ES2203625T3 - Clonacion y expresion de un gen codificante de briodina 1 a partir de bryonia dioica. - Google Patents
Clonacion y expresion de un gen codificante de briodina 1 a partir de bryonia dioica.Info
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Abstract
SE DESCRIBE LA CLONACION MOLECULAR Y LA EXPRESION DE LA PROTEINA BRIODINA 1 BIOLOGICAMENTE ACTIVA,INACTIVADORA DE LOS RIBOSOMAS. TAMBIEN SE DESCRIBE LA SECUENCIA AMINOACIDA Y OLIGONUCLEOTIDA COMPLETA QUE CODIFICA LA BRIODINA 1. SE DESCRIBEN ADEMAS, VECTORES DE EXPRESION PLASMIDOS QUE CONTIENEN UNA SECUENCIA NUCLEOTIDA QUE CODIFICA LA BRIODINA 1 Y CELULAS HUESPED MODIFICADAS. EL AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE LA SECUENCIA NUCLEOTIDA PARA LA BRIODINA 1 PERMITE LA PRODUCCION RECOMBINANTE DE UNA GRAN CANTIDAD DE BRIODINA 1 PARA SU USO IN VITRO O IN VIVO, DIRECTAMENTE O COMO CONJUGADOS DE LIGANDOS/TOXINAS O PROTEINAS DE FUSION. ESTAS COMPOSICIONES PUEDEN UTILIZARSE PARA DESTRUIR SELECTIVAMENTE LAS CELULAS NO DESEADAS COMO LAS CELULAS CANCERIGENAS, LAS CELULAS INFECTADAS, LAS BACTERIAS Y SUS ANALOGOS.
Description
Clonación y expresión de un gen codificante de
briodina 1 a partir de Bryonia dioica.
La presente invención trata del aislamiento y
caracterización de una secuencia de oligonucleótidos que codifica
una proteína inactivadora de ribosomas a partir de la planta
Bryonia dioica. Asimismo, la invención también trata de
vectores de expresión que comprenden la secuencia oligonucleotídica
purificada operativamente unida a las adecuadas secuencias de
control transcripcional y traduccional, células hospedadoras
transformadas y una proteína inactivadora de ribosomas expresada
mediante recombinación. El uso de oligonucleótidos purificados que
codifican la proteína inactivadora de ribosomas para la expresión de
una proteína inactivadora de ribosomas (PIR) y en la construcción
de proteínas de fusión también se considera parte de la presente
invención.
Proteínas inhibidoras de la síntesis proteica se
han aislado de diversos organismos, incluidos plantas, bacterias y
hongos. Se piensa que los organismos producen estas toxinas
proteicas para proporcionar una ventaja selectiva para el
crecimiento de los organismos que las producen. A pesar del origen
evolutivo divergente de los organismos en los que se encuentran
estas toxinas proteicas, sorprendentemente, la mayoría de las
toxinas tienen mecanismos de acción similares. Un determinado grupo
de toxinas ejerce su efecto bloqueando la síntesis proteica,
directamente modificando el factor de elongación 2
(EF-2) o modificando el propio ribosoma de manera
que el EF-2 no pueda funcionar en la síntesis de
proteínas. Este tipo de toxinas, proteínas inactivadoras de
ribosomas (PIR), puede aislarse a partir de varias familias de
plantas.
Las proteínas inactivadoras de ribosomas de
plantas se han dividido en dos grupos en función de su estructura.
Las proteínas inactivadoras de ribosomas del tipo I (PIR tipo I)
contienen una cadena sencilla que tiene actividad inactivadora de
ribosomas. Entre los ejemplos de PIR tipo I se incluyen la
gelonina, la saporina, la tricosantina y la briodina. Las proteínas
inactivadoras de ribosomas del tipo II (PIR tipo II) están
compuestas por dos cadenas, una cadena A capaz de inactivar el
EF-2, y una cadena B, que contiene un dominio de
unión a la célula con propiedades similares a la lectina. El dominio
de unión permite a las PIR de tipo II unirse a muchos tipos
celulares y matar a dichas células. Ejemplos de PIR de tipo II son
el ricino y la abrina.
Aunque los dos tipos de proteínas inactivadoras
de ribosomas difieren en sus estructuras, ambos tipos inhiben la
síntesis de proteínas inactivando la subunidad 60s de los ribosomas
eucarióticos mediante la fragmentación del enlace
N-glucosídico del residuo de adenina localizado en
la posición 4324 del ARNr 28s (Endo y Tsurugi 1987, J. Biol.
Chem 262:8128-8130; Stirpe, F. y col., 1988,
Nucl. Acid. Resp. 16: 1349-1357).
Se han aislado proteínas inactivadoras de
ribosomas a partir de diversas familias de plantas, incluyendo
Cariofillaceae, Cucurbitaceae, Euforbiaceae y
Fitolacaceae. Las toxinas se han aislado, particularmente, de
la raíz, las semillas y las hojas de las plantas. Se han comparado
las secuencias de aminoácidos del extremo N-terminal
de las PIR aisladas a partir de las semillas de Gelonium
multiflorum (Euforbiaceace), Momordica charantia
(Cucurbitaceae), Bryonia dioica
(Cucurbitaceae), Saponaria officinalis
(saporina-5a, saporina-5b,
saporina-6a, saporina-6b)
(Cariofilaceae) y de las aisladas de las hojas de
Saponaria officinalis (saporina-1). Se han
determinado las secuencias de aminoácidos completas de una PIR de
tipo I aislada de Trichosanthes kirilowii maxim y del
inhibidor de la síntesis proteica de semillas de cebada. Estas
comparaciones muestran que al menos las regiones
N-terminales de las toxinas briodina y momordina
(miembros de la familia Cucurbitaceae) revelan un nivel
elevado de semejanza con la cadena A del ricino y con la gelonina,
que son miembros de la familia Euforbiaceae. Se piensa que la
semejanza es una consecuencia de un origen evolutivo similar. Se
encontraron muy pocas semejanzas entre las PIR de las familias
Cucurbitaceae y Euforbiaceae y las de las familias
Fitolaceae o Cariofilaceae (Montecucchi y col., 1989,
Int. J. Peptide Protein Res. 33: 263-267).
Aunque se encuentran analogías en las secuencias de aminoácidos de
las regiones N-terminales de las PIR aisladas de las
mismas especies, sí existen muchas diferencias, particularmente
entre las toxinas aisladas a partir de tejido diferente de la misma
planta.
Inicialmente se identificó una toxina proteica
vegetal denominada briodina, como una proteína de
27-30 kDa aislada a partir de la raíz de Bryonia
dioica (solicitud de patente del Reino Unido GB2194948,
publicada el 23 de marzo de 1988). La toxina es una proteína
inactivadora de ribosomas de tipo I que tiene una cadena sencilla y
un mecanismo de acción que inactiva los ribosomas bloqueando las
interacciones productivas con el factor de
elongación-2. Dado que no tiene un dominio de unión
a células, la briodina, como las otras PIR de tipo I, no suele
unirse a células de mamífero. Mediante filtración en gel se ha
demostrado que la proteína tiene un peso molecular de alrededor de
27.300 daltons y, mediante electroforesis en gel de poliacrilamida,
de aproximadamente de 28.800 daltons, y un punto isoeléctrico de
9,5. Se encontró que esta toxina inhibía la síntesis de proteínas en
el sistema de lisado de reticulocitos de conejo con ribosomas de
germen de trigo a 3,6 ng/ml (DI_{50}) y una DL_{50} en ratones
de 14,5 mg/kg al administrarla por vía intraperitoneal. No se ha
determinado la secuencia completa de aminoácidos de la briodina 1 y
solo se ha obtenido una secuencia aminoacídica parcial del extremo
N-terminal. Se ha determinado que la secuencia de
aminoácidos del extremo N-terminal es
A partir de las hojas de B. dioica se ha
aislado una segunda proteína inactivadora de ribosomas (publicación
de patente europea EPO 390 040, publicada el 3 de octubre de 1990).
Se ha descrito que el peso molecular de esta molécula obtenido
mediante filtración en gel es de 27.300 daltons y, mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida, de 28.800 daltons, y un
punto isoeléctrico de 9,5, y se ha denominado
briodina-L. Se encontró que esta forma de briodina
inhibía la síntesis proteica en un sistema de lisado de
reticulocitos de conejo, con una CE_{50} de 0,1 nM (3,6 ng/ml) y
tiene una DL_{50} en ratones de 10 mg/kg, cuando se administra
por vía intraperitoneal. También se proporcionó un análisis de
aminoácidos, pero no se ha descrito ninguna secuencia de
aminoácidos o de nucleótidos para esta molécula.
Las proteínas inactivadoras de ribosomas son de
interés por su utilidad como componentes de "inmunotoxinas".
Las inmunotoxinas son moléculas híbridas que consisten en una
fracción tóxica unida a un anticuerpo capaz de dirigir de forma
selectiva a la toxina hacia un blanco específico. Entre las posibles
células diana se incluyen las células perjudiciales, es decir,
células neoplásicas, infectadas por virus, inmunocompetentes o
parásitos. Las inmunotoxinas, tal y como se definen en la presente
invención, pueden ser conjugados químicos de un ligando específico
de célula unido a una molécula tóxica, como por ejemplo una proteína
inactivadora de ribosomas. El hecho de que muchas de las proteínas
inactivadoras de ribosomas son conocidas y de que nuevas toxinas
están siendo descubiertas proporciona una variedad de fracciones
tóxicas con niveles variables de toxicidad intrínseca sobre células
enteras cuando están sin conjugar, y proporciona una fuente
disponible de toxinas alternativas por si el paciente desarrolla
una respuesta inmunitaria durante el tratamiento a largo plazo
in vivo frente a la inmunotoxina administrada originalmente.
Además, algunas inmunotoxinas, saporina 6 y el anticuerpo antiThy
1.1. o su fragmento F(ab')_{2}, eran más tóxicas que la
toxina libre, proporcionando una necesidad de moléculas de toxina
diferentes y nuevas.
La presente invención proporciona una secuencia
oligonucleotídica purificada que codifica una toxina proteica
vegetal aislada de Bryonia dioica. Asimismo, la presente
invención proporciona vectores de expresión en los que la secuencia
oligonucleotídica purificada está operativamente unida a secuencias
de control transcripcional y traduccional adecuadas de células
hospedadoras, que, cuando se usan para transformar las células
hospedadoras adecuadas, expresan grandes cantidades de la toxina
proteica vegetal. Además, la secuencia de oligonucleótidos puede
usarse para construir moléculas oligonucleotídicas que codifiquen
moléculas de fusión que comprendan la toxina y un ligando específico
para una determinada célula. Este inmunoconjugado es tóxico para la
célula diana y proporciona composiciones útiles para matar células
de forma dirigida.
La presente invención describe la secuencia
nucleotídica completa que codifica la proteína inactivadora de
ribosomas, briodina 1 (BD1), aislada a partir de la planta
Bryonia dioica, y proporciona las bases de la presente
invención. La invención incluye formas de realización que describen
un oligonucleótido purificado que codifica la briodina 1. Asimismo,
se incluyen las formas de realización que describen plásmidos, que
comprenden la secuencia de ADN que codifica la briodina 1, y
vectores de expresión que comprenden la secuencia de ADN que
codifica la briodina 1 operativamente unida con las adecuadas
secuencias de control transcripcional y células hospedadoras
transformadas.
Además, la invención trata de procedimientos para
producir briodina 1 por medios recombinantes. La proteína producida
mediante recombinación puede ser briodina 1, fragmentos o derivados
de briodina 1 con actividad inactivadora de ribosomas y como
proteínas de fusión. Las proteínas de fusión pueden comprender un
ligando específico de un tipo celular concreto y una porción
funcional de la briodina 1, que son capaces de dirigir de forma
específica la briodina 1 hacia la célula diana.
La figura 1 proporciona los resultados de la
lectura de la absorbancia de la cromatografía en un gel
CM-Sefarosa de proteínas aisladas de la raíz de
Bryonia dioica.
La figura 2 es el resultado de un análisis en
SDS-PAGE de las fracciones 9 a la 15 de la
separación cromatográfica en CM-Sefarosa. La calle M
contiene los pesos moleculares estándar: ovoalbúmina (p.m. 43.000),
anhidrasa carbónica (p.m. 29.000),
\beta-lactoglobulina (p.m. 18.000), lisozima (p.m.
14.000), inhibidor de la tripsina bovina (p.m. 6.000) e insulina
(p.m. 2.000).
La figura 3 es un cromatograma obtenido de
columnas de exclusión por tamaño TSK-3000. Las
fracciones que contenían la banda de 29 kDa se extrajeron de la
separación cromatográfica en CM-Sefarosa y se
concentraron a menos de 8 ml. El concentrado se aplicó a la columna
y se midió la absorbancia a 280 nm.
La figura 4 ilustra el resultado obtenido del
análisis en SDS-PAGE de las fracciones 58 a 64
procedentes de la cromatografía de exclusión por tamaño de la
briodina parcialmente purificada. La calle M contiene los pesos
moleculares estándar: ovoalbúmina (p.m. 43.000), anhidrasa carbónica
(p.m. 29.000) y \beta-lactoglobulina (p.m.
18.000).
La figura 5 es la secuencia de ADN que codifica
la briodina 1. La secuencia está numerada comenzando en las
secuencias no codificadoras localizadas en posición 5' de los
residuos I-290 y los nucleótidos
1-1094. Los nucleótidos 914-916
representan el codón de terminación y los nucleótidos
917-1094 son secuencias no codificadoras en
dirección 3'. Las dos secuencias hexanucleotídicas subrayadas de la
región 3' no codificadora corresponden a una señal de
poliadenilación encontrada en dos clones individuales. Las flechas
que señalan a los residuos de aminoácidos 271 y 290 corresponden a
dos formas de BD1 (F2 y F1, respectivamente), que codifican la
proteína putativa madura (F2) y la pro-proteína
completa (F1).
Las figuras 6A y 6B son diagramas esquemáticos de
los plásmidos de expresión de la BD1 pSE 13.0 y pSE 14.0.
Las figuras 7A, B y C son un perfil de
cromatografía en CM-Sefarosa (A), análisis
SDS-PAGE con tinción con azul de Coomassie (B) y
Western blot usando anticuerpos policlonales antiBD1 (conejo) (C) de
BD1F1 recombinante (residuos de aminoácidos 24-290)
que han sido desnaturalizados y renaturalizados. Las fracciones del
perfil cromatográfico corresponden a los números de fracción en los
geles. N=BD1 nativa.
Las figuras 8A, B y C son los resultados de la
purificación de la BD1F2 recombinante (residuos de aminoácidos
24-270) (A); perfil de cromatografía en
CM-Sefarosa (B); SDS-PAGE con
tinción con azul de Coomassie (C); y Western blot con tinción con
antisuero policlonal antiBD1. N= BD1 nativa.
La figura 9 proporciona los datos de la actividad
inhibidora de la síntesis proteica de BD1F1 y BD1F2 recombinantes
frente a la BD1 nativa usando un ensayo de traducción in
vitro con un sistema acelular de reticulocitos de conejo. La
síntesis proteica se midió como la incorporación de
leucina-[^{3}H] en los productos de la traducción tratados y no
tratados con proteína inactivadora de ribosomas.
La presente invención trata de un oligonucleótido
sustancialmente purificado que codifica la proteína inactivadora de
ribosomas briodina 1, aislada a partir de la planta Bryonia
dioica o su complemento. El oligonucleótido puede ser ADNc, ADN
genómico, purificado, ARN o ARN antisentido. La presente invención
también abarca plásmidos y vectores de expresión que comprenden al
menos un oligonucleótido codificador de briodina 1 o fragmentos y
derivados biológicamente activos de la misma. El oligonucleótido
está unido operativamente a una secuencia de control
transcripcional y traduccional en los vectores de expresión de la
presente invención. Las células hospedadoras transformadas con los
plásmidos y vectores de expresión también se consideran parte de la
presente invención. Las composiciones citadas anteriormente pueden
usarse para la expresión recombinante de grandes cantidades de
briodina 1 o de fragmentos o derivados biológicamente activos por
parte de las células hospedadoras transformadas.
La briodina 1 (BD1), una proteína inactivadora de
ribosomas, se aísla a partir de las raíces de Bryonia dioica.
BD1 exhibe una toxicidad celular similar a la que presentan otras
proteínas inactivadoras de ribosomas, lo que sugiere que puede ser
útil para matar células, particularmente si es dirigida hacia una
determinada población celular mediante el ligando de una molécula
específica de célula. Tales ligandos pueden incluir un anticuerpo o
un ligando de un receptor de superficie celular (es decir,
transferrina, heregulina, y otros bien conocidos para el experto en
la técnica). La BD1 también puede usarse para construir conjugados o
moléculas de fusión que comprendan el ligando de una molécula
específica de célula y la toxina que sería útil en el tratamiento
de un estado patológico.
La briodina 1 purificada se ha detectado en forma
de una banda única de aproximadamente 29.000 daltons de peso
molecular, tanto en condiciones reductoras como no reductoras. En
la presente invención se describe una estructura primaria completa
de la BD1 determinada mediante clonación con ADNc y determinación de
una secuencia de aminoácidos putativa. El análisis de la secuencia
reveló que la BD1 es una proteína inactivadora de ribosomas de tipo
1 que tiene alguna semejanza con, pero distinta de, otras proteínas
inactivadoras de ribosomas procedentes de la familia Cucurbitaceae,
incluidas la tricosantina y la momorcarina-\alpha
(Montecucchi y col., 1989, Int. J. Peptide Protein Res. 33:
263-267). Todas estas proteínas exhiben ciertas
propiedades comunes características de las proteínas inactivadoras
de ribosomas de tipo 1, tales como estar comprendidas por una
cadena peptídica sencilla, tener un peso molecular entre 25 y 30
kDa y un punto isoeléctrico de aproximadamente 9,
0-10,0 (Stirpe y Barbieri, 1986, FEBS Lett.
196: 1-8; Jiménez y Vásquez, D., 1985, Ann. Rev.
Microbiol. 39: 649-672).
La BD1 puede producirse mediante técnicas de ADN
recombinante o por procedimientos químicos sintéticos. Para producir
BD1 con procedimientos recombinantes, el ARN mensajero (ARNm) para
la preparación de ADN complementario (ADNc) puede obtenerse a partir
de fuentes celulares que produzcan BD1, mientras que las secuencias
genómicas para la BD1 pueden obtenerse a partir de cualquier célula
de Bryonia dioica, independientemente del tipo de tejido.
Por ejemplo, las raíces de B. dioica pueden usarse como
fuente de secuencias codificadoras de BD1 y/o para preparar ADNc o
genotecas. Microorganismos o líneas celulares, producidos mediante
ingeniería genética, transformados o en los que se ha realizado una
transfección con ADN o ARN total a partir de una fuente, pueden
usarse como fuente conveniente de ADN para la selección.
A partir de fragmentos de ADN generados usando
técnicas bien conocidas en la materia, pueden preparase ADNc o
genotecas. Los fragmentos que codifican BD1 pueden identificarse
mediante detección de las genotecas preparadas con una sonda
nucleotídica que codificaría una secuencia de aminoácidos homóloga
de una porción de la secuencia aminoacídica del
N-terminal de BD1 (Sec. ID. Nº 2). Aunque pueden
usarse porciones de la secuencia codificadora para la clonación y la
expresión, para la expresión pueden ser preferible usar clones de
longitud completa, es decir, aquéllos que contienen toda la región
codificadora de BD1. Con estos fines, pueden usarse técnicas bien
conocidas por aquéllos expertos en la técnica para el aislamiento
de ADN, generación de fragmentos adecuados, mediante diversos
procedimientos, construcción de clones y genotecas, y recombinantes
para detección. Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en
Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, NY.
Debido a la degeneración de las secuencias
nucleotídicas codificadoras, en la práctica de la presente invención
para la clonación y expresión de BD1 pueden usarse secuencias de
ADN alternativas que codifican secuencias de aminoácidos análogas de
un gen de BD1. Tales alteraciones incluyen deleciones, adiciones o
sustituciones de diferentes residuos nucleotídicos, que dan lugar a
una secuencia que codifica el mismo producto génico u otro
funcionalmente equivalente. El producto génico puede contener
deleciones, adiciones o sustituciones de residuos aminoacídicos
dentro de la secuencia, que resultan en un cambio imperceptible,
produciendo por tanto un producto bioactivo. En este contexto, la
bioactividad se mide por la capacidad del producto génico para
inhibir la síntesis de proteínas.
Cualquier sustitución de aminoácidos puede
realizarse sobre la base de semejanzas en la polaridad, la carga, la
solubilidad, la hidrofobicidad/hidrofilicidad y/o la naturaleza
anfipática del residuo implicado. Por ejemplo, entre los
aminoácidos cargados negativamente se incluyen los ácidos aspártico
y glutámico; entre los aminoácidos cargados positivamente se
incluyen la lisina y la arginina; entre los aminoácidos con grupos
sin carga en la cabeza polar con valores parecidos de hidrofilicidad
se incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina, glicina,
alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina,
tirosina.
Para expresar una briodina 1 biológicamente
activa, la secuencia de nucleótidos que codifica BD1, o una
secuencia nucleotídica funcionalmente equivalente, se inserta en un
vector adecuado, es decir un vector que contenga los elementos
necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia
codificadora insertada. Se pueden fabricar versiones modificadas de
la secuencia de BD1 para aumentar la estabilidad, la producción, la
purificación, el rendimiento o la toxicidad del producto expresado.
Mediante ingeniería genética se puede obtener la expresión de una
proteína de fusión o de una proteína de fusión fragmentable que
comprenda BD1 y una proteína heteróloga. Tal proteína de fusión
puede diseñarse de manera que la proteína de fusión pueda ser
aislada con facilidad mediante cromatografía de afinidad; por
ejemplo, mediante inmovilización en una columna específica de la
proteína heteróloga. Si se fabrica un sitio de fragmentación entre
la fracción BD1 y la proteína heteróloga, puede extraerse la
proteína BD1 de la columna cromatográfica mediante tratamiento con
una enzima o agente adecuado que corte en el sitio de fragmentación
(por ejemplo, véase Booth y col., 1988, Immunol. Lett.
19:65-70; y Gardella y col., 1990, J. Biol. Chem.
265: 15854-15859).
Para construir vectores de expresión que
contengan una secuencia codificadora de BD1 y señales de control
transcripcional/traduccional adecuadas se pueden usar
procedimientos bien conocidos para aquéllos expertos en la técnica.
Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in
vitro, técnicas sintéticas y técnicas de
recombinación/genéticas in vivo. Véase, por ejemplo, las técnicas
descritas en SambrooK y col., 1989, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory,
NY.
Para expresar la secuencia codificadora de BD1,
puede usarse una variedad de sistemas de expresión en hospedador.
Entre éstos se incluyen, pero no se limita a ellos,
microorganismos, tales como bacterias transformadas con un vector de
expresión ADN recombinante de bacteriófago, ADN plasmídico o ADN de
cósmido, que contiene la secuencia codificadora de BD1; levaduras
transformadas con vectores de expresión de levadura recombinantes,
que contienen la secuencia codificadora de BD1; sistemas de células
vegetales infectados con vectores de expresión víricos recombinantes
(por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CoMV; virus del
mosaico del tabaco, TMV) o trasnformados con vectores de expresión
plasmídicos recombinantes, tales como el plásmido Ti, que contienen
la secuencia codificadora de BD1. Para usar sistemas de expresión
de mamíferos, la actividad inactivadora de ribosomas de BD1 tendría
que ser bloqueada o enmascarada hasta que se produzca la lisis de
la célula hospedadora o hasta que se produzca la secreción de BD1 al
medio de cultivo, para proteger a la célula hospedadora de los
efectos tóxicos de BD1, o debe usarse una célula hospedadora
mutante resistente a la briodina.
En función del sistema vector/hospedador usado,
en el vector de expresión puede usarse cualquiera de un número de
elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo
promotores constitutivos e inducibles, elementos intensificadores de
la transcripción, terminadores de la transcripción, etc., (véase,
por ejemplo, Bitter y col., 1987,
Methods in Enzymol. 153: 516-544). Por ejemplo, cuando la clonación se realiza en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles como pL del bacteriófago \lambda; plac, ptrp, ptae (promotor híbrido ptrp-lac) y similares. También se pueden usar promotores producidos mediante técnicas de ADN recombinante o sintéticas, para proporcionar una transcripción controlada y de alto nivel de la secuencia codificadora de BD1 insertada.
Methods in Enzymol. 153: 516-544). Por ejemplo, cuando la clonación se realiza en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles como pL del bacteriófago \lambda; plac, ptrp, ptae (promotor híbrido ptrp-lac) y similares. También se pueden usar promotores producidos mediante técnicas de ADN recombinante o sintéticas, para proporcionar una transcripción controlada y de alto nivel de la secuencia codificadora de BD1 insertada.
En los sistemas bacterianos, se puede seleccionar
de forma ventajosa una serie de vectores de expresión, dependiendo
del uso que se pretende dar a la BD1 expresada. Por ejemplo, cuando
se desean grandes cantidades de BD1, puede ser deseable usar
vectores que dirijan la expresión de niveles elevados del producto
proteico, posiblemente como una fusión con una secuencia
señalizadora hidrofóbica, que dirige el producto expresado hacia el
periplasma de la bacteria o al medio de cultivo, donde el producto
proteico se purifica con facilidad. También pueden ser deseables
ciertas proteínas de fusión fabricadas con un sitio de fragmentación
específico, para facilitar la recuperación de la BD1. Entre tales
vectores adaptables a tal manipulación se incluyen, pero no están
limitados a ellos, la serie pET de vectores de expresión de
E.coli (Studier y col., 1990, Methods in Enzymol. 185:
60-89).
En levaduras, se puede usar un número de vectores
que contienen promotores constitutivos o inducibles. Como repaso,
véase Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988,
ed. Ausuble y col., Greene Publish. Assoc. y Wiley Interscience, ed.
13; Grant y col., 1987, "Expression and Secretion Vectors for
Yeast" en Methods in Enzymol. 153:
516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL
Press, Wash. D.C., Ch. 3; y Bitter, 1987, "Heterologous Gene
Expression in Yeast", en Methods in Enzymol., 152:
673-684. Se puede usar un promotor constitutivo de
levadura, como ADH o Leu2, o un promotor inducible como GAL
("Cloning in Yeast," ed. 3, R. Rothstein en: DNA
Cloning, Vol. 11, A Practical Approach, Ed. D. M. Glover, 1986,
IRL Press, Wash. D.C.). Por otro lado, pueden usarse vectores que
estimulen la integración en el cromosoma de la levadura de las
secuencias de ADN extrañas.
En los casos en los que se usan vectores de
expresión vegetales, la expresión de la secuencia codificadora de
BD1 puede llevarse a cabo mediante varios promotores. Por ejemplo,
pueden usarse promotores víricos tales como los promotores ARN 35s y
ARN 19s del CoMV (Brisson y col., 1984, Nature 310:
511-514) o el promotor de la cubierta proteica del
TMV (Takamatsu y col., 1987, EMBO J. 6:
307-311). Por otro lado, pueden usarse promotores
vegetales tales como la subunidad pequeña de la RUBISCO (Coruzzi y
col., 1984, EMBO J. 3: 1671-1680; Brogli y
col., 1984, Science 224: 838-843); o promotores de
choque térmico, por ejemplo el hsp15,5-E o
hsp17.3-B de soja (Gurley y col., 1986, Mol.
Cell. Biol. 6: 559-565). Estas estructuras
pueden introducirse en células vegetales usando el plásmido Ti, el
plásmido Ri, vectores víricos vegetales, transformación de ADN
directa, microinyección, electroporación y otras técnicas bien
conocidas para el experto en la materia. Véase, por ejemplo,
Weissbach y Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular
Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, págs.
421-463; y Guerson y Corey, 1988, Plant Molecular
Biology, 2ª ed., Blackie, Londres. Ch. 7-9.
Otros sistemas de expresión, tales como sistemas
de células hospedadoras de mamíferos e insectos, son bien conocidas
en la materia, pero tendrían que ser modificados o adaptados para
producir una molécula tóxica.
Un posible enfoque a la modificación sería aislar
líneas celulares mutantes de mamífero o de insecto resistentes a
BD1, como se ha mencionado anteriormente.
Además de la producción de briodina 1 mediante
técnicas de ADN recombinante, la BD1 también puede fabricarse, por
completo o en parte, por medio de técnicas químicas sintéticas en
fase sólida basadas en la secuencia de aminoácidos determinada
(véase, Creighton, 1983, Protein Structures and Molecular
Principles, W.H. Freeman y Co., NY, págs. 50-60;
Stewart y Young, 1984, Peptide Synthesis, 2ª ed., Pierce
Chemical Co.). Este abordaje puede ser particularmente útil en la
generación de segmentos o fragmentos de BD1 correspondientes a una o
más de sus regiones biológicamente activas.
En otro aspecto de la presente invención, la
briodina 1 recombinante expresada, o un equivalente funcional, puede
usarse con un ligando para un receptor de superficie celular para
dirigir la toxina hacia una población celular específica en forma
de conjugado toxina-ligando.
El experto en la materia entiende que el término
"ligando" incluye dentro de su alcance cualquier molécula que
se una específicamente, o se asocie reactivamente o forme complejos
con un receptor u otra fracción receptiva asociada con una
determinada población celular diana. Esta molécula, o ligando,
reactiva frente a células, a la cual la toxina se une a través de un
agente ligante en el conjugado, puede ser cualquier molécula que se
una a, forme complejos con o reaccione frente a la población celular
buscada para alterarla terapéuticamente o, por el contrario,
biológicamente. La molécula reactiva frente a células actúa
liberando la toxina en la particular población celular diana frente
a la que el ligando reacciona. Tales moléculas incluyen, pero no se
limitan a, proteínas de peso molecular elevado (generalmente mayores
de 10.000 daltons) tales como, por ejemplo, anticuerpos o moléculas
de adhesión, proteínas de menor peso molecular (generalmente,
menores de 10.000 daltons), polipéptidos o ligandos peptídicos y
ligandos no peptídicos.
Entre las proteínas no inmunorreactivas,
polipéptidos o ligandos peptídicos, que pueden ser de utilidad para
formar los conjugados de la presente invención, se pueden incluir,
pero no se limitan a, transferrina, factores de crecimiento
epidérmico, bombesina, gastrina, péptido liberador de gastrina,
factor de crecimiento derivado de plaquetas, Il-2,
Il-6, o factores de crecimiento tumoral, tales como
TGF-\alpha y TGF-\beta. Entre
los ligandos no peptídicos se pueden incluir, por ejemplo,
esteroides, hidratos de carbono y lectinas.
Los ligandos inmunorreactivos comprenden una
inmunoglobulina de reconocimiento de antígeno (o anticuerpo) o un
fragmento de la misma de reconocimiento de antígeno. Entre las
inmunoglobulinas particularmente preferidas se encuentran aquellas
inmunoglobulinas que pueden reconocer un antígeno asociado con un
tumor capaz de su internalización. Como se usa,
"inmunoglobulina" puede referirse a cualquier clase o subclase
reconocida de inmunoglobulinas, tales como IgG, IgA, IgM, IgD o
IgE. Las preferidas son las inmunoglobulinas pertenecientes a la
clase de inmunoglobulinas IgG. La inmunoglobulina puede derivar de
cualquier especie. Preferiblemente, sin embargo, la inmunoglobulina
es una de origen murino o humano. Además, la inmunoglobulina puede
ser monoclonal o policlonal, preferiblemente monoclonal.
Como se puede observar, un experto en la materia
apreciará que la invención también abarca el uso de fragmentos de
inmunoglobulinas de reconocimiento de antígeno. Tales fragmentos de
inmunoglobulinas incluyen, por ejemplo, los fragmentos Fab',
F(ab')_{2}, Fv o Fab, u otros fragmentos de
inmunoglobulinas de reconocimiento antigénico. Tales fragmentos de
inmunoglobulina pueden prepararse, por ejemplo, mediante digestión
enzimática proteolítica, por ejemplo, digestión con pepsina o
papaína, alquilación reductora o técnicas recombinantes. Los
materiales y procedimientos para preparar los fragmentos de
inmunoglobulina son bien conocidos para aquellos expertos en la
materia. Véase, para detalles generales, Parham, 1983, J.
Immunol. 131:2895; Lamoye y col., 1983, J. Immunol.
Methods 56: 235; Parham, 1982, J. Immunol. Methods 53:
133 y Matthew y col., 1982, J. Immunol Methods 50: 239.
Asimismo, la inmunoglobulina puede ser
"quimérica", ya que ese término está reconocido en la materia.
También, la inmunoglobulina puede ser un anticuerpo
"bifuncional" o "híbrido", es decir, un anticuerpo que
puede tener un "brazo" con especificidad para un sitio
antigénico, tales como un antígeno asociado con un tumor, mientras
que el otro brazo reconoce un blanco diferente, por ejemplo, una
segunda molécula receptora específica de tipo celular. En cualquier
caso, los anticuerpos híbridos tienen una especificidad doble,
preferiblemente con uno o más sitios de unión específicos para un
antígeno diana, por ejemplo, un antígeno asociado con un tumor, un
organismo infeccioso u otro estado patológico.
Anticuerpos bifuncionales se describen, por
ejemplo, en la publicación de patente europea EPA 0105360. Tales
anticuerpos híbridos o bifuncionales pueden derivar, como se puede
observar, biológicamente mediante técnicas de fusión celular, o
químicamente, en especial con agentes reticulantes o con reactivos
formadores de puentes disulfuro, y pueden estar compuestos por
anticuerpos enteros y/o por fragmentos de los mismos. Procedimientos
para obtener tales anticuerpos híbridos se describen, por ejemplo,
en la solicitud PCT WO83/03699, publicada el 27 de octubre de 1983,
y en la publicación de patente europea EPA 0217577, publicada el 8
de abril de 1987.
Además, la inmunoglobulina puede ser un
anticuerpo de cadena sencilla ("SCA"). Éstos pueden consistir
en fragmentos Fv de cadena sencilla ("scFv") (Ward y col.,
1989, Nature 341: 544), en los que los dominios variable ligero
("V_{L}") y variable pesado ("V_{H}") están unidos por
un enlace peptídico o mediante puentes disulfuro. Asimismo, la
inmunoglobulina puede consistir en dominios sencillos VH (dAbs), que
poseen actividad de unión al antígeno. Véase, por ejemplo, Winter y
Millstein, 1991, Nature 349: 295 y Glockshaber y col., 1990,
Biochemistry 29: 1362. Además, la inmunoglobulina puede
consistir en Fvs estabilizados con disulfuro (Brinkman y col., 1993,
Proc. Natl. Acad. Sci. 90:7538).
Una forma de realización preferida de un ligando
inmunológico como parte de un conjugado ligando/toxina para usar en
la presente invención es un anticuerpo monoclonal quimérico,
preferiblemente aquellos anticuerpos quiméricos que tienen
especificidad por un antígeno asociado con un tumor. Como se usa en
la presente invención, el término "anticuerpo quimérico" se
refiere a un anticuerpo monoclonal que comprende una región
variable, es decir, región de unión, procedente de una fuente o
especie y al menos una porción de una región constante derivada de
una fuente o una especie diferentes, normalmente preparadas mediante
técnicas de ADN recombinante. Los anticuerpos quiméricos que
comprenden una región variable murínica y una región constante
humana, son especialmente preferidos en ciertas aplicaciones de la
presente invención, particularmente para tratamiento humano. Tales
anticuerpos quiméricos murinos/humanos son el producto de la
expresión de genes de inmunoglobulinas que comprenden segmentos de
ADN codificadores de regiones variables de inmunoglobulina murina y
segmentos de ADN codificadores de regiones constantes de
inmunoglobulina humana. Otras formas de "anticuerpos
quiméricos" abarcadas en la presente invención son aquéllas en
las que la clase o subclase ha sido modificada o cambiada del
anticuerpo original. Tales anticuerpos "quiméricos" también se
denominan "anticuerpos de clase cambiada". Los procedimientos
para producir anticuerpos quiméricos implican técnicas
convencionales de ADN recombinante y de transfección génica, en la
actualidad bien conocidas en la materia. Véase, por ejemplo,
Morrison y col., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 81:
6851; patente de EE.UU. Nº 5.202.238 y patente de EE.UU. nº
5.204.244.
El término "anticuerpo quimérico" abarca el
concepto de "anticuerpo humanizado", es decir, aquellos
anticuerpos en los que se ha modificado la estructura o "regiones
determinantes de la complementariedad" (CDR) para que comprendan
CDR de una inmunoglobulina de especificidad diferente de la de la
inmunoglobulina original. En una forma de realización preferida, una
CDR murina se injerta en la región estructural de un anticuerpo
humano para preparar el "anticuerpo humanizado". Véase, por
ejemplo, Riechmann y col., 1988, Nature 332:323 y Neuberer y
col., 1985, Nature 314:268. CDR particularmente preferidas
corresponden a aquéllas que representan secuencias de reconocimiento
de antígenos mencionadas anteriormente para los anticuerpos
quiméricos y bifuncionales.
Un experto en la materia reconocerá que se puede
preparar un anticuerpo quimérico bifuncional que tendría los
beneficios de la menor capacidad inmunógena del anticuerpo
quimérico o humanizado, así como la flexibilidad, especialmente
para usos terapéuticos, del anticuerpo bifuncional descrito
anteriormente. Tales anticuerpos
bifuncionales-quiméricos pueden sintetizarse, por
ejemplo, mediante síntesis química usando agentes reticulantes y/o
procedimientos recombinantes del tipo descrito anteriormente. En
cualquier caso, la presente invención no debe ponerse en práctica
con un alcance limitado por cualquier procedimiento concreto de
producción de un anticuerpo, ya sea bifuncional, quimérico,
bifuncional-quimérico, humanizado o un fragmento de
reconocimiento antigénico o derivado del mismo.
Además, como se ha mencionado anteriormente, la
inmunoglobulina, o un fragmento de la misma, usada en la presente
invención, puede ser de naturaleza policlonal o monoclonal. Sin
embargo, las inmunoglobulinas preferidas son los anticuerpos
monoclonales. En la actualidad, la preparación de tales anticuerpos
policlonales o monoclonales es bien conocida por los expertos en la
materia que sean capaces de producir inmunoglobulinas útiles que
puedan usarse en la presente invención. Véase, por ejemplo, Kohler y
Milstein, 1975, Nature 256:495. Además, los hibridomas y/o
los anticuerpos monoclonales producidos por tales hibridomas y que
sean útiles en la práctica de la presente invención están
públicamente disponibles en fuentes como la American Type Culture
Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, o
comercialmente, por ejemplo, en Boehringer-Mannheim
Biochemicals, P.O. Box 50816, Indianapolis, IN 46250.
Un anticuerpo monoclonal particularmente
preferido en la presente invención es uno que se une a un antígeno
de superficie celular asociado con un tumor y que es capaz de
internalizarse. En una particular forma de realización de la
presente invención, la toxina se conjuga con el anticuerpo quimérico
BR96 ("chiBR96"), descrito en el número de serie de EE.UU.
07/544.246, presentado el 26 de junio de 1990, y que es equivalente
a la solicitud PCT publicada WO91/00295, publicada el 10 de enero de
1991. ChiBR96 es un anticuerpo quimérico murino/humano
internalizante, que reacciona con una antígeno Y fucosilado de Lewis
expresado por células de carcinoma humanas, como las derivadas de
carcinomas de mama, pulmón, colon y de ovarios. El hibridoma que
expresa la quimera BR96 e identificado como chiBR96, fue depositado
el 23 de mayo de 1990 bajo los términos del Tratado de Budapest, con
la American Type Culture Collection, y denominado ATCCHB10460.
Uno de los procedimientos preferidos para
fabricar una inmunotoxina de la presente invención consiste en
conjugar químicamente la toxina briodina 1 recombinante de la
presente invención con el ligando, preferiblemente un anticuerpo
monoclonal o un fragmento del mismo, como se ha descrito
anteriormente. Muchos procedimientos de conjugación química son bien
conocidos para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo,
Viletta y col., 1987, Science 138: 1098; Pastan y col.,
1986, Cell 47: 641; y Thorpe y col., 1987, Cancer Res.
47: 5924). Generalmente, estos procedimientos conjugan la toxina y
el anticuerpo mediante agentes reticulantes que introducen un
puente disulfuro entre las dos proteínas. Se ha demostrado que las
inmunotoxinas preparadas con enlaces no reducibles son
consistentemente menos citotóxicas que toxinas parecidas unidas
mediante puentes disulfuro.
Un procedimiento preferido usa
N-succinimidil-3-(2-piridiltitio)-propionato
(SPDP) y clorhidrato de 2-iminotiolano (2IT). Otros
reactivos preferidos son sodio
S-4-succinimidiloxicarbonil-\alpha-metil
bencil tiosulfato (SMBT) y 2IT o succinimidiloxi
carbonil-\alpha-metil-\alpha(2-piridiltio)-tolueno
y 2IT. Cada grupo de reactivos introduce un puente disulfuro entre
la toxina y el anticuerpo que es reducible, pero el enlace también
es resistente a su rotura, lo que proporciona estabilidad al
conjugado in vitro e in vivo. Tras la internalización
en los lisosomas o en los endosomas por la célula diana, se produce
la reducción del enlace y la toxina entra en el citoplasma, se une
al factor de elongación 2 y altera la síntesis de proteínas.
Otra forma de realización preferida de la
presente invención es el uso de inmunotoxinas recombinantes,
particularmente de inmunotoxinas de cadena sencilla. Estas
moléculas presentan la ventaja sobre los conjugados
toxina-anticuerpo (inmunotoxinas) de que se producen
con más facilidad que los conjugados, y se generan poblaciones
homogéneas de moléculas de toxina, es decir, péptidos sencillos
compuestos por los mismos residuos de aminoácidos.
Las técnicas de clonación y expresión de
secuencias de ADN codificadoras de las secuencias de aminoácidos
correspondientes a un derivado de cadena sencilla de un anticuerpo
parental son bien conocidas para el experto en la materia, como se
ha descrito anteriormente. La presente invención proporciona la
secuencia nucleotídica de la briodina 1 y diversos procedimientos
para preparar las proteínas de fusión de la toxina recombinante se
describen en Pastan y Fitzgerald, 1991, Science 254, 1173;
Siegall y col., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85: 9738;
Batra y col., 1991, Mol. Cell Biol. 11: 2200; O'Hare y col.,
1990, FEBS Lett, 273:200; Westby y col., 1992, Bioconj.
Chem. 3:375.
La toxina recombinante inactivadora de ribosomas,
briodina 1, de la presente invención es útil para aplicaciones
terapéuticas, tanto in vitro como in vivo, en su
forma aislada y en su forma de conjugados
ligando-toxina y proteínas de fusión de toxina
recombinantes. Las proteínas inactivadoras de ribosomas aisladas a
partir de plantas de la familia Cucurbitaceae han demostrado tener
uso como, entre otros, agentes abortivos, inmunomoduladores,
antitumorales y antivíricos (Ng y col., 1992, Gen. Pharmac.
23:575-590) o como antipalúdico (Amorim y col.,
1991, Mem. Inst. Oswaldo Cruz 86: 177).
La briodina 1 recombinante es particularmente
útil como conjugado ligando/toxina o como proteína de fusión de
toxina recombinante, ya que la BD1 es menos tóxica que muchas otras
toxinas proteicas y proteínas inactivadoras de ribosomas que se han
usado para fabricar inmunotoxinas, y es particularmente potente
inhibiendo la síntesis de proteínas una vez que se encuentra en el
interior de la célula. Los conjugados ligando-toxina
y las proteínas de fusión de toxina recombinante pueden usarse para
el tratamiento in vivo de células extraídas del cuerpo de un
paciente para retirar o matar una población celular deseada antes
de la reinfusión de las células restantes en el paciente, o
administrar directamente al paciente la fusión de toxina
recombinante.
\newpage
Para usos ex vivo, pueden extraerse
células, como las de la médula ósea, de un paciente enfermo de
cáncer y purgar la médula mediante tratamiento con el conjugado
ligando-toxina o con la proteína de fusión. Tras el
tratamiento, la médula se vuelve a introducir en el paciente
(véase, por ejemplo, Ramsay y col., 1988, J. Clin. Immunol.
8:81-88).
Para usos in vivo, la presente invención
proporciona un procedimiento para matar células de forma selectiva,
es decir, células tumorales, que expresan el antígeno al que
específicamente se une el ligando, o un equivalente funcional del
conjugado ligando-toxina o una molécula de fusión.
Este procedimiento comprende la reacción del conjugado toxina
recombinante o la molécula de fusión con la célula tumoral,
administrando al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de una
composición que contiene al menos un conjugado toxina
recombinante-ligando o una molécula de fusión de la
presente invención.
De acuerdo con la presente invención, el sujeto
puede ser humano, equino, porcino, bovino, murino, canino, felino y
un ave. Otros animales de sangre caliente también están incluidos
dentro del alcance de la presente invención.
La invención reivindicada también proporciona un
procedimiento para inhibir la proliferación de células tumorales de
mamífero. Este procedimiento comprende poner en contacto las células
tumorales de mamífero con una cantidad inhibidora de la
proliferación (es decir, una cantidad eficaz) de una toxina
recombinante dirigida hacia el tumor unida con un ligando
específico de un antígeno asociado al tumor, para inhibir la
proliferación de las células tumorales de mamífero.
Los siguientes ejemplos se presentan para
ilustrar la presente invención y para ayudar al profano en la
materia a preparar y usar la misma. No se ha pretendido que los
ejemplos limiten, de ninguna manera, el alcance de la invención.
Este ejemplo describe la preparación de proteína
total a partir de la raíz de Bryonia dioica y la separación
de las proteínas inactivadoras de ribosomas, incluyendo la nueva
proteína briodina 1.
Las raíces de Bryonia dioica (Poyntzfield
Herb Nursery, Ross-shire, Escocia) se lavaron,
pelaron, rallaron u homogeneizaron usando un homogeneizador Waring
en suero salino tamponado con fosfato (PBS, 1 litro PBS: 550 g
material radicular). La pasta obtenida se agitó durante 16 horas a
4ºC y se coló a través de una estopilla. Después de eliminar el
material vegetal, el filtrado se centrifugó a 15 g durante 15
minutos a 4ºC para retirar las partículas grandes y, después, se
centrifugó una segunda vez a 50 g durante 20 minutos para aclarar. A
continuación, el sobrenadante se filtró a través de un filtro
estéril de 0,22 micrómetros y se dializó frente a un tampón de
fosfato sódico 5 mM a un pH de 6,5.
A continuación, se separaron las proteínas
vegetales en función de su carga y tamaño usando un procedimiento de
cinco etapas. En primer lugar, el extracto de raíz dializado se
aplicó a una columna de CM-Sefarosa (Pharmacia,
Uppsala, Suecia), equilibrada con fosfato sódico 5mM a pH 6,5. La
elución de las proteínas de la columna se realizó usando un
gradiente salino de NaCl 0M a 0,3M. En segundo lugar, se recogieron
4 fracciones y se midió la densidad óptica del efluente a 280 nm
(figura 1). Las fracciones cromatográficas se evaluaron mediante
electroforesis. Alícuotas de quince \mul de cada fracción
recogida fueron añadidas a un tampón de muestra
SDS-PAGE, se llevaron a ebullición a 100ºC durante 5
minutos y se separaron en geles de gradiente
SDS-PAGE 4%-12% (Laemmili, 1970, Nature
227:680-685). A continuación, se procedió a la
tinción de los geles con azul de Coomassie para resolver las
proteínas separadas (figura 2).
En la tercera etapa de la purificación, las
fracciones 9 a 15, que contenían una banda proteica de 29 kDa, se
mezclaron y después se concentraron hasta un volumen inferior a 8
ml usando un Centriprep 10 (Amicon, Bedford, MA). La cuarta etapa
consistió en aplicar el concentrado a una columna de exclusión por
tamaño TSK-3000 (TosoHaas, Inc., Filadelfia, PA) y,
después, eluir las proteínas vegetales de forma isocrática. Se
recogieron fracciones de 3 ml y el eluato se midió a 280 nm (figura
3). Tras la cromatografía de exclusión por tamaño, la quinta etapa
en el procedimiento de purificación consistía en analizar las
fracciones mediante SDS-PAGE, como se ha descrito
anteriormente, a excepción de que se usó un gel
SDS-PAGE de 12%. Las proteínas se resolvieron
mediante tinción con azul de Coomassie. En las fracciones máximas
58 a 64 se observaron dos bandas proteicas pequeñas migrando a 29
kDa y a 27 kDa (figura 4). Estas fracciones se recogieron
separadamente y este material se usó para su posterior
caracterización.
En este ejemplo se determinó la secuencia de
aminoácidos del extremo N-terminal de las proteínas
de 29 kDa contenidas en las fracciones mezcladas. Los primeros 32
residuos aminoacídicos de la banda proteica de 29 kDa se
determinaron sin ninguna ambigüedad y se descubrió que eran
idénticos a los de la briodina (briodina 1) descrita por Stirpe.
La secuencia aminoacídica del extremo
N-terminal se determinó usando los siguientes
procedimientos, que se describen brevemente. La banda proteica se
recuperó de forma individual a partir de los geles
SDS-poliacrilamida mediante electrotransferencia por
adsorción en una membrana Problott (Applied Biosystems, Foster City,
CA) usando una célula de transferencia electroforética
Mini-transblot (Bio Rad Laboratories, Richmond, CA)
(Matsudaira, 1987, J. Biol. Chem. 262: 10035-10038).
La membrana se tiñó con azul de Coomassie brillante, después se
limpió, y la banda de 29 kDa se escindió para el posterior análisis
de la secuencia amino terminal.
La muestra se secuenció en un secuenciador
proteico en fase líquida por pulsos (modelo 476A, Applied
Biosystems) equipado con un cartucho de reacción vertical de flujo
cruzado usando los programas de ciclos proporcionados por el
fabricante. Los derivados del aminoácido feniltiohidantoína se
analizaron mediante HPLC de fase inversa con una columna PTH C18
(Applied Biosystems) usando un gradiente de elución de acetato
sódico/tetrahidrofurano/aceto-
nitrilo (Tempst y Reviere, 1989, Anal. Biochem. 183: 290-300).La cuantificación y reducción de datos se llevaron a cabo usando un software de análisis cromatográfico Modelo 610A (Applied Biosystems).
nitrilo (Tempst y Reviere, 1989, Anal. Biochem. 183: 290-300).La cuantificación y reducción de datos se llevaron a cabo usando un software de análisis cromatográfico Modelo 610A (Applied Biosystems).
La secuencia de aminoácidos del extremo
N-terminal de BD1 se realizó con 47 pmoles (en
función del rendimiento inicial de la Val-1
identificada), y se sometió a electrotransferencia por adsorción
usando una membrana Problott. Se obtuvo una única secuencia
aminoacídica y la identificación sin ambigüedades de los derivados
del aminoácido PTH fue posible hasta el residuo 32 (Sec. ID. nº
1).
En este ejemplo, el ARN total de las hojas de
Bryonia dioica se usó para la clonación del ADNc de la
briodina 1. Brevemente, el ARN total se extrajo a partir de 2,1 g
del material de las hojas usando un reactivo TRI (Molecular Research
Center, Inc., Cincinnati, OH), siguiendo el protocolo del
fabricante. Las hojas congeladas se pulverizaron, solubilizaron en
reactivos TRI y homogeneizaron. La extracción del ARN se produjo con
cloroformo, se precipitó con isopropanol y se lavó en etanol. El
ARN total resultante se resuspendió en H_{2}O, se cuantificó y se
analizó mediante electroforesis en geles de
formaldehído-agarosa y se visualizó mediante tinción
con bromuro de etidio. El rendimiento aproximado fue de 0,9 mg de
ARN total/g de material de hoja.
El ADNc cebado con oligo(dT) (usando ARN
total como molde) se amplificó mediante PCR usando mezclas de
oligonucleótidos degenerados, BD1-p20 (Sec. ID nº 3)
y BD1-p22 (Sec. ID. nº 4), para aislar la secuencia
de BD1 exacta entre los aminoácidos 7 y 30. Los productos de la
reacción de PCR se subclonaron en el vector pCRII (Invitrogen
Corp., San Diego, CA), según el protocolo del fabricante usando el
kit de clonación TA. Brevemente, los productos amplificados por la
PCR que contenían desoxiadenosinas sencillas 3' se ligaron en el
vector pCRII preparado con extremos salientes 3'dT en el sitio de
EcoRI. El producto de ligación se transformó en las células de E.
coli DH5\alpha (Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning. A
Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, NY).
Se seleccionaron clones recombinantes para el
análisis de la secuencia de ADN en función de la presencia de
insertos de 100-120 pares de bases (pb),
determinados mediante electroforesis en gel de agarosa (Sambrook y
col., supra). La secuenciación de ADN (Sanger y col., 1977,
Proc. Natl. acad. Sci. 74, 5463) se realizó mediante
terminación didesoxinucleotídica usando Sequenase (United States
Biochemical Corp., Cleveland, OH). Tras el análisis de la secuencia
de 81 clones individuales, se identificó un clon que contenía los
nucleótidos correctos correspondientes a la secuencia del extremo
amino de la BD1.
El extremo 3' del gen de BD1 se amplificó
mediante RACE3' de la siguiente manera: la amplificación de la
primera cadena de ADNc de ARN total con oligonucleótido
XSC-T17 (Sec. ID. nº 9) y XSC (Sec. ID. nº 10) y la
clonación en el pCRII se han descrito anteriormente. Los clones con
las secuencias de BD1 se seleccionaron por hibridación en filtros
de nylon usando como sonda BD1-Ej4 marcada con
[^{32}P] (Sec. ID. nº 6), un oligonucleótido con la secuencia
oligonucleotídica exacta de la región del gen deBD1 localizada en
dirección 3' del cebador de PCR BD1-Ej2. Mediante
secuenciación del ADN se identificaron dos clones que codificaban el
marco de lectura abierto del gen de BD1.
Para identificar el extremo 5' exacto del gen de
BD1, se realizó una 5' RACE usando el sistema RACE 5' (Gibco BRL,
Gaithersburg, MD), siguiendo el protocolo del fabricante.
Brevemente, la primera hebra del ADNc se sintetizó usando como
cebador el oligonucleótido BD1-completa (Sec. ID. nº
7) terminado con dCTP, y la primera hebra resultante se amplificó
mediante PCR usando como cebadores los oligonucleótidos
BD1-p2 (Sec. Id. nº 8, que codifica los residuos de
aminoácidos 26-36) y AP (Sec. ID. nº 11, que
codifica el cebador adaptador poli-G que se une a la
cola de poliC). Los fragmentos de ADN amplificados resultantes se
subclonaron en el interior del plásmido pCRII como se ha descrito
anteriormente. Los clones que codifican BD1 se seleccionaron
mediante hibridación en filtros de nylon usando como sonda
BD1-Ej2 marcada con [^{32}P] (Sec. ID. nº 5). Se
seleccionaron dos clones positivos que contenían ADNc que codificaba
BD1, pCRII BD1 c1.1 y pCRII BD1 c1.6 para la secuenciación del ADN.
La secuencia de ADN completa codificadora de BD1 se muestra en la
figura 5.
Los oligonucleótidos usados en la clonación de
ADNc de BD1 fueron los siguientes, representando las secuencia en
corchetes la degeneración nucleotídica y las secuencias en
paréntesis, la secuencia de aminoácidos correspondiente:
\newpage
En este ejemplo, se fabricaron dos plásmidos (pSE
14,0 y pSE 13,0) con briodina 1 recombinante codificada y expresada
(rBD1F1 y rBD1F2, respectivamente). Asimismo, en este ejemplo, la
briodina 1 expresada por los plásmidos se purificó y se demostró que
inhibía la síntesis de proteínas.
Brevemente, el plásmido pSE13,0 se fabricó de la
siguiente manera. La secuencia de ADNc codificada por el plásmido
pCRIIBD1 c1.1 se usó para amplificar mediante PCR un fragmento de
ADN de 770 pb con el cebador 1,
El cebador en 5' usado en la PCR (cebador 1) se
diseñó para codificar un único sitio de restricción NcoI adyacente a
un codón de iniciación ATG y los 14 primeros codones del gen de BD1.
El cebador en 3' usado en la PCR (cebador 2) se diseñó para que
hibridara con los últimos 9 codones del gen de BD1 correspondientes
al extremo carbonilo de la proteína BD1 madura. El cebador 3'
también contiene dos codones de terminación consecutivos seguidos
por un sitio de restricción EcoRI.
Tras la amplificación mediante PCR y la digestión
con NcoI y EcoRI, el fragmento NcoI-EcoRI de 747 pb
se ligó en un fragmento vector NcoI-EcoRI de 5465 pb
preparado a partir del plásmido pET22b (Novagen, Madison WI), que se
encuentra bajo el control transcripcional del promotor T7. El
producto de esta unión fue un vector intermedio denominado pSE10,o,
que contenía el promotor T7, la secuencia líder PelB y la secuencia
de ADNc codificadora de BD1.
El vector de expresión pSE13.0, que contenía la
secuencia de ADNc codificadora de BD1 sin la secuencia líder, se
creó mediante la digestión del vector de expresión pSE10,0 con las
enzimas de restricción XbaI y NcoI. Tras la digestión, el fragmento
de 6106 pb se ligó con el oligodúplex formado por la hibridación
del cebador 3 y el cebador 4.
El plásmido pSE14,0 se fabricó de forma parecida
al plásmido pSE13,0. La secuencia de ADNc codificada por el plásmido
pCRIIBD c1.1.1 se amplificó mediante PCR con el cebador 1 (Sec. ID.
nº 12) y el cebador 5.
El cebador 3' (cebador 5) codifica un único sitio
de restricción EcoRI e hibrida con los últimos 17 codones del gen de
BD1 correspondientes al extremo carbonilo de la proteína BD1
completa.
El cebador 3' también contiene dos codones de
terminación antes del sitio EcoRI. Después de la amplificación por
PCR y de la digestión con NcoI-EcoRI, el fragmento
de 807 pb se ligó en el plásmido pET22b exactamente como se ha
descrito para el plásmido pSE13,0, dando lugar al plásmido
intermedio pSE11,9. La secuencia líder PelB del plásmido pSE11,0 se
eliminó exactamente como se ha descrito para el plásmido pSE13,0,
dando lugar al plásmido de expresión pSE14,0 que codifica la forma
completa de BD1 (BD1F1).
La expresión de cada plásmido, pSE14,0 y pSE13,0,
se llevó a cabo en cultivos de 1 litro de E. coli BL21
(\lambdaDE3) en crecimiento en caldo T complementado con 50
\mug/ml de ampicilina, a una A_{630}= 0,6-0,8 y
la inducción se realizó con IPTG (1 mM) durante 1,5 horas a 37ºC.
Los precipitados celulares recogidos mediante centrifugación y se
procesaron por medio de uno de dos procedimientos. En el primer
procedimiento, las células se lisaron en Tris 10 mM, a pH 7,4, KCl
100 mM, EDTA 20 mM, 2.mercaptoetanol 10 mM, NP-40 al
0,05% y 5 mg de lisozima/litro de cultivo, durante 30 minutos en
hielo. Las suspensiones celulares se enfriaron/descongelaron tres
veces, se sometieron a ultrasonidos y se centrifugaron a 15.000 rpm
durante 30 minutos. En el segundo procedimiento, el precipitado
celular se resuspendió en sacarosa al 20%, Tris HCl 30 mM a pH 7,5 y
EDTA 1mM, en hielo durante 10 minutos y se centrifugaron a 8.000 rpm
durante 15 minutos. El precipitado se resuspendió en H_{2}O helada
durante 10 minutos y se centrifugó como anteriormente. El
precipitado (o esferoblastos) se resuspendió en Tris HCl 50 mM (pH
8,0) y EDTA 1mM, se sometió a ultrasonidos y se centrifugó a 30K
durante 45 minutos. Los precipitados recogidos por ambos
procedimientos se disolvieron en guanidina HCl 7M, Tris 100 mM a pH
7,4 y EDTA 1mM, durante 1 hora, se sometieron a ultrasonidos y se
centrifugaron a 25.000 rpm durante 30 minutos.
La proteína briodina recombinante desnaturalizada
(BD1), expresada y aislada del pSE13.0 o del pSE14.0, se
renaturalizó en PBS-L-arginina 0,4
M, y guanidina HCl 70 mM a una concentración de 80 \mug/ml de
proteína a 4ºC durante >24 horas. La proteína se dializó
extensamente frente a NaH_{2}PO_{4} 5 mM y se aisló mediante
cromatografía CM-sefarosa (intercambio catiónico
semanal), usando un gradiente de NaCl 0-0,3 M. La
BD1F1 y BD1F2 recombinantes se analizaron mediante
SDS-PAGE y análisis Western blot usando un
anticuerpo monoclonal antiBD1 de conejo y se comparó con la BD1
nativa (figuras 7 y 8).
La actividad de la BD1 recombinante purificada
mediante ambos procedimientos de recogida, 1 y 2, se probó en el
siguiente ensayo de reticulocito de conejo acelular (Promega
Biotec, Madison, WI). Brevemente, las proteínas toxinas se
mezclaron en un volumen de 25 \mul con lisado de reticulocitos de
conejo (70% de volumen de reacción), una mezcla de todos los
aminoácidos (menos leucina) a 1 mM, 0,5 mCi/ml
[^{3}H-leucina] y ARN virus del mosaico del bromo
(Shih y col., 1973. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 70:
1799-1803) como sustrato (0,5 \mug). La reacción
se incubó a 30ºC durante 30 minutos y se interrumpió añadiendo NaOH
1M, H_{2}O_{2} al 2%. El producto de la traducción precipitó
usando ácido tricloroacético (TCA)al 25%, ácidos casamino al
2% en hielo durante 30 minutos. Las proteínas marcadas
radiactivamente se recogieron en filtros de fibra de vidrio, se
enjuagaron con TCA al 5%, se enjuagaron con etanol, se secaron y se
cuantificaron usando un contador de centelleo.
Se encontró que las BD1 recombinantes aisladas
mediante ambos procedimientos de recogida eran potentes inhibidores
de la síntesis de proteínas y esencialmente equivalentes a aquéllas
de la BD1 nativa, con valores CE_{50} de 3-4 pM
(figura 9).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Bristol-Myers Squibb Company
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Clonación y expresión de un gen codificante de briodina 1 a partir de Bryonia dioica
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 16
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Bristol-Myers Squibb Company
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 3005 First Avenue
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Seattle
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Washington
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 98121
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible con PC
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patentin Release 1.0, versión 1.25
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1094 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- MICROORGANISMO: Bryonia dioica
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 290 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- MICROORGANISMO: Bryonia dioica
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(Secuencia pasa a página
siguiente)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCTAGCCCAT GGATGTKAGC TTYCGTTT
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCTAGCGAAT TCCTASAGAG GKATRTTGTA SAC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTTATCAGGTG CTACAACCAC ATCC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGAAGCTCTTC CATACGAAAG G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 75 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAAAGATCCT CTGAATTCTT ACTATATACC ATAAAGTCCA TGTTCAAAGC CGATGAGTGT
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCATAGAAATG TCCTC
\hfill75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGAGAGGTATG TTGTAGACTT TCCT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGACTCGAGTC GACATCGATT TTTTTTTTTT TTTTT
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGACTCGAGTC GACATGC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 24
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota "N significa inosina"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 25
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota "N significa inosina"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 29
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota "N significa inosina"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 30
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota "N significa inosina"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 34
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota "N significa inosina"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 35
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota "N significa inosina"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGGCCACGCGT CGACTAGTAC GGGNNGGGNN GGGNNG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 12:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 56 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGTCAGAGTTC CATGGATGTG AGCTTTCGTT TATCAGGTGC TACAACCACA TCCTAT
\hfill56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 13:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAAAGATCCT CTGAATTCTT ATTATGCAAT ATTATTTCTG TTAGCAGCAA
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 14:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTAGAAATAA TTTTGTTTAA CTTTAAGAAG GAGATAC
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 15:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCATGGTATCT CCTTCTTAAA GTTAAACAAA ATTATTT
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº 16:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 75 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAAAGATCCT CTGAATTCTT ACTATATACC ATAAAGTCCA TGTTCAAAGC CGATGAGTGT
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCATAGAAATG TCCTC
\hfill75
Claims (16)
1. Una secuencia nucleotídica aislada que
codifica una proteína inactivadora de ribosomas partir de Bryonia
dioica, comprendiendo dicha proteína la secuencia de aminoácidos
de la SEC. ID. Nº 2; o un complemento de la secuencia de
nucleótidos.
2. La secuencia de nucleótidos aislada de la
reivindicación 1, que comprende la secuencia nucleotídica de la SEC.
ID. Nº 1 desde el nucleótido número 44 hasta el nucleótido número
913, o desde el nucleótido número 113 hasta el nucleótido número
913.
3. Una secuencia nucleotídica aislada, en la que
la secuencia de nucleótidos codifica un fragmento biológicamente
activo de la proteína de la reivindicación 1, que inhibe la
síntesis de proteínas in vitro.
4. Un vector recombinante que comprende una
secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 3.
5. El vector recombinante de la reivindicación 4,
que además comprende secuencias de control transcripcional y
traduccional operativamente unidas a la secuencia de nucleótidos que
codifica la proteína inactivadora de ribosomas.
6. El vector recombinante de la reivindicación 4,
en el que el vector es pSE14.0, denominado ATCC 69620.
7. Una célula hospedadora en la que se ha
producido una transfección con un vector recombinante de una
cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
8. Un procedimiento para producir briodina 1
recombinante que comprende la transfección de una célula hospedadora
con un vector de expresión que comprende una secuencia de
nucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el
crecimiento de las células hospedadoras sometidas a la transfección,
la inducción de las células hospedadoras sometidas a transfección
para que expresen la briodina 1, y aislar la briodina 1 recombinante
expresada.
9. Un procedimiento para producir una proteína de
fusión briodina 1 recombinante-ligando, que
comprende la transfección de una célula hospedadora con un vector
de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 operativamente unidos con
una secuencia de nucleótidos que codifica un ligando, el
crecimiento de las células hospedadoras sometidas a la transfección,
la inducción de las células hospedadoras sometidas a la
transfección para que expresen la proteína de fusión briodina
1-ligando, y aislar la proteína de fusión briodina
1-ligando recombinante expresada.
10. El procedimiento de las reivindicaciones 8 ó
9, en el que la célula hospedadora es una bacteria, una planta, una
levadura o una célula de mamífero.
11. El procedimiento de la reivindicación 9, en
el que el ligando es una proteína, un polipéptido o un
peptido-ligando.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que el ligando es un ligando inmunorreactivo, transferrina, un
factor de crecimiento epidérmico, bombesina, gastrina, péptido
liberador de gastrina, factor de crecimiento derivado de plaquetas,
IL-2, IL-6 o un factor de
crecimiento tumoral.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que el ligando inmunorreactivo es una inmunoglobulina de
reconocimiento de antígeno, o un fragmento de reconocimiento de
antígeno del mismo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo
bifuncional, un anticuerpo híbrido o un anticuerpo de cadena
sencilla.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que el fragmento de reconocimiento de antígeno del ligando
inmunorreactivo es un fragmento Fab', F(ab')_{2}, Fv o Fab
de una inmunoglobulina.
15. Una proteína de fusión, como se ha definido
en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14.
16. Una composición farmacéutica que comprende al
menos una proteína de fusión de la reivindicación 15, opcionalmente
en combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente
aceptable.
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