ES2233036T3 - Composicion farmaceutica que comprende factor viii y liposomas neutros. - Google Patents
Composicion farmaceutica que comprende factor viii y liposomas neutros.Info
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Abstract
Una composición farmacéutica para administración parenteral, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de factor de coagulación VIII (FVIII) y partículas coloidales sustancialmente neutras, comprendiendo dichas partículas 1-20 por ciento en moles de un lípido anfipático derivatizado con un polímero hidrófilo biocompatible, no teniendo dicho polímero sustancialmente carga neta, en la que dicho FVIII no está encapsulado en dichas partículas coloidales.
Description
Composición farmacéutica que comprende factor
VIII y liposomas neutros.
La presente invención se refiere a una
formulación farmacéutica estable para el desprendimiento lento de
substancias que promueven la coagulación para el tratamiento de
trastornos de coagulación de la sangre.
La hemofilia A es uno de los trastornos
hereditarios de la coagulación que ocurren más frecuentemente. Los
pacientes con hemofilia A son propensos a hemorragias frecuentes
como resultado de una o más malfunciones del sistema de coagulación.
Una de las causas de la hemofilia es una falta de Factor VIII
(FVIII) en la sangre. Este problema se puede tratar con concentrados
de Factor VIII. Sin embargo, en alrededor del 15% de los pacientes
da como resultado la aparición de anticuerpos que neutralizan el
Factor VIII, llamados inhibidores, por lo que una terapia con
concentrados de Factor VIII apenas es posible.
Se han descrito dos planteamientos básicos en la
bibliografía para proteger el FVIII de la inactivación por los
inhibidores.
El documento WO/80/01456 de Hemker describe una
composición farmacéutica apropiada para la administración oral que
comprende FVIII incorporado dentro de liposomas de
0,5-1,0 micrómetros formados de fosfolípidos. Los
fosfolípidos tienen una carga neta, y el FVIII se incorpora entre
las capas del liposoma. Se reivindica que los niveles de FVIII en el
plasma permanecieron por encima de alrededor del 5% del valor normal
durante un período de 50 horas.
El documento US 4.348.384 de Horikoshi afirma que
se preparó una composición como se describe en Hemker, pero no dio
resultados satisfactorios. Por lo tanto, Horikoski incorpora un
inhibidor de proteasa en el liposoma junto con el FVIII, para
protegerlo de la proteolisis. Se obtuvieron el 3% de los niveles en
plasma de FVIII durante un periodo de 6 horas.
El documento US 5.013.556 de Woodle describe una
composición de liposoma para su uso para suministrar diversos
fármacos vía la corriente sanguínea. El liposoma contiene entre
1-20 por ciento en moles de un lípido anfipático
derivatizado con un poli(éter alquílico). También aquí, el compuesto
del fármaco está atrapado dentro del liposoma. Estas composiciones
de liposoma están disponibles comercialmente con el nombre de
ampollas Stealth® (SUV's, pequeñas ampollas unilaminares que
comprenden fosfolípido y polietilenglicol (PEG) unido covalentemente
a fosfolípido).
Un problema adicional con este planteamiento es
que los liposomas que tienen un gran diámetro tienen una semivida
corta. Por lo tanto, los liposomas se deben rebajar de tamaño a alta
presión, lo que puede afectar a las actividades de las proteínas
como en los factores de coagulación V y VIII.
En un segundo planteamiento, Barrowcliffe T.W.,
et al. (1983). J. Lab. Clin. Med. 101:34-43
enseña que mezclar FVIII con fosfolípido extraído de cerebro humano
y/o animal imparte protección significativa al FVIII in
vitro. En este planteamiento, el fosfolípido está unido al FVIII
en lugar de encapsulándolo. Kemball-Cook G. y
Barrowcliffe T.W. (1992) Thromb. Res. 67:57-71,
enseña que es necesaria una superficie de fosfolípido negativamente
cargada para unirse al FVIII. Se encontró que la fosfatidilserina
negativamente cargada y el ácido fosfatídico eran altamente activos
para unirse al FVIII, mientras que la fosfatidilcolina era inactiva.
Sin embargo, los fosfolípidos negativamente cargados son tóxicos, y
los derivados de tejido cerebral pueden llevar agentes
patógenos.
El documento EP 689.428 describe una composición
de liposoma que comprende liposomas que tienen una capa superficial
exterior de cadenas de polímero hidrófilo. Una molécula de efector
de polipéptido o polisacárido está covalentemente unida a los
extremos distales de las cadenas poliméricas por activación del
anclaje del lípido previamente al acoplamiento del efector.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar una composición farmacéutica que comprende una proteína
o polipéptido para el tratamiento terapéutico. En particular, es un
objetivo de la presente invención proporcionar una composición
farmacéutica que comprende FVIII para el tratamiento de trastornos
de la coagulación de la sangre.
Es un objetivo adicional de la invención
proporcionar FVIII en una forma que tiene una semivida extendida en
la corriente sanguínea.
En un objetivo aún más adicional de la invención
proporcionar un método para tratar pacientes que padecen trastornos
de coagulación de la sangre, particularmente hemofilia, y más
particularmente los que tienen inhibidores del FVIII.
En un aspecto de la presente invención se
proporciona una composición farmacéutica para su administración
parenteral que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del
factor de coagulación VIII (FVIII) y partículas coloidales
sustancialmente neutras, comprendiendo las partículas
1-20 por ciento en moles de un lípido anfipático
derivatizado con un polímero hidrófilo biocompatible, no teniendo el
polímero sustancialmente carga neta, en el que el FVIII no está
encapsulado en las partículas coloidales.
La presente invención está basada en el
sorprendente e inesperado hallazgo de que los fosfolípidos neutros
derivatizados con un polímero hidrófilo biocompatible se pueden usar
para unirse al FVIII y protegerlo de los inhibidores en la corriente
sanguínea. Esto proporciona una significativa ventaja sobre las
composiciones de la técnica anterior, dado que los fosfolípidos
usados son sintéticos y no tóxicos, y por lo tanto se pueden usar
in vivo para tratamiento terapéutico. Además, el liposoma no
encapsula al FVIII de modo que se pueden usar liposomas de tamaño
más pequeño que tienen una semivida más larga in vivo, dado
que no son retirados por el sistema reticuloendotélico (RES). Tal
como se describirá a continuación con mayor detalle, el FVIII
interacciona no covalentemente con las cadenas poliméricas sobre la
superficie externa de los liposomas, y no se lleva a cabo ninguna
reacción química para activar las cadenas poliméricas, a diferencia
de las composiciones descritas en el documento EP 689.428.
En la presente memoria descriptiva, las
expresiones "sustancialmente neutro" y "sustancialmente sin
carga neta" quieren decir ni positiva ni negativamente cargado.
Sin embargo, se incluye dentro del significado de las expresiones
anteriores una muy pequeña carga medida dentro del error
experimental de cero.
La expresión "cantidad terapéuticamente
efectiva" se debe entender que se refiere a una cantidad de FVIII
que da como resultado un nivel de FVIII en la corriente sanguínea
que tiene un efecto terapéutico deseado. Tal cantidad se puede
determinar experimentalmente administrando composiciones que
comprenden diferentes cantidades de FVIII y midiendo el nivel en la
sangre en varios momentos después de la administración.
El lípido anfipático usado para preparar las
partículas coloidales es preferentemente un fosfolípido, y se puede
obtener de fuentes naturales o sintéticas. Un fosfolípido más
preferido es fosfatidilcolina, lo más preferentemente
fosfatidilcolina de huevo.
El polímero hidrófilo biocompatible puede incluir
polímeros familias de poli(éter alquílico), poli(ácido láctico) o
poli(ácido glicólico). Preferentemente, el polímero es
polietilenglicol (PEG). El propósito del polímero es estabilizar
estéricamente las SUV's, previniendo de este modo la unión de las
ampollas in vitro, y permitiendo que las ampollas escapen de
la absorción por el RES in vivo. El polímero tendrá
preferentemente un peso molecular entre 1000 y 5000 daltons, lo más
preferentemente aproximadamente 2000 daltons.
Las partículas coloidales tendrán preferentemente
un diámetro medio de partícula entre 0,05 y 0,4 \mum, lo más
preferentemente alrededor de 0,1 \mum. Esto es para incrementar su
tiempo de circulación in vivo y evitar su adsorción por el
RES. El lípido anfipático comprende aproximadamente de 1 a alrededor
de 20% en moles de partículas, preferentemente aproximadamente
1-5%, lo más preferentemente 5%.
Se pueden usar varias reacciones de copulación
conocidas para preparar lípidos que forman ampollas derivatizados
con polímeros hidrófilos. Por ejemplo, un polímero (tal como PEG) se
puede derivatizar con un lípido tal como fosfatidiletanolamina (PE)
a través de un grupo cloruro cianúrico. Alternativamente un PEG
protegido se puede activar con un reactivo de copulación de
carbonil-diimidazol, para formar un compuesto de
imidazol activado. Otras reacciones son bien conocidas y se listan,
por ejemplo, en el documento U.S. 5.013.556 anteriormente
mencionado.
mencionado.
El FVIII usado en la composición de la invención
está comercialmente disponible. Puede ser de una fuente natural
humana, o, preferentemente, se puede preparar recombinantemente. El
FVIII recombinante está comercialmente disponible, por ejemplo,
Antihemophilic Factor (Recombinant), rFVIII-SQ
(Pharmacia), y Kogenate, Miles Inc., Pharmaceutical Division,
Elkhart, IN, U.S.A, entre otros suministradores.
La composición de la invención se administra
parenteralmente, preferentemente iv.. Las composiciones de la
técnica anterior se deseaban solo para uso oral, debido a los
efectos secundarios causados durante la inyección por la composición
de liposoma. La composición de la invención, por otra parte, no es
tóxica por inyección, aparentemente debido a la ausencia de carga,
entre otras causas. Se han inyectado cantidades hasta de 0,5 mg/kg
de peso corporal de partículas coloidales según la invención sin
síntomas tóxicos detectables. La dosis se espera que esté en el
intervalo de 25-27 u.i./Kg de peso corporal. La
relación de partícula a FVIII (peso/unidad de FVIII) estará
preferentemente entre 0,1 mg/unidad y 10 mg/unidad, y lo más
preferentemente, aproximadamente 1 mg/unidad. Aunque la forma libre
del FVIII:C tiene una semivida de menos de 2 horas (el FVIII medido
por la actividad de coagulación) en ratones, el FVIII administrado
en la composición de la invención se espera que sea efectivo durante
por lo menos 24 horas, que es el período de actividad efectiva del
compuesto promotor de coagulación. La composición de la invención se
espera que sea efectiva "cuando se necesite" y en el
tratamiento profiláctico de pacientes de hemofilia, y
particularmente los pacientes que han desarrollado anticuerpos
inhibidores del FVIII.
La efectividad del FVIII contenido en la
composición de la invención se puede determinar por un ensayo
cromogénico que determina la actividad del FVIII por medio de dos
etapas consecutivas: (1) la conversión dependiente de FVIII del
Factor X al Factor Xa en un reactivo del factor de coagulación
compuesto de componentes purificados, y (2) la escisión enzimática
de un substrato de Factor Xa cromogénico para dar un cromóforo que
se puede cuantificar espectrofotométricamente. En las condiciones de
ensayo apropiadas, existe una relación lineal entre la velocidad de
la formación del Factor Xa y la concentración de FVIII. Además, la
actividad del FVIII se puede determinar por medio de un ensayo de
coagulación de una etapa. Este ensayo determina la actividad del
FVIII por la conversión de la protrombina a trombina, que
subsecuentemente escinde el fibrinógeno para formar un coágulo
compuesto de fibrina. La actividad del FVIII en ratones hemofílicos
se puede determinar también midiendo la supervivencia de los ratones
después de un corte en la cola.
En un aspecto adicional de la invención, se
proporciona una composición farmacéutica para administración
parenteral que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de
una proteína o polipéptido y partículas coloidales sustancialmente
neutras, comprendiendo dichas partículas 1-20 por
ciento en moles de un lípido anfipático derivatizado con un polímero
hidrófilo biocompatible, no teniendo dicho polímero sustancialmente
carga neta, en el que dicha proteína o polipéptido se selecciona del
grupo que consiste en: (a) proteínas o polipéptidos capaces de
unirse externamente a dichas partículas coloidales; y (b) proteínas
o polipéptidos capaces de unirse a polietilenglicol (PEG), y en el
que dicha proteína o polipéptido no está encapsulado en dichas
partículas coloidales.
La expresión "proteinas o polipéptidos capaces
de unirse externamente a dichas partículas coloidales" incluye
proteínas y polipéptidos que, similarmente al FVIII, se unen a
membranas que comprenden fosfatidilcolina:fosfatidilserina (PC:PS)
(véase Haemostasis and Thrombosis. Arthur L. Bloom and Duncan P.
Thomas (eds) (1987) Churchill Livingstone, pg.
179-180). Los ejemplos no limitantes de tales
proteínas son factores de coagulación tales como protrombina, Factor
X y Factor V.
La expresión "proteínas o polipéptidos capaces
de unirse a polietilenglicol" incluye proteínas y polipéptidos
que se unen a PEG o derivados de PEG por medio de cualquier
mecanismo no covalente, tal como interacciones iónicas,
interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno y atracciones de Van
der Waals (Arakawa, T. and Timasheff, S.N. (1985) Biochemistry
24:6756-6762; Lee, J.C. and Lee, L.L.Y. (1981). J.
Biol. Chem. 226:625-631).
Para comprender la invención y ver como se puede
llevar a cabo en la práctica, se describirán ahora las realizaciones
preferidas solo por medio del ejemplo no limitante, con referencia
al dibujo que le acompaña que ilustra la supervivencia de ratones
hemofílicos inyectados con FVIII después de un corte en la cola en
varios periodos de tiempo después de la inyección.
Ejemplos
1-3
Se preparó una disolución en
terc-butanol de fosfatidilcolina de huevo
(E-PC) disolviendo 2,0 g de E-PC,
1,9 mg de \alpha-tocoferol y fosfatidiletanolamina
marcada con fluoresceína (relación molar a lípido 1:1000) en 18 ml
de terc-butanol.
El disolvente orgánico se retiró de la mezcla
lipídica por liofilización y los lípidos se reconstituyeron en agua
al 10% peso/v. Los liposomas obtenidos se redujeron de tamaño
extruyéndolos a través de una serie de filtros de policarbonato (PC)
(0,4 \mum, 0,2 \mum, 0,1 \mum y 0,05 \mum) usando el
extrusor Liposofast-Basic o
Liposofast-50 (Avestin) para obtener liposomas de un
tamaño medio de 0,1 \mum.
Se preparó una disolución de fosfatidilcolina de
huevo (E-PC) en terc-butanol y
polietilenglicol-fosfatidiletanolamina
(PEG-PE) mezclando 0,73 g de EP-C,
0,185 g de PEG-PE, 0,86 mg de
\alpha-tocoferol y fosfatidiletanolamina marcada
con fluoresceína (relación molar a lípido 1:1000) en 18 ml de
terc-butanol.
El disolvente orgánico se retiró de la mezcla
lipídica por liofilización y a continuación se reconstituyó en agua
hasta el 10% peso/v. Los liposomas obtenidos se redujeron de tamaño
como se describe en 1 anteriormente para obtener liposomas de un
tamaño medio de 0,1 \mum.
Se preparó una disolución de fosfatidilcolina de
huevo (E-PC) en terc-butanol y
fosfatidilglicerol (PG) mezclando 0,822 g de EP-C,
0,0924 g de PG, 0,86 mg de \alpha-tocoferol y
fosfatidiletanolamina marcada con fluoresceína (relación molar a
lípido 1:1000) en 18 ml de terc-butanol.
El disolvente orgánico se retiró de la mezcla
lipídica por liofilización y a continuación se reconstituyó en agua
hasta el 10% peso/v. Los liposomas obtenidos se redujeron de tamaño
como se describe en 1 anteriormente para obtener liposomas de un
tamaño medio de 0,1 \mum.
En los siguientes ejemplos se usaron los lotes
70K026 y 70K027 de Kogenate (rFVIII formulado con albúmina humana,
Bayer). Se reconstituyó un vial que contenía alrededor de 500 UI de
actividad de FVIII con 2 ml de agua y se dejó solubilizar. Se
congelaron alícuotas de 200 \mul a -20ºC hasta su uso.
Para la preparación de Kogenate sin albúmina, se
usó el lote nº 70K027. Se reconstituyeron 10 viales de Kogenate en
20 ml de agua y se cromatografiaron en un gel de sílice hidrófilo
(pelets de 3-10 \mum). Se recogieron fracciones de
10 ml y se controlaron las actividades de la proteína y FVIII:Ag. Se
encontró un 50% de recuperación en la actividad de FVIII:Ag en un
pico de las fracciones 4-6 y en otro de las
fracciones 8-14. Dado que el ensayo de la proteína
dio un pico en las fracciones 9-12, se mezclaron las
fracciones 4-6, se formaron partes alícuotas y se
liofilizaron para uso posterior.
5. Se usaron ratones hemofílicos preparados como
se describe en Bi, L., et al. (1995) Nature Genetics
10:119-121.
6. La actividad del FVIII:Ag se determinó usando
un ensayo cromogénico del FVIII disponible comercialmente de Dade
AG, Dudingen, Switzerland.
Se mezcló una alícuota liposomal con un volumen
determinado de FVIII para obtener una actividad del FVIII:Ag de
5-10 UI/ml y se hizo rodar a temperatura ambiente
para conseguir homogeneidad.
8. Se inyectaron bolos IV a grupos de
5-10 ratones hemofílicos a través de la vena de la
cola, con 200 o 400 \mul de la mezcla. Los ratones fueron
sangrados por el ojo a intervalos regulares de tiempo (1 h, 4 h, 8
h, 32 h, y 48 h) y se siguieron las actividades del FVIII:Ag en el
plasma.
9. Se determinó la farmacocinética del FVIII a
partir de los resultados usando el software de cálculo RSTRIP para
obtener la actividad FVIII:C inicial (A_{0}) y el tiempo de
semivida (T_{1/2}) del factor en la circulación sanguínea del
ratón.
Se prepararon liposomas de 0,05 \mum que
comprenden E-PC,
E-PC/PEG-PE y
E-PC/PG, se mezclaron con Kogenate con una relación
de lípido a proteína de 72:1 y se inyectaron en ratones hemofílicos.
Como control, se diluyó Kogenate en disolución salina y se inyectó
en los ratones de la misma manera que las mezclas liposomales. Se
determinaron los parámetros farmacocinéticos como se describe
anteriormente, y los resultados se resumen en la siguiente
tabla:
| Composición de lípido | A_{0}* (UI/ml) | T_{1/2} (h) | nº. de ratones |
| Control | 2,22 | 4,51 | 18 |
| E-PC/PEG-PE | 3,20 | 7,84 | 10 |
| E-PC | 1,01 | 2,33 | 10 |
| E-PC/PG | No detectable | No detectable | 10 |
| * A_{0}= concentración inicial de FVIII:C |
Se puede ver en la tabla que los liposomas que
contienen E-PC/PEG-PE fueron los más
efectivos dado que tanto la actividad inicial del FVIII como el
tiempo de semivida fueron más altos para esta composición que para
el Kogenate o mezclas de liposoma-Kogenate en las
que los liposomas estaban compuestos de E-PC/PG o
sólo de E-PC.
Además, el 40% de los ratones inyectados con
FVIII libre y el 100% de los ratones inyectados con el complejo
FVIII/PC no exhibieron ninguna recuperación de la actividad
cromogénica del FVIII, mientras que solo el 10% de los ratones
inyectados con FVIII/PC+PEG exhibieron el mismo fenómeno 60 minutos
después de la inyección.
Se obtuvieron varias relaciones de lípido a
proteína en la composición de liposoma mezclando varias alícuotas de
liposomas de 0,05 \mum que comprenden
E-PC/PEG-PE con Kogenate. Estas se
inyectaron en ratones hemofílicos. Como control, se diluyó Kogenate
en disolución salina y se inyectó en los ratones de la misma manera
que las mezclas liposomales. Se determinaron los parámetros
farmacocinéticos como se describe anteriormente, y los resultados se
resumen en la siguiente tabla:
| Lípido/proteína (peso/peso) | A_{0}* (UI/ml) | T_{1/2} (h) | nº. de ratones |
| 134 | 2,26 | 3,3 | 10 |
| 32 | 1,61 | 1,91 | 10 |
| 5,3 | 3,12 | 1,64 | 10 |
| 0,89 | 2,69 | 1,5 | 10 |
| Control | 2,22 | 1,5 | 18 |
Se puede ver en la Tabla nº 2 que al incrementar
la relación de lípido/proteína se incrementa el tiempo de semivida
del FVIII en la circulación sanguínea en los ratones hemofílicos.
Las diferencias en las actividades iniciales FVIII:C parecen no
estar relacionadas con la relación lípido/proteína.
Se prepararon SUV's de 0,05 \mum que contienen
E-PC y PEG-PE (94:6% mol), se
mezclaron con concentrados de FVIII de varias fuentes (Kogenate,
Baxter and Omrixate) en una relación de lípido/proteína de 72:1 y se
inyectaron en ratones hemofílicos. Como control, cada concentrado de
FVIII de las distintas fuentes se diluyó en disolución salina y se
inyectó en los ratones de la misma manera que las mezclas
liposomales. Los parámetros farmacocinéticos se determinaron como se
describe anteriormente, y los resultados se resumen en la siguiente
tabla:
| fuente | A_{0} (UI/ml) | T_{1/2} (h) |
| Kogenate | 2,22 | 4,51 |
| Kogenate+SUV's | 3,36 | 8,60 |
| Baxter | 1,36 | 3,83 |
| Baxter+SUV's | 1,08 | 4,45 |
| Omrixate | 2,35 | 3,21 |
| Omrixate+SUV's | 2,31 | 3,90 |
Las mezclas que contienen liposomas y FVIII de
Baxter u Omrixate incrementaron la semivida del factor en un 20%,
cuando se compara con los valores farmacocinéticos del factor libre,
como se puede ver en la tabla anterior. La semivida del factor VIII
de Kogenate, mezclado con liposomas de
E-PC/PEG-PE era el doble de larga,
comparada con la forma del factor libre.
Los liposomas se prepararon como sigue: se pesó
fosfatidilcolina de huevo (EPC) y
diestearoilfosfatidil-etanolamina
metil-polietilenglicol 2000
(DSPE-PEG 2000) hasta una relación de 80:20
peso/peso (relación 5% molar de DSPE-PEG 2000),
respectivamente, se disolvieron hasta el 10% peso/v en
terc-butanol (Reidel-de Haen), y se
liofilizó la disolución. El lípido en polvo seco obtenido se
resuspendió hasta el 10% peso/v en un tampón que contiene NaCl 130
mM, citrato de sodio 10 mM, CaCl_{2} 1 mM, pH 7,0 para formar
liposomas. Los liposomas se filtraron en un aparato extrusor
(Avestin) a través de filtros de policarbonato de 1,2 \mum, 0,2
\mum y 0,1 \mum de tamaño para formar liposomas de
120-140 nm de tamaño.
El control de calidad de los liposomas
incluía:
- 1)
- Distribución de tamaño medido por un analizador de partículas submicrométricas (N4 plus, Coulter Electronics).
- 2)
- Determinación del fosfolípido (por el fósforo)
- 3)
- Estabilidad química de los lípidos por TLC
Los ensayos se realizaron como se describe en:
Barenholtz, Y. and Amselem, S. (1993) en Liposome Technology,
2^{nd} edition, Vol. 1 (Gregoriadis, G., ed.), CRC Press, Boca
Raton, Fl, pp. 527-616.
Se disolvió Kogenate (Lote no. 70K027, 620 UI) o
New Kogenate (500 UI) en 1 ml o 2 ml de H_{2}O. El concentrado de
rFVIII se disolvió en disolución de liposoma. El factor FVIII se
formuló con liposomas mezclando concentrado de FVIII con los
liposomas durante alrededor de 1 hora a temperatura ambiente. La
relación de lípidos a FVIII era alrededor de 1 mg de lipidos/1
unidad de FVIII.
El factor VIII y el FVIII formulado con liposomas
se inyectaron en la vena de la cola de ratones hemofílicos. La dosis
inyectada era de 3 unidades/ratón para Kogenate (2 experimentos
separados) y New Kogenate y de 4 unidades/ratón para
rFVIII-SQ. Los ratones fueron sangrados en tubos de
citrato 10 minutos después de la inyección y a alrededor de 4, 19 y
27 horas después de la inyección.
La concentración de FVIII humano en plasma de
ratón se midió usando un ensayo cromogénico (Chromogenix) según las
instrucciones del fabricante, y por medio de un ensayo de
coagulación de una etapa (usando reactivos Stago y máquina de
coagulación ST4) según las instrucciones del fabricante.
Se analizaron los parámetros farmacocinéticos
usando un programa de ordenador (RSTRIP, MicroMath Inc.)
Se inyectó rFVIII-SQ libre o
rFVIII-SQ formulado con liposoma (4 unidades/ratón)
a ratones, 11 ratones en cada grupo. 20 horas después de la
inyección se les cortaron 2 cm de la cola. Las colas de los ratones
supervivientes se cortaron de nuevo a las 28, 44, 52, 69, 88 y 140
horas después de la inyección (2 mm cada vez).
Los resultados de la actividad del FVIII en cada
punto de tiempo post-inyección y los parámetros
farmacocinéticos [semivida del FVIII (HL) y el área bajo la curva
(AUC)] de 4 experimentos diferentes se resumen en las Tablas
4-7B. En las Tablas 4 y 5, se inyectaron 3 unidades
de Kogenate/ratón; en la Tabla 6, se inyectaron 3 unidades de New
Kogenate/ratón; y en las Tablas 7A, 7B, y en la Fig 1, se inyectaron
4 unidades de rFVIII-SQ/ratón.
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Además, se calculó la semivida del FVIII humano
en cada ratón y las semividas del FVIII en todos los grupos
experimentales se compararon estadísticamente entre sí por un test
de la t de student.
El análisis estadístico indica que en los 4
experimentos las semividas del FVIII humano en los grupos que
recibieron FVIII formulado con liposomas eran más altas y
significativamente diferentes (p<0,055) de las semividas del
FVIII humano en los grupos que recibieron FVIII libre: HL de
Kogenate frente a HL de Kogenate + liposomas (tabla 4) p=0,054; HL
de Kogenate frente a AUC de Kogenate + liposomas (tabla 5) p=0,031;
HL de New Kogenate frente a HL de New Kogenate + liposomas (tabla 6)
p=0,0085;
HL de rFVIII-SQ frente a HL de
rFVIII-SQ + liposomas (tabla 7A); p=0,0045; HL de
rFVIII-SQ frente a HL de rFVIII-SQ +
liposomas (tabla 7B) p=0,022).
Estos resultados indican que la formulación de
Kogenate, New Kogenate, o rFVIII-SQ con liposomas
incrementa significativamente la semivida del factor (HL) y el área
bajo la curva (AUC) del FVIII en ratones hemofílicos (factor de
1,6-2,0 para HL y AUC).
La supervivencia de los ratones se ilustra en la
Fig.1. Los resultados del experimento de corte de la cola indican
que el FVIII formulado con liposomas está biológicamente activo más
tiempo que el FVIII libre, y por lo tanto puede proteger a los
pacientes hemofílicos durante mayor periodo de tiempo.
Se incubaron 15 unidades de FVIII (Kogenate)
durante una hora a temperatura ambiente con liposomas de 120 nm (15
mg de lípidos) que contienen (EPC:DSPE-PEG2000
(95:5% en moles). A continuación, se incubó 1 unidad de FVIII libre
(Kogenate) o 1 unidad de FVIII formulado con liposomas durante 2
horas a 37ºC con varias diluciones de un suero de un paciente
hemofílico que había desarrollado inhibidores (anticuerpos anti
FVIII). Después de la incubación, se midió la actividad del factor
VIII por un ensayo cromogénico.
Los resultados se resumen en la tabla 8:
| Dilución del suero | FVIII libre | FVIII-liposomas |
| Ninguna | 0 | 0,028 |
| 1:5 | 0,052 | 0,094 |
| 1:10 | 0,137 | 0,162 |
| 1:25 | 0,6 | 0,98 |
| 1:100 | 8,736 | 14,94 |
Se puede ver claramente en este experimento que
la administración de FVIII junto con las partículas coloidales es
efectiva para proteger al FVIII de los inhibidores del suero.
Claims (19)
1. Una composición farmacéutica para
administración parenteral, que comprende una cantidad
terapéuticamente efectiva de factor de coagulación VIII (FVIII) y
partículas coloidales sustancialmente neutras, comprendiendo dichas
partículas 1-20 por ciento en moles de un lípido
anfipático derivatizado con un polímero hidrófilo biocompatible, no
teniendo dicho polímero sustancialmente carga neta,
en la que dicho FVIII no está encapsulado en
dichas partículas coloidales.
2. La composición farmacéutica de la
reivindicación 1, en la que la partícula coloidal tiene un diámetro
medio de partícula entre 0,05 y 0,4 \mum.
3. La composición farmacéutica de la
reivindicación 2, en la que la partícula coloidal tiene un diámetro
medio de partícula de aproximadamente 0,1 \mum.
4. La composición farmacéutica de la
reivindicación 1, en la que dicho lípido anfipático es un
fosfolípido de fuentes naturales o sintéticas.
5. La composición farmacéutica de la
reivindicación 4, en la que dicho lípido anfipático es
fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG.
6. La composición farmacéutica de la
reivindicación 1, en la que dicho polímero hidrófilo biocompatible
se selecciona de familias de poli(éter alquílico), poli(ácido
láctico) y poli(ácido glicólico).
7. La composición farmacéutica de la
reivindicación 6, en la que dicho polímero hidrófilo biocompatible
es polietilenglicol.
8. La composición farmacéutica de la
reivindicación 7, en la que el polietilenglicol tiene un peso
molecular entre 1000 y 5000 daltons.
9. La composición farmacéutica de la
reivindicación 8, en la que el polietilenglicol tiene un peso
molecular de aproximadamente 2000 daltons.
10. La composición farmacéutica de la
reivindicación 1, en la que el FVIII es de una fuente natural.
11. La composición farmacéutica de la
reivindicación 1, en la que el FVIII se prepara
recombinantemente.
12. La composición farmacéutica de la
reivindicación 1, en la que la relación de partícula a FVIII
(peso/unidad de FVIII) está entre 0,1 mg/unidad y 10 mg/unidad.
13. La composición farmacéutica de la
reivindicación 12, en la que la relación de partícula a FVIII
(peso/unidad de FVIII) es aproximadamente 1 mg/unidad.
14. La composición farmacéutica de la
reivindicación 1, en la que dicho lípido anfipático comprende
fosfatidilcolina.
15. La composición farmacéutica de la
reivindicación 1, que comprende fosfatidilcolina y
fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG.
16. El uso de una partícula coloidal en la
preparación de una composición farmacéutica para administración
parenteral para el tratamiento de un paciente que padece hemofilia,
que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de factor de
coagulación VIII (FVIII) y partículas coloidales sustancialmente
neutras, comprendiendo dichas partículas 1-20 por
ciento en moles de un lípido anfipático derivatizado con un polímero
hidrófobo biocompatible, no teniendo dicho polímero sustancialmente
carga neta,
en la que dicho FVIII no está encapsulado en
dichas partículas coloidales.
17. Un uso según la reivindicación 15, en el que
dicho paciente ha desarrollado anticuerpos inhibidores del
FVIII.
18. Una composición farmacéutica para
administración parenteral que comprende una cantidad
terapéuticamente efectiva de una proteína o polipéptido y partículas
coloidales sustancialmente neutras, comprendiendo dichas partículas
1-20 por ciento en moles de un lípido anfipático
derivatizado con un polímero hidrófilo biocompatible, no teniendo
dicho polímero sustancialmente carga neta,
en la que dicha proteína o polipéptido se
selecciona de:
- (a)
- proteínas o polipéptidos capaces de unirse externamente a dichas partículas coloidales; y
- (b)
- proteínas o polipéptidos capaces de unirse a polietilenglicol,
y en la que dicha proteína o polipéptido no está
encapsulada en dichas partículas coloidales.
19. El uso de una partícula coloidal en la
preparación de una composición farmacéutica para administración
parenteral que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de
una proteína o polipéptido y partículas coloidales sustancialmente
neutras, comprendiendo dichas partículas 1-20 por
ciento en moles de un lípido anfipático derivatizado con un polímero
hidrófilo biocompatible, no teniendo dicho polímero sustancialmente
carga neta,
en la que dicha proteína o polipéptido se
selecciona de:
- (a)
- proteínas o polipéptidos capaces de unirse externamente a dichas partículas coloidales; y
- (b)
- proteínas o polipéptidos capaces de unirse a polietilenglicol,
y en la que dicha proteína o polipéptido no está
encapsulada en dichas partículas coloidales.
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