JP4545928B2 - 第ｖｉｉｉ因子及び中性リポソームを含有する薬学的組成物 - Google Patents
第ｖｉｉｉ因子及び中性リポソームを含有する薬学的組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4545928B2 JP4545928B2 JP2000545506A JP2000545506A JP4545928B2 JP 4545928 B2 JP4545928 B2 JP 4545928B2 JP 2000545506 A JP2000545506 A JP 2000545506A JP 2000545506 A JP2000545506 A JP 2000545506A JP 4545928 B2 JP4545928 B2 JP 4545928B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fviii
- pharmaceutical composition
- colloidal particles
- lipid
- factor viii
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 title claims abstract description 112
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 title claims abstract description 112
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 title claims abstract description 109
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 239000002502 liposome Substances 0.000 title description 60
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 36
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 35
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 35
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 17
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims abstract description 5
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 claims description 19
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 claims description 17
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 15
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 11
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims description 10
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 229940105778 coagulation factor viii Drugs 0.000 claims description 3
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 claims description 2
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 claims description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 20
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 13
- 238000009739 binding Methods 0.000 abstract description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 8
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 8
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 7
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 description 6
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 5
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 3
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 3
- VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N Cu+ Chemical compound [Cu+] VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 3
- -1 activated imidazole compound Chemical class 0.000 description 3
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 description 3
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 3
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 229940047434 kogenate Drugs 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 3
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 description 3
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 description 3
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 2
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 2
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 2
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 2
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 2
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 2
- 238000002266 amputation Methods 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 101100008046 Caenorhabditis elegans cut-2 gene Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000603 anti-haemophilic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N cyanuric chloride Chemical group ClC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- A61K38/37—Factors VIII
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液凝固疾患の治療のための凝固促進物質を除放するための安定な薬学的製剤(pharmaceutical formulation)に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血友病Ａは、最も度々発生する遺伝性凝固疾患の１つである。血友病Ａの患者は、凝固系の１又はそれ以上が誤機能する結果、頻繁な出血の傾向がある。血友病の原因の１つは、血液中の第VIII因子（ＦVIII）の欠乏である。この問題は、第VIII因子濃縮物により治療し得る。しかしながら、患者の約１５％において、第VIII因子中和抗体（いわゆる、阻害剤）が発生し、これにより、第VIII因子濃縮物(concentrate)を用いる治療は、ほとんど不可能である。
【０００３】
文献には、ＦVIIIを阻害剤による不活化から保護するための２つの基本的なアプローチが記載されている。
【０００４】
ヘムカー(Hemker)のＷＯ／８０／０１４５６には、リン脂質から形成される０．５〜１．０ミクロンのリポソーム内に取り込まれたＦVIIIを含む経口投与に好適な薬学的組成物が開示されている。リン脂質は、正味電荷を有し、ＦVIIIは、リポソームの層間に取り込まれる。血漿中のＦVIIIレベルは、５０時間の間、正常値の約５％に維持されることが特許請求されている。
【０００５】
ホリコシのＵＳ ４，３４８，３８４には、ヘムカーに記載される組成物を調製したが、満足な結果は得られなかったことが述べられている。そこで、ホリコシは、ＦVIIIを蛋白分解から保護するために、リポソーム内にＦVIIIとともにプロテアーゼ阻害剤を取り込んでいる。ＦVIIIの正常血中レベルの３％が６時間にわたり得られている。
【０００６】
ウードル(Woodle)のＵＳ ５，０１３，５５６には、血流を通して各種の薬剤を配達するために用いるリポソーム組成物が開示されている。このリポソームには、ポリアルキルエーテルにより誘導された両親媒性リピド１〜２０モルパーセントが含有されている。ここでも、薬剤化合物は、リポソーム内に取り込まれている。これらのリポソーム組成物は、ステアルス小胞(Stealth(登録商標) vesicle)の名称で（ＳＵＶ’ｓ、リン脂質及びリン脂質に共有結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有する小さい単房小胞）、商業的に入手可能である。
【０００７】
このアプローチに伴う更なる問題は、大きい直径を有するリポソームが短い半減期を有することにある。従って、リポソームは、高圧下にサイズダウンしなければならず、凝固因子Ｖ及びVIII内おけるような蛋白活性に影響を及ぼし得る。
【０００８】
第２のアプローチにおいて、バロウクリフ(Barrowcliffe)，Ｔ．Ｗ．，ら（１９８３）、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１０１：３４〜４３には、ＦVIIIをヒト及び／又は動物の脳から抽出したリン脂質と混合することにより、イン・ビトロでＦVIIIへの有意な保護が付与されることが教示されている。このアプローチでは、リン脂質は、それを被胞するというよりは、むしろ、ＦVIIIに結合している。ケンボル−クック(Kemball-Cook)，Ｇ．及びバロウクリフ，Ｔ．Ｗ．（１９９２）、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．６７：５７〜７１には、負電荷を帯びたリン脂質表面が、ＦVIII結合に必要であることが教示されている。負電荷を帯びたホスファチジルセリン及びホスファチジン酸がＦVIIIに対する結合が高活性である一方で、ホスファチジルコリンは、不活性であることが見出された。しかしながら、負に電荷したリン脂質は、毒性があり、脳組織由来のリン脂質は、細胞変性剤を同伴し得る。
【０００９】
ＥＰ ６８９，４２８には、親水性ポリマー鎖の外表面層を有するリポソームを含有するリポソーム組成物が開示されている。ポリペプチド又は多糖類エフェクター分子が、エフェクター結合に先立つリピドアンカーの活性化によりポリマー鎖の遠心端に共有結合している。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、治療的処置のための蛋白又はポリペプチドを含有する薬学的組成物を提供することである。具体的には、本発明の目的は、血液凝固疾患の治療のためのＦVIIIを含有する薬学的組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる目的は、血流中で延長された半減期を有する形態にあるＦVIIIを提供することである。
【００１２】
本発明の更なる目的は、血液凝固疾患に罹った患者、具体的には、血友病、最も具体的には、ＦVIII阻害剤を有する患者を治療する方法を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の一つの側面において、非経口投与のための薬学的組成物であって、治療的に有効量の凝固因子ＶIII（ＦVIII）及び実質的に中性のコロイド状粒子を含み、前記粒子が生物適合性親水性ポリマーにより誘導された両親媒性リピドを１〜２０モルパーセント含み、前記ポリマーが実質的に正味電荷を有さないものである組成物において、前記ＦVIIIがコロイド状粒子内に被包されていないものである組成物、が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、生物適合性親水性ポリマー(biocompatible hydrophilic polymer)により誘導された中性リン脂質が、ＦVIIIと結合させるために用い得、ＦVIIIを血流中の阻害剤から保護し得るという驚くべきかつ予測外の発見に基づいている。これにより、従来の組成物よりも有意な利点が提供される。なぜならば、用いられるリン脂質は、合成品であり、非毒性であり、従って、治療的処置のためにイン・ビボで用い得るからである。さらに、リポソームは、ＦVIIIを被包しないので、イン・ビボにおいてより長い半減期を有するより小サイズのリポソームを用いることができる。これは、細網内皮系により除去されないからである。以下に、より詳細に記載するように、ＦVIIIは、リポソームの外表面上のポリマー鎖と非共有的に相互作用し、ＥＰ ６８９，４２８に開示される組成物とは異なり、ポリマー鎖を活性化するための化学反応は行われない。
【００１５】
本明細書において、「実質的に中性」及び「実質的に正味電荷がない」との用語は、正にも負にも電荷されていないことを意味する。しかしながら、実験誤差ゼロの範囲内の非常に低い測定電荷は、上記用語の意味に含まれる。
【００１６】
「治療的に有効量」との用語は、所望の治療効果を有するＦVIIIの血流中レベルをもたらすＦVIIIの量をいう。そのような量は、異なる量のＦVIIIを含む組成物を投与し、投与後の様々な時間に血液中のレベルを測定することにより実験的に測定することができる。
【００１７】
コロイド状粒子を調製するために用いる両親媒性リピドは、好ましくは、リン脂質であり、天然源又は合成源のいずれからでも入手し得る。最も好ましいリン脂質は、ホスファチジルコリンであり、最も好ましくは、卵−ホスファチジルコリンである。
【００１８】
生物適合性親水性ポリマーには、ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸又はポリグリコール酸ファミリー由来のポリマーが含まれる。好ましくは、生物適合性親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。このポリマーの目的は、立体的にＳＵＶsを安定化し、それによりイン・ビボでの小胞の融合を防止し、イン・ビボにおいて小胞がＲＥＳにより吸着することを回避することを可能にする。生物適合性親水性ポリマーは、好ましくは約１０００ないし約５０００ダルトン、最も好ましくは、約２０００ダルトンの分子量を有するであろう。
【００１９】
コロイド状粒子は、好ましくは、平均粒子直径約０．０５ないし約０．４ミクロン、最も好ましくは、約０．１ミクロンを有する。これは、コロイド状粒子のイン・ビボにおける循環時間を増加させ、ＲＥＳによりそれらが吸着されることを防止するためである。両親媒性リピドは、粒子の約１ないし約２０モル％、好ましくは、約１〜５％、最も好ましくは、５％を構成する。
【００２０】
親水性ポリマーにより誘導される小胞形成リピドを調製するために、多様な既知の結合反応を用いることができる。例えば、ポリマー（ＰＥＧのような）を、塩化シアヌル基を通してホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）のようなリピドに誘導し得る。その代りに、キャップしたＰＥＧをカルボニルジイミダゾールカップリング剤により活性化し、活性化イミダゾール化合物を形成することができる。他の反応は周知であり、例えば、前述のＵ．Ｓ． ５，０１３，５５６（この内容は、引用により本明細書に取り込む）に列記されている。
【００２１】
本発明の組成物において用いられるＦVIIIは、商業的に入手可能である。天然のヒト起源由来であってもよいし、または、好ましくは、組換えにより調製することもできる。組換えＦVIIIは、商業的に入手可能であり、例えば、抗血友病因子（レコンビナント(Recombinant)）、ｒＦVIII−ＳＱ（ファルマシア(Pharmacia)）、及びとりわけ、コゲネート(Kogenate)、マイルス社(Miles Inc.,)、薬学部門、エルクハート(Elkhart)、インデティアナ州、アメリカ合衆国が挙げられる。
【００２２】
本発明の組成物は、非経口的に投与され、好ましくは、静脈内投与される。従来の組成物は、リポソーム組成物による注射中に引き起こされる副作用故に、経口使用のみであった。これに対して、本発明の組成物は、その他の理由のなかでも、おそらくは荷電を欠如しているが故に、注射により非毒性である。本発明のコロイド状粒子は、検知し得る毒性症状を伴わず、０．５ｇｍ／体重Ｋｇまでの量注射されてきた。投与量は、およそ２５〜７５ｉ．ｕ．／体重Ｋｇの範囲であることが期待される。粒子対ＦVIII比（Ｗ／ユニットＦVIII）は、好ましくは、約０．１ｍｇ／ユニット及び約１０ｍｇ／ユニットの間、最も好ましくは、約１ｍｇ／ユニットであろう。遊離の形態のＦVIII：Ｃの半減期は、マウスにおいて２時間未満であるが（凝固活性により測定されるＦVIII）、本発明の組成物中において投与されるＦVIIIは、少なくとも２４時間有効であることが期待される。この半減期は、前記凝固促進化合物の有効活性の期間である。本発明の組成物は、「オン・デマンド」であり、かつ血友病患者の予防的治療、特に、ＦVIII阻害抗体を発現した患者に有効であることが期待される。
【００２３】
本発明の組成物に含有されるＦVIIIの有効性は、次の２つの連続工程：（１）精製された成分を含有する凝固因子試薬におけるＸ因子のＸａ因子へのＦVIII依存的転換工程、及び（２）色素因子Ｘａ基質の酵素的解裂により、分光測光により定量化し得る色素を得る工程、によりＦVIII活性を測定する色素アッセイにより測定することができる。適切なアッセイ条件下において、Ｘａ因子形成速度とＦVIII濃度との間には直線関係がある。更に、ＦVIII活性は、一段階凝固アッセイにより測定し得る。このアッセイは、プロスロンビンからスロンビンへの転換（スロンビンは、引き続いて、フィブリノーゲンを解裂し、フィブリンを含む血塊を形成する）によりＦVIII活性を測定する。血友病マウスにおけるＦVIII活性は、尾切断後のマウスの生存数を測定することによっても決定し得る。
【００２４】
本発明のさらなる側面において、非経口投与のための薬学的組成物であって、薬学的に有効量の蛋白又はポリペプチド及び実質的に中性のコロイド状粒子を含有し、前記粒子が、生物適合性親水性ポリマーにより誘導される両親媒性親水性ポリマーを約１〜２０モルパーセント含有し、前記ポリマーが実質的に正味電荷を有しない組成物において、前記蛋白又はポリペプチドが、（ａ）前記コロイド状粒子に外部から結合し得る蛋白又はポリペプチド、及び（ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合し得る蛋白又はポリペプチドからなる群から選択され、前記蛋白又はポリペプチドが、前記コロイド状粒子内に被包されていないものである薬学的組成物、が提供される。
【００２５】
「前記コロイド状粒子に外部から結合し得る蛋白又はポリペプチド」との用語には、蛋白及びポリペプチドであって、ＦVIIIと同様に、ホスファチジルコリン：ホスファチジルセリン（ＰＣ：ＰＳ）を含む膜に結合するものが含まれる（恒常性及び血栓症(Haemostasis and Thrombosis)、アルサー(Arthur) Ｌ．、ブルーム及びダンカン(Bloom and Duncan)、Ｐ．トーマス(Thomas)（編）（１９８７）、チャーチル リビングストン(Churchill Livingstone)、１７９〜１８０頁を参照）。そのような蛋白の例は、プロスロンビン、Ｘ因子及びＶ因子のような凝固因子であるが、これらに限られるものではない。
【００２６】
「ポリエチレングリコールに結合し得る蛋白又はポリペプチド」との用語には、蛋白及びポリペプチドであって、イオン相互作用、疎水性相互作用、水素結合及びファンデルワールス力のような、非共有性メカニズムによりＰＥＧ又はＰＥＧの誘導体に結合するものが含まれる（アラカワ、Ｔ．及びチマシェフ(Timasheff)、Ｓ．Ｎ．（１９８５）、バイオケミストリー ２４：６７５６〜６７６２；リー(Lee)，Ｊ．Ｃ．及びリー、Ｌ．Ｌ．Ｙ．（１９８１） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６：６２５〜６３１）。
【００２７】
［好ましい態様の詳細な説明］
例１〜３
方法及び材料
１．卵ホスファチジルコリン（Ｅ−ＰＣ）リポソーム
卵ホスファチジルコリン（Ｅ−ＰＣ）のｔｅｒｔ−ブタノール溶液を、１８ｍｌのｔｅｒｔ−ブタノール中に２．０ｇのＥ−ＰＣ、１．９ｍｇのα−トコフェロール及び蛍光標識されたホスファチジルエタノールアミン（１：１０００リピドモル比）を溶解することにより調製した。
【００２８】
凍結乾燥によりリピド混合物から有機溶媒を除去し、リピドを水に再溶解し、１０％（ｗ／ｖ）にした。得られたリポソームを、Ｌｉｐｏｓｏｆａｓｔ−Ｂａｓｉｃ又はＬｉｐｏｓｏｆａｓｔ−５０押出し機（Ａｖｅｓｔｉｎ）を用いてポリカーボネート（ＰＣ）フィルター（０．４μｍ、０．２μｍ、０．１μｍ及び０．０５μｍ）を連続的に通して押出すことにより、リポソームのサイズを低減させ、平均サイズ０．１μｍのリポソームを得た。
【００２９】
２．卵ホスファチジルコリン／ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン（Ｅ−ＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥ）リポソーム
卵ホスファチジルコリン（Ｅ−ＰＣ）及びポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）のｔｅｒｔ−ブタノール溶液を、１８ｍｌのｔｅｒｔ−ブタノール中に０．７３ｇのＥ−ＰＣ、０．１８５ｇのＰＥＧ−ＰＥ、０．８６ｍｇのα−トコフェロール及び蛍光標識されたホスファチジルエタノールアミン（１：１０００リピドモル比）を混合することにより調製した。
【００３０】
凍結乾燥によりリピド混合物から有機溶媒を除去し、次いで、リピドを水に再溶解し、１０％（ｗ／ｖ）にした。上記１に記載したようにして、得られたリポソームのサイズを低減させ、平均サイズ０．１μｍのリポソームを得た。
【００３１】
３．卵ホスファチジルコリン−ホスファチジルグリセロール（Ｅ−ＰＣ／ＰＧ）リポソーム
卵ホスファチジルコリン（Ｅ−ＰＣ）及びホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のｔｅｒｔ−ブタノール溶液を、１８ｍｌのｔｅｒｔ−ブタノール中に０．８２２ｇのＥ−ＰＣ、０．０９２４ｇのＰＧ、０．８６ｍｇのα−トコフェロール及び蛍光標識されたホスファチジルエタノールアミン（１：１０００リピドモル比）を混合することにより調製した。
【００３２】
凍結乾燥によりリピド混合物から有機溶媒を除去し、次いで、リピドを水に再溶解し、１０％（ｗ／ｖ）にした。上記１に記載したようにして、得られたリポソームのサイズを低減させ、平均サイズ０．１μｍのリポソームを得た。
【００３３】
４．ヒト組替え第VIII因子の再溶解
コゲネート(Kogenate)（ヒトアルブミンと共に製剤されたｒＦVIII、バイエル(Bayer)）のロット７０Ｋ０２６及び７０Ｋ０２７を以下の例で用いた。約５００ＩＵのＦVIII活性を含有する１つのバイアルを水２ｍｌに再溶解し、安定化させた。２００μｌのアリクオットを使用するまで−２０℃に凍結した。
【００３４】
アルブミン枯渇コゲネートの調製のために、ロット＃７０Ｋ０２７を用いた。コゲネート１０バイアルを２０ｍｌの水に再溶解し、親水性シリカゲル（３〜１０μｍビーズ）でクロマトグラフに供した。１０ｍｌのフラクションを回収し、蛋白及びＦVIII：Ａｇ活性をモニターした。フラクション４〜６の１つのピーク及びフラクション８〜１４の別のピークにおいて、ＦVIII：Ａｇ活性の回収率５０％を認めた。蛋白アッセイによりフラクション９〜１２にピークが得られたので、フラクション４〜６をプールし、アリクオットにして凍結乾燥し、更なる使用に供した。
【００３５】
５．ビ(Bi)．Ｌ．，ら（１９９５）のネイーチャー・ジェネティクス、１０：１１９〜１２１に記載されるようにして調製した血友病マウスを用いた。
【００３６】
６．スイス、ＤｕｄｉｎｇｅｎのＤａｄｅ ＡＧから商業的に入手可能なＦVIII色素アッセイを用いて、ＦVIII：Ａｇ活性を測定した。
【００３７】
７．組成物の調製及び血友病マウスへの注射
リポソームアリクオットを所定の体積のＦVIIIと混合し、５〜１０ＩＵ／ｍｌのＦVIII：Ａｇ活性を得、室温で回転させ、均質にした。
【００３８】
８．５〜１０匹の血友病マウスの群に、２００又は４００μｌの混合物と共にIVボーラス(IV bolus)を尾静脈を通して注射した。規則的な時間間隔（１時間、４時間、８時間、２４時間、３２時間及び４８時間）でマウスの目から採血し、血漿中のＦVIII：Ａｇ活性を追跡した。
【００３９】
９．ＲＳＴＲＩＰコンピュータソフトウエアーを用いて得られた結果から、ＦVIIIの薬学速度論を測定し、マウス血液循環における初ＦVIII：Ｃ活性（Ａ0）及びVIII因子の半減期（Ｔ1/2）を得た。
【００４０】
結果
１．第VIII因子の半減期へのリピド組成物の影響
Ｅ−ＰＣ、Ｅ−ＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥ及びＥ−ＰＣ／ＰＧを含む０．０５μｍのリポソームを調製し、コゲネートと７２：１のリピド対蛋白（Ｗ／Ｗ）比率に混合し、血友病マウスに注射した。対照として、コゲネートを生理食塩水に希釈し、リポソーム混合物と同様にしてマウスに注射した。薬学速度論パラメータを上述のようにして求めた。結果を以下の表に要約する。
【００４１】
【表１】
【００４２】
上記表から、Ｅ−ＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥを含有するリポソームの初ＦVIII活性及び半減期は、リポソームがＥ−ＰＣ／ＰＧ又はＥ−ＰＣのみから構成されるコゲネート又はコゲネート−リポソーム混合物よりも高いので、Ｅ−ＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥを含有するリポソームが最も有効であったことが明らかである。
【００４３】
さらに、遊離のＦVIIIを注射されたマウスの４０％及びＦVIII／ＰＣ複合体を注射されたマウスの１００％は、ＦVIII色素活性の回復を見せなかった一方で、ＦVIII／ＰＣ＋ＰＥＧを注射されたマウスの１０％は、注射後６０分で同じ現象を見せた。
【００４４】
２．第VIII因子の半減期へのリピド／蛋白比の影響
Ｅ−ＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥを含有する０．０５μｍのリポソームの様々なアリクオットをコゲネートと混合することにより、リポソーム組成物における様々なリピド対蛋白比を得た。これらを血友病マウスに注射した。対照として、コゲネートを生理食塩水で希釈し、リポソーム混合物と同じ方法でマウスに注射した。薬学速度論を上述のようにして求めた。結果を以下の表に要約する。
【００４５】
【表２】
【００４６】
表２から、リピド／蛋白比を増加することにより、血友病マウスの血流中のＦVIIIの半減期が増加することが分かる。初ＦVIII：Ｃ活性における差違は、リピド／蛋白比に無関係なようである。
【００４７】
３．異なる第VIII因子源の影響
Ｅ−ＰＣ及びＰＥＧ−ＰＥ（９４：６モル％）を含有する０．０５μｍのＳＵＶｓを調製し、様々な源由来（コゲネート、バクスター(Baxter)及びオムリキシエート(Omrixate)）のＦVIII濃縮物と７２：１のリピド対蛋白比に混合し、血友病マウスに注射した。対照として、様々な源由来のＦVIIIの濃縮物の各々を生理食塩水に希釈し、リポソーム混合物と同じ方法でマウスに注射した。薬学速度論を上述のようにして求めた。結果を以下の表に要約する。
【００４８】
【表３】
【００４９】
上記表から明らかなように、遊離の因子の薬学速度論と比較して、リポソーム及びバクスター又はオムリキシエート由来のＦVIIIを含有する混合物は、この因子の半減期を２０％増加させた。コゲネート由来のＦVIII因子の半減期は、Ｅ−ＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥリポソームと混合された場合、遊離形態の因子と比較して２倍長かった。
【００５０】
例４
方法及び材料
１．リポソーム調製：
リポソームを次のようにして調製した：卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）及びジステアロイルホスファチジル−エタノールアミンメチルポリエチレングリコール２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ ２０００）を８０：２０ｗ／ｗの割合（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ ２０００の５％モル比）にそれぞれ秤量し、ｔｅｒｔ−ブタノール（Ｒｅｉｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ）中に１０％ｗ／ｖに溶解し、溶液を凍結乾燥した。得られた乾燥リピド粉末を、１３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１ｍＭのＣａＣｌ2を含有する緩衝液（ｐＨ７．０）に１０％ｗ／ｖに再懸濁させ、リポソームを形成した。１．２μｍ、０．２μｍ及び０．１μｍサイズのポリカーボネートフィルターを通して押出し機（Ａｖｅｓｔｉｎ）でろ過し、１２０〜１４０ｎｍサイズのリポソームを形成した。
【００５１】
２．リポソーム品質管理
リポソームの品質管理には、
１）サブミクロン粒子分析器（Ｎ４プラス、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）により測定したサイズ分布
２）リン脂質測定（リンによる）
３）ＴＬＣによるリピドの化学的安定性
が含まれる。
【００５２】
試験は、バレンホルツ(Barenholz)，Ｙ．及びアムセレム(Amselem)，Ｓ．（１９９３）のリポソームテクノロジー、第２版、Ｉ巻（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，編）、フロリダ州、ボカレイトン(Boca Rayton)のＣＲＣプレス、５２７〜６１６頁に記載されるようにして行った。
【００５３】
３．ＦVIII及びリポソームの製剤
コゲネート（ロット番号７０Ｋ０２７、６２０ＩＵ）又はニューコゲネート(New Kogenate)（５００ＩＵ）を１ｍｌ又は２ｍｌのＨ2Ｏに溶解した。ｒＦVIII−ＳＱ濃縮物をリポソーム溶液に溶解した。第VIII因子濃縮物をリポソームと室温で約１時間混合することにより、第VIII因子をリポソームと製剤した。リピド対ＦVIIIユニットの比は、約１ｍｇリピド／１ユニットＦVIIIであった。
【００５４】
４．血友病マウスへの注射及び採血手順
第VIII因子及びリポソームと製剤されたＦVIIIを血友病マウスの尾静脈に注射した。注射投与量は、コゲネート（２つの別の実験）及びニューコゲネートについては３ユニット／マウス、並びにｒＦVIII−ＳＱについては４ユニット／マウスであった。注射後１０分において、並びに注射後約４、１９及び２７時間において、クエン酸塩試験管にマウスから採血した。
【００５５】
５．マウス血漿におけるＦVIII濃縮物の測定
色素アッセイ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を用いて製造者の指示に従い、及び１段階凝固アッセイ（Ｓｔａｇｏ ｒｅａｇｅｎｔｓ及びＳＴ４凝固機を用いた）により製造者の指示に従い、マウス血漿中のヒトＦVIII濃縮物を測定した。
【００５６】
６．薬学速度論分析
薬学速度論パラメータは、コンピュータプログラム（ＲＳＴＲＩＰ、ＭｉｃｒｏＭａｔｈ社）を用いて分析した。
【００５７】
７．尾切断後の血友病マウスの生存数
ｒＦVIII−ＳＱ又はリポソームと製剤されたｒＦVIII−ＳＱをマウスに注射した（４ユニット／マウス、各々の群１１匹のマウス）。注射後２０時間において、尾を２ｃｍ切断した。投与後２８、４４、５２、６９、８８及び１４０時間において、生存しているマウスの尾を再び切断した（各々の回、２ｍｍ）。
【００５８】
結果
４つの異なる実験の、各々の注射後の時点におけるＦVIII活性及び薬学速度論パラメータ｛ＦVIII半減期（ＨＬ）及び曲線下エリア（ＡＵＣ）｝の結果を表４〜７Ｂに要約する。表４及び５において、３ユニットのコゲネート／マウスが注射された。表６において、３ユニットのニューコゲネート／マウスが注射された。また、表７Ａ、７Ｂ及び図１において、４ユニットのｒＦVIII−ＳＱ／マウスが注射された。
【００５９】
【表４】
【００６０】
【表５】
【００６１】
【表６】
【００６２】
【表７】
【００６３】
【表８】
【００６４】
さらに、各々のマウスにおけるヒトＦVIIIの半減期を計算し、全ての実験群におけるＦVIII半減期をスチューデント試験により統計的に互いに比較した。
【００６５】
４つの実験すべてにおいて、リポソームと製剤されたＦVIIIを受けた群におけるヒトＦVIII半減期は、遊離のＦVIIIを受けた群におけるヒトＦVIIIよりも高くかつ有意に異なる（ｐ＜０．０５５）：
コゲネートのＨＬ対コゲネート＋リポソームのＨＬ（表４）ｐ＝０．０５４；
コゲネートのＨＬ対コゲネート＋リポソームのＡＵＣ（表５）ｐ＝０．０３１；
ニューコゲネートのＨＬ対ニューコゲネート＋リポソームのＨＬ（表６）ｐ＝０．００８５
ｒＦVIII−ＳＱのＨＬ対ｒＦVIII−ＳＱ＋リポソームのＨＬ（表７Ａ）ｐ＝０．００４５；
ｒＦVIII−ＳＱのＨＬ対ｒＦVIII−ＳＱ＋リポソームのＨＬ（表７Ｂ）ｐ＝０．０２２）。
【００６６】
これらの結果は、コゲネート、ニューコゲネート又はｒＦVIII−ＳＱのリポソームとの製剤は、第VIII因子の半減期（ＨＬ）及び血友病マウス（ＨＬ及びＡＵＣについて１．６〜２．０の因子）におけるＦVIIIの曲線下エリア(area under the curve)（ＡＵＣ）を有意に増加させることを示している。
【００６７】
マウスの生存数を図１に示す。尾切断実験の結果は、リポソームと製剤されたＦVIIIは、遊離のＦVIIIよりも生物学的に活性であり、従って、血友病患者をより長い期間保護し得ることを示している。
【００６８】
例５
阻害剤を有する患者におけるＦVIII組成物の影響
ＦVIII（コゲネート）１５ユニットを、ＥＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）を含有する１２０ｎｍリポソーム（１５ｍｇリピド）と室温で１時間インキュベートした。次いで、阻害剤（抗ＦVIII抗体）を発現した血友病患者からの血漿の様々な希釈物とともに、１ユニットの遊離のＦVIII（コゲネート）又は１ユニットのリポソームと製剤されたＦVIIIを３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの後、第VIII因子の活性を色素アッセイにより測定した。
【００６９】
表８に結果を要約する：
【表９】
【００７０】
この実験から、コロイド状粒子と一緒にＦVIIIを投与することは、ＦVIIIを血漿阻害剤から保護することに有効であることが明らかに分かる。
【図面の簡単な説明】
本発明を理解し、及び本発明がどのようにして実施し得るかが分かるために、制限を課することのない例のみにより好ましい態様を添付の図面を言及して説明する。
【図１】 図１には、ＦVIIIを注射され、引き続いて注射後の様々な時間において尾を切断された血友病マウスの生存数を示している。
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液凝固疾患の治療のための凝固促進物質を除放するための安定な薬学的製剤(pharmaceutical formulation)に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血友病Ａは、最も度々発生する遺伝性凝固疾患の１つである。血友病Ａの患者は、凝固系の１又はそれ以上が誤機能する結果、頻繁な出血の傾向がある。血友病の原因の１つは、血液中の第VIII因子（ＦVIII）の欠乏である。この問題は、第VIII因子濃縮物により治療し得る。しかしながら、患者の約１５％において、第VIII因子中和抗体（いわゆる、阻害剤）が発生し、これにより、第VIII因子濃縮物(concentrate)を用いる治療は、ほとんど不可能である。
【０００３】
文献には、ＦVIIIを阻害剤による不活化から保護するための２つの基本的なアプローチが記載されている。
【０００４】
ヘムカー(Hemker)のＷＯ／８０／０１４５６には、リン脂質から形成される０．５〜１．０ミクロンのリポソーム内に取り込まれたＦVIIIを含む経口投与に好適な薬学的組成物が開示されている。リン脂質は、正味電荷を有し、ＦVIIIは、リポソームの層間に取り込まれる。血漿中のＦVIIIレベルは、５０時間の間、正常値の約５％に維持されることが特許請求されている。
【０００５】
ホリコシのＵＳ ４，３４８，３８４には、ヘムカーに記載される組成物を調製したが、満足な結果は得られなかったことが述べられている。そこで、ホリコシは、ＦVIIIを蛋白分解から保護するために、リポソーム内にＦVIIIとともにプロテアーゼ阻害剤を取り込んでいる。ＦVIIIの正常血中レベルの３％が６時間にわたり得られている。
【０００６】
ウードル(Woodle)のＵＳ ５，０１３，５５６には、血流を通して各種の薬剤を配達するために用いるリポソーム組成物が開示されている。このリポソームには、ポリアルキルエーテルにより誘導された両親媒性リピド１〜２０モルパーセントが含有されている。ここでも、薬剤化合物は、リポソーム内に取り込まれている。これらのリポソーム組成物は、ステアルス小胞(Stealth(登録商標) vesicle)の名称で（ＳＵＶ’ｓ、リン脂質及びリン脂質に共有結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有する小さい単房小胞）、商業的に入手可能である。
【０００７】
このアプローチに伴う更なる問題は、大きい直径を有するリポソームが短い半減期を有することにある。従って、リポソームは、高圧下にサイズダウンしなければならず、凝固因子Ｖ及びVIII内おけるような蛋白活性に影響を及ぼし得る。
【０００８】
第２のアプローチにおいて、バロウクリフ(Barrowcliffe)，Ｔ．Ｗ．，ら（１９８３）、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１０１：３４〜４３には、ＦVIIIをヒト及び／又は動物の脳から抽出したリン脂質と混合することにより、イン・ビトロでＦVIIIへの有意な保護が付与されることが教示されている。このアプローチでは、リン脂質は、それを被胞するというよりは、むしろ、ＦVIIIに結合している。ケンボル−クック(Kemball-Cook)，Ｇ．及びバロウクリフ，Ｔ．Ｗ．（１９９２）、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．６７：５７〜７１には、負電荷を帯びたリン脂質表面が、ＦVIII結合に必要であることが教示されている。負電荷を帯びたホスファチジルセリン及びホスファチジン酸がＦVIIIに対する結合が高活性である一方で、ホスファチジルコリンは、不活性であることが見出された。しかしながら、負に電荷したリン脂質は、毒性があり、脳組織由来のリン脂質は、細胞変性剤を同伴し得る。
【０００９】
ＥＰ ６８９，４２８には、親水性ポリマー鎖の外表面層を有するリポソームを含有するリポソーム組成物が開示されている。ポリペプチド又は多糖類エフェクター分子が、エフェクター結合に先立つリピドアンカーの活性化によりポリマー鎖の遠心端に共有結合している。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、治療的処置のための蛋白又はポリペプチドを含有する薬学的組成物を提供することである。具体的には、本発明の目的は、血液凝固疾患の治療のためのＦVIIIを含有する薬学的組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる目的は、血流中で延長された半減期を有する形態にあるＦVIIIを提供することである。
【００１２】
本発明の更なる目的は、血液凝固疾患に罹った患者、具体的には、血友病、最も具体的には、ＦVIII阻害剤を有する患者を治療する方法を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の一つの側面において、非経口投与のための薬学的組成物であって、治療的に有効量の凝固因子ＶIII（ＦVIII）及び実質的に中性のコロイド状粒子を含み、前記粒子が生物適合性親水性ポリマーにより誘導された両親媒性リピドを１〜２０モルパーセント含み、前記ポリマーが実質的に正味電荷を有さないものである組成物において、前記ＦVIIIがコロイド状粒子内に被包されていないものである組成物、が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、生物適合性親水性ポリマー(biocompatible hydrophilic polymer)により誘導された中性リン脂質が、ＦVIIIと結合させるために用い得、ＦVIIIを血流中の阻害剤から保護し得るという驚くべきかつ予測外の発見に基づいている。これにより、従来の組成物よりも有意な利点が提供される。なぜならば、用いられるリン脂質は、合成品であり、非毒性であり、従って、治療的処置のためにイン・ビボで用い得るからである。さらに、リポソームは、ＦVIIIを被包しないので、イン・ビボにおいてより長い半減期を有するより小サイズのリポソームを用いることができる。これは、細網内皮系により除去されないからである。以下に、より詳細に記載するように、ＦVIIIは、リポソームの外表面上のポリマー鎖と非共有的に相互作用し、ＥＰ ６８９，４２８に開示される組成物とは異なり、ポリマー鎖を活性化するための化学反応は行われない。
【００１５】
本明細書において、「実質的に中性」及び「実質的に正味電荷がない」との用語は、正にも負にも電荷されていないことを意味する。しかしながら、実験誤差ゼロの範囲内の非常に低い測定電荷は、上記用語の意味に含まれる。
【００１６】
「治療的に有効量」との用語は、所望の治療効果を有するＦVIIIの血流中レベルをもたらすＦVIIIの量をいう。そのような量は、異なる量のＦVIIIを含む組成物を投与し、投与後の様々な時間に血液中のレベルを測定することにより実験的に測定することができる。
【００１７】
コロイド状粒子を調製するために用いる両親媒性リピドは、好ましくは、リン脂質であり、天然源又は合成源のいずれからでも入手し得る。最も好ましいリン脂質は、ホスファチジルコリンであり、最も好ましくは、卵−ホスファチジルコリンである。
【００１８】
生物適合性親水性ポリマーには、ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸又はポリグリコール酸ファミリー由来のポリマーが含まれる。好ましくは、生物適合性親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。このポリマーの目的は、立体的にＳＵＶsを安定化し、それによりイン・ビボでの小胞の融合を防止し、イン・ビボにおいて小胞がＲＥＳにより吸着することを回避することを可能にする。生物適合性親水性ポリマーは、好ましくは約１０００ないし約５０００ダルトン、最も好ましくは、約２０００ダルトンの分子量を有するであろう。
【００１９】
コロイド状粒子は、好ましくは、平均粒子直径約０．０５ないし約０．４ミクロン、最も好ましくは、約０．１ミクロンを有する。これは、コロイド状粒子のイン・ビボにおける循環時間を増加させ、ＲＥＳによりそれらが吸着されることを防止するためである。両親媒性リピドは、粒子の約１ないし約２０モル％、好ましくは、約１〜５％、最も好ましくは、５％を構成する。
【００２０】
親水性ポリマーにより誘導される小胞形成リピドを調製するために、多様な既知の結合反応を用いることができる。例えば、ポリマー（ＰＥＧのような）を、塩化シアヌル基を通してホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）のようなリピドに誘導し得る。その代りに、キャップしたＰＥＧをカルボニルジイミダゾールカップリング剤により活性化し、活性化イミダゾール化合物を形成することができる。他の反応は周知であり、例えば、前述のＵ．Ｓ． ５，０１３，５５６（この内容は、引用により本明細書に取り込む）に列記されている。
【００２１】
本発明の組成物において用いられるＦVIIIは、商業的に入手可能である。天然のヒト起源由来であってもよいし、または、好ましくは、組換えにより調製することもできる。組換えＦVIIIは、商業的に入手可能であり、例えば、抗血友病因子（レコンビナント(Recombinant)）、ｒＦVIII−ＳＱ（ファルマシア(Pharmacia)）、及びとりわけ、コゲネート(Kogenate)、マイルス社(Miles Inc.,)、薬学部門、エルクハート(Elkhart)、インデティアナ州、アメリカ合衆国が挙げられる。
【００２２】
本発明の組成物は、非経口的に投与され、好ましくは、静脈内投与される。従来の組成物は、リポソーム組成物による注射中に引き起こされる副作用故に、経口使用のみであった。これに対して、本発明の組成物は、その他の理由のなかでも、おそらくは荷電を欠如しているが故に、注射により非毒性である。本発明のコロイド状粒子は、検知し得る毒性症状を伴わず、０．５ｇｍ／体重Ｋｇまでの量注射されてきた。投与量は、およそ２５〜７５ｉ．ｕ．／体重Ｋｇの範囲であることが期待される。粒子対ＦVIII比（Ｗ／ユニットＦVIII）は、好ましくは、約０．１ｍｇ／ユニット及び約１０ｍｇ／ユニットの間、最も好ましくは、約１ｍｇ／ユニットであろう。遊離の形態のＦVIII：Ｃの半減期は、マウスにおいて２時間未満であるが（凝固活性により測定されるＦVIII）、本発明の組成物中において投与されるＦVIIIは、少なくとも２４時間有効であることが期待される。この半減期は、前記凝固促進化合物の有効活性の期間である。本発明の組成物は、「オン・デマンド」であり、かつ血友病患者の予防的治療、特に、ＦVIII阻害抗体を発現した患者に有効であることが期待される。
【００２３】
本発明の組成物に含有されるＦVIIIの有効性は、次の２つの連続工程：（１）精製された成分を含有する凝固因子試薬におけるＸ因子のＸａ因子へのＦVIII依存的転換工程、及び（２）色素因子Ｘａ基質の酵素的解裂により、分光測光により定量化し得る色素を得る工程、によりＦVIII活性を測定する色素アッセイにより測定することができる。適切なアッセイ条件下において、Ｘａ因子形成速度とＦVIII濃度との間には直線関係がある。更に、ＦVIII活性は、一段階凝固アッセイにより測定し得る。このアッセイは、プロスロンビンからスロンビンへの転換（スロンビンは、引き続いて、フィブリノーゲンを解裂し、フィブリンを含む血塊を形成する）によりＦVIII活性を測定する。血友病マウスにおけるＦVIII活性は、尾切断後のマウスの生存数を測定することによっても決定し得る。
【００２４】
本発明のさらなる側面において、非経口投与のための薬学的組成物であって、薬学的に有効量の蛋白又はポリペプチド及び実質的に中性のコロイド状粒子を含有し、前記粒子が、生物適合性親水性ポリマーにより誘導される両親媒性親水性ポリマーを約１〜２０モルパーセント含有し、前記ポリマーが実質的に正味電荷を有しない組成物において、前記蛋白又はポリペプチドが、（ａ）前記コロイド状粒子に外部から結合し得る蛋白又はポリペプチド、及び（ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合し得る蛋白又はポリペプチドからなる群から選択され、前記蛋白又はポリペプチドが、前記コロイド状粒子内に被包されていないものである薬学的組成物、が提供される。
【００２５】
「前記コロイド状粒子に外部から結合し得る蛋白又はポリペプチド」との用語には、蛋白及びポリペプチドであって、ＦVIIIと同様に、ホスファチジルコリン：ホスファチジルセリン（ＰＣ：ＰＳ）を含む膜に結合するものが含まれる（恒常性及び血栓症(Haemostasis and Thrombosis)、アルサー(Arthur) Ｌ．、ブルーム及びダンカン(Bloom and Duncan)、Ｐ．トーマス(Thomas)（編）（１９８７）、チャーチル リビングストン(Churchill Livingstone)、１７９〜１８０頁を参照）。そのような蛋白の例は、プロスロンビン、Ｘ因子及びＶ因子のような凝固因子であるが、これらに限られるものではない。
【００２６】
「ポリエチレングリコールに結合し得る蛋白又はポリペプチド」との用語には、蛋白及びポリペプチドであって、イオン相互作用、疎水性相互作用、水素結合及びファンデルワールス力のような、非共有性メカニズムによりＰＥＧ又はＰＥＧの誘導体に結合するものが含まれる（アラカワ、Ｔ．及びチマシェフ(Timasheff)、Ｓ．Ｎ．（１９８５）、バイオケミストリー ２４：６７５６〜６７６２；リー(Lee)，Ｊ．Ｃ．及びリー、Ｌ．Ｌ．Ｙ．（１９８１） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６：６２５〜６３１）。
【００２７】
［好ましい態様の詳細な説明］
例１〜３
方法及び材料
１．卵ホスファチジルコリン（Ｅ−ＰＣ）リポソーム
卵ホスファチジルコリン（Ｅ−ＰＣ）のｔｅｒｔ−ブタノール溶液を、１８ｍｌのｔｅｒｔ−ブタノール中に２．０ｇのＥ−ＰＣ、１．９ｍｇのα−トコフェロール及び蛍光標識されたホスファチジルエタノールアミン（１：１０００リピドモル比）を溶解することにより調製した。
【００２８】
凍結乾燥によりリピド混合物から有機溶媒を除去し、リピドを水に再溶解し、１０％（ｗ／ｖ）にした。得られたリポソームを、Ｌｉｐｏｓｏｆａｓｔ−Ｂａｓｉｃ又はＬｉｐｏｓｏｆａｓｔ−５０押出し機（Ａｖｅｓｔｉｎ）を用いてポリカーボネート（ＰＣ）フィルター（０．４μｍ、０．２μｍ、０．１μｍ及び０．０５μｍ）を連続的に通して押出すことにより、リポソームのサイズを低減させ、平均サイズ０．１μｍのリポソームを得た。
【００２９】
２．卵ホスファチジルコリン／ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン（Ｅ−ＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥ）リポソーム
卵ホスファチジルコリン（Ｅ−ＰＣ）及びポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）のｔｅｒｔ−ブタノール溶液を、１８ｍｌのｔｅｒｔ−ブタノール中に０．７３ｇのＥ−ＰＣ、０．１８５ｇのＰＥＧ−ＰＥ、０．８６ｍｇのα−トコフェロール及び蛍光標識されたホスファチジルエタノールアミン（１：１０００リピドモル比）を混合することにより調製した。
【００３０】
凍結乾燥によりリピド混合物から有機溶媒を除去し、次いで、リピドを水に再溶解し、１０％（ｗ／ｖ）にした。上記１に記載したようにして、得られたリポソームのサイズを低減させ、平均サイズ０．１μｍのリポソームを得た。
【００３１】
３．卵ホスファチジルコリン−ホスファチジルグリセロール（Ｅ−ＰＣ／ＰＧ）リポソーム
卵ホスファチジルコリン（Ｅ−ＰＣ）及びホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のｔｅｒｔ−ブタノール溶液を、１８ｍｌのｔｅｒｔ−ブタノール中に０．８２２ｇのＥ−ＰＣ、０．０９２４ｇのＰＧ、０．８６ｍｇのα−トコフェロール及び蛍光標識されたホスファチジルエタノールアミン（１：１０００リピドモル比）を混合することにより調製した。
【００３２】
凍結乾燥によりリピド混合物から有機溶媒を除去し、次いで、リピドを水に再溶解し、１０％（ｗ／ｖ）にした。上記１に記載したようにして、得られたリポソームのサイズを低減させ、平均サイズ０．１μｍのリポソームを得た。
【００３３】
４．ヒト組替え第VIII因子の再溶解
コゲネート(Kogenate)（ヒトアルブミンと共に製剤されたｒＦVIII、バイエル(Bayer)）のロット７０Ｋ０２６及び７０Ｋ０２７を以下の例で用いた。約５００ＩＵのＦVIII活性を含有する１つのバイアルを水２ｍｌに再溶解し、安定化させた。２００μｌのアリクオットを使用するまで−２０℃に凍結した。
【００３４】
アルブミン枯渇コゲネートの調製のために、ロット＃７０Ｋ０２７を用いた。コゲネート１０バイアルを２０ｍｌの水に再溶解し、親水性シリカゲル（３〜１０μｍビーズ）でクロマトグラフに供した。１０ｍｌのフラクションを回収し、蛋白及びＦVIII：Ａｇ活性をモニターした。フラクション４〜６の１つのピーク及びフラクション８〜１４の別のピークにおいて、ＦVIII：Ａｇ活性の回収率５０％を認めた。蛋白アッセイによりフラクション９〜１２にピークが得られたので、フラクション４〜６をプールし、アリクオットにして凍結乾燥し、更なる使用に供した。
【００３５】
５．ビ(Bi)．Ｌ．，ら（１９９５）のネイーチャー・ジェネティクス、１０：１１９〜１２１に記載されるようにして調製した血友病マウスを用いた。
【００３６】
６．スイス、ＤｕｄｉｎｇｅｎのＤａｄｅ ＡＧから商業的に入手可能なＦVIII色素アッセイを用いて、ＦVIII：Ａｇ活性を測定した。
【００３７】
７．組成物の調製及び血友病マウスへの注射
リポソームアリクオットを所定の体積のＦVIIIと混合し、５〜１０ＩＵ／ｍｌのＦVIII：Ａｇ活性を得、室温で回転させ、均質にした。
【００３８】
８．５〜１０匹の血友病マウスの群に、２００又は４００μｌの混合物と共にIVボーラス(IV bolus)を尾静脈を通して注射した。規則的な時間間隔（１時間、４時間、８時間、２４時間、３２時間及び４８時間）でマウスの目から採血し、血漿中のＦVIII：Ａｇ活性を追跡した。
【００３９】
９．ＲＳＴＲＩＰコンピュータソフトウエアーを用いて得られた結果から、ＦVIIIの薬学速度論を測定し、マウス血液循環における初ＦVIII：Ｃ活性（Ａ0）及びVIII因子の半減期（Ｔ1/2）を得た。
【００４０】
結果
１．第VIII因子の半減期へのリピド組成物の影響
Ｅ−ＰＣ、Ｅ−ＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥ及びＥ−ＰＣ／ＰＧを含む０．０５μｍのリポソームを調製し、コゲネートと７２：１のリピド対蛋白（Ｗ／Ｗ）比率に混合し、血友病マウスに注射した。対照として、コゲネートを生理食塩水に希釈し、リポソーム混合物と同様にしてマウスに注射した。薬学速度論パラメータを上述のようにして求めた。結果を以下の表に要約する。
【００４１】
【表１】
上記表から、Ｅ−ＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥを含有するリポソームの初ＦVIII活性及び半減期は、リポソームがＥ−ＰＣ／ＰＧ又はＥ−ＰＣのみから構成されるコゲネート又はコゲネート−リポソーム混合物よりも高いので、Ｅ−ＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥを含有するリポソームが最も有効であったことが明らかである。
【００４３】
さらに、遊離のＦVIIIを注射されたマウスの４０％及びＦVIII／ＰＣ複合体を注射されたマウスの１００％は、ＦVIII色素活性の回復を見せなかった一方で、ＦVIII／ＰＣ＋ＰＥＧを注射されたマウスの１０％は、注射後６０分で同じ現象を見せた。
【００４４】
２．第VIII因子の半減期へのリピド／蛋白比の影響
Ｅ−ＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥを含有する０．０５μｍのリポソームの様々なアリクオットをコゲネートと混合することにより、リポソーム組成物における様々なリピド対蛋白比を得た。これらを血友病マウスに注射した。対照として、コゲネートを生理食塩水で希釈し、リポソーム混合物と同じ方法でマウスに注射した。薬学速度論を上述のようにして求めた。結果を以下の表に要約する。
【００４５】
【表２】
表２から、リピド／蛋白比を増加することにより、血友病マウスの血流中のＦVIIIの半減期が増加することが分かる。初ＦVIII：Ｃ活性における差違は、リピド／蛋白比に無関係なようである。
【００４７】
３．異なる第VIII因子源の影響
Ｅ−ＰＣ及びＰＥＧ−ＰＥ（９４：６モル％）を含有する０．０５μｍのＳＵＶｓを調製し、様々な源由来（コゲネート、バクスター(Baxter)及びオムリキシエート(Omrixate)）のＦVIII濃縮物と７２：１のリピド対蛋白比に混合し、血友病マウスに注射した。対照として、様々な源由来のＦVIIIの濃縮物の各々を生理食塩水に希釈し、リポソーム混合物と同じ方法でマウスに注射した。薬学速度論を上述のようにして求めた。結果を以下の表に要約する。
【００４８】
【表３】
上記表から明らかなように、遊離の因子の薬学速度論と比較して、リポソーム及びバクスター又はオムリキシエート由来のＦVIIIを含有する混合物は、この因子の半減期を２０％増加させた。コゲネート由来のＦVIII因子の半減期は、Ｅ−ＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥリポソームと混合された場合、遊離形態の因子と比較して２倍長かった。
【００５０】
例４
方法及び材料
１．リポソーム調製：
リポソームを次のようにして調製した：卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）及びジステアロイルホスファチジル−エタノールアミンメチルポリエチレングリコール２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ ２０００）を８０：２０ｗ／ｗの割合（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ ２０００の５％モル比）にそれぞれ秤量し、ｔｅｒｔ−ブタノール（Ｒｅｉｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ）中に１０％ｗ／ｖに溶解し、溶液を凍結乾燥した。得られた乾燥リピド粉末を、１３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１ｍＭのＣａＣｌ2を含有する緩衝液（ｐＨ７．０）に１０％ｗ／ｖに再懸濁させ、リポソームを形成した。１．２μｍ、０．２μｍ及び０．１μｍサイズのポリカーボネートフィルターを通して押出し機（Ａｖｅｓｔｉｎ）でろ過し、１２０〜１４０ｎｍサイズのリポソームを形成した。
【００５１】
２．リポソーム品質管理
リポソームの品質管理には、
１）サブミクロン粒子分析器（Ｎ４プラス、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）により測定したサイズ分布
２）リン脂質測定（リンによる）
３）ＴＬＣによるリピドの化学的安定性
が含まれる。
【００５２】
試験は、バレンホルツ(Barenholz)，Ｙ．及びアムセレム(Amselem)，Ｓ．（１９９３）のリポソームテクノロジー、第２版、Ｉ巻（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，編）、フロリダ州、ボカレイトン(Boca Rayton)のＣＲＣプレス、５２７〜６１６頁に記載されるようにして行った。
【００５３】
３．ＦVIII及びリポソームの製剤
コゲネート（ロット番号７０Ｋ０２７、６２０ＩＵ）又はニューコゲネート(New Kogenate)（５００ＩＵ）を１ｍｌ又は２ｍｌのＨ2Ｏに溶解した。ｒＦVIII−ＳＱ濃縮物をリポソーム溶液に溶解した。第VIII因子濃縮物をリポソームと室温で約１時間混合することにより、第VIII因子をリポソームと製剤した。リピド対ＦVIIIユニットの比は、約１ｍｇリピド／１ユニットＦVIIIであった。
【００５４】
４．血友病マウスへの注射及び採血手順
第VIII因子及びリポソームと製剤されたＦVIIIを血友病マウスの尾静脈に注射した。注射投与量は、コゲネート（２つの別の実験）及びニューコゲネートについては３ユニット／マウス、並びにｒＦVIII−ＳＱについては４ユニット／マウスであった。注射後１０分において、並びに注射後約４、１９及び２７時間において、クエン酸塩試験管にマウスから採血した。
【００５５】
５．マウス血漿におけるＦVIII濃縮物の測定
色素アッセイ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を用いて製造者の指示に従い、及び１段階凝固アッセイ（Ｓｔａｇｏ ｒｅａｇｅｎｔｓ及びＳＴ４凝固機を用いた）により製造者の指示に従い、マウス血漿中のヒトＦVIII濃縮物を測定した。
【００５６】
６．薬学速度論分析
薬学速度論パラメータは、コンピュータプログラム（ＲＳＴＲＩＰ、ＭｉｃｒｏＭａｔｈ社）を用いて分析した。
【００５７】
７．尾切断後の血友病マウスの生存数
ｒＦVIII−ＳＱ又はリポソームと製剤されたｒＦVIII−ＳＱをマウスに注射した（４ユニット／マウス、各々の群１１匹のマウス）。注射後２０時間において、尾を２ｃｍ切断した。投与後２８、４４、５２、６９、８８及び１４０時間において、生存しているマウスの尾を再び切断した（各々の回、２ｍｍ）。
【００５８】
結果
４つの異なる実験の、各々の注射後の時点におけるＦVIII活性及び薬学速度論パラメータ｛ＦVIII半減期（ＨＬ）及び曲線下エリア（ＡＵＣ）｝の結果を表４〜７Ｂに要約する。表４及び５において、３ユニットのコゲネート／マウスが注射された。表６において、３ユニットのニューコゲネート／マウスが注射された。また、表７Ａ、７Ｂ及び図１において、４ユニットのｒＦVIII−ＳＱ／マウスが注射された。
【００５９】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
さらに、各々のマウスにおけるヒトＦVIIIの半減期を計算し、全ての実験群におけるＦVIII半減期をスチューデント試験により統計的に互いに比較した。
【００６５】
４つの実験すべてにおいて、リポソームと製剤されたＦVIIIを受けた群におけるヒトＦVIII半減期は、遊離のＦVIIIを受けた群におけるヒトＦVIIIよりも高くかつ有意に異なる（ｐ＜０．０５５）：
コゲネートのＨＬ対コゲネート＋リポソームのＨＬ（表４）ｐ＝０．０５４；
コゲネートのＨＬ対コゲネート＋リポソームのＡＵＣ（表５）ｐ＝０．０３１；
ニューコゲネートのＨＬ対ニューコゲネート＋リポソームのＨＬ（表６）ｐ＝０．００８５
ｒＦVIII−ＳＱのＨＬ対ｒＦVIII−ＳＱ＋リポソームのＨＬ（表７Ａ）ｐ＝０．００４５；
ｒＦVIII−ＳＱのＨＬ対ｒＦVIII−ＳＱ＋リポソームのＨＬ（表７Ｂ）ｐ＝０．０２２）。
【００６６】
これらの結果は、コゲネート、ニューコゲネート又はｒＦVIII−ＳＱのリポソームとの製剤は、第VIII因子の半減期（ＨＬ）及び血友病マウス（ＨＬ及びＡＵＣについて１．６〜２．０の因子）におけるＦVIIIの曲線下エリア(area under the curve)（ＡＵＣ）を有意に増加させることを示している。
【００６７】
マウスの生存数を図１に示す。尾切断実験の結果は、リポソームと製剤されたＦVIIIは、遊離のＦVIIIよりも生物学的に活性であり、従って、血友病患者をより長い期間保護し得ることを示している。
【００６８】
例５
阻害剤を有する患者におけるＦVIII組成物の影響
ＦVIII（コゲネート）１５ユニットを、ＥＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）を含有する１２０ｎｍリポソーム（１５ｍｇリピド）と室温で１時間インキュベートした。次いで、阻害剤（抗ＦVIII抗体）を発現した血友病患者からの血漿の様々な希釈物とともに、１ユニットの遊離のＦVIII（コゲネート）又は１ユニットのリポソームと製剤されたＦVIIIを３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの後、第VIII因子の活性を色素アッセイにより測定した。
【００６９】
表８に結果を要約する：
【表９】
この実験から、コロイド状粒子と一緒にＦVIIIを投与することは、ＦVIIIを血漿阻害剤から保護することに有効であることが明らかに分かる。
【図面の簡単な説明】
本発明を理解し、及び本発明がどのようにして実施し得るかが分かるために、制限を課することのない例のみにより好ましい態様を添付の図面を言及して説明する。
【図１】 図１には、ＦVIIIを注射され、引き続いて注射後の様々な時間において尾を切断された血友病マウスの生存数を示している。
Claims (17)
- 治療的に有効量の凝固因子VIII（ＦVIII）及び中性のコロイド状粒子を含有する非経口投与用薬学的組成物であって、前記粒子が生物適合性親水性ポリマーにより誘導された両親媒性リピドを１〜２０モルパーセント含有し、前記ポリマーが正味電荷を帯びていないものである組成物において、
前記ＦVIIIが前記コロイド状粒子内に被包されていない薬学的組成物。 - 前記コロイド状粒子が、平均粒子直径０．０５ないし０．４ミクロンを有する請求項１の薬学的組成物。
- 前記コロイド状粒子が平均粒子直径０．１ミクロンを有する請求項２の薬学的組成物。
- 前記両親媒性リピドが、天然又は合成源由来のリン脂質である請求項１の薬学的組成物。
- 前記両親媒性リピドが、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）である請求項４の薬学的組成物。
- 前記生物適合性親水性ポリマーが、ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーからなる群から選択される請求項１の薬学的組成物。
- 前記生物適合性親性ポリマーが、ポリエチレングリコールである請求項６の薬学的組成物。
- 前記ポリエチレングリコールが、１０００ないし５０００ダルトンの分子量を有する請求項７の薬学的組成物。
- 前記ポリエチレングリコールが、２０００ダルトンの分子量を有する請求項８の薬学的組成物。
- 前記ＦVIIIが、天然源由来のものである請求項１の薬学的組成物。
- 前記ＦVIIIが、組替えにより調製されたものである請求項１の薬学的組成物。
- 前記粒子対ＦVIII比（ｗ／ユニットＦVIII）が、０．１ｍｇ／ユニットないし１０ｍｇ／ユニットである請求項１の薬学的組成物。
- 前記粒子対ＦVIII比（ｗ／ユニットＦVIII）が、１ｍｇ／ユニットである請求項１２の薬学的組成物。
- 血友病に罹っている患者の治療のための非経口投与用薬学的組成物の調製におけるコロイド状粒子の使用であって、前記薬学的組成物が治療的に有効量の凝固第VIII因子（ＦVIII）及び中性のコロイド状粒子を含み、前記粒子が生物適合性親水性ポリマーにより誘導された両親媒性リピド１〜２０モルパーセントを含有し、前記ポリマーが正味電荷を帯びていないものである使用において、
前記ＦVIIIが前記コロイド状粒子内に被包されていないものである使用。 - 前記患者が、ＦVIII阻害抗体を発現している請求項１４の使用。
- 前記コロイド状粒子が、さらに天然又は合成源から得られた第２の両親媒性リピドを含む請求項１の薬学的組成物。
- 前記第２の両親媒性リピドが、ホスファチジルコリンである請求項１６の薬学的組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL12422498 | 1998-04-27 | ||
| IL124224 | 1998-04-27 | ||
| PCT/IL1999/000217 WO1999055306A1 (en) | 1998-04-27 | 1999-04-23 | Pharmaceutical composition comprising factor viii and neutral liposomes |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002512947A JP2002512947A (ja) | 2002-05-08 |
| JP2002512947A5 JP2002512947A5 (ja) | 2006-01-05 |
| JP4545928B2 true JP4545928B2 (ja) | 2010-09-15 |
Family
ID=11071435
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000545506A Expired - Fee Related JP4545928B2 (ja) | 1998-04-27 | 1999-04-23 | 第ｖｉｉｉ因子及び中性リポソームを含有する薬学的組成物 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6593294B1 (ja) |
| EP (1) | EP1079805B1 (ja) |
| JP (1) | JP4545928B2 (ja) |
| AT (1) | ATE283034T1 (ja) |
| AU (1) | AU747391B2 (ja) |
| BR (1) | BR9909978A (ja) |
| CA (1) | CA2329768C (ja) |
| DE (1) | DE69922189T2 (ja) |
| ES (1) | ES2233036T3 (ja) |
| MX (1) | MXPA00010241A (ja) |
| PT (1) | PT1079805E (ja) |
| WO (1) | WO1999055306A1 (ja) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8110218B2 (en) | 2000-11-30 | 2012-02-07 | The Research Foundation Of State University Of New York | Compositions and methods for less immunogenic protein-lipid complexes |
| US7625584B2 (en) * | 2000-11-30 | 2009-12-01 | The Research Foundation Of State University Of New York | Method of complexing a protein by the use of a dispersed system and proteins thereof |
| US20020132982A1 (en) * | 2000-11-30 | 2002-09-19 | Balasubramanian Sathyamangalam V. | AHF associated dispersion system and method for preparation |
| US7718160B2 (en) * | 2002-07-02 | 2010-05-18 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Radiolabeled compounds and liposomes and their method of making and using same |
| US7351688B2 (en) * | 2003-02-05 | 2008-04-01 | The Research Foundation Of State University Of New York | Compositions and methods for less immunogenic protein formulations |
| AU2004229253B2 (en) * | 2003-04-15 | 2009-11-05 | Cantab Biopharmaceuticals Patents Limited | Pharmaceutical composition comprising proteins and/or polypeptides and colloidal particles |
| EP1668358B1 (en) * | 2003-08-05 | 2014-12-10 | The Research Foundation of State University of New York | Reconstitution medium for protein and peptide formulations |
| US20070003607A1 (en) * | 2003-09-02 | 2007-01-04 | Vibhudutta Awasthi | Neutral liposome-encapsulated compounds and methods of making and using thereof |
| US7208174B2 (en) * | 2003-12-18 | 2007-04-24 | Hoffmann-La Roche Inc. | Liposome compositions |
| JP4966018B2 (ja) * | 2004-01-23 | 2012-07-04 | カムルス エービー | 三元非ラメラ脂質組成物 |
| WO2006053299A2 (en) | 2004-11-12 | 2006-05-18 | Bayer Healthcare Llc | Site-directed modification of fviii |
| AU2006236453B2 (en) * | 2005-01-25 | 2012-02-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Delivery of siRNA by neutral lipid compositions |
| CA2613705A1 (en) * | 2005-06-29 | 2007-01-04 | The Research Foundation Of State University Of New York | Compositions and methods for less immunogenic pr0tein-lip1d complexes |
| WO2007021822A2 (en) | 2005-08-09 | 2007-02-22 | The Research Foundation Of State Of University Of New York At Buffalo | Compositions and methods of preparation of liposomal microparticulate il-12 |
| EP1816201A1 (en) | 2006-02-06 | 2007-08-08 | CSL Behring GmbH | Modified coagulation factor VIIa with extended half-life |
| US7875288B2 (en) * | 2006-03-30 | 2011-01-25 | The Research Foundation Of State University Of New York | Method for treating blood coagulation disorders |
| NZ572308A (en) * | 2006-03-30 | 2011-09-30 | Univ New York State Res Found | Compositions of less immunogenic and long-circulating protein-lipid complexes |
| PL2101821T3 (pl) * | 2006-12-15 | 2015-01-30 | Baxalta Inc | Koniugat czynnik viia-(poli)kwas sjalowy o przedłużonym okresie półtrwania in vivo |
| AU2007338298B2 (en) | 2006-12-22 | 2013-02-07 | Csl Behring Gmbh | Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life |
| JP5832285B2 (ja) | 2008-06-24 | 2015-12-16 | ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー | 延長されたインビボ半減期を有する第ｖｉｉｉ因子、フォン・ヴィレブランド因子又はそれらの複合体 |
| CA2730340C (en) | 2008-07-14 | 2017-02-07 | Polypid Ltd. | Sustained-release drug carrier composition |
| WO2010135714A2 (en) | 2009-05-22 | 2010-11-25 | The Methodist Hospital Research Institute | Methods for modulating adipocyte expression using microrna compositions |
| CN102470105B (zh) | 2009-07-14 | 2015-07-29 | 波利皮得有限公司 | 持续释放药物载体组合物 |
| WO2011025893A1 (en) | 2009-08-28 | 2011-03-03 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Systems, methods, and devices for production of gas-filled microbubbles |
| US10010709B2 (en) | 2009-12-16 | 2018-07-03 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Composition for on-demand ultrasound-triggered drug delivery |
| US20130028959A1 (en) | 2009-12-16 | 2013-01-31 | Massachusetts Institute Of Technology | Liposomes for Preventing the Spread of HIV |
| AU2011208374B2 (en) | 2010-01-19 | 2016-09-08 | Polypid Ltd. | Sustained-release nucleic acid matrix compositions |
| US8637448B2 (en) * | 2010-09-14 | 2014-01-28 | University Of Rochester | Recombinant factor VIII having enhanced stability following mutation at the A1-C2 domain interface |
| DE102010043733A1 (de) | 2010-11-10 | 2012-05-10 | Oxprotect Gmbh | Unbeladene PEGylierte Liposomen zur Verwendung als Arzneimittel zur Prophylaxe und Therapie von hämorrhagischen und thrombo- embolischen Erkrankungen |
| PL2814502T3 (pl) | 2012-02-15 | 2018-02-28 | Csl Behring Gmbh | Warianty czynnika von Willebranda mające ulepszone powinowactwo do wiązania czynnika VIII |
| EP2796145B1 (en) | 2013-04-22 | 2017-11-01 | CSL Ltd. | A covalent complex of von willebrand factor and faktor viii linked by a disulphide bridge |
| US10253088B2 (en) | 2014-07-02 | 2019-04-09 | CSL Behring Lengnau AG | Modified von Willebrand Factor |
| GB201417589D0 (en) | 2014-10-06 | 2014-11-19 | Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd | Pharmaceutical Formulations |
| JP2018510212A (ja) | 2015-03-06 | 2018-04-12 | ツェー・エス・エル・ベーリング・レコンビナント・ファシリティ・アクチエンゲゼルシャフト | 向上した半減期を有する改変したフォンヴィレブランド因子 |
| SG10201910896UA (en) | 2015-05-22 | 2020-01-30 | CSL Behring Lengnau AG | Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia |
| JP6651548B2 (ja) | 2015-05-22 | 2020-02-19 | ツェー・エス・エル・ベーリング・レングナウ・アクチエンゲゼルシャフト | 改変フォン・ヴィルブランド因子を製造するための方法 |
| GB201518171D0 (en) | 2015-10-14 | 2015-11-25 | Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd | Colloidal particles for topical administration with therapeutic agent |
| GB201518170D0 (en) | 2015-10-14 | 2015-11-25 | Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd | Colloidal particles for subcutaneous administration with intravenous administration of therapeutic agent |
| GB201518172D0 (en) | 2015-10-14 | 2015-11-25 | Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd | Colloidal particles for use in medicine |
| ES2881701T3 (es) | 2016-01-07 | 2021-11-30 | CSL Behring Lengnau AG | Factor de von Willebrand mutado |
| US10806774B2 (en) | 2016-01-07 | 2020-10-20 | CSL Behring Lengnau AG | Mutated truncated von Willebrand Factor |
| WO2017220099A1 (en) | 2016-06-24 | 2017-12-28 | Statens Serum Institut | Adjuvants with modified drainage properties |
| US11246832B2 (en) * | 2016-06-28 | 2022-02-15 | Verily Life Sciences Llc | Serial filtration to generate small cholesterol-containing liposomes |
| DK3538134T3 (da) | 2016-11-11 | 2022-02-07 | CSL Behring Lengnau AG | Trunkeret von willebrand-faktor polypeptider til ekstravaskulær administration til behandling eller profylakse af en blodkoagulationsforstyrrelse |
| AU2017358861B2 (en) | 2016-11-11 | 2022-02-17 | CSL Behring Lengnau AG | Truncated von Willebrand Factor polypeptides for treating hemophilia |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL7900459A (nl) | 1979-01-19 | 1980-07-22 | Hendrik Coenraad Hemker Prof D | Farmaceutisch preparaat en werkwijze ter bereiding daarvan. |
| JPS56127307A (en) * | 1980-03-11 | 1981-10-06 | Green Cross Corp:The | Blood-coagulation factor 8 pharmaceutical for oral administration |
| US4348384A (en) | 1980-10-17 | 1982-09-07 | Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. | Pharmaceutical composition for oral administration containing coagulation factor VIII or IX |
| US5013556A (en) * | 1989-10-20 | 1991-05-07 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
| US5527528A (en) * | 1989-10-20 | 1996-06-18 | Sequus Pharmaceuticals, Inc. | Solid-tumor treatment method |
| WO1991012021A2 (en) * | 1990-02-13 | 1991-08-22 | Oxford Virology Plc | Therapeutic agents, and intermediates for the synthesis thereof |
| US6326353B1 (en) | 1993-03-23 | 2001-12-04 | Sequus Pharmaceuticals, Inc. | Enhanced circulation effector composition and method |
-
1999
- 1999-04-23 JP JP2000545506A patent/JP4545928B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-23 AU AU34414/99A patent/AU747391B2/en not_active Ceased
- 1999-04-23 AT AT99916022T patent/ATE283034T1/de active
- 1999-04-23 WO PCT/IL1999/000217 patent/WO1999055306A1/en active IP Right Grant
- 1999-04-23 CA CA002329768A patent/CA2329768C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-23 BR BR9909978-0A patent/BR9909978A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-04-23 MX MXPA00010241A patent/MXPA00010241A/es active IP Right Grant
- 1999-04-23 PT PT99916022T patent/PT1079805E/pt unknown
- 1999-04-23 US US09/673,412 patent/US6593294B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-23 EP EP99916022A patent/EP1079805B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-23 DE DE69922189T patent/DE69922189T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-23 ES ES99916022T patent/ES2233036T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-12-26 US US10/327,970 patent/US6930087B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6593294B1 (en) | 2003-07-15 |
| ES2233036T3 (es) | 2005-06-01 |
| CA2329768A1 (en) | 1999-11-04 |
| AU747391B2 (en) | 2002-05-16 |
| PT1079805E (pt) | 2005-03-31 |
| US20030134778A1 (en) | 2003-07-17 |
| AU3441499A (en) | 1999-11-16 |
| US6930087B2 (en) | 2005-08-16 |
| DE69922189D1 (de) | 2004-12-30 |
| WO1999055306A1 (en) | 1999-11-04 |
| EP1079805A1 (en) | 2001-03-07 |
| MXPA00010241A (es) | 2004-09-06 |
| CA2329768C (en) | 2008-06-10 |
| DE69922189T2 (de) | 2005-11-10 |
| BR9909978A (pt) | 2000-12-26 |
| ATE283034T1 (de) | 2004-12-15 |
| EP1079805B1 (en) | 2004-11-24 |
| JP2002512947A (ja) | 2002-05-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4545928B2 (ja) | 第ｖｉｉｉ因子及び中性リポソームを含有する薬学的組成物 | |
| JP2001181214A (ja) | リポゾームマイクロレシーバー組成物および方法 | |
| US11484499B2 (en) | Pharmaceutical formulations of PEGylated liposomes and blood coagulation factors | |
| US20030232075A1 (en) | Compositions for producing factor Xa | |
| AU2004229253B2 (en) | Pharmaceutical composition comprising proteins and/or polypeptides and colloidal particles | |
| IL139053A (en) | Pharmaceutical composition comprising factor VIII and neutral colloidal particles | |
| JP2024532164A (ja) | 血友病ａの治療における使用のための修飾コロイド粒子 | |
| EP4387652A1 (en) | Modified colloidal particles for use in the treatment of haemophilia a | |
| JP2024532163A (ja) | 血友病ａの治療における使用のための修飾コロイド粒子 | |
| Ramani et al. | Preclinical Evaluation of PEGylated Liposomal-Recombinant Human FVIII in a Murine Model of Hemophilia A |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050714 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050714 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20070713 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20070713 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080930 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20081225 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090108 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090130 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090512 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090914 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20091215 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100601 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100701 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130709 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |