-
GEBIET DER
ERFINDUNG
-
Die
Erfindung betrifft Proteine mit A- und B-Ketten eines Ricin-ähnlichen
Toxins, die durch eine Linker-Sequenz
verbunden sind, die durch eine retrovirale Protease spezifisch spaltbar
ist, um die aktive A-Kette freizugeben. Die Erfindung betrifft außerdem ein
Nukleinsäuremolekül, das das
Protein kodiert, und die Expressionsvektoren, die das Nukleinsäuremolekül beinhalten.
Außerdem
wird die Verwendung des Proteins der Erfindung für die Fertigung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung zur Inhibierung oder Zerstörung von Säugerzellen bereitgestellt,
die mit einem Retrovirus infiziert sind, und einer pharmazeutischen
Zusammensetzung zur Behandlung einer HIV-Infektion.
-
ALLGEMEINER
STAND DER TECHNIK
-
Es
ist bekannt, dass Bakterien und Pflanzen zytotoxische Proteine produzieren,
die aus einem, zwei oder mehreren Polypeptiden oder Untereinheiten
bestehen können.
Diese Proteine mit einer einfachen Untereinheit können etwas
ungenau als Typ-I-Proteine klassifiziert werden. Viele der Zytotoxine,
die Strukturen mit zwei Untereinheiten entwickelt haben, werden
als Typ-II-Proteine
bezeichnet (Saelinger, C. B. in Trafficking of Bacterial Toxins
(eds. Saelinger, C. B.) 1–13
(CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, 1990). Eine Untereinheit, die
A-Kette, besitzt die toxische Aktivität, während die zweite Untereinheit,
die B-Kette, Zelloberflächen
bindet und den Eintritt von Toxin in eine Targetzelle vermittelt.
Eine Teilmenge dieser Toxine tötet
Targetzellen durch die Inhibition der Proteinbiosynthese. Zum Beispiel
inhibieren bakterielle Toxine, wie etwa Diphtherietoxin oder Pseudomonasexotoxin,
die Proteinsynthese, indem sie den Elongationsfaktor 2 inaktivieren.
Pflanzentoxine wie etwa Ricin arbeiten, indem sie Ribosomen direkt
inaktivieren [Olsnes, S. & Phil, A.
in Molecular action of toxins and viruses (eds. Cohen, P. & vanHeyningen,
S.); 51–105
(Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, 1982].
-
Ricin,
das von den Samen der Ricinus communis (Kastorölpflanze) abgeleitet ist, ist
das wirksamste pflanzliche Toxin. Es wird geschätzt, dass eine einzige Ricin-A-Kette in der Lage
ist, Ribosomen mit einer Rate von 1.500 Ribosomen/Minute zu inaktivieren.
Folglich reicht ein einziges Ricinmolekül aus, um eine Zelle zu töten [Olsnes,
S. & Phil, A.
in Molecular action of toxins and viruses (eds. Cohen, P. & vanHeyningen,
S.); 51–105
(Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, 1982]. Das Ricintoxin ist
ein glycosyliertes Heterodimer mit A- und B-Kette mit einer Molekularmasse
von 30.625 Da bzw. 31.431 Da. Die A-Kette des Ricins hat eine N-Glycosidase-Aktivität und katalysiert
die Exzision eines spezifischen Adeninrests von der 28S rRNA der
eukaryontischen Ribosomen (Endo, Y; & Tsurugi, K. J. Biol. Chem. 262:
8128 (1987)). Die B-Kette des Ricins, obwohl selbst nicht toxisch,
fördert
die Toxizität
der A-Kette, indem
sie an Galactosereste auf der Oberfläche eukaryontischer Zellen
bindet und die rezeptorvermittelte Endocytose der Toxinmoleküle stimuliert
(Simmons et al. Biol. Chem. 261: 7912 (1986)).
-
Proteintoxine
werden anfangs in einer inaktiven Vorläuferform produziert. Ricin
wird anfangs als ein einfaches Polypeptid (Präproricin) mit einer N-terminalen
Präsequenz
von 35 Aminosäuren
und 12 Aminosäurelinkern
zwischen den A- und B-Ketten produziert. Die Präsequenz wird während der
Translokation des Ricin-Vorläufers
in das endoplasmatische Retikulum entfernt (Lord, J. M. Eur. J.
Biochem. 146: 403–409
(1985) und Lord, J. M. Eur. J. Biochem. 146: 411–416 (1985)). Das Proricin
wird dann in spezialisierte Organelle transloziert, genannt Proteinkörper, in
dem eine Pflanzenprotease das Protein in einer Linkerregion zwischen
den A- und B-Ketten spaltet (Lord, J. M. et al., FASAB Journal 8:
201–208
(1994)). Die beiden Ketten bleiben jedoch durch eine Disulfidbrücke (Cystein
259 in der A-Kette zu Cystein 4 in der B-Kette) kovalent gebunden
und reifes Disulfid-gebundenes
Ricin wird von den Pflanzenzellen abgesondert. Die A-Kette ist im
Proricin inaktiv (O'Hare,
M., et al. FEBS Lett. 273: 200–204
(1990)) und sie ist in dem Disulfid-verlinkten reifen Ricin inaktiv (Richardson,
P. T., et al. FEBS Lett. 255: 15–20 (1989)). Die Ribosomen
des Rizinusstrauchs sind selbst anfällig für die Inaktivierung durch die
Ricin-A-Kette; da jedoch keine Galactose auf der Zelloberfläche vorhanden ist,
die die B-Ketten-Erkennung erlaubt, kann die A-Kette nicht erneut
in die Zelle eindringen. Der genaue Mechanismus der A-Ketten-Freigabe
und Aktivierung im Cytoplasma der Targetzelle ist nicht bekannt
(Lord, J. M. et al., FASAB Journal 8: 201–208 (1994)). Es ist jedoch
bekannt, dass, damit die Aktivierung stattfindet, die Disulfidbindung
zwischen den A- und B-Ketten verringert sein muss, und daher die
Kopplung zwischen Untereinheiten unterbrochen sein muss.
-
Das
Ricingen wurde kloniert und sequenziert, und die Röntgenkristallstrukturen
der A- und B-Ketten beschrieben (Rutenber, E., et al. Proteins 10:
240–250
(1991); Weston et al., Mol. Bio. 244.410–422, 1994; Lamb and Lord Eur.
J. Biochem. 14: 265 (1985); Hailing, K., et al. Nucleic Acids Res.
13: 8019 (1985)). Aufgrund seiner extremen Toxizität gab es
ein großes
Interesse an der Erzeugung eines Ricin-basierten Immunotoxins als
therapeutischem Wirkstoff zur Zerstörung oder Inhibition von Targetzellen
oder Organismen (Vitetta et al., Science 238: 1098–1104 (1987)).
Ein Immunotoxin ist ein Konjugat einer spezifischen zellbindenden Komponente,
wie etwa einem monoklonalen Antikörper oder Wachstumsfaktor und
dem Toxin, in dem die beiden Proteinkomponenten kovalent verlinkt
sind. Im Allgemeinen sind die Komponenten chemisch gekoppelt. Die
Kopplung kann jedoch auch eine Peptid- oder eine Disulfidbindung
sein. Der Antikörper
lenkt das Toxin zu Zelltypen, die ein spezifisches Antigen aufweisen
und stellt dadurch eine Wirkungsspezifität bereit, die mit dem natürlichen
Toxin nicht möglich
ist. Immunotoxine wurden sowohl mit dem gesamten Ricinmolekül erzeugt
(d.h. beide Ketten) als auch mit der Ricin-A-Kette allein (Spooner
et al. Mol. Immunol. 31: 117–125,
(1994)).
-
Immunotoxine,
die mit dem Ricindimer (IT-Rs) erzeugt wurden, sind potentere Toxine
als jene, die nur mit der A-Kette (IT-As) erzeugt wurden. Es wird
angenommen, dass die erhöhte
Toxizität
von IT-Rs der Doppelrolle der B-Ketten zuzuschreiben ist, die darin
besteht, an der Zelloberfläche
zu binden und die A-Kette zum cytosolischen Kompartiment der Targetzelle
zu translozieren (Vitetta et al., Science 238: 1098–1104 (1987); Vitetta & Thorpe Seminars
in Cell Biology 2: 47–58
(1991)). Die Gegenwart der B-Kette in diesen Konjugaten fördert jedoch
auch den Eintritt des Immunotoxins in Nicht-Targetzellen. Sogar
geringe Mengen an B-Kette können
die Spezifität
der zellbindenden Komponente außer
Kraft setzen, da die B-Kette unspezifisch an N-glycosylierte Galactose
bindet, die auf den meisten Zellen vorhanden ist. Die Verwendung
von IT-As ist spezifischer und sicherer als die Verwendung von IT-Rs.
In Abwesenheit der B-Kette verfügt
die A-Kette jedoch nur über
eine stark verringerte Toxizität.
-
Eine
Reihe von Immunotoxinen wurden designed, um Antigene auf den Oberflächen von
Tumorzellen zu erkennen. Ein Hauptproblem bei der Verwendung der
ITs ist, dass das Targetantigen oftmals auch auf Nicht-Tumorzellen
zu finden ist (Vitetta et al., Immunology Today 14: 252–259 (1993)).
Außerdem
müssen
aufgrund der verringerten Potenz von IT-As im Vergleich mit ITRs,
den Patienten hohe Dosen von IT-As verabreicht werden. Die hohen
Dosen verursachen bei Patienten häufig Immunantworten und die Produktion
neutralisierender Antikörper
(Vitetta et al., Science 238: 1098–1109 (1987)). IT-As und IT-Rs
leiden beide an verringerter Toxizität, da die A-Kette nicht aus
dem Konjugat in das Cytoplasma der Targetzelle freigegeben wird.
-
Die
Insertion intramolekularer Spaltungsorte zwischen den cytotoxischen
und zellbindenden Komponenten eines Toxins kann den Weg, den das
natürliche
Toxin aktiviert, imitieren. Die europäische Patentanmeldung Nr. 466
222 beschreibt die Verwendung des Mais-abgeleiteten Pro-Proteins,
das durch Spaltung mit extrazellulären Blutenzymen in die aktive
Form umgewandelt werden kann, wie etwa Faktor Xa, Thrombin oder Kollagenase.
Westby et al. (Bioconjugate Chem., 3: 375–381, 1992) dokumentierte Fusionsproteine,
die eine spezifische zellbindende Komponente und Proricin mit einem
Protease-sensitiven Spaltungsort haben, der für Faktor Xa innerhalb der Linker-Sequenz
spezifisch ist. O'Hare
et al. (FEBS Lett. 273: 200–204,
1990) beschreiben ebenfalls ein rekombinantes Fusionsprotein von
RTA und ein staphylococcales Protein A, verbunden durch einen Trypsinsensitiven
Spaltungsort. Angesichts der Prävalenz
der extrazellulären
Proteasen, die in diesen Ansätzen
verwendet werden, verleiht eine solche künstliche Aktivierung des Toxinvorläufers oder
Immunotoxins keinen Mechanismus für die intrazelluläre Toxinaktivierung,
und die Probleme der Targetspezifität und der nachteiligen immunologischen
Reaktionen auf die zellbildende Komponente des Immunotoxins bleiben
bestehen.
-
Angesichts
der extremen Toxizität
von Proteinen wie etwa Ricin, kann die fehlende Spezifität des Immunotoxins
ihre Brauchbarkeit als Therapeutika für die Behandlung von Krebs
und Infektionskrankheiten stark einschränken. Die Herstellung einer
passenden, spezifischen zellbindenden Komponente kann problematisch sein.
Zum Beispiel können
für die
Targetzelle spezifische Antigene nicht verfügbar sein, und viele potentielle Targetzellen
und infektiöse
Organismen können
ihre antigene Zusammensetzung schnell verändern, um eine Immunerkennung
zu vermeiden.
-
Das
Potential bakterieller und pflanzlicher Toxine zur Inhibition von
Säugerretroviren,
vorzugsweise AIDS, wurde erforscht. Bakterielle Toxine, wie etwa
Pseudomonasexotoxin-A und die Untereinheit A des Diphtherietoxins;
doppelkettige, ribosomale, inhibierende pflanzliche Toxine, wie
etwa Ricin und einfachkettige ribosomale inhibierende Proteine,
wie etwa Trichosanthin und das antivirale Kermesbeer-Protein wurden
für die Eliminierung
von HIV-infizierten Zellen verwendet (Olson et al. 1991, AIDS Res.
und Human Retroviruses 7: 1025–1030).
Die hohe Toxizität
dieser Toxine für
Säugerzellen,
in Kombination mit der fehlenden Wirkungsspezifität, stellt
ein Hauptproblem für
die Entwicklung von Arzneimitteln dar, die Toxine, wie etwa Immunotoxine beinhalten.
-
Immunotoxine
werden so designed, dass ihre Wirkungsspezifität nur durch die Antikörperkomponente determiniert
ist; Zellen die Antigen aufweisen werden vorzugsweise durch das
Arzneimittel zerstört
(Pastan et al., Annals New York Academy of Sciences 758: 345–353 (1995)).
Das Toxinprotein der Immunotoxin-Konjugate gibt der Therapie keinerlei
zusätzliche
Wirkungsspezifität;
es wird die Zerstörung
jeder Zelle bewirken, in die es abgegeben wird.
-
KURZDARSTELLUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
betreffenden Erfinder haben neuartige rekombinante toxische Proteine
hergestellt, die für
Zellen, die mit Retroviren infiziert sind, spezifisch toxisch sind,
und die im Hinblick auf ihre Wirkungsspezifität nicht von einer spezifischen
zellbindenden Komponente abhängen.
-
Die
rekombinanten Proteine der Erfindung haben eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen
Toxins, die über eine
Linker-Sequenz mit einer B-Kette verbunden ist, die innerhalb infizierter
Zellen durch eine retrovirale Protease spezifisch spaltbar sein
kann, um die toxische A-Kette zu aktivieren.
-
In
einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine gereinigte und
isolierte Nukleinsäure
bereit, die eine Nukleotidsequenz besitzt, die für eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen
Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen
Toxins und eine heterloge Linker-Aminosäuresequenz
kodiert, die die A- und B-Ketten verbindet. Die Linker-Sequenz ist
keine Linker-Sequenz eines Ricin-ähnliches Toxins, sondern vielmehr
enthält
die heterologe Linker-Sequenz eine Spaltungserkennungssequenz für eine retrovirale
Protease. Die A-Kette und oder die B-Kette können eine Kette des Ricins
sein.
-
In
einer Ausführungsform
ist die Spaltungserkennungssequenz die Spaltungserkennungssequenz
für eine
HIV-Protease. In
einer besonderen Ausführungsform
umfasst die Linker-Aminosäuresequenz
VSQNYPIVQNFN; SKARVLAEAMSN; oder SIRKILFLDGIN. In weiteren besonderen
Ausführungsformen
hat die Nukleinsäure
die in 8 (SEQ ID NO: 23), 9 (SEQ
ID NO: 24) oder 10 (SEQ ID NO: 25) gezeigte
Nukleotidsequenz.
-
In
einer weiteren Ausführungsform,
ist die Spaltungserkennungssequenz die Spaltungserkennungssequenz
für eine
humane T-Zell-Leukämie-Virus-Protease.
In einer besonderen Ausführungsform
umfasst die Linker-Aminosäuresequenz
SAPQVLPVMHPN oder SKTKVLVVQPKN, gespalten durch eine humane T-Zell-Leukämie-Virus-I-(HTLV-I)-Protease;
oder, SKTKVLVVQPRN oder STTQCFPILHPN, gespalten durch eine humane
T-Zell-Leukämie-Virus-II
(HTLV-II)-Protease.
-
Die
betreffende Erfindung stellt ferner ein Plasmid bereit, das die
Nukleinsäure
der Erfindung beinhaltet. In einer Ausführungsform hat das Plasmid
die Restriktionsschnittkarte, die in den 1A, 2A, 3A, 16A, 17A, 18A oder 19A gezeigt
wird.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung einen Baculovirus-Transfervektor bereit,
der die Nukleinsäure
der Erfindung beinhaltet. In besonderen Ausführungsformen stellt die Erfindung einen
Baculovirus-Transfervektor bereit, der die in den 5, 6, 7, 16C, 17C, 18C oder 19C gezeigte
Restriktionsschnittkarte, oder die in 11 gezeigte
DNA-Sequenz hat.
-
Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein rekombinantes
Protein bereit, das eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette
eines Ricin-ähnlichen
Toxins und eine heterologe Linker-Aminosäuresequenz umfasst, die die
A- und B-Ketten verbindet, wobei die Linker-Sequenz eine Spaltungserkennungssequenz
für eine
retrovirale Protease enthält.
Die A-Kette und oder die B-Kette können eine Kette des Ricins
sein.
-
In
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines rekombinanten
Proteins der Erfindung bereit, das eine heterologe Linker-Sequenz
aufweist, die eine Spaltungserkennungssequenz für die Retrovirus-Protease enthält, zur
Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Inhibierung
oder Zerstörung
von Säugerzellen,
die mit einem Retrovirus infiziert sind, der eine Protease aufweist.
In einer Ausführungsform
ist das Retrovirus HIV.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung eines
rekombinanten Proteins der Erfindung zur Herstellung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung zur Behandlung eines mit HIV infizierten Säugers.
-
Außerdem wird
ein Verfahren zur Herstellung eines Pharmazeutikums zur Behandlung
eines mit einem Retrovirus, der eine Protease besitzt, infizierten
Säugers
bereitgestellt, umfassend die Schritte des Herstellens einer gereinigten
und isolierten Nukleinsäure,
die eine Nukleotidsequenz besitzt, die für eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen
Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen
Toxins und eine heterologe Linker-Aminosäuresequenz, die die A- und
B-Ketten verbindet, kodiert, wobei die Linker-Sequenz eine Spaltungserkennungssequenz
für die
Protease enthält;
Einführen
der Nukleinsäure
in eine Wirtszelle; Exprimieren der Nukleinsäure in der Wirtszelle, um ein
rekombinantes Protein zu erhalten, das eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette
eines Ricin-ähnlichen
Toxins und eine heterologe Linker-Aminosäuresequenz, die die A- und B-Ketten
verbindet, umfasst, wobei die Linker-Sequenz die Spaltungserkennungssequenz
für die
Protease enthält;
und Suspendieren des Proteins in einem pharmazeutisch akzeptablen
Träger,
Verdünnungsmittel
oder Excipienten.
-
In
einer Ausführungsform
wird ein Verfahren zur Herstellung eines Pharmazeutikums zur Behandlung eines
mit einem Retrovirus, der eine Protease besitzt, infizierten Säugers bereitgestellt,
umfassend die Schritte des Identifizierens einer Spaltungserkennungssequenz
für die
Protease; Herstellen eines rekombinanten Proteins, das eine A-Kette
eines Ricin-ähnlichen
Toxins, eine B-Kette
eines Ricin-ähnlichen
Toxins und eine heterloge Linker-Aminosäuresequenz, die die A- und
B-Ketten verbindet, umfasst, wobei die Linker-Sequenz die Spaltungserkennungssequenz
für die
Protease enthält
und Suspendieren des Proteins in einem pharmazeutisch akzeptablen
Träger,
Verdünnungsmittel
oder Excipienten.
-
In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische
Zusammensetzung für
die Behandlung einer retroviralen Infektion, wie etwa HIV, in einem
Säuger
bereit, die das rekombinante Protein der Erfindung und einen pharmazeutisch
akzeptablen Träger,
Verdünnungsmittel
oder Excipienten umfasst.
-
Die
Erfindung betrifft außerdem
die Verwendung eines rekombinanten Proteins der Erfindung, das eine
heterologe Linker-Sequenz aufweist, die eine Spaltungserkennungssequenz
für eine
HTLV-Protease enthält,
zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung
von Krebszellen, die eine HTLV-Protease enthalten. Die Zusammensetzung
kann verwendet werden, um einen Säuger mit humanen T-Zell-Leukämien, an
denen ein HTLV beteiligt ist, zu behandeln. Zusammensetzungen für die Behandlung
von humanen T-Zell-Leukämien,
an denen ein HTLV beteiligt ist, die das rekombinante Protein der
Erfindung, das eine heterologe Linker-Sequenz aufweist, die eine
Spaltungserkennungssequenz für
eine HTLV-Protease enthält,
und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Excipient
umfassen, werden außerdem
bereitgestellt.
-
Andere
Objekte, Merkmale und Vorteile der betreffenden Erfindung werden
aus der folgenden ausführlichen
Beschreibung offenbar.
-
BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
Die
Erfindung ist unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen besser
zu verstehen:
-
1A fasst
die Klonierungsstrategie zusammen, die verwendet wurde, um das pAP-146-Konstrukt zu
generieren;
-
1B zeigt
die Nukleotidsequenz der HIV-A-Linkerregion
von pAP-146;
-
2A fasst die Klonierungsstrategie zusammen, die
verwendet wurde, um das pAP-147-Konstrukt zu generieren;
-
2B zeigt die Nukleotidsequenz der HIV-B-Linkerregion von
pAP-147;
-
3A fasst die Klonierungsstrategie zusammen, die
verwendet wurde, um das pAP-148-Konstrukt zu generieren;
-
3B zeigt die Nukleotidsequenz der HIV-H-Linkerregion von
pAP-148;
-
4 zeigt
die Aminosäuresequenzen
des Wildtyp-Ricin-Linkers,
des pAP-146-Linkers, des pAP-147-Linkers und des pAP-148-Linkers;
-
5 zeigt
das Subklonieren der HIV-A-Linkervariante in einen Baculovirus-Transfervektor;
-
6 zeigt
das Subklonieren der HIV-B-Linkervariante in einen Baculovirus-Transfervektor;
-
7 zeigt
das Subklonieren der HIV-H-Linkervariante in einen Baculovirus-Transfervektor;
-
8 zeigt
die DNA-Sequenz des pAP-190-Inserts (SEQ ID NO: 23);
-
9 zeigt
die DNA-Sequenz des pAP-196-Inserts (SEQ ID NO: 24);
-
10 zeigt die DNA-Sequenz des pAP-197-Inserts (SEQ
ID NO: 25);
-
11 zeigt die DNA-Sequenz des Baculovirus-Transfervektors pVL1393
(SEQ ID NO: 26);
-
12 ist ein Diagramm des Vektors pSB2;
-
13 zeigt einen Western Blot einer pAP-190-Proricinvariante;
-
14 ist ein Blot, der die Spaltung einer pAp-190-Proricinvariante
mittels HIV-Protease zeigt;
-
15 ist ein Blot, der die Aktivierung einer pAp-190-Proricinvariante
mittels HIV-Protease zeigt;
-
16A ist ein Diagramm, das die Klonierungsstrategie
zusammenfasst, die verwendet wurde, um das pAP-205-Konstrukt zu generieren;
-
16B zeigt die Nukleotidsequenz der HTLV-I-A-Linkerregionen von
pAP-205;
-
16C ist ein Diagramm, das das Subklonieren der
HTLV-I-A-Linkervariante in einen Baculovirus-Transfervektor zeigt;
-
16D zeigt die DNA-Sequenz des pAP-206-Inserts,
das Ricin und den HTLV-I-A-Linker enthält;
-
17A ist ein Diagramm, das die Klonierungsstrategie
zusammenfasst, die verwendet wurde, um das pAP-207-Konstrukt zu generieren;
-
17B zeigt die Nukleotidsequenz der HTLV-I-B-Linkerregionen von
pAP-207;
-
17C ist ein Diagramm, das das Subklonieren der
HTLV-I-B-Linkervariante in einen Baculovirus-Transfervektor zusammenfasst;
-
17D zeigt die DNA-Sequenz des pAP-208-Inserts,
das Ricin und den HTLV-I-B-Linker enthält;
-
18A ist ein Diagramm, das die Klonierungsstrategie
zusammenfasst, die verwendet wurde, um das pAP-209-Konstrukt zu generieren;
-
18B zeigt die Nukleotidsequenz der HTLV-II-A-Linkerregionen von
pAP-209;
-
18C ist ein Diagramm, das das Subklonieren der
HTLV-II-A-Linkervariante in einen Baculovirus-Transfervektor zusammenfasst;
-
18D zeigt die DNA-Sequenz des pAP-210-Inserts,
das Ricin und den HTLV-II-A-Linker enthält;
-
19A ist ein Diagramm, das die Klonierungsstrategie
zusammenfasst, die verwendet wurde, um das pAP-211-Konstrukt zu generieren;
-
19B zeigt die Nukleotidsequenz der HTLV-II-B-Linkerregionen von
pAP-211;
-
19C ist ein Diagramm, das das Subklonieren der
HTLV-II-B-Linkervariante in einen Baculovirus-Transfervektor zusammenfasst;
-
19D zeigt die DNA-Sequenz des pAP-212-Inserts,
das Ricin und den HTLV-Linker enthält; und
-
20 zeigt die Aminosäuresequenzen des Wildtyp-Ricin-Linkers und
des HTLV-Protease-sensitiven Aminosäurelinkers, der in den Linkern
pAP-205 bis pAP-212 enthalten ist.
-
GENAUE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Nukleinsäuremoleküle der Erfindung
-
Die
betreffenden Erfinder haben neuartige gereinigte und isolierte Nukleinsäuremoleküle kloniert
und exprimiert, die eine Nukleotidsequenz aufweisen, die für eine A-Kette
eines Ricin-ähnlichen
Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins und eine heterloge
Linker-Aminosäuresequenz,
die die A- und B-Ketten verbindet, kodiert. Die heterologe Linker-Sequenz
enthält
eine Spaltungserkennungssequenz für eine retrovirale Protease,
wie etwa eine Spaltungserkennungssequenz für HIV oder eine humane T-Zell-Leukämie-Virus-Protease.
-
Die
Begriffe „isoliert
und gereinigt",
wie sie hier verwendet werden, betreffen eine Nukleinsäure, die
im Wesentlichen frei von zellulärem
Material oder Kulturmedium ist, wenn sie mittels rekombinanter DNA-Techniken produziert
wird, oder frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien,
wenn sie chemisch synthetisiert wird. Eine „isolierte und gereinigte" Nukleinsäure ist
außerdem
im Wesentlichen frei von Sequenzen, die die Nukleinsäure natürlich flankieren
(d.h., Sequenzen, die an den 5'-
und 3'-Enden der
Nukleinsäure
untergebracht sind), aus der die Nukleinsäure abgeleitet ist. Der Begriff „Nukleinsäure" soll DNA und RNA
einschließen,
wobei sie sowohl doppel- als auch einzelsträngig sein kann.
-
Der
Begriff „Linker-Sequenz", wie er hier verwendet
wird, betrifft eine interne Aminosäuresequenz innerhalb des Proteins,
die für
das Nukleinsäuremolekül der Er findung
kodiert, das Reste enthält,
die die A- und B-Kette
verbinden, um damit die A-Kette unfähig machen, ihre toxische Wirkung
auszuüben,
zum Beispiel indem sie die Translation eines eukaryontischen Ribosoms
katalytisch inhibiert. Mit heterolog ist gemeint, dass die Linker-Sequenz
keine Sequenz ist, die für
eine A- oder B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins oder eines Vorläufers davon,
nativ ist. Jedoch können
die Linker-Sequenzen
vorzugsweise von ähnlicher
Länge sein
wie die Linker-Sequenzen eines Ricin-ähnlichen Toxins und sollten
die Rolle, die die B-Kette bei der Zellbindung und dem Transport
in das Cytoplasma spielt, nicht stören. Wenn die Linker-Sequenz
gespalten ist, wird die A-Kette aktiv oder toxisch.
-
Das
Nukleinsäuremolekül der Erfindung
wurde kloniert, indem ein Präproricin-cDNA-Klon
(pAP-144) einer ortsgerichteten Mutagenese unterzogen wurde, um
eine Serie von Varianten zu generieren, die sich nur in der Sequenz
zwischen den A- und B-Ketten unterscheiden (Linkerregion). Oligonukleotide,
die den äußersten
5'- und 3'-Enden des Präproricingens
entsprechen, wurden synthetisiert und verwendet, um das Gen mittels
PCR zu amplifizieren. Bei der Verwendung der cDNA-Sequenz für Präproricin
(Lamb et al., Eur. J. Biochem., 145: 266–270, 1985) wurden mehrere
Oligonukleotidprimere designed, um die Start- und Stoppcodone des
offenen Leserahmens des Präproricins
zu flankieren.
-
Die
Präproricin-cDNA
wurde unter Verwendung des Upstream-Primers Ricin-99 amplifiziert
(Ricin-109 kann ebenfalls verwendet werden) und des Downstream-Primers
Ricin1729C mit Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs) unter Verwendung
von Standardverfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Second Edition, (Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)). Mit
der Verwendung des Upstream-Primers Ricin-109 wird der Subklonierungsschritt
in den Vektor pSB2 umgangen.
-
Das
gereinigte PCR-Fragment, das die Präproricin-cDNA kodiert, wurde
dann in ein Eco-RV-verdautes pBluescript-II-SK-Plasmid (Stratagene)
ligiert, und verwendet, um kompetente XL1-Blue Zellen (Stratagene)
zu transformieren.
-
Das
klonierte PCR-Produkt, das das vermutete Präproricingen enthält, wurde
mittels DNA-Sequenzierung des gesamten cDNA-Klons (pAP-144) bestätigt. Die
Sequenzen und der Ort der Oligonukleotidprimer, die für die Sequenzierung
verwendet wurden, werden in Tabelle 1 gezeigt.
-
Der
Präproricin-cDNA-Klon
(pAP-144) wurde einer ortsgerichteten Mutagenese unterzogen, um
eine Serie von Varianten zu generieren, die sich nur in der Sequenz
zwischen den A- und B-Ketten unterscheiden (Linkerregion). Die Wildtyp-Präproricin-Linkerregion
wurde mit den drei Linker-Sequenzen pAP-146, pAP-147 und pAP-148
ersetzt, die in 4 gezeigt werden. Die Linkerregionen
der Varianten kodieren eine HIV-Protease-Spaltungserkennungssequenz (Slalka et
al., Cell, 56: 911–913,
1989). Die Mutagenese- und Klonierungsstrategie, die verwendet wurde,
um die Linkervarianten pAP-146,
pAP-147 und pAP-148 zu generieren, werden in 1A bzw. 1B, 2A bzw. 2B und 3A bzw. 3B zusammengefasst.
Der erste Schritt war mit einer DNA-Amplifikation unter Verwendung
eines Satzes mutagener Primer (HIVA 1, 2; HIVB 1, 2; HIVH 1, 2)
verbunden, in Kombination mit den zwei flankierenden Primern Ricin-99Eco
und Ricin1729Xba. Restriktionsverdaute PCR-Fragmente wurden Gel-gereinigt
und dann mit PBluescript-SK ligiert, das mit EcoRI und XbaI verdaut
worden war. Ligationsreaktionen wurden verwendet, um kompetente
XL1-Blue-Zellen (Stratagene) zu transformieren. Rekombinante Klone
wurden mittels Restriktionsverdautn von Plasmid Miniprep-DNA identifiziert,
und die mutanten Linker-Sequenzen wurden mittels DNA-Sequenzierung
bestätigt.
-
Rekombinante
Klone wurden in den Vektor pSB2 subkloniert. Die drei erhaltenen
Konstrukte waren pAP-151, pAP-159 und pAP-163, wobei jedes den mutanten
Linker aufweist der in pAP-146, pAP-147 bzw. pAP-148 gefunden wurde.
-
Die
oben beschriebene Klonierungsstrategie kann auch auf die Herstellung
rekombinanter Klone, die eine Spaltungserkennungssequenz für eine humane
T-Zell-Leukämie-Virus-Protease enthalten,
angewendet werden. Zum Beispiel wurden die rekombinanten Klone pAP-205,
pAP-207, pAP-209 und pAP-211 unter Verwendung eines ähnlichen
Verfahrens wie dem oben beschriebenen, hergestellt.
-
Das
Nukleinsäuremolekül der Erfindung
hat Sequenzen, die eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen
Toxins und eine heterologe Linker-Sequenz, die eine Spaltungserkennungssequenz
für eine
retrovirale Protease enthält,
wie etwa eine HIV-Protease
oder eine HTLV-Protease, kodiert. Die Nukleinsäure kann exprimiert werden,
um ein rekombinantes Protein bereitzustellen, das eine A-Kette eines
Ricin-ähnlichen
Toxins, eine B-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins und eine heterologe
Linker-Sequenz, die eine Spaltungserkennungssequenz für eine retrovirale
Protease, wie etwa eine HIV-Protease oder eine HTLV-Protease, enthält.
-
Das
Nukleinsäuremolekül kann die
A- und/oder B-Kette des Ricins umfassen. Das Ricingen wurde kloniert
und sequenziert, und die Röntgenkristallstrukturen
der A- und B-Ketten
wurden veröffentlicht
(Rutenber, E., et al. Proteins 10: 240–250 (1991); Weston et al.,
Mol. Bio. 244.410–422,
1994; Lamb and Lord Eur. J. Biochem. 14: 265 (1985); Halling, K.,
et al. Nucleic Acids Res. 13: 8019 (1985)). Es wird ersichtlich,
dass die Erfindung Nukleinsäuremoleküle einschließt, die
Trunkationen von A- und B-Ketten von Ricin-ähnlichen Proteinen und Analogen
und Homologen von A- und B-Ketten von Ricin-ähnlichen
Proteinen und Trunkationen davon (d.h. Ricin-ähnliche
Proteine), wie hier beschrieben, kodieren. Es ist ferner ersichtlich,
dass variante Formen der Nukleinsäuremoleküle der Erfindung, die durch
alternatives Splicing einer mRNA entstehen, die einer cDNA der Erfindung
entspricht, durch die Erfindung erfasst sind.
-
Ein
weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine Nukleotidsequenz bereit,
die unter Bedingungen hoher Stringenz zu einer Nukleotidsequenz
hybridisiert, die A- und/oder
B-Ketten eines Ricin-ähnlichen
Proteins kodiert. Geeignete Stringenzbedingungen, die die DNA-Hybridisierung fördern, sind
den Fachleuten bekannt oder finden sich in Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons,
New York (1989), 6.3.1–6.3.6. Zum
Beispiel kann 6.0 × Natriumchlorid/Natriumcitrat
(SSC) bei etwa 45°C,
gefolgt von einer Wäsche
von 2.0 × SSC
bei 50°C
verwendet werden. Die Stringenz kann auf der Basis der im Waschschritt
verwendeten Bedingungen ausgewählt
werden. Beispielsweise kann die Salzkonzentration im Waschschritt
mit einer hohen Stringenz von etwa 0.2 × SSC bei 50°C ausgewählt werden.
Zusätzlich
kann die Temperatur im Waschschritt unter hohen Stringenzbedingungen
bei etwa 65°C
liegen.
-
Das
Nukleinsäuremolekül kann die
A- und/oder B-Kette eines Ricin-ähnlichen
Toxins umfassen. Verfahren zur Klonierung Ricin-ähnlicher Toxine sind den Fachleuten
bekannt und zum Beispiel in
EP
466 222 beschrieben. Sequenzen, die Ricin- oder Ricin-ähnliche
A- und B-Ketten kodieren, können
mittels selektiver Amplifikation einer kodierenden Region erhalten
werden, unter Verwendung von Sätzen
degenerativer Primer oder Sonden für die selektive Amplifikation
der kodierenden Region in einer genomen Bibliothek oder cDNA-Bibliothek.
Geeignete Primer können
aus der Nukleinsäuresequenz
der A- und B- Ketten
von Ricin oder von Ricin-ähnlichen
Toxinen ausgewählt
werden. Außerdem
ist es möglich,
synthetische Oligonukleotidprimer aus den Nukleotidsequenzen für die Verwendung
in der PCR zu designen. Passende Primere können ausgewählt werden aus Sequenzen kodierenden
Regionen von Ricin-ähnlichen
Proteinen, die stark konserviert sind, wie zum Beispiel in der US-Patentschrift
Nr. 5,101,025 und
EP 466 222 beschrieben.
-
Eine
Nukleinsäure
kann unter Verwendung dieser Oligonukleotidprimer und Standard-PCR-Amplifikationstechniken
aus einer cDNA oder aus einer genomen DNA amplifiziert sein. Die
so amplifizierte Nukleinsäure
kann in einen geeigneten Vektor kloniert und mittels DNA-Sequenzanalyse
charakterisiert werden. Es wird ersichtlich, dass cDNA aus mRNA
hergestellt werden kann, indem gesamte zelluläre mRNA mittels einer Vielzahl
von Techniken isoliert wird, zum Beispiel, unter Verwendung des
Guanidinium-Thiocyanat-Extraktionsverfahrens
von Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294–5299 (1979). Die cDNA wird
dann aus der mRNA synthetisiert unter Verwendung der reversen Transkriptase
(zum Beispiel, Moloney MLV reverse Transkriptase, erhältlich bei
Gibco/BRL, Bethesda, MD., oder AMV reverse Transkriptase, erhältlich bei
Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, Florida). Es wird ersichtlich,
dass die oben beschriebenen Verfahren verwendet werden können, um
die kodierende Sequenz aus Pflanzen, Bakterien oder Pilzen zu erhalten,
vorzugsweise aus Pflanzen, die bekannte Ricin-ähnliche Proteine produzieren
und auch, um nach der Gegenwart von Genen zu screenen, die bisher
noch unbekannte Ricin-ähnliche
Proteine kodieren.
-
Eine
Sequenz, die eine Spaltungserkennungssequenz für eine retrovirale Protease
enthält,
kann ausgewählt
werden auf der Basis des Retrovirus, das durch das rekombinante
Protein targetiert werden soll. Die Spaltungs erkennungssequenz kann
ausgewählt
werden aus Sequenzen, die bekannt dafür sind, dass sie eine Spaltungserkennungssequenz
für die
Retrovirus-Protease kodieren. Sequenzen, die Spaltungserkennungssequenzen
kodieren, können
mittels Testen des Expressionsprodukts der Sequenz auf Anfälligkeit
für die
Spaltung durch eine retrovirale Protease hin identifiziert werden.
Ein Assay zur Identifizierung von Peptiden, die Spaltungserkennungssequenzen
für HIV-Protease
aufweisen, ist in PCT/US88/01849 beschrieben. Die HIV-Protease ist
durch das p17-Gen von HIV kodiert und weist das hochkonservierte
Asp-Thr-Gly-Sequenzmerkmal der Aktivstelle der zellulären Aspartylproteasen
auf. Die HIV-Protease kann mittels im Fachgebiet bekannter Verfahren
hergestellt, und zum Testen vermuteter Spaltungserkennungssequenzen
verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Polypeptid, das die vermutete
Spaltungserkennungssequenz enthält,
mit der Protease inkubiert, und die Menge des Spaltungsprodukts
determiniert werden (Dilannit, 1990, J. Biol. Chem. 285: 17345–17354).
Substrate für
HIV-Proteasen sind in der US-Patentschrift Nr. 5,235,039 beschrieben.
Die Erfindung ist nicht auf Proteine beschränkt, die die Spaltungserkennungssequenz
für HIV-Proteasen
enthalten, sondern schließt
Erkennungssequenzen anderer retroviraler Proteasen ein, einschließlich Proteasen
von Mitgliedern der Unterfamilien Oncovirinae, Lentivirinae und
Spumavirinae, zum Beispiel von HTLV, AMV, RSV, BLV, FeLV und MMTV.
Beispiele für
retrovirale Proteasen und konservierte Sequenzen davon werden, zum Beispiel,
in Katoh et al., (Nature 329: 654–656) bereitgestellt.
-
Eine
Sequenz, die eine Spaltungserkennungssequenz für eine HTLV-Protease enthält, kann
unter Verwendung der hier beschriebenen herkömmlichen Verfahren ausgewählt werden.
Die Herstellung humaner T-Zell-Leukämie-Virus-Proteasen, ihrer Substrate und die Enzymaktivitäts-Assay-Methodik wurden
beschrieben von Petit, S. C. et al. (J. Biol. Chem. 266: 14539–14547 (1991))
und Blaha, I. et al. (FEBS Lett. 309: 389–393 (1992)).
-
In
einer Ausführungsform
ist die Spaltungserkennungssequenz die Spaltungserkennungssequenz
für eine
HIV-Protease. In
einer besonderen Ausführungsform
umfasst die Linker-Aminosäuresequenz
VSQNYPIVQNFN; SKARVLAEAMSN; oder SIRKILFLDGIN. In weiteren besonderen
Ausführungsformen
hat die Nukleinsäure,
die in 8 (SEQ ID NO: 23), 9 (SEQ
ID NO: 24) oder 10 (SEQ ID NO: 25) gezeigte
Nukleotidsequenz.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
ist die Spaltungserkennungssequenz die Spaltungserkennungssequenz
für eine
humane T-Zell-Leukämie-Virus-Protease.
In einer besonderen Ausführungsform
umfasst die Linker-Aminosäuresequenz
SAPQVLPVMHPN oder SKTKVLVVQPKN, gespalten durch eine humane T-Zell-Leukämie-Virus-I-(HTLV-I)-Protease;
oder SKTKVLVVQPRN oder STTQCFPILHPN, gespalten durch eine humane
T-Zell-Leukämie-Virus-II
(HTLV-II)-Protease.
-
Das
Nukleinsäuremolekül der Erfindung
kann durch ortsgerichtete Mutagenese hergestellt werden. Zum Beispiel
kann der Spaltungsort einer retroviralen Protease mittels ortsgerichteter
Mutagenese der homologen Linker-Sequenzen
eines Proricin-ähnlichen
Toxins hergestellt werden. Verfahren für die Klonierung Proricin-ähnlicher
Gene, die eine Linker-Sequenz kodieren, sind in
EP 466 222 beschrieben. Ortsgerichtete
Mutagene können
mittels DNA-Amplifikation der mutagenen Primere in Kombination mit
den flankierenden Primeren ausgeführt werden. Passende Verfahren,
in denen die mutagenen Primere HIVA1, HIVB1 und HIVH1 verwendet
werden, werden in
1A bis
3B und
16A,
16B,
17A,
17B,
18A,
19A und
19B gezeigt.
-
Das
Nukleinsäuremolekül der Erfindung
kann auch ein Fusionsprotein kodieren. Eine Sequenz, die eine heterologe
Linker-Sequenz kodiert, die eine Spaltungserkennungssequenz für eine retrovirale
Protease enthält,
kann aus einer cDNA-Bibliothek oder Genombibliothek kloniert werden
oder auf der Basis der bekannten Sequenz solcher Spaltungssequenzen
chemisch synthetisiert werden. Die heterologe Linker-Sequenz kann
dann im Leserahmen mit den Sequenzen, die die A- und B-Ketten des
Ricin-ähnlichen
Toxins kodieren, für
die Expression als Fusionsprotein eingefügt werden. Es wird ersichtlich,
dass ein Nukleinsäuremolekül, das ein
Fusionsprotein kodiert, eine Sequenz enthalten kann, die eine A-Kette
und ein B-Kette des gleichen Ricin-ähnlichen Toxins kodieren kann,
oder die kodierten A- und B-Ketten von unterschiedlichen Toxinen
stammen können.
Zum Beispiel kann die A-Kette von Ricin abgeleitet sein und die
B-Kette kann von
Abrin abgeleitet sein. Ein Protein kann außerdem mittels chemischer Konjugation
der A- und B-Ketten
und Linker-Sequenzen unter Verwendung herkömmlicher Kopplungsmittel für kovalente
Anheftung hergestellt werden.
-
Ein
isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül der Erfindung, das RNA ist,
kann mittels Klonierung einer cDNA isoliert werden, die eine A-
und B-Kette und einen Linker in einen geeigneten Vektor kodiert,
wodurch es möglich
wird, durch Transkription der cDNA, ein RNA-Molekül herzustellen, das ein Protein
der Erfindung kodiert. Zum Beispiel kann eine cDNA stromabwärts eines
Bakteriophagen-Promoters, (z. B. eines T7-Promoters) in einen Vektor
kloniert werden, die cDNA kann in vitro mit T7-Polymerase transkribiert
werden, und die resultierende RNA kann mittels Standardtechniken
isoliert werden.
-
Rekombinantes Protein
der Erfindung
-
Wie
vorstehend erwähnt,
stellt die Erfindung neuartige rekombinante Proteine bereit, die
die A- und B-Ketten eines Ricin-ähnlichen
Toxins beinhalten, die durch eine heterologe Linker-Sequenz verbunden
sind, die eine Spaltungserkennungssequenz für eine retrovirale Protease,
wie etwa eine HIV-Protease oder eine HTLV-Protease enthalten. Es
ist ein Vorteil der rekombinanten Proteine der Erfindung, dass sie
solange nicht toxisch sind, bis die A-Kette von der B-Kette mittels
spezifischer Spaltung des Linkers durch die retrovirale Protease,
wie etwa eine HIV-Protease oder eine HTLV-Protease, abgespalten
ist. Somit kann das Protein verwendet werden, um Zellen zu targetieren,
die mit dem Retrovirus infiziert sind, in Abwesenheit zusätzlicher
spezifischer zellbindender Komponenten zur Targetierung infizierter
Zellen. Ein weiterer Vorteil ist, dass die retrovirale Protease
die heterologen Linker intrazellulär spaltet, und dabei die toxische
A-Kette direkt in das Cytoplasma der infizierten Zelle freigibt.
In der Folge werden die infizierten Zellen spezifisch targetiert
und nicht-infizierte
Zellen werden der aktivierten freien A-Kette nicht direkt ausgesetzt.
-
Ricin
ist ein von Pflanzen abgeleitetes Ribosominhibierendes Protein,
das die Proteinsynthese in eukaryontischen Zellen blockiert. Ricin
kann abgeleitet werden von den Samen der Ricinus communis (Kastorölpflanze).
Das Ricintoxin ist ein glycosyliertes Heterodimer mit A- und B-Kette
mit Molekularmassen von 30.625 Da bzw. 31.431 Da. Die A-Kette von
Ricin hat eine N-Glycosidase-Aktivität und katalysiert die Exzision
eines spezifischen Adeninrests der 28S rRNA eukaryontischer Ribosomen
(Endo, Y; & Tsurugi,
K. J. Biol. Chem. 262: 8128 (1987)). Die B-Kette von Ricin, obwohl
selbst nicht toxisch, fördert
die Toxizität
der A-Kette, indem sie an Galactosereste auf der Oberfläche eukaryontischer
Zelle bindet und die rezeptorvermittelte Endocy tose der Toxinmoleküle stimuliert
(Simmons et al. Biol. Chem. 261: 7912 (1986)).
-
Proteintoxine
werden anfangs in einer inaktiven Vorläuferform produziert. Ricin
wird anfangs als ein einfaches Polypeptid (Präproricin) mit einer N-terminalen
Präsequenz
von 35 Aminosäuren
und 12 Aminosäurelinkern
zwischen den A- und B-Ketten produziert. Die Präsequenz wird während der
Translokation des Ricin-Vorläufers
in das endoplasmatische Retikulum entfernt (Lord, J. M. Eur. J.
Biochem. 146: 403–409
(1985) und Lord, J. M. Eur. J. Biochem. 146: 411–416 (1985)). Das Proricin
wird dann in spezialisierte Organellen transloziert, genannt Proteinkörper, in
denen eine Pflanzenprotease das Protein in einer Linkerregion zwischen den
A- und B-Ketten spaltet (Lord, J. M. et al., FASAB Journal 8: 201–208 (1994)).
Die beiden Ketten bleiben jedoch durch eine Disulfidbrücke (Cystein
259 in der A-Kette zu Cystein 4 in der B-Kette) kovalent gebunden, und
reifes Disulfid-gebundenes
Ricin wird von den Pflanzenzellen abgesondert. Die A-Kette ist in
dem Proricin inaktiv (O'Hare,
M., et al. FEBS Lett. 273: 200–204
(1990)), und sie ist in dem Disulfid-verlinkten reifen Ricin inaktiv
(Richardson, P. T., et al. FEBS Lett. 255: 15–20 (1989)). Die Ribosomen
des Rizinusstrauchs sind selbst anfällig für die Inaktivierung durch die
Ricin-A-Kette; da jedoch keine Galactose auf der Zelloberfläche vorhanden
ist, die die B-Ketten-Erkennung erlaubt, kann die A-Kette nicht erneut
in die Zelle eindringen.
-
Ricin-ähnliche
Proteine schließen
bakterielle, fungale und pflanzliche Toxine ein, die A- und B-Ketten aufweisen
und Ribosomen inaktivieren und die Proteinsynthese inhibieren. Die
A-Kette ist eine aktive Polypeptid-Untereinheit, die für die pharmakologische Wirkung
des Toxins verantwortlich ist. In den meisten Fällen ist die aktive Komponente
einer A-Kette ein Enzym. Die B-Kette
ist verantwortlich für
die Bindung des Toxins an die Zelloberfläche und ist dazu gedacht, den
Eintritt der A-Kette in das Cytoplasma der Zelle zu erleichtern.
Die A- und B-Ketten in den reifen Toxinen sind durch Disulfidbindungen
verbunden. Die Toxine, die Ricin in der Struktur am ähnlichsten
sind, sind pflanzliche Toxine, die eine A-Kette und eine B-Kette
aufweisen. Beispiele für
solche Toxine schließen
Abrin ein, das aus den Samen von Abrus precatorius isoliert werden
kann, Ricin, das aus den Samen der Riziniusbohnen, Ricinus communis,
isoliert werden kann, und Modeccin.
-
Ricin-ähnliche
bakterielle Proteine schließen
Diphtherietoxin ein, das von Corynebacterium diphtheriae hergestellt
wird, Pseudomonasenterotoxin A und Choleratoxin. Es wird ersichtlich,
dass der Begriff Ricin-ähnliche
Toxine auch die A-Kette jener Toxine einschließen soll, die nur eine A-Kette
aufweisen. Die rekombinanten Proteine der Erfindung könnten die
A-Kette dieser Toxine, konjugiert zu, oder exprimiert als ein rekombinantes
Protein mit der B-Kette eines anderen Toxins einschließen. Beispiele
für pflanzliche
Toxine, die nur eine A-Kette aufweisen, schließen Trichosanthin, MMC und
antivirale Kermesbeer-Proteine, Dianthin 30, Dianthin 32, Crotin
II, Curcin II und Weizenkeim-Inhibitor ein. Beispiele für fungale
Toxine, die nur eine A-Kette aufweisen, schließen Alpha-sarcin, Restrictocin,
Mitogillin, Enomycin, Phenomycin ein. Beispiele für bakterielle Toxine,
die nur eine A-Kette aufweisen, schließen Cytotoxin von Shigella
dysenteriae und verwandte Shiga-ähnliche
Toxine ein. Rekombinantes Trichosanthin und die kodierende Sequenz
davon ist in den US-Patentschriften mit den Nr. 5,101,025 und 5,128,460
offenbart.
-
Zusätzlich zu
den gesamten B- oder A-Ketten eines Ricin-ähnlichen Toxins, ist ersichtlich,
dass das rekombinante Protein der Erfindung nur den Abschnitt der
A-Kette enthalten
kann, der für
die Ausübung
seiner cyto toxischen Wirkung notwendig ist. Zum Beispiel können die
ersten 30 Aminosäuren
der Ricin-A-Kette entfernt werden, was in einer trunkierten A-Kette
resultiert, welche die toxische Aktivität bewahrt. Das trunkierte Ricin
oder die Ricin-ähnliche
A-Kette kann mittels Expression eines trunkierten Gens oder mittels
proteolytischem Abbau, zum Beispiel mit Nagarase hergestellt werden
(Funmatsu et al., 1970, Jap. J. Med. Sci. Biol. 23: 264–267). In ähnlicher
Weise kann das rekombinante Protein der Erfindung nur den Abschnitt
der B-Kette enthalten, der für
die Galactoseerkennung, die Zellbindung und den Transport in das
Cytoplasma der Zelle notwendig ist. Trunkierte B-Ketten werden zum
Beispiel in
EP 145 111 beschrieben.
Die A- und B-Ketten können glycosyliert
oder nicht glycosyliert sein. Glycosylierte A- und B-Ketten können mittels
Expression in der geeigneten Wirtszelle erhalten werden, die zur
Glycosylierung fähig
ist. Nicht glycosylierte Ketten können mittels Expression in
nicht glycosylierende Wirtszellen oder mittels Behandlung zur Entfernung
oder Zerstörung
der Kohlenhydrateinheiten erhalten werden.
-
Die
Proteine der Erfindung können
unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren hergestellt werden.
Folglich können
die Nukleinsäuremoleküle der betreffenden
Erfindung in bekannter Weise in einen geeigneten Expressionsvektor
eingebaut werden, der eine gute Expression des Proteins gewährleistet.
Mögliche Expressionsvektoren
schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
auf Cosmide, Plasmide oder modifizierte Viren (z. B. replikationsdefekte
Retroviren, Adenoviren und adenoassoziierte Viren), solange der
Vektor mit den verwendeten Wirtszellen kompatibel ist. Expressionsvektoren,
die „geeignet
für die
Transformation einer Wirtszelle" sind,
bedeutet, dass die Expressionsvektoren ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung
und regulatorische Sequenzen enthalten, die auf der Basis der Wirtzellen
ausgewählt
werden, die für
die Expression verwendet werden, welche wirksam mit dem Nukleinsäuremolekül verbunden
sind. Wirksam verbunden soll bedeuten, dass die Nukleinsäure mit
regulatorischen Sequenzen auf eine Weise verbunden ist, die die
Expression der Nukleinsäure
ermöglicht.
-
Daher
betrachtet die Erfindung einen rekombinanten Expressionsvektor der
Erfindung, der ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung
oder ein Fragment davon enthält,
und die für
die Transkription und Translation der eingefügten Proteinsequenz notwendigen
regulatorischen Sequenzen. Passende regulatorische Sequenzen können von
einer Vielzahl von Quellen abgeleitet werden, einschließlich bakterieller,
fungaler, viraler Gene, Säugetier-
oder Insektengene (vgl. zum Beispiel, die regulatorischen Sequenzen,
beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology
185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Wie nachfolgend diskutiert,
ist die Auswahl geeigneter regulatorischer Sequenzen abhängig von
den gewählten Wirtszellen
und kann von einem Fachmann ohne weiteres erreicht werden. Beispiele
für solche
regulatorische Sequenzen schließen
ein: Einen Transkriptionspromoter und -verstärker oder eine RNA-Polymerase-bindende Sequenz,
eine ribosomale Bindungssequenz, einschließlich eines Translationsinitiationssignals.
Zusätzlich können, abhängig von
der gewählten
Wirtszelle und dem verwendeten Vektor, andere Sequenzen, wie etwa ein
Replikationsstartpunkt, zusätzliche
DNA-Restriktionsorte, Verstärker
und Sequenzen, die Transkriptionsinduzierbarkeit verleihen, in den
Expressionsvektor eingebaut werden. Es ist ebenfalls ersichtlich,
dass die notwendigen regulatorischen Sequenzen von den nativen A-
und B-Ketten und/oder deren flankierenden Regionen geliefert werden
können.
-
Die
rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können ebenfalls
ein selektierbares Markergen enthalten, das die Selektion von Wirtszellen
erleichtert, die mit einem rekombinanten Molekül der Erfindung transformiert
oder transfiziert sind. Beispiele für selektierbare Markergene
sind Gene, die ein Protein wie etwa G418 und Hygromycin kodieren,
das Resistenz gegenüber
bestimmten Arzneien verleiht, β-Galactosidase,
Chloramphenicolacetyltransferase, Glühwürmchen-Luciferase oder ein
Immunglobulin oder ein Abschnitt davon, wie etwa den Fc-Abschnitt
eines Immunglobulins, vorzugsweise IgG. Die Transkription des selektierbaren
Markergens wird durch Veränderungen
in der Konzentration des selektierbaren Markerproteins, wie etwa β-Galactosidase,
Chloramphenicolacetyltransferase oder Glühwürmchen-Luciferase überwacht. Wenn das selektierbare
Markergen ein Protein kodiert, das Antibiotikaresistenz verleiht,
wie etwa Neomycin, können resistenztransformante
Zellen mit G418 ausgewählt
werden. Zellen, die das selektierbare Markergen beinhalten, werden überleben,
während
andere Zellen sterben. Das macht es möglich, die Expression der rekombinanten
Expressionsvektoren der Erfindung zu visualisieren und zu prüfen, und
insbesondere, die Wirkung einer Mutation auf Expression und Phänotyp zu
determinieren. Es wird ersichtlich, dass die selektierbaren Marker
auf einen separaten Vektor der interessierenden Nukleinsäure eingeführt werden
können.
-
Die
rekombinanten Expressionsvektoren können außerdem Gene enthalten, die
einen Fusionsanteil kodieren, welcher die erhöhte Expression des rekombinanten
Proteins; erhöhte
Löslichkeit
des rekombinanten Proteins; und Hilfe bei der Reinigung des rekombinanten
Targetproteins bereitstellt, indem sie als Ligand bei der Affinitätsreinigung
handeln. Zum Beispiel kann eine proteolytische Spaltungssequenz
einem rekombinanten Targetprotein zugefügt werden, um das Separieren
des rekombinanten Proteins des Fusionsanteils, anschließend an
die Reinigung des Fusionsproteins, zu ermöglichen. Typische Fusionsexpressionsvektoren schließen pGEX
(Amrad Corp., Melbourne, Australia), pMAL (New England Bi olabs,
Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N. J.) ein, die Glutathion-S-transferase
(GST), Maltose-E-Bindungsprotein
bzw. Protein A zu dem rekombinanten Protein fusionieren.
-
Rekombinante
Expressionsvektoren können
in die Wirtszellen eingeführt
werden, um eine transformante Wirtszelle zu produzieren. Der Begriff „transformante
Wirtszelle" soll
prokaryontische und eukaryontische Zellen einschließen, die
mit einem rekombinanten Expressionsvektor der Erfindung transformiert
oder transfiziert wurden. Die Begriffe „transformiert mit", „transfiziert
mit", „Transformation" und „Transfektion" sollen die Einführung von
Nukleinsäure
(z. B. einen Vektor) in eine Zelle durch eine der vielen möglichen
im Fachgebiet bekannten Techniken umfassen. Prokaryontische Zellen
können
mit Nukleinsäure,
zum Beispiel, durch Elektroporation oder Calciumchlorid-vermittelte
Transformation, transformiert werden. Nukleinsäure kann in Säugerzellen über herkömmliche
Techniken eingeführt
werden, wie etwa Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation,
DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, Elektroporation
oder Mikroinjektion. Passende Verfahren zur Transformation und Transfektion
von Wirtszellen sind zu finden in Sambrook et al. (Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, (1989)).
-
Geeignete
Wirtszellen schließen
eine große
Vielzahl prokaryontischer und eukaryontischer Wirtszellen ein. Zum
Beispiel können
die Proteine der Erfindung in bakteriellen Zellen exprimiert werden,
wie etwa in E. coli, Insektenzellen (unter Verwendung des Baculovirus),
in Hefezellen oder Säugerzellen.
Andere passende Wirtszellen sind zu finden in Goeddel, Gene Expression
Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,
CA (1991).
-
Besonders
bevorzugte bakterielle Wirtszellen, die für die Durchführung der
vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen E. coli, B. subtilis, Salmonella
typhimurium und verschieden Arten innerhalb der Gattung Pseudomonas,
Streptomycine und Staphylococcus, sowie viele andere bakterielle
Arten, die einem Fachmann gut bekannt sind, ein. Geeignete bakterielle
Expressionsvektoren umfassen bevorzugt einen Promoter, der in einer
Wirtszelle funktioniert, einen oder mehrere selektierbare phänotypische
Marker und einen bakteriellen Replikationsstartpunkt. Repräsentative
Promoter schließen
eine β-Lactamase
(Penicillinase) und ein Lactose-Promotersystem
(vgl. Chang et al., Nature 275: 615, 1978), den trp-Promoter (Nichols
and Yanofsky, Meth in Enzymology 101: 155, 1983) und den tac-Promoter
(Russell et al., Gene 20: 231, 1982) ein. Repräsentative selektierbare Marker
schließen
verschiedene Antibiotikaresistenzmarker ein, wie etwa die Kanamycin-
oder Ampicillinresistenzgene. Passende Expressionsvektoren schließen ein,
sind jedoch nicht beschränkt
auf Bakteriophagen, wie etwa Lambda-Derivate oder Plasmide, wie
etwa pBR322 (vgl. Bolivar et al., Gene 2: 9S, 1977), pUC-Plasmide
pUC18, pUCl9, pUC118, pUC119 (vgl. Messing, Meth in Enzymology 101:
20–77,
1983 und Vieira and Messing, Gene 19: 259–268, 1982) und pNH8A, pNH16a,
pNH18a und Bluescript M13 (Stratagene, La Jolla, Calif.). Typische
Fusionsexpressionsvektoren, die verwendet werden können, werden
oben diskutiert, z. B. pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia),
pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway,
N. J.). Beispiele induzierbarer nicht-Fusionsexpressionsvektoren schließen pTrc
(Amann et al., (1988) Gene 69: 301–315) und pET 11d (Studier
et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic
Press, San Diego, CA (1990) 60–89).
-
Hefe-
und Pilzwirtszellen, die für
die Durchführung
der betreffenden Erfindung geeignet sind, schließen ein, sind jedoch nicht
beschränkt
auf, Saccharomyces cerevisae, die Gattungen Pichia oder Kluyveromyces und
verschiedene Arten der Gattung Aspergillus. Beispiele für Vektoren
für die
Expression in Hefe S. cerivisae schließen pYepSec1 (Baldari. et al.,
(1987) Embo J. 6: 229–234),
pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al.,
(1987) Gene 54: 113–123),
und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) ein. Protokolle
für die
Transformation von Hefe und Pilzen sind den Fachleuten gut bekannt.
(Vgl. Hinnen et al., PNAS USA 75: 1929, 1978; Itoh et al., J. Bacteriology
153: 163, 1983, und Cullen et al. (Bio/Technology 5: 369, 1987).
-
Säugerzellen,
die für
die Durchführung
der betreffenden Erfindung geeignet sind, schließen unter anderem ein: COS
(z. B., ATCC-Nr. CRL 1650 oder 1651), BHK (z. B., ATCC-Nr. CRL 6281),
CHO (ATCC-Nr. CCL 61), HeLa (z. B., ATCC-Nr. CCL 2), 293 (ATCC-Nr.
1573) und NS-1-Zellen. Passende Expressionsvektoren für die Lenkung
der Expression in Säugerzellen
schließen
im Allgemeinen einen Promoter ein (z. B. abgeleitet von viralem
Material, wie etwa Polyoma, Adenovirus 2, Zytomegalie-Virus und
Simian-Virus 40), sowie andere transkriptionale und translationale
Kontrollsequenzen. Beispiele für
Säuger-Expressionsvektoren schließen pCDM8
(Seed, B., (1987) Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987),
EMBOJ. 6: 187–195)
ein.
-
In
Anbetracht der hier bereitgestellten Lehren können Promoter, Terminatoren
und Verfahren zur Einführung
von Expressionsvektoren eines geeigneten Typs in Pflanzen-, Vogel-
und Insektenzellen auch ohne weiteres erreicht werden. Zum Beispiel
können
innerhalb einer Ausführungsform
die Proteine der Erfindung von Pflanzenzellen exprimiert werden
(vgl. Sinkar et al., J. Biosci (Bangalore) 11: 47–58, 1987,
der die Verwendung von Agrobacterium-Rhizogenes-Vektoren prüft; vgl.
auch Zambryski et al., Genetic Engineering, Principles and Methods,
Hollaender and Setlow (eds.), Vol. VI, pp. 253–278, Plenum Press, New York,
1984, der die Verwendung von Expressionsvektoren für Pflanzenzellen
beschreibt, einschließlich,
unter anderem pAS2022, pAS2023 und pAS2034).
-
Insektenzellen,
die für
die Durchführung
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen Zellen und Zelllinien von
Bombyx- oder Spodoteraarten ein. Baculovirusvektoren, die für die Expression
von Proteinen in kultivierten Insektenzellen verfügbar sind
(SF 9-Zellen) schließen die
pAc-Serien (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165) und
die pVL-Serien (Lucklow, V. A., and Summers, M. D., (1989) Virology
170: 31–39)
ein. Einige Baculovirus-Insektenzellen-Expressionssysteme, die für die Expression
des rekombinanten Proteins der Erfindung geeignet sind, werden in
PCT/US/02442 beschrieben.
-
Alternativ
können
die Proteine der Erfindung auch in nicht-humanen transgenen Tieren,
wie etwa Ratten, Kaninchen, Schafen und Schweinen, exprimiert werden
(vgl. Hammer et al. (Nature 315: 680–683, 1985), Palmiter et al.
(Science 222: 809–814,
1983), Brinster et al. (Proc Natl. Acad. Sci USA 82: 44384442, 1985), Palmiter
and Brinster (Gell. 41: 343–345,
1985) und U.S. Pat. No. 4, 736, 866).
-
Die
Proteine der Erfindung können
auch mittels chemischer Synthese unter Verwendung von Techniken
hergestellt werden, die in der Proteinchemie gut bekannt sind, wie
etwa Festphasen-Synthese (Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc.
85: 2149–2154)
oder der Synthese in einer homogenen Lösung (Houbenweyl, 1987, Methods
of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 I and II, Thieme, Stuttgart).
-
Die
betreffende Erfindung stellt außerdem
Proteine bereit, die eine A-Kette eines Ricin-ähnlichen Toxins, eine B-Kette
eines Ricin-ähnlichen
Toxins und eine heterologe Linker-Aminosäuresequenz umfasst, die die
A- und B-Ketten
verbindet, wobei die Linker-Sequenz eine Spaltungserkennungssequenz
für eine
retrovirale Protease, wie etwa eine HIV-Protease oder eine HTLV-Protease,
enthält.
Ein solches Protein kann auch mit anderen als rekombinanten Mitteln
hergestellt werden, zum Beispiel mittels chemischer Synthese oder
mittels Konjugation von A- und B-Ketten und einer Linker-Sequenz,
die aus ihrer natürlichen
pflanzlichen, fungalen oder bakteriellen Quelle isoliert und gereinigt
wurden. Solche A- und
B-Ketten können
so hergestellt werden, dass sie das Glycosylierungsmuster des nativen
Ricin-ähnlichen
Toxins aufweisen.
-
N-terminale
oder C-terminale Fusionsproteine, die das Protein der Erfindung,
konjugiert mit anderen Molekülen,
wie etwa Proteine, umfassen, können
mittels Fusion, durch Rekombinationstechniken hergestellt werden.
Die resultierenden Fusionsproteine enthalten ein Protein der Erfindung,
das mit dem gewählten
Protein oder dem hier beschriebenen Markerprotein fusioniert. Das
rekombinante Protein der Erfindung kann auch mit bekannten Techniken
an andere Proteine konjugiert werden. Zum Beispiel können die
Proteine gekoppelt werden, unter Verwendung heterobifunktionaler
Thiol-enthaltender Linker, wie in WO 90/10457 beschrieben, N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio-proprionat)
oder N-Succinimidyl-5-thioacetat.
Beispiele für
Proteine, die verwendet werden können,
um Fusionsproteine oder Konjugate herzustellen, einschließlich zellbindender
Proteine, wie etwa Immunoglobuline, Hormone, Wachstumsfaktoren,
Lektine, Insulin, Low-density-Lipoprotein, Glucagon, Endorphine,
Transferrin, Bombesin, Asialoglykoproteinglutathion-S-transferase
(GST), Hemagglutinin (HA) und trunkiertes myc.
-
Nützlichkeit
der Nukleinsäuremoleküle und Proteine
der Erfindung
-
Die
Proteine der Erfindung können
für die
Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden,
um Säuger-Krebszellen
oder Säugerzellen,
die mit einem Retrovirus infiziert sind, spezifisch zu inhibieren
oder zu zerstören.
Es ist ein Vorteil der rekombinanten Proteine der Erfindung, dass
sie eine Spezifität
für die
infizierten Zellen aufweisen, ohne dafür eine zellbindende Komponente
zu brauchen. Die Ricin-ähnliche
B-Kette der rekombinanten Proteine erkennt Galactoseanteile auf
der Zelloberfläche
und gewährleistet,
dass das Protein von der Zelle aufgenommen und in das Cytoplasma
freigegeben wird. Wenn das Protein in eine nicht infizierte Zelle
freigegeben wird, wird die A-Kette
inaktiv an die B-Kette gebunden sein. Wenn das Protein jedoch in
eine mit einem Retrovirus infizierte Zelle freigegeben wird, die
eine HTLV- oder HIV-Protease
enthält,
wird die retrovirale Protease die Spaltungserkennungssequenz in
dem Linker spalten, wobei die toxische A-Kette freigegeben wird.
-
Die
Spezifität
eines rekombinanten Proteins der Erfindung kann getestet werden,
indem das Protein mit der retroviralen Protease, wie etwa HIV-Protease
oder HTLV-Protease,
behandelt wird, von der angenommen wird, dass sie für die Spaltungserkennungssequenz
des Linkers spezifisch ist, und Spaltungsprodukte nachgewiesen werden.
Retrovirale Proteasen, wie etwa HIV-Protease oder HTLV-Protease kann von
infizierten Zellen isoliert werden oder kann rekombinant hergestellt
werden, zum Beispiel, indem dem Verfahren in Darket et al. (1988,
J. Biol. Chem. 254: 2307–2312)
gefolgt wird. Die Spaltungsprodukte können zum Beispiel auf der Basis
von Größe, Antigenität oder Aktivität identifiziert
werden. Die Toxizität
des rekombinanten Proteins kann untersucht werden, indem die Spaltungsprodukte
einem in vitro Translations-Assay in Zell-Lysaten unterzogen werden,
zum Beispiel unter Verwendung der Trespenmosaik-Virus-mRNA als Matrize.
Die Toxizität der
Spaltungsprodukte kann unter Verwendung eines ribosomalen Inaktivierungs-Assays
determiniert werden (Westby et al. 1992, Bioconjugate Chem. 3: 377–382). Die
Wirkung der Spaltungsprodukte auf die Proteinsynthese kann in standardisierten
Assays von In-vitro-Translation gemessen werden, unter Verwendung
teilweise definierter zellfreier Systeme, die zum Beispiel aus einer
Retikulozyt-Lysatherstellung bestehen als Quelle von Ribosomen und
verschiedener essentieller Kofaktoren, wie etwa mRNA-Matrize und
Aminosäuren.
Die Verwendung radioaktiv markierter Aminosäuren in der Mischung, ermöglicht die
quantitative Bestimmung der Inkorporation von freien Aminosäuren-Vorläufern in
mit Trichloressigsäure
abscheidbaren Proteinen. Kaninchen-Retikulozytlysate können bequem verwendet werden
(O'Hare, FEBS Lett.
1990, 273: 200–204).
-
Die
Fähigkeit
der rekombinanten Proteine der Erfindung, Säugerzellen, die mit einem Retrovirus
infiziert sind, wie etwa Krebszellen, an denen HTLV beteiligt ist,
oder Zellen, an denen HIV beteiligt ist, selektiv zur inhibieren
oder zu zerstören,
kann ohne weiteres in vitro unter Verwendung von Säugerzellkulturen
getestet werden, die mit dem interessierenden Retrovirus oder Krebslinien
infiziert sind. Die selektive Inhibitorwirkung der rekombinanten
Proteine der Erfindung kann determiniert werden, indem die selektive
Inhibition der viralen Antigenexpression in Säugerzellen oder die selektive
Inhibition von zellulärer
Proliferation in Krebszellen oder infizierten Zellen demonstriert
wird. Zum Beispiel kann ein selektiver Inhibitionseffekt mittels
der selektiven Inhibition der viralen Antigenexpression in HIV-infizierten
mononukleären
Zellen der phagozytischen Linie demonstriert werden; selektive Inhibition
der zellulären
Proliferation wie gegen Prote in- und DNA-Syntheselevels in behandelten,
nicht-infizierten
T-Zellen gemessen und; der selektive Verlust der Lebensfähigkeit
der T-Zelle. Zum Beispiel können
die nachfolgend genannten Kultivierungssysteme verwendet werden,
um die Fähigkeit
rekombinanter Proteine zu testen, die eine heterloge Linker-Sequenz
aufweisen, die eine Spaltungserkennungssequenz für die HIV-Protease enthält, um HIV-infizierte Zellen
selektiv zu inhibieren. Der Begriff HIV betrifft einen CD4+-abhängigen humanen
Immunschwäche-Retrovirus,
wie etwa HIV-1 und Varianten davon.
-
Normale
humane T-Lymphocyten können
aus peripheren Blutproben hergestellt und in vitro kultiviert werden,
wie im Allgemeinen in der US-Patentschrift Nr. 4,869,903 beschrieben.
HIV-infizierte Zellen können auch
von AIDS-Patienten erhalten werden. Die Zellen können in vitro mit HIV infiziert
werden, das von einem AIDS-Patient abgeleitet wurde. Die Toxizität des rekombinanten
Proteins für
infizierte und nicht infizierte Kulturen kann dann verglichen werden.
HIV-infizierte T-Zellen
exprimieren ein HIV-Hüllprotein
auf der Zelloberfläche,
insbesondere die Proteine gp120 und gp41. Die Fähigkeit des rekombinanten Proteins
der Erfindung, die Expression dieser viralen Antigene zu inhibieren,
kann ein wichtiger Indikator für
die Fähigkeit
des Proteins sein, die virale Replikation zu inhibieren. Die Toxizität kann auf
der Basis von Zelltod oder Lysis oder mittels einer Reduktion in
der Expression des HIV-Antigens,
wie etwa des Haupt-Hüllproteins
gp120 und gp41 oder dem HIV-Kapsidproteinantigen p24, gemessen werden.
-
Der
Level dieser Antigene kann in Assays gemessen werden, die markierte
Antikörper
verwenden, die eine Spezifität
für die
Antigene aufweisen. Die Inhibition viraler Antigenexpression wurde
mit der Inhibition der viralen Replikation korreliert (US-Patentschrift
Nr. 4,869,903). Ähnliche
Assays können
unter Verwendung anderer passender Säugerzellen durchgeführt werden,
die in vitro kultiviert werden können
und die in der Lage sind, die retrovirale Replikation zu erhalten.
Beispiele für
passende Zellen schließen
mononukleare phagozytische Verzweigungszellen ein. Die Toxizität kann auch
auf der Basis einer Abnahme an Proteinsynthese in Targetzellen bewertet
werden, die mittels bekannter Techniken, wie etwa der Inkorporation
markierter Aminosäuren,
wie etwa [3H]-Leucin gemessen werden (O'Hare et al. 1990, FEBS Lett. 273: 200–204). Infizierte
Zellen können
auch mit radioaktiv markiertem Thymidin gepulst werden, und die
Inkorporation der radioaktiven Markierung in zellulärer DNA
kann als Maß für die zelluläre Proliferation
genommen werden.
-
In
den viralen Infektions- und Replikationsmodellen zur Bestätigung der
Aktivität
rekombinanter Proteine der Erfindung, sind jene Säugerzellen
als Wirte passend, die in vitro kultiviert werden können und
die in der Lage sind, die virale Replikation zu erhalten. Beispiele
für passende
Zellen können
humane T-Lymphozyten oder mononukleare phagozytische Verzweigungszellen
sein. Normale humane T-Lymphocyten können aus pheripheren Blutproben
hergestellt und in vitro kultiviert werden, wie im Allgemeinen in
der US-Patentschrift Nr. 4,869,903 beschrieben. Viral infizierte
Zellen können
auch aus dem Blut infizierter Patienten erhalten werden. Die Toxizität des rekombinanten
Proteins für
infizierte und nicht infizierte Kulturen kann dann verglichen werden.
Die Fähigkeit
des rekombinanten Proteins der Erfindung, die Expression dieser
viralen Antigene zu inhibieren, kann ein wichtiger Indikator für die Fähigkeit
des Proteins sein, die virale Replikation zu inhibieren. Der Level
dieser Antigene kann in Assays gemessen werden, die markierte Antikörper verwenden,
die eine Spezifität
für das
Antigen aufweisen. Die Inhibition viraler Antigenexpression wurde
mit der Inhi bition der viralen Replikation korreliert (US-Patentschrift Nr.
4,869,903).
-
Die
Toxizität
kann auch auf der Basis einer Abnahme an Proteinsynthese in Targetzellen
bewertet werden, die mittels bekannter Techniken, wie etwa der Inkorporation
markierter Aminosäuren,
wie etwa [3H]-Leucin gemessen werden (O'Hare et al. 1990, FEBS Lett. 273: 200–204). Infizierte
Zellen können
auch mit radioaktiv markiertem Thymidin gepulst werden und die Inkorporation
der radioaktiven Markierung in zellulärer DNA, kann als Maß für die zelluläre Proliferation
genommen werden. Zusätzlich
kann die Toxizität
auf der Basis der Lebensfähigkeit
der Zelle gemessen werden, zum Beispiel kann die Lebensfähigkeit
infizierter oder nicht infizierter Zellkulturen, die einem rekombinanten
Protein ausgesetzt werden, verglichen werden. Die Lebensfähigkeit
der Zelle kann mittels bekannter Techniken, wie etwa Trypanblau-Exklusionsassays,
bewertet werden.
-
Obwohl
die Spezifität
der Proteine der Erfindung für
retroviral infizierte Zellen durch spezifische Spaltung der Spaltungserkennungssequenz
des Linkers vermittelt wird, ist es ersichtlich, dass spezifische
zellbindende Komponenten optional an die Proteine der Erfindung
konjugiert werden können.
Solche zellbindenden Komponenten können als Fusionsproteine mit
den Proteinen der Erfindung exprimiert werden, oder die zellbindenden
Komponente kann physikalisch oder chemisch an die Proteinkomponente
gekoppelt werden. Beispiele für
passende zellbindende Komponenten schließen Antikörper für retrovirale Proteine oder
für Krebszellproteine
ein.
-
Antikörper, die
eine Spezifität
für ein
Zellenoberflächenprotein
aufweisen, können
mittels herkömmlicher
Verfahren hergestellt werden. Ein Säuger, (z. B. eine Maus, ein
Hamster oder ein Kaninchen) kann mit einer immunogenen Form des
Peptids immunisiert werden, die eine Antikörperantwort in dem Säuger verursacht.
Techniken für
die Immunogenität
auf einem Peptid verleihen, schließen die Konjugation von Trägern oder
andere Techniken ein, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Zum
Beispiel kann das Peptid in Gegenwart eines Hilfsmittels verabreicht
werden. Der Fortschritt der Immunisierung kann mittels Nachweis
von Antikörpertitern
in Plasma oder Serum überwacht
werden. Es können
Standard-ELISA-Verfahren
oder andere Immunassay-Verfahren mit dem Immunogen als Antigen verwendet
werden, um den Antikörperlevel
zu bewerten. Nach der Immunisierung können Antiseren erhalten werden,
und, wenn gewünscht,
polyklonale Antikörper aus
den Seren isoliert werden.
-
Um
monoklonale Antikörper
herzustellen, können
Antikörperproduzierende
Zellen (Lymphozyten) von einem immunisierten Tier geerntet und mit
Myelomzellen mittels Standardverfahren der Somazellfusion fusioniert
werden, um diese Zellen so unsterblich zu machen und Hybridomzellen
zu liefern. Solche Techniken sind auf dem Fachgebiet gut bekannt,
(z. B. die Hybridomtechnik, die ursprünglich. von Kohler und Milstein
entwickelt wurde (Nature 256, 495–497 (1975)) sowie andere Techniken,
wie etwa die humane B-Zellen-Hybridomtechnik (Kozbor et al., Immunol.
Today 4, 72 (1983)), die EBV-Hybridom-Technik, um humane monoklonale Antikörper zu
produzieren (Cole et al. Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy
(1985) Allen R. Bliss, Inc., Seiten 77–96), und Screening kombinatorischer
Antikörperbibliotheken
(Huse et al., Science 246, 1275 (1989)]. Hybridomzellen können immunochemisch
für die
Produktion von Antikörpern
gescreent werden, die mit dem Peptid spezifisch reaktiv sind, und
die monoklonalen Antikörper
können
isoliert werden.
-
Der
Begriff „Antikörper" wie er hier verwendet
wird, soll auch Fragmente davon einschließen, die auch spezifisch mit
einer Zelloberflächenkomponente
reagieren.
-
Antikörper können, unter
Verwendung herkömmlicher
Techniken fragmentiert werden, und die Fragmente können auf
die gleiche Art wie oben beschrieben auf ihren Nutzen hin gescreened
werden. Zum Beispiel können
F(ab')2-Fragmente mittels
Behandlung der Antikörper
mit Pepsin generiert werden. Das resultierende F(ab')2-Fragment kann
behandelt werden, um Disulfidbrücken
zu reduzieren, um Fab'-Fragmente
zu produzieren.
-
Chimäre Antikörperderivate,
d. h. Antikörpermoleküle, die
eine nicht-humane tierische variable Region und eine humane konstante
Region kombinieren, werden auch innerhalb des Umfangs der Erfindung
betrachtet. Chimäre
Antikörpermoleküle können zum
Beispiel die antigenbindende Domäne
eines Antikörpers
einer Maus, einer Ratte oder einer anderen Art, mit humanen konstanten
Regionen, einschließen.
Herkömmliche Verfahren
können
verwendet werden, um chimäre
Antikörper
zu machen, die die Immunoglobulin-variable Region enthalten, die
ein Zelloberflächenantigen
erkennen (vgl., zum Beispiel, Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci.
U.S.A. 81,6851 (1985); Takeda et al., Nature 314, 452 (1985), Cabilly
et al., US-Patentschrift Nr. 4,816,567; Boss et al., US-Patenschrift
Nr. 4,816,397; Tanaguchi et al., europäische Patentveröffentlichung
EP 171 496 ; europäische Patentveröffentlichung
0 173 494, Vereinigtes Königreich-Patentschrift
GB 2177096B ). Es
wird erwartet, dass chimäre
Antikörper
in einem humanen Subjekt weniger immunogen sein werden als die entsprechenden
nicht chimären
Antikörper.
-
Monoklonale
oder chimäre
Antikörper,
die gegen Zelloberfächen-Komponenten
spezifisch reaktiv sind, können
weiter humanisiert werden, indem humane Konstantregion-Chimären produziert
werden, in denen Teile der variablen Regionen, besonders die konservierten
Framework-Regionen
der antigen-bindenden Domäne,
humanen Ursprungs und nur die hypervariablen Regionen nicht huma nen
Ursprungs sind. Solche Immunglobulinmoleküle können mittels Techniken gemacht
werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, (z. B. Teng et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 7308–7312 (1983); Kozbor et al.,
Immunology Today, 4, 7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol.,
92, 3–16
(1982)), und PCT Publikation W092/06193 oder
EP 0239400 ). Humanisierte Antikörper können auch
kommerziell produziert werden (Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham,
Middlesex, Great Britain.)
-
Spezifische
Antikörper,
oder Antikörperfragmente,
die reaktiv gegen Zelloberfächenkomponenten sind,
können
auch generiert werden, indem Screening-Expressions-Bibliotheken, die
Immunglobulingene kodieren, oder Abschnitte davon, in Bakterien
mit Zelloberflächenkomponenten
exprimiert werden. Zum Beispiel können komplette Fab-Fragmente,
VH-Regionen und FV-Regionen in Bakterien exprimiert werden, die
die Phage-Expressionbibliothek verwenden (vgl. zum Beispiel Ward
et al., Nature 341, 544–546:
(1989); Huse et al., Science 246, 1275–1281 (1989); und McCafferty
et al. Nature 348, 552–554
(1990)). Alternativ kann eine SCID-hu-Maus, zum Beispiel das Modell,
das von Genpharm entwickelt wurde, verwendet werden, um Antikörper, oder
Fragmente davon, zu produzieren.
-
Die
Proteine der Erfindung können
in pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Verabreichung an Subjekte
in einer biologisch kompatiblen Form formuliert werden, die für die Verabreichung
in vivo passend ist. Mit „biologisch
kompatibler Form, die für
die Verabreichung in vivo passend ist" ist eine Form der Substanz gemeint,
die verabreicht werden soll, in der die therapeutischen Wirkungen
alle toxischen Wirkungen überwiegen.
Die Substanzen können
an lebende Organismen verabreicht werden, einschließlich Menschen
und Tiere. Die Verabreichung einer therapeutisch aktiven Menge der pharmazeutischen
Zusammensetzungen der betreffenden Erfindung ist als eine wirksame
Menge definiert, in Dosierungen und in Zeitabständen, die notwendig sind, um
das gewünschte
Ergebnis zu erreichen. Zum Beispiel kann eine therapeutisch aktive
Menge an der Substanz in Abhängigkeit
von Faktoren variieren, wie dem Krankheitszustand, dem Alter, dem
Geschlecht und dem Gewicht des Individuums, und der Fähigkeit
des Antikörpers,
eine gewünschte
Antwort in dem Individuum hervorzurufen. Das Dosierungsregime kann
angepasst werden, um die optimale therapeutische Antwort bereitzustellen.
Zum Beispiel können
mehrere verteilte Dosen täglich
verabreicht werden, oder die Dosis kann proportional verringert
werden, wie durch die Erfordernisse der therapeutischen Situation
angezeigt.
-
Die
aktive Substanz kann auf bequeme Weise verabreicht werden, wie etwa
durch Injektion (subkutan, intravenös usw.), orale Verabreichung,
Inhalation, transdermale Applikation oder rektale Administration.
In Abhängigkeit
vom Verabreichungsweg kann die aktive Substanz in ein Material gehüllt werde,
um die Verbindung vor der Wirkung der Enzyme, Säuren und anderen natürlichen
Bedingungen zu schützen,
die die Verbindung inaktivieren könnten.
-
Die
hier beschriebenen Zusammensetzungen können mittels an sich bekannter
Verfahren für
die Herstellung von pharmazeutisch akzeptablen Zusammensetzungen
hergestellt werden, die Subjekten verabreicht werden können, so
dass eine wirksame Menge der aktiven Substanz in einer Mischung
mit einem pharmazeutisch akzeptablen Vehikel kombiniert wird. Passende
Vehikel werden zum Beispiel beschrieben in Remington's Pharmaceutical
Sciences (Remington's
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA
1985). Auf dieser Basis schließen
die Zusammensetzungen, wenn auch nicht exklusiv, Lösungen der Substanzen
in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen
Vehikeln oder Verdünnungsmitteln
ein, sowie in gepufferten Lösungen,
die über
den für
das physiologische Fluid passenden pH-Wert und iso-osmotischen Wert verfügen.
-
Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur Behandlung von Säugern, einschließlich Menschen
verwendet werden, die mit einem Retrovirus infiziert sind. Es ist
zu erwarten, dass die Zusammensetzungen besonders für die Behandlung
von Patienten nützlich
sein werden, die mit HIV-1, HIV-2 infiziert sind oder an Krebsformen
erkrankt sind, an denen Retroviren beteiligt sind, wie etwa humane
T-Zell-Leukämien,
an denen ein HTLV beteiligt ist. Die Wirksamkeit von solchen Behandlungen
kann überwacht
werden, in dem die Gesundheit des behandelten Patienten beurteilt
wird, und indem der Prozentsatz an HIV-positiven Monozyten in den
behandelten Patienten gemessen wird.
-
Die
Dosis des rekombinanten Proteins, die verabreicht werden soll, wird
von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, die in humanen Subjekten
ohne weiteres überwacht
werden können.
Solche Faktoren schließen
HIV-Antigen-Level,
in Zusammenhang mit HIV-infizierten T-Zellen oder mononukleare Phagozyten; HIV-Antigen-Level
im Blutstrom; reverse Transkriptaseaktivität, in Verbindung mit HIV-infizierten
T-Zellen oder mononuklearen Phagozyten; und das Verhältnis von
lebensfähigen
HIV-infizierten
Zellen zu nicht infizierten Zellen ein. Zum Beispiel kann der HIV-Antigen-Level
im Plasma ohne weiteres unter Verwendung eines ELISA-Assays determiniert
werden.
-
Die
folgenden nicht limitierenden Beispiele dienen der Illustration
der vorliegenden Erfindung:
-
BEISPIELE
-
BEISPIEL 1
-
Klonierung und Expression
von Proricinvarianten, die durch HIV-Proteasen aktiviert werden
-
Isolierung
von Gesamt-RNA
-
Das
Präproricingen
wurde aus neuem Blattwerk des Rizinusstrauchs kloniert. Gesamt-Messenger-RNA
wurde gemäß anerkannter
Verfahren isoliert (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Lab Manual
(Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, (1989)), und cDNA
wurde unter Verwendung reverser Transkriptase generiert.
-
cDNA-Synthese
-
Oligonukleotide,
die den äußersten
5'- und 3'-Enden des Präproricingens
entsprechen, wurden synthetisiert und verwendet, um das Gen mittels
PCR zu amplifizieren. Bei der Verwendung der cDNA-Sequenz für Präproricin
(Lamb et al., Eur. J. Biochem., 145: 266–270, 1985) wurden mehrere
Oligonukleotidprimere designed, um die Start- und Stoppcodone des offenen Leserahmens
des Präproricins
zu flankieren. Die Oligonukleotide werden unter Verwendung eines
Applied Biosystems Model 392 DNA/RNA-Synthetisierers synthetisiert. Die cDNA
des ersten Strangs wurde unter Verwendung des Oligonukleotids Ricin1729C
primerunterstützt
synthetisiert (Tabelle 1). Drei Mikrogramm Gesamt-RNA wurden als
eine Matrize für
die Oligo-Ricin1729C primunterstützte
Synthese der cDNA verwendet, unter Verwendung von Superscript II
Reverse-Transkriptase
(BRL), gemäß des Protokolls
des Herstellers.
-
DNA-Amplifikation
und Klonierung
-
Die
cDNA-Synthesereaktion des ersten Strangs wurde als Matrize für die DNA-Amplifikation
mittels Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) verwendet. Die Präproricin-cDNA
wurde unter Verwendung des Upstream-Primers Ricin-99 und des Downstream-Primers
Ricin1729C mit Vent-DNA-Polymerase
(New England Biolabs) unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition,
(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)) amplifiziert. Die Amplifikation
wurde in einem Biometra Thermal-Cycler (TRIO-Thermalcycler) unter Verwendung der
folgenden Parameter durchgeführt:
Denaturierung bei 95°C
für 1 Min.,
Annealing bei 52°C
für 1 Min.,
und Extension 72°C
für 2 Min.,
(33 Zyklen), gefolgt von einem finalen Extensionszyklus bei 72°C für 10 Min.
Das amplifizierte Produkt 1846 bp wurde auf einem Agarosegel fraktioniert
(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second
Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), und die DNA
wurde von der Gelschicht unter Verwendung von Qiaex-Harz (Qiagen),
gemäß dem Protokoll
des Herstellers, gereinigt. Das gereinigte PCR-Fragment, das die Präproricin-cDNA kodiert, wurde
dann (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second
Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)) in ein Eco-RV-verdautes
pBluescript-II-SK-Plasmid
(Stratagene) ligiert und verwendet, um kompetente XL1-Blue-Zellen
(Stratagene) zu transformieren. Die positiven Klone wurden mittels
Restriktionsverdauung der gereinigten Plasmid-DNA bestätigt. Die
Plasmid-DNA wurde unter
Verwendung eines Qiaprep Spin-Plasmid-Miniprep-Kit (Qiagen) extrahiert.
-
DNA-Sequenzierung
-
Das
klonierte PCR-Produkt, das das vermutete Präproricingen enthält, wurde
mittels DNA-Sequenzierung des ge samten cDNA-Klons (pAP-144) bestätigt. Die
Sequenzierung wurde unter Verwendung eines automatischen DNA Sequencers
von Applied Biosystems 373A ausgeführt und mittels doppelsträngiger Didesoxy-Sequenzierung
per Sanger-Verfahren unter Verwendung des Sequenase-Kits (USB) bestätigt. Für die Sequenzierung
wurden folgende Oligonukleotidprimer verwendet: Ricin267, Ricin486,
Ricin725, Ricin937, Ricin1151, Ricini1399, Ricin1627, T3-Primer (5'AATTAACCCTCACTAAAGGG-3') und T7-Primer (5'GTAATACGACTCACTATAGGGC-3).
Die Sequenzdaten wurden unter Verwendung des PC-Gen-Software-Package (intelligenetics)
kompiliert und analysiert. Die Sequenzen und der Ort der Oligonukleotidprimere
werden in Tabelle 1 gezeigt.
-
Mutagenese
der Präproricin-Linker
-
Der
Präporicin-cDNA-Klon
(pAP-144) wurde einer ortsgerichteten Mutagenese unterzogen, um
eine Serie von Varianten zu generieren, die sich nur in der Sequenz
zwischen den A- und B-Ketten unterscheiden (Linkerregion). Die Wildtyp-Präproricin-Linkerregion
wurde mit den drei Linker-Sequenzen ersetzt, pAP-146, pAP-147 und
pAP-148, die in 4 angegeben sind. Die Linkerregionen
der Varianten kodieren eine HIV-Protease-Spaltungserkennungssequenz (Slalka et
al., Cell, 56: 911–913,
1989). Die Mutagenese und Klonierungsstrategie, die verwendet wurden,
um die Linkervariante pAP-146
zu generieren, werden in 1A und 1B zusammengefasst.
Die Mutagenese- und Klonierungsstrategie, die verwendet wurde, um
die Linkervariante pAP-147 zu generieren, wird in 2A und 2B zusammengefasst.
Die Mutagenese- und Klonierungsstrategie, die verwendet wurde, um
die Linkervariante pAP-148 zu generieren, wurde in 3A und 3B zusammengefasst.
Am ersten Schritt ist eine DNA-Amplifikation unter Verwendung eines
Satzes mutagener Primer (HIVA1; HIVB1; HIVH1) in Kombination mit
den zwei flankierenden Primer Ricin- 99Eco und Ricin1729Xba beteiligt. Das
PCR-Protokoll und die verwendeten Bedingungen waren die gleichen,
wie oben beschrieben. Die PCR-Produkte jeder Mutagenesereaktion
wurden einer Gelreinigung und dann einer Restriktionsverdauung unterzogen,
entweder mit EcoRI für
das die A-Kette kodierende Fragment, oder mit XbaI für das die
B-Kette kodierende Fragment. Restriktionsverdaute PCR-Fragmente
wurden Gel-gereinigt und dann mit Pbluescript-SK ligiert, das mit
EcoRI und XbaI verdaut worden war. Ligationsreaktionen wurden verwendet, um
kompetente XL1-Blue-Zellen (Stratagene) zu transformieren. Rekombinante
Klone wurden mittels Restriktionsverdauen von Plasmid Miniprep-DNA
identifiziert, und die mutanten Linker-Sequenzen wurden mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.
-
Subklonierung von Präproricinmutanten
in Vektor pSB2
-
Präproricin-cDNA
in Gesamtlänge
wurde aus den Klonen pAP-146, pAP-147 und pAP-148 kreiert, denen
die ersten drei Nukleotide der Signalsequenz fehlen (Halling et
al., Nucleic Acids Research, 13: 8019–8033, 1985). Das fehlende
ATG (Startcodon) wurde in alle Mutanten mittels ortsgerichteter
Mutagnese unter Verwendung der Primer Ricin-109 und Ricin1729C eingeführt. Die
DNA-Matrize für jede Reaktion
war pAP-146, pAP-147 oder pAP-148, und die PCR-Bedingungen waren
die gleichen wie die oben beschriebenen. Die PCR-Produkte wurden
Gelgereinigt und dann mit SmaI-verdautem pSB2 ligiert (vgl. 12). Rekombinante Klone wurden mittels Restriktionsverdauen
von Plasmid Miniprep-DNA identifiziert, und 5'- und 3'-Verknüpfungen wurden mittels DNA-Sequenzierung bestätigt. Die
drei erhaltenen Konstrukte waren pAP-151, pAP-159 und pAP-163, wobei
jedes den mutanten Linker aufweist, der in pAP-146, pAP-147 bzw.
pAP-148 gefunden wurde.
-
Subklonierung von Präproricinmutanten
in Vektor pVL1393
-
Präproricinvarianten
wurden in den Baculovirus-Transfervektor
pVL1393 subkloniert (PharMingen, Sequenz in 11 gezeigt).
Die Subklonierungsstrategie für
die HIV-A-Linkervariante ist in 5 zusammengefasst.
Die Subklonierungsstrategie für
die HIV-B-Linkervariante
ist in 6 zusammengefasst. Die Subklonierungsstrategie
für die
HIV-H-Linkervariante ist in 7 zusammengefasst.
Das 1315 bp EcoRI/KpnI-Fragment, das die Ricin-A-Kette kodiert und
jeder mutante Linker wurde aus jeder der varianten Klone in pSB2 (pAP-151,
pAP-159 und pAP-163) isoliert. Jedes dieser gereinigten Fragmente
wurde mit einem 564 bp KpnI/PstI-Fragment ligiert, erhalten aus
pAP-144 und mit EcoRI/PstI, gespalten mit pVL1393. Rekombinante
Klone wurden mittels Restriktionsverdauen von Plasmid Miniprep-DNA
identifiziert und 5'-
und 3'-Verknüpfungen wurden
mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.
Die drei erhaltenen Konstrukte waren pAP-190, pAP-196 und pAP-197, wobei jedes
den mutanten Linker aufweist der in pAP-146, pAP-147 bzw. pAP-148
gefunden wurde.
-
Isolierung
der rekombinanten Baculoviren
-
Die
Insektenzellen S. frugiperda (Sf9) und Trichoplusia ni (Tn368 und
BTI-TN-581-4 (High Five)) wurden auf einem TMN-FH-Medium gehalten,
das mit 10% fötalem
Kälberserum
angereichert war (Summers et al., A Manual of Methods of Baculovirus
Vectors und Insect Cell Culture Procedures, (Texas Agricultural
Experiment Station, 1987)). Zwei Mikrogramm rekombinanter pVL1393
DNA (pAP-190, pAP-196,
oder pAP-197) wurden mit 0,5 Mikrogramm BaculoGold AcNPV DNA (Pharmingen)
in 2 × 106 Tn368 Insektenzellen kotransfiziert, gemäß dem Protokoll
des Herstellers (Gruenwald et al., Baculovirus Expression Vector
System: Procedures und Methods Manual, 2nd Edition, (San Diego,
CA, 1993)). Am Tag 5 nach der Transfektion wurden die Medien zentrifugiert,
und die Überstände wurden
in Grenzwert-Verdünnungs-Assays
mit Tn368-Zellen getestet (Summers et al., A Manual of Methods of
Baculovirus Vectors und Insect Cell Culture Procedures, (Texas Agricultural
Experiment Station, 1987)). Dann wurden die rekombinanten Viren
in den Überständen amplifiziert,
indem Tn368-Zellen bei einer Infektionsmultiplizität (moi)
von 0,1 infiziert wurden, gefolgt von der Sammlung der Überstände an Tag
7. Insgesamt wurden drei Amplifikationsrunden für jede Rekombinante gemäß anerkannter
Verfahren durchgeführt
(Summers et al., A Manual of Methods of Baculovirus Vectors und
Insect Cell Culture Procedures, (Texas Agricultural Experiment Station,
1987 und Gruenwald et al., Baculovirus Expression Vector System:
Procedures and Methods Manual, 2nd Edition, (San Diego, CA, (1993)).
-
Expression
von mutantem Proricin
-
Rekombinante
Baculoviren (pAP-190baculo, pAP-196baculo und pAP-197-baculo) wurden
verwendet, um 2 × 105 Tn368- oder
sf9-Zellen mit einer moi von 5 in EX-CELL400-Medien (JRH Biosciences) mit 25 mM α-Lactose
in Schüttelkolben
zu infizieren. Medien-Überstände, die
mutante Proricine enthalten, wurden am 6. Tag nach der Infektion
gesammelt.
-
Reinigung
von mutantem Proricin
-
Medien-Überstände wurden
bei 100.000 g 1 Stunde lang ultrazentrifugiert. Nach der Zugabe
von 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid wurden die Überstände unter Verwendung einer
Amicon 8050 Ultrafiltrationszelle, die mit einer Diaflo-XM50-Membran
ausgerüstet
war, konzentriert. Die Überstände wurden
dann ausgiebig gegen 137 mN NaCl, 2,2 mM KCl, 2,6 mM KH2PO4 und 8,6 mM Na2HPO4, pH-Wert 7,4, das 1 mM Dithiothreitol (Dialysepuffer)
enthielt, dialysiert. Rekombinante Proricinpro teine wurden mittels
Affinitätschromatographie gereinigt,
unter Verwendung von Lactose-Agarose (Sigma), wie zuvor für die rekombinante
Ricin-β-Kette
beschrieben (Ferrini et al., Eur. J. Biochem., 233: 772–777, 1995).
Die Fraktionen, die das rekombinante Proricin enthielten, wurden
unter Verwendung von SDS/PAGE, (Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Second Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989) und mittels Western-Blot-Analyse, unter Verwendung
von Anti-Ricin-Antikörpern
(Sigma) identifiziert.
-
In-Vitro-HIV-Proteaseverdauung
von Proricinvarianten
-
Affinitätsgereinigtes
mutantes Proricin wurde mit HIV-Protease
behandelt, um die spezifische Spaltung in der Linkerregion zu bestätigen. Die
Proricinvarianten wurden aus der Lactose-Agarose-Matrix im Protease-Verdauungspuffer
elutiert (50 mM NaCl, 50 mM Na-Acetat, pH-Wert 5,5, 1 mM Dithiothreitol),
das 100 mM Lactose enthält.
Proricinsubstrat wurde dann bei 37°C für 60 Minuten mit 400 ng/ml
rekombinanter HIV-Protease (BACHEM Biosciences Inc.) inkubiert.
Die Spaltungsprodukte von Proricin (Ricin-A- und B-Ketten) wurden
unter Verwendung von SDS/PAGE (Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 2nd. Ed., Cold Spring
Harbor Press, 1989) gefolgt von Western-Blot-Analyse, unter Verwendung
von Anti-ricin-Antikörpern
(Sigma) identifiziert.
-
In-Vitro-Translationsassay
-
Die
Aktivität
der Protease-behandelten Proricinvarianten wurde unter Verwendung
eines Kaninchen-Retikulozytlysats
in einem nicht radioaktiven (Amersham, ECL-System) In-vitro-Translationsassay überwacht.
Protease-behandeltes Proricin wurde einer Standard-50 μl-Translations-Reaktionsmischung
zugefügt, die
Trespenmosaik-Virus-mRNA als Matrize enthält (gemäß dem Protokoll des Herstellers).
Aktive Ricinvarianten inhibieren die In-vitro-Translationreaktion,
indem Ribosomen inaktiviert werden. Folglich wurden in Gegenwart
einer aktiven Ricinvariante keine viralen Proteine synthetisiert.
-
BEISPIEL 2
-
Ernten und
Reinigen von Proricinvarianten mittels Affinitätssäule
-
Es
wurden drei Tage nach der Infektion Proteinproben geerntet. Die
Zellen wurden entfernt, indem die Medien bei 1465 g 10 Minuten lang
unter Verwendung eines SLA-1500
(Sorvall) Zentrifugenrotors zentrifugiert wurden. Der Überstand
wurde weiter geklärt,
indem er bei 7970 g fünfzehn
Minuten lang zentrifugiert wurde. Der Proteaseinhibitor Phenylmethylsulfonylfluorid
(Sigma) wurde mit einer Endkonzentration von 1% zugefügt. Die
Proben wurden konzentriert (fünffach)
und (vier Mal fünffach)
in Dialysepuffer (1 × Baculopuffer
(8,6 mM Na2HPO4,
2,6 mM KH2PO4, 137
mM NaCl und 2,6 mM KCl, pH-Wert 7,4), der 2,5 mM Lactose und 0,02% NaN3) enthielt, unter Verwendung eines MINITAN-Konzentrators
(Millipore) mit 30 kDa NMWL-Platten dialysiert. Dithiothreitol (DTT)
wurde dann in einer Endkonzentration von 1 mM zugefügt, und
die Proben wurden bei 37.000 g eine Stunde lang zentrifugiert.
-
Nach
dem Zentrifugieren wurde ein Dialysepuffer, der 1 mM DTT enthält, den
Proben bis zu einem Endvolumen von 500 ml zugefügt. Die Proben wurden entgast
und über
Nacht bei 4°C über eine
ASF-Sepharose-Affinitätssäule (hergestellt
gemäß dem Pharmacia-Protokoll)
in einer 10 mL-Chromatographiesäule
(Biorad) gegeben. Die Säule
wurde mit 300 ml Waschpuffer (100 mM NaOAc, pH-Wert 5,2, 1 mM DTT
und 0,02% NaN3) gewaschen. Die Elution der
Proricinvariante wurde ausgeführt,
indem 500 ml des Elutionspuffers darübergegeben wurden (100 mM NaOAc,
pH-Wert 5,2, 250 mM-Lactose und 5 mM DTT). Das Eluat wurde konzentriert
unter Verwendung des Amicon 8050 – Konzentrators (Amicon) mit
einer YM10 176 mm-Membran, wobei ein Argongas verwendet wurde, um
die Kammer unter Druck zu setzen. Die Proben wurden weiter konzentriert
und in einen 1 × Baculopuffer
dialysiert, unter Verwendung von Ultrafree-15 Biomax (Millipore)
10 kDa NMWL-Filtergeräten, die
in einem Beckman-S4180-Rotor (Beckman) bei 2.000 g geschleudert
wurden. Die Proben wurden in Trockeneis schockgefroren und bei –20°C gelagert.
-
Reinigung von pAP 190
mittels Gelfiltrationschromatographie
-
Um
die Proricinvariante vom verarbeiteten Material zu reinigen, das
während
der Fermentation produziert wurde, wurde das Protein über eine
SUPERDEX 75 (16/60)-Säule und
eine SUPERDEX 200 (16/60)-Säule
(Pharmacia) gegeben, die miteinander verbunden waren, mit 50 mM
Tris, 100 mM NaCl, pH-Wert 7,5 ausgeglichen, das 100 mM Lactose
und 0,1% β-Mercaptoethanol
(βME) enthält. Die
Flussrate der Säule
betrug 0,15 ml/Min., und die Fraktionen wurden alle 25 Minuten gesammelt.
Die UV-(280 nm)-Spur
wurde verwendet, um den ungefähren
Ort des gereinigten pAP 190 zu determinieren und so die Proben für die Western-Analyse zu
determinieren.
-
Western-Analyse
der Säulenfraktionen
-
Die
Fraktionen, die aus den SUPERDEX-Säulen (Pharmacia) eluiert wurden,
wurden auf Reinheit unter Verwendung von Standard-Western-Blotting-Techniken
analysiert. Ein Aliquot von 10 μl
von jeder Fraktion wurde in einem 1 × Probenpuffer (62,6 mM Tris-Cl,
pH-Wert 6,8, 4,4% βME,
2% Natriumdodecylsulfat (SDS), 5% Glycerol (alle von Sigma) und
0,002% Bromophenolblau (Biorad)) fünf Minuten lang gekocht. Denaturierte Proben
wurden auf 12% Tris-Glycingele (Biorad) geladen, zusammen mit 50
ng von RCA60 (Sigma) und 5 μl von „Kaleidoscope
Prestained Standards" (Biorad).
Die Elektrophorese wurde neunzig Minuten lang bei 100 V in 25 mM
Tris-Cl, pH-Wert
8,3, 0,1% SDS, und 192 mM Glycin, unter Verwendung der BioRad-Mini-Protean-II-Zellen
(Biorad) durchgeführt.
-
Nach
der Elektrophorese wurden Gele in einem Transferpuffer (48 mM Tris,
39 mM Glycin, 0,0375% SDS und 20 Methanol) einige Minuten lang äquilibriert.
Die PVDF-Biorad-Membran
wurde eine Minute lang in 100% Methanol und zwei Minuten im Transferpuffer
voreingeweicht. Whatman-Papier wurde kurz im Transferpuffer durchtränkt. Fünf Stück Whatman-Papier,
Membran, Gel und weitere fünf
Stück von
Whatman-Papier wurden auf dem Boden der Kathode (Anode) des Pharmacia-Novablot-Transferapparats
(Pharmacia) arrangiert. Der Transfer erfolgte eine Stunde lang bei
Konstantstrom (2 mA/cm2).
-
Der
Transfer wurde bestätigt,
indem das Erscheinen der vorgefärbten
Standards auf der Membran überprüft wurde.
Nicht-spezifische Orte auf der Membran wurden blockiert, indem der
Blot dreißig
Minuten lang in 1 × Phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
(1 × PBS;
137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, pH-Wert 7,4) mit 5% Magermilchpulver (Carnation)
inkubiert wurde. Primäre
Antikörper
(Kaninchen-α-Ricin,
Sigma) wurden in 1:3.000 in 1 × PBS,
das 0,1% Tween 20 (Sigma) enthält,
und 2,5% Magermilch gelöst
und mit Blot fünfundvierzig
Minuten auf einem Rundschüttler
(VWR) inkubiert. Die nicht spezifisch gebundenen primären Antikörper wurden
entfernt, indem der Blot zehn Minuten lang mit 1 × PBS gewaschen wurde,
das 0,2% Tween 20 enthält.
Das wurde vier Mal wiederholt. Der sekundäre Esel-anti-Kaninchen-Antikörper (Amersham)
wurde mit dem Blot unter den gleichen Bedingungen wie der primäre Antikörper inkubiert. Überschüssige sekundäre Antikörper wurden
wie oben beschrieben gewaschen. Die Blots wurden mit den ECL-Western-Blotting-Detection-Reagenzien
gemäß den Herstellerangaben
entwickelt. Die Blots wurden drei bis fünfzehn Minuten lang Medtecs
Full Speed Blue Film (Medtec) oder Amersham's ECL-Hyperfilm (Amersham) exponiert.
Der Film wurde in einem KODAK-Entwicklungsautomat
entwickelt.
-
Bestimmung
der lectinbindenden Fähigkeit
der Proricinvariante
-
Ein
Immulon-2-Place (VDVR) wurde mit 100 μl je Vertiefung mit 10 μg/ml Aasialofetuin
beschichtet und über
Nacht bei 4°C
stehen gelassen. Die Platte wurde mit 3 × 300 μl je Vertiefung mit ddH2O unter Verwendung eines automatischen Mikrotiterplatten-Washers
(BioRad) gewaschen. Die Platte wurde eine Stunde lang bei 37°C blockiert,
indem 300 μl
PBS je Vertiefung zugefügt
wurden, das 1% Ovalbumin enthielt. Die Platte wurde wie oben beschrieben
erneut gewaschen. Die Proricinvariante pAP 190 wurde zu der Platte
in verschiedenen Verdünnungen
in 1 × Baculo
zugefügt.
Eine Standardkurve von RCA60 (Sigma) von
1–10 ng
wurde ebenfalls einbezogen. Die Platte wurde 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert.
Die Platte wurde wie oben beschrieben gewaschen. Der monoklonale
Antiricin-Antikörper
(Sigma) wurde in 1:3.000 in 1 × PBS,
das 0,5% Ovalbumin und 0,1% Tween 20 enthielt, gelöst, bei
100 μl je
Vertiefung zugefügt
und 1 Stunde lang bei 37°C
inkubiert. Die Platte wurde wie oben beschrieben gewaschen. Der
polyklonale Esel-anti-Kaninchen-Antikörper (Sigma)
wurde in 1:3.000 in 1 × PBS,
das 0,5% Ovalbumin und 0,1% Tween 20 enthielt, gelöst, bei
100 μl je
Vertiefung zugefügt
und 1 Stunde lang bei 37°C
inkubiert. Die Platte erhielt eine Schlusswäsche wie oben beschrieben. Das
Substrat wurde einer Platte bei 100 μl je Vertiefung zugefügt (1 mg/ml
o-Phenylendiamin (Sigma), 1 μl/ml H2O2, 25 μl der Stopplösung (20%
H2SO4) wurde zugefügt und die
Absorbanz (A490 nm-A630 nm) unter Verwendung eines SPECTRA MAX 340
Plattenlesers (Molecular Devices) abgelesen.
-
Bestimmung der pAP-190-Aktivität unter
Verwendung des Kaninchen-Retikulozyt-Assays
-
Die
Ricinprobe wurde für
die Reduktion hergestellt.
- A) RCR60 =
3.500 ng/μl
von RCA60 + 997 μl 1 × Endopuffer (25 mM Tris, 25
mM KCl, 5 mM MgCl2, pH-Wert 7,6)
Reduktion
= 95 μl
von 10 ng/μl
+ 5 μl β-Mercaptoethanol
- (B) Ricinvarianten
Reduktion = 40 μl-Variante + 2 μl β-Mercaptoethanol
Der
Ricinstandard und die Varianten wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert.
-
Ricin-Kaninchen-Retikulozyt-Lysat-Reaktion
-
Die
erforderliche Anzahl von 0,5 ml-Röhren wurde markiert. (2 Röhren für jede Probe,
+ und – Anilin.) Jedem
der Proberöhren
wurden 20 μl
1 × Endopuffer
zugefügt,
und 30 μl
des Puffers wurde den Kontrollen zugefügt. Den Probenröhren wurden
entweder 10 μl
des 10 ng/μl
Ricins oder 10 μl
der Variante zugefügt. Schließlich wurden
30 μl des
Kaninchen-Retikulozyt-Lysats allen Röhren zugefügt. Die Proben wurden 30 Minuten
lang bei 30°C
unter Verwendung des Thermalblocks inkubiert. Die Proben wurden
aus dem Eppendorf-Röhrchen
entfernt, und die Inhalte wurden einem 1,5 ml Röhrchen zugefügt, das
1 ml TRIZOL (Gibco) enthielt. Die Proben wurden 15 Minuten lang
bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden 200 μl Chloroform
zugefügt,
und die Probe wurde bei 12.000 g 15 Minuten bei 4°C verwirbelt
und geschleudert. Die obere wässrige
Schicht der Proben wurde entfernt und die Inhalte einem 1 ml-Röhrchen zugeführt, das
500 μl Isopropanol
enthielt. Die Proben wurden 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert
und dann bei 12.000 g 15 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand
wurde entfernt, und die Pellets wurden mit 1 ml von 70%-igem Ethanol
gewaschen. Zentrifugieren bei 12.000 g 5 Minuten lang bei 4°C führte zur
Ausfällung
der RNA. Alles außer
ungefähr
20 μl des Überstands
wurde entfernt und die verbleibende Flüssigkeit unter Verwendung der
Speed-Vacuum-Maschine verdampft. Die Kontrollproben (–Anilin)
wurden in 10 μl
von 0,1 × E-Puffer (36 mM Tris,
30 mM NaH2PO4, 1
mM EDTA, pH-Wert 7,8) gelöst
und bei –70°C oder auf
Trockeneis bis zur späteren
Verwendung gelagert. Die Pellets der anderen Proben (+Anilinproben)
wurden in 20 μl DEPC-behandeltem
ddH2O gelöst. Ein 80 μl-Aliquot von 1 M Anilin (destilliert)
mit 2,8 M Essigsäure
wurde diesen RNA-Proben zugefügt
und in ein frisches 0,5 ml-Röhrchen
transferiert. Die Proben wurden in Dunkelheit 3 Minuten lang bei
60°C inkubiert.
Die RNA wurde durch Zufügen
von 100 μl
95%-igem Ethanol und 5 μl
3 M Natriumacetat, pH-Wert 5,2 in jedes Röhrchen und Zentrifugieren bei
12.000 g 30 Minuten lang bei 4°C
ausgefällt.
Die Pellets wurden mit 1 ml 70%-igem Ethanol gewaschen und erneut
bei 12.000 g 5 Minuten lang bei 4°C
zentrifugiert, um RNA ausfällen.
Der Überstand
wurde entfernt und die überschüssige Flüssigkeit
unter Verwendung der Speed-Vacuum-Machine verdampft. Diese Pellets
(+Anilin-Proben)
wurden in 10 μl
0,1 × E-Puffer
gelöst.
Allen Proben (+ und –Anilin)
wurden 10 μl
Formamid-Loading Dye zugefügt.
Die RNA-Leiter (8 μl
der Leiter + 8 μl
der Loading Dye) wurde ebenfalls beigefügt. Die Proben wurden 2 Minuten
bei 70°C
auf dem Thermalblock inkubiert. Die Elektrophorese wurde an den
Proben unter Verwendung von 1,2% Agarose-, 50% Formamidgelen in
0,1 × E-Puffer
+ 0,2% SDS durchgeführt.
Das Gel wurde 90 Minuten bei 75 Watt laufen gelassen. Die RNA wurde
visualisiert, indem das Gel 1 μg/μl Ethidiumbromid
im Laufpuffer 45 Minuten lang gefärbt hat. Das Gel wurde auf
einer 302 nm UV-Box unter Verwendung des Geldokumentationssystems überprüft und fotografiert.
-
Ergebnisse
-
Proteinexpressionsausbeute
-
Die
Aliquots wurden bei jedem Stopp der Ernte/Reinigung genommen und
getestet. Die Erträge
der funktionellen Ricinvariante wurden mittels ELISA determiniert.
Typische Ergebnisse auf einem 800 mL prep von infizierten T. ni
Zellen werden im Folgenden angegeben,
Aliquot | μg pAP 190 |
Vor
Konzentration und Dialyse | 648,5 |
Nach
Konzentration und Dialyse | 364,4 |
RSF-Säulen-Durchfluss | 62,1 |
ASF-Säulen-Elution | 300,7 |
Ausbeute: 300,7/648,5 = 46,4
-
Reinigung von pAP 190
und Western Analyse der Säulenfraktionen
-
Teilweise
gereinigtes pAP 190 wurde auf Superdex 75 und 200 (16/60) Säulen, die
miteinander verbunden sind, gegeben, um die kontaminierenden nicht
spezifisch verarbeitet pAP 190 zu entfernen. Elutierte Fraktionen
wurden per Western-Analyse getestet, und die Fraktionen, die das
reinste Protein enthielten, wurden gepooled, konzentriert und erneut über die
Säule gegeben.
Die Variante wurde insgesamt drei Mal über die Säule gegeben. Das finale gereinigte
pAP 190 hatte weniger als 1% prozessierte Variante. 13 zeigt, dass die gereinigte pAP 190 in drei
Fraktionen und das verarbeitete Material in zwei separaten Fraktionen
elutierte.
-
Gereinigtes
pAP 190 wurde auf seine Empfindlichkeit, mittels HIV-Protease gespalten
zu werden, und auf Aktivierung der A-Kette der Proricinvariante
(Inhibition der Proteinsynthese) getestet. PAP 190 wurde mit und
ohne HIV-Protease für
einen spezifischen Zeitraum inkubiert und dann einer Elektrophorese
unterzogen und geblotted. Gespaltenes pAP 190 wird als zwei 30 kDa
Proteine (B ist etwas größer) unter
reduzierenden (SDS-PAGE)-Bedingungen
laufen gelassen. Nicht verarbeitetes pAP 190, das die Linkerregion
enthält,
wird bei 60 kDa laufen gelassen. Die HIV-Protease war in der Lage,
pAP 190 (gezeigt in 14) zu spalten. Die Spuren
B und D zeigen unbehandelte; während
die Spuren C und E, bis G das mit HIV-Protease behandelte pAP 190
zeigt.
-
Die Aktivierung der pAP-190-Variante
mit HIV-Protease
-
Die
Aktivierung der HIV-Protease, die mit pAP 190, auf der Basis des
Verfahrens von May et al. (EMBO Journal. 8 301–8, 1989) behandelt ist, wurde
in 15 veranschaulicht. Das Erscheinen des 390-Basenpaarprodukts
wird in Spur B beobachtet, der positiven Kontrolle, und nicht in
Spur C beobachtet, der negativen Kontrolle. Die Spuren D–G zeigen,
dass es, wie vorhergesagt, keine N-Glycosidase-Aktivität in der
pAP 190-Variante gab. Die Spuren H–K zeigen, dass, wie vorhergesagt,
das verarbeitete pAP 190 die N-Glycosidase-Aktivität besitzt.
-
Die
pAP 190-Variante wurde in Insektenzellen exprimiert, bis zu über 99%
gereinigt, und die Aktivierung der Variante wurde mittels Spaltung
mit HIV-Protease demonstriert.
-
BEISPIEL 3
-
Klonierung und Expression
von Proricinvarianten, die durch HTLV aktiviert werden
-
Isolierung
von Gesamt-RNA
-
Das
Präproricingen
wird aus neuem Blattwerk des Rizinusstrauchs kloniert. Gesamt-Messenger-RNA wird
gemäß anerkannter
Verfahren isoliert (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Lab Manual
(Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, (1989)) und cDNA
wird unter Verwendung reverser Transkriptase generiert.
-
cDNA-Synthese
-
Oligonukleotide,
die den äußersten
5'- und 3'-Enden des Präproricingens
entsprechen, werden synthetisiert und verwendet, um das Gen mittels
PCR zu amplifizieren. Bei der Verwendung der cDNA-Sequenz für Präproricin
(Lamb et al., Eur. J. Biochem., 145: 266–270, (1985)), werden mehrere
Oligonukleotidprimere designed, um die Start-und Stoppcodone des offenen Leserahmens
des Präproricins
zu flankieren. Die Oligonukleotide werden unter Verwendung eines
Applied Biosystems Model 392 DNA/RNA-Synthetisierers synthetisiert. Die cDNA
des ersten Strangs wird unter Verwendung des Oligonukleotids Ricin1729C
primerunterstützt synthetisiert
(Tabelle 1). Drei Mikrogramm Gesamt-RNA werden als Matrize für Oligo-Ricinl729C
primunterstützer
Synthese der cDNA verwendet, unter Verwendung von Superscript II
Reverse-Transkriptase
(BRL), gemäß des Protokolls
des Herstellers.
-
DNA-Amplifikation
und Klonierung
-
Die
cDNA-Synthesereaktion des ersten Strangs wird als Matrize für die DNA-Amplifikation
mittels Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) verwendet. Die Präproricin-cDNA
wird unter Verwendung des Upstream-Primers Ricin-109 und des Downstream-Primers
Ricin1729C mit Vent-DNA-Polymerase
(New England Biolabs) unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition,
(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)) amplifiziert. Die Amplifikation
wird in einem Biometra Thermal-Cycler (TRIO-Thermalcycler) unter Verwendung der
folgenden Parameter durchgeführt:
Denaturierung bei 95°C
für 1 Min.,
Annealing bei 52°C
für 1 Min.,
und Extension 72°C
für 2 Min.,
(33 Zyklen), gefolgt von einem finalen Extensionszyklus bei 72°C für 10 Min.
Das amplifizierte Produkt 1846 bp wird auf einem Agarosegel fraktioniert
(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second
Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), und die DNA
wird von der Gelschicht unter Verwendung von Qiaex-Harz (Qiagen),
gemäß dem Protokoll
des Herstellers, gereinigt. Das gereinigte PCR-Fragment, das die Präproricin-cDNA kodiert, wird
dann (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second
Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)) in ein Eco-RI-verdautes
pBluescript-II-SK-Plasmid
(Stratagene) ligiert, und verwendet, um kompetente XL1-Blue-Zellen
(Stratagene) zu transformieren. Die positiven Klone werden mittels
Restriktionsverdauung der gereinigten Plasmid-DNA bestätigt. Die
Plasmid-DNA werden
unter Verwendung eines Qiaprep Spin-Plasmid-Miniprep-Kit (Qiagen) extrahiert.
-
DNA-Sequenzierung
-
Das
klonierte PCR-Produkt, das das mutmaßliche Präproricingen enthält, wird
mittels DNA-Sequenzierung des gesamten cDNA-Klons (pAP-144) bestätigt. Die
Sequenzierung wird unter Verwendung eines Applied Biosystems 373A
Automated DNA Sequenzers ausgeführt,
und mittels doppelsträngiger
Didesoxy-Sequenzierung per Sangerverfahren unter Verwendung des
Sequenase-Kits (USB) bestätigt.
Für die
Sequenzierung werden folgende Oligonukleotidprimer verwendet: Ricin267,
Ricin486, Ricin725, Ricin937, Ricin1151, Ricin 1399, Ricin1627,
T3-Primer (5'AATTAACCCTCACTAAAGGG-3') und T7-Primer (5'GTAATACGACTCACTATAGGGC-3).
Die Sequenzdaten werden unter Verwendung des PC-Gen-Software-Package
(intelligenetics) kompiliert und analysiert. Die Sequenzen und der
Ort der Oligonukleotidprimer sind in Tabelle 1 gezeigt.
-
Mutagenese
der Präproricin-Linker
-
Der
Präproricin-cDNA-Klon
(pAP-144) wird einer ortsgerichteten Mutagenese unterzogen, um eine Serie
von Varianten zu generieren, die sich nur in der Sequenz zwischen
den A- und B-Ketten unterscheiden (Linkerregion). Die Wildtyp-Präproricin-Linkerregion
wird mit den Linker-Sequenzen ersetzt, die in 20 dargestellt sind. Die Linkerregionen der Varianten
kodieren eine krankheitsspezifische Protease-Spaltungserkennungssequenz (Slalka et
al., Cell, 56: 911–913,
1989). Die Mutagenese- und Klonierungsstrategie, die verwendet wird,
um die HTLV-Proteasesensitiven Linkervarianten zu generieren, werden
in 16A, 17A, 18A und 19A zusammengefasst.
-
Am
ersten Schritt ist eine DNA-Amplifikation unter Verwendung eines
Satzes mutagener Primer beteiligt, die für die krankheitsspezifische
Protease-sensitive Linker kodieren, in Kombination mit den zwei
flankierenden Primer Ricin-109Eco und Ricin1729Xba. Das PCR-Protokoll
und die verwendeten Bedingungen sind die gleichen, wie oben beschrieben.
Die PCR-Produkte von jeder Mutagenesereaktion werden einer Gelreinigung
und dann einer Restriktionsverdauung unterzogen, entweder mit EcoRI
für das
die A-Kette kodierende Fragment, oder mit XbaI für das die B-Kette kodierende
Fragment. Restriktionsverdaute PCR-Fragmente sind Gel-gereinigt
und dann mit Pbluescript-SK ligiert, das mit EcoRI und XbaI verdaut
worden ist. Ligationsreaktionen werden verwendet, um kompetente
XL1-Blue-Zellen (Stratagene) zu transformieren. Rekombinante Klone
werden mittels Restriktions verdauen von Plasmid Miniprep-DNA identifiziert,
und die mutanten Linker-Sequenzen werden mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.
-
Subklonierung von Präproricinmutanten
in Vektor pVL1393
-
Die
Präproricinvarianten
werden in den Baculovirus-Transfervektor
pVL1393 (PharMingen) subkloniert. Die Subklonierungsstrategie für die HTLV-Protease-sensitive
Linkervarianten sind in 16C, 17C, 18C,
und 19C zusammengefasst. Das 1315
bp EcoRI/KpnI-Fragment, das die Ricin-A-Kette kodiert und jeder
mutante Linker ist von pAP-205, pAP-207, pAP-209 oder pAP-211 isoliert.
Jedes dieser gereinigten Fragmente ist mit einem 564-bp-KpnI/PStI-Fragment
ligiert, erhalten von pAP-144, und mit EcoRI/PstI gespaltenem pVL1393.
Rekombinante Klone werden mittels Restriktionsverdauen von Plasmid
Miniprep-DNA identifiziert, und 5'- und 3'-Verknüpfungen
wurden mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.
-
Isolierung
der rekombinanten Baculoviren
-
Die
Insektenzellen S. frugiperda (Sf9) und Trichoplusia ni (Tn368 und
BTI-TN-581-4 (High Five)) werden auf einem TMN-FH-Medium erhalten,
das mit 10% fötalem
Kälberserum
angereichert ist (Summers et al., A Manual of Methods of Baculovirus
Vectors and Insect Cell Culture Procedures, (Texas Agricultural
Experiment Station, 1987)). Zwei Mikrogramm rekombinanter pVL1393-DNA
(pAP-190, pAP-196
oder pAP-197) werden mit 0,5 Mikrogramm BaculoGold-AcNPV-DNA (Pharmingen)
in 2 × 106 Tn368 Insektenzellen kotransfiziert, gemäß dem Protokoll
des Herstellers (Gruenwald et al., Baculovirus Expression Vector
System: Procedures and Methods Manual, 2nd Edition, (San Diego,
CA, 1993)). An Tag 5 nach der Transfektion werden die Medien zentrifugiert,
und die Überstände werden
in limitierenden Verdünnungs-Assays
mit Tn368- Zellen
getestet (Summers et al., A Manual of Methods of Baculovirus Vectors
und Insect Cell Culture Procedures, (Texas Agricultural Experiment
Station, 1987)). Dann werden die rekombinanten Viren in den Überständen amplifiziert, indem
Tn368-Zellen bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,1 infiziert werden,
gefolgt von der Sammlung der Überstände am 7.
Tag. Insgesamt werden drei Amplifikationsrunden für jede Rekombinante
gemäß anerkannter
Verfahren durchgeführt
(Summers et al., A Manual of Methods of Baculovirus Vectors und
Insect Cell Culture Procedures, (Texas Agricultural Experiment Station,
1987 and Gruenwald et al., Baculovirus Expression Vector System:
Procedures and Methods Manual, 2nd Edition, (San Diego, CA, 1993)).
-
Expression
von mutantem Proricin
-
Rekombinante
Baculoviren (pAP-206-baculo, pAP-208-baculo, pAP-210-baculo und pAP-212-baculo) wurden
verwendet, um 2 × 105 Tn368 oder sf9-Zellen mit einer moi von
5 in EX-CELL400-Medien (JRH Biosciences) mit 25 mM a-Lactose in Schüttelkolben
zu infizieren. Medien-Überstände, die
mutante Proricine enthalten, werden am Tag 6 nach der Infektion
gesammelt.
-
Reinigung
von mutantem Proricin
-
Medien-Überstände werden
bei 100.000 g 1 Stunde lang ultrazentrifugiert. Nach der Zugabe
von 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid werden die Überstände unter Verwendung einer
Amicon 8050 Ultrafiltrationszelle, die mit einer Diaflo-XM50-Membran
ausgerüstet
ist, konzentriert. Die Überstände werden
dann ausgiebig gegen 137 mN NaCl, 2,2 mM KCl, 2,6 mM KH2PO4 und 8,6 mM Na2HPO4, pH-Wert 7,4, der 1 mM Dithiothreitol (Dialysepuffer)
enthält,
dialysiert. Rekombinante Proricinproteine werden mittels Affinitätschromatographie
unter Verwendung von Lactose-Agarose (Sigma) gereinigt, wie zuvor
für die
rekombinante Ricin-B-Kette beschrieben (Ferrini et al., Eur. J.
Biochem., 233: 772–777,
(1995)). Die Fraktionen, die das rekombinante Proricin enthalten,
werden unter Verwendung von SDS/PAGE, (Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989) und mittels Western-Blot-Analyse, unter Verwendung
von Anti-ricin-Antikörpern
(Sigma) identifiziert.
-
In-Vitro-Protease-Verdauung
von Proricinvarianten
-
Eine
affinitätsgereinigte
Proricinvariante wird mit individuellen krankheitsspezifischen Proteasen
behandelt, um die spezifische Spaltung in der Linkerregion zu bestätigen. Ricin-ähnliche
Toxinvarianten werden aus der Lactose-Agarose-Matrix im Protease-Verdauungspuffer
elutiert (50 mM NaCl, 50 mM Na-Acetat, pH-Wert 5,5, 1 mM Dithiothreitol),
das 100 mM Lactose enthält.
Das Proricinsubstrat wird dann bei 37°C 60 Minuten mit einer krankheitsspezifischen
Protease inkubiert. Die Spaltungsprodukte, die aus Ricin-A- und B-Ketten
bestehen, werden unter Verwendung von SDS/PAGE (Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd.
Ed., Cold Spring Harbor Press, 1989) gefolgt von Western-Blot-Analyse, unter Verwendung von
anti-Ricin-Antikörpern
(Sigma) identifiziert.
-
HTLV-Proteasen
können
von Bachem Bioscience erhalten werden. Cathepsin B kann von Medcor oder
Calbiochem erhalten werden.
-
In-Vitro-Translations-Assay
-
Die
Aktivität
der Protease-behandelten Ricin-ähnlichen
Toxinvarianten wurden unter Verwendung eines Kaninchen-Retikulozytlysats
in einem nicht radioaktiven (Amersham, ECL-System) In-vitro-Translationsassay überwacht.
-
Protease-behandeltes
Proricin wird einer Standard-50
ml-Translations-Reaktionsmischung zugefügt, die Trespenmosaik-Virus-mRNA
als Matrize enthält
(gemäß dem Protokoll
des Herstellers). Aktive Ricinvarianten inhibieren die In-vitro-Translationreaktion,
indem Ribosomen inaktiviert werden. Folglich wurden in Gegenwart
einer aktiven Ricinvariante keine viralen Proteine synthetisiert.
-
In-Vitro-Hefeproteinsyntheseassay
-
Die
Aktivität
von Protease-behandelten Proricin-ähnlichen
Toxinen können
auch mittels eines Hefeproteinsyntheseassays bewertet werden. Zum
Beispiel lehrt Murakami, S et al., Mol., Cel. Biol. 2: 588–592, 1982, ein
Hefeproteinsyntheseassay, um eine Ricin-ähnliche Toxizität zu determinieren,
das genauso empfindlich ist, wie die Säugerzellen-Assays.
-
Sechs
fünf ml
Kulturen von Saccharomyces cerevisiase (Y235-Zellen und 2 Zellwandmutanten)
in einem YPD-Medium
(10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton) werden gestartet, indem 800 μl des Medium
mit 1 Kolonie Saccharomyces cerevisiase inokuliert und verwirbelt
werden und dann 100 μl
dieser Suspension zu 5 mL des Mediums zugegeben werden. Die Kulturen
werden über
Nacht bei 30°C
unter leichtem Rühren
wachsen gelassen. Die Zellen werden mittels Inokulation von 100 μl YPD-Medium
mit einer oder mehreren der 5 ml-Über-Nacht-Kulturen expandiert
und bei 30°C
unter leichtem Rühren
bis zu einer Konzentration von 1 × 105 Zellen/ml
wachsen gelassen. Die Zellen werden mit sterilem doppelt destilliertem
Wasser gewaschen, bei 1.200 g 3 Minuten lang zentrifugiert und in
einem ZSM-Puffer (1 M Sorbitol, 10 mM Tris-Cl, pH-Wert 7,5, 50 mM
Dithiotheitol (DDT)) 3-fach konzentriert. Die Proben werden unter
leichtem Schütteln
10 Minuten lang bei 30°C
inkubiert, bei 1.200 g 3 Minuten lang zentrifugiert und in einem
ZSM- Puffer resuspendiert,
so dass die Zellkonzentration bei 1 × 108 Zellen/ml
lag. Die Zellwände
werden gesprengt, indem den Proben 1 ml Betaglucuronidase (Sigma,
St. Louis, MO.) zugefügt
und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert
wird. Die Zellen werden 3 Mal mit ZSM und Protoplastzellen im Regenerationsmedium
(0,17% Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren (Difco, Detroit, Michigan)
gewaschen, in 2 Dropout + all (essentielle Aminosäuren), 10
mM Tris-Cl, pH-Wert
7,5, 2% Glucose, 1 M Sorbitol) bis zu einer Endkonzentration von
1 × 108 Zellen/ml resuspendiert. Eine aktivierte
Proricinvariante, die in einem sterilem 1 × Baculopuffer (0,137 M) NaCl, 2,7
mM KCl, 2,6 mM KH2PO4,
pH-Wert 7,4) dialysiert wurde, wird einer Hälfte des Protoplasts zugefügt, während ein
steriler 1 × Baculopuffer
allein der anderen Hälfte
des Protoplasts als Kontrolle zugefügt wird. Beide Probensets wurden
bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubiert. In Zeitabständen von
0, 1, 2, und 3 Stunden wird ein Aliquot jeder Kultur entfernt. Die
Zellen werden der Reihe nach von 10–4 auf
10–8 in
ZSM verdünnt
und auf Weichagar plattiert (1:1 ZSM:YPD, 15% Agar). Gleichzeitig
werden Verdünnungen
von 10–2 bis 10–4 in
sterilem doppelt destilliertem Wasser gemacht und 50 μL Aliquots
werden auf YPD-Medium mit 20% Agar plattiert. Die Platten werden
2 Tage lang bei 30°C
plattiert und danach werden die Kolonien gezählt. Eine grafische Darstellung,
die die Zahl der gezählten
Zellen mit der Zeit in Relation setzt, wird verwendet, um die Ricin-Testkultur mit der
Kontrollkultur ohne Ricin zu vergleichen.
-
Die
aktivierte Proricin-ähnliche
Toxinvariante inhibiert in vitro die Proteinsynthese durch ribosomale
Inaktivierung. Es wird erwartet, dass die Zellwachstumsrate der
Behandlungsgruppe bedeutend niedriger ist, als die der Kontrollgruppe.
-
Die N-Glycosidaseaktivität der Proricinvariante
auf rRNA-Oligonukleotide
-
Ricin-ähnliche
Toxine inhibieren die ribosomale Funktion, indem sie die N-glycosidische
Bindung zwischen der Nukleotidbase und der Ribose bei Position A4319
in eukaryontischer 28S-ribosomaler RNA (rRNA) hydrolysieren. Die
Fähigkeit
der aktivierten Ricin-ähnlichen
Toxine, die ribosomale RNA (rRNA)-Funktion zu inhibieren, kann in
einem In-Vitro-Ribonukleotidkatalyseassay untersucht werden, unter
Verwendung eines synthetischen Oligoribonukleotids, das die sekundäre Struktur
der natürlichen
hydrolytischen Spaltungsdomäne
der RNA besitzt.
-
Ein
synthetisches 32-Nukleotid-RNA-Oligomer (University of Calgary,
DNA Core Services), das die 28S-rRNA-Toxinaktive Stelle imitiert,
wird verwendet, um die N-Glycosidaseaktivität der Proricinvarianten
zu testen. Die Olinukleotidsequenz und die allgemeine Methodik werden
im Wesentlichen in Gluck, A. und Wool I. G., J. Mol. Biol. 256:
838–848,
1996 beschrieben.
-
Eine
Markierungsreaktion wird aufgebaut und umfasst: 50 pmol Oligonukleotid,
20 Einheiten von T4-Polynukleotidkinase
(PNK; Gibco-BRL, Gaithersburg, MA), 25 pmol von γ-32P
(Amersham, Arlington, IL), 1 × T4
PNK-Puffer in einem
Endvolumen von 50 μl.
Die Proben werden 30 Minuten lang bei 37°C und dann 20 Minuten lang bei
65°C inkubiert.
Das markierte Oligonukleotid wird mit 95% Ethanol ausgefällt und
unter Verwendung eines Thermal-Cyclers getrocknet. Ein zweiter Ethanol-Ausfällungsschritt
kann wiederholt werden, um weitere Spuren von Fremdstoffen zu beseitigen.
Die RNA wurde auf eine Endkonzentration von 1 ng/μl in 10 mM
Tris-Cl (pH-Wert 7,6) und 50 mM NaCl (5 ng Oligonukleotid wird je
Probe verwendet) resuspendiert.
-
Die
aktivierte Proricinvariante wird vor der Verwendung in 1 × Baculopuffer
mit 1% Betamercaptoethanol 30 Minuten lang bei Raumtemperatur reduziert.
Die Oligonukleotide werden in 10 mM Tris-Cl (pH-Wert 7,6), 50 mM
NaCl 1 Minute lang auf 90°C
erhitzt und können
bei 0°C
renaturieren. CaCl2, EGTA und Wasser werden zu
der renaturierten RNA zugefügt,
um die folgenden Konzentrationen zu ergeben: 3 mM Tris-HCl (pH 7,6),
15 mM NaCl, 5 mM CaCl2 und 5 mM EGTA. Eine
aktivierte Proricinvariante oder Ricin-A-Kette (Sigma, St. Louis, MO)
wird jedem Röhrchen
zugefügt.
Die Konzentration des Ricins reichte von 1 bis 10 μM, und die
Proricinvariante war 10-fach größer. Die
Röhrchen
werden bei 35°C
20 Minuten lang inkubiert, und die Reaktion wird durch die Zugabe
von Natriumdodecylsulfat (SDS) in einer Endkonzentration von 0,5%
(w/v) gestoppt. Das Oligonukleotid und 15 μg des zugefügten Trägers tRNA (Hefe-tRNA; Gibco-BRL
Gaithersburg, MA) werden mit 300 mM NaCl und 2,5 Volumen von 95%
Ethanol ausgefällt.
Die Pellets werden einmal mit 70% Ethanol gewaschen und auf CENTRIVAP
(Labconco, Kansas City, MO) getrocknet. Die RNA wird in 5 μl Wasser
aufgelöst,
25 μl einer
Lösung
von Anilin und Essigsäure
(1 bzw. 2,8 mM) werden zugefügt,
und die Probe wird 10 Minuten bei 40°C inkubiert. Die Anilin-behandelte
RNA wird mit Ethanol und 300 mM NaCl ausgefällt, einmal in 70% Ethanol
gewaschen und auf CENTRIVAP getrocknet. Die Pellets werden in 10 μl DEPC-behandeltem doppelt
destilliertem Wasser und 10 μl
2 × Loading
Dye (178 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,3), 178 mM Borsäure, 5 mM EDTA, 0,05% (w/v)
Bromophenolblau und 14 M Harnstoff) gelöst und 3 Stunden lang bei 50
Watt in 10% (w/v) Polyacrylamidgel der Elektrophorese unterzogen,
wobei 7 M Harnstoff in 1 × TBE-Puffer (89 mM Tris-HCl (pH-Wert
8,3), 89 mM Borsäure,
2,5 mM Borsäure,
2,5 mM EDTA) enthalten sind. Die Gele werden einem blauen Höchstgeschwindigkeits-Röntgenfilm
von KODAK exponiert und bei –70°C stehen
gelassen.
-
Nach
2 Tagen wurde der Film in einem automatischen KODAK-Filmprozessor
entwickelt.
-
Wenn
die Proricinvariante, die mit einer krankheitsspezifischen Protease
aktiviert ist, dem Oligoribonukleotid zugefügt wird, würde die Hydrolyse der N-glycosidischen Bindung
an Position 20 (Depurinieren von Adenosin) stattfinden, und das
Erscheinen von zwei Banden auf dem Autoradiogramm würde erwartet.
Die Proricinvariante ohne Vorbehandlung mit der krankheitsspezifischen
Protease würde
das RNA-Oligonukleotid nicht spalten und würde zu einem einfachen Band
auf dem Autoradiogramm führen.
-
In-Vitro-Cytotoxizitätsassay
-
Humane
Ovarialkarzinomzellen (z. B. MA148) werden in Flachbodenplatten
mit 96-Vertiefungen ausgesät
und Ricin-ähnlichen
Toxinvarianten oder einem Kontrollmedium 16 Stunden lang bei 37°C ausgesetzt. Die
Lebensfähigkeit
der Krebszellen wird mittels Messung [35S]Methionin-Inkorporation
determiniert und ist in den Vertiefungen, die mit den Toxinvarianten
behandelt wurden signifikant niedriger, als in jenen mit dem Kontrollmedium.
-
In-Vivo-Tumorwachstums-Inhibitionsassay
-
Humane
Brustkrebszellen (z. B. MCF-7) werden in einem passenden Medium
erhalten, das 10% fötales
Kälberserum
enthält.
Die Zellen werden gewachsen, geerntet und daraufhin in athymische
nackte Mäuse, denen
die Eierstöcke
entfernt wurden, subkutan injiziert. Die Tumorgröße wird in Intervallen determiniert,
indem zwei rechtwinkelige Messungen unter Verwendung von Schieblehren
gemessen werden.
-
In-Vivo-Tumor-Metastasenassay
-
Die
Metastasenstudie wird im Wesentlichen wie in Honn beschrieben, K.
V. et al. (Biochem. Pharmacol. 34: 235–241 (1985)) ausgeführt. Lebensfähige B16a-Melanomtumorzellen
werden hergestellt und subkutan in die linke axilläre Region
von syngenen Mäusen
injiziert. Das Ausmaß der
Tumormetastase wird nach 4 Wochen gemessen. Die Lungen werden aus
den Tieren entfernt und in Bouin's-Lösung fixiert,
und makroskopische pulmonale Metastasen werden unter Verwendung
eines Präpariermikroskops
gezählt.
Ohne therapeutische Intervention bildet die Injektion von 10
5 lebensfähigen
Tumorzellen im Allgemeinen ungefähr
40 bis 50 pulmonale Metastasen. TABELLE
1 Tabelle
1 – Sequenz
und Ort von Oligonukleotidprimern
- ✝ unterstrichene
Sequenzen zum Subklonieren einegefügt und nicht in endgültigen Präprorian-Sequenzen
enthalten
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-