaccgccc tggtggagct ggtgaagcac 3060
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gagaagtgct gcaaggccga cgacaaggag acctgcttcg ccgaggaggg caagaagctg 3180
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<210> 17
<211> 3177
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多核苷酸
<400> 17
atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct 60
gcaggcgggg tcgctaaggc ctcaggagga gaaacacggg acatgccgtg gaagccgggg 120
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gccaacgcgt tcctggagga gctgcggccg ggctccctgg agagggagtg caaggaggag 240
cagtgctcct tcgaggaggc ccgggagatc ttcaaggacg cggagaggac gaagctgttc 300
tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcc 360
tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgc ttctgcctcc ctgccttcga gggccggaac 420
tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 480
tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 540
ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 600
ctagaaaaaa gaaatgccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgcccc 660
aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtgggggg 720
accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggcccact gtttcgacaa aatcaagaac 780
tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 840
cagagccggc gggtggcgca ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 900
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<210> 18
<211> 3213
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多核苷酸
<400> 18
atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct 60
gcaggcgggg tcgctaaggc ctcaggagga gaaacacggg acatgccgtg gaagccgggg 120
cctcacagag tcttcgtaac ccaggaggaa gcccacggcg tcctgcaccg gcgccggcgc 180
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cagcgcctga agtgcgccag cctgcagaag ttcggcgagc gcgccttcaa ggcctgggcc 2100
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accgacctga ccaaggtgca caccgagtgc tgccacggcg acctgctgga gtgcgccgac 2220
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gtggccgcca gccaggccgc cctgggcctg taa 3213
<210> 19
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
寡核苷酸
<400> 19
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<210> 20
<211> 522
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多核苷酸
<400> 20
tcctcaggtg caggctgcct atcagaaggt ggtggctggt gtggccaatg ccctggctca 60
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多核苷酸
<400> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多核苷酸
<400> 22
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aagtgatcat ccccagcacc tatgtgcccg gcaccaccaa tcacgatatc gccctgctca 3300
gactgcacca gcctgtggtg ctgacagatc acgtggtgcc tctgtgcctg ccagagagga 3360
cctttagcga gagaaccctg gccttcgtgc ggttctctct ggtgtctgga tggggccagc 3420
tgctggatag aggcgctaca gctctggaac tgatggtgct gaacgtgccc agactgatga 3480
cccaggattg cctgcagcag agcagaaaag tgggcgacag ccccaacatc accgagtaca 3540
tgttctgcgc cggctactcc gacggcagca aggatagctg taaaggcgat tctggcggcc 3600
ctcacgccac acactataga ggcacctggt atctgaccgg catcgtgtct tggggacagg 3660
gctgtgctac agtgggccac tttggcgtgt acaccagagt gtcccagtac atcgagtggc 3720
tgcagaaact catgcggagc gagcctagac ctggcgtgtt gctgagagcc ccttttcctt 3780
aatcctcagg tgcaggctgc ctatcagaag gtggtggctg gtgtggccaa tgccctggct 3840
cacaaatacc actgagatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc 3900
cttgagcatc tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg 3960
aattttttgt gtctctcact cggaaggaca tatgggaggg caaatcattt aaaacatcag 4020
aatgagtatt tggtttagag tttggcaaca tatgcccata tgctggctgc catgaacaaa 4080
ggttggctat aaagaggtca tcagtatatg aaacagcccc ctgctgtcca ttccttattc 4140
catagaaaag ccttgacttg aggttagatt ttttttatat tttgttttgt gttatttttt 4200
tctttaacat ccctaaaatt ttccttacat gttttactag ccagattttt cctcctctcc 4260
tgactactcc cagtcatagc tgtccctctt ctcttatgga gatccctcga cctgcagccc 4320
aagcttggat ccccgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 4380
acccccgccc attgacgtca atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg 4440
tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta 4500
cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattgtgcc cagtacatga 4560
ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg 4620
tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 4680
ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg cgaggcggag 4740
aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg 4800
gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgcgctg 4860
ccttcgcccc gtgccccgct ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac 4920
cgcgttactc ccacaggtga gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct 4980
gagcaagagg taagggttta agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct 5040
ggagcacctg cctgaaatca ctttttttca ggttggcaag tttgtacaaa aaagcaggct 5100
ggctcgcatc tctccttcac gcgcccgccg ccctacctga ggccgccatc cacgccggtt 5160
gagtcgcgtt ctgccgcctc ccgcctgtgg tgcctcctga actgcgtccg ccgtctaggt 5220
aagtttaaag ctcaggtcga gaccgggcct ttgtccggcg ctcccttgga gcctacctag 5280
actcagccgg ctctccacgc tttgcctgac cctgcttgct caactctacg tctttgtttc 5340
gttttctgtt ctgcgccgtt acagatccaa gctgtgaccg gcgccaccat ggtgtcacag 5400
gccctgagac tgctgtgtct gctgctggga ctgcagggat gtttggctgc tggcggagtg 5460
gctaaagcct ctggcggaga gacaagagac atgccctgga agcctggacc tcacagagtg 5520
ttcgtgaccc aagaggaagc ccacggcgtt ctgcacagaa gaagaagggc caacgccttc 5580
ctggaagaac tgaggcctgg ctctctggaa cgcgagtgca aagaggaaca gtgcagcttc 5640
gaggaagcca gagagatctt caaggacgcc gagcggacca agctgttctg gatcagctac 5700
agcgacggcg accagtgtgc cagctctcct tgtcagaatg gcggcagctg caaggaccag 5760
ctgcagagct acatctgctt ttgcctgcct gccttcgagg gcagaaactg cgagacacac 5820
aaggacgacc agctgatctg cgtgaacgag aacggcggct gcgagcagta ctgtagcgat 5880
cacacaggca ccaagcggag ctgcagatgt cacgagggct attccctgct ggccgatggc 5940
gttagctgta cccctaccgt ggaatacccc tgcggcaaga tccccatcct ggaaaagaga 6000
aacgccagca agccccaggg cagaatcgtt ggcggcaaag tgtgccctaa gggcgagtgt 6060
ccttggcagg ttctgctgct tgtgaatggc gctcagctgt gtggcggcac cctgatcaat 6120
accatctggg tcgtgtccgc cgctcactgc ttcgacaaga tcaagaactg gcggaacctg 6180
atcgccgtgc tgggagagca cgatctgtct gaacacgatg gcgacgagca gtctcggaga 6240
gtggcccaag tgatcatccc cagcacctat gtgcccggca ccaccaatca cgatatcgcc 6300
ctgctcagac tgcaccagcc tgtggtgctg acagatcacg tggtgcctct gtgcctgcca 6360
gagaggacct ttagcgagag aaccctggcc ttcgtgcggt tctctctggt gtctggatgg 6420
ggccagctgc tggatagagg cgctacagct ctggaactga tggtgctgaa cgtgcccaga 6480
ctgatgaccc aggattgcct gcagcagagc agaaaagtgg gcgacagccc caacatcacc 6540
gagtacatgt tctgcgccgg ctactccgac ggcagcaagg atagctgtaa aggcgattct 6600
ggcggccctc acgccacaca ctatagaggc acctggtatc tgaccggcat cgtgtcttgg 6660
ggacagggct gtgctacagt gggccacttt ggcgtgtaca ccagagtgtc ccagtacatc 6720
gagtggctgc agaaactcat gcggagcgag cctagacctg gcgtgttgct gagagcccct 6780
tttccttaag aattcgtcga catcgattcc tcaggtgcag gctgcctatc agaaggtggt 6840
ggctggtgtg gccaatgccc tggctcacaa ataccactga gatctttttc cctctgccaa 6900
aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact tctggctaat aaaggaaatt 6960
tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc tcactcggaa ggacatatgg 7020
gagggcaaat catttaaaac atcagaatga gtatttggtt tagagtttgg caacatatgc 7080
ccatatgctg gctgccatga acaaaggttg gctataaaga ggtcatcagt atatgaaaca 7140
gccccctgct gtccattcct tattccatag aaaagccttg acttgaggtt agattttttt 7200
tatattttgt tttgtgttat ttttttcttt aacatcccta aaattttcct tacatgtttt 7260
actagccaga tttttcctcc tctcctgact actcccagtc atagctgtcc ctcttctctt 7320
atggagatcc tcgaggcggc cgctaacgag agcataatat tgatatgtgc caaagttgtt 7380
tctgactgac taataagtat aatttgtttc tattatgtat aggttaagct aattacttat 7440
tttataatac aacatgactg tttttaaagt acaaaataag tttatttttg taaaagagag 7500
aatgtttaaa agttttgtta ctttatagaa gaaattttga gtttttgttt ttttttaata 7560
aataaataaa cataaataaa ttgtttgttg aatttattat tagtatgtaa gtgtaaatat 7620
aataaaactt aatatctatt caaattaata aataaacctc gatatacaga ccgataaaac 7680
acatgcgtca attttacgca tgattatctt taacgtacgt cacaatatga ttatctttct 7740
agggttaaat aatagtttct aattttttta ttattcagcc tgctgtcgtg aataccgagc 7800
tccaattcgc cctatagtga gtcgtattac aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt 7860
gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc 7920
agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 7980
aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg 8040
cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct 8100
tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta 8160
gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt 8220
tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 8280
ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat 8340
tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt 8400
taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta ggtggcactt 8460
ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 8520
atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 8580
tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 8640
tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 8700
gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 8760
aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 8820
gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 8880
ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 8940
gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 9000
gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 9060
atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 9120
ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 9180
cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 9240
cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 9300
gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 9360
cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 9420
cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt 9480
taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 9540
ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 9600
aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 9660
caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 9720
taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag 9780
gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 9840
cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 9900
taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 9960
agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 10020
ttcccgaaga gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 10080
gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 10140
acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 10200
acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 10260
tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg 10320
ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag 10380
agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 10440
acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 10500
tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 10560
ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctcg 10620
aaattaaccc tcactaaagg gaacaaaagc tggtacctcg cgcgacttgg tttgccattc 10680
tttagcgcgc gtcgcgtcac acagcttggc cacaatgtgg tttttgtcaa acgaagattc 10740
tatgacgtgt ttaaagttta ggtcgagtaa agcgcaaatc tttt 10784
<210> 23
<211> 3968
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多核苷酸
<400> 23
ctcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 420
tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 480
cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc 540
ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt 600
ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg 660
cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc 720
cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc 780
ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg 840
aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg gagcggctcg gggggtgcgt 900
gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc gctgcccggc ggctgtgagc 960
gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt gcgcgagggg agcgcggccg 1020
ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg 1080
tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt cgggctgcaa ccccccctgc 1140
acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg tgcggggctc cgtacggggc 1200
gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg 1260
cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg 1320
gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg 1380
cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca 1440
ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg 1500
agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc tctccagcct cggggctgtc 1560
cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg 1620
tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 1680
tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt tggcaaagaa ttgcaagttt 1740
gtacaaaaaa gcaggctggc tcgcatctct ccttcacgcg cccgccgccc tacctgaggc 1800
cgccatccac gccggttgag tcgcgttctg ccgcctcccg cctgtggtgc ctcctgaact 1860
gcgtccgccg tctaggtaag tttaaagctc aggtcgagac cgggcctttg tccggcgctc 1920
ccttggagcc tacctagact cagccggctc tccacgcttt gcctgaccct gcttgctcaa 1980
ctctacgtct ttgtttcgtt ttctgttctg cgccgttaca gatccaagct gtgaccggcg 2040
ccaccatggt gtcacaggcc ctgagactgc tgtgtctgct gctgggactg cagggatgtt 2100
tggctgctgg cggagtggct aaagcctctg gcggagagac aagagacatg ccctggaagc 2160
ctggacctca cagagtgttc gtgacccaag aggaagccca cggcgttctg cacagaagaa 2220
gaagggccaa cgccttcctg gaagaactga ggcctggctc tctggaacgc gagtgcaaag 2280
aggaacagtg cagcttcgag gaagccagag agatcttcaa ggacgccgag cggaccaagc 2340
tgttctggat cagctacagc gacggcgacc agtgtgccag ctctccttgt cagaatggcg 2400
gcagctgcaa ggaccagctg cagagctaca tctgcttttg cctgcctgcc ttcgagggca 2460
gaaactgcga gacacacaag gacgaccagc tgatctgcgt gaacgagaac ggcggctgcg 2520
agcagtactg tagcgatcac acaggcacca agcggagctg cagatgtcac gagggctatt 2580
ccctgctggc cgatggcgtt agctgtaccc ctaccgtgga atacccctgc ggcaagatcc 2640
ccatcctgga aaagagaaac gccagcaagc cccagggcag aatcgttggc ggcaaagtgt 2700
gccctaaggg cgagtgtcct tggcaggttc tgctgcttgt gaatggcgct cagctgtgtg 2760
gcggcaccct gatcaatacc atctgggtcg tgtccgccgc tcactgcttc gacaagatca 2820
agaactggcg gaacctgatc gccgtgctgg gagagcacga tctgtctgaa cacgatggcg 2880
acgagcagtc tcggagagtg gcccaagtga tcatccccag cacctatgtg cccggcacca 2940
ccaatcacga tatcgccctg ctcagactgc accagcctgt ggtgctgaca gatcacgtgg 3000
tgcctctgtg cctgccagag aggaccttta gcgagagaac cctggccttc gtgcggttct 3060
ctctggtgtc tggatggggc cagctgctgg atagaggcgc tacagctctg gaactgatgg 3120
tgctgaacgt gcccagactg atgacccagg attgcctgca gcagagcaga aaagtgggcg 3180
acagccccaa catcaccgag tacatgttct gcgccggcta ctccgacggc agcaaggata 3240
gctgtaaagg cgattctggc ggccctcacg ccacacacta tagaggcacc tggtatctga 3300
ccggcatcgt gtcttgggga cagggctgtg ctacagtggg ccactttggc gtgtacacca 3360
gagtgtccca gtacatcgag tggctgcaga aactcatgcg gagcgagcct agacctggcg 3420
tgttgctgag agcccctttt ccttaatcct caggtgcagg ctgcctatca gaaggtggtg 3480
gctggtgtgg ccaatgccct ggctcacaaa taccactgag atctttttcc ctctgccaaa 3540
aattatgggg acatcatgaa gccccttgag catctgactt ctggctaata aaggaaattt 3600
attttcattg caatagtgtg ttggaatttt ttgtgtctct cactcggaag gacatatggg 3660
agggcaaatc atttaaaaca tcagaatgag tatttggttt agagtttggc aacatatgcc 3720
catatgctgg ctgccatgaa caaaggttgg ctataaagag gtcatcagta tatgaaacag 3780
ccccctgctg tccattcctt attccataga aaagccttga cttgaggtta gatttttttt 3840
atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta acatccctaa aattttcctt acatgtttta 3900
ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta ctcccagtca tagctgtccc tcttctctta 3960
tggagatc 3968
<210> 24
<211> 2996
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多核苷酸
<400> 24
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60
gacgtcaata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg 120
gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 180
cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttgtgcccag tacatgacct tatgggactt 240
tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtcg aggtgagccc 300
cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt 360
tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca 420
gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg 480
ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg cgcgctgcct tcgccccgtg 540
ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct gactgaccgc gttactccca 600
caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct ccgggctgta attagctgag caagaggtaa 660
gggtttaagg gatggttggt tggtggggta ttaatgttta attacctgga gcacctgcct 720
gaaatcactt tttttcaggt tggcaagttt gtacaaaaaa gcaggctggc tcgcatctct 780
ccttcacgcg cccgccgccc tacctgaggc cgccatccac gccggttgag tcgcgttctg 840
ccgcctcccg cctgtggtgc ctcctgaact gcgtccgccg tctaggtaag tttaaagctc 900
aggtcgagac cgggcctttg tccggcgctc ccttggagcc tacctagact cagccggctc 960
tccacgcttt gcctgaccct gcttgctcaa ctctacgtct ttgtttcgtt ttctgttctg 1020
cgccgttaca gatccaagct gtgaccggcg ccaccatggt gtcacaggcc ctgagactgc 1080
tgtgtctgct gctgggactg cagggatgtt tggctgctgg cggagtggct aaagcctctg 1140
gcggagagac aagagacatg ccctggaagc ctggacctca cagagtgttc gtgacccaag 1200
aggaagccca cggcgttctg cacagaagaa gaagggccaa cgccttcctg gaagaactga 1260
ggcctggctc tctggaacgc gagtgcaaag aggaacagtg cagcttcgag gaagccagag 1320
agatcttcaa ggacgccgag cggaccaagc tgttctggat cagctacagc gacggcgacc 1380
agtgtgccag ctctccttgt cagaatggcg gcagctgcaa ggaccagctg cagagctaca 1440
tctgcttttg cctgcctgcc ttcgagggca gaaactgcga gacacacaag gacgaccagc 1500
tgatctgcgt gaacgagaac ggcggctgcg agcagtactg tagcgatcac acaggcacca 1560
agcggagctg cagatgtcac gagggctatt ccctgctggc cgatggcgtt agctgtaccc 1620
ctaccgtgga atacccctgc ggcaagatcc ccatcctgga aaagagaaac gccagcaagc 1680
cccagggcag aatcgttggc ggcaaagtgt gccctaaggg cgagtgtcct tggcaggttc 1740
tgctgcttgt gaatggcgct cagctgtgtg gcggcaccct gatcaatacc atctgggtcg 1800
tgtccgccgc tcactgcttc gacaagatca agaactggcg gaacctgatc gccgtgctgg 1860
gagagcacga tctgtctgaa cacgatggcg acgagcagtc tcggagagtg gcccaagtga 1920
tcatccccag cacctatgtg cccggcacca ccaatcacga tatcgccctg ctcagactgc 1980
accagcctgt ggtgctgaca gatcacgtgg tgcctctgtg cctgccagag aggaccttta 2040
gcgagagaac cctggccttc gtgcggttct ctctggtgtc tggatggggc cagctgctgg 2100
atagaggcgc tacagctctg gaactgatgg tgctgaacgt gcccagactg atgacccagg 2160
attgcctgca gcagagcaga aaagtgggcg acagccccaa catcaccgag tacatgttct 2220
gcgccggcta ctccgacggc agcaaggata gctgtaaagg cgattctggc ggccctcacg 2280
ccacacacta tagaggcacc tggtatctga ccggcatcgt gtcttgggga cagggctgtg 2340
ctacagtggg ccactttggc gtgtacacca gagtgtccca gtacatcgag tggctgcaga 2400
aactcatgcg gagcgagcct agacctggcg tgttgctgag agcccctttt ccttaagaat 2460
tcgtcgacat cgattcctca ggtgcaggct gcctatcaga aggtggtggc tggtgtggcc 2520
aatgccctgg ctcacaaata ccactgagat ctttttccct ctgccaaaaa ttatggggac 2580
atcatgaagc cccttgagca tctgacttct ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca 2640
atagtgtgtt ggaatttttt gtgtctctca ctcggaagga catatgggag ggcaaatcat 2700
ttaaaacatc agaatgagta tttggtttag agtttggcaa catatgccca tatgctggct 2760
gccatgaaca aaggttggct ataaagaggt catcagtata tgaaacagcc ccctgctgtc 2820
cattccttat tccatagaaa agccttgact tgaggttaga ttttttttat attttgtttt 2880
gtgttatttt tttctttaac atccctaaaa ttttccttac atgttttact agccagattt 2940
ttcctcctct cctgactact cccagtcata gctgtccctc ttctcttatg gagatc 2996
<210> 25
<211> 6993
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多核苷酸
<400> 25
ctcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 420
tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 480
cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc 540
ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt 600
ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg 660
cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc 720
cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc 780
ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg 840
aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg gagcggctcg gggggtgcgt 900
gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc gctgcccggc ggctgtgagc 960
gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt gcgcgagggg agcgcggccg 1020
ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg 1080
tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt cgggctgcaa ccccccctgc 1140
acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg tgcggggctc cgtacggggc 1200
gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg 1260
cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg 1320
gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg 1380
cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca 1440
ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg 1500
agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc tctccagcct cggggctgtc 1560
cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg 1620
tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 1680
tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt tggcaaagaa ttgcaagttt 1740
gtacaaaaaa gcaggctggc tcgcatctct ccttcacgcg cccgccgccc tacctgaggc 1800
cgccatccac gccggttgag tcgcgttctg ccgcctcccg cctgtggtgc ctcctgaact 1860
gcgtccgccg tctaggtaag tttaaagctc aggtcgagac cgggcctttg tccggcgctc 1920
ccttggagcc tacctagact cagccggctc tccacgcttt gcctgaccct gcttgctcaa 1980
ctctacgtct ttgtttcgtt ttctgttctg cgccgttaca gatccaagct gtgaccggcg 2040
ccaccatggt gtcacaggcc ctgagactgc tgtgtctgct gctgggactg cagggatgtt 2100
tggctgctgg cggagtggct aaagcctctg gcggagagac aagagacatg ccctggaagc 2160
ctggacctca cagagtgttc gtgacccaag aggaagccca cggcgttctg cacagaagaa 2220
gaagggccaa cgccttcctg gaagaactga ggcctggctc tctggaacgc gagtgcaaag 2280
aggaacagtg cagcttcgag gaagccagag agatcttcaa ggacgccgag cggaccaagc 2340
tgttctggat cagctacagc gacggcgacc agtgtgccag ctctccttgt cagaatggcg 2400
gcagctgcaa ggaccagctg cagagctaca tctgcttttg cctgcctgcc ttcgagggca 2460
gaaactgcga gacacacaag gacgaccagc tgatctgcgt gaacgagaac ggcggctgcg 2520
agcagtactg tagcgatcac acaggcacca agcggagctg cagatgtcac gagggctatt 2580
ccctgctggc cgatggcgtt agctgtaccc ctaccgtgga atacccctgc ggcaagatcc 2640
ccatcctgga aaagagaaac gccagcaagc cccagggcag aatcgttggc ggcaaagtgt 2700
gccctaaggg cgagtgtcct tggcaggttc tgctgcttgt gaatggcgct cagctgtgtg 2760
gcggcaccct gatcaatacc atctgggtcg tgtccgccgc tcactgcttc gacaagatca 2820
agaactggcg gaacctgatc gccgtgctgg gagagcacga tctgtctgaa cacgatggcg 2880
acgagcagtc tcggagagtg gcccaagtga tcatccccag cacctatgtg cccggcacca 2940
ccaatcacga tatcgccctg ctcagactgc accagcctgt ggtgctgaca gatcacgtgg 3000
tgcctctgtg cctgccagag aggaccttta gcgagagaac cctggccttc gtgcggttct 3060
ctctggtgtc tggatggggc cagctgctgg atagaggcgc tacagctctg gaactgatgg 3120
tgctgaacgt gcccagactg atgacccagg attgcctgca gcagagcaga aaagtgggcg 3180
acagccccaa catcaccgag tacatgttct gcgccggcta ctccgacggc agcaaggata 3240
gctgtaaagg cgattctggc ggccctcacg ccacacacta tagaggcacc tggtatctga 3300
ccggcatcgt gtcttgggga cagggctgtg ctacagtggg ccactttggc gtgtacacca 3360
gagtgtccca gtacatcgag tggctgcaga aactcatgcg gagcgagcct agacctggcg 3420
tgttgctgag agcccctttt ccttaatcct caggtgcagg ctgcctatca gaaggtggtg 3480
gctggtgtgg ccaatgccct ggctcacaaa taccactgag atctttttcc ctctgccaaa 3540
aattatgggg acatcatgaa gccccttgag catctgactt ctggctaata aaggaaattt 3600
attttcattg caatagtgtg ttggaatttt ttgtgtctct cactcggaag gacatatggg 3660
agggcaaatc atttaaaaca tcagaatgag tatttggttt agagtttggc aacatatgcc 3720
catatgctgg ctgccatgaa caaaggttgg ctataaagag gtcatcagta tatgaaacag 3780
ccccctgctg tccattcctt attccataga aaagccttga cttgaggtta gatttttttt 3840
atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta acatccctaa aattttcctt acatgtttta 3900
ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta ctcccagtca tagctgtccc tcttctctta 3960
tggagatccc tcgacctgca gcccaagctt ggatccccgt tacataactt acggtaaatg 4020
gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaatagta acgccaatag 4080
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 4140
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 4200
cctggcattg tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 4260
tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 4320
tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 4380
cgatgggggc ggggcgaggc ggagaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg 4440
aaagtttcct tttatggcga ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg 4500
gcgggcggga gtcgctgcgc gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg 4560
ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc 4620
ttctcctccg ggctgtaatt agctgagcaa gaggtaaggg tttaagggat ggttggttgg 4680
tggggtatta atgtttaatt acctggagca cctgcctgaa atcacttttt ttcaggttgg 4740
caagtttgta caaaaaagca ggctggctcg catctctcct tcacgcgccc gccgccctac 4800
ctgaggccgc catccacgcc ggttgagtcg cgttctgccg cctcccgcct gtggtgcctc 4860
ctgaactgcg tccgccgtct aggtaagttt aaagctcagg tcgagaccgg gcctttgtcc 4920
ggcgctccct tggagcctac ctagactcag ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct 4980
tgctcaactc tacgtctttg tttcgttttc tgttctgcgc cgttacagat ccaagctgtg 5040
accggcgcca ccatggtgtc acaggccctg agactgctgt gtctgctgct gggactgcag 5100
ggatgtttgg ctgctggcgg agtggctaaa gcctctggcg gagagacaag agacatgccc 5160
tggaagcctg gacctcacag agtgttcgtg acccaagagg aagcccacgg cgttctgcac 5220
agaagaagaa gggccaacgc cttcctggaa gaactgaggc ctggctctct ggaacgcgag 5280
tgcaaagagg aacagtgcag cttcgaggaa gccagagaga tcttcaagga cgccgagcgg 5340
accaagctgt tctggatcag ctacagcgac ggcgaccagt gtgccagctc tccttgtcag 5400
aatggcggca gctgcaagga ccagctgcag agctacatct gcttttgcct gcctgccttc 5460
gagggcagaa actgcgagac acacaaggac gaccagctga tctgcgtgaa cgagaacggc 5520
ggctgcgagc agtactgtag cgatcacaca ggcaccaagc ggagctgcag atgtcacgag 5580
ggctattccc tgctggccga tggcgttagc tgtaccccta ccgtggaata cccctgcggc 5640
aagatcccca tcctggaaaa gagaaacgcc agcaagcccc agggcagaat cgttggcggc 5700
aaagtgtgcc ctaagggcga gtgtccttgg caggttctgc tgcttgtgaa tggcgctcag 5760
ctgtgtggcg gcaccctgat caataccatc tgggtcgtgt ccgccgctca ctgcttcgac 5820
aagatcaaga actggcggaa cctgatcgcc gtgctgggag agcacgatct gtctgaacac 5880
gatggcgacg agcagtctcg gagagtggcc caagtgatca tccccagcac ctatgtgccc 5940
ggcaccacca atcacgatat cgccctgctc agactgcacc agcctgtggt gctgacagat 6000
cacgtggtgc ctctgtgcct gccagagagg acctttagcg agagaaccct ggccttcgtg 6060
cggttctctc tggtgtctgg atggggccag ctgctggata gaggcgctac agctctggaa 6120
ctgatggtgc tgaacgtgcc cagactgatg acccaggatt gcctgcagca gagcagaaaa 6180
gtgggcgaca gccccaacat caccgagtac atgttctgcg ccggctactc cgacggcagc 6240
aaggatagct gtaaaggcga ttctggcggc cctcacgcca cacactatag aggcacctgg 6300
tatctgaccg gcatcgtgtc ttggggacag ggctgtgcta cagtgggcca ctttggcgtg 6360
tacaccagag tgtcccagta catcgagtgg ctgcagaaac tcatgcggag cgagcctaga 6420
cctggcgtgt tgctgagagc cccttttcct taagaattcg tcgacatcga ttcctcaggt 6480
gcaggctgcc tatcagaagg tggtggctgg tgtggccaat gccctggctc acaaatacca 6540
ctgagatctt tttccctctg ccaaaaatta tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct 6600
gacttctggc taataaagga aatttatttt cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg 6660
tctctcactc ggaaggacat atgggagggc aaatcattta aaacatcaga atgagtattt 6720
ggtttagagt ttggcaacat atgcccatat gctggctgcc atgaacaaag gttggctata 6780
aagaggtcat cagtatatga aacagccccc tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc 6840
cttgacttga ggttagattt tttttatatt ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc 6900
cctaaaattt tccttacatg ttttactagc cagatttttc ctcctctcct gactactccc 6960
agtcatagct gtccctcttc tcttatggag atc 6993
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 26
Ser Trp Glu Leu Tyr Tyr Pro Leu Arg Ala Asn Leu
1 5 10
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 27
His Ala Val Asp Ile
1 5
<210> 28
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 28
Asp Gly Glu Ala
1
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 29
Phe Tyr Phe Asp Leu Arg
1 5
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (3)..(3)
<223> 4-羟脯氨酸
<400> 30
Gly Phe Pro Gly Glu Arg
1 5
<210> 31
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
多肽
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (19)..(19)
<223> 4-羟脯氨酸
<400> 31
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro
1 5 10 15
Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
20 25 30
Pro Pro Gly Pro Pro
35
<210> 32
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 32
Val Ala Pro Gly
1
<210> 33
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 33
Arg Gly Asp
1
<210> 34
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 34
Gly Pro Arg
1
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 35
Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 36
Pro His Ser Arg Asn
1 5
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 37
Pro His Ser Arg Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Gly Asp Ser
1 5 10 15
<210> 38
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 38
Arg Glu Asp Val
1
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 39
Ile Lys Val Ala Val
1 5
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 40
Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Ala Ser Ile Lys Val Ala Val Ala Asp
1 5 10 15
Arg
<210> 41
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 41
Leu Arg Glu
1
<210> 42
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 42
Lys Gln Leu Arg Glu Gln
1 5
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 43
Tyr Ile Gly Ser Arg
1 5
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 44
Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg
1 5
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 45
Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu
1 5
<210> 46
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 46
Val Thr Cys Gly
1
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 47
Ser Val Thr Cys Gly
1 5
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 48
Arg Gly Asp Ser Pro
1 5
<210> 49
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 49
Gly Arg Gly Asp Ser Pro
1 5
<210> 50
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 50
Gly Arg Gly Asp
1
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 51
Gly Gly Arg Gly Asp Ser Pro
1 5
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<400> 52
Gly Gly Gly Arg Gly Asp Ser Pro
1 5
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(3)
<223> 该区域可以涵盖1-3个残基
<400> 53
Gly Gly Gly Arg Gly Asp
1 5
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成
肽
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(3)
<223> 该区域可以涵盖1-3个残基
<400> 54
Gly Gly Gly Arg Gly Asp Ser Pro
1 5

Claims (23)

1.一种能够表达和分泌FVII蛋白的工程化的RPE细胞，其中该细胞包含含有编码该FVII蛋白的外源核苷酸序列，其中该编码序列包含选自下组的前体FVII编码序列，该组由以下组成：
(i)SEQ ID NO:3，
(ii)与SEQ ID NO:3至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的核苷酸序列，
(iii)SEQ ID NO:4，和
(iv)与SEQ ID NO:4至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的工程化的RPE细胞，其中该外源核苷酸序列进一步包含与该编码序列可操作地连接的启动子，其中该启动子任选地基本上由以下的核苷酸序列组成或由其组成，该核苷酸序列与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:21相同或基本上相同。
3.如权利要求2所述的工程化的RPE细胞，其中该编码序列包含SEQ ID NO:3，并且该启动子由SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:21组成。
4.如权利要求1所述的工程化的RPE细胞，其中该FVII蛋白是FVII融合蛋白，并且任选地该FVII融合蛋白包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。
5.如权利要求4所述的工程化的RPE细胞，其中该编码序列包含SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18。
6.如权利要求1所述的工程化的RPE细胞，该工程化的RPE细胞包含SEQ ID NO:23、SEQID NO:24或SEQ ID NO:25。
7.如权利要求1所述的工程化的RPE细胞，该工程化的RPE细胞包含SEQ ID NO:22。
8.如权利要求1所述的工程化的RPE细胞，其中该外源核苷酸序列包含染色体外表达载体或被整合到该RPE细胞中的至少一个染色体位置中。
9.如权利要求1所述的工程化的RPE细胞，该工程化的RPE细胞衍生自ARPE-19细胞。
10.一种组合物，该组合物包含如权利要求1所述的工程化的RPE细胞。
11.如权利要求10所述的组合物，该组合物是多克隆细胞培养物或单克隆细胞系的培养物。
12.一种分离的双链DNA分子，该分离的双链DNA分子包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25。
13.如权利要求12所述的分离的DNA分子，该分离的DNA分子基本上由SEQ ID NO:22组成。
14.一种可植入装置，该装置包含至少一个包含如权利要求1所述的工程化的RPE细胞的细胞容纳隔室和至少一种用于减轻当该装置被植入该受试者体内时的异物反应(FBR)的器件。
15.如权利要求14所述的可植入装置，其中该至少一个细胞容纳隔室包含包封该多个工程化的RPE细胞的聚合物组合物，并且任选地包含至少一种细胞结合物质(CBS)。
16.如权利要求14所述的可植入装置，其中该细胞容纳隔室被屏障隔室环绕，该屏障隔室包含海藻酸水凝胶和任选地设置在该屏障隔室外表面的具有式(I)的化合物。
17.如权利要求15所述的可植入装置，其中该聚合物组合物包含用肽共价修饰的藻酸盐，其中该肽基本上由GRGDSP(SEQ ID NO:49)或GGRGDSP(SEQ ID NO:51)组成或由其组成，并且其中该屏障隔室包含用
Figure FDA0003279416300000021
或其药学上可接受的盐修饰的藻酸盐。
18.一种水凝胶胶囊，该水凝胶胶囊包含：
(a)内隔室，其包含包封在第一聚合物组合物中的如权利要求1所述的工程化的细胞，其中该第一聚合物组合物包含形成水凝胶的聚合物；以及
(b)屏障隔室，其环绕该内隔室并且包含第二聚合物组合物，其中该第二聚合物组合物包含用如下表所示的至少一种化合物或该化合物的药学上可接受的盐共价修饰的藻酸盐，该至少一种化合物选自下组，该组由以下组成：化合物100、化合物101、化合物110、化合物112、化合物113、和化合物114：
Figure FDA0003279416300000031
19.如权利要求18所述的水凝胶胶囊，其中所选择的化合物是
Figure FDA0003279416300000032
20.如权利要求18所述的水凝胶胶囊，其中该内隔室包含多个如权利要求1所述的工程化的细胞，任选地其中该内隔室中的该工程化的细胞的浓度为至少4000万个细胞/ml该第一聚合物组合物。
21.如权利要求18所述的水凝胶胶囊，其中该工程化的细胞衍生自ARPE-19并且包含SEQ ID NO:25。
22.一种组合物，该组合物包含多个如权利要求18所述的水凝胶胶囊。
23.一种向有需要的患者递送FVII疗法的方法，该方法包括施用如权利要求14所述的装置、如权利要求18所述的水凝胶胶囊、或如权利要求22所述的组合物。
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