CN102603897B - 含引导肽和GnRH-PE39KDEL的融合蛋白和核酸及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过引入肽段（优选蛋白质转导域（PTD）），提高了免疫毒素人促黄体激素释放激素-绿脓杆菌外毒素A衍生物（GnRH-PE39KDEL）细胞杀伤活性，该肽段定位于人促黄体激素释放激素（GnRH）的C端和绿脓杆菌外毒素A衍生物（PE39KDEL）的N端并和GnRH、PE39KDEL组成一种新的融合蛋白，编码该融合蛋白编码的核苷酸序列，以及含有所述序列的表达载体和含有这种表达载体的宿主细胞以及作为免疫毒素在抗肿瘤药物中的应用。

Description

含引导肽和GnRH-PE39KDEL的融合蛋白和核酸及其用途

技术领域

本发明属于生物工程领域。具体为一种新的融合蛋白及其在药物中的应用。本发明公开了一种通过引入肽段（优选蛋白质转导域（PTD）），提高了免疫毒素（人促黄体激素释放激素-绿脓杆菌外毒素A衍生物（GnRH-PE39KDEL））细胞杀伤活性，该肽段定位于人促黄体激素释放激素（GnRH）的C端和绿脓杆菌外毒素A 衍生物（PE39KDEL）的N端并和GnRH、PE39KDEL组成一种新的融合蛋白，以及编码该融合蛋白编码的核苷酸序列，含有所述序列的表达载体和含有这种表达载体的宿主细胞以及作为免疫毒素在抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

目前癌症的治疗仍然是一个世界难题，人们应用的主要的治疗手段仍然是手术，放疗和化疗，传统的治疗法在带来疗效的同时，副作用也往往很大，并且对于复发的肿瘤治疗效果更加有限。最早在20世纪初，Ehrilich等就提出免疫毒素（Immunotoxins,ITs）的概念。是一种专门设计用于选择性破坏具有某一特异性标记细胞的一类融合蛋白，通常由具有高度特异的单克隆抗体与具有强大杀伤作用的毒素分子通过化学交联构建而成。

免疫毒素是由具有催化作用的毒素和有适当导向作用的细胞因子、短肽激素或者抗体构建的具有药理活性的生物制剂,主要应用于肿瘤的导向治疗。免疫毒素克服了传统治疗肿瘤的化疗和放疗 方法的缺陷。它既具有特异性的识别功能，又具有毒素的杀伤功能。研究表明，免疫毒素在细胞培养水平有很好的选择性结合与杀伤肿瘤细胞作用，主要应用于肿瘤的导向治疗，是一种有望代替化疗的新的治疗手段。免疫毒素是达到导向治疗的一个重要的发展方向，通过特异性抗体或细胞因子、激素等与毒素连接，前者作为导向部分，即配体，可以引导分子到达肿瘤部位并与肿瘤细胞表面的过量表达的该种受体结合，后者作为毒素部分，即杀灭肿瘤细胞的部分。部分免疫毒素，如OVB3—PE、IgG—HD37—dgA、IgG—RFB4—dgA、B3—PE40、 LHRH—PE40等已进入临床观察，DAB389—IL—2（商品名为ONTAC）已通过FDA批准上市，显示良好的疗效。目前以GnRH或其衍生物为导向部分，以PE毒素的截短形式及其衍生物为毒素部分的靶向治疗剂已经有报道（ 中国专利：应用嵌合毒素诊断癌症的方法，99806580.3；中国专利：一种能特异杀死肿瘤细胞的基因工程重组蛋白；03137587.1；高效低毒的系列功能蛋白，200410033621.6；高细胞毒性靶向融合蛋白200710301316 GnRH与PE衍生物组成的融合蛋白GnRH-PE39KDEL，其与目前的同类靶向药物相比，具有更高的靶向细胞毒性活性，从而在肿瘤的治疗方面有潜在的应用价值。），这些融合蛋白的靶向型已得到广泛验证，能特异性地识别目的细胞并将其杀死，但目前在应用中还存在一个很大的问题，那就是由于实体瘤的结构问题，如对靶组织的特异性杀伤作用较弱，尤其对大型实体瘤的浸润性较差，在体内的免疫反应严重，所以如何增强靶向毒性蛋白中PE部分的细胞毒性，研制出只杀死相关病理有关的免疫毒素就成为关键。而通过增强免疫毒素对肿瘤细胞的穿透性势必能增强其毒性。

蛋白质转导域(proteintransductiondomain,PTD)或Trojanhorsepeptides，可以有效地将蛋白、多肽、核酸片段通过无受体介导、无耗能的方式，导入多种哺乳动物细胞，且在一定浓度范围内不会造成细胞损伤。在细胞生物学、基因治疗、药物体内转运、临床药效评价及细胞免疫学等研究领域均具有良好的应用前景。细胞穿膜肽有天然存在和人工合成两大类，细胞穿膜肽的研究始于1988年，Green和Frankel分别证实HIV-1的反式激活蛋白Tat能跨膜转移入细胞质和细胞核内。1997年，Vives等发现HIV-TAT中一个富含碱性氨基酸、带正电荷的多肽片断与蛋白转导功能密切相关天然存在的CPPs。目前已经发现的有三种，分别来自果蝇同源异型域ANTP、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)VP22转录因子以及HIV-1和SIV(2，3)的Tat。这些细胞穿膜肽均为带有正电荷的长短不等的多肽片段，其中富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残基。利用这一特性，人工合成的多聚精氨酸、赖氨酸，也具有穿膜活性，且9个精氨酸和9个赖氨酸残基构成的基序比TatPTD的蛋白转导活性还要强。

发明内容

为了提供一种新的应用于肿瘤的导向治疗药物的融合蛋白，本发明选用一种胞质转导肽，可以有效地介导外源物质进入细胞的胞质当中，与其他蛋白的融合表达产物能够高效地进入体外培养的细胞，并且表现出生物学活性。具有更强的介导外源物质进入细胞的能力，胞质转导肽融合蛋白的作用具有速度快、温度适应性广、浓度依赖性、能够掺入所有细胞等特点。胞质转导肽融合分子穿越细胞膜而不损伤细胞，被胞质转导肽带入细胞的分子仍保留其原有的性质。无活性的分子进入细胞后也能重新折叠，自我复性，是基因工程药物经济、高效利用的有利途径。用胞质转导肽融合蛋白进行介导方法简单，转导的效率高，反应条件也不严格，而且它转导的蛋白质在细胞内部仍具有活性。融合蛋白的转导使药物的用量显著下降，副作用明显减少，是其它方法所无法比拟的。

本发明所述的融合蛋白为含人促黄体激素释放激素（GnRH）和绿脓杆菌外毒素A衍生物（PE39KDEL）以及肽载体（蛋白质转导域（PTD）的融合蛋白。其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明用大肠杆菌表达系统高效表达含蛋白转导域（PTD）和免疫毒素GnRH -PE39KDEL融合蛋白，蛋白转导域（PTD）定位于融合蛋白GnRH的C端和PE39KDEL的N端之间并在此融合蛋白的N端引入了6个His标签和Factor Xa蛋白酶切位点，表达后的产物是含有6个His标签和GnRH-PTD-PE39KDEL的前体融合蛋白，Factor Xa蛋白酶可以将融合蛋白专一性的切割产生具有天然N端得目的蛋白，Factor Xa蛋白酶酶切后直接得到GnRH- PTD-PE39KDEL，从而使生产、纯化工艺简化。最终我们得到的高活性的靶向融合蛋白GnRH- PTD-PE39KDEL，作用原理是首先重组蛋白的GnRH部分与肿瘤细胞的GnRH受体结合，结合后由PTD介导将融合蛋白转送至细胞的内质网，由融合蛋白的毒素部分作用于延长因子2使之核糖基化，阻断蛋白合成杀死细胞。由于增加了PTD蛋白转导域可以增强跨越细胞膜的能力，所以可以大大增强融合蛋白在实体瘤中浸润性，在肿瘤治疗方面有将有很高的应用价值。

本发明提供了高效表达含两种不同抑菌机制的抗菌肽融合蛋白的表达质粒pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL，其包N端有6个His标签，序列中有Factor Xa蛋白酶切位点，有利于表达纯化。

本发明提供的宿主细胞是E.coli BL21(DE3)plysS，具有氯霉素抗性。

本发明提供表达融合蛋白GnRH-PTD-PE39KDEL的工程菌株 为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）GnRH-PTD-PE39KDEL/pET-His，是由表达质粒pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL 转化 E.coli BL21(DE3)plysS 细胞获得的最高表达量的菌株。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.5357，保藏时间为2011年10月17日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明提供了使用Factor Xa蛋白酶切割法制备GnRH-PTD-PE39KDEL的方法，并在此基础上提供了完整的表达、分离纯化GnRH-PTD-PE39KDEL融合蛋白的方法。

本发明所获得的GnRH-PTD-PE39KDEL融合蛋白可用于制备治疗和预防肿瘤的药物，特别是用于制备防治在肿瘤细胞表面过量表达促黄体激素释放激素（GnRH）肿瘤的药物。

附图说明

图1重组质粒pET-His -GnRH-PTD-PE39KDEL酶切电泳图。

M DL2000 DNA Marker （2000，1000，750，500，250，100）bp

1质粒pET-His酶切（BamH I和EcoR I）。

2重组质粒pET-His -GnRH-PTD-PE39KDEL酶切（BamH I和EcoR I）。

图2 SDS-PAGE电泳分析GnRH-PTD-PE39KDEL表达。

M 高分子量蛋白标准（116，66.2，45，35，25，18，14.4）KD

1 表达质粒pET-His在E.coliBL21(DE3)plysS细胞中的表达(空白对照)。

2 表达质粒pET-His -GnRH-PTD-PE39KDEL在E.coliBL21(DE3)plysS细胞中的表达。

图3 SDS-PAGE电泳检测GnRH-PTD-PE39KDEL。

M 高分子量蛋白标准（116，66.2，45，35，25，18，14.4）KD

1表达质粒pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL在E.coliBL21(DE3)plysS细胞中的表达后使用Ni柱纯化的表达蛋白穿通液。

2表达质粒pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL在E.coliBL21(DE3)plysS细胞中的表达后使用Ni柱纯化的表达蛋白清洗液。

3 表达质粒pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL在E.coliBL21(DE3)plysS细胞中的表达后使用Ni柱纯化后的洗脱液经Factor Xa蛋白酶切割后分离纯化得到的GnRH-PTD-PE39KDEL融合蛋白。

具体实施方式

实施例1 GnRH-PTD-PE39KDEL融合蛋白基因序列的获得

依据已知GnRH -PE39KDEL的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成GnRH -PE39KDEL基因序列（生工生物工程（上海）有限公司完成），同时在相应于所编码的氨基酸序列之N末端和C末端加上限制性酶切位点。

应用PCR的方法对全基因合成PE39KDEL的基因序列进行操作，设计3条引物：

MiddleCTDF1

5’TACAACGCTGGTCGTCGTGCTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCACTTCCCGGAAGGTGG

MiddleCTDF2

5’ GGGATCCGTGGAAGGTCGCGAACACTGGTCTTACGGTCTGCGTCCGGGTTACAACGCTGGTCGTCG

GnRHR 5’ GAATTCTCACAGTTCGTCTTTCGG

在GnRH -PE39KDEL的GnRH的C端引入PTD序列，并在GnRH-PTD-PE39KDEL的N末端引入Factor Xa蛋白酶切割位点，得到编码SEQ ID NO:2的融合蛋白的核酸序列SEQ ID NO:1。

实施例2

2.1 GnRH-PTD-PE39KDEL基因重组质粒的构建：

提取质粒pET-His，用BamH I和EcoR I双酶切，回收2.8 kb的线性质粒；

将所述步骤1中获得的GnRH-PTD-PE39KDEL基因片段用BamH I和EcoR I双酶切，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（体积比25:24:1）抽提，3倍体积无水乙醇沉淀回收酶切片段；

将上述回收酶切产物片段，用T4 DNA连接酶进行连接，连接反应体系为25μl：

于16℃连接过夜，连接产物为pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL重组质粒。

2.2 重组质粒pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL转化大肠杆菌Top 10F验证重组结果：

取pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL重组质粒1μl，稀释10倍后直接转化E. coli Top 10F感受态细胞，涂布LB+Amp平板，37°C倒置过夜培养。从上述LB平板上挑取全部单克隆菌落，接种到5ml LB+Amp液体培养基，37°C振荡过夜培养，次日提取质粒，BamH I和EcoR I双酶切质粒，电泳检测，得到2.8kb的质粒片段和1160bp左右的GnRH-PTD-PE39KDEL融合基因片段，表明重组质粒pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL构建成功（图1）。

实施例3 表达GnRH-PTD-PE39KDEL工程菌株的构建和筛选

3.1 重组质粒pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL转化表达菌株BL21(DE3)plysS

取上述2.1中构建的pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL质粒1μl，稀释10倍后直接转化E. coli表达菌株BL21(DE3)plysS感受态细胞，涂布LB+Amp平板，37°C倒置过夜培养。

3.2筛选表达GnRH-PTD-PE39KDEL的工程菌株GnRH-PTD-PE39KDEL/pET-His

从上述LB平板上挑取4个单克隆菌落，2ml LB+Amp液体培养基37°C振荡过夜培养，次日，取20 μl过夜培养液加入到2 ml YTA+Amp液体培养基中转培养，37°C振荡培养3h，至OD600在0.5～0.7之间，然后加入IPTG至终浓度为0.3mM， 30°C振荡培养诱导表达3-8 h。诱导前，随机从一个样品中取出0.5ml菌液，电泳检测时作为诱导对照。

诱导表达完后，各取0.5ml菌液（视表达细菌的量多少而变化，一般在0.2～0.5mL之间），5000 rpm 5min离心收集细胞，包括未诱导的样品，重悬于100μl去离子水中，以此为电泳样品作12.5％的SDS-PGAE。根据电泳结果，得到有表达的菌株。将LB+Amp培养基中的菌液加入30％甘油后-70°C保存菌种。（图2）是表达筛选获得一株表达量较高的工程菌的SDS-PAGE电泳分析结果。

3.3 GnRH-PTD-PE39KDEL融合蛋白的大规模表达

挑取表达菌株单克隆在LB+Amp液体培养基中37°C过夜振荡培养，次日，按照体积比1:100加入到100 ml YTA+Amp培养基中转培养，37°C振荡培养3h后，再加入IPTG至终浓度为1mM，再30°C振荡诱导培养3-8 h。诱导前取出0.5ml的菌液，作为诱导前对照样品。

以下操作在冰浴或4°C中进行。诱导培养完后，取出0.5ml的菌液作为诱导后对照，剩下的菌液在合适的离心管中5000 rpm离心10min收集细胞，细胞重悬于5ml预冷的1×PBS，加入50μl 20％的Triton X-100，充分混匀后冰浴30min。超声波破碎细胞，超声循环为：超声1s；间隔1s；全程40s。重复4次，每次间隙时将菌液在冰浴中混匀，避免局部温度太高，使蛋白质变性。最后，将破碎后的菌液10000 rpm离心15min，收集上清液和沉淀，上清液和沉淀分别留样、备用。

3.4 GnRH-PTD-PE39KDEL融合蛋白的纯化和酶解

将Ni-NTA树脂在原包装中充分混匀，装入合适的层析柱，层析用10倍Ni-NTA体积的NTA-0 Buffer (20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol) 洗。将样品加到NTA层析柱中，流速控制在0.3ml/min左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。层析用5倍Ni-NTA体积的NTA-0 Buffer洗，流速控制在0.5，用的NTA-10 Buffer (20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 20mM Imidazole) 洗5倍Ni-NTA体积，流速控制在0.5 ml/min左右，去除未结合杂蛋白。最后用NTA-500 Buffer (20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol 500mM Imidazole) 洗脱，直到检测不到蛋白为止，流速控制在0.3ml/min左右。

GnRH-PTD-PE39KDEL的裂解：取上述经过NTA树脂纯化的融合蛋白溶液，使用缓冲液（20 mM Tris-HCl,100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, (pH 8.0)）中调整至10mL，用Minipore Ultra-4 超滤离心管浓缩至0.5 mL，加入10 μg的Factor Xa，23°C温育6h。并使用苯甲脒-琼脂糖特异性清除Factor Xa。SDS-PAGE检测目的蛋白（图3）。

通过上述方法，我们可以得到GnRH-PTD-PE39KDEL融合蛋白。

实施例4目的蛋白生物活性的测定

取本发明中的靶向融合蛋白以及对照GnRH -PE39KDEL融合蛋白进行细胞活性试验:用MTT法，首先对人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A549细胞进行消化和收集，将细胞用RPMI 1640培养液稀释成5×10⁴个/毫升的细胞悬液，接种于96孔板，100ul/ 孔，37°C培养4小时。对照加入100ul培养液。样品先用RPMI 1640培养液稀释成100ul/mL，作为起始孔，然后按每孔与上孔2.5倍的关系稀释样品，各加入稀释的样品每孔100ul，37°C，培养24小时，取出，用MTT法染色，用酶标仪570nm进行测定并计算IC50值。活性测定的结果见下表。

从以上结果可以看出，本发明中GnRH-PTD-PE39KDEL的体外细胞活性显著高于目前GnRH-PE39KDEL，说明本发明通过对靶向融合蛋白引入蛋白转导域PTD增强了其生物活性。

本发明提供了一种新的免疫毒素GnRH-PTD-PE39KDEL以及相应的表达方式和制备的方法。可以有效增强其生物活性同时表达方式和工艺纯化方便，产品活性高稳定性好。所以，本发明具有明显的技术创新和工艺先进性，适用于工业化生产。可应用于抗肿瘤药物等生产。

序列表：

<110> 山东省科学院生物研究所

<120> 含引导肽和GnRH-PE39KDEL的融合蛋白和核酸及其用途

<160> 1

<210> 1

<211> 1152

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)...(1152)

<400> 1

gtggaaggtc gcgaacactg gtcttacggt ctgcgtccgg gttacaacgc tggtcgtcgt 60

gctcgtcgtc gtcgtcgtcg tcacttcccg gaaggtggtt ctctggctgc tctgaccgct 120

caccaggctt gccacctgcc gctggaaacc ttcacccgtc accgtcagcc gcgtggttgg 180

gaacagctgg aacagtgcgg ttacccggtt cagcgtctgg ttgctctgta cctggctgct 240

cgtctgtctt ggaaccaggt tgaccaggtt atccgtaacg ctctggcttc tccgggttct 300

ggtggtgacc tgggtgaagc tatccgtgaa cagccggaac aggctcgtct ggctctgacc 360

ctggctgctg ctgaatctga acgtttcgtt cgtcagggta ccggtaacga cgacgttgtt 420

tctctgacct gcccggttgc tgctggtgaa tgcgctggtc cggctgactc tggtgacgct 480

ctgctggaac gtaactaccc gaccggtgct gagttcctgg gtaacggtgg tgacgtttct 540

ttctctaccc gtggtaccca gaactggacc gttgaacgtc tgctgcaggc tcaccgtcag 600

ctggaagaac gtggttacgt tttcgttggt taccacggta ccttcctgga agctgctcag 660

tctatcgttt tcggtggtgt tcgtgctcgt tctcaggacc tggacgctat ctggcgtggt 720

ttctacatcg ctggtgaccc ggaactggct tacggttacg ctcaggacca ggaaccggac 780

gctcgtggtc gtatccgtaa cggtgctctg ctgcgtgttt acgttccgcg ttcttctctg 840

ccgggtttct accgtaccgg tctgaccctg gctgctccgg aagctgctgg tgaagttgaa 900

cgtctgatcg gtcacccgct gccgctgcgt ctggacgcta tcaccggtcc ggaagaagaa 960

ggtggtcgtc tggaaaccat cctgggttgg ccgctggctg aacgtaccgt tgttatcccg 1020

tctgctatcc cgaccgaccc gcgtaacgtt ggtggtgacc tggacccgtc ttctatcccg 1080

gacaaagaac aggctatctc tgctctgccg gactacgctt ctcagccggg taaaccgccg 1140

aaagacggac tg

<210> 2

<211> 384

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> TRANSMEM

<222> (11)...(27)

<400> 2

Val Glu Gly Arg Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Tyr

1 5 10 15

Asn Ala Gly Arg Arg Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg His Phe Pro

20 25 30

Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His

35 40 45

Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp

50 55 60

Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala

65 70 75

Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val

80 85 90

Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly

95 100 105

Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr

110 115 120

Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly

125 130 135

Asn Asp Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu

140 145 150

Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn

155 160 165

Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asn Gly Gly Asp Val Ser

170 175 180

Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu

185 190 195

Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly

200 205 210

Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly

215 220 225

Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly

230 235 240

Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Glu Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln

245 250 255

Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu

260 265 270

Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg

275 280 285

Thr Gly Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu

290 295 300

Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr

305 310 315

Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp

320 325 330

Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr

335 340 345

Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro

350 355 360

Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln

365 370 375

Pro Gly Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu

380

Claims (2)

1.一种含引导肽和GnRH-PE39KDEL的融合蛋白，其特征是含人促黄体激素释放激素GnRH和绿脓杆菌外毒素A衍生物PE39KDEL以及肽载体-蛋白质转导域PTD的融合蛋白；

所述蛋白质转导域PTD定位于人促黄体激素释放激素GnRH的C端和绿脓杆菌外毒素A 衍生物PE39KDEL的N端并直接相连和GnRH、PE39KDEL组成的融合蛋白GnRH-PTD-PE39KDEL，核苷酸序列如SEQ ID NO.1；其氨基酸序列为SEQ ID NO.2；

所述GnRH-PTD-PE39KDEL融合蛋白是用下述方法制得的：

（1）GnRH-PTD-PE39KDEL基因重组质粒的构建：利用MiddleCTDF1、MiddleCTDF2、GnRHR引物通过2轮PCR扩增获得N端含Factor Xa蛋白酶切位点的GnRH-PTD-PE39KDEL基因，并通过双酶切引入到质粒pET-His中，构建获得重组质粒pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL；

所述引物 MiddleCTDF1 为：

5’TACAACGCTGGTCGTCGTGCTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCACTTCCCGGAAGGTGG，

所述引物MiddleCTDF2为：

5’GGGATCCGTGGAAGGTCGCGAACACTGGTCTTACGGTCTGCGTCCGGGTTACAACGCTGGTCGTCG，

所述引物GnRHR 为：5’ GAATTCTCACAGTTCGTCTTTCGG；

（2）重组质粒pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL转化表达菌株BL21(DE3)plysS，并通过筛选获得其中稳定表达融合蛋白的工程菌株，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.5357，保藏时间为2011年11月02日；该菌株所表达的融合蛋白具有N端含6个组氨酸的标签和Factor Xa蛋白酶切位点的特征；

（3）含组氨酸的标签和Factor Xa蛋白酶切位点的前体融合蛋白的大规模表达：表达菌株在发酵培养基YTA+Amp中，使用IPTG 30°C振荡诱导培养3-8 h，完成前体融合蛋白的大量表达；冰浴或4°C条件下超声波破碎细胞，获得前体融合蛋白样品；

（4）GnRH-PTD-PE39KDEL融合蛋白的纯化和酶解：将（3）中获得前体融合蛋白样品使用Ni-NTA亲和层析进行纯化，然后超滤离心浓缩，在Factor Xa适合的缓冲体系条件下进行酶解，并使用苯甲脒-琼脂糖特异性清除Factor Xa，最终制得GnRH-PTD-PE39KDEL融合蛋白。

2.如权利要求1所述含引导肽和GnRH-PE39KDEL的融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征是，利用该融合蛋白增强了的对人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A549细胞的生物抑制活性。