DE69531332T2

DE69531332T2 - Klonierung und Expression eines Gens, das Bryodin 1 aus Bryonia dioica kodiert

Info

Publication number: DE69531332T2
Application number: DE69531332T
Authority: DE
Inventors: Clay B. Siegall
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1994-05-17
Filing date: 1995-05-16
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2015-05-17
Also published as: ATE245697T1; EP0710723A1; JPH0898694A; US5541110A; EP0710723B1; US5932447A; CA2148724A1; DE69531332D1; ES2203625T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung und Charakterisierung einer Oligonukleotidsequenz, die ein Ribosom-inaktivierendes Protein aus der Pflanze Bryonia dioica kodiert. Die Erfindung betrifft auch die gereinigte Oligonukleotidsequenz in operativer Verknüpfung mit geeigneten transkriptionalen und translationalen Kontrollsequenzen umfassende Expressionsvektoren, transformierte Wirtszellen und ein rekombinant exprimiertes Ribosom-inaktivierendes Protein. Die Verwendung der gereinigten, das Ribosom-inaktivierende Protein kodierenden Oligonukleotide zur Expression eines Ribosom-inaktivierenden Proteins (RIP) und zur Konstruktion von Fusionsproteinen ist ebenfalls als Teil der vorliegenden Erfindung anzusehen.
Hintergrund der Erfindung
Proteine, die die Proteinsynthese inhibieren, wurden aus verschiedenen Organismen isoliert, einschließlich Pflanzen, Bakterien und Pilzen. Man nimmt an, dass diese Proteintoxine von den Organismen produziert werden, um einen Selektionsvorteil für das Wachstum der Organismen, die diese produzieren, zu gewinnen. Trotz des divergenten Evolutionshintergrunds der Organismen, in denen diese Proteintoxine gefunden werden, weisen die meisten Toxine auffallend ähnliche Wirkmechanismen auf. Eine bestimmte Gruppe von Toxinen wirkt durch Blockierung der Proteinsynthese, indem entweder der Elongationsfaktor 2 (EF-2) direkt modifiziert wird oder indem das Ribosom selbst modifiziert wird, so dass EF-2 bei der Proteinsynthese nicht mehr funktionsfähig ist. Diese Klasse von Toxinen, Ribosominaktivierende Proteine (RIPs), kann aus Pflanzen verschiedener Familien isoliert werden.
Ribosom-inaktivierende Proteine aus Pflanzen sind auf Basis ihrer Struktur in zwei Gruppen gegliedert worden. Ribosom-inaktivierende Proteine vom Typ I (RIPs vom Typ I) enthalten eine Einzelkette, die Ribosom-inaktivierende Aktivität aufweist. Zu RIPs vom Typ I gehören beispielsweise Gelonin, Saporin, Trichosanthin und Bryodin. Ribosom-inaktivierende Proteine vom Typ II (RIPs vom Typ II) umfassen zwei Ketten, eine A-Kette, die befähigt ist, EF-2 zu inaktivieren, und eine B-Kette, die eine Zellbindungsdomäne mit Lectin-artigen Eigenschaften enthält. Die Bindungsdomäne befähigt RIPs vom Typ II, viele Arten von Zellen zu binden und diese Zellen zu töten. Beispiele von RIPs vom Typ II sind Ricin und Abrin.
Obwohl die zwei Arten Ribosom-inaktivierender Proteine sich in ihren Strukturen unterscheiden, inhibieren beide Arten die Proteinsynthese, indem sie die 60S-Untereinheit eukaryotischer Ribosomen durch Spaltung der N-glycosidischen Bindung des Adeninrests an der Position 4324 der 28S rRNA inaktivieren (Endo und Tsurugi 1987, J. Biol. Chem. 262: 8128–8130; Stirpe, F. et al. 1988, Nucl. Acid Res. 16: 1349–1357).
Ribosom-inaktivierende Proteine wurden aus mehreren Pflanzenfamilien isoliert, einschließlich Cariophyllaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae und Phytolaccaceae. Die Toxine wurden insbesondere aus den Wurzeln, Samen und Blättern der Pflanzen isoliert. Es wurden Vergleiche angestellt zwischen den N-terminalen Aminosäuresequenzen von RIPs, die aus den Samen von Gelonium multiflorum (Euphorbiaceae), Momordica charantia (Cucurbitaceae), Bnonia dioica (Cucurbitaceae), Saponaria officinalis (Saporin-5a, Saporin-5b, Saporin-6a) (Cariophyllaceae) und aus den Blättern von Saponaria officinalis (Saporin-1) isoliert wurden. Die vollständigen Aminosäuresequenzen wurden für ein RIP vom Typ I aus Trichosanthes kirilowii maxim und aus Gerstensamen-Proteinsynthese-Inhibitor bestimmt. Diese Vergleiche zeigen, dass mindestens die N-terminalen Regionen der Toxine Bryodin und Momordin (Mitglieder der Familie Curcurbitaceae) einen hohen Grad an Ähnlichkeit mit der Ricin-A-Kette und mit Gelonin aufweisen, die Mitglieder der Familie Euphorbiaceae sind. Man nimmt an, dass die Ähnlichkeit die Konsequenz eines gleichen evolutionären Ursprungs ist. Eine sehr geringe Ähnlichkeit wurde zwischen RIPs der Familien Cucurbitaceae und Euphorbiaceae sowie denjenigen der Familien Phytolaccaceae oder Cariophyllaceae gefunden (Montecucchi et al., 1989, Int. J. Peptide Protein Res. 33: 263–267). Obwohl Ähnlichkeiten bezüglich der Aminosäuresequenzen der N-terminalen Regionen von RIPs, die aus derselben Pflanzenart isoliert wurden, gefunden wurden, bestehen insbesondere zwischen Toxinen, die aus unterschiedlichen Geweben derselben Pflanze isoliert wurden, viele Unterschiede.
Ein Pflanzenproteintoxin mit der Bezeichnung Bryodin wurde ursprünglich als ein 27–30 kDal-Protein, das aus der Wurzel von Bryonia dioica isoliert wurde, identifiziert (Patentanmeldung in Großbritannien GB 2194948, veröffentlicht am 23. März 1988). Das Toxin ist ein Ribosom-inaktivierendes Protein vom Typ I mit einer Einzelkette und einem Wirkmechanismus, der Ribosomen durch Blockierung produktiver Wechselwirkungen mit dem Elongationsfaktor-2 inaktiviert. Da Bryodin keine Zellbindungsdomäne aufweist, wie die anderen RIPs vom Typ I, bindet es normalennreise nicht an Säugerzellen. Es wurde gezeigt, dass das Protein ein Molekulargewicht von etwa 27.300 Dalton gemäß Gelfiltration und von etwa 28.800 Dalton gemäß Polyacrylamidgelelektrophorese sowie einen isoelektrischen Punkt von 9,5 aufweist. Es wurde gefunden, dass dieses Toxin die Proteinsynthese im Kaninchen-Retikulozytenlysat-System mit Weizenkeimribosomen bei 3,6 ng/ml (ID₅₀) inhibiert und eine LD₅₀ in Mäusen von 14,5 mg/kg aufweist, wenn es intraperitoneal verabreicht wird. Eine vollständige Nukleotidsequenz ist für Bryodin 1 nicht bestimmt worden, es wurde nur eine teilweise N-terminale Aminosäuresequenz erhalten. Es wurde bestimmt, dass die N-terminale Aminosäuresequenz wie folgt lautet:
Ein zweites Ribosom-inaktivierendes Protein wurde aus den Blättern von B. dioica isoliert (Europäische Patentveröffentlichung EP 0 390 040 , veröffentlicht am 3. Oktober 1990). Dieses Molekül wurde so beschrieben, dass es ein Molekulargewicht von 27.300 Dalton gemäß Gelfiltration und 28.800 Dalton gemäß Polyacrylamidgelelektrophorese und einen isoelektrischen Punkt von 9,5 aufweist, und es wurde als Bryodin-L bezeichnet. Es wurde gefunden, dass diese Form von Bryodin die Proteinsynthese im Kaninchen-Retikulozytenlysat-System mit einer EC₅₀ von 0,1 nM (3,6 ng/ml) inhibiert und eine LD₅₀ in Mäusen von 10 mg/kg aufweist, wenn es intraperitoneal verabreicht wird. Eine Aminosäureanalyse wurde ebenfalls bereitgestellt, es wurde jedoch keine Aminosäuresequenz oder Nukleotidsequenz für die Moleküle offenbart.
Ribosom-inaktivierende Proteine sind wegen ihrer Nützlichkeit als Komponenten von „Immunotoxinen" von Interesse. Immunotoxine sind Hybridmoleküle aus einem toxischen Teil, der mit einem Antikörper verknüpft ist, der das Toxin selektiv einer spezifischen Zielzelle zuzuführen vermag. Potentielle Zielzellen schließen schädliche Zellen ein, d. h. neoplastische, viral infizierte, immunkompetente und parasitäre Zellen. Gemäß der Definition der vorliegenden Erfindung können Immunotoxine chemische Konjugate aus einem zellspezifischen Liganden sein, der mit einem toxischen Molekül, wie etwa einem Ribosom-inaktivierenden Protein, verknüpft ist. Aufgrund der Tatsache, dass viele unterschiedliche Ribosominaktivierende Proteine bekannt sind und dass neue Toxine entdeckt werden, steht eine Reihe toxischer Einheiten zur Verfügung, die im unkonjugierten Zustand verschiedene Grade intrinsischer Toxizität gegenüber ganzen Zellen aufweisen und die eine verfügbare Quelle alternativer Toxine darstellen, falls der Patient während einer Langzeit-in-vivo-Behandlung eine Immunantwort gegenüber dem ursprünglich verabreichten Immunotoxin entwickeln sollte. Zusätzlich waren einige Immunotoxine, Saporin 6 und ein Anti-Thy-1.1-Antikörper oder dessen F(ab')₂-Fragment, toxischer als das freie Toxin, woraus sich ein Bedürfnis nach neuen und anderen Toxinmolekülen ergibt.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine gereinigte Oligonukleotidsequenz, die ein aus Bryonia dioica isoliertes Pflanzenproteintoxin kodiert. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Expressionsvektoren, bei denen die gereinigte Oligonukleotidsequenz operativ mit geeigneten transkriptionalen und translationalen Kontrollsequenzen von Wirtszellen verknüpft ist, die große Mengen des Pflanzenproteintoxins exprimieren, wenn sie zur Transformation der geeigneten Wirtszellen verwendet werden. Des Weiteren kann die Oligonukleotidsequenz zur Konstruktion von Oligonukleotidmolekülen verwendet werden, die das Toxin und einen für eine Zielzelle spezifischen Liganden umfassende Fusionsmoleküle kodieren. Dieses Immunkonjugat ist für die Zielzelle toxisch und stellt Zusammensetzungen bereit, die für ein zielgerichtetes Abtöten von Zellen brauchbar sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vollständige Nukleotidsequenz, die das aus der Pflanze Bryonia dioica isolierte Ribosom-inaktivierende Protein Bryodin 1 (BD1) kodiert, wird hier offenbart und ist Grundlage der vorliegenden Erfindung dar. Die Erfindung umfasst Ausführungsformen, die ein Bryodin-1-kodierendes gereinigtes Oligonukleotid offenbaren. Auch gehören Ausführungsformen dazu, die Plasmide offenbaren, die die Bryodin-1-kodierende DNA-Sequenz umfassen, sowie solche, die Expressionsvektoren offenbaren, die die Bryodin-1-kodierende DNA-Sequenz in operativer Verknüpfung mit geeigneten transkriptionalen Kontrollsequenzen und transformierte Wirtszellen umfassen.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Bryodin-1 durch rekombinante Mittel. Bei dem rekombinant produzierten Protein kann es sich um Bryodin-1, Fragmente oder Derivate von Bryodin-1 handeln, die auch als Fusionsproteine eine Ribosom-inaktivierende Aktivität aufweisen. Fusionsproteine können einen für eine bestimmte Zellart spezifischen Liganden und einen funktionalen Anteil von Bryodin-1 umfassen, die befähigt sind, das Bryodin-1 spezifisch der Zielzelle zuzuführen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt die Ergebnisse der Absorptionsmessung aus der CM-Sepharose-Chromatographie eines aus der Wurzel von Bryonia dioica isolierten Proteins dar.
2 stellt das Ergebnis der SDS-PAGE-Analyse der Fraktionen 9 bis 15 aus der Trennung mittels CM-Sepharose-Chromatographie dar. Spur M enthält Molekulargewichtsstandards: Ovalbumin (43.000 MW), Carboanhydrase oder Carbonat-Dehydratase (29.000 MW), β-Lactoglobulin (18.000 MW), Lysozym (14.000 MW), Rindertrypsininhibitor (6.000 MW) und Insulin (2.000 MW).
3 stellt ein aus einer TSK-3000 Größenausschlusssäule erhaltenes Chromatogramm dar. Die das 29-kDa-Band enthaltenden Fraktionen wurden aus der Auftrennung mittels CM-Sepharose-Chromatographie gepoolt und auf weniger als 8 ml aufkonzentriert. Das Konzentrat wurde auf die Säule aufgetragen und die Absorption bei 280 nm verfolgt.
4 veranschaulicht das Ergebnis, das für die SDS-PAGE-Analyse der Fraktionen 58 bis 64 aus der Größenausschlusschromatographie des teilweise gereinigten Bryodins erhalten wurde. Spur M enthält Molekulargewichtstandards: Ovalbumin (43.000 MW), Carboanhydrase (29.000 MW) und β-Lactoglobulin (18.000 MW ).
5 stellt die Bryodin-1-kodierende DNA-Sequenz dar. Beginnend mit den 5'-nichtkodierenden Sequenzen ist die Sequenz von den Resten 1–290 und Nukleotiden 1–1094 durchnummeriert. Die Nukleotide 914–916 stehen für das Stoppcodon, die Nukleotide 917–1094 sind 3'-nichtkodierende Sequenzen. Die zwei unterstrichenen Hexanukleotidsequenzen in der 3'-nichtkodierenden Region entsprechen Polyadenylierungssignalen, die in zwei einzelnen Klonen gefunden wurden. Der Pfeil bei der Aminosäure 24 entspricht dem Start des reifen BD1-Aminoterminus. Die Pfeile bei den Aminosäureresten 271 und 290 entsprechen zwei Formen von BD1 (F2 beziehungsweise F1), die das mutmaßlich reife Protein (F2) und das vollständige Pro-Protein (F1) kodieren.
Die 6A und 6B sind schematische Diagramme der BD1-Expressionsplasmide pSE 13.0 und pSE 14.0.
Die 7A, B und C stellen ein CM-Sepharose-Chromatographie-Profil (A), SDS-PAGE mit Coomassie-Blau-Einfärbung (B) und Western-Blot unter Verwendung polyklonaler Anti-BD1-Antikörper (Kaninchen) (C) von rekombinantem BD1 F1 (Aminosäurereste 24–290), das denaturiert und erneut gefaltet wurde, dar. Die Fraktionen im Chromatographieprofil entsprechen den Fraktionsnummern in den Gelen. N = Natives BD1.
Die 8A, B und C zeigen die Ergebnisse der Reinigung von rekombinantem BD1 F2 (Aminosäurereste 24–270) (A); CM-Sepharose-Chromatographie-Profil (B), SDS-PAGE angefärbt mit Coomassie-Blau (C) und Western-Blot, angefärbt mit polyklonalem Anti-BD1-Antiserum. N = Natives BD1.
9 stellt Daten zur Proteinsynthese-Inhibitionsaktivität von rekombinantem BD1 F1 und BD1 F2 gegenüber nativem BD1 unter Verwendung eines in vitro-zellfreien-Kaninchen-Retikulozyt-Translationsassays dar. Die Proteinsynthese wurde als [³H]-Leucin-Einbau von mit Ribosom-inaktivierendem Protein behandelten und unbehandelten Translationsprodukten gemessen.
Ausführliche Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen
Die vorliegende Ertindung betrifft ein im Wesentlichen gereinigtes Oligonukleotid, das das aus der Pflanze Bryonia dioica isolierte, Ribosominaktivierende Protein Bryodin-1 kodiert, oder dessen Komplement. Bei dem Oligonukleotid kann es sich um eine cDNA, isolierte, gereinigte genomische DNA, RNA oder Antisense-RNA handeln. Plasmide und Expressionsvektoren, die wenigstens ein Bryodin-1-kodierendes Oligonukleotid oder biologisch aktive Fragmente und Derivate davon umfassen, werden ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst. Das Oligonukleotid ist operativ mit einer transkriptionalen und translationalen Kontrollsequenz in den Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung verknüpft. Mit den Plasmiden und Expressionsvektoren transformierte Wirtszellen sind ebenfalls als Teil der vorliegenden Erfindung anzusehen. Die obigen Zusammensetzungen können zur rekombinanten Expression großer Mengen Bryodin-1 oder biologisch aktiver Fragmente oder Derivate durch die transformierten Wirtszellen verwendet werden.
Bryodin-1 (BD1), ein Ribosom-inaktivierendes Protein, wird aus den Wurzeln von Bnonia dioica isoliert. BD1 weist eine Toxizität gegenüber Zellen auf, die derjenigen anderer Pflanzen-Ribosom-inaktivierender Proteine ähnlich ist, was darauf hindeutet, dass es bei der Abtötung von Zellen nützlich sein kann, insbesondere wenn es durch den Liganden eines zellspezifischen Moleküls auf eine definierte Zellpopulation gerichtet wird. Solche Liganden können einen Antikörper oder einen Liganden eines Zellobertlächenrezeptors (d. h. Transferrin, Heregulin und weitere dem Fachmann bekannte) einschließen. BD1 kann auch bei der Konstruktion von Konjugaten oder Fusionsmolekülen, umfassend den Liganden eines zellspezifischen Moleküls und das Toxin, verwendet werden, die bei der Behandlung eines Krankheitszustands nützlich sein können.
Gereinigtes Bryodin-1 wurde sowohl unter reduzierenden als auch nichtreduzierenden Bedingungen als einzelnes Band mit einem Molekulargewicht von ungefähr 29.000 Dalton detektiert. Eine vollständige, hier beschriebene Primärstruktur von BD1 wurde mittels cDNA-Klonierung und Bestimmung einer mutmaßlichen Aminosäuresequenz bestimmt. Die Sequenzanalyse zeigte auf, dass BD1 ein Ribosom-inaktivierendes Protein vom Typ I ist, das eine gewisse Ähnlichkeit mit anderen Ribosom-inaktivierenden Proteinen der Familie Cucurbitaceae, einschließlich Trichosanthin und α-Momorcharin, aufweist (Montecucchi et al., 1989, Int. J. Peptide Protein Res. 33: 263–267), von diesen jedoch verschieden ist. Alle diese Proteine weisen bestimmte gemeinsame Eigenschaften auf, die für Ribosominaktivierende Proteine vom Typ I charakteristisch sind, wie etwa, dass sie eine einzelne Peptidkette umfassen, ein Molekulargewicht zwischen 25 und 30 kDa und einen isoelektrischen Punkt von ungefähr 9,0–10,0 aufweisen (Stirpe und Barbieri, 1986, FEBS Lett. 196: 1–8; Jimenez und Vasquez, D., 1985, Ann. Rev. Microbiol. 39: 649-672).
BD1 kann durch rekombinante DNA-Verfahren oder chemischsynthetische Verfahren hergestellt werden. Um BD1 durch rekombinante Verfahren herzustellen, ist Messenger-RNA (mRNA) zur Herstellung komplementärer DNA (cDNA) aus Zellquellen, die BD1 produzieren, erhältlich; wohingegen genomische Sequenzen für BD1 aus allen Zellen von Bnonia dioica erhältlich sind, unabhängig vom Gewebetyp. Zum Beispiel können die Wurzeln von B. dioica entweder als die Quelle der kodierenden Sequenzen für BD1 und/oder zur Herstellung von cDNA- oder genomischen Bibliotheken verwendet werden. Genetisch manipulierte Mikroorganismen oder mit der gesamten DNA oder RNA aus einer Quelllinie transformierte oder transfizierte Zelllinien können als eine geeignete Quelle von DNA zum Screening verwendet werden.
Sowohl cDNA- als auch genomische Bibliotheken können aus DNA-Fragmenten, die durch im Fachgebiet bekannte Verfahren erzeugt wurden, hergestellt werden. Die für BD1 kodierenden Fragmente können identifiziert werden, indem man die hergestellten Bibliotheken mit einer Nukleotidsonde screent, die eine zu einem Teil der N-terminalen BD1-Aminosäuresequenz (Seq. ID Nr. 2) homologe Aminosäuresequenz kodieren würde. Obwohl Teile der kodierenden Sequenz zur Klonierung und Expression verwendet werden können, können Klone von ganzer Länge, d. h. solche, die die gesamte für BD1 kodierende Region enthalten, zur Expression bevorzugt sein. Zu diesen Zwecken können dem Fachmann bekannte Verfahren zur Isolierung von DNA, Erzeugung geeigneter Fragmente mittels verschiedener Verfahren, zur Konstruktion von Klonen und Bibliotheken sowie zum Screenen von Rekombinanten verwendet werden. Siehe zum Beispiel die in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, NY, beschriebenen Verfahren.
Aufgrund der Degeneration der kodierenden Nukleotidsequenzen können alternative DNA-Sequenzen, die zu dem BD1-Gen analoge Aminosäuresequenzen kodieren, bei der praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung zur Klonierung und Expression von BD1 verwendet werden. Solche Änderungen schließen Deletionen, Additionen oder Substitutionen verschiedener Nukleotidreste ein, woraus eine Sequenz resultiert, die dasselbe oder ein funktional äquivalentes Genprodukt kodiert. Das Genprodukt kann Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb der Sequenz enthalten, die zu einer „stillen Änderung" führen und somit ein bioaktives Produkt produzieren. In diesem Zusammenhang wird Bioaktivität durch die Fähigkeit des Genprodukts, die Proteinsynthese zu inhibieren, gemessen.
Alle Aminosäuresubstitutionen können auf der Basis einer Ähnlichkeit bezüglich der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität/Hydrophilie und/oder der amphipathischen Natur der beteiligten Reste vorgenommen werden. Zum Beispiel schließen negativ geladene Aminosäuren Asparagin- und Glutaminsäure ein; positiv geladene Aminosäuren schließen Lysin und Arginin ein; Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen, die ähnliche Werte der Hydrophilie aufweisen, schließen die folgenden ein: Leucin, Isoleucin, Valin; Glycin, Alanin; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Phenylalanin, Tyrosin.
Um ein biologisch aktives Bryodin 1 zu exprimieren, insertiert man die Bryodin-1-kodierende Nukleotidsequenz oder eine funktional äquivalente Nukleotidsequenz in einen geeigneten Vektor, d. h. einen Vektor, der die zur Transkription und Translation der insertierten kodierenden Sequenz benötigten Elemente enthält. Die BD1-Sequenz kann genetisch modifiziert werden, um die Stabilität, Produktion, Reinigung, Ausbeute oder Toxizität des exprimierten Produkts zu verbessern. Zum Beispiel kann die Expression eines Fusionsproteins oder eines spaltbaren Fusionsproteins, das BD1 und ein heterologes Protein umfasst, durch genetische Manipulation erreicht werden. Solch ein Fusionsprotein kann so gestaltet werden, dass das Fusionsprotein ohne weiteres mittels Affinitätschromatographie isoliert werden kann; zum Beispiel durch Immobilisierung auf einer für das heterologe Protein spezifischen Säule. In den Fällen, in denen eine Spaltstelle zwischen der BD1-Einheit und dem heterologen Protein eingebaut ist, kann das BD1-Protein von der Chromatographiesäule durch Behandlung mit einem geeigneten Enzym oder Mittel, das die Spaltstelle spaltet, freigesetzt werden (siehe zum Beispiel Booth et al., 1988, Immunol. Lett. 19: 65–70; und Gardella et al., 1990, J. Biol. Chem., 265: 15854–15859).
Dem Fachmann bekannte Verfahren können verwendet werden, um Expressionsvektoren, die eine Bryodin-1-kodierende Sequenz und geeignete transkriptionale/translationale Kontrollsignale enthalten, zu konstruieren. Diese Verfahren schließen rekombinante in vitro-DNA-Verfahren, synthetische Verfahren und in vivo-Rekombinations-/genetische Verfahren ein. Siehe zum Beispiel die in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, NY, beschriebenen Verfahren.
Eine Reihe von Wirts-Expressionssystemen kann verwendet werden, um die Bryodin-1-kodierende Sequenz zu exprimieren. Diese schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, Mikroorganismen, wie etwa Bakterien, die mit einem die Bryodin-1-kodierende Sequenz enthaltenden Bakteriophagen-DNA-, Plasmid-DNA- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektor transformiert wurden; Hefe, die mit rekombinanten, die Bryodin-1-kodierende Sequenz enthaltenden Hefeexpressionsvektoren transformiert wurde; Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z. B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) infiziert oder mit rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren, wie etwa Ti-Plasmid, transformiert wurden, die jeweils die Bryodin-1-kodierende Sequenz enthalten, ein. Damit Expressionssysteme von Säugern verwendet werden können, müsste die Ribosom-inaktivierende Aktivität von BD1 bis zur Lysis der Wirtszelle oder bis zur Sekretion von BD1 ins Kulturmedium blockiert oder maskiert werden, um die Wirtszelle vor den Toxin-Wirkungen von BD1 zu schützen, oder eine gegen Bryodin resistente Mutanten-Wirtszelle muss verwendet werden.
In Abhängigkeit vom verwendeten Wirt/Vektor-System kann jedes einer Reihe geeigneter Transkriptions- und Translationselemente in dem Expressionsvektor verwendet werden, einschließlich konstitutiver und induzierbarer Promotoren, Transkriptions-Enhancer-Elemente, Transkriptions-Terminatoren, etc. (siehe zum Beispiel Bitter et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516–544). Wenn man zum Beispiel in bakteriellen Systemen kloniert, können induzierbare Promotoren, wie etwa pL des Bakteriophagen λ; plac, ptrp, ptac (ptrp-lac-Hybrid-Promotor) und dergleichen, verwendet werden. Durch rekombinante DNA- oder synthetische Verfahren produzierte Promotoren können ebenfalls verwendet werden, um eine kontrollierte und effiziente Transkription der insertierten Bryodin-1-kodierenden Sequenz sicherzustellen.
In bakteriellen Systemen kann eine Reihe von Expressionsvektoren vorteilhaft in Abhängigkeit von der für das exprimierte BD1 beabsichtigten Verwendung ausgewählt werden. Wenn zum Beispiel große Mengen an BD1 gewünscht sind, können Vektoren wünschenswert sein, die eine effiziente Expression an Proteinprodukt veranlassen, gegebenenfalls als Fusionsprodukt mit einer hydrophoben Signalsequenz, die das exprimierte Produkt ins Periplasma der Bakterien oder in das Kulturmedium lenkt, woraus das Proteinprodukt leicht gereinigt werden kann. Bestimmte, durch Genmanipulation hergestellte Fusionsproteine mit einer spezifischen Spaltstelle, die bei der Gewinnung des BD1 hilfreich sind, können ebenfalls wünschenswert sein. Solche Vektoren, die einer derartigen Manipulation zugänglich sind, schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Expressionsvektoren der pET-Serien von E. coli ein (Studier et al., 1990, Methods in Enzymol. 185: 60-89).
In Hefe kann eine Reihe von Vektoren verwendet werden, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten. Für eine Übersicht siehe Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 2, 1988, Hg. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Kap. 13; Grant et al., 1987, „Expression and Secretion Vectors for Yeast," in Methods in Enzymol. 153: 516–544; Glover, 1986, DNA Cloning, Bd. II, IRL Press, Wash., D. C., Kap. 3; und Bitter, 1987, „Heterologous Gene Expression in Yeast," in Methods in Enzymol. 152: 673–684. Es kann ein konstitutiver Hefe-Promotor, wie etwa ADH oder Leu2, oder ein induzierbarer Promotor, wie etwa GAL, vennrendet werden („Cloning in Yeast," Kap. 3, R. Rothstein In: DNA Cloning, Bd. 11, A Practical Approach, Hg. D. M. Glover, 1986, IRL Press, Wash. D. C.). Alternativ können Vektoren verwendet werden, die die Integration fremder DNA-Sequenzen in das Hefe-Chromosom fördern.
In Fällen, in denen Pflanzen-Expressionsvektoren verwendet werden, kann die Expression der Bryodin-1-kodierenden Sequenz durch eine Reihe von Promotoren gesteuert werden. Zum Beispiel können virale Promotoren, wie etwa die 35S RNA- und 19S RNA-Promotoren von CaMV (Brisson et al., 1984, Nature 310: 511-514), oder der Mantelprotein-Promotor für TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6: 307–311) verwendet werden. Alternativ können Pflanzen-Promotoren, wie etwa die kleine Untereinheit von RUBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3: 1671–1680; Brogli et al., 1984, Science 224: 838–843); oder Hitzeschock-Promotoren, z. B. Sojabohne hsp17.5-E oder hsp17.3-B (Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 559-565) verwendet werden. Diese Konstrukte können unter Verwendung von Ti-Plasmid, Ri-Plasmid, viraler Pflanzenvektoren, direkter DNA-Transformation, Mikroinjektion, Elektroporation und weiterer dem Fachmann bekannter Verfahren in die Pflanzenzellen eingeführt werden. Siehe zum Beispiel Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Abschnitt VIII, S. 421–463; und Guerson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2. Aufl., Blackie, London, Kap. 7–9.
Weitere Expressionssysteme, wie etwa Wirtszellsysteme von Insekten und Säugern, sind im Fachgebiet bekannt, müssten aber modifiziert oder angepasst werden, um ein toxisches Molekül zu produzieren. Ein möglicher Weg zur Modifikation wäre, wie oben erwähnt, gegen BD1 resistente Mutanten-Zelllinien aus Insekten oder Säugern zu isolieren.
Zusätzlich zur Produktion von Bryodin 1 durch rekombinante DNA-Verfahren kann BD1 auch als Ganzes oder in Teilen durch chemisch-synthetische Festphasen-Verfahren auf Basis der bestimmten Aminosäuresequenz hergestellt werden (siehe Creighton, 1983, Protein Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman und Co., N.Y., S. 50–60; Stewart und Young, 1984, Peptide Synthesis, 2. Aufl. Pierce Chemical Co.). Dieser Weg kann besonders brauchbar bei der Erzeugung von Segmenten oder Fragmenten von BD1 sein, die einer oder mehrerer seiner biologisch aktiven Regionen entsprechen.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann des Weiteren das exprimierte rekombinante Bryodin 1 oder ein funktionales Äquivalent mit einem Liganden für einen Zelloberflächenrezeptor verwendet werden, um das Toxin als ein Toxin-Ligand-Konjugat auf eine spezifische Zellpopulation zu richten.
Der Fachmann versteht, dass der Ausdruck „Ligand" in seiner Tragweite jedes Molekül einschließt, das einen Rezeptor oder eine andere rezeptive Einheit, die mit einer gegebenen Zielzellpopulation assoziiert ist, spezifisch bindet oder mit diesem reaktiv assoziiert oder einen Komplex mit diesem bildet. Dieses zell-reaktive Molekül oder dieser zell-reaktive Ligand, mit dem das Toxin über einen Linker im Konjugat verbunden ist, kann jedes Molekül sein, das die Zellpopulation, die therapeutisch oder in anderer Weise biologisch beeinflusst werden soll, bindet, mit dieser einen Komplex bildet oder mit ihr reagiert. Das zell-reaktive Molekül wirkt derart, dass es das Toxin der bestimmten Zielzellpopulation zuführt, mit der der Ligand reagiert. Solche Moleküle schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, Proteine von großem Molekulargewicht (im Allgemeinen größer als 10.000 Dalton), wie etwa zum Beispiel Antikörper oder Adhäsionsmoleküle, Proteine von geringerem Molekulargewicht (im Allgemeinen weniger als 10.000 Dalton), Polypeptide oder Peptidliganden und Nicht-Peptidyl-Liganden ein.
Die nicht-immunreaktiven Protein-, Polypeptid- oder Peptidliganden, die zur Bildung der erfindungsgemäßen Konjugate verwendbar sind, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Transferrin, epidermale Wachstumsfaktoren, Bombesin, Gastriin, Gastrin-freisetzendes Peptid, von Plättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor, IL-2, IL-6 oder Tumorwachstumsfaktoren, wie etwa TGF-α und TGF-β. Nicht-Peptidyl-Liganden umfassen zum Beispiel Steroide, Kohlenhydrate und Lectine.
Die immunreaktiven Liganden umfassen ein Antigen-erkennendes Immunglobulin (oder einen Antikörper) oder ein Antigen-erkennendes Fragment davon. Besonders bevorzugt sind diejenigen Immunglobuline, die ein zur Internalisierung befähigtes Tumor-assoziiertes Antigen erkennen können. Wie verwendet, kann sich „Immunglobulin" auf jede erkannte Klasse oder Unterklasse von Immunglobulinen, wie etwa IgG, IgA, IgM, IgD oder IgE, beziehen. Bevorzugt sind diejenigen Immunglobuline, die zur Klasse IgG der Immunglobuline gehören. Das Immunglobulin kann von jeder Spezies abstammen. Bevorzugt ist das Immunglobulin jedoch humanen oder murinen Ursprungs. Des Weiteren kann das Immunglobulin polyklonal oder monoklonal, bevorzugt monoklonal, sein.
Wie erwähnt, erkennt der Fachmann, dass die Erfindung auch die Verwendung Antigen-erkennender Immunglobulin-Fragmente umfasst. Solche Immunglobulin-Fragmente schließen zum Beispiel die Fab'-, F(ab')₂-, Fv- oder Fab-Fragmente oder andere Antigen-erkennende Immunglobulin-Fragmente ein. Solche Immunglobulin-Fragmente können zum Beispiel durch proteolytischen Enzymverdau, zum Beispiel durch Pepsin- oder Papain-Verdau, reduzierende Alkylierung oder rekombinante Verfahren hergestellt werden. Die Materialien und Verfahren zur Herstellung von Immunglobulin-Fragmenten sind dem Fachmann bekannt. Siehe allgemein Parham, 1983, J. Immunol. 131: 2895; Lamoye et al., 1983, J. Immunol. Methods 56: 235; Parham, 1982, J. Immunol. Methods 53: 133 und Matthew et al., 1982, J. Immunol. Methods 50: 239.
Das Immunglobulin kann auch „chimär" sein, so wie der Ausdruck im Fachgebiet bekannt ist. Das Immunglobulin kann auch ein „bifunktionaler" oder „Hybrid"-Antikörper sein, das heißt, ein Antikörper, der einen „Arm" mit einer Spezifität für eine antigene Stelle, wie etwa ein Tumor-assoziiertes Antigen, aufweist, während der andere Arm ein davon verschiedenes Ziel erkennt, zum Beispiel ein zweites zelltypspezifisches Rezeptormolekül. In jedem Fall weisen die Hybrid-Antikörper eine duale Spezifität auf, vorzugsweise mit einer oder mehreren für ein Zielantigen spezifischen Bindungsstellen, zum Beispiel ein mit einem Tumor assoziiertes Antigen, ein infektiöser Organismus oder ein anderer Krankheitszustand.
Bifunktionale Antikörper sind zum Beispiel in der europäischen Patentveröffentlichung EPA 0 105 360 beschrieben. Wie erwähnt, können solche Hybrid- oder bifunktionalen Antikörper entweder biologisch mittels Zellfusionsverfahren oder chemisch, insbesondere mit vernetzenden Mitteln oder Disulfidbrücken-bildenden Reagenzien gewonnen werden; sie können ganze Antikörper und/oder Fragmente davon umfassen. Verfahren, um solche Hybrid-Antikörper zu erhalten, sind zum Beispiel in der PCT-Anmeldung W083/03699, veröffentlicht am 27. Oktober 1983, und der Europäischen Patentveröffentlichung EPA 0 217 577, veröffentlicht am B. April 1987, offenbart.
Zusätzlich kann das Immunglobulin ein Einzelketten-Antikörper („SCA") sein. Diese können aus Einzelketten-Fv-Fragmenten („scFv") bestehen (Ward et al., 1989, Nature 341: 544), bei denen die variablen leichten („V_L") und variablen schweren („V_H") Domänen durch eine Peptidbrücke oder durch Disulfidbindungen verbunden sind. Das Immunglobulin kann auch aus einzelnen V_H-Domänen (dAbs), die Antigen-bindende Aktivität besitzen, bestehen. Siehe zum Beispiel Winter und Milstein, 1991, Nature 349: 295 und Glockshaber et al., 1990, Biochemistry 29: 1362. Zusätzlich kann das Immunglobulin aus Disulfid-stabilisierten Fvs bestehen (Brinkman et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 7538.
Eine bevorzugte Ausführungsform eines immunologischen Liganden als Teil eines Ligand/Toxin-Konjugats zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung betrifft einen chimären monoklonalen Antikörper, bevorzugt solche chimären Antikörper, die eine Spezifität für ein Tumor-assoziiertes Antigen aufweisen. Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „chimärer Antikörper" auf einen monoklonalen Antikörper, der eine variable Region, d. h. eine Bindungsregion, aus 1 Quelle oder Spezies und mindestens einen Teil einer konstanten Region, die von einer davon verschiedenen Quelle oder Spezies abstammt, umfasst und der gewöhnlich mittels rekombinanter DNA-Verfahren hergestellt wird. Chimäre Antikörper, die eine murine variable Region und eine humane konstante Region umfassen, sind für bestimmte Anwendungen der vorliegenden Erfindung, insbesondere die Humantherapie besonders bevorzugt. Solche murinen/humanen chimären Antikörper sind das Produkt exprimierter Immunglobulin-Gene, die DNA-Segmente umfassen, die variable Regionen muriner Immunglobuline kodieren, und DNA-Segmente umfassen, die konstante Regionen humaner Immunglobuline kodieren. Weitere Formen „chimäre" Antikörper", die durch die vorliegende Erfindung umfasst werden, sind diejenigen, bei denen die Klasse oder Unterklasse gegenüber derjenigen des ursprünglichen Antikörpers modifiziert oder geändert wurde. Solche „chimären" Antikörper werden auch als „class-switched-Antikörper" bezeichnet. Verfahren zur Herstellung chimärer Antikörper umfassen herkömmliche rekombinante DNA- und Gen-Transfektions-Verfahren, die heutzutage im Fachgebiet bekannt sind. Siehe zum Beispiel Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851; U. S. Patent Nr. 5,202,238 und U. S. Patent Nr. 5,204,244.
Der Ausdruck „chimäre Antikörper" umfasst das Konzept des „humanisierten Antikörpers", das heißt, diejenigen Antikörper, bei denen das Gerüst (framework) oder die „Komplementarität-bestimmenden Regionen" (CDR) modifiziert wurden, so dass sie die CDR eines Immunglobulins unterschiedlicher Spezifität im Vergleich zu derjenigen des Eltern-Immunglobulins umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine murine CDR in die Gerüstregion eines humanen Antikörpers transplantiert, um den „humanisierten" Antikörper herzustellen. Siehe z. B. Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323; und Neuberer et al., 1985, Nature 314: 268. Besonders bevorzugte CDRs entsprechen denjenigen, die Sequenzen repräsentieren, die die oben für chimäre und bifunktionale Antikörper erwähnten Antigene erkennen.
Der Fachmann erkennt, dass ein bifunktionaler chimärer Antikörper hergestellt werden kann, der die Vorteile geringerer Immunogenität des chimären oder humanisierten Antikörpers sowie die Flexibilität, besonders für therapeutische Anwendungen, des oben beschriebenen bifunktionalen Antikörpers aufweisen würde. Solche bifunktional-chimären Antikörper können zum Beispiel durch chemische Synthese unter Verwendung vernetzender Mittel und/oder rekombinanter Verfahren der oben beschriebenen Art hergestellt werden. In keinem Fall sollte die vorliegende Erfindung dahingehend ausgelegt werden, dass sie in ihrer Tragweite durch irgendein bestimmtes Herstellungsverfahren eines Antikörpers limitiert sei, sei es ein bifunktionaler, chimärer, bifunktional-chimärer oder humanisierter Antikörper oder ein Antigen-erkennendes Fragment oder Derivat davon.
Wie oben erwähnt, kann das in der vorliegenden Erfindung verwendete Immunglobulin oder Fragment davon des Weiteren polyklonaler oder monoklonaler Natur sein. Monoklonale Antikörper sind jedoch die bevorzugten Immunglobuline. Die Herstellung solcher polyklonaler oder monoklonaler Antikörper ist dem Fachmann heutzutage bekannt, der vollständig in der Lage ist, brauchbare Immunglobuline, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, herzustellen. Siehe zum Beispiel Kohlen und Milstein, 1975, Nature 256: 495. Zusätzlich sind Hybridome und/oder von solchen Hybridomen produzierte monoklonale Antikörper, die für die Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, öffentlich zugänglich aus Quellen, wie etwa der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, oder kommerziell, zum Beispiel von Boehringer-Mannheim Biochemicals, P. O. Box 50816, Indianapolis, IN 46250.
Ein besonders bevorzugter erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper ist einer, der ein Tumor-assoziiertes Zelloberflächen-Antigen bindet und zur Internalisierung befähigt ist. In einer bestimmten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Toxin mit dem chimären Antikörper BR96 („chiBR96") konjugiert, der in der U. S. Serien-Nr. 07/544,246, eingereicht am 26. Juni 1990; äquivalent zur veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 91/00295, veröffentlicht am 10. Januar 1991, offenbart ist. ChiBR96 ist ein internalisierender muriner/humaner chimärer Antikörper und reagiert mit einem fucosylierten Lewis-Y-Antigen, das von humanen Karzinomzellen, wie etwa denjenigen, die von Brust-, Lungen-, Colon- und Eierstockkarzinomen abstammen, exprimiert wird. Das chimären BR96 exprimierende und als chiBR96 bezeichnete Hybridom wurde am 23. Mai 1990 entsprechend dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection hinterlegt und erhielt die Bezeichnung ATCC HB10460.
Eines der bevorzugten Verfahren zur Herstellung eines Immunotoxins der vorliegenden Erfindung ist die chemische Konjugation des rekombinanten Bryodin-1-Toxins der vorliegenden Erfindung mit dem Liganden, bevorzugt einem monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon, wie oben beschrieben. Dem Fachmann sind viele Verfahren zur chemischen Konjugation bekannt. Siehe zum Beispiel Vitetta at al., 1987, Science 238: 1098; Pastan et al., 1986, Cell 47: 641; und Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47: 5924). Bei diesen Verfahren werden das Toxin und der Antikörper im Allgemeinen durch vernetzende Mittel konjugiert, die eine Disulfidbindung zwischen den zwei Proteinen einführen. Immuntoxine, die mit nichtreduzierbaren Bindungen hergestellt wurden, erwiesen sich durchweg als weniger zytotoxisch als ähnliche Toxine, die durch Disulfidbindungen vernetzt waren.
Ein bevorzugtes Verfahren verwendet N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP) und 2-Iminothiolanhydrochlorid (2IT). Weitere bevorzugte Reagenzien sind Natrium-S-4-succinimidyloxycarbonyl-α-methylbenzylthiosulfat (SMBT) und 2IT oder Succinimidyloxycarbonyl-α-methyl-α(2-pyridyldithio)-toluol und 2IT. Jede Gruppe von Reagenzien führt eine Disulfidbindung zwischen dem Toxin und dem Antikörper ein, die reduzierbar ist, die Bindung ist aber auch gegen Aufbrechen beständig, so dass dem Konjugat Stabilität in vitro und in vivo verliehen wird. Auf Internalisierung in die Lysosomen oder Endosomen durch die Zielzellen hin wird die Bindung reduziert und das Toxin gelangt ins Zytoplasma, bindet den Elongationsfaktor 2 und unterbricht dadurch die Proteinsynthese.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um rekombinante Immunotoxine, insbesondere einkettige Immunotoxine. Diese Moleküle besitzen gegenüber Toxin-Antikörper-Konjugaten (Immunotoxinen) den Vorteil, dass sie leichter hergestellt werden können als die Konjugate und dass homogene Populationen von Toxinmolekülen erzeugt werden, d. h. Einzelpeptide, die aus denselben Aminosäureresten aufgebaut sind.
Die Verfahren zur Klonierung und zum Exprimieren von DNA-Sequenzen, die die einem Einzelketten-Derivat eines Eltern-Antikörpers entsprechenden Aminosäuresequenzen kodieren, sind dem Fachmann bekannt, wie oben diskutiert. Die Nukleotidsequenz von Bryodin 1 wird durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt und verschiedene Verfahren zur Konstruktion rekombinanter Toxinfusionsproteine sind in Pastan und Fitzgerald, 1991, Science 254, 1173; Siegall et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9738; Batra et al., 1991, Mol. Cell Biol. 11: 2200; O'Hare et al., 1990, FEBS Lett. 273: 200; Westby et al., 1992, Bioconj. Chem. 3: 375 beschrieben.
Das erfindungsgemäße rekombinante Ribosom-inaktivierende Toxin Bryodin 1 ist sowohl in vitro als auch in vivo für therapeutische Anwendungen brauchbar, und zwar in seiner isolierten Form wie auch als Ligand-Toxin-Konjugat und als rekombinantes Toxinfusionsprotein. Aus Cucurbitaceae-Pflanzen isolierte Ribosom-inaktivierende Proteine haben unter anderem als Abortiva, Immunmodulatoren, Antitumor- und antivirale Mittel (Ng et al., 1992, Gen. Pharmac. 23: 575–590) oder als ein Antimalariamittel (Amorim et al., 1991, Mem. Insf. Oswaldo Cruz 86: 177) Verwendung gefunden.
Rekombinantes Bryodin 1 ist besonders brauchbar als ein Ligand-Toxin-Konjugat oder ein rekombinantes Toxinfusionsprotein, da BD1 weniger toxisch als viele andere Proteintoxine und Ribosom-inaktivierende Proteine ist, die zur Konstruktion von Immunotoxinen verwendet wurden; es ist besonders wirksam bei der Inhibierung der Proteinsynthese, sobald es sich im Inneren der Zelle befindet. Ligand-Toxin-Konjugate und rekombinante Toxinfusionsproteine können entweder zur in-vivo-Behandlung von Zellen, die dem Körper oder einem Patienten entnommen wurden, verwendet werden, um eine gewünschte Zellpopulation vor Re- Infusion der verbleibenden Zellen in den Patienten zu entfernen oder abzutöten, oder sie können dazu verwendet werden, die rekombinanten Toxinfusionsprodukte direkt dem Patienten zu verabreichen.
Für ex-vivo-Anwendungen kann man Zellen, wie etwa Knochenmark, einem unter Krebs leidenden Patienten entnehmen und das Mark durch Behandlung mit dem Ligand-Toxin-Konjugat oder Fusionsprotein reinigen. Im Anschluss an die Behandlung wird das Mark in den Patienten zurück infundiert (siehe z. B. Ramsay et al., 1988, J. Clin. Immunol. 8: 81–88).
Für in-vivo-Anwendungen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum selektiven Abtöten von Zellen bereit, d. h. von Tumorzellen, die das Antigen, das spezifisch den Liganden oder das funktionale Äquivalent des Ligand-Toxin-Konjugats oder Fusionsmoleküls bindet, exprimieren. Dieses Verfahren umfasst das Umsetzen des rekombinanten Toxin-Konjugats oder Fusionsmoleküls mit den Tumorzellen, indem man einem Lebewesen eine pharmazeutisch wirksame Menge einer Zusammensetzung verabreicht, die mindestens ein erfindungsgemäßes rekombinantes Ligand-Toxin-Konjugat oder Fusionsmolekül enthält.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Lebewesen ein Mensch, ein Pferd, ein Schwein, ein Rind, eine Maus, ein Hund, eine Katze und ein Vogel sein. Weitere warmblütige Tiere sind ebenfalls im Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Die beanspruchte Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Inhibierung der Proliferation von Tumorzellen in Säugern bereit. Dieses Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen der Tumorsäugerzellen mit einer die Proliferation inhibierenden Menge (d. h. einer wirksamen Menge) eines auf einen Tumor gerichteten rekombinanten Toxins, das mit einem für ein Tumor-assoziiertes Antigen spezifischen Liganden verknüpft ist, so dass die Proliferation der Tumorzellen in Säugern inhibiert wird.
Die folgenden Beispiele dienen zur Illustration der vorliegenden Erfindung und dazu, dem durchschnittlichen Fachmann die Durchführung und Verwendung derselben zu erleichtern. Es ist in keiner Weise beabsichtigt, dass die Beispiele den Umfang der Erfindung in irgendeiner anderen Weise limitieren.
Beispiel 1
Reinigung von Bryodin 1 aus Bryonia dioica
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung des Gesamtproteins aus der Wurzel von Bryonia dioica und die Abtrennung der Ribosom-inaktivierenden Proteine einschließlich des neuartigen Proteins Bryodin 1.
Wurzeln von Bnonia dioica (Poyntzfield Herb Nursery, Ross-shire, Schottland) wurden unter Verwendung eines Waring-Mischers in Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 1 Liter PBS: 550 g Wurzelmaterial) gereinigt, geschält, zerkleinert und homogenisiert. Das erhaltene Slurry wurde 16 Stunden bei 4°C gerührt und durch ein Seihtuch geseiht. Nach Entfernung des Pflanzenmaterials wurde das Filtrat 15 Minuten bei 4°C mit 15 × g zentrifugiert, um große Partikel zu entfernen, und dann ein zweites Mal 20 Minuten bei 50 × g zentrifugiert, um einen klaren Überstand zu erhalten. Der Überstand wurde anschließend durch einen sterilen 0,22 Mikrometer-Filter filtriert und gegen 5 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, dialysiert.
Die Pflanzenproteine wurden dann auf Basis ihrer Ladung und Größe unter Verwendung eines fünfschriittigen Verfahrens getrennt. Zunächst wurde der dialysierte Wurzelextrakt auf eine CM-Sepharose-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden), die auf 5 mM Natriumphosphat, pH 6,5 equilibriert war, aufgebracht. Die Proteine wurden unter Verwendung eines Salzgradienten von 0 bis 0,3 M NaCl von der Säule eluiert. Zweitens wurden 4 ml Fraktionen gesammelt und die optische Dichte des Eluats wurde bei 280 nm überwacht (1). Die Chromatographiefraktionen wurden dann mittels Elektrophorese evaluiert. 15 μl Aliquote jeder gesammelten Fraktion wurden zu SDS-PAGE-Probepuffer gegeben, 5 min. bei 100°C gekocht und auf 4–12% SDS-PAGE-Gradientengelen (Laemmili, 1970, Nature 227: 680685) getrennt. Die Gele wurden dann mit Coomassie-Blau angefärbt, um die getrennten Proteine zu markieren (2).
Im dritten Schritt der Reinigung wurden die Fraktionen 9 bis 15, die eine 29 kDa-Protein-Bande enthielten, gepoolt und anschließend auf ein Volumen von weniger als 8 ml unter Verwendung einer Centriprep 10 (Amincon, Bedford, MA) konzentriert. Im vierten Schritt wurde das Konzentrat auf eine Größenausschlusssäule TSK-3000 (TosoHaas, Inc., Philadelphia, PA) aufgebracht und die Pflanzenproteine wurden isokratisch eluiert. 3 ml Fraktionen wurden gesammelt und das Eluat wurde bei 280 nm überwacht (3). Im Anschluss an die Größenausschluss-Chromatographie wurden im fünften Schritt des Reinigungsprozesses die Fraktionen durch SDS-PAGE analysiert, wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass ein 12%SDS-PAGE-Gel verwendet wurde. Die Proteine wurden mittels Färbung durch Coomassie-Blau markiert. Zwei diskrete Proteinbanden, die bei 29 kDa und 27 kDa migrierten, wurden in den Peakfraktionen 58 bis 64 beobachtet (4). Diese Fraktionen wurden getrennt gepoolt, dieses Material wurde zur weiteren Charakterisierung verwendet.
Beispiel 2
N-terminate Aminosäuresequenz-Analyse von Bryodin
In diesem Beispiel wurde die N-terminate Aminosäuresequenz der 29 kDa-Proteine, die in den gepoolten Fraktionen enthalten waren, bestimmt. Die ersten 32 Aminosäurereste der 29 kDa-Protein-Bande wurden eindeutig bestimmt; es wurde gefunden, dass sie mit dem von Stirpe beschriebenen Bryodin (Bryodin 1) identisch waren.
Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde unter Verwendung der folgenden Verfahren, die kurz beschrieben werden, bestimmt. Die Proteinbande wurde einzeln aus den SDS-Polyacrylamidgelen mittels Elektroblotting auf eine Problott-Membran (Applied Biosystems, Foster City, CA) unter Verwendung einer Mini-transblot-Elektrophoresetransferzelle (Bio Rad Laboratories, Richmond, CA) (Matsudaira, 1987, J. Biol. Chem. 262: 10035–10038) gewonnen. Die Membran wurde mit Coomassie-Brilliantblau angefärbt, dann entfärbt, und die 29 kDa-Bande wurde für die nachfolgende aminoterminale Sequenzanalyse ausgeschnitten.
Die Probe wurde in einem gepulsten Flüssigphasen-Proteinsequenzer (Modell 476A, Applied Biosystems), der mit einer vertikalen Querstromreaktionspatrone ausgestattet war, unter Verwendung der vom Hersteller angebotenen Zyklusprogramme sequenziert. Phenylthiohydantoin-Aminosäurederivate wurden durch reversed-phase-HPLC mit einer PTH-C18-Säule (Applied Biosystems) unter Verwendung eines Natriumacetat/Tetrahydrofuran/Acetonitril-Gradienten zur Elution (Tempst und Reviere, 1989, Anal. Biochem. 183: 290–300) analysiert. Reduktion und Quantifizierung der Daten wurden unter Verwendung von Modell-610A-Chromatographie-Analysesoftware (Applied Biosystems) durchgeführt.
Die aminoterminale Aminosäuresequenzierung von BD1 wurde mit 47 pmol (auf Basis der ursprünglichen Ausbeute an identifiziertem Val-1 ), auf eine Problott-Membran „elektrogeblottet", durchgeführt. Eine einzelne Aminosäurese quenz wurde erhalten und die eindeutige Identifizierung der PTH-Aminosäurederivate war bis zum Rest 32 möglich (Seq. I. D. Nr. 1).
Beispiel 3
cDNA-Klonierung von Bryodin 1
In diesem Beispiel wurde die Gesamt-RNA aus Bryonia-dioica-Blättern zur cDNA-Klonierung von Bryodin 1 verwendet. Kurz dargestellt, wurde die Gesamt-RNA aus 2,1 g Blattmaterial unter Verwendung von TRI-Reagenz (Mofecular Research Center, Inc., Cincinnatti, OH) entsprechend den Herstellerangaben extrahiert. Die gefrorenen Blätter wurden pulverisiert, in TRI-Reagenz solubilisiert und homogenisiert. Die RNA wurde mit Chloroform extrahiert, mit Isopropanol präzipitiert und in Ethanol gewaschen. Die resultierende Gesamt-RNA wurde in H₂O resuspendiert, durch Elektrophorese in Formaldehyd-Agarosegelen quantifiziert und analysiert und durch Anfärbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die ungefähre Ausbeute betrug 0,9 mg Gesamt-RNA/g Blattmaterial.
Oligo-(dT)-primed-cDNA (unter Verwendung von Gesamt-RNA als Templat) wurde unter Verwendung der degenerierten Oligonukleotid-Mischungen BD1-p20 (Seq. ID Nr. 3) und BD1-p22 (Seq. ID Nr. 4) mittels PCR amplifiziert, um die exakte BD1-Sequenz zwischen den Aminosäuren 7 und 30 zu isolieren. Die Produkte der PCR-Reaktion wurden in den Vektor pCRII (Invitrogen Corp., San Diego, CA) entsprechend den Herstellerangaben unter Verwendung des TA-Klonierungs-Kits subkloniert. Kurz dargestellt, wurden die PCR-amplifizierten Produkte, enthaltend einzelne 3'-Desoxyadenosine, in den pCRll-Vektor ligiert, der mit 3'dT-Überhängen an der EcoRI-Stelle hergestellt wurde. Das Ligationsprodukt wurde in DH5a E.-coli-Zellen transformiert (Sambrook et al., 1989, Moleculai-Cloning, A Laboraton Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, NY).
Rekombinante Klone wurden auf Basis der Anwesenheit von Insertierungen von 100–120 Basenpaaren (bp), wie durch Agarosegel-Elektrophorese bestimmt (Sambrook et al., siehe oben), zur DNA-Sequenzanalyse ausgewählt. Die DNA-Sequenzierung (Sangen et al., 1977, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 74, 5463) wurde unter Verwendung von Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH) mittels Didesoxynucleotid-Termination durchgeführt. Ein Klon, der die richtige Nukleotidentsprechung zur aminoterminalen Sequenz von BD1 enthielt, wurde nach Sequenzanalyse von 81 einzelnen Klonen identifiziert.
Das 3'-Ende des BD1-Gens wurde mittels 3'-RACE wie folgt amplifiziert: Man befolgte die cDNA-Amplifikation der Gesamt-RNA für den ersten Strang mit dem Oligonukleotid XSC-T17 (Seq. ID Nr. 9), und XSC (Seq. ID Nr. 10) und klonierte in pCRll, wie oben beschrieben. BD1-Sequenzen-enthaltende Klone wurden durch Hybridisierung auf Nylonfiltern selektiert, die mit [³²P]-markiertem BD1-Ex4 (Seq. ID Nr. 6) sondiert wurden, einem Oligonukleotid, das die exakte Nukleotidsequenz der Region des stromabwärts vom PCR-Primer BD1-Ex2 lokalisierten BD1-Gens aufweist. Durch DNA-Sequenzierung wurden zwei Klone identifiziert, die den offenen Leserahmen des BD1-Gens kodierten.
Zur Identifizierung des exakten 5'-Endes des BD1-Gens wurde 5'-RACE unter Verwendung des 5'-RACE-Systems (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) entsprechend den Herstellerangaben durchgeführt. Kurz dargestellt, wurde ein erster Strang cDNA unter Verwendung des Oligonukleotid-Primers BD1-Full (Seq. ID Nr. 7), der einen dCTP-Schwanz aufwies, synthetisiert, der resultierende erste Strang wurde mit den Oligonukleotid-Primern BD1-p2 (Seq. ID Nr. 8, kodiert die Aminosäurereste 26–36) und AP (Seq. ID Nr. 11, kodiert den Poly-G-Adaptor-Primer, der an den Poly-C-Schwanz bindet) PCR-amplifiziert. Die resultierenden amplifizierten DNA-Fragmente wurden, wie oben beschrieben, in das Plasmid pCRII subkloniert. BD1-kodierende Klone wurden durch Hybridisierung auf Nylonfiltern selektiert, die mit [³²P]-markiertem BD1-Ex2 (Seq. ID Nr. 5) sondiert wurden. Zwei positive Klone, die BD1-kodierende cDNA enthielten, pCRII BD1 c1.1 und pCRII BD1 c1.6 wurden zur DNA-Sequenzierung selektiert. Die vollständige, BD1-kodierende DNA-Sequenz ist in 5 gezeigt.
Die bei der cDNA-Klonierung von BD1 verwendeten Oligonukleotide lauteten wie folgt, wobei die Sequenzen in eckigen Klammern die Nukleotiddegeneration kennzeichnen und die Sequenzen in runden Klammern die entsprechenden Aminosäuresequenzen kennzeichnen:
Beispiel 4
Konstruktion der Expressionsplasmide und Expression von rekombinantem BD1
In diesem Beispiel wurden zwei Plasmide (pSE 14.0 und pSE 13.0) konstruiert, die rekombinantes Bryodin 1 kodierten und exprimierten (rBD1 F1 beziehungsweise rBD1 F2). Außerdem wurde in diesem Beispiel durch die Plasmide exprimiertes Bryodin 1 gereinigt und gezeigt, dass es die Proteinsynthese inhibiert.
Kurz dargestellt, wurde pSE 13.0 wie folgt konstruiert. Die durch das Plasmid pCRII BD1 c1.1 kodierte cDNA-Sequenz wurde verwendet, um ein 770 bp DNA-Fragment mit Primer 1
und Primer 2
mittels PCR zu amplifizieren. Der 5'-PCR-Primer (Primer 1) wurde so gestaltet, dass er eine einem ATG-Initionationskodon benachbarte, einzige NcoI-Restriktionsstelle und die ersten 14 Kodons des BD1-Gens kodiert. Der 3'-PCR-Primer (Primer 2) wurde so gestaltet, dass er sich an die letzten 9 Kodons des BD1-Gens, die dem Carboxylterminus des reifen BD1-Proteins entsprechen, anlagert. Der 3'-Primer enthält auch zwei konsekutive Stoppkodons und darauf folgend eine EcoRI-Restriktionsstelle.
Nach PCR-Amplifikation und Verdau mit NcoI und EcoRI wurde das 747 bp-NcoI-EcoRI-Fragment in ein 5465 bp NcoI-EcoRI-Vektorfragment ligiert, das aus dem Plasmid pET22b (Novagen, Madison, WI), das unter der transkriptionalen Kontrolle des T7-Promotors steht, hergestellt wurde. Das Produkt dieser Ligation war ein Zwischenvektor mit der Bezeichnung pSE10.0, der den T7-Promotor, die PeIB-Leadersequenz und die BD1-kodierende cDNA-Sequenz enthielt.
Der Expressionsvektor pSE13.0, enthaltend die BD1-kodierende cDNA-Sequenz ohne die PeIB-Leadersequenz, wurde durch Verdau des Expressionsvektors pSE10.0 mit den Restriktionsenzymen XbaI und NcoI konstruiert. Im Anschluss an den Verdau wurde das 6106 by Fragment mit dem durch Annealing des Primers 3 und Primers 4 gebildeten Oligoduplex ligiert.
Das Plasmid pSE14.0 wurde in ähnlicher Weise wie pSE13.0 konstruiert. Die durch das Plasmid pCRII BD c1.1.1 kodierte cDNA-Sequenz wurde mit Primer 1 (Seq. ID Nr. 12) und Primer 5 PCR-amplifiziert.
Der 3'-Primer (Primer 5) kodiert eine einzige EcoRI-Restriktionsstelle und lagert sich an die letzten 17 Kodons des BD1-Gens an, die dem Carboxylterminus des vollständigen BD1-Proteins entsprechen. Der 3'-Primer enthält auch zwei Stoppkodons vor der EcoRI-Stelle. Nach PCR-Amplifikation und NcoI-EcoRI-Verdau wurde das 807-bp-Fragment in pET22b ligiert, exakt wie für pSE13.0 beschrieben, woraus das Zwischenplasmid pSE11.0 resultierte. Die PeIB-Leadersequenz von pSE11.0 wurde, exakt wie für pSE13.0 beschrieben, entfernt, was das Expressionsplasmid pSE14.0 ergab, das die vollständige BD1-Form (BD1 F1) kodiert.
Die Expression von jedem der Plasmide pSE14.0 und pSE13.0 wurde in Ein-Liter-Kulturen von E. coli BL21 (λDE3), die in mit 50 μg/ml Ampicillin versetzter T-Brühe bis zu A₆₅₀ = 0,6–0,8 gezüchtet wurden, mit Induktion durch IPTG (1 mM) 1,5 Stunden bei 37°C durchgeführt. Zellpellets wurden durch Zentrifugation gesammelt und nach einem von zwei Verfahren weiter verarbeitet. Beim ersten Verfahren wurden die Zellen in 10 mM Tris, pH 7,4, 100 mM KCl, 20 mM EDTA, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 0,05% NP-40 und 5 mg Lysozym/Liter Kultur 30 Minuten auf Eis lysiert. Die Zellsuspensionen wurden anschließend dreimal gefroren/aufgetaut, beschallt und bei 15.000 UPM 30 Minuten zentrifugiert. Beim zweiten Verfahren wurden die Zellpellets in 20% Saccharose, 30 mM Tris NCl, pH 7,5, und 1 mM EDTA 10 min. auf Eis resuspendiert und bei 8.000 UPM 15 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in eiskaltem H₂O 10 min. resuspendiert und wie oben zentrifugiert. Das Pellet (oder die Sphäroplasten) wurden in 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA resuspendiert, beschallt und 45 Minuten bei 30 K zentrifugiert. Die durch die beiden Verfahren gesammelten Pellets wurden anschließend in 7 M Guanidin-HCl, 100 mM Tris, pH 7,4, und 1 mM EDTA 1 Stunde gelöst, beschallt und bei 25 UPM 30 Minuten zentrifugiert.
Das denaturierte rekombinante Bryodin-1(BD1)-Protein, das aus pSE13.0 oder pSE14.0 exprimiert und isoliert wurde, wurde in 0,4 M L-Arginin-PBS und 70 mM Guanidin-HCl bei einer Konzentration von 80 μg/ml Protein bei 4°C > 24 Stunden erneut gefaltet. Das Protein wurde ausgiebig gegen 5 mM NaHP₂O₄ dialysiert und durch CM-Sepharose-(schwacher Kationen-Austausch)-Chromatographie unter Verwendung eines 0–0,3 M NaCl-Gradienten isoliert. Rekombinantes BD1 F1 und BD1 F2 wurden durch SDS-PAGE und Westernblot-Analyse unter Verwendung eines polyklonalen Anti-BD1-Kaninchen-Antikörpers analysiert und mit nativem BD1 verglichen (7 und 8).
Die Aktivität des durch beide Erntemethoden 1 und 2 gereinigten, rekombinanten BD1 wurde in zellfreiem Kaninchen-Retikulozytenassay (Promega Biotec, Madison, WI) getestet, der folgt. Kurz dargestellt, wurden die Toxinproteine in einem Volumen von 25 μl mit Kaninchen-Retikulozytenlysat (70% des Reaktionsvolumens), einer Mischung aus allen Aminosäuren (minus Leucin) bei 1 mM, 0,5 mCi/ml [³H-Leucin] und Brome-Mosaik-Virus-RNA (Shih et al., 1973, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 70: 1799-1803) als Substrat (0,5 μg) gemischt. Die Reaktion wurde 30 min. bei 30°C inkubiert und durch Zugabe von 1 M NaOH, 2% N₂O₂ abgebrochen. Das Translationsprodukt wurde unter Venwendung eiskalter 25%iger Trichloressigsäure (TCA), 2% Casaminosäuren auf Eis 30 min. gefällt. Die radiomarkierten Proteine wurden auf Glasfaserfiltern gesammelt, mit 5% TCA gespült, mit Ethanol gespült, getrocknet und unter Verwendung eines Szintillationszählers quantifiziert.
Durch beide Erntemethoden isoliertes rekombinantes BD1 erwies sich als leistungsstarker Inhibitor der Proteinsynthese und im Wesentlichen äquivalent zur Inhibitionswirkung von nativem BD1, mit EC₅₀-Werten von 3–4 pM (9).
Sequenz-Protokoll

Claims

Isolierte Nukleotidsequenz, die ein Ribosom inaktivierendes Protein aus Bryonia dioica kodiert, wobei das Protein die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 umfaßt; oder ein Komplement der Nukleotidsequenz.
Isolierte Nukleotidsequenz nach Anspruch 1, umfassend die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 von dem Nukleotid mit der Nummer 44 bis zum Nukleotid mit der Nummer 913, oder von dem Nukleotid mit der Nummer 113 bis zum Nukleotid mit der Nummer 913.
Isolierte Nukleotidsequenz, worin die Nukleotidsequenz ein biologisch aktives Fragment des Proteins aus Anspruch 1, welches die Proteinsynthese in vitro inhibiert, kodiert.
Rekombinanter Vektor, umfassend eine Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 4, weiterhin umfassend transkriptionale und translationale Kontrollsequenzen, die mit der Nukleotidsequenz, welche das Ribosom inaktivierende Protein kodiert, operativ verknüpft sind.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 4, wobei der Vektor pSE 14.0 mit der Bezeichnung ATCC 69620 ist.
Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 4 bis 6 transfiziert ist.
Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Bryodin 1, wobei man eine Wirtszelle mit einem eine Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfassenden Expressionsvektor transfiziert, die transfizierten Wirtszellen anzieht, die transfizierten Wirtszellen zur Expression des Bryodin 1 veranlaßt und das exprimierte rekombinante Bryodin 1 isoliert.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Bryodin 1-Ligand-Fusionsproteins, wobei man eine Wirtszelle mit einem Expressionsvektor transfiziert, der eine Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in operativer Verknüpfung mit einer einen Liganden kodierenden Nukleotidsequenz umfasst, die transfizierten Wirtszellen anzieht, die transfizierten Wirtszellen zur Expression des rekombinanten Bryodin 1-Ligand-Fusionsproteins veranlasst, und das exprimierte rekombinante Bryodin 1-Ligand-Fusionsprotein isoliert.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Wirtszelle ein Bakterium, eine Pflanze, eine Hefe oder eine Säugerzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Ligand ein Protein, ein Polypeptid oder ein Peptid-Ligand ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Ligand ein immunreaktiver Ligand, Transferrin, ein epidermaler Wachstumsfaktor, Bombesin, Gastrin, Gastrinfreisetzendes Peptid, von Plättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor, IL-2, IL-6 oder ein Tumorwachstumsfaktor ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der immunreaktive Ligand ein Antigen erkennendes Immunglobulin, oder ein Antigen erkennendes Fragment davon, ein chimärer Antikörper, ein bifunktionaler Antikörper, ein Hybridantikörper oder ein einzelkettiger Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Antigen erkennende Fragment des immunreaktiven Liganden ein Fab'-, F(ab')₂-, Fv- oder Fab-Fragment eines Immunglobulins ist.
Fusionsprotein, wie in einem der Ansprüche 9 bis 14 definiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend wenigstens ein Fusionsprotein nach Anspruch 15, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.