DE69922189T2

DE69922189T2 - Pharmazeutische zusammensetzungen enthaltend faktor viii und neutrale liposomen

Info

Publication number: DE69922189T2
Application number: DE69922189T
Authority: DE
Inventors: Moshe Baru; Liliana Bar; Israel Nur
Original assignee: Opperbas Holding BV
Current assignee: ZILIP PHARMA B.V., ALKMAAR, NL
Priority date: 1998-04-27
Filing date: 1999-04-23
Publication date: 2005-11-10
Anticipated expiration: 2019-04-24
Also published as: EP1079805B1; AU747391B2; JP2002512947A; BR9909978A; CA2329768A1; US20030134778A1; PT1079805E; AU3441499A; MXPA00010241A; DE69922189D1; CA2329768C; US6930087B2; ATE283034T1; ES2233036T3; JP4545928B2; EP1079805A1; WO1999055306A1; US6593294B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine stabile pharmazeutische Zubereitung für die langsame Freisetzung von gerinnungsfördernden Substanzen für die Behandlung von Blutgerinnungsstörungen.
Hintergrund der Erfindung
Hämophilie A ist eine der am häufigsten vorkommenden erblichen Gerinnungsstörungen. Patienten mit Hämophilie A unterliegen häufigen Blutungen als Ergebnis von einer oder mehreren Fehlfunktionen des Gerinnungssystems. Eine der Ursachen von Hämophilie ist ein Mangel an Faktor VIII (FVIII) im Blut. Dieses Problem kann mit Faktor-VIII-Konzentraten behandelt werden. Bei etwa 15% der Patienten ist das Auftreten der Krankheit jedoch das Ergebnis von Faktor-VIII-neutralisierenden Antikörpern, sogenannten Inhibitoren, so dass eine Therapie mit Faktor-VIII-Konzentraten kaum möglich ist.
Zwei grundsätzliche Ansätze wurden in der Literatur beschrieben, um FVIII vor einer Inaktivierung durch Inhibitoren zu schützen.
WO 80/01456 an Hemker offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung, die für die orale Verabreichung geeignet ist und FVIII umfasst, der in aus Phospholipiden gebildete Liposomen von 0,5-1,0 μm eingebaut ist. Die Phospholipide haben eine Nettoladung, und der FVIII ist zwischen den Schichten des Liposoms eingebaut. Es wird behauptet, dass die FVIII-Konzentrationen im Plasma während eines Zeitraums von 50 Stunden über etwa 5% der Normalwerts blieben.
In US 4,348,384 (Horikoshi) heißt es, dass eine Zusammensetzung hergestellt wurde, wie sie bei Hemker beschrieben ist, aber es werden keine befriedigenden Ergebnisse angegeben. Daher baut Horikoshi einen Protease-Inhibitor zusammen mit dem FVIII in das Liposom ein, um diesen vor einer Proteolyse zu schützen. Über einen Zeitraum von 6 Stunden wurden 3% der normalen Plasmawerte von FVIII erhalten.
US 5,013,556 (Woodle) offenbart eine Liposomenzusammensetzung zur Verwendung bei der Verabreichung verschiedener Wirkstoffe über den Blutstrom. Das Liposom enthält 1-20 Molprozent eines amphipathischen Lipids, das mit einem Polyalkylether derivatisiert ist. Auch hier ist die Wirkstoffverbindung innerhalb des Liposoms eingeschlossen. Diese Liposomenzusammensetzungen sind kommerziell unter der Bezeichnung Stealth^®-Vesikel erhältlich (SUVs, kleine unilamellare Vesikel, die aus Phospholipid und Polyethylenglycol (PEG), das kovalent an das Phospholipid gebunden ist, bestehen).
Ein weiteres Problem mit diesem Ansatz besteht darin, dass Liposomen mit einem großen Durchmesser eine kurze Halbwertszeit haben. Daher müssen die Liposomen unter hohem Druck verkleinert werden, was die Proteinaktivitäten beeinflussen kann, wie bei den Gerinnungsfaktoren V und VIII.
In einem zweiten Ansatz lehren Barrowcliffe, T.W., et al. (1983), J. Lab. Clin. Med. 101: 34-43, dass in vitro ein erheblicher Schutz des FVIII erreicht wird, indem man FVIII mit Phospholipid mischt, das aus menschlichem und/oder tierischem Gehirn extrahiert wurde. Bei diesem Ansatz ist das Phospholipid an den FVIII gebunden und kapselt ihn nicht ein. Kemball-Cook, G., und Barrowcliffe, T.W. (1992), Thromb. Res. 67: 57-71, lehren, dass für die FVIII-Bindung eine negativ geladene Phospholipidoberfläche notwendig ist. Es zeigte sich, dass negativ geladenes Phosphatidylserin und negativ geladene Phosphatidinsäure hochgradig aktiv in bezug auf die Bindung an FVIII sind, während Phosphatidylcholin inaktiv war. Negativ geladene Phospholipide sind jedoch toxisch, und solche, die aus Gehirngewebe stammen, können Krankheitserreger tragen.
EP 689,428 offenbart eine Liposomenzusammensetzung, die Liposomen umfasst, die eine äußere Oberflächenschicht aus hydrophilen Polymerketten aufweisen. Ein Polypeptid- oder Polysaccharid-Effektormolekül ist durch Aktivierung des Lipidankers vor der Effektorkopplung kovalent an die distalen Enden der Polymerketten gebunden.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die ein Protein oder Polypeptid für die therapeutische Behandlung umfasst. Insbesondere ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die FVIII für die Behandlung von Blutgerinnungsstörungen umfasst.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, FVIII in einer Form bereitzustellen, die eine verlängerte Halbwertszeit im Blutstrom aufweist.
Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Behandlung von Patienten, die unter Blutgerinnungsstörungen, insbesondere Hämophilie, leiden, und insbesondere derjenigen, die FVIII-Inhibitoren aufweisen, bereitzustellen.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung bereitgestellt, die eine therapeutisch wirksame Menge Koagulationsfaktor VIII (FVIII) und im Wesentlichen neutrale kolloidale Teilchen umfasst, wobei die Teilchen 1-20 Mol-% eines amphipathischen Lipids umfassen, das mit einem biokompatiblen hydrophilen Polymer derivatisiert ist, wobei das Polymer im Wesentlichen keine Nettoladung trägt, wobei der FVIII nicht in den kolloidalen Teilchen eingekapselt ist.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem überraschenden und unerwarteten Ergebnis, dass neutrale Phospholipide, die mit einem biokompatiblen hydrophilen Polymer derivatisiert sind, verwendet werden können, um FVIII zu binden und ihn vor Inhibitoren im Blutstrom zu schützen. Dies ergibt einen erheblichen Vorteil gegenüber den Zusammensetzungen des Standes der Technik, da die verwendeten Phospholipide synthetisch und nichttoxisch sind und daher in vivo für die therapeutische Behandlung verwendet werden können. Weiterhin kapselt das Liposom den FVIII nicht ein, so dass kleinere Liposomen verwendet werden können, die in vivo eine längere Halbwertszeit haben, da sie nicht vom retikuloendothelialen System (RES) entfernt werden. Wie im Folgenden noch ausführlicher beschrieben wird, tritt FVIII in eine nichtkovalente Wechselwirkung mit den Polymerketten auf der äußeren Oberfläche der Liposomen, und im Unterschied zu der in EP 689 428 offenbarten Zusammensetzung wird keine chemische Reaktion durchgeführt, um die Polymerketten zu aktivieren.
In der vorliegenden Beschreibung bedeuten die Ausdrücke "im Wesentlichen neutral" und "im Wesentlichen keine Nettoladung" weder positiv noch negativ geladen. Jedoch ist eine sehr geringe gemessene Ladung von nahezu Null innerhalb des experimentellen Fehlers in der Bedeutung der obigen Ausdrücke mit eingeschlossen.
Der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge" ist so zu verstehen, dass er sich auf eine Menge an FVIII bezieht, die zu einer Konzentration an FVIII im Blutstrom führt, die eine gewünschte therapeutische Wirkung hat. Eine solche Menge kann experimentell bestimmt werden, indem man Zusammensetzungen, die verschiedene Mengen an FVIII umfassen, verabreicht und die Konzentration im Blut zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung misst.
Das amphipathische Lipid, das zur Herstellung der kolloidalen Teilchen verwendet wird, ist vorzugsweise ein Phospholipid und kann entweder aus natürlichen oder aus synthetischen Quellen erhalten werden. Ein am meisten bevorzugtes Phospholipid ist Phosphatidylcholin, am meisten bevorzugt Eier-Phosphatidylcholin.
Das biokompatible hydrophile Polymer kann Polymere aus den Familien der Polyalkylether, Polymilch- oder Polyglycolsäuren umfassen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Polymer um Polyethylenglycol (PEG). Der Zweck des Polymers besteht darin, die SUVs sterisch zu stabilisieren und dadurch die Fusion der Vesikel in vitro zu verhindern und es zu ermöglichen, dass die Vesikel in vivo einer Adsorption durch das RES entgehen. Das Polymer hat vorzugsweise ein Molekulargewicht zwischen 1000 und 5000 Dalton, am meisten bevorzugt ungefähr 2000 Dalton.
Die kolloidalen Teilchen haben vorzugsweise einen mittleren Teilchendurchmesser zwischen 0,05 und 0,4 μm, am meisten bevorzugt etwa 0,1 μm. Dadurch soll ihre Zirkulationszeit in vivo erhöht und ihre Adsorption durch das RES verhindert werden. Das amphipathische Lipid umfasst ungefähr 1 bis etwa 20 Mol-% der Teilchen, vorzugsweise ungefähr 1-5%, am meisten bevorzugt 5%.
Eine Vielzahl von bekannten Kopplungsreaktionen kann verwendet werden, um vesikelbildende Lipide, die mit hydrophilen Polymeren derivatisiert sind, herzustellen. Zum Beispiel kann ein Polymer (wie PEG) über eine Cyanursäurechloridgruppe an ein Lipid, wie Phosphatidylethanolamin (PE), derivatisiert sein. Alternativ dazu kann ein verkapptes PEG mit einem Carbonyldiimidazol-Kopplungsreagens aktiviert werden, um eine aktivierte Imidazolverbindung zu bilden. Weitere Reaktionen sind wohlbekannt und z.B. in der oben genannten US 5,013,556 aufgeführt.
Der FVIII, der in der Zusammensetzung der Erfindung verwendet wird, ist kommerziell erhältlich. Er kann aus einer natürlichen menschlichen Quelle stammen, oder vorzugsweise kann er rekombinant hergestellt sein. Rekombinanter FVIII ist zum Beispiel zum Beispiel als Antihemophilic Factor (Recombinant), rFVIII-SQ (Pharmacia), und Kogenate, Miles Inc., Pharmaceutical Division, Elkhart, IN, USA, neben anderen Herstellern, kommerziell erhältlich.
Die Zusammensetzung der Erfindung wird parenteral, vorzugsweise intravenös, verabreicht. Die Zusammensetzungen des Standes der Technik waren aufgrund von Nebenwirkungen, die bei der Injektion der Liposomenzusammensetzung verursacht wurden, nur für die orale Verwendung bestimmt. Die Zusammensetzung der Erfindung ist andererseits nichttoxisch bei Injektion, anscheinend aufgrund der fehlenden Ladung, neben anderen Gründen. Mengen von bis zu 0,5 g kolloidale Teilchen gemäß der Erfindung pro kg Körpergewicht wurden ohne nachweisbare toxische Symptome injiziert. Es wird erwartet, dass die Dosis im Bereich von 25-75 IE/kg Körpergewicht liegt. Das Verhältnis von Teilchen zu FVIII (w/FVIII-Einheit) liegt vorzugsweise zwischen 0,1 mg/Einheit und 10 mg/Einheit und beträgt am meisten bevorzugt ungefähr 1 mg/Einheit. Obwohl die freie Form von FVIII:C bei Mäusen eine Halbwertszeit von weniger als 2 Stunden hat (FVIII gemessen anhand seiner Gerinnungsaktivität), wird erwartet, dass in der Zusammensetzung der Erfindung verabreichtes FVIII wenigstens 24 Stunden lang effektiv ist, das ist die Zeit der effektiven Aktivität der gerinnungsfördernden Verbindung. Es wird erwartet, dass die Zusammensetzung der Erfindung bei der Behandlung von Hämophiliepatienten "nach Bedarf" und zur prophylaktischen Behandlung effektiv ist, und insbesondere solcher Patienten, die FVIII-Inhibitor-Antikörper entwickelt haben.
Die Wirksamkeit des in der Zusammensetzung der Erfindung enthaltenen FVIII kann durch einen chromogenen Assay bestimmt werden, der die FVIII-Aktivität durch zwei aufeinanderfolgende Schritte bestimmt: (1) die FVIII-abhängige Umwandlung von Faktor X in Faktor Xa in einem Koagulationsfaktorreagens, das aus gereinigten Komponenten besteht, und (2) die enzymatische Spaltung eines chromogenen Faktor-Xa-Substrats unter Bildung eines Chromophors, das spektrophotometrisch quantifiziert werden kann. Unter geeigneten Assaybedingungen gibt es eine lineare Beziehung zwischen der Geschwindigkeit der Faktor-Xa-Bildung und der FVIII-Konzentration. Außerdem kann die FVIII-Aktivität durch einen einstufigen Gerinnungsassay bestimmt werden. Dieser Assay bestimmt die FVIII-Aktivität durch die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin, das anschließend Fibrinogen spaltet, wobei ein aus Fibrin bestehendes Gerinnsel entsteht. Die FVIII-Aktivität bei hämophilen Mäusen kann auch bestimmt werden, indem man die Überlebensrate der Mäuse nach Abschneiden des Schwanzes misst.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung bereitgestellt, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Proteins oder Polypeptids und im Wesentlichen neutrale kolloidale Teilchen umfasst, wobei die Teilchen 1-20 Mol-% eines amphipathischen Lipids umfassen, das mit einem biokompatiblen hydrophilen Polymer derivatisiert ist, wobei das Polymer im Wesentlichen keine Nettoladung trägt, wobei das Protein oder Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus (a) Proteinen oder Polypeptiden, die extern an die kolloidalen Teilchen binden können, und (b) Proteinen oder Polypeptiden, die Polyethylenglycol (PEG) binden können, besteht, und wobei das Protein oder Polypeptid nicht in den kolloidalen Teilchen eingekapselt ist.
Der Ausdruck "Proteine oder Polypeptide, die extern an die kolloidalen Teilchen binden können" umfasst Proteine und Polypeptide, die ähnlich wie FVIII an Membranen binden, die Phosphatidylcholin:Phosphatidylserin (PC:PS) umfassen (siehe Hämostase und Thrombose, Arthur L. Bloom und Duncan P. Thomas (Hrsg.) (1987), Churchill Livingstone, 5. 179-180). Nichteinschränkende Beispiele für solche Proteine sind Koagulationsfaktoren wie Prothrombin, Faktor X und Faktor V.
Der Ausdruck "Proteine oder Polypeptide, die Polyethylenglycol binden können" umfasst Proteine und Polypeptide, die durch irgendeinen nichtkovalenten Mechanismus , wie ionische Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen und van-der-Waals-Anziehungskräfte an PEG oder Derivate von PEG binden (Arakawa, T., und Timasheff, S.N. (1985) Biochemistry 24: 6756-6762; Lee, J.C. und Lee, L.L.Y. (1981) J. Biol. Chem. 226: 625-631).
Kurzbeschreibung der Zeichnung
Um die Erfindung zu verstehen und zu sehen, wie sie in der Praxis ausgeführt werden kann, werden jetzt bevorzugte Ausführungsformen nur anhand von nichteinschränkenden Beispielen beschrieben, wobei auf die Begleitzeichnung Bezug genommen wird, die die Überlebensrate von hämophilen Mäusen, denen nach einem Schwanzschnitt FVIII injiziert wurde, zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion veranschaulicht.
Ausführliche Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform
Beispiele 1-3
Verfahren und Materialien
1. Liposomen mit Eier-Phosphatidylcholin (E-PC)
Eine Lösung von Eier-Phosphatidylcholin (E-PC) in tert-Butanol wurde hergestellt, indem man 2,0 g E-PC, 1,9 mg α-Tocopherol und Fluorescein-markiertes Phosphatidylethanolamin (1:1000 Lipid-Stoffmengenverhältnis) in 18 ml tert-Butanol löste.
Das organische Lösungsmittel wurde durch Lyophilisierung aus dem Lipidgemisch entfernt, und die Lipide wurden in Wasser zu 10% (w/v) rekonstituiert. Die erhaltenen Liposomen wurden verkleinert, indem man sie unter Verwendung des Liposofast-Basic- oder Liposofast-50-Extruders (Avestin) durch eine Reihe von Polycarbonat-(PC)-Filtern (0,4 μm, 0,2 μm, 0,1 μm und 0,05 μm) extrudierte, wobei man Liposomen mit einer mittleren Größe von 0,1 μm erhielt.
2. Liposomen mit Eier-Phosphatidylcholin/Polyethylenglycol-Phosphatidylethanolamin (E-PC/PEG-PE)
Eine Lösung von Eier-Phosphatidylcholin (E-PC) und Polyethylenglycol-Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) in tert-Butanol wurde hergestellt, indem man 0,73 g E-PC, 0,185 g PEG-PE, 0,86 mg α-Tocopherol und Fluorescein-markiertes Phosphatidylethanolamin (1:1000 Lipid-Stoffmengenverhältnis) in 18 ml tert-Butanol löste.
Das organische Lösungsmittel wurde durch Lyophilisierung aus dem Lipidgemisch entfernt und dann in Wasser zu 10% (w/v) rekonstituiert. Die erhaltenen Liposomen wurden verkleinert, wie es oben unter 1 beschrieben ist, wobei man Liposomen mit einer mittleren Größe von 0,1 μm erhielt.
3. Liposomen mit Eier-Phosphatidylcholin-Phosphatidylglycerin (E-PC/PG)
Eine Lösung von Eier-Phosphatidylcholin (E-PC) und Phosphatidylglycerin (PG) in tert-Butanol wurde hergestellt, indem man 0,822 g E-PC, 0,0924 g PG, 0,86 mg α-Tocopherol und Fluorescein-markiertes Phosphatidylethanolamin (1:1000 Lipid-Stoffmengenverhältnis) in 18 ml tert-Butanol löste.
Das organische Lösungsmittel wurde durch Lyophilisierung aus dem Lipidgemisch entfernt und dann in Wasser zu 10% (w/v) rekonstituiert. Die erhaltenen Liposomen wurden verkleinert, wie es oben unter 1 beschrieben ist, wobei man Liposomen mit einer mittleren Größe von 0,1 μm erhielt.
4. Rekonstitution des humanen rekombinanten Faktors VIII:
In den folgenden Beispielen wurde Kogenate (rFVIII, zubereitet mit Human-Albumin, Bayer), Chargen 70K026 und 70K027, verwendet. Eine Ampulle, die etwa 500 IE FVIII-Aktivität enthielt, wurde mit 2 ml Wasser rekonstituiert, und man ließ die Substanz sich auflösen. 200-μl-Aliquote wurden bis zur Verwendung bei –20 °C eingefroren.
Für die Herstellung von Albumin-abgereichertem Kogenate wurde die Charge Nr. 70K027 verwendet. 10 Ampullen Kogenate wurden in 20 ml Wasser rekonstituiert und auf einem hydrophilen Silicagel (3-10 μm Kügelchen) chromatographiert. Fraktionen von 10 ml wurden aufgefangen, und die Aktivitäten des Proteins und von FVIII:Ag wurden überwacht. Eine 50%ige Ausbeute der FVIII:Ag-Aktivität wurde in einem Peak der Fraktionen 4-6 und einem anderen der Fraktionen 8-14 gefunden. Da der Proteinassay einen Peak bei den Fraktionen 9-12 ergab, wurden die Fraktionen 4-6 vereinigt, allquotiert und für die weitere Verwendung lyophilisiert.

5. Hämophile Mäuse, die so hergestellt wurden, wie es in Bi, L., et al. (1995) Nature Genetics 10: 119-121, beschrieben ist, wurden verwendet.
6. Die FVIII:Ag-Aktivität wurde unter Verwendung eines chromogenen FVIII-Assay bestimmt, der von Dade AG, Dudingen, Schweiz, kommerziell erhältlich ist.
7. Herstellung einer Zusammensetzung und Injektion in hämophile Mäuse Ein liposomales Aliquot wurde mit einem vorbestimmten Volumen von FVIII gemischt, so dass man eine FVIII:Ag-Aktivität von 5-10 IE/ml erhielt, und bei RT gerollt, um Homogenität zu erreichen.
8. Gruppen von 5-10 hämophilen Mäusen wurde ein Bolus von 200 oder 400 μl des Gemischs intravenös durch die Schwanzvene injiziert. Den Mäusen wurde in regelmäßigen Zeitabständen (1 h, 4 h, 8 h, 24 h, 32 h und 48 h) Blut aus dem Auge entnommen, und die FVIII:Ag-Aktivitäten im Plasma wurden verfolgt.
9. Aus den Ergebnissen wurde die Pharmakokinetik von FVIII bestimmt, indem man die RSTRIP-Computer-Software verwendete, wobei man die anfängliche FVIII:C-Aktivität (A₀) und die Halbwertszeit (T_1/2) des Faktors im Blutkreislauf der Mäuse erhielt.

Ergebnisse
1. Wirkung der Lipidzusammensetzung auf die Halbwertszeit von Faktor VIII
Liposomen von 0,05 μm, die E-PC, E-PC/PEG-PE und E-PC/PG enthielten, wurden hergestellt, in einem Verhältnis von Lipid zu Protein (w/w) von 72:1 mit Kogenate gemischt und in hämophile Mäuse injiziert. Als Kontrolle wurde Kogenate in Salzlösung verdünnt und in derselben Weise wie die liposomalen Gemische in die Mäuse injiziert. Die pharmakokinetischen Parameter wurden so bestimmt, wie es oben beschrieben ist, und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst: Tabelle Nr. 1: Wirkung der Lipidzusammensetzung auf die Halbwertszeit von FVIII
Aus der Tabelle ist zu erkennen, dass Liposomen, die E-PC/PEG-PE enthalten, am effektivsten waren, da sowohl die Anfangs-FVIII-Aktivität als auch die Halbwertszeit für diese Zusammensetzung höher waren als für Kogenate oder Kogenate-Liposomen-Gemische, bei denen die Liposomen aus E-PC/PG oder nur aus E-PC bestanden.
Außerdem zeigten 40% der Mäuse, denen freier FVIII injiziert wurde, und 100% der Mäuse, denen FVIII/PC-Komplex injiziert wurde, keine Erholung der chromogenen FVIII-Aktivität, während nur 10% der Mäuse, denen FVIII/PC+PEG injiziert wurde, 60 min nach der Injektion dasselbe Phänomen zeigten.
2. Wirkung des Lipid/Protein-Verhältnisses auf die Halbwertszeit von Faktor VIII
Verschiedene Verhältnisse von Lipid zu Protein in der Liposomenzusammensetzung wurden erhalten, indem man verschiedene Aliquote von Liposomen von 0,05 μm, die E-PC/PEG-PE umfassten, mit Kogenate mischte. Diese wurden in hämophile Mäuse injiziert. Als Kontrolle wurde Kogenate in Salzlösung verdünnt und in derselben Weise wie die liposomalen Gemische in die Mäuse injiziert. Die pharmakokinetischen Parameter wurden so bestimmt, wie es oben beschrieben ist, und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst: Tabelle Nr. 2: Wirkung des Verhältnisses von Lipid zu Protein auf die Halbwertszeit von FVIII
Aus Tabelle Nr. 2 ist zu erkennen, dass durch eine Erhöhung des Lipid/Protein-Verhältnisses die Halbwertszeit von FVIII im Blutkreislauf der hämophilen Mäuse erhöht wird. Die Unterschiede in den anfänglichen FVIII:C-Aktivitäten scheinen nicht mit dem Lipid/Protein-Verhältnis zusammenzuhängen.
3. Wirkung von verschiedenen Faktor-VIII-Quellen
SUVs von 0,05 μm, die E-PC und PEG-PE (94:6 Mol-%) enthielten, wurden hergestellt, mit FVIII-Konzentraten aus verschiedenen Quellen (Kogenate, Baxter und Omrixate) in einem Lipid-Protein-Verhältnis von 72:1 gemischt und in hämophile Mäuse injiziert. Als Kontrolle wurde jedes FVIII-Konzentrat aus den verschiedenen Quellen in Salzlösung verdünnt und in derselben Weise wie die liposomalen Gemische in die Mäuse injiziert. Die pharmakokinetischen Parameter wurden so bestimmt, wie es oben beschrieben ist, und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst: Tabelle Nr. 3: Wirkung der Faktor-VIII-Quelle auf die Halbwertszeit von FVIII
Gemische, die Liposomen und FVIII von Baxter oder Omrixate enthielten, erhöhten die Halbwertszeit des Faktors um 20% im Vergleich zu den pharmakokinetischen Werten des freien Faktors, wie man aus der obigen Tabelle ersieht. Die Halbwertszeit des Faktors FVIII von Kogenate, gemischt mit E-PC/PEG-PE-Liposomen, war doppelt so lang als die der freien Form des Faktors.
Beispiel 4
Verfahren und Materialien
1. Liposomenherstellung:
Liposomen wurden wie folgt hergestellt: Eier-Phosphatidylcholin (EPC) und Distearoylphosphatidylethanolaminmethyl-Polyethylenglycol 2000 (DSPE-PEG 2000) wurden auf ein Verhältnis von 80:20 w/w (5% Stoffmengenanteil von DSPE-PEG 2000) abgewogen, auf 10% w/v in tert-Butanol (Riedel-de-Haen) gelöst, und die Lösung wurde lyophilisiert. Das erhaltene trockene Lipidpulver wurde in einem Puffer, der 130 mM NaCl, 10 mM Natriumcitrat, 1 mM CaCl₂, pH 7,0, enthielt, auf 10% w/v resuspendiert, wobei Liposomen entstanden. Die Liposomen wurden in einer Extruderapparatur (Avestin) durch Polycarbonatfilter mit einer Größe von 1,2 μm, 0,2 μm und 0,1 μm filtriert, wobei Liposomen mit einer Größe von 120-140 nm entstanden.
2. Liposomen-Qualitätskontrolle
Zur Qualitätskontrolle der Liposomen gehörte:

1) Messung der Größenverteilung durch Submikron-Teilchenanalysator (N4 plus, Coulter Electronics)
2) Phospholipidbestimmung (anhand von Phosphor)
3) Chemische Stabilität der Lipide durch DC

Die Tests wurden so durchgeführt, wie es beschrieben ist in: Barenholz, Y. und Amselem, 5. (1993) in Liposome Technology, 2. Auflage, Band I (Gregoriadis, G., Hrsg.), CRC Press, Boca Raton, FL, 5. 527-616.
3. Zubereitung von FVIII und Liposomen
Kogenate (Chargen-Nr. 70K027, 620 IE) oder New Kogenate (500 IE) wurde in 1 ml oder 2 ml H₂O aufgelöst. Das rFVIII-SQ-Konzentrat wurde in Liposomenlösung aufgelöst. Faktor VIII wurde mit Liposomen zubereitet, indem man FVIII-Konzentrat etwa 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit den Liposomen mischt. Das Verhältnis von Lipiden zu FVIII-Einheiten betrug etwa 1 mg Lipide pro Einheit FVIII.
4. Injektion in hämophile Mäuse und Blutentnahmeverfahren
Faktor VIII und mit Liposomen zubereiteter FVIII wurden in die Schwanzvene von hämophilen Mäusen injiziert. Die injizierte Dosis betrug 3 Einheiten/Maus für Kogenate (2 getrennte Experimente) und New Kogenate sowie 4 Einheiten/Maus für rFVIII-SQ. Den Mäusen wurde 10 Minuten nach der Injektion und etwa 4, 19 und 27 Stunden nach der Injektion Blut in Citratröhrchen entnommen.
5. Messung von FVIII-Konzentrat in Mausplasma
Human-FVIII-Konzentrat in Mausplasma wurde unter Verwendung eines chromogenen Assays (Chromogenix) gemäß den Anweisungen des Herstellers und durch einen einstufigen Gerinnungsassay (mit Hilfe von Stago-Reagentien und ST4-Gerinnungsmaschine) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.
6. Pharmakokinetik-Analyse
Pharmakokinetik-Parameter wurden unter Verwendung eines Computerprogramms (RSTRIP, MicroMath Inc.) analysiert.
7. Überlebensrate von hämophilen Mäusen nach einem Schwanzschnitt
Mäusen wurde freies rFVIII-SQ oder mit Liposomen zubereitetes rFVIII-SQ (4 Einheiten/Maus, 11 Mäuse in jeder Gruppe) injiziert. 20 Stunden nach der Injektion wurden 2 cm des Schwanzes abgeschnitten. Die Schwänze der überlebenden Mäuse wurden wiederum 28, 44, 52, 69, 88 und 140 Stunden nach der Injektion (jedes Mal 2 mm) abgeschnitten.
Ergebnisse
Die Ergebnisse der FVIII-Aktivität zu jedem Zeitpunkt nach der Injektion und die Pharmakokinetik-Parameter [FVIII-Halbwertszeit (HL) und die Fläche unter der Kurve (AUC)] von 4 verschiedenen Experimenten sind in den Tabellen 4-7B zusammengefasst. In den Tabellen 4 und 5 wurden 3 Einheiten Kogenate/Maus injiziert; in Tabelle 6 wurden 3 Einheiten New Kogenate/Maus injiziert; und in den Tabellen 7A, 7B und in 1 wurden 4 Einheiten rFVIII-SQ/Maus injiziert.
Tabelle 4: Faktor-VIII-Aktivität (E/ml, gemessen durch einen chromogenen Assay) und Pharmakokinetik-Parameter nach der Injektion von humanem FVIII in hämophile Mäuse
Tabelle 5: Faktor-VIII-Aktivität (E/ml, gemessen durch einen chromogenen Assay) und Pharmakokinetik-Parameter nach der Injektion von humanem FVIII in hämophile Mäuse
Tabelle 6: Faktor-VIII-Aktivität (E/ml, gemessen durch einen chromogenen Assay) und Pharmakokinetik-Parameter nach der Injektion von humanem FVIII in hämophile Mäuse
Tabelle 7A: Faktor-VIII-Aktivität (E/ml, gemessen durch einen chromogenen Assay) und Pharmakokinetik-Parameter nach der Injektion von humanem FVIII in hämophile Mäuse
Tabelle 7B: Faktor-VIII-Aktivität (E/ml, gemessen durch einen einstufigen Gerinnungsassay) und Pharmakokinetik-Parameter nach der Injektion von humanem FVIII in hämophile Mäuse
Außerdem wurde die Halbwertszeit von humanem FVIII in jeder Maus berechnet, und die FVIII-Halbwertszeiten in allen experimentellen Gruppen wurden mit einem Student-t-Test statistisch miteinander verglichen.
Die statistische Analyse weist darauf hin, dass die Halbwertszeiten von humanem FVIII in den Gruppen, die Liposomen-zubereiteten FVIII erhielten, bei allen 4 Experimenten höher und signifikant unterschiedlich (p < 0,055) von den Halbwertszeiten von humanem FVIII in den Gruppen, die freies FVIII erhielten, waren:
HL von Kogenate vs. HL von Kogenate + Liposomen (Tabelle 4) p = 0,054
HL von Kogenate vs. AUC von Kogenate + Liposomen (Tabelle 5) p = 0,031
HL von New Kogenate vs. HL von New Kogenate + Liposomen (Tabelle 6) p = 0,0085
HL von rFVIII-SQ vs. HL von rFVIII-SQ + Liposomen (Tabelle 7A) p = 0,0045
HL von rFVIII-SQ vs. HL von rFVIII-SQ + Liposomen (Tabelle 7B) p = 0,022
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Zubereitung von Kogenate, New Kogenate oder rFVIII-SQ mit Liposomen die Halbwertszeit (HL) des Faktors und die Fläche unter der Kurve (AUC) von FVIII bei hämophilen Mäusen signifikant erhöht (Faktor 1,6-2,0 für HL und AUC).
Die Überlebensrate der Mäuse ist in 1 gezeigt. Die Ergebnisse des Schwanzschnittexperiments weisen darauf hin, dass der Liposomen-zubereitete FVIII länger biologisch aktiv ist als freier FVIII und daher hämophile Patienten während eines längeren Zeitraums schützen kann.
Beispiel 5
Wirksamkeit einer FVIII-Zusammensetzung bei Patienten mit Inhibitoren
15 Einheiten FVIII (Kogenate) wurden eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 120-nm-Liposomen (15 mg Lipide), die EPC:DSPE-PEG2000 enthielten (95:5 Mol-%) inkubiert. Dann wurde 1 Einheit freier FVIII (Kogenate) oder 1 Einheit Liposomen-zubereiteter FVIII 2 Stunden lang bei 37 °C mit verschiedenen Verdünnungen eines Serums von einem Hämophiliepatienten inkubiert, der Inhibitoren entwickelt hatte (Anti-FVIII-Antikörper). Nach der Inkubation wurde die Aktivität von Faktor VIII durch einen chromogenen Assay gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefasst:
Tabelle 8: Aktivität (Einheiten/ml) von Faktor VIII in Gegenwart von FVIII-Inhibitoren
Aus diesem Experiment ist eindeutig zu ersehen, dass die Verabreichung von FVIII zusammen mit den kolloidalen Teilchen den FVIII wirksam vor Serum-Inhibitoren schützt.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge Koagulationsfaktor VIII (FVIII) und im Wesentlichen neutrale kolloidale Teilchen, wobei die Teilchen 1-20 Mol-% eines amphipathischen Lipids umfassen, das mit einem biokompatiblen hydrophilen Polymer derivatisiert ist, wobei das Polymer im Wesentlichen keine Nettoladung trägt, wobei der FVIII nicht in den kolloidalen Teilchen eingekapselt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das kolloidale Teilchen einen mittleren Teilchendurchmesser von 0,05 bis 0,4 μm hat.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei das kolloidale Teilchen einen mittleren Teilchendurchmesser von ungefähr 0,1 μm hat.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das amphipathische Lipid ein Phospholipid aus natürlichen oder synthetischen Quellen ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, wobei es sich bei dem amphipathischen Lipid um Phosphatidylethanolamin, das mit PEG derivatisiert ist, handelt.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das biokompatible hydrophile Polymer aus Polyalkylether, Polymilch- und Polyglycolsäurefamilien ausgewählt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei das biokompatible hydrophile Polymer Polyethylenglycol ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei das Polyethylenglycol ein Molekulargewicht von 1000 bis 5000 Dalton hat.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, wobei das Polyethylenglycol ein Molekulargewicht von ungefähr 2000 Dalton hat.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der FVIII aus einer natürlichen Quelle stammt.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der FVIII rekombinant hergestellt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Verhältnis von Teilchen zu FVIII (Gewicht/FVIII-Einheit) 0,1 mg/Einheit bis 10 mg/Einheit beträgt.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei das Verhältnis von Teilchen zu FVIII (Gewicht/FVIII-Einheit) ungefähr 1 mg/Einheit beträgt.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das amphipathische Lipid Phosphatidylcholin umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, die mit PEG derivatisiertes Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin umfasst.
Verwendung eines kolloidalen Teilchens bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung für die Behandlung eines Patienten, der unter Hämophilie leidet, wobei die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge Koagulationsfaktor VIII (FVIII) und im Wesentlichen neutrale kolloidale Teilchen umfasst, wobei die Teilchen 1-20 Mol-% eines amphipathischen Lipids umfassen, das mit einem biokompatiblen hydrophilen Polymer derivatisiert ist, wobei das Polymer im Wesentlichen keine Nettoladung trägt, wobei der FVIII nicht in den kolloidalen Teilchen eingekapselt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei der Patient FVIII-Inhibitor-Antikörper entwickelt hat.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Proteins oder Polypeptids und im Wesentlichen neutrale kolloidale Teilchen, wobei die Teilchen 1-20 Mol-% eines amphipathischen Lipids umfassen, das mit einem biokompatiblen hydrophilen Polymer derivatisiert ist, wobei das Polymer im Wesentlichen keine Nettoladung trägt, wobei das Protein oder Polypeptid ausgewählt ist aus: (a) Proteinen oder Polypeptiden, die extern an die kolloidalen Teilchen binden können; und (b) Proteinen oder Polypeptiden, die Polyethylenglycol binden können; und wobei das Protein oder Polypeptid nicht in den kolloidalen Teilchen eingekapselt ist.
Verwendung eines kolloidalen Teilchens bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Proteins oder Polypeptids und im Wesentlichen neutrale kolloidale Teilchen umfasst, wobei die Teilchen 1- 20 Mol-% eines amphipathischen Lipids umfassen, das mit einem biokompatiblen hydrophilen Polymer derivatisiert ist, wobei das Polymer im Wesentlichen keine Nettoladung trägt, wobei das Protein oder Polypeptid ausgewählt ist aus: (a) Proteinen oder Polypeptiden, die extern an die kolloidalen Teilchen binden können; und (b) Proteinen oder Polypeptiden, die Polyethylenglycol binden können; und wobei das Protein oder Polypeptid nicht in den kolloidalen Teilchen eingekapselt ist.