DE69734656T2 - Antivirale variante von ricin-proteinen - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft Proteine mit A- und B-Ketten eines Ricin-ähnlichen Toxins, die durch eine Linker-Sequenz verbunden sind, die durch eine retrovirale Protease spezifisch spaltbar ist, um die aktive A-Kette freizugeben. Die Erfindung betrifft außerdem ein Nukleinsäuremolekül, das das Protein kodiert, und die Expressionsvektoren, die das Nukleinsäuremolekül beinhalten. Außerdem wird die Verwendung des Proteins der Erfindung für die Fertigung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung oder Zerstörung von Säugerzellen bereitgestellt, die mit einem Retrovirus infiziert sind, und einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer HIV-Infektion.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Es ist bekannt, dass Bakterien und Pflanzen zytotoxische Proteine produzieren, die aus einem, zwei oder mehreren Polypeptiden oder Untereinheiten bestehen können. Diese Proteine mit einer einfachen Untereinheit können etwas ungenau als Typ-I-Proteine klassifiziert werden. Viele der Zytotoxine, die Strukturen mit zwei Untereinheiten entwickelt haben, werden als Typ-II-Proteine bezeichnet (Saelinger, C. B. in Trafficking of Bacterial Toxins (eds. Saelinger, C. B.) 1–13 (CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, 1990). Eine Untereinheit, die A-Kette, besitzt die toxische Aktivität, während die zweite Untereinheit, die B-Kette, Zelloberflächen bindet und den Eintritt von Toxin in eine Targetzelle vermittelt. Eine Teilmenge dieser Toxine tötet Targetzellen durch die Inhibition der Proteinbiosynthese. Zum Beispiel inhibieren bakterielle Toxine, wie etwa Diphtherietoxin oder Pseudomonasexotoxin, die Proteinsynthese, indem sie den Elongationsfaktor 2 inaktivieren. Pflanzentoxine wie etwa Ricin arbeiten, indem sie Ribosomen direkt inaktivieren [Olsnes, S. & Phil, A. in Molecular action of toxins and viruses (eds. Cohen, P. & vanHeyningen, S.); 51–105 (Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, 1982].
  • Ricin, das von den Samen der Ricinus communis (Kastorölpflanze) abgeleitet ist, ist das wirksamste pflanzliche Toxin. Es wird geschätzt, dass eine einzige Ricin-A-Kette in der Lage ist, Ribosomen mit einer Rate von 1.500 Ribosomen/Minute zu inaktivieren. Folglich reicht ein einziges Ricinmolekül aus, um eine Zelle zu töten [Olsnes, S. & Phil, A. in Molecular action of toxins and viruses (eds. Cohen, P. & vanHeyningen, S.); 51–105 (Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, 1982]. Das Ricintoxin ist ein glycosyliertes Heterodimer mit A- und B-Kette mit einer Molekularmasse von 30.625 Da bzw. 31.431 Da. Die A-Kette des Ricins hat eine N-Glycosidase-Aktivität und katalysiert die Exzision eines spezifischen Adeninrests von der 28S rRNA der eukaryontischen Ribosomen (Endo, Y; & Tsurugi, K. J. Biol. Chem. 262: 8128 (1987)). Die B-Kette des Ricins, obwohl selbst nicht toxisch, fördert die Toxizität der A-Kette, indem sie an Galactosereste auf der Oberfläche eukaryontischer Zellen bindet und die rezeptorvermittelte Endocytose der Toxinmoleküle stimuliert (Simmons et al. Biol. Chem. 261: 7912 (1986)).
  • Proteintoxine werden anfangs in einer inaktiven Vorläuferform produziert. Ricin wird anfangs als ein einfaches Polypeptid (Präproricin) mit einer N-terminalen Präsequenz von 35 Aminosäuren und 12 Aminosäurelinkern zwischen den A- und B-Ketten produziert. Die Präsequenz wird während der Translokation des Ricin-Vorläufers in das endoplasmatische Retikulum entfernt (Lord, J. M. Eur. J. Biochem. 146: 403–409 (1985) und Lord, J. M. Eur. J. Biochem. 146: 411–416 (1985)). Das Proricin wird dann in spezialisierte Organelle transloziert, genannt Proteinkörper, in dem eine Pflanzenprotease das Protein in einer Linkerregion zwischen den A- und B-Ketten spaltet (Lord, J. M. et al., FASAB Journal 8: 201–208 (1994)). Die beiden Ketten bleiben jedoch durch eine Disulfidbrücke (Cystein 259 in der A-Kette zu Cystein 4 in der B-Kette) kovalent gebunden und reifes Disulfid-gebundenes Ricin wird von den Pflanzenzellen abgesondert. Die A-Kette ist im Proricin inaktiv (O'Hare, M., et al. FEBS Lett. 273: 200–204 (1990)) und sie ist in dem Disulfid-verlinkten reifen Ricin inaktiv (Richardson, P. T., et al. FEBS Lett. 255: 15–20 (1989)). Die Ribosomen des Rizinusstrauchs sind selbst anfällig für die Inaktivierung durch die Ricin-A-Kette; da jedoch keine Galactose auf der Zelloberfläche vorhanden ist, die die B-Ketten-Erkennung erlaubt, kann die A-Kette nicht erneut in die Zelle eindringen. Der genaue Mechanismus der A-Ketten-Freigabe und Aktivierung im Cytoplasma der Targetzelle ist nicht bekannt (Lord, J. M. et al., FASAB Journal 8: 201–208 (1994)). Es ist jedoch bekannt, dass, damit die Aktivierung stattfindet, die Disulfidbindung zwischen den A- und B-Ketten verringert sein muss, und daher die Kopplung zwischen Untereinheiten unterbrochen sein muss.
  • Das Ricingen wurde kloniert und sequenziert, und die Röntgenkristallstrukturen der A- und B-Ketten beschrieben (Rutenber, E., et al. Proteins 10: 240–250 (1991); Weston et al., Mol. Bio. 244.410–422, 1994; Lamb and Lord Eur. J. Biochem. 14: 265 (1985); Hailing, K., et al. Nucleic Acids Res. 13: 8019 (1985)). Aufgrund seiner extremen Toxizität gab es ein großes Interesse an der Erzeugung eines Ricin-basierten Immunotoxins als therapeutischem Wirkstoff zur Zerstörung oder Inhibition von Targetzellen oder Organismen (Vitetta et al., Science 238: 1098–1104 (1987)). Ein Immunotoxin ist ein Konjugat einer spezifischen zellbindenden Komponente, wie etwa einem monoklonalen Antikörper oder Wachstumsfaktor und dem Toxin, in dem die beiden Proteinkomponenten kovalent verlinkt sind. Im Allgemeinen sind die Komponenten chemisch gekoppelt. Die Kopplung kann jedoch auch eine Peptid- oder eine Disulfidbindung sein. Der Antikörper lenkt das Toxin zu Zelltypen, die ein spezifisches Antigen aufweisen und stellt dadurch eine Wirkungsspezifität bereit, die mit dem natürlichen Toxin nicht möglich ist. Immunotoxine wurden sowohl mit dem gesamten Ricinmolekül erzeugt (d.h. beide Ketten) als auch mit der Ricin-A-Kette allein (Spooner et al. Mol. Immunol. 31: 117–125, (1994)).
  • Immunotoxine, die mit dem Ricindimer (IT-Rs) erzeugt wurden, sind potentere Toxine als jene, die nur mit der A-Kette (IT-As) erzeugt wurden. Es wird angenommen, dass die erhöhte Toxizität von IT-Rs der Doppelrolle der B-Ketten zuzuschreiben ist, die darin besteht, an der Zelloberfläche zu binden und die A-Kette zum cytosolischen Kompartiment der Targetzelle zu translozieren (Vitetta et al., Science 238: 1098–1104 (1987); Vitetta & Thorpe Seminars in Cell Biology 2: 47–58 (1991)). Die Gegenwart der B-Kette in diesen Konjugaten fördert jedoch auch den Eintritt des Immunotoxins in Nicht-Targetzellen. Sogar geringe Mengen an B-Kette können die Spezifität der zellbindenden Komponente außer Kraft setzen, da die B-Kette unspezifisch an N-glycosylierte Galactose bindet, die auf den meisten Zellen vorhanden ist. Die Verwendung von IT-As ist spezifischer und sicherer als die Verwendung von IT-Rs. In Abwesenheit der B-Kette verfügt die A-Kette jedoch nur über eine stark verringerte Toxizität.
  • Eine Reihe von Immunotoxinen wurden designed, um Antigene auf den Oberflächen von Tumorzellen zu erkennen. Ein Hauptproblem bei der Verwendung der ITs ist, dass das Targetantigen oftmals auch auf Nicht-Tumorzellen zu finden ist (Vitetta et al., Immunology Today 14: 252–259 (1993)). Außerdem müssen aufgrund der verringerten Potenz von IT-As im Vergleich mit ITRs, den Patienten hohe Dosen von IT-As verabreicht werden. Die hohen Dosen verursachen bei Patienten häufig Immunantworten und die Produktion neutralisierender Antikörper (Vitetta et al., Science 238: 1098–1109 (1987)). IT-As und IT-Rs leiden beide an verringerter Toxizität, da die A-Kette nicht aus dem Konjugat in das Cytoplasma der Targetzelle freigegeben wird.
  • Die Insertion intramolekularer Spaltungsorte zwischen den cytotoxischen und zellbindenden Komponenten eines Toxins kann den Weg, den das natürliche Toxin aktiviert, imitieren. Die europäische Patentanmeldung Nr. 466 222 beschreibt die Verwendung des Mais-abgeleiteten Pro-Proteins, das durch Spaltung mit extrazellulären Blutenzymen in die aktive Form umgewandelt werden kann, wie etwa Faktor Xa, Thrombin oder Kollagenase. Westby et al. (Bioconjugate Chem., 3: 375–381, 1992) dokumentierte Fusionsproteine, die eine spezifische zellbindende Komponente und Proricin mit einem Protease-sensitiven Spaltungsort haben, der für Faktor Xa innerhalb der Linker-Sequenz spezifisch ist. O'Hare et al. (FEBS Lett. 273: 200–204, 1990) beschreiben ebenfalls ein rekombinantes Fusionsprotein von RTA und ein staphylococcales Protein A, verbunden durch einen Trypsinsensitiven Spaltungsort. Angesichts der Prävalenz der extrazellulären Proteasen, die in diesen Ansätzen verwendet werden, verleiht eine solche künstliche Aktivierung des Toxinvorläufers oder Immunotoxins keinen Mechanismus für die intrazelluläre Toxinaktivierung, und die Probleme der Targetspezifität und der nachteiligen immunologischen Reaktionen auf die zellbildende Komponente des Immunotoxins bleiben bestehen.
  • Angesichts der extremen Toxizität von Proteinen wie etwa Ricin, kann die fehlende Spezifität des Immunotoxins ihre Brauchbarkeit als Therapeutika für die Behandlung von Krebs und Infektionskrankheiten stark einschränken. Die Herstellung einer passenden, spezifischen zellbindenden Komponente kann problematisch sein. Zum Beispiel können für die Targetzelle spezifische Antigene nicht verfügbar sein, und viele potentielle Targetzellen und infektiöse Organismen können ihre antigene Zusammensetzung schnell verändern, um eine Immunerkennung zu vermeiden.
  • Das Potential bakterieller und pflanzlicher Toxine zur Inhibition von Säugerretroviren, vorzugsweise AIDS, wurde erforscht. Bakterielle Toxine, wie etwa Pseudomonasexotoxin-A und die Untereinheit A des Diphtherietoxins; doppelkettige, ribosomale, inhibierende pflanzliche Toxine, wie etwa Ricin und einfachkettige ribosomale inhibierende Proteine, wie etwa Trichosanthin und das antivirale Kermesbeer-Protein wurden für die Eliminierung von HIV-infizierten Zellen verwendet (Olson et al. 1991, AIDS Res. und Human Retroviruses 7: 1025–1030). Die hohe Toxizität dieser Toxine für Säugerzellen, in Kombination mit der fehlenden Wirkungsspezifität, stellt ein Hauptproblem für die Entwicklung von Arzneimitteln dar, die Toxine, wie etwa Immunotoxine beinhalten.
  • Immunotoxine werden so designed, dass ihre Wirkungsspezifität nur durch die Antikörperkomponente determiniert ist; Zellen die Antigen aufweisen werden vorzugsweise durch das Arzneimittel zerstört (Pastan et al., Annals New York Academy of Sciences 758: 345–353 (1995)). Das Toxinprotein der Immunotoxin-Konjugate gibt der Therapie keinerlei zusätzliche Wirkungsspezifität; es wird die Zerstörung jeder Zelle bewirken, in die es abgegeben wird.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Die betreffenden Erfinder haben neuartige rekombinante toxische Proteine hergestellt, die für Zellen, die mit Retroviren infiziert sind, spezifisch toxisch sind, und die im Hinblick auf ihre Wirkungsspezifität nicht von einer spezifischen zellbindenden Komponente abhängen.
  • Die rekombinanten Proteine der Erfindung haben eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, die über eine Linker-Sequenz mit einer B-Kette verbunden ist, die innerhalb infizierter Zellen durch eine retrovirale Protease spezifisch spaltbar sein kann, um die toxische A-Kette zu aktivieren.
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine gereinigte und isolierte Nukleinsäure bereit, die eine Nukleotidsequenz besitzt, die für eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins und eine heterloge Linker-Aminosäuresequenz kodiert, die die A- und B-Ketten verbindet. Die Linker-Sequenz ist keine Linker-Sequenz eines Ricin-ähnliches Toxins, sondern vielmehr enthält die heterologe Linker-Sequenz eine Spaltungserkennungssequenz für eine retrovirale Protease. Die A-Kette und oder die B-Kette können eine Kette des Ricins sein.
  • In einer Ausführungsform ist die Spaltungserkennungssequenz die Spaltungserkennungssequenz für eine HIV-Protease. In einer besonderen Ausführungsform umfasst die Linker-Aminosäuresequenz VSQNYPIVQNFN; SKARVLAEAMSN; oder SIRKILFLDGIN. In weiteren besonderen Ausführungsformen hat die Nukleinsäure die in 8 (SEQ ID NO: 23), 9 (SEQ ID NO: 24) oder 10 (SEQ ID NO: 25) gezeigte Nukleotidsequenz.
  • In einer weiteren Ausführungsform, ist die Spaltungserkennungssequenz die Spaltungserkennungssequenz für eine humane T-Zell-Leukämie-Virus-Protease. In einer besonderen Ausführungsform umfasst die Linker-Aminosäuresequenz SAPQVLPVMHPN oder SKTKVLVVQPKN, gespalten durch eine humane T-Zell-Leukämie-Virus-I-(HTLV-I)-Protease; oder, SKTKVLVVQPRN oder STTQCFPILHPN, gespalten durch eine humane T-Zell-Leukämie-Virus-II (HTLV-II)-Protease.
  • Die betreffende Erfindung stellt ferner ein Plasmid bereit, das die Nukleinsäure der Erfindung beinhaltet. In einer Ausführungsform hat das Plasmid die Restriktionsschnittkarte, die in den 1A, 2A, 3A, 16A, 17A, 18A oder 19A gezeigt wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen Baculovirus-Transfervektor bereit, der die Nukleinsäure der Erfindung beinhaltet. In besonderen Ausführungsformen stellt die Erfindung einen Baculovirus-Transfervektor bereit, der die in den 5, 6, 7, 16C, 17C, 18C oder 19C gezeigte Restriktionsschnittkarte, oder die in 11 gezeigte DNA-Sequenz hat.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein rekombinantes Protein bereit, das eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins und eine heterologe Linker-Aminosäuresequenz umfasst, die die A- und B-Ketten verbindet, wobei die Linker-Sequenz eine Spaltungserkennungssequenz für eine retrovirale Protease enthält. Die A-Kette und oder die B-Kette können eine Kette des Ricins sein.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines rekombinanten Proteins der Erfindung bereit, das eine heterologe Linker-Sequenz aufweist, die eine Spaltungserkennungssequenz für die Retrovirus-Protease enthält, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Inhibierung oder Zerstörung von Säugerzellen, die mit einem Retrovirus infiziert sind, der eine Protease aufweist. In einer Ausführungsform ist das Retrovirus HIV.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung eines rekombinanten Proteins der Erfindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung eines mit HIV infizierten Säugers.
  • Außerdem wird ein Verfahren zur Herstellung eines Pharmazeutikums zur Behandlung eines mit einem Retrovirus, der eine Protease besitzt, infizierten Säugers bereitgestellt, umfassend die Schritte des Herstellens einer gereinigten und isolierten Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz besitzt, die für eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins und eine heterologe Linker-Aminosäuresequenz, die die A- und B-Ketten verbindet, kodiert, wobei die Linker-Sequenz eine Spaltungserkennungssequenz für die Protease enthält; Einführen der Nukleinsäure in eine Wirtszelle; Exprimieren der Nukleinsäure in der Wirtszelle, um ein rekombinantes Protein zu erhalten, das eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins und eine heterologe Linker-Aminosäuresequenz, die die A- und B-Ketten verbindet, umfasst, wobei die Linker-Sequenz die Spaltungserkennungssequenz für die Protease enthält; und Suspendieren des Proteins in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Excipienten.
  • In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Herstellung eines Pharmazeutikums zur Behandlung eines mit einem Retrovirus, der eine Protease besitzt, infizierten Säugers bereitgestellt, umfassend die Schritte des Identifizierens einer Spaltungserkennungssequenz für die Protease; Herstellen eines rekombinanten Proteins, das eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins und eine heterloge Linker-Aminosäuresequenz, die die A- und B-Ketten verbindet, umfasst, wobei die Linker-Sequenz die Spaltungserkennungssequenz für die Protease enthält und Suspendieren des Proteins in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Excipienten.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung einer retroviralen Infektion, wie etwa HIV, in einem Säuger bereit, die das rekombinante Protein der Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Excipienten umfasst.
  • Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung eines rekombinanten Proteins der Erfindung, das eine heterologe Linker-Sequenz aufweist, die eine Spaltungserkennungssequenz für eine HTLV-Protease enthält, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Krebszellen, die eine HTLV-Protease enthalten. Die Zusammensetzung kann verwendet werden, um einen Säuger mit humanen T-Zell-Leukämien, an denen ein HTLV beteiligt ist, zu behandeln. Zusammensetzungen für die Behandlung von humanen T-Zell-Leukämien, an denen ein HTLV beteiligt ist, die das rekombinante Protein der Erfindung, das eine heterologe Linker-Sequenz aufweist, die eine Spaltungserkennungssequenz für eine HTLV-Protease enthält, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Excipient umfassen, werden außerdem bereitgestellt.
  • Andere Objekte, Merkmale und Vorteile der betreffenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung offenbar.
  • BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die Erfindung ist unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen besser zu verstehen:
  • 1A fasst die Klonierungsstrategie zusammen, die verwendet wurde, um das pAP-146-Konstrukt zu generieren;
  • 1B zeigt die Nukleotidsequenz der HIV-A-Linkerregion von pAP-146;
  • 2A fasst die Klonierungsstrategie zusammen, die verwendet wurde, um das pAP-147-Konstrukt zu generieren;
  • 2B zeigt die Nukleotidsequenz der HIV-B-Linkerregion von pAP-147;
  • 3A fasst die Klonierungsstrategie zusammen, die verwendet wurde, um das pAP-148-Konstrukt zu generieren;
  • 3B zeigt die Nukleotidsequenz der HIV-H-Linkerregion von pAP-148;
  • 4 zeigt die Aminosäuresequenzen des Wildtyp-Ricin-Linkers, des pAP-146-Linkers, des pAP-147-Linkers und des pAP-148-Linkers;
  • 5 zeigt das Subklonieren der HIV-A-Linkervariante in einen Baculovirus-Transfervektor;
  • 6 zeigt das Subklonieren der HIV-B-Linkervariante in einen Baculovirus-Transfervektor;
  • 7 zeigt das Subklonieren der HIV-H-Linkervariante in einen Baculovirus-Transfervektor;
  • 8 zeigt die DNA-Sequenz des pAP-190-Inserts (SEQ ID NO: 23);
  • 9 zeigt die DNA-Sequenz des pAP-196-Inserts (SEQ ID NO: 24);
  • 10 zeigt die DNA-Sequenz des pAP-197-Inserts (SEQ ID NO: 25);
  • 11 zeigt die DNA-Sequenz des Baculovirus-Transfervektors pVL1393 (SEQ ID NO: 26);
  • 12 ist ein Diagramm des Vektors pSB2;
  • 13 zeigt einen Western Blot einer pAP-190-Proricinvariante;
  • 14 ist ein Blot, der die Spaltung einer pAp-190-Proricinvariante mittels HIV-Protease zeigt;
  • 15 ist ein Blot, der die Aktivierung einer pAp-190-Proricinvariante mittels HIV-Protease zeigt;
  • 16A ist ein Diagramm, das die Klonierungsstrategie zusammenfasst, die verwendet wurde, um das pAP-205-Konstrukt zu generieren;
  • 16B zeigt die Nukleotidsequenz der HTLV-I-A-Linkerregionen von pAP-205;
  • 16C ist ein Diagramm, das das Subklonieren der HTLV-I-A-Linkervariante in einen Baculovirus-Transfervektor zeigt;
  • 16D zeigt die DNA-Sequenz des pAP-206-Inserts, das Ricin und den HTLV-I-A-Linker enthält;
  • 17A ist ein Diagramm, das die Klonierungsstrategie zusammenfasst, die verwendet wurde, um das pAP-207-Konstrukt zu generieren;
  • 17B zeigt die Nukleotidsequenz der HTLV-I-B-Linkerregionen von pAP-207;
  • 17C ist ein Diagramm, das das Subklonieren der HTLV-I-B-Linkervariante in einen Baculovirus-Transfervektor zusammenfasst;
  • 17D zeigt die DNA-Sequenz des pAP-208-Inserts, das Ricin und den HTLV-I-B-Linker enthält;
  • 18A ist ein Diagramm, das die Klonierungsstrategie zusammenfasst, die verwendet wurde, um das pAP-209-Konstrukt zu generieren;
  • 18B zeigt die Nukleotidsequenz der HTLV-II-A-Linkerregionen von pAP-209;
  • 18C ist ein Diagramm, das das Subklonieren der HTLV-II-A-Linkervariante in einen Baculovirus-Transfervektor zusammenfasst;
  • 18D zeigt die DNA-Sequenz des pAP-210-Inserts, das Ricin und den HTLV-II-A-Linker enthält;
  • 19A ist ein Diagramm, das die Klonierungsstrategie zusammenfasst, die verwendet wurde, um das pAP-211-Konstrukt zu generieren;
  • 19B zeigt die Nukleotidsequenz der HTLV-II-B-Linkerregionen von pAP-211;
  • 19C ist ein Diagramm, das das Subklonieren der HTLV-II-B-Linkervariante in einen Baculovirus-Transfervektor zusammenfasst;
  • 19D zeigt die DNA-Sequenz des pAP-212-Inserts, das Ricin und den HTLV-Linker enthält; und
  • 20 zeigt die Aminosäuresequenzen des Wildtyp-Ricin-Linkers und des HTLV-Protease-sensitiven Aminosäurelinkers, der in den Linkern pAP-205 bis pAP-212 enthalten ist.
  • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Nukleinsäuremoleküle der Erfindung
  • Die betreffenden Erfinder haben neuartige gereinigte und isolierte Nukleinsäuremoleküle kloniert und exprimiert, die eine Nukleotidsequenz aufweisen, die für eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins und eine heterloge Linker-Aminosäuresequenz, die die A- und B-Ketten verbindet, kodiert. Die heterologe Linker-Sequenz enthält eine Spaltungserkennungssequenz für eine retrovirale Protease, wie etwa eine Spaltungserkennungssequenz für HIV oder eine humane T-Zell-Leukämie-Virus-Protease.
  • Die Begriffe „isoliert und gereinigt", wie sie hier verwendet werden, betreffen eine Nukleinsäure, die im Wesentlichen frei von zellulärem Material oder Kulturmedium ist, wenn sie mittels rekombinanter DNA-Techniken produziert wird, oder frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, wenn sie chemisch synthetisiert wird. Eine „isolierte und gereinigte" Nukleinsäure ist außerdem im Wesentlichen frei von Sequenzen, die die Nukleinsäure natürlich flankieren (d.h., Sequenzen, die an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure untergebracht sind), aus der die Nukleinsäure abgeleitet ist. Der Begriff „Nukleinsäure" soll DNA und RNA einschließen, wobei sie sowohl doppel- als auch einzelsträngig sein kann.
  • Der Begriff „Linker-Sequenz", wie er hier verwendet wird, betrifft eine interne Aminosäuresequenz innerhalb des Proteins, die für das Nukleinsäuremolekül der Er findung kodiert, das Reste enthält, die die A- und B-Kette verbinden, um damit die A-Kette unfähig machen, ihre toxische Wirkung auszuüben, zum Beispiel indem sie die Translation eines eukaryontischen Ribosoms katalytisch inhibiert. Mit heterolog ist gemeint, dass die Linker-Sequenz keine Sequenz ist, die für eine A- oder B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins oder eines Vorläufers davon, nativ ist. Jedoch können die Linker-Sequenzen vorzugsweise von ähnlicher Länge sein wie die Linker-Sequenzen eines Ricin-ähnlichen Toxins und sollten die Rolle, die die B-Kette bei der Zellbindung und dem Transport in das Cytoplasma spielt, nicht stören. Wenn die Linker-Sequenz gespalten ist, wird die A-Kette aktiv oder toxisch.
  • Das Nukleinsäuremolekül der Erfindung wurde kloniert, indem ein Präproricin-cDNA-Klon (pAP-144) einer ortsgerichteten Mutagenese unterzogen wurde, um eine Serie von Varianten zu generieren, die sich nur in der Sequenz zwischen den A- und B-Ketten unterscheiden (Linkerregion). Oligonukleotide, die den äußersten 5'- und 3'-Enden des Präproricingens entsprechen, wurden synthetisiert und verwendet, um das Gen mittels PCR zu amplifizieren. Bei der Verwendung der cDNA-Sequenz für Präproricin (Lamb et al., Eur. J. Biochem., 145: 266–270, 1985) wurden mehrere Oligonukleotidprimere designed, um die Start- und Stoppcodone des offenen Leserahmens des Präproricins zu flankieren.
  • Die Präproricin-cDNA wurde unter Verwendung des Upstream-Primers Ricin-99 amplifiziert (Ricin-109 kann ebenfalls verwendet werden) und des Downstream-Primers Ricin1729C mit Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs) unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)). Mit der Verwendung des Upstream-Primers Ricin-109 wird der Subklonierungsschritt in den Vektor pSB2 umgangen.
  • Das gereinigte PCR-Fragment, das die Präproricin-cDNA kodiert, wurde dann in ein Eco-RV-verdautes pBluescript-II-SK-Plasmid (Stratagene) ligiert, und verwendet, um kompetente XL1-Blue Zellen (Stratagene) zu transformieren.
  • Das klonierte PCR-Produkt, das das vermutete Präproricingen enthält, wurde mittels DNA-Sequenzierung des gesamten cDNA-Klons (pAP-144) bestätigt. Die Sequenzen und der Ort der Oligonukleotidprimer, die für die Sequenzierung verwendet wurden, werden in Tabelle 1 gezeigt.
  • Der Präproricin-cDNA-Klon (pAP-144) wurde einer ortsgerichteten Mutagenese unterzogen, um eine Serie von Varianten zu generieren, die sich nur in der Sequenz zwischen den A- und B-Ketten unterscheiden (Linkerregion). Die Wildtyp-Präproricin-Linkerregion wurde mit den drei Linker-Sequenzen pAP-146, pAP-147 und pAP-148 ersetzt, die in 4 gezeigt werden. Die Linkerregionen der Varianten kodieren eine HIV-Protease-Spaltungserkennungssequenz (Slalka et al., Cell, 56: 911–913, 1989). Die Mutagenese- und Klonierungsstrategie, die verwendet wurde, um die Linkervarianten pAP-146, pAP-147 und pAP-148 zu generieren, werden in 1A bzw. 1B, 2A bzw. 2B und 3A bzw. 3B zusammengefasst. Der erste Schritt war mit einer DNA-Amplifikation unter Verwendung eines Satzes mutagener Primer (HIVA 1, 2; HIVB 1, 2; HIVH 1, 2) verbunden, in Kombination mit den zwei flankierenden Primern Ricin-99Eco und Ricin1729Xba. Restriktionsverdaute PCR-Fragmente wurden Gel-gereinigt und dann mit PBluescript-SK ligiert, das mit EcoRI und XbaI verdaut worden war. Ligationsreaktionen wurden verwendet, um kompetente XL1-Blue-Zellen (Stratagene) zu transformieren. Rekombinante Klone wurden mittels Restriktionsverdautn von Plasmid Miniprep-DNA identifiziert, und die mutanten Linker-Sequenzen wurden mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • Rekombinante Klone wurden in den Vektor pSB2 subkloniert. Die drei erhaltenen Konstrukte waren pAP-151, pAP-159 und pAP-163, wobei jedes den mutanten Linker aufweist der in pAP-146, pAP-147 bzw. pAP-148 gefunden wurde.
  • Die oben beschriebene Klonierungsstrategie kann auch auf die Herstellung rekombinanter Klone, die eine Spaltungserkennungssequenz für eine humane T-Zell-Leukämie-Virus-Protease enthalten, angewendet werden. Zum Beispiel wurden die rekombinanten Klone pAP-205, pAP-207, pAP-209 und pAP-211 unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens wie dem oben beschriebenen, hergestellt.
  • Das Nukleinsäuremolekül der Erfindung hat Sequenzen, die eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins und eine heterologe Linker-Sequenz, die eine Spaltungserkennungssequenz für eine retrovirale Protease enthält, wie etwa eine HIV-Protease oder eine HTLV-Protease, kodiert. Die Nukleinsäure kann exprimiert werden, um ein rekombinantes Protein bereitzustellen, das eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins und eine heterologe Linker-Sequenz, die eine Spaltungserkennungssequenz für eine retrovirale Protease, wie etwa eine HIV-Protease oder eine HTLV-Protease, enthält.
  • Das Nukleinsäuremolekül kann die A- und/oder B-Kette des Ricins umfassen. Das Ricingen wurde kloniert und sequenziert, und die Röntgenkristallstrukturen der A- und B-Ketten wurden veröffentlicht (Rutenber, E., et al. Proteins 10: 240–250 (1991); Weston et al., Mol. Bio. 244.410–422, 1994; Lamb and Lord Eur. J. Biochem. 14: 265 (1985); Halling, K., et al. Nucleic Acids Res. 13: 8019 (1985)). Es wird ersichtlich, dass die Erfindung Nukleinsäuremoleküle einschließt, die Trunkationen von A- und B-Ketten von Ricin-ähnlichen Proteinen und Analogen und Homologen von A- und B-Ketten von Ricin-ähnlichen Proteinen und Trunkationen davon (d.h. Ricin-ähnliche Proteine), wie hier beschrieben, kodieren. Es ist ferner ersichtlich, dass variante Formen der Nukleinsäuremoleküle der Erfindung, die durch alternatives Splicing einer mRNA entstehen, die einer cDNA der Erfindung entspricht, durch die Erfindung erfasst sind.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine Nukleotidsequenz bereit, die unter Bedingungen hoher Stringenz zu einer Nukleotidsequenz hybridisiert, die A- und/oder B-Ketten eines Ricin-ähnlichen Proteins kodiert. Geeignete Stringenzbedingungen, die die DNA-Hybridisierung fördern, sind den Fachleuten bekannt oder finden sich in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989), 6.3.1–6.3.6. Zum Beispiel kann 6.0 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einer Wäsche von 2.0 × SSC bei 50°C verwendet werden. Die Stringenz kann auf der Basis der im Waschschritt verwendeten Bedingungen ausgewählt werden. Beispielsweise kann die Salzkonzentration im Waschschritt mit einer hohen Stringenz von etwa 0.2 × SSC bei 50°C ausgewählt werden. Zusätzlich kann die Temperatur im Waschschritt unter hohen Stringenzbedingungen bei etwa 65°C liegen.
  • Das Nukleinsäuremolekül kann die A- und/oder B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins umfassen. Verfahren zur Klonierung Ricin-ähnlicher Toxine sind den Fachleuten bekannt und zum Beispiel in EP 466 222 beschrieben. Sequenzen, die Ricin- oder Ricin-ähnliche A- und B-Ketten kodieren, können mittels selektiver Amplifikation einer kodierenden Region erhalten werden, unter Verwendung von Sätzen degenerativer Primer oder Sonden für die selektive Amplifikation der kodierenden Region in einer genomen Bibliothek oder cDNA-Bibliothek. Geeignete Primer können aus der Nukleinsäuresequenz der A- und B- Ketten von Ricin oder von Ricin-ähnlichen Toxinen ausgewählt werden. Außerdem ist es möglich, synthetische Oligonukleotidprimer aus den Nukleotidsequenzen für die Verwendung in der PCR zu designen. Passende Primere können ausgewählt werden aus Sequenzen kodierenden Regionen von Ricin-ähnlichen Proteinen, die stark konserviert sind, wie zum Beispiel in der US-Patentschrift Nr. 5,101,025 und EP 466 222 beschrieben.
  • Eine Nukleinsäure kann unter Verwendung dieser Oligonukleotidprimer und Standard-PCR-Amplifikationstechniken aus einer cDNA oder aus einer genomen DNA amplifiziert sein. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Es wird ersichtlich, dass cDNA aus mRNA hergestellt werden kann, indem gesamte zelluläre mRNA mittels einer Vielzahl von Techniken isoliert wird, zum Beispiel, unter Verwendung des Guanidinium-Thiocyanat-Extraktionsverfahrens von Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294–5299 (1979). Die cDNA wird dann aus der mRNA synthetisiert unter Verwendung der reversen Transkriptase (zum Beispiel, Moloney MLV reverse Transkriptase, erhältlich bei Gibco/BRL, Bethesda, MD., oder AMV reverse Transkriptase, erhältlich bei Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, Florida). Es wird ersichtlich, dass die oben beschriebenen Verfahren verwendet werden können, um die kodierende Sequenz aus Pflanzen, Bakterien oder Pilzen zu erhalten, vorzugsweise aus Pflanzen, die bekannte Ricin-ähnliche Proteine produzieren und auch, um nach der Gegenwart von Genen zu screenen, die bisher noch unbekannte Ricin-ähnliche Proteine kodieren.
  • Eine Sequenz, die eine Spaltungserkennungssequenz für eine retrovirale Protease enthält, kann ausgewählt werden auf der Basis des Retrovirus, das durch das rekombinante Protein targetiert werden soll. Die Spaltungs erkennungssequenz kann ausgewählt werden aus Sequenzen, die bekannt dafür sind, dass sie eine Spaltungserkennungssequenz für die Retrovirus-Protease kodieren. Sequenzen, die Spaltungserkennungssequenzen kodieren, können mittels Testen des Expressionsprodukts der Sequenz auf Anfälligkeit für die Spaltung durch eine retrovirale Protease hin identifiziert werden. Ein Assay zur Identifizierung von Peptiden, die Spaltungserkennungssequenzen für HIV-Protease aufweisen, ist in PCT/US88/01849 beschrieben. Die HIV-Protease ist durch das p17-Gen von HIV kodiert und weist das hochkonservierte Asp-Thr-Gly-Sequenzmerkmal der Aktivstelle der zellulären Aspartylproteasen auf. Die HIV-Protease kann mittels im Fachgebiet bekannter Verfahren hergestellt, und zum Testen vermuteter Spaltungserkennungssequenzen verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Polypeptid, das die vermutete Spaltungserkennungssequenz enthält, mit der Protease inkubiert, und die Menge des Spaltungsprodukts determiniert werden (Dilannit, 1990, J. Biol. Chem. 285: 17345–17354). Substrate für HIV-Proteasen sind in der US-Patentschrift Nr. 5,235,039 beschrieben. Die Erfindung ist nicht auf Proteine beschränkt, die die Spaltungserkennungssequenz für HIV-Proteasen enthalten, sondern schließt Erkennungssequenzen anderer retroviraler Proteasen ein, einschließlich Proteasen von Mitgliedern der Unterfamilien Oncovirinae, Lentivirinae und Spumavirinae, zum Beispiel von HTLV, AMV, RSV, BLV, FeLV und MMTV. Beispiele für retrovirale Proteasen und konservierte Sequenzen davon werden, zum Beispiel, in Katoh et al., (Nature 329: 654–656) bereitgestellt.
  • Eine Sequenz, die eine Spaltungserkennungssequenz für eine HTLV-Protease enthält, kann unter Verwendung der hier beschriebenen herkömmlichen Verfahren ausgewählt werden. Die Herstellung humaner T-Zell-Leukämie-Virus-Proteasen, ihrer Substrate und die Enzymaktivitäts-Assay-Methodik wurden beschrieben von Petit, S. C. et al. (J. Biol. Chem. 266: 14539–14547 (1991)) und Blaha, I. et al. (FEBS Lett. 309: 389–393 (1992)).
  • In einer Ausführungsform ist die Spaltungserkennungssequenz die Spaltungserkennungssequenz für eine HIV-Protease. In einer besonderen Ausführungsform umfasst die Linker-Aminosäuresequenz VSQNYPIVQNFN; SKARVLAEAMSN; oder SIRKILFLDGIN. In weiteren besonderen Ausführungsformen hat die Nukleinsäure, die in 8 (SEQ ID NO: 23), 9 (SEQ ID NO: 24) oder 10 (SEQ ID NO: 25) gezeigte Nukleotidsequenz.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die Spaltungserkennungssequenz die Spaltungserkennungssequenz für eine humane T-Zell-Leukämie-Virus-Protease. In einer besonderen Ausführungsform umfasst die Linker-Aminosäuresequenz SAPQVLPVMHPN oder SKTKVLVVQPKN, gespalten durch eine humane T-Zell-Leukämie-Virus-I-(HTLV-I)-Protease; oder SKTKVLVVQPRN oder STTQCFPILHPN, gespalten durch eine humane T-Zell-Leukämie-Virus-II (HTLV-II)-Protease.
  • Das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kann durch ortsgerichtete Mutagenese hergestellt werden. Zum Beispiel kann der Spaltungsort einer retroviralen Protease mittels ortsgerichteter Mutagenese der homologen Linker-Sequenzen eines Proricin-ähnlichen Toxins hergestellt werden. Verfahren für die Klonierung Proricin-ähnlicher Gene, die eine Linker-Sequenz kodieren, sind in EP 466 222 beschrieben. Ortsgerichtete Mutagene können mittels DNA-Amplifikation der mutagenen Primere in Kombination mit den flankierenden Primeren ausgeführt werden. Passende Verfahren, in denen die mutagenen Primere HIVA1, HIVB1 und HIVH1 verwendet werden, werden in 1A bis 3B und 16A, 16B, 17A, 17B, 18A, 19A und 19B gezeigt.
  • Das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kann auch ein Fusionsprotein kodieren. Eine Sequenz, die eine heterologe Linker-Sequenz kodiert, die eine Spaltungserkennungssequenz für eine retrovirale Protease enthält, kann aus einer cDNA-Bibliothek oder Genombibliothek kloniert werden oder auf der Basis der bekannten Sequenz solcher Spaltungssequenzen chemisch synthetisiert werden. Die heterologe Linker-Sequenz kann dann im Leserahmen mit den Sequenzen, die die A- und B-Ketten des Ricin-ähnlichen Toxins kodieren, für die Expression als Fusionsprotein eingefügt werden. Es wird ersichtlich, dass ein Nukleinsäuremolekül, das ein Fusionsprotein kodiert, eine Sequenz enthalten kann, die eine A-Kette und ein B-Kette des gleichen Ricin-ähnlichen Toxins kodieren kann, oder die kodierten A- und B-Ketten von unterschiedlichen Toxinen stammen können. Zum Beispiel kann die A-Kette von Ricin abgeleitet sein und die B-Kette kann von Abrin abgeleitet sein. Ein Protein kann außerdem mittels chemischer Konjugation der A- und B-Ketten und Linker-Sequenzen unter Verwendung herkömmlicher Kopplungsmittel für kovalente Anheftung hergestellt werden.
  • Ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül der Erfindung, das RNA ist, kann mittels Klonierung einer cDNA isoliert werden, die eine A- und B-Kette und einen Linker in einen geeigneten Vektor kodiert, wodurch es möglich wird, durch Transkription der cDNA, ein RNA-Molekül herzustellen, das ein Protein der Erfindung kodiert. Zum Beispiel kann eine cDNA stromabwärts eines Bakteriophagen-Promoters, (z. B. eines T7-Promoters) in einen Vektor kloniert werden, die cDNA kann in vitro mit T7-Polymerase transkribiert werden, und die resultierende RNA kann mittels Standardtechniken isoliert werden.
  • Rekombinantes Protein der Erfindung
  • Wie vorstehend erwähnt, stellt die Erfindung neuartige rekombinante Proteine bereit, die die A- und B-Ketten eines Ricin-ähnlichen Toxins beinhalten, die durch eine heterologe Linker-Sequenz verbunden sind, die eine Spaltungserkennungssequenz für eine retrovirale Protease, wie etwa eine HIV-Protease oder eine HTLV-Protease enthalten. Es ist ein Vorteil der rekombinanten Proteine der Erfindung, dass sie solange nicht toxisch sind, bis die A-Kette von der B-Kette mittels spezifischer Spaltung des Linkers durch die retrovirale Protease, wie etwa eine HIV-Protease oder eine HTLV-Protease, abgespalten ist. Somit kann das Protein verwendet werden, um Zellen zu targetieren, die mit dem Retrovirus infiziert sind, in Abwesenheit zusätzlicher spezifischer zellbindender Komponenten zur Targetierung infizierter Zellen. Ein weiterer Vorteil ist, dass die retrovirale Protease die heterologen Linker intrazellulär spaltet, und dabei die toxische A-Kette direkt in das Cytoplasma der infizierten Zelle freigibt. In der Folge werden die infizierten Zellen spezifisch targetiert und nicht-infizierte Zellen werden der aktivierten freien A-Kette nicht direkt ausgesetzt.
  • Ricin ist ein von Pflanzen abgeleitetes Ribosominhibierendes Protein, das die Proteinsynthese in eukaryontischen Zellen blockiert. Ricin kann abgeleitet werden von den Samen der Ricinus communis (Kastorölpflanze). Das Ricintoxin ist ein glycosyliertes Heterodimer mit A- und B-Kette mit Molekularmassen von 30.625 Da bzw. 31.431 Da. Die A-Kette von Ricin hat eine N-Glycosidase-Aktivität und katalysiert die Exzision eines spezifischen Adeninrests der 28S rRNA eukaryontischer Ribosomen (Endo, Y; & Tsurugi, K. J. Biol. Chem. 262: 8128 (1987)). Die B-Kette von Ricin, obwohl selbst nicht toxisch, fördert die Toxizität der A-Kette, indem sie an Galactosereste auf der Oberfläche eukaryontischer Zelle bindet und die rezeptorvermittelte Endocy tose der Toxinmoleküle stimuliert (Simmons et al. Biol. Chem. 261: 7912 (1986)).
  • Proteintoxine werden anfangs in einer inaktiven Vorläuferform produziert. Ricin wird anfangs als ein einfaches Polypeptid (Präproricin) mit einer N-terminalen Präsequenz von 35 Aminosäuren und 12 Aminosäurelinkern zwischen den A- und B-Ketten produziert. Die Präsequenz wird während der Translokation des Ricin-Vorläufers in das endoplasmatische Retikulum entfernt (Lord, J. M. Eur. J. Biochem. 146: 403–409 (1985) und Lord, J. M. Eur. J. Biochem. 146: 411–416 (1985)). Das Proricin wird dann in spezialisierte Organellen transloziert, genannt Proteinkörper, in denen eine Pflanzenprotease das Protein in einer Linkerregion zwischen den A- und B-Ketten spaltet (Lord, J. M. et al., FASAB Journal 8: 201–208 (1994)). Die beiden Ketten bleiben jedoch durch eine Disulfidbrücke (Cystein 259 in der A-Kette zu Cystein 4 in der B-Kette) kovalent gebunden, und reifes Disulfid-gebundenes Ricin wird von den Pflanzenzellen abgesondert. Die A-Kette ist in dem Proricin inaktiv (O'Hare, M., et al. FEBS Lett. 273: 200–204 (1990)), und sie ist in dem Disulfid-verlinkten reifen Ricin inaktiv (Richardson, P. T., et al. FEBS Lett. 255: 15–20 (1989)). Die Ribosomen des Rizinusstrauchs sind selbst anfällig für die Inaktivierung durch die Ricin-A-Kette; da jedoch keine Galactose auf der Zelloberfläche vorhanden ist, die die B-Ketten-Erkennung erlaubt, kann die A-Kette nicht erneut in die Zelle eindringen.
  • Ricin-ähnliche Proteine schließen bakterielle, fungale und pflanzliche Toxine ein, die A- und B-Ketten aufweisen und Ribosomen inaktivieren und die Proteinsynthese inhibieren. Die A-Kette ist eine aktive Polypeptid-Untereinheit, die für die pharmakologische Wirkung des Toxins verantwortlich ist. In den meisten Fällen ist die aktive Komponente einer A-Kette ein Enzym. Die B-Kette ist verantwortlich für die Bindung des Toxins an die Zelloberfläche und ist dazu gedacht, den Eintritt der A-Kette in das Cytoplasma der Zelle zu erleichtern. Die A- und B-Ketten in den reifen Toxinen sind durch Disulfidbindungen verbunden. Die Toxine, die Ricin in der Struktur am ähnlichsten sind, sind pflanzliche Toxine, die eine A-Kette und eine B-Kette aufweisen. Beispiele für solche Toxine schließen Abrin ein, das aus den Samen von Abrus precatorius isoliert werden kann, Ricin, das aus den Samen der Riziniusbohnen, Ricinus communis, isoliert werden kann, und Modeccin.
  • Ricin-ähnliche bakterielle Proteine schließen Diphtherietoxin ein, das von Corynebacterium diphtheriae hergestellt wird, Pseudomonasenterotoxin A und Choleratoxin. Es wird ersichtlich, dass der Begriff Ricin-ähnliche Toxine auch die A-Kette jener Toxine einschließen soll, die nur eine A-Kette aufweisen. Die rekombinanten Proteine der Erfindung könnten die A-Kette dieser Toxine, konjugiert zu, oder exprimiert als ein rekombinantes Protein mit der B-Kette eines anderen Toxins einschließen. Beispiele für pflanzliche Toxine, die nur eine A-Kette aufweisen, schließen Trichosanthin, MMC und antivirale Kermesbeer-Proteine, Dianthin 30, Dianthin 32, Crotin II, Curcin II und Weizenkeim-Inhibitor ein. Beispiele für fungale Toxine, die nur eine A-Kette aufweisen, schließen Alpha-sarcin, Restrictocin, Mitogillin, Enomycin, Phenomycin ein. Beispiele für bakterielle Toxine, die nur eine A-Kette aufweisen, schließen Cytotoxin von Shigella dysenteriae und verwandte Shiga-ähnliche Toxine ein. Rekombinantes Trichosanthin und die kodierende Sequenz davon ist in den US-Patentschriften mit den Nr. 5,101,025 und 5,128,460 offenbart.
  • Zusätzlich zu den gesamten B- oder A-Ketten eines Ricin-ähnlichen Toxins, ist ersichtlich, dass das rekombinante Protein der Erfindung nur den Abschnitt der A-Kette enthalten kann, der für die Ausübung seiner cyto toxischen Wirkung notwendig ist. Zum Beispiel können die ersten 30 Aminosäuren der Ricin-A-Kette entfernt werden, was in einer trunkierten A-Kette resultiert, welche die toxische Aktivität bewahrt. Das trunkierte Ricin oder die Ricin-ähnliche A-Kette kann mittels Expression eines trunkierten Gens oder mittels proteolytischem Abbau, zum Beispiel mit Nagarase hergestellt werden (Funmatsu et al., 1970, Jap. J. Med. Sci. Biol. 23: 264–267). In ähnlicher Weise kann das rekombinante Protein der Erfindung nur den Abschnitt der B-Kette enthalten, der für die Galactoseerkennung, die Zellbindung und den Transport in das Cytoplasma der Zelle notwendig ist. Trunkierte B-Ketten werden zum Beispiel in EP 145 111 beschrieben. Die A- und B-Ketten können glycosyliert oder nicht glycosyliert sein. Glycosylierte A- und B-Ketten können mittels Expression in der geeigneten Wirtszelle erhalten werden, die zur Glycosylierung fähig ist. Nicht glycosylierte Ketten können mittels Expression in nicht glycosylierende Wirtszellen oder mittels Behandlung zur Entfernung oder Zerstörung der Kohlenhydrateinheiten erhalten werden.
  • Die Proteine der Erfindung können unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren hergestellt werden. Folglich können die Nukleinsäuremoleküle der betreffenden Erfindung in bekannter Weise in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut werden, der eine gute Expression des Proteins gewährleistet. Mögliche Expressionsvektoren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Cosmide, Plasmide oder modifizierte Viren (z. B. replikationsdefekte Retroviren, Adenoviren und adenoassoziierte Viren), solange der Vektor mit den verwendeten Wirtszellen kompatibel ist. Expressionsvektoren, die „geeignet für die Transformation einer Wirtszelle" sind, bedeutet, dass die Expressionsvektoren ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung und regulatorische Sequenzen enthalten, die auf der Basis der Wirtzellen ausgewählt werden, die für die Expression verwendet werden, welche wirksam mit dem Nukleinsäuremolekül verbunden sind. Wirksam verbunden soll bedeuten, dass die Nukleinsäure mit regulatorischen Sequenzen auf eine Weise verbunden ist, die die Expression der Nukleinsäure ermöglicht.
  • Daher betrachtet die Erfindung einen rekombinanten Expressionsvektor der Erfindung, der ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder ein Fragment davon enthält, und die für die Transkription und Translation der eingefügten Proteinsequenz notwendigen regulatorischen Sequenzen. Passende regulatorische Sequenzen können von einer Vielzahl von Quellen abgeleitet werden, einschließlich bakterieller, fungaler, viraler Gene, Säugetier- oder Insektengene (vgl. zum Beispiel, die regulatorischen Sequenzen, beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Wie nachfolgend diskutiert, ist die Auswahl geeigneter regulatorischer Sequenzen abhängig von den gewählten Wirtszellen und kann von einem Fachmann ohne weiteres erreicht werden. Beispiele für solche regulatorische Sequenzen schließen ein: Einen Transkriptionspromoter und -verstärker oder eine RNA-Polymerase-bindende Sequenz, eine ribosomale Bindungssequenz, einschließlich eines Translationsinitiationssignals. Zusätzlich können, abhängig von der gewählten Wirtszelle und dem verwendeten Vektor, andere Sequenzen, wie etwa ein Replikationsstartpunkt, zusätzliche DNA-Restriktionsorte, Verstärker und Sequenzen, die Transkriptionsinduzierbarkeit verleihen, in den Expressionsvektor eingebaut werden. Es ist ebenfalls ersichtlich, dass die notwendigen regulatorischen Sequenzen von den nativen A- und B-Ketten und/oder deren flankierenden Regionen geliefert werden können.
  • Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können ebenfalls ein selektierbares Markergen enthalten, das die Selektion von Wirtszellen erleichtert, die mit einem rekombinanten Molekül der Erfindung transformiert oder transfiziert sind. Beispiele für selektierbare Markergene sind Gene, die ein Protein wie etwa G418 und Hygromycin kodieren, das Resistenz gegenüber bestimmten Arzneien verleiht, β-Galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase, Glühwürmchen-Luciferase oder ein Immunglobulin oder ein Abschnitt davon, wie etwa den Fc-Abschnitt eines Immunglobulins, vorzugsweise IgG. Die Transkription des selektierbaren Markergens wird durch Veränderungen in der Konzentration des selektierbaren Markerproteins, wie etwa β-Galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase oder Glühwürmchen-Luciferase überwacht. Wenn das selektierbare Markergen ein Protein kodiert, das Antibiotikaresistenz verleiht, wie etwa Neomycin, können resistenztransformante Zellen mit G418 ausgewählt werden. Zellen, die das selektierbare Markergen beinhalten, werden überleben, während andere Zellen sterben. Das macht es möglich, die Expression der rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung zu visualisieren und zu prüfen, und insbesondere, die Wirkung einer Mutation auf Expression und Phänotyp zu determinieren. Es wird ersichtlich, dass die selektierbaren Marker auf einen separaten Vektor der interessierenden Nukleinsäure eingeführt werden können.
  • Die rekombinanten Expressionsvektoren können außerdem Gene enthalten, die einen Fusionsanteil kodieren, welcher die erhöhte Expression des rekombinanten Proteins; erhöhte Löslichkeit des rekombinanten Proteins; und Hilfe bei der Reinigung des rekombinanten Targetproteins bereitstellt, indem sie als Ligand bei der Affinitätsreinigung handeln. Zum Beispiel kann eine proteolytische Spaltungssequenz einem rekombinanten Targetprotein zugefügt werden, um das Separieren des rekombinanten Proteins des Fusionsanteils, anschließend an die Reinigung des Fusionsproteins, zu ermöglichen. Typische Fusionsexpressionsvektoren schließen pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia), pMAL (New England Bi olabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N. J.) ein, die Glutathion-S-transferase (GST), Maltose-E-Bindungsprotein bzw. Protein A zu dem rekombinanten Protein fusionieren.
  • Rekombinante Expressionsvektoren können in die Wirtszellen eingeführt werden, um eine transformante Wirtszelle zu produzieren. Der Begriff „transformante Wirtszelle" soll prokaryontische und eukaryontische Zellen einschließen, die mit einem rekombinanten Expressionsvektor der Erfindung transformiert oder transfiziert wurden. Die Begriffe „transformiert mit", „transfiziert mit", „Transformation" und „Transfektion" sollen die Einführung von Nukleinsäure (z. B. einen Vektor) in eine Zelle durch eine der vielen möglichen im Fachgebiet bekannten Techniken umfassen. Prokaryontische Zellen können mit Nukleinsäure, zum Beispiel, durch Elektroporation oder Calciumchlorid-vermittelte Transformation, transformiert werden. Nukleinsäure kann in Säugerzellen über herkömmliche Techniken eingeführt werden, wie etwa Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, Elektroporation oder Mikroinjektion. Passende Verfahren zur Transformation und Transfektion von Wirtszellen sind zu finden in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)).
  • Geeignete Wirtszellen schließen eine große Vielzahl prokaryontischer und eukaryontischer Wirtszellen ein. Zum Beispiel können die Proteine der Erfindung in bakteriellen Zellen exprimiert werden, wie etwa in E. coli, Insektenzellen (unter Verwendung des Baculovirus), in Hefezellen oder Säugerzellen. Andere passende Wirtszellen sind zu finden in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991).
  • Besonders bevorzugte bakterielle Wirtszellen, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen E. coli, B. subtilis, Salmonella typhimurium und verschieden Arten innerhalb der Gattung Pseudomonas, Streptomycine und Staphylococcus, sowie viele andere bakterielle Arten, die einem Fachmann gut bekannt sind, ein. Geeignete bakterielle Expressionsvektoren umfassen bevorzugt einen Promoter, der in einer Wirtszelle funktioniert, einen oder mehrere selektierbare phänotypische Marker und einen bakteriellen Replikationsstartpunkt. Repräsentative Promoter schließen eine β-Lactamase (Penicillinase) und ein Lactose-Promotersystem (vgl. Chang et al., Nature 275: 615, 1978), den trp-Promoter (Nichols and Yanofsky, Meth in Enzymology 101: 155, 1983) und den tac-Promoter (Russell et al., Gene 20: 231, 1982) ein. Repräsentative selektierbare Marker schließen verschiedene Antibiotikaresistenzmarker ein, wie etwa die Kanamycin- oder Ampicillinresistenzgene. Passende Expressionsvektoren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Bakteriophagen, wie etwa Lambda-Derivate oder Plasmide, wie etwa pBR322 (vgl. Bolivar et al., Gene 2: 9S, 1977), pUC-Plasmide pUC18, pUCl9, pUC118, pUC119 (vgl. Messing, Meth in Enzymology 101: 20–77, 1983 und Vieira and Messing, Gene 19: 259–268, 1982) und pNH8A, pNH16a, pNH18a und Bluescript M13 (Stratagene, La Jolla, Calif.). Typische Fusionsexpressionsvektoren, die verwendet werden können, werden oben diskutiert, z. B. pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N. J.). Beispiele induzierbarer nicht-Fusionsexpressionsvektoren schließen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301–315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) 60–89).
  • Hefe- und Pilzwirtszellen, die für die Durchführung der betreffenden Erfindung geeignet sind, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Saccharomyces cerevisae, die Gattungen Pichia oder Kluyveromyces und verschiedene Arten der Gattung Aspergillus. Beispiele für Vektoren für die Expression in Hefe S. cerivisae schließen pYepSec1 (Baldari. et al., (1987) Embo J. 6: 229–234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113–123), und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) ein. Protokolle für die Transformation von Hefe und Pilzen sind den Fachleuten gut bekannt. (Vgl. Hinnen et al., PNAS USA 75: 1929, 1978; Itoh et al., J. Bacteriology 153: 163, 1983, und Cullen et al. (Bio/Technology 5: 369, 1987).
  • Säugerzellen, die für die Durchführung der betreffenden Erfindung geeignet sind, schließen unter anderem ein: COS (z. B., ATCC-Nr. CRL 1650 oder 1651), BHK (z. B., ATCC-Nr. CRL 6281), CHO (ATCC-Nr. CCL 61), HeLa (z. B., ATCC-Nr. CCL 2), 293 (ATCC-Nr. 1573) und NS-1-Zellen. Passende Expressionsvektoren für die Lenkung der Expression in Säugerzellen schließen im Allgemeinen einen Promoter ein (z. B. abgeleitet von viralem Material, wie etwa Polyoma, Adenovirus 2, Zytomegalie-Virus und Simian-Virus 40), sowie andere transkriptionale und translationale Kontrollsequenzen. Beispiele für Säuger-Expressionsvektoren schließen pCDM8 (Seed, B., (1987) Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987), EMBOJ. 6: 187–195) ein.
  • In Anbetracht der hier bereitgestellten Lehren können Promoter, Terminatoren und Verfahren zur Einführung von Expressionsvektoren eines geeigneten Typs in Pflanzen-, Vogel- und Insektenzellen auch ohne weiteres erreicht werden. Zum Beispiel können innerhalb einer Ausführungsform die Proteine der Erfindung von Pflanzenzellen exprimiert werden (vgl. Sinkar et al., J. Biosci (Bangalore) 11: 47–58, 1987, der die Verwendung von Agrobacterium-Rhizogenes-Vektoren prüft; vgl. auch Zambryski et al., Genetic Engineering, Principles and Methods, Hollaender and Setlow (eds.), Vol. VI, pp. 253–278, Plenum Press, New York, 1984, der die Verwendung von Expressionsvektoren für Pflanzenzellen beschreibt, einschließlich, unter anderem pAS2022, pAS2023 und pAS2034).
  • Insektenzellen, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen Zellen und Zelllinien von Bombyx- oder Spodoteraarten ein. Baculovirusvektoren, die für die Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen verfügbar sind (SF 9-Zellen) schließen die pAc-Serien (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165) und die pVL-Serien (Lucklow, V. A., and Summers, M. D., (1989) Virology 170: 31–39) ein. Einige Baculovirus-Insektenzellen-Expressionssysteme, die für die Expression des rekombinanten Proteins der Erfindung geeignet sind, werden in PCT/US/02442 beschrieben.
  • Alternativ können die Proteine der Erfindung auch in nicht-humanen transgenen Tieren, wie etwa Ratten, Kaninchen, Schafen und Schweinen, exprimiert werden (vgl. Hammer et al. (Nature 315: 680–683, 1985), Palmiter et al. (Science 222: 809–814, 1983), Brinster et al. (Proc Natl. Acad. Sci USA 82: 44384442, 1985), Palmiter and Brinster (Gell. 41: 343–345, 1985) und U.S. Pat. No. 4, 736, 866).
  • Die Proteine der Erfindung können auch mittels chemischer Synthese unter Verwendung von Techniken hergestellt werden, die in der Proteinchemie gut bekannt sind, wie etwa Festphasen-Synthese (Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc. 85: 2149–2154) oder der Synthese in einer homogenen Lösung (Houbenweyl, 1987, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 I and II, Thieme, Stuttgart).
  • Die betreffende Erfindung stellt außerdem Proteine bereit, die eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins und eine heterologe Linker-Aminosäuresequenz umfasst, die die A- und B-Ketten verbindet, wobei die Linker-Sequenz eine Spaltungserkennungssequenz für eine retrovirale Protease, wie etwa eine HIV-Protease oder eine HTLV-Protease, enthält. Ein solches Protein kann auch mit anderen als rekombinanten Mitteln hergestellt werden, zum Beispiel mittels chemischer Synthese oder mittels Konjugation von A- und B-Ketten und einer Linker-Sequenz, die aus ihrer natürlichen pflanzlichen, fungalen oder bakteriellen Quelle isoliert und gereinigt wurden. Solche A- und B-Ketten können so hergestellt werden, dass sie das Glycosylierungsmuster des nativen Ricin-ähnlichen Toxins aufweisen.
  • N-terminale oder C-terminale Fusionsproteine, die das Protein der Erfindung, konjugiert mit anderen Molekülen, wie etwa Proteine, umfassen, können mittels Fusion, durch Rekombinationstechniken hergestellt werden. Die resultierenden Fusionsproteine enthalten ein Protein der Erfindung, das mit dem gewählten Protein oder dem hier beschriebenen Markerprotein fusioniert. Das rekombinante Protein der Erfindung kann auch mit bekannten Techniken an andere Proteine konjugiert werden. Zum Beispiel können die Proteine gekoppelt werden, unter Verwendung heterobifunktionaler Thiol-enthaltender Linker, wie in WO 90/10457 beschrieben, N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio-proprionat) oder N-Succinimidyl-5-thioacetat. Beispiele für Proteine, die verwendet werden können, um Fusionsproteine oder Konjugate herzustellen, einschließlich zellbindender Proteine, wie etwa Immunoglobuline, Hormone, Wachstumsfaktoren, Lektine, Insulin, Low-density-Lipoprotein, Glucagon, Endorphine, Transferrin, Bombesin, Asialoglykoproteinglutathion-S-transferase (GST), Hemagglutinin (HA) und trunkiertes myc.
  • Nützlichkeit der Nukleinsäuremoleküle und Proteine der Erfindung
  • Die Proteine der Erfindung können für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, um Säuger-Krebszellen oder Säugerzellen, die mit einem Retrovirus infiziert sind, spezifisch zu inhibieren oder zu zerstören. Es ist ein Vorteil der rekombinanten Proteine der Erfindung, dass sie eine Spezifität für die infizierten Zellen aufweisen, ohne dafür eine zellbindende Komponente zu brauchen. Die Ricin-ähnliche B-Kette der rekombinanten Proteine erkennt Galactoseanteile auf der Zelloberfläche und gewährleistet, dass das Protein von der Zelle aufgenommen und in das Cytoplasma freigegeben wird. Wenn das Protein in eine nicht infizierte Zelle freigegeben wird, wird die A-Kette inaktiv an die B-Kette gebunden sein. Wenn das Protein jedoch in eine mit einem Retrovirus infizierte Zelle freigegeben wird, die eine HTLV- oder HIV-Protease enthält, wird die retrovirale Protease die Spaltungserkennungssequenz in dem Linker spalten, wobei die toxische A-Kette freigegeben wird.
  • Die Spezifität eines rekombinanten Proteins der Erfindung kann getestet werden, indem das Protein mit der retroviralen Protease, wie etwa HIV-Protease oder HTLV-Protease, behandelt wird, von der angenommen wird, dass sie für die Spaltungserkennungssequenz des Linkers spezifisch ist, und Spaltungsprodukte nachgewiesen werden. Retrovirale Proteasen, wie etwa HIV-Protease oder HTLV-Protease kann von infizierten Zellen isoliert werden oder kann rekombinant hergestellt werden, zum Beispiel, indem dem Verfahren in Darket et al. (1988, J. Biol. Chem. 254: 2307–2312) gefolgt wird. Die Spaltungsprodukte können zum Beispiel auf der Basis von Größe, Antigenität oder Aktivität identifiziert werden. Die Toxizität des rekombinanten Proteins kann untersucht werden, indem die Spaltungsprodukte einem in vitro Translations-Assay in Zell-Lysaten unterzogen werden, zum Beispiel unter Verwendung der Trespenmosaik-Virus-mRNA als Matrize. Die Toxizität der Spaltungsprodukte kann unter Verwendung eines ribosomalen Inaktivierungs-Assays determiniert werden (Westby et al. 1992, Bioconjugate Chem. 3: 377–382). Die Wirkung der Spaltungsprodukte auf die Proteinsynthese kann in standardisierten Assays von In-vitro-Translation gemessen werden, unter Verwendung teilweise definierter zellfreier Systeme, die zum Beispiel aus einer Retikulozyt-Lysatherstellung bestehen als Quelle von Ribosomen und verschiedener essentieller Kofaktoren, wie etwa mRNA-Matrize und Aminosäuren. Die Verwendung radioaktiv markierter Aminosäuren in der Mischung, ermöglicht die quantitative Bestimmung der Inkorporation von freien Aminosäuren-Vorläufern in mit Trichloressigsäure abscheidbaren Proteinen. Kaninchen-Retikulozytlysate können bequem verwendet werden (O'Hare, FEBS Lett. 1990, 273: 200–204).
  • Die Fähigkeit der rekombinanten Proteine der Erfindung, Säugerzellen, die mit einem Retrovirus infiziert sind, wie etwa Krebszellen, an denen HTLV beteiligt ist, oder Zellen, an denen HIV beteiligt ist, selektiv zur inhibieren oder zu zerstören, kann ohne weiteres in vitro unter Verwendung von Säugerzellkulturen getestet werden, die mit dem interessierenden Retrovirus oder Krebslinien infiziert sind. Die selektive Inhibitorwirkung der rekombinanten Proteine der Erfindung kann determiniert werden, indem die selektive Inhibition der viralen Antigenexpression in Säugerzellen oder die selektive Inhibition von zellulärer Proliferation in Krebszellen oder infizierten Zellen demonstriert wird. Zum Beispiel kann ein selektiver Inhibitionseffekt mittels der selektiven Inhibition der viralen Antigenexpression in HIV-infizierten mononukleären Zellen der phagozytischen Linie demonstriert werden; selektive Inhibition der zellulären Proliferation wie gegen Prote in- und DNA-Syntheselevels in behandelten, nicht-infizierten T-Zellen gemessen und; der selektive Verlust der Lebensfähigkeit der T-Zelle. Zum Beispiel können die nachfolgend genannten Kultivierungssysteme verwendet werden, um die Fähigkeit rekombinanter Proteine zu testen, die eine heterloge Linker-Sequenz aufweisen, die eine Spaltungserkennungssequenz für die HIV-Protease enthält, um HIV-infizierte Zellen selektiv zu inhibieren. Der Begriff HIV betrifft einen CD4+-abhängigen humanen Immunschwäche-Retrovirus, wie etwa HIV-1 und Varianten davon.
  • Normale humane T-Lymphocyten können aus peripheren Blutproben hergestellt und in vitro kultiviert werden, wie im Allgemeinen in der US-Patentschrift Nr. 4,869,903 beschrieben. HIV-infizierte Zellen können auch von AIDS-Patienten erhalten werden. Die Zellen können in vitro mit HIV infiziert werden, das von einem AIDS-Patient abgeleitet wurde. Die Toxizität des rekombinanten Proteins für infizierte und nicht infizierte Kulturen kann dann verglichen werden. HIV-infizierte T-Zellen exprimieren ein HIV-Hüllprotein auf der Zelloberfläche, insbesondere die Proteine gp120 und gp41. Die Fähigkeit des rekombinanten Proteins der Erfindung, die Expression dieser viralen Antigene zu inhibieren, kann ein wichtiger Indikator für die Fähigkeit des Proteins sein, die virale Replikation zu inhibieren. Die Toxizität kann auf der Basis von Zelltod oder Lysis oder mittels einer Reduktion in der Expression des HIV-Antigens, wie etwa des Haupt-Hüllproteins gp120 und gp41 oder dem HIV-Kapsidproteinantigen p24, gemessen werden.
  • Der Level dieser Antigene kann in Assays gemessen werden, die markierte Antikörper verwenden, die eine Spezifität für die Antigene aufweisen. Die Inhibition viraler Antigenexpression wurde mit der Inhibition der viralen Replikation korreliert (US-Patentschrift Nr. 4,869,903). Ähnliche Assays können unter Verwendung anderer passender Säugerzellen durchgeführt werden, die in vitro kultiviert werden können und die in der Lage sind, die retrovirale Replikation zu erhalten. Beispiele für passende Zellen schließen mononukleare phagozytische Verzweigungszellen ein. Die Toxizität kann auch auf der Basis einer Abnahme an Proteinsynthese in Targetzellen bewertet werden, die mittels bekannter Techniken, wie etwa der Inkorporation markierter Aminosäuren, wie etwa [3H]-Leucin gemessen werden (O'Hare et al. 1990, FEBS Lett. 273: 200–204). Infizierte Zellen können auch mit radioaktiv markiertem Thymidin gepulst werden, und die Inkorporation der radioaktiven Markierung in zellulärer DNA kann als Maß für die zelluläre Proliferation genommen werden.
  • In den viralen Infektions- und Replikationsmodellen zur Bestätigung der Aktivität rekombinanter Proteine der Erfindung, sind jene Säugerzellen als Wirte passend, die in vitro kultiviert werden können und die in der Lage sind, die virale Replikation zu erhalten. Beispiele für passende Zellen können humane T-Lymphozyten oder mononukleare phagozytische Verzweigungszellen sein. Normale humane T-Lymphocyten können aus pheripheren Blutproben hergestellt und in vitro kultiviert werden, wie im Allgemeinen in der US-Patentschrift Nr. 4,869,903 beschrieben. Viral infizierte Zellen können auch aus dem Blut infizierter Patienten erhalten werden. Die Toxizität des rekombinanten Proteins für infizierte und nicht infizierte Kulturen kann dann verglichen werden. Die Fähigkeit des rekombinanten Proteins der Erfindung, die Expression dieser viralen Antigene zu inhibieren, kann ein wichtiger Indikator für die Fähigkeit des Proteins sein, die virale Replikation zu inhibieren. Der Level dieser Antigene kann in Assays gemessen werden, die markierte Antikörper verwenden, die eine Spezifität für das Antigen aufweisen. Die Inhibition viraler Antigenexpression wurde mit der Inhi bition der viralen Replikation korreliert (US-Patentschrift Nr. 4,869,903).
  • Die Toxizität kann auch auf der Basis einer Abnahme an Proteinsynthese in Targetzellen bewertet werden, die mittels bekannter Techniken, wie etwa der Inkorporation markierter Aminosäuren, wie etwa [3H]-Leucin gemessen werden (O'Hare et al. 1990, FEBS Lett. 273: 200–204). Infizierte Zellen können auch mit radioaktiv markiertem Thymidin gepulst werden und die Inkorporation der radioaktiven Markierung in zellulärer DNA, kann als Maß für die zelluläre Proliferation genommen werden. Zusätzlich kann die Toxizität auf der Basis der Lebensfähigkeit der Zelle gemessen werden, zum Beispiel kann die Lebensfähigkeit infizierter oder nicht infizierter Zellkulturen, die einem rekombinanten Protein ausgesetzt werden, verglichen werden. Die Lebensfähigkeit der Zelle kann mittels bekannter Techniken, wie etwa Trypanblau-Exklusionsassays, bewertet werden.
  • Obwohl die Spezifität der Proteine der Erfindung für retroviral infizierte Zellen durch spezifische Spaltung der Spaltungserkennungssequenz des Linkers vermittelt wird, ist es ersichtlich, dass spezifische zellbindende Komponenten optional an die Proteine der Erfindung konjugiert werden können. Solche zellbindenden Komponenten können als Fusionsproteine mit den Proteinen der Erfindung exprimiert werden, oder die zellbindenden Komponente kann physikalisch oder chemisch an die Proteinkomponente gekoppelt werden. Beispiele für passende zellbindende Komponenten schließen Antikörper für retrovirale Proteine oder für Krebszellproteine ein.
  • Antikörper, die eine Spezifität für ein Zellenoberflächenprotein aufweisen, können mittels herkömmlicher Verfahren hergestellt werden. Ein Säuger, (z. B. eine Maus, ein Hamster oder ein Kaninchen) kann mit einer immunogenen Form des Peptids immunisiert werden, die eine Antikörperantwort in dem Säuger verursacht. Techniken für die Immunogenität auf einem Peptid verleihen, schließen die Konjugation von Trägern oder andere Techniken ein, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Zum Beispiel kann das Peptid in Gegenwart eines Hilfsmittels verabreicht werden. Der Fortschritt der Immunisierung kann mittels Nachweis von Antikörpertitern in Plasma oder Serum überwacht werden. Es können Standard-ELISA-Verfahren oder andere Immunassay-Verfahren mit dem Immunogen als Antigen verwendet werden, um den Antikörperlevel zu bewerten. Nach der Immunisierung können Antiseren erhalten werden, und, wenn gewünscht, polyklonale Antikörper aus den Seren isoliert werden.
  • Um monoklonale Antikörper herzustellen, können Antikörperproduzierende Zellen (Lymphozyten) von einem immunisierten Tier geerntet und mit Myelomzellen mittels Standardverfahren der Somazellfusion fusioniert werden, um diese Zellen so unsterblich zu machen und Hybridomzellen zu liefern. Solche Techniken sind auf dem Fachgebiet gut bekannt, (z. B. die Hybridomtechnik, die ursprünglich. von Kohler und Milstein entwickelt wurde (Nature 256, 495–497 (1975)) sowie andere Techniken, wie etwa die humane B-Zellen-Hybridomtechnik (Kozbor et al., Immunol. Today 4, 72 (1983)), die EBV-Hybridom-Technik, um humane monoklonale Antikörper zu produzieren (Cole et al. Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) Allen R. Bliss, Inc., Seiten 77–96), und Screening kombinatorischer Antikörperbibliotheken (Huse et al., Science 246, 1275 (1989)]. Hybridomzellen können immunochemisch für die Produktion von Antikörpern gescreent werden, die mit dem Peptid spezifisch reaktiv sind, und die monoklonalen Antikörper können isoliert werden.
  • Der Begriff „Antikörper" wie er hier verwendet wird, soll auch Fragmente davon einschließen, die auch spezifisch mit einer Zelloberflächenkomponente reagieren.
  • Antikörper können, unter Verwendung herkömmlicher Techniken fragmentiert werden, und die Fragmente können auf die gleiche Art wie oben beschrieben auf ihren Nutzen hin gescreened werden. Zum Beispiel können F(ab')2-Fragmente mittels Behandlung der Antikörper mit Pepsin generiert werden. Das resultierende F(ab')2-Fragment kann behandelt werden, um Disulfidbrücken zu reduzieren, um Fab'-Fragmente zu produzieren.
  • Chimäre Antikörperderivate, d. h. Antikörpermoleküle, die eine nicht-humane tierische variable Region und eine humane konstante Region kombinieren, werden auch innerhalb des Umfangs der Erfindung betrachtet. Chimäre Antikörpermoleküle können zum Beispiel die antigenbindende Domäne eines Antikörpers einer Maus, einer Ratte oder einer anderen Art, mit humanen konstanten Regionen, einschließen. Herkömmliche Verfahren können verwendet werden, um chimäre Antikörper zu machen, die die Immunoglobulin-variable Region enthalten, die ein Zelloberflächenantigen erkennen (vgl., zum Beispiel, Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 81,6851 (1985); Takeda et al., Nature 314, 452 (1985), Cabilly et al., US-Patentschrift Nr. 4,816,567; Boss et al., US-Patenschrift Nr. 4,816,397; Tanaguchi et al., europäische Patentveröffentlichung EP 171 496 ; europäische Patentveröffentlichung 0 173 494, Vereinigtes Königreich-Patentschrift GB 2177096B ). Es wird erwartet, dass chimäre Antikörper in einem humanen Subjekt weniger immunogen sein werden als die entsprechenden nicht chimären Antikörper.
  • Monoklonale oder chimäre Antikörper, die gegen Zelloberfächen-Komponenten spezifisch reaktiv sind, können weiter humanisiert werden, indem humane Konstantregion-Chimären produziert werden, in denen Teile der variablen Regionen, besonders die konservierten Framework-Regionen der antigen-bindenden Domäne, humanen Ursprungs und nur die hypervariablen Regionen nicht huma nen Ursprungs sind. Solche Immunglobulinmoleküle können mittels Techniken gemacht werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, (z. B. Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 7308–7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4, 7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92, 3–16 (1982)), und PCT Publikation W092/06193 oder EP 0239400 ). Humanisierte Antikörper können auch kommerziell produziert werden (Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britain.)
  • Spezifische Antikörper, oder Antikörperfragmente, die reaktiv gegen Zelloberfächenkomponenten sind, können auch generiert werden, indem Screening-Expressions-Bibliotheken, die Immunglobulingene kodieren, oder Abschnitte davon, in Bakterien mit Zelloberflächenkomponenten exprimiert werden. Zum Beispiel können komplette Fab-Fragmente, VH-Regionen und FV-Regionen in Bakterien exprimiert werden, die die Phage-Expressionbibliothek verwenden (vgl. zum Beispiel Ward et al., Nature 341, 544–546: (1989); Huse et al., Science 246, 1275–1281 (1989); und McCafferty et al. Nature 348, 552–554 (1990)). Alternativ kann eine SCID-hu-Maus, zum Beispiel das Modell, das von Genpharm entwickelt wurde, verwendet werden, um Antikörper, oder Fragmente davon, zu produzieren.
  • Die Proteine der Erfindung können in pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Verabreichung an Subjekte in einer biologisch kompatiblen Form formuliert werden, die für die Verabreichung in vivo passend ist. Mit „biologisch kompatibler Form, die für die Verabreichung in vivo passend ist" ist eine Form der Substanz gemeint, die verabreicht werden soll, in der die therapeutischen Wirkungen alle toxischen Wirkungen überwiegen. Die Substanzen können an lebende Organismen verabreicht werden, einschließlich Menschen und Tiere. Die Verabreichung einer therapeutisch aktiven Menge der pharmazeutischen Zusammensetzungen der betreffenden Erfindung ist als eine wirksame Menge definiert, in Dosierungen und in Zeitabständen, die notwendig sind, um das gewünschte Ergebnis zu erreichen. Zum Beispiel kann eine therapeutisch aktive Menge an der Substanz in Abhängigkeit von Faktoren variieren, wie dem Krankheitszustand, dem Alter, dem Geschlecht und dem Gewicht des Individuums, und der Fähigkeit des Antikörpers, eine gewünschte Antwort in dem Individuum hervorzurufen. Das Dosierungsregime kann angepasst werden, um die optimale therapeutische Antwort bereitzustellen. Zum Beispiel können mehrere verteilte Dosen täglich verabreicht werden, oder die Dosis kann proportional verringert werden, wie durch die Erfordernisse der therapeutischen Situation angezeigt.
  • Die aktive Substanz kann auf bequeme Weise verabreicht werden, wie etwa durch Injektion (subkutan, intravenös usw.), orale Verabreichung, Inhalation, transdermale Applikation oder rektale Administration. In Abhängigkeit vom Verabreichungsweg kann die aktive Substanz in ein Material gehüllt werde, um die Verbindung vor der Wirkung der Enzyme, Säuren und anderen natürlichen Bedingungen zu schützen, die die Verbindung inaktivieren könnten.
  • Die hier beschriebenen Zusammensetzungen können mittels an sich bekannter Verfahren für die Herstellung von pharmazeutisch akzeptablen Zusammensetzungen hergestellt werden, die Subjekten verabreicht werden können, so dass eine wirksame Menge der aktiven Substanz in einer Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Vehikel kombiniert wird. Passende Vehikel werden zum Beispiel beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985). Auf dieser Basis schließen die Zusammensetzungen, wenn auch nicht exklusiv, Lösungen der Substanzen in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Vehikeln oder Verdünnungsmitteln ein, sowie in gepufferten Lösungen, die über den für das physiologische Fluid passenden pH-Wert und iso-osmotischen Wert verfügen.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur Behandlung von Säugern, einschließlich Menschen verwendet werden, die mit einem Retrovirus infiziert sind. Es ist zu erwarten, dass die Zusammensetzungen besonders für die Behandlung von Patienten nützlich sein werden, die mit HIV-1, HIV-2 infiziert sind oder an Krebsformen erkrankt sind, an denen Retroviren beteiligt sind, wie etwa humane T-Zell-Leukämien, an denen ein HTLV beteiligt ist. Die Wirksamkeit von solchen Behandlungen kann überwacht werden, in dem die Gesundheit des behandelten Patienten beurteilt wird, und indem der Prozentsatz an HIV-positiven Monozyten in den behandelten Patienten gemessen wird.
  • Die Dosis des rekombinanten Proteins, die verabreicht werden soll, wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, die in humanen Subjekten ohne weiteres überwacht werden können. Solche Faktoren schließen HIV-Antigen-Level, in Zusammenhang mit HIV-infizierten T-Zellen oder mononukleare Phagozyten; HIV-Antigen-Level im Blutstrom; reverse Transkriptaseaktivität, in Verbindung mit HIV-infizierten T-Zellen oder mononuklearen Phagozyten; und das Verhältnis von lebensfähigen HIV-infizierten Zellen zu nicht infizierten Zellen ein. Zum Beispiel kann der HIV-Antigen-Level im Plasma ohne weiteres unter Verwendung eines ELISA-Assays determiniert werden.
  • Die folgenden nicht limitierenden Beispiele dienen der Illustration der vorliegenden Erfindung:
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • Klonierung und Expression von Proricinvarianten, die durch HIV-Proteasen aktiviert werden
  • Isolierung von Gesamt-RNA
  • Das Präproricingen wurde aus neuem Blattwerk des Rizinusstrauchs kloniert. Gesamt-Messenger-RNA wurde gemäß anerkannter Verfahren isoliert (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Lab Manual (Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, (1989)), und cDNA wurde unter Verwendung reverser Transkriptase generiert.
  • cDNA-Synthese
  • Oligonukleotide, die den äußersten 5'- und 3'-Enden des Präproricingens entsprechen, wurden synthetisiert und verwendet, um das Gen mittels PCR zu amplifizieren. Bei der Verwendung der cDNA-Sequenz für Präproricin (Lamb et al., Eur. J. Biochem., 145: 266–270, 1985) wurden mehrere Oligonukleotidprimere designed, um die Start- und Stoppcodone des offenen Leserahmens des Präproricins zu flankieren. Die Oligonukleotide werden unter Verwendung eines Applied Biosystems Model 392 DNA/RNA-Synthetisierers synthetisiert. Die cDNA des ersten Strangs wurde unter Verwendung des Oligonukleotids Ricin1729C primerunterstützt synthetisiert (Tabelle 1). Drei Mikrogramm Gesamt-RNA wurden als eine Matrize für die Oligo-Ricin1729C primunterstützte Synthese der cDNA verwendet, unter Verwendung von Superscript II Reverse-Transkriptase (BRL), gemäß des Protokolls des Herstellers.
  • DNA-Amplifikation und Klonierung
  • Die cDNA-Synthesereaktion des ersten Strangs wurde als Matrize für die DNA-Amplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet. Die Präproricin-cDNA wurde unter Verwendung des Upstream-Primers Ricin-99 und des Downstream-Primers Ricin1729C mit Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs) unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)) amplifiziert. Die Amplifikation wurde in einem Biometra Thermal-Cycler (TRIO-Thermalcycler) unter Verwendung der folgenden Parameter durchgeführt: Denaturierung bei 95°C für 1 Min., Annealing bei 52°C für 1 Min., und Extension 72°C für 2 Min., (33 Zyklen), gefolgt von einem finalen Extensionszyklus bei 72°C für 10 Min. Das amplifizierte Produkt 1846 bp wurde auf einem Agarosegel fraktioniert (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), und die DNA wurde von der Gelschicht unter Verwendung von Qiaex-Harz (Qiagen), gemäß dem Protokoll des Herstellers, gereinigt. Das gereinigte PCR-Fragment, das die Präproricin-cDNA kodiert, wurde dann (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)) in ein Eco-RV-verdautes pBluescript-II-SK-Plasmid (Stratagene) ligiert und verwendet, um kompetente XL1-Blue-Zellen (Stratagene) zu transformieren. Die positiven Klone wurden mittels Restriktionsverdauung der gereinigten Plasmid-DNA bestätigt. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung eines Qiaprep Spin-Plasmid-Miniprep-Kit (Qiagen) extrahiert.
  • DNA-Sequenzierung
  • Das klonierte PCR-Produkt, das das vermutete Präproricingen enthält, wurde mittels DNA-Sequenzierung des ge samten cDNA-Klons (pAP-144) bestätigt. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung eines automatischen DNA Sequencers von Applied Biosystems 373A ausgeführt und mittels doppelsträngiger Didesoxy-Sequenzierung per Sanger-Verfahren unter Verwendung des Sequenase-Kits (USB) bestätigt. Für die Sequenzierung wurden folgende Oligonukleotidprimer verwendet: Ricin267, Ricin486, Ricin725, Ricin937, Ricin1151, Ricini1399, Ricin1627, T3-Primer (5'AATTAACCCTCACTAAAGGG-3') und T7-Primer (5'GTAATACGACTCACTATAGGGC-3). Die Sequenzdaten wurden unter Verwendung des PC-Gen-Software-Package (intelligenetics) kompiliert und analysiert. Die Sequenzen und der Ort der Oligonukleotidprimere werden in Tabelle 1 gezeigt.
  • Mutagenese der Präproricin-Linker
  • Der Präporicin-cDNA-Klon (pAP-144) wurde einer ortsgerichteten Mutagenese unterzogen, um eine Serie von Varianten zu generieren, die sich nur in der Sequenz zwischen den A- und B-Ketten unterscheiden (Linkerregion). Die Wildtyp-Präproricin-Linkerregion wurde mit den drei Linker-Sequenzen ersetzt, pAP-146, pAP-147 und pAP-148, die in 4 angegeben sind. Die Linkerregionen der Varianten kodieren eine HIV-Protease-Spaltungserkennungssequenz (Slalka et al., Cell, 56: 911–913, 1989). Die Mutagenese und Klonierungsstrategie, die verwendet wurden, um die Linkervariante pAP-146 zu generieren, werden in 1A und 1B zusammengefasst. Die Mutagenese- und Klonierungsstrategie, die verwendet wurde, um die Linkervariante pAP-147 zu generieren, wird in 2A und 2B zusammengefasst. Die Mutagenese- und Klonierungsstrategie, die verwendet wurde, um die Linkervariante pAP-148 zu generieren, wurde in 3A und 3B zusammengefasst. Am ersten Schritt ist eine DNA-Amplifikation unter Verwendung eines Satzes mutagener Primer (HIVA1; HIVB1; HIVH1) in Kombination mit den zwei flankierenden Primer Ricin- 99Eco und Ricin1729Xba beteiligt. Das PCR-Protokoll und die verwendeten Bedingungen waren die gleichen, wie oben beschrieben. Die PCR-Produkte jeder Mutagenesereaktion wurden einer Gelreinigung und dann einer Restriktionsverdauung unterzogen, entweder mit EcoRI für das die A-Kette kodierende Fragment, oder mit XbaI für das die B-Kette kodierende Fragment. Restriktionsverdaute PCR-Fragmente wurden Gel-gereinigt und dann mit Pbluescript-SK ligiert, das mit EcoRI und XbaI verdaut worden war. Ligationsreaktionen wurden verwendet, um kompetente XL1-Blue-Zellen (Stratagene) zu transformieren. Rekombinante Klone wurden mittels Restriktionsverdauen von Plasmid Miniprep-DNA identifiziert, und die mutanten Linker-Sequenzen wurden mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • Subklonierung von Präproricinmutanten in Vektor pSB2
  • Präproricin-cDNA in Gesamtlänge wurde aus den Klonen pAP-146, pAP-147 und pAP-148 kreiert, denen die ersten drei Nukleotide der Signalsequenz fehlen (Halling et al., Nucleic Acids Research, 13: 8019–8033, 1985). Das fehlende ATG (Startcodon) wurde in alle Mutanten mittels ortsgerichteter Mutagnese unter Verwendung der Primer Ricin-109 und Ricin1729C eingeführt. Die DNA-Matrize für jede Reaktion war pAP-146, pAP-147 oder pAP-148, und die PCR-Bedingungen waren die gleichen wie die oben beschriebenen. Die PCR-Produkte wurden Gelgereinigt und dann mit SmaI-verdautem pSB2 ligiert (vgl. 12). Rekombinante Klone wurden mittels Restriktionsverdauen von Plasmid Miniprep-DNA identifiziert, und 5'- und 3'-Verknüpfungen wurden mittels DNA-Sequenzierung bestätigt. Die drei erhaltenen Konstrukte waren pAP-151, pAP-159 und pAP-163, wobei jedes den mutanten Linker aufweist, der in pAP-146, pAP-147 bzw. pAP-148 gefunden wurde.
  • Subklonierung von Präproricinmutanten in Vektor pVL1393
  • Präproricinvarianten wurden in den Baculovirus-Transfervektor pVL1393 subkloniert (PharMingen, Sequenz in 11 gezeigt). Die Subklonierungsstrategie für die HIV-A-Linkervariante ist in 5 zusammengefasst. Die Subklonierungsstrategie für die HIV-B-Linkervariante ist in 6 zusammengefasst. Die Subklonierungsstrategie für die HIV-H-Linkervariante ist in 7 zusammengefasst. Das 1315 bp EcoRI/KpnI-Fragment, das die Ricin-A-Kette kodiert und jeder mutante Linker wurde aus jeder der varianten Klone in pSB2 (pAP-151, pAP-159 und pAP-163) isoliert. Jedes dieser gereinigten Fragmente wurde mit einem 564 bp KpnI/PstI-Fragment ligiert, erhalten aus pAP-144 und mit EcoRI/PstI, gespalten mit pVL1393. Rekombinante Klone wurden mittels Restriktionsverdauen von Plasmid Miniprep-DNA identifiziert und 5'- und 3'-Verknüpfungen wurden mittels DNA-Sequenzierung bestätigt. Die drei erhaltenen Konstrukte waren pAP-190, pAP-196 und pAP-197, wobei jedes den mutanten Linker aufweist der in pAP-146, pAP-147 bzw. pAP-148 gefunden wurde.
  • Isolierung der rekombinanten Baculoviren
  • Die Insektenzellen S. frugiperda (Sf9) und Trichoplusia ni (Tn368 und BTI-TN-581-4 (High Five)) wurden auf einem TMN-FH-Medium gehalten, das mit 10% fötalem Kälberserum angereichert war (Summers et al., A Manual of Methods of Baculovirus Vectors und Insect Cell Culture Procedures, (Texas Agricultural Experiment Station, 1987)). Zwei Mikrogramm rekombinanter pVL1393 DNA (pAP-190, pAP-196, oder pAP-197) wurden mit 0,5 Mikrogramm BaculoGold AcNPV DNA (Pharmingen) in 2 × 106 Tn368 Insektenzellen kotransfiziert, gemäß dem Protokoll des Herstellers (Gruenwald et al., Baculovirus Expression Vector System: Procedures und Methods Manual, 2nd Edition, (San Diego, CA, 1993)). Am Tag 5 nach der Transfektion wurden die Medien zentrifugiert, und die Überstände wurden in Grenzwert-Verdünnungs-Assays mit Tn368-Zellen getestet (Summers et al., A Manual of Methods of Baculovirus Vectors und Insect Cell Culture Procedures, (Texas Agricultural Experiment Station, 1987)). Dann wurden die rekombinanten Viren in den Überständen amplifiziert, indem Tn368-Zellen bei einer Infektionsmultiplizität (moi) von 0,1 infiziert wurden, gefolgt von der Sammlung der Überstände an Tag 7. Insgesamt wurden drei Amplifikationsrunden für jede Rekombinante gemäß anerkannter Verfahren durchgeführt (Summers et al., A Manual of Methods of Baculovirus Vectors und Insect Cell Culture Procedures, (Texas Agricultural Experiment Station, 1987 und Gruenwald et al., Baculovirus Expression Vector System: Procedures and Methods Manual, 2nd Edition, (San Diego, CA, (1993)).
  • Expression von mutantem Proricin
  • Rekombinante Baculoviren (pAP-190baculo, pAP-196baculo und pAP-197-baculo) wurden verwendet, um 2 × 105 Tn368- oder sf9-Zellen mit einer moi von 5 in EX-CELL400-Medien (JRH Biosciences) mit 25 mM α-Lactose in Schüttelkolben zu infizieren. Medien-Überstände, die mutante Proricine enthalten, wurden am 6. Tag nach der Infektion gesammelt.
  • Reinigung von mutantem Proricin
  • Medien-Überstände wurden bei 100.000 g 1 Stunde lang ultrazentrifugiert. Nach der Zugabe von 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid wurden die Überstände unter Verwendung einer Amicon 8050 Ultrafiltrationszelle, die mit einer Diaflo-XM50-Membran ausgerüstet war, konzentriert. Die Überstände wurden dann ausgiebig gegen 137 mN NaCl, 2,2 mM KCl, 2,6 mM KH2PO4 und 8,6 mM Na2HPO4, pH-Wert 7,4, das 1 mM Dithiothreitol (Dialysepuffer) enthielt, dialysiert. Rekombinante Proricinpro teine wurden mittels Affinitätschromatographie gereinigt, unter Verwendung von Lactose-Agarose (Sigma), wie zuvor für die rekombinante Ricin-β-Kette beschrieben (Ferrini et al., Eur. J. Biochem., 233: 772–777, 1995). Die Fraktionen, die das rekombinante Proricin enthielten, wurden unter Verwendung von SDS/PAGE, (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) und mittels Western-Blot-Analyse, unter Verwendung von Anti-Ricin-Antikörpern (Sigma) identifiziert.
  • In-Vitro-HIV-Proteaseverdauung von Proricinvarianten
  • Affinitätsgereinigtes mutantes Proricin wurde mit HIV-Protease behandelt, um die spezifische Spaltung in der Linkerregion zu bestätigen. Die Proricinvarianten wurden aus der Lactose-Agarose-Matrix im Protease-Verdauungspuffer elutiert (50 mM NaCl, 50 mM Na-Acetat, pH-Wert 5,5, 1 mM Dithiothreitol), das 100 mM Lactose enthält. Proricinsubstrat wurde dann bei 37°C für 60 Minuten mit 400 ng/ml rekombinanter HIV-Protease (BACHEM Biosciences Inc.) inkubiert. Die Spaltungsprodukte von Proricin (Ricin-A- und B-Ketten) wurden unter Verwendung von SDS/PAGE (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed., Cold Spring Harbor Press, 1989) gefolgt von Western-Blot-Analyse, unter Verwendung von Anti-ricin-Antikörpern (Sigma) identifiziert.
  • In-Vitro-Translationsassay
  • Die Aktivität der Protease-behandelten Proricinvarianten wurde unter Verwendung eines Kaninchen-Retikulozytlysats in einem nicht radioaktiven (Amersham, ECL-System) In-vitro-Translationsassay überwacht. Protease-behandeltes Proricin wurde einer Standard-50 μl-Translations-Reaktionsmischung zugefügt, die Trespenmosaik-Virus-mRNA als Matrize enthält (gemäß dem Protokoll des Herstellers). Aktive Ricinvarianten inhibieren die In-vitro-Translationreaktion, indem Ribosomen inaktiviert werden. Folglich wurden in Gegenwart einer aktiven Ricinvariante keine viralen Proteine synthetisiert.
  • BEISPIEL 2
  • Ernten und Reinigen von Proricinvarianten mittels Affinitätssäule
  • Es wurden drei Tage nach der Infektion Proteinproben geerntet. Die Zellen wurden entfernt, indem die Medien bei 1465 g 10 Minuten lang unter Verwendung eines SLA-1500 (Sorvall) Zentrifugenrotors zentrifugiert wurden. Der Überstand wurde weiter geklärt, indem er bei 7970 g fünfzehn Minuten lang zentrifugiert wurde. Der Proteaseinhibitor Phenylmethylsulfonylfluorid (Sigma) wurde mit einer Endkonzentration von 1% zugefügt. Die Proben wurden konzentriert (fünffach) und (vier Mal fünffach) in Dialysepuffer (1 × Baculopuffer (8,6 mM Na2HPO4, 2,6 mM KH2PO4, 137 mM NaCl und 2,6 mM KCl, pH-Wert 7,4), der 2,5 mM Lactose und 0,02% NaN3) enthielt, unter Verwendung eines MINITAN-Konzentrators (Millipore) mit 30 kDa NMWL-Platten dialysiert. Dithiothreitol (DTT) wurde dann in einer Endkonzentration von 1 mM zugefügt, und die Proben wurden bei 37.000 g eine Stunde lang zentrifugiert.
  • Nach dem Zentrifugieren wurde ein Dialysepuffer, der 1 mM DTT enthält, den Proben bis zu einem Endvolumen von 500 ml zugefügt. Die Proben wurden entgast und über Nacht bei 4°C über eine ASF-Sepharose-Affinitätssäule (hergestellt gemäß dem Pharmacia-Protokoll) in einer 10 mL-Chromatographiesäule (Biorad) gegeben. Die Säule wurde mit 300 ml Waschpuffer (100 mM NaOAc, pH-Wert 5,2, 1 mM DTT und 0,02% NaN3) gewaschen. Die Elution der Proricinvariante wurde ausgeführt, indem 500 ml des Elutionspuffers darübergegeben wurden (100 mM NaOAc, pH-Wert 5,2, 250 mM-Lactose und 5 mM DTT). Das Eluat wurde konzentriert unter Verwendung des Amicon 8050 – Konzentrators (Amicon) mit einer YM10 176 mm-Membran, wobei ein Argongas verwendet wurde, um die Kammer unter Druck zu setzen. Die Proben wurden weiter konzentriert und in einen 1 × Baculopuffer dialysiert, unter Verwendung von Ultrafree-15 Biomax (Millipore) 10 kDa NMWL-Filtergeräten, die in einem Beckman-S4180-Rotor (Beckman) bei 2.000 g geschleudert wurden. Die Proben wurden in Trockeneis schockgefroren und bei –20°C gelagert.
  • Reinigung von pAP 190 mittels Gelfiltrationschromatographie
  • Um die Proricinvariante vom verarbeiteten Material zu reinigen, das während der Fermentation produziert wurde, wurde das Protein über eine SUPERDEX 75 (16/60)-Säule und eine SUPERDEX 200 (16/60)-Säule (Pharmacia) gegeben, die miteinander verbunden waren, mit 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH-Wert 7,5 ausgeglichen, das 100 mM Lactose und 0,1% β-Mercaptoethanol (βME) enthält. Die Flussrate der Säule betrug 0,15 ml/Min., und die Fraktionen wurden alle 25 Minuten gesammelt. Die UV-(280 nm)-Spur wurde verwendet, um den ungefähren Ort des gereinigten pAP 190 zu determinieren und so die Proben für die Western-Analyse zu determinieren.
  • Western-Analyse der Säulenfraktionen
  • Die Fraktionen, die aus den SUPERDEX-Säulen (Pharmacia) eluiert wurden, wurden auf Reinheit unter Verwendung von Standard-Western-Blotting-Techniken analysiert. Ein Aliquot von 10 μl von jeder Fraktion wurde in einem 1 × Probenpuffer (62,6 mM Tris-Cl, pH-Wert 6,8, 4,4% βME, 2% Natriumdodecylsulfat (SDS), 5% Glycerol (alle von Sigma) und 0,002% Bromophenolblau (Biorad)) fünf Minuten lang gekocht. Denaturierte Proben wurden auf 12% Tris-Glycingele (Biorad) geladen, zusammen mit 50 ng von RCA60 (Sigma) und 5 μl von „Kaleidoscope Prestained Standards" (Biorad). Die Elektrophorese wurde neunzig Minuten lang bei 100 V in 25 mM Tris-Cl, pH-Wert 8,3, 0,1% SDS, und 192 mM Glycin, unter Verwendung der BioRad-Mini-Protean-II-Zellen (Biorad) durchgeführt.
  • Nach der Elektrophorese wurden Gele in einem Transferpuffer (48 mM Tris, 39 mM Glycin, 0,0375% SDS und 20 Methanol) einige Minuten lang äquilibriert. Die PVDF-Biorad-Membran wurde eine Minute lang in 100% Methanol und zwei Minuten im Transferpuffer voreingeweicht. Whatman-Papier wurde kurz im Transferpuffer durchtränkt. Fünf Stück Whatman-Papier, Membran, Gel und weitere fünf Stück von Whatman-Papier wurden auf dem Boden der Kathode (Anode) des Pharmacia-Novablot-Transferapparats (Pharmacia) arrangiert. Der Transfer erfolgte eine Stunde lang bei Konstantstrom (2 mA/cm2).
  • Der Transfer wurde bestätigt, indem das Erscheinen der vorgefärbten Standards auf der Membran überprüft wurde. Nicht-spezifische Orte auf der Membran wurden blockiert, indem der Blot dreißig Minuten lang in 1 × Phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1 × PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, pH-Wert 7,4) mit 5% Magermilchpulver (Carnation) inkubiert wurde. Primäre Antikörper (Kaninchen-α-Ricin, Sigma) wurden in 1:3.000 in 1 × PBS, das 0,1% Tween 20 (Sigma) enthält, und 2,5% Magermilch gelöst und mit Blot fünfundvierzig Minuten auf einem Rundschüttler (VWR) inkubiert. Die nicht spezifisch gebundenen primären Antikörper wurden entfernt, indem der Blot zehn Minuten lang mit 1 × PBS gewaschen wurde, das 0,2% Tween 20 enthält. Das wurde vier Mal wiederholt. Der sekundäre Esel-anti-Kaninchen-Antikörper (Amersham) wurde mit dem Blot unter den gleichen Bedingungen wie der primäre Antikörper inkubiert. Überschüssige sekundäre Antikörper wurden wie oben beschrieben gewaschen. Die Blots wurden mit den ECL-Western-Blotting-Detection-Reagenzien gemäß den Herstellerangaben entwickelt. Die Blots wurden drei bis fünfzehn Minuten lang Medtecs Full Speed Blue Film (Medtec) oder Amersham's ECL-Hyperfilm (Amersham) exponiert. Der Film wurde in einem KODAK-Entwicklungsautomat entwickelt.
  • Bestimmung der lectinbindenden Fähigkeit der Proricinvariante
  • Ein Immulon-2-Place (VDVR) wurde mit 100 μl je Vertiefung mit 10 μg/ml Aasialofetuin beschichtet und über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Die Platte wurde mit 3 × 300 μl je Vertiefung mit ddH2O unter Verwendung eines automatischen Mikrotiterplatten-Washers (BioRad) gewaschen. Die Platte wurde eine Stunde lang bei 37°C blockiert, indem 300 μl PBS je Vertiefung zugefügt wurden, das 1% Ovalbumin enthielt. Die Platte wurde wie oben beschrieben erneut gewaschen. Die Proricinvariante pAP 190 wurde zu der Platte in verschiedenen Verdünnungen in 1 × Baculo zugefügt. Eine Standardkurve von RCA60 (Sigma) von 1–10 ng wurde ebenfalls einbezogen. Die Platte wurde 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Platte wurde wie oben beschrieben gewaschen. Der monoklonale Antiricin-Antikörper (Sigma) wurde in 1:3.000 in 1 × PBS, das 0,5% Ovalbumin und 0,1% Tween 20 enthielt, gelöst, bei 100 μl je Vertiefung zugefügt und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Platte wurde wie oben beschrieben gewaschen. Der polyklonale Esel-anti-Kaninchen-Antikörper (Sigma) wurde in 1:3.000 in 1 × PBS, das 0,5% Ovalbumin und 0,1% Tween 20 enthielt, gelöst, bei 100 μl je Vertiefung zugefügt und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Platte erhielt eine Schlusswäsche wie oben beschrieben. Das Substrat wurde einer Platte bei 100 μl je Vertiefung zugefügt (1 mg/ml o-Phenylendiamin (Sigma), 1 μl/ml H2O2, 25 μl der Stopplösung (20% H2SO4) wurde zugefügt und die Absorbanz (A490 nm-A630 nm) unter Verwendung eines SPECTRA MAX 340 Plattenlesers (Molecular Devices) abgelesen.
  • Bestimmung der pAP-190-Aktivität unter Verwendung des Kaninchen-Retikulozyt-Assays
  • Die Ricinprobe wurde für die Reduktion hergestellt.
    • A) RCR60 = 3.500 ng/μl von RCA60 + 997 μl 1 × Endopuffer (25 mM Tris, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2, pH-Wert 7,6) Reduktion = 95 μl von 10 ng/μl + 5 μl β-Mercaptoethanol
    • (B) Ricinvarianten Reduktion = 40 μl-Variante + 2 μl β-Mercaptoethanol Der Ricinstandard und die Varianten wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Ricin-Kaninchen-Retikulozyt-Lysat-Reaktion
  • Die erforderliche Anzahl von 0,5 ml-Röhren wurde markiert. (2 Röhren für jede Probe, + und – Anilin.) Jedem der Proberöhren wurden 20 μl 1 × Endopuffer zugefügt, und 30 μl des Puffers wurde den Kontrollen zugefügt. Den Probenröhren wurden entweder 10 μl des 10 ng/μl Ricins oder 10 μl der Variante zugefügt. Schließlich wurden 30 μl des Kaninchen-Retikulozyt-Lysats allen Röhren zugefügt. Die Proben wurden 30 Minuten lang bei 30°C unter Verwendung des Thermalblocks inkubiert. Die Proben wurden aus dem Eppendorf-Röhrchen entfernt, und die Inhalte wurden einem 1,5 ml Röhrchen zugefügt, das 1 ml TRIZOL (Gibco) enthielt. Die Proben wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden 200 μl Chloroform zugefügt, und die Probe wurde bei 12.000 g 15 Minuten bei 4°C verwirbelt und geschleudert. Die obere wässrige Schicht der Proben wurde entfernt und die Inhalte einem 1 ml-Röhrchen zugeführt, das 500 μl Isopropanol enthielt. Die Proben wurden 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann bei 12.000 g 15 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und die Pellets wurden mit 1 ml von 70%-igem Ethanol gewaschen. Zentrifugieren bei 12.000 g 5 Minuten lang bei 4°C führte zur Ausfällung der RNA. Alles außer ungefähr 20 μl des Überstands wurde entfernt und die verbleibende Flüssigkeit unter Verwendung der Speed-Vacuum-Maschine verdampft. Die Kontrollproben (–Anilin) wurden in 10 μl von 0,1 × E-Puffer (36 mM Tris, 30 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA, pH-Wert 7,8) gelöst und bei –70°C oder auf Trockeneis bis zur späteren Verwendung gelagert. Die Pellets der anderen Proben (+Anilinproben) wurden in 20 μl DEPC-behandeltem ddH2O gelöst. Ein 80 μl-Aliquot von 1 M Anilin (destilliert) mit 2,8 M Essigsäure wurde diesen RNA-Proben zugefügt und in ein frisches 0,5 ml-Röhrchen transferiert. Die Proben wurden in Dunkelheit 3 Minuten lang bei 60°C inkubiert. Die RNA wurde durch Zufügen von 100 μl 95%-igem Ethanol und 5 μl 3 M Natriumacetat, pH-Wert 5,2 in jedes Röhrchen und Zentrifugieren bei 12.000 g 30 Minuten lang bei 4°C ausgefällt. Die Pellets wurden mit 1 ml 70%-igem Ethanol gewaschen und erneut bei 12.000 g 5 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, um RNA ausfällen. Der Überstand wurde entfernt und die überschüssige Flüssigkeit unter Verwendung der Speed-Vacuum-Machine verdampft. Diese Pellets (+Anilin-Proben) wurden in 10 μl 0,1 × E-Puffer gelöst. Allen Proben (+ und –Anilin) wurden 10 μl Formamid-Loading Dye zugefügt. Die RNA-Leiter (8 μl der Leiter + 8 μl der Loading Dye) wurde ebenfalls beigefügt. Die Proben wurden 2 Minuten bei 70°C auf dem Thermalblock inkubiert. Die Elektrophorese wurde an den Proben unter Verwendung von 1,2% Agarose-, 50% Formamidgelen in 0,1 × E-Puffer + 0,2% SDS durchgeführt. Das Gel wurde 90 Minuten bei 75 Watt laufen gelassen. Die RNA wurde visualisiert, indem das Gel 1 μg/μl Ethidiumbromid im Laufpuffer 45 Minuten lang gefärbt hat. Das Gel wurde auf einer 302 nm UV-Box unter Verwendung des Geldokumentationssystems überprüft und fotografiert.
  • Ergebnisse
  • Proteinexpressionsausbeute
  • Die Aliquots wurden bei jedem Stopp der Ernte/Reinigung genommen und getestet. Die Erträge der funktionellen Ricinvariante wurden mittels ELISA determiniert. Typische Ergebnisse auf einem 800 mL prep von infizierten T. ni Zellen werden im Folgenden angegeben,
    Aliquot μg pAP 190
    Vor Konzentration und Dialyse 648,5
    Nach Konzentration und Dialyse 364,4
    RSF-Säulen-Durchfluss 62,1
    ASF-Säulen-Elution 300,7
    Ausbeute: 300,7/648,5 = 46,4
  • Reinigung von pAP 190 und Western Analyse der Säulenfraktionen
  • Teilweise gereinigtes pAP 190 wurde auf Superdex 75 und 200 (16/60) Säulen, die miteinander verbunden sind, gegeben, um die kontaminierenden nicht spezifisch verarbeitet pAP 190 zu entfernen. Elutierte Fraktionen wurden per Western-Analyse getestet, und die Fraktionen, die das reinste Protein enthielten, wurden gepooled, konzentriert und erneut über die Säule gegeben. Die Variante wurde insgesamt drei Mal über die Säule gegeben. Das finale gereinigte pAP 190 hatte weniger als 1% prozessierte Variante. 13 zeigt, dass die gereinigte pAP 190 in drei Fraktionen und das verarbeitete Material in zwei separaten Fraktionen elutierte.
  • Gereinigtes pAP 190 wurde auf seine Empfindlichkeit, mittels HIV-Protease gespalten zu werden, und auf Aktivierung der A-Kette der Proricinvariante (Inhibition der Proteinsynthese) getestet. PAP 190 wurde mit und ohne HIV-Protease für einen spezifischen Zeitraum inkubiert und dann einer Elektrophorese unterzogen und geblotted. Gespaltenes pAP 190 wird als zwei 30 kDa Proteine (B ist etwas größer) unter reduzierenden (SDS-PAGE)-Bedingungen laufen gelassen. Nicht verarbeitetes pAP 190, das die Linkerregion enthält, wird bei 60 kDa laufen gelassen. Die HIV-Protease war in der Lage, pAP 190 (gezeigt in 14) zu spalten. Die Spuren B und D zeigen unbehandelte; während die Spuren C und E, bis G das mit HIV-Protease behandelte pAP 190 zeigt.
  • Die Aktivierung der pAP-190-Variante mit HIV-Protease
  • Die Aktivierung der HIV-Protease, die mit pAP 190, auf der Basis des Verfahrens von May et al. (EMBO Journal. 8 301–8, 1989) behandelt ist, wurde in 15 veranschaulicht. Das Erscheinen des 390-Basenpaarprodukts wird in Spur B beobachtet, der positiven Kontrolle, und nicht in Spur C beobachtet, der negativen Kontrolle. Die Spuren D–G zeigen, dass es, wie vorhergesagt, keine N-Glycosidase-Aktivität in der pAP 190-Variante gab. Die Spuren H–K zeigen, dass, wie vorhergesagt, das verarbeitete pAP 190 die N-Glycosidase-Aktivität besitzt.
  • Die pAP 190-Variante wurde in Insektenzellen exprimiert, bis zu über 99% gereinigt, und die Aktivierung der Variante wurde mittels Spaltung mit HIV-Protease demonstriert.
  • BEISPIEL 3
  • Klonierung und Expression von Proricinvarianten, die durch HTLV aktiviert werden
  • Isolierung von Gesamt-RNA
  • Das Präproricingen wird aus neuem Blattwerk des Rizinusstrauchs kloniert. Gesamt-Messenger-RNA wird gemäß anerkannter Verfahren isoliert (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Lab Manual (Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, (1989)) und cDNA wird unter Verwendung reverser Transkriptase generiert.
  • cDNA-Synthese
  • Oligonukleotide, die den äußersten 5'- und 3'-Enden des Präproricingens entsprechen, werden synthetisiert und verwendet, um das Gen mittels PCR zu amplifizieren. Bei der Verwendung der cDNA-Sequenz für Präproricin (Lamb et al., Eur. J. Biochem., 145: 266–270, (1985)), werden mehrere Oligonukleotidprimere designed, um die Start-und Stoppcodone des offenen Leserahmens des Präproricins zu flankieren. Die Oligonukleotide werden unter Verwendung eines Applied Biosystems Model 392 DNA/RNA-Synthetisierers synthetisiert. Die cDNA des ersten Strangs wird unter Verwendung des Oligonukleotids Ricin1729C primerunterstützt synthetisiert (Tabelle 1). Drei Mikrogramm Gesamt-RNA werden als Matrize für Oligo-Ricinl729C primunterstützer Synthese der cDNA verwendet, unter Verwendung von Superscript II Reverse-Transkriptase (BRL), gemäß des Protokolls des Herstellers.
  • DNA-Amplifikation und Klonierung
  • Die cDNA-Synthesereaktion des ersten Strangs wird als Matrize für die DNA-Amplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet. Die Präproricin-cDNA wird unter Verwendung des Upstream-Primers Ricin-109 und des Downstream-Primers Ricin1729C mit Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs) unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)) amplifiziert. Die Amplifikation wird in einem Biometra Thermal-Cycler (TRIO-Thermalcycler) unter Verwendung der folgenden Parameter durchgeführt: Denaturierung bei 95°C für 1 Min., Annealing bei 52°C für 1 Min., und Extension 72°C für 2 Min., (33 Zyklen), gefolgt von einem finalen Extensionszyklus bei 72°C für 10 Min. Das amplifizierte Produkt 1846 bp wird auf einem Agarosegel fraktioniert (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), und die DNA wird von der Gelschicht unter Verwendung von Qiaex-Harz (Qiagen), gemäß dem Protokoll des Herstellers, gereinigt. Das gereinigte PCR-Fragment, das die Präproricin-cDNA kodiert, wird dann (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)) in ein Eco-RI-verdautes pBluescript-II-SK-Plasmid (Stratagene) ligiert, und verwendet, um kompetente XL1-Blue-Zellen (Stratagene) zu transformieren. Die positiven Klone werden mittels Restriktionsverdauung der gereinigten Plasmid-DNA bestätigt. Die Plasmid-DNA werden unter Verwendung eines Qiaprep Spin-Plasmid-Miniprep-Kit (Qiagen) extrahiert.
  • DNA-Sequenzierung
  • Das klonierte PCR-Produkt, das das mutmaßliche Präproricingen enthält, wird mittels DNA-Sequenzierung des gesamten cDNA-Klons (pAP-144) bestätigt. Die Sequenzierung wird unter Verwendung eines Applied Biosystems 373A Automated DNA Sequenzers ausgeführt, und mittels doppelsträngiger Didesoxy-Sequenzierung per Sangerverfahren unter Verwendung des Sequenase-Kits (USB) bestätigt. Für die Sequenzierung werden folgende Oligonukleotidprimer verwendet: Ricin267, Ricin486, Ricin725, Ricin937, Ricin1151, Ricin 1399, Ricin1627, T3-Primer (5'AATTAACCCTCACTAAAGGG-3') und T7-Primer (5'GTAATACGACTCACTATAGGGC-3). Die Sequenzdaten werden unter Verwendung des PC-Gen-Software-Package (intelligenetics) kompiliert und analysiert. Die Sequenzen und der Ort der Oligonukleotidprimer sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • Mutagenese der Präproricin-Linker
  • Der Präproricin-cDNA-Klon (pAP-144) wird einer ortsgerichteten Mutagenese unterzogen, um eine Serie von Varianten zu generieren, die sich nur in der Sequenz zwischen den A- und B-Ketten unterscheiden (Linkerregion). Die Wildtyp-Präproricin-Linkerregion wird mit den Linker-Sequenzen ersetzt, die in 20 dargestellt sind. Die Linkerregionen der Varianten kodieren eine krankheitsspezifische Protease-Spaltungserkennungssequenz (Slalka et al., Cell, 56: 911–913, 1989). Die Mutagenese- und Klonierungsstrategie, die verwendet wird, um die HTLV-Proteasesensitiven Linkervarianten zu generieren, werden in 16A, 17A, 18A und 19A zusammengefasst.
  • Am ersten Schritt ist eine DNA-Amplifikation unter Verwendung eines Satzes mutagener Primer beteiligt, die für die krankheitsspezifische Protease-sensitive Linker kodieren, in Kombination mit den zwei flankierenden Primer Ricin-109Eco und Ricin1729Xba. Das PCR-Protokoll und die verwendeten Bedingungen sind die gleichen, wie oben beschrieben. Die PCR-Produkte von jeder Mutagenesereaktion werden einer Gelreinigung und dann einer Restriktionsverdauung unterzogen, entweder mit EcoRI für das die A-Kette kodierende Fragment, oder mit XbaI für das die B-Kette kodierende Fragment. Restriktionsverdaute PCR-Fragmente sind Gel-gereinigt und dann mit Pbluescript-SK ligiert, das mit EcoRI und XbaI verdaut worden ist. Ligationsreaktionen werden verwendet, um kompetente XL1-Blue-Zellen (Stratagene) zu transformieren. Rekombinante Klone werden mittels Restriktions verdauen von Plasmid Miniprep-DNA identifiziert, und die mutanten Linker-Sequenzen werden mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • Subklonierung von Präproricinmutanten in Vektor pVL1393
  • Die Präproricinvarianten werden in den Baculovirus-Transfervektor pVL1393 (PharMingen) subkloniert. Die Subklonierungsstrategie für die HTLV-Protease-sensitive Linkervarianten sind in 16C, 17C, 18C, und 19C zusammengefasst. Das 1315 bp EcoRI/KpnI-Fragment, das die Ricin-A-Kette kodiert und jeder mutante Linker ist von pAP-205, pAP-207, pAP-209 oder pAP-211 isoliert. Jedes dieser gereinigten Fragmente ist mit einem 564-bp-KpnI/PStI-Fragment ligiert, erhalten von pAP-144, und mit EcoRI/PstI gespaltenem pVL1393. Rekombinante Klone werden mittels Restriktionsverdauen von Plasmid Miniprep-DNA identifiziert, und 5'- und 3'-Verknüpfungen wurden mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • Isolierung der rekombinanten Baculoviren
  • Die Insektenzellen S. frugiperda (Sf9) und Trichoplusia ni (Tn368 und BTI-TN-581-4 (High Five)) werden auf einem TMN-FH-Medium erhalten, das mit 10% fötalem Kälberserum angereichert ist (Summers et al., A Manual of Methods of Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, (Texas Agricultural Experiment Station, 1987)). Zwei Mikrogramm rekombinanter pVL1393-DNA (pAP-190, pAP-196 oder pAP-197) werden mit 0,5 Mikrogramm BaculoGold-AcNPV-DNA (Pharmingen) in 2 × 106 Tn368 Insektenzellen kotransfiziert, gemäß dem Protokoll des Herstellers (Gruenwald et al., Baculovirus Expression Vector System: Procedures and Methods Manual, 2nd Edition, (San Diego, CA, 1993)). An Tag 5 nach der Transfektion werden die Medien zentrifugiert, und die Überstände werden in limitierenden Verdünnungs-Assays mit Tn368- Zellen getestet (Summers et al., A Manual of Methods of Baculovirus Vectors und Insect Cell Culture Procedures, (Texas Agricultural Experiment Station, 1987)). Dann werden die rekombinanten Viren in den Überständen amplifiziert, indem Tn368-Zellen bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,1 infiziert werden, gefolgt von der Sammlung der Überstände am 7. Tag. Insgesamt werden drei Amplifikationsrunden für jede Rekombinante gemäß anerkannter Verfahren durchgeführt (Summers et al., A Manual of Methods of Baculovirus Vectors und Insect Cell Culture Procedures, (Texas Agricultural Experiment Station, 1987 and Gruenwald et al., Baculovirus Expression Vector System: Procedures and Methods Manual, 2nd Edition, (San Diego, CA, 1993)).
  • Expression von mutantem Proricin
  • Rekombinante Baculoviren (pAP-206-baculo, pAP-208-baculo, pAP-210-baculo und pAP-212-baculo) wurden verwendet, um 2 × 105 Tn368 oder sf9-Zellen mit einer moi von 5 in EX-CELL400-Medien (JRH Biosciences) mit 25 mM a-Lactose in Schüttelkolben zu infizieren. Medien-Überstände, die mutante Proricine enthalten, werden am Tag 6 nach der Infektion gesammelt.
  • Reinigung von mutantem Proricin
  • Medien-Überstände werden bei 100.000 g 1 Stunde lang ultrazentrifugiert. Nach der Zugabe von 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid werden die Überstände unter Verwendung einer Amicon 8050 Ultrafiltrationszelle, die mit einer Diaflo-XM50-Membran ausgerüstet ist, konzentriert. Die Überstände werden dann ausgiebig gegen 137 mN NaCl, 2,2 mM KCl, 2,6 mM KH2PO4 und 8,6 mM Na2HPO4, pH-Wert 7,4, der 1 mM Dithiothreitol (Dialysepuffer) enthält, dialysiert. Rekombinante Proricinproteine werden mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung von Lactose-Agarose (Sigma) gereinigt, wie zuvor für die rekombinante Ricin-B-Kette beschrieben (Ferrini et al., Eur. J. Biochem., 233: 772–777, (1995)). Die Fraktionen, die das rekombinante Proricin enthalten, werden unter Verwendung von SDS/PAGE, (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) und mittels Western-Blot-Analyse, unter Verwendung von Anti-ricin-Antikörpern (Sigma) identifiziert.
  • In-Vitro-Protease-Verdauung von Proricinvarianten
  • Eine affinitätsgereinigte Proricinvariante wird mit individuellen krankheitsspezifischen Proteasen behandelt, um die spezifische Spaltung in der Linkerregion zu bestätigen. Ricin-ähnliche Toxinvarianten werden aus der Lactose-Agarose-Matrix im Protease-Verdauungspuffer elutiert (50 mM NaCl, 50 mM Na-Acetat, pH-Wert 5,5, 1 mM Dithiothreitol), das 100 mM Lactose enthält. Das Proricinsubstrat wird dann bei 37°C 60 Minuten mit einer krankheitsspezifischen Protease inkubiert. Die Spaltungsprodukte, die aus Ricin-A- und B-Ketten bestehen, werden unter Verwendung von SDS/PAGE (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed., Cold Spring Harbor Press, 1989) gefolgt von Western-Blot-Analyse, unter Verwendung von anti-Ricin-Antikörpern (Sigma) identifiziert.
  • HTLV-Proteasen können von Bachem Bioscience erhalten werden. Cathepsin B kann von Medcor oder Calbiochem erhalten werden.
  • In-Vitro-Translations-Assay
  • Die Aktivität der Protease-behandelten Ricin-ähnlichen Toxinvarianten wurden unter Verwendung eines Kaninchen-Retikulozytlysats in einem nicht radioaktiven (Amersham, ECL-System) In-vitro-Translationsassay überwacht.
  • Protease-behandeltes Proricin wird einer Standard-50 ml-Translations-Reaktionsmischung zugefügt, die Trespenmosaik-Virus-mRNA als Matrize enthält (gemäß dem Protokoll des Herstellers). Aktive Ricinvarianten inhibieren die In-vitro-Translationreaktion, indem Ribosomen inaktiviert werden. Folglich wurden in Gegenwart einer aktiven Ricinvariante keine viralen Proteine synthetisiert.
  • In-Vitro-Hefeproteinsyntheseassay
  • Die Aktivität von Protease-behandelten Proricin-ähnlichen Toxinen können auch mittels eines Hefeproteinsyntheseassays bewertet werden. Zum Beispiel lehrt Murakami, S et al., Mol., Cel. Biol. 2: 588–592, 1982, ein Hefeproteinsyntheseassay, um eine Ricin-ähnliche Toxizität zu determinieren, das genauso empfindlich ist, wie die Säugerzellen-Assays.
  • Sechs fünf ml Kulturen von Saccharomyces cerevisiase (Y235-Zellen und 2 Zellwandmutanten) in einem YPD-Medium (10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton) werden gestartet, indem 800 μl des Medium mit 1 Kolonie Saccharomyces cerevisiase inokuliert und verwirbelt werden und dann 100 μl dieser Suspension zu 5 mL des Mediums zugegeben werden. Die Kulturen werden über Nacht bei 30°C unter leichtem Rühren wachsen gelassen. Die Zellen werden mittels Inokulation von 100 μl YPD-Medium mit einer oder mehreren der 5 ml-Über-Nacht-Kulturen expandiert und bei 30°C unter leichtem Rühren bis zu einer Konzentration von 1 × 105 Zellen/ml wachsen gelassen. Die Zellen werden mit sterilem doppelt destilliertem Wasser gewaschen, bei 1.200 g 3 Minuten lang zentrifugiert und in einem ZSM-Puffer (1 M Sorbitol, 10 mM Tris-Cl, pH-Wert 7,5, 50 mM Dithiotheitol (DDT)) 3-fach konzentriert. Die Proben werden unter leichtem Schütteln 10 Minuten lang bei 30°C inkubiert, bei 1.200 g 3 Minuten lang zentrifugiert und in einem ZSM- Puffer resuspendiert, so dass die Zellkonzentration bei 1 × 108 Zellen/ml lag. Die Zellwände werden gesprengt, indem den Proben 1 ml Betaglucuronidase (Sigma, St. Louis, MO.) zugefügt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert wird. Die Zellen werden 3 Mal mit ZSM und Protoplastzellen im Regenerationsmedium (0,17% Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren (Difco, Detroit, Michigan) gewaschen, in 2 Dropout + all (essentielle Aminosäuren), 10 mM Tris-Cl, pH-Wert 7,5, 2% Glucose, 1 M Sorbitol) bis zu einer Endkonzentration von 1 × 108 Zellen/ml resuspendiert. Eine aktivierte Proricinvariante, die in einem sterilem 1 × Baculopuffer (0,137 M) NaCl, 2,7 mM KCl, 2,6 mM KH2PO4, pH-Wert 7,4) dialysiert wurde, wird einer Hälfte des Protoplasts zugefügt, während ein steriler 1 × Baculopuffer allein der anderen Hälfte des Protoplasts als Kontrolle zugefügt wird. Beide Probensets wurden bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubiert. In Zeitabständen von 0, 1, 2, und 3 Stunden wird ein Aliquot jeder Kultur entfernt. Die Zellen werden der Reihe nach von 10–4 auf 10–8 in ZSM verdünnt und auf Weichagar plattiert (1:1 ZSM:YPD, 15% Agar). Gleichzeitig werden Verdünnungen von 10–2 bis 10–4 in sterilem doppelt destilliertem Wasser gemacht und 50 μL Aliquots werden auf YPD-Medium mit 20% Agar plattiert. Die Platten werden 2 Tage lang bei 30°C plattiert und danach werden die Kolonien gezählt. Eine grafische Darstellung, die die Zahl der gezählten Zellen mit der Zeit in Relation setzt, wird verwendet, um die Ricin-Testkultur mit der Kontrollkultur ohne Ricin zu vergleichen.
  • Die aktivierte Proricin-ähnliche Toxinvariante inhibiert in vitro die Proteinsynthese durch ribosomale Inaktivierung. Es wird erwartet, dass die Zellwachstumsrate der Behandlungsgruppe bedeutend niedriger ist, als die der Kontrollgruppe.
  • Die N-Glycosidaseaktivität der Proricinvariante auf rRNA-Oligonukleotide
  • Ricin-ähnliche Toxine inhibieren die ribosomale Funktion, indem sie die N-glycosidische Bindung zwischen der Nukleotidbase und der Ribose bei Position A4319 in eukaryontischer 28S-ribosomaler RNA (rRNA) hydrolysieren. Die Fähigkeit der aktivierten Ricin-ähnlichen Toxine, die ribosomale RNA (rRNA)-Funktion zu inhibieren, kann in einem In-Vitro-Ribonukleotidkatalyseassay untersucht werden, unter Verwendung eines synthetischen Oligoribonukleotids, das die sekundäre Struktur der natürlichen hydrolytischen Spaltungsdomäne der RNA besitzt.
  • Ein synthetisches 32-Nukleotid-RNA-Oligomer (University of Calgary, DNA Core Services), das die 28S-rRNA-Toxinaktive Stelle imitiert, wird verwendet, um die N-Glycosidaseaktivität der Proricinvarianten zu testen. Die Olinukleotidsequenz und die allgemeine Methodik werden im Wesentlichen in Gluck, A. und Wool I. G., J. Mol. Biol. 256: 838–848, 1996 beschrieben.
  • Eine Markierungsreaktion wird aufgebaut und umfasst: 50 pmol Oligonukleotid, 20 Einheiten von T4-Polynukleotidkinase (PNK; Gibco-BRL, Gaithersburg, MA), 25 pmol von γ-32P (Amersham, Arlington, IL), 1 × T4 PNK-Puffer in einem Endvolumen von 50 μl. Die Proben werden 30 Minuten lang bei 37°C und dann 20 Minuten lang bei 65°C inkubiert. Das markierte Oligonukleotid wird mit 95% Ethanol ausgefällt und unter Verwendung eines Thermal-Cyclers getrocknet. Ein zweiter Ethanol-Ausfällungsschritt kann wiederholt werden, um weitere Spuren von Fremdstoffen zu beseitigen. Die RNA wurde auf eine Endkonzentration von 1 ng/μl in 10 mM Tris-Cl (pH-Wert 7,6) und 50 mM NaCl (5 ng Oligonukleotid wird je Probe verwendet) resuspendiert.
  • Die aktivierte Proricinvariante wird vor der Verwendung in 1 × Baculopuffer mit 1% Betamercaptoethanol 30 Minuten lang bei Raumtemperatur reduziert. Die Oligonukleotide werden in 10 mM Tris-Cl (pH-Wert 7,6), 50 mM NaCl 1 Minute lang auf 90°C erhitzt und können bei 0°C renaturieren. CaCl2, EGTA und Wasser werden zu der renaturierten RNA zugefügt, um die folgenden Konzentrationen zu ergeben: 3 mM Tris-HCl (pH 7,6), 15 mM NaCl, 5 mM CaCl2 und 5 mM EGTA. Eine aktivierte Proricinvariante oder Ricin-A-Kette (Sigma, St. Louis, MO) wird jedem Röhrchen zugefügt. Die Konzentration des Ricins reichte von 1 bis 10 μM, und die Proricinvariante war 10-fach größer. Die Röhrchen werden bei 35°C 20 Minuten lang inkubiert, und die Reaktion wird durch die Zugabe von Natriumdodecylsulfat (SDS) in einer Endkonzentration von 0,5% (w/v) gestoppt. Das Oligonukleotid und 15 μg des zugefügten Trägers tRNA (Hefe-tRNA; Gibco-BRL Gaithersburg, MA) werden mit 300 mM NaCl und 2,5 Volumen von 95% Ethanol ausgefällt. Die Pellets werden einmal mit 70% Ethanol gewaschen und auf CENTRIVAP (Labconco, Kansas City, MO) getrocknet. Die RNA wird in 5 μl Wasser aufgelöst, 25 μl einer Lösung von Anilin und Essigsäure (1 bzw. 2,8 mM) werden zugefügt, und die Probe wird 10 Minuten bei 40°C inkubiert. Die Anilin-behandelte RNA wird mit Ethanol und 300 mM NaCl ausgefällt, einmal in 70% Ethanol gewaschen und auf CENTRIVAP getrocknet. Die Pellets werden in 10 μl DEPC-behandeltem doppelt destilliertem Wasser und 10 μl 2 × Loading Dye (178 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,3), 178 mM Borsäure, 5 mM EDTA, 0,05% (w/v) Bromophenolblau und 14 M Harnstoff) gelöst und 3 Stunden lang bei 50 Watt in 10% (w/v) Polyacrylamidgel der Elektrophorese unterzogen, wobei 7 M Harnstoff in 1 × TBE-Puffer (89 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,3), 89 mM Borsäure, 2,5 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA) enthalten sind. Die Gele werden einem blauen Höchstgeschwindigkeits-Röntgenfilm von KODAK exponiert und bei –70°C stehen gelassen.
  • Nach 2 Tagen wurde der Film in einem automatischen KODAK-Filmprozessor entwickelt.
  • Wenn die Proricinvariante, die mit einer krankheitsspezifischen Protease aktiviert ist, dem Oligoribonukleotid zugefügt wird, würde die Hydrolyse der N-glycosidischen Bindung an Position 20 (Depurinieren von Adenosin) stattfinden, und das Erscheinen von zwei Banden auf dem Autoradiogramm würde erwartet. Die Proricinvariante ohne Vorbehandlung mit der krankheitsspezifischen Protease würde das RNA-Oligonukleotid nicht spalten und würde zu einem einfachen Band auf dem Autoradiogramm führen.
  • In-Vitro-Cytotoxizitätsassay
  • Humane Ovarialkarzinomzellen (z. B. MA148) werden in Flachbodenplatten mit 96-Vertiefungen ausgesät und Ricin-ähnlichen Toxinvarianten oder einem Kontrollmedium 16 Stunden lang bei 37°C ausgesetzt. Die Lebensfähigkeit der Krebszellen wird mittels Messung [35S]Methionin-Inkorporation determiniert und ist in den Vertiefungen, die mit den Toxinvarianten behandelt wurden signifikant niedriger, als in jenen mit dem Kontrollmedium.
  • In-Vivo-Tumorwachstums-Inhibitionsassay
  • Humane Brustkrebszellen (z. B. MCF-7) werden in einem passenden Medium erhalten, das 10% fötales Kälberserum enthält. Die Zellen werden gewachsen, geerntet und daraufhin in athymische nackte Mäuse, denen die Eierstöcke entfernt wurden, subkutan injiziert. Die Tumorgröße wird in Intervallen determiniert, indem zwei rechtwinkelige Messungen unter Verwendung von Schieblehren gemessen werden.
  • In-Vivo-Tumor-Metastasenassay
  • Die Metastasenstudie wird im Wesentlichen wie in Honn beschrieben, K. V. et al. (Biochem. Pharmacol. 34: 235–241 (1985)) ausgeführt. Lebensfähige B16a-Melanomtumorzellen werden hergestellt und subkutan in die linke axilläre Region von syngenen Mäusen injiziert. Das Ausmaß der Tumormetastase wird nach 4 Wochen gemessen. Die Lungen werden aus den Tieren entfernt und in Bouin's-Lösung fixiert, und makroskopische pulmonale Metastasen werden unter Verwendung eines Präpariermikroskops gezählt. Ohne therapeutische Intervention bildet die Injektion von 105 lebensfähigen Tumorzellen im Allgemeinen ungefähr 40 bis 50 pulmonale Metastasen. TABELLE 1 Tabelle 1 – Sequenz und Ort von Oligonukleotidprimern
    Figure 00700001
    • ✝ unterstrichene Sequenzen zum Subklonieren einegefügt und nicht in endgültigen Präprorian-Sequenzen enthalten
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (28)

  1. Gereinigte und isolierte Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz besitzt, die für eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins und eine heterologe Linker-Aminosäuresequenz, die die A- und B-Ketten verbindet, kodiert, wobei die Linker-Sequenz eine Spaltungserkennungssequenz für eine retrovirale Protease enthält.
  2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, bei der die A-Kette die Ricin-A-Kette ist.
  3. Nukleinsäure nach Anspruch 1, bei der die B-Kette die Ricin-B-Kette ist.
  4. Nukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei der die Spaltungserkennungssequenz die Spaltungserkennungssequenz für eine HIV-Protease ist.
  5. Nukleinsäure nach Anspruch 4, bei der die Linker-Aminosäuresequenz VSQNYPIVQNFN (SEQ ID NO: 20); SKARVLAEAMSN (SEQ ID NO: 21); oder SIRKILFLDGIN (SEQ ID NO: 22) umfaßt.
  6. Nukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, die die in 8 (SEQ ID NO: 23), 9 (SEQ ID NO: 24) oder 10 (SEQ ID NO: 25) gezeigte Nukleotidsequenz hat.
  7. Nukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei der die Spaltungserkennungssequenz die Spaltungserkennungssequenz für eine humane T-Zell-Leukämievirus (HTLV)-Protease ist.
  8. Nukleinsäure nach Anspruch 7, bei der die Linker-Aminosäuresequenz SAPQVLPVMHPN (SEQ ID NO: 55); SKTKVLVVQPKN (SEQ ID NO: 56); SKTKVLVVQPRN (SEQ ID NO: 57) oder STTQCFPILHPN (SEQ ID NO: 58) umfaßt.
  9. Plasmid, das die Nukleinsäure irgendeines der Ansprüche 1 bis 8 beinhaltet.
  10. Plasmid nach Anspruch 9, das die in 1A, 2A, 3A, 16A, 17A oder 18A gezeigte Restriktionsschnittkarte hat.
  11. Baculovirus-Transfervektor, der die Nukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 beinhaltet.
  12. Baculovirus-Transfervektor nach Anspruch 11, der die in 5, 6, 7, 16C, 17C oder 18C gezeigte Restriktionsschnittkarte hat.
  13. Baculovirus-Transfervektor nach Anspruch 11, der die in 11 (SEQ ID NO: 26) gezeigte DNA-Sequenz hat, in die die Nukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 eingeschlossen ist.
  14. Rekombinantes Protein, das eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins und eine heterologe Linker-Aminosäuresequenz, die die A- und B-Ketten verbindet, umfaßt, wobei die Linker-Sequenz eine Spaltungserkennungssequenz für eine retrovirale Protease enthält.
  15. Rekombinantes Protein nach Anspruch 14, bei dem die A-Kette die Ricin-A-Kette ist.
  16. Rekombinantes Protein nach Anspruch 14, bei dem die B-Kette die Ricin-B-Kette ist.
  17. Rekombinantes Protein nach Anspruch 14, bei dem die Spaltungserkennungssequenz die Spaltungserkennungssequenz für eine HIV-Protease ist.
  18. Rekombinantes Protein nach Anspruch 14, bei dem die Linker-Aminosäuresequenz VSQNYPIVQNFN (SEQ ID NO: 20); SKARVLAEAMSN (SEQ ID NO: 21); oder SIRKILFLDGIN (SEQ ID NO: 22) umfaßt.
  19. Rekombinantes Protein, das eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins und eine heterologe Linker-Aminosäuresequenz, die die A- und B-Ketten verbindet, umfaßt, wobei die Linker-Sequenz eine Spaltungserkennungssequenz für eine HTLV-Protease enthält.
  20. Rekombinantes Protein nach Anspruch 19, bei dem die Linker-Aminosäuresequenz SAPQVLPVMHPN (SEQ ID NO: 55); SKTKVLVVQPKN (SEQ ID NO: 56); SKTKVLVVQPRN (SEQ ID NO: 57) oder STTQCFPILHPN (SEQ ID NO: 58) umfaßt.
  21. Verwendung eines Proteins nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 20 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung oder Zerstörung von Säugerzellen, die mit einem Retrovirus infiziert sind, der eine Protease besitzt.
  22. Verwendung nach Anspruch 21, bei der das Retrovirus HIV ist.
  23. Verwendung nach Anspruch 21, bei dem die Säugerzellen humane Zellen sind.
  24. Verwendung eines Proteins nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 20 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung eines mit HIV infizierten Säugers.
  25. Verfahren zur Herstellung eines Pharmazeutikums zur Behandlung eines mit einem Retrovirus, der eine Protease besitzt, infizierten Säugers, umfassend die Schritte des Herstellens einer gereinigten und isolierten Nukleinsäure, die eine Nukleotid-Sequenz besitzt, die für eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette, eines Ricin-ähnlichen Toxins und eine heterologe Linker-Aminosäuresequenz, die die A- und B-Ketten verbindet, kodiert, wobei die Linker-Sequenz eine Spaltungserkennungssequenz für die Protease enthält; Einführen der Nukleinsäure in eine Wirtszelle; Exprimieren der Nukleinsäure in der Wirtszelle, um ein rekombinantes Protein zu erhalten, das eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins und eine Linker-Aminosäuresequenz, die die A- und B-Ketten verbindet, umfaßt, wobei die Linkersequenz die Spaltungserkennungssequenz für die Protease enthält, und Suspendieren des Proteins in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Excipienten.
  26. Verfahren zur Herstellung eines Pharmzeutikums zur Behandlung eines mit einem Retrovirus, der eine Protease besitzt, infizierten Säugers, umfassend die Schritte des Identifizierens einer Spaltungserkennungssequenz für die Protease; Herstellen eines rekombinanten Proteins, das eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins und eine heterologe Linker-Aminosäuresequenz, die die A- und B-Ketten verbindet, umfaßt, wobei die Linker-Sequenz eine Spaltungserkennungssequenz für die Protease enthält, und Suspendieren des Proteins in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Excipienten.
  27. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer retroviralen Infektion in einem Säuger, umfassend das rekombinante Protein nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 20 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Excipienten.
  28. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer HIV-Infektion in einem Säuger, umfassend das rekombinante Protein nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 20 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Excipienten.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2288943C (en) 1997-04-30 2011-02-01 De Novo Enzyme Corporation Ricin-like toxin variants for treatment of cancer, viral or parasitic infections
US7247715B2 (en) 1997-04-30 2007-07-24 Twinstrand Therapeutics Inc. Ricin-like toxin variants for treatment of cancer, viral or parasitic infections
WO2001025267A2 (en) 1999-10-04 2001-04-12 Twinstrand Therapeutics Inc. Improved ricin-like toxins for treatment of cancer
US6803358B1 (en) * 2000-04-14 2004-10-12 Twinstrand Therapeutics Inc. Ricin-like toxin variants for treatment of cancer, viral or parasitic infections
WO2001060393A1 (en) * 2000-02-16 2001-08-23 Bechtel Bwxt Idaho, Llc Selective destruction of cells infected with human immunodeficiency virus
US7273722B2 (en) 2000-11-29 2007-09-25 Allergan, Inc. Neurotoxins with enhanced target specificity
US6869787B2 (en) 2002-02-27 2005-03-22 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Ricin vaccine and methods of making and using thereof
CA2477094A1 (en) * 2002-02-27 2003-09-04 Mark A. Olson Ricin vaccine and methods of making and using thereof
JP2007530019A (ja) * 2004-03-24 2007-11-01 ツインストランド セラピューティックス インコーポレイテッド リシン様タンパク質のグリコシル化変種
US20190106466A1 (en) * 2016-04-04 2019-04-11 Ophiuchus Medicine Inc. Medicinal plants

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2521657B2 (ja) 1983-07-15 1996-08-07 インペリアル・ケミカル・インダストリーズ・ピーエルシー 組換ｄｎａ分子及びこれを含有する形質転換宿主細胞
US5668255A (en) * 1984-06-07 1997-09-16 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US5252477A (en) 1987-06-01 1993-10-12 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Health And Human Services Human immunodeficiency virus specific proteolytic enzyme and a method for its synthesis and renaturation
AU2136788A (en) 1987-07-24 1989-03-01 Cetus Corporation Production of ricin toxins in a baculovirus-insect cell expression system
WO1990010457A1 (en) 1989-03-14 1990-09-20 New York University Method of treating hiv infections using immunotoxins
US5128460A (en) 1989-04-04 1992-07-07 Genelabs Incorporated Recombinant trichosanthin and coding sequence
US5248606A (en) * 1990-06-11 1993-09-28 Dowelanco Dna encoding inactive precursor and active forms of maize ribosome inactivating protein
US5235039A (en) 1991-06-10 1993-08-10 Eli Lilly And Company Substrates for hiv protease
US5677274A (en) * 1993-02-12 1997-10-14 The Government Of The United States As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Anthrax toxin fusion proteins and related methods

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