JP2521657B2 - 組換ｄｎａ分子及びこれを含有する形質転換宿主細胞 - Google Patents
組換ｄｎａ分子及びこれを含有する形質転換宿主細胞Info
- Publication number
- JP2521657B2 JP2521657B2 JP59145878A JP14587884A JP2521657B2 JP 2521657 B2 JP2521657 B2 JP 2521657B2 JP 59145878 A JP59145878 A JP 59145878A JP 14587884 A JP14587884 A JP 14587884A JP 2521657 B2 JP2521657 B2 JP 2521657B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- nucleotide sequence
- recombinant dna
- dna molecule
- following
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Botany (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明はリシン又はリシンのＡ鎖のポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列を有するDNAを含有する組換D
NA分子及びこの組換DNA分子を含有する宿主細胞に関す
る。リシン、及びそれ以外の植物毒素例えばアブリン，
モデシン（modeccin）及びビスキユミン（viscumin）
は、ジスルフイドブリツジによつて結合された２つのポ
リペプチド鎖（Ａ鎖及びＢ鎖として知られている）から
成り、１つの鎖（Ａ鎖）は細胞毒性の主因であり、残り
の鎖（Ｂ鎖）は分子を細胞表面に結合させ得る部位を有
する。リシンはRiciniscommunis（ヒマとしても知られ
る）中で“プレプロリシン”として知られるタンパク前
駆物質を経て産生される。
ードするヌクレオチド配列を有するDNAを含有する組換D
NA分子及びこの組換DNA分子を含有する宿主細胞に関す
る。リシン、及びそれ以外の植物毒素例えばアブリン，
モデシン（modeccin）及びビスキユミン（viscumin）
は、ジスルフイドブリツジによつて結合された２つのポ
リペプチド鎖（Ａ鎖及びＢ鎖として知られている）から
成り、１つの鎖（Ａ鎖）は細胞毒性の主因であり、残り
の鎖（Ｂ鎖）は分子を細胞表面に結合させ得る部位を有
する。リシンはRiciniscommunis（ヒマとしても知られ
る）中で“プレプロリシン”として知られるタンパク前
駆物質を経て産生される。
プレプロリシンは、リーダー配列を含むポリペプチド
単鎖を含む。リーダー配列は生体中で除去されてプロリ
シンを生じ、このプロリシンが次に開裂され、リンカー
領域が除去されジスルフイド結合で接合されて成熟タン
パクを形成する。
単鎖を含む。リーダー配列は生体中で除去されてプロリ
シンを生じ、このプロリシンが次に開裂され、リンカー
領域が除去されジスルフイド結合で接合されて成熟タン
パクを形成する。
リシン型毒素の毒性は３段階で作用する。即ち、
（１）Ｂ鎖を介して細胞表面に結合する；（２）少くと
もＡ鎖が細胞質ゾルに浸透する；（３）リボソームの60
Sサブユニツトを巧撃するＡ鎖によつてタンパク合成を
阻害する。従つて、互いに分離されたＡ鎖及びＢ鎖は本
質的に無毒であり、本来有毒なＡ鎖は、Ｂ鎖が存在しな
いと細胞表面に結合する能力をもたない。
（１）Ｂ鎖を介して細胞表面に結合する；（２）少くと
もＡ鎖が細胞質ゾルに浸透する；（３）リボソームの60
Sサブユニツトを巧撃するＡ鎖によつてタンパク合成を
阻害する。従つて、互いに分離されたＡ鎖及びＢ鎖は本
質的に無毒であり、本来有毒なＡ鎖は、Ｂ鎖が存在しな
いと細胞表面に結合する能力をもたない。
また、リシン型毒素に於いては、Ｂ鎖はガラクトース
認識部位を介して細胞表面に結合することも知られてい
るが、この部位は細胞表面に露出した糖タンパク又は糖
脂質と反応する。
認識部位を介して細胞表面に結合することも知られてい
るが、この部位は細胞表面に露出した糖タンパク又は糖
脂質と反応する。
腫瘍細胞のみに対する結合能を有する別の担体成分を
無差別結合Ｂ鎖に置換すると、リシンＡ鎖の毒性を抗腫
瘍治療に使用し得るかも知れないことは既に教示されて
いる。即ち、全リシン又は天然リシンの分離Ａ鎖と腫瘍
特異的モノクローナル抗体との接合体から成る種々の免
疫毒素（immunotoxin）は既に調製されている。これら
公知の接合体はかなり有効ではあるが、まだ改良の余地
がある。
無差別結合Ｂ鎖に置換すると、リシンＡ鎖の毒性を抗腫
瘍治療に使用し得るかも知れないことは既に教示されて
いる。即ち、全リシン又は天然リシンの分離Ａ鎖と腫瘍
特異的モノクローナル抗体との接合体から成る種々の免
疫毒素（immunotoxin）は既に調製されている。これら
公知の接合体はかなり有効ではあるが、まだ改良の余地
がある。
公知の接合体に関する１つの問題は、天然リシンから
得られるＡ鎖の構造的特徴から生じる。天然リシンのＡ
鎖は合成中にRicinus細胞中に存在する酵素によつてＮ
−グリコシル化されることが知られており、これにより
生じる糖成分は細胞表面との非特異的相互作用が可能で
あると考えられる。即ち、公知のＡ鎖接合体は天然Ｂ鎖
が存在しない場合にも標的以外の細胞と或る程度結合す
ることができ、従つて標的以外の細胞に対する免疫毒素
の毒性を増加すると考えられる。
得られるＡ鎖の構造的特徴から生じる。天然リシンのＡ
鎖は合成中にRicinus細胞中に存在する酵素によつてＮ
−グリコシル化されることが知られており、これにより
生じる糖成分は細胞表面との非特異的相互作用が可能で
あると考えられる。即ち、公知のＡ鎖接合体は天然Ｂ鎖
が存在しない場合にも標的以外の細胞と或る程度結合す
ることができ、従つて標的以外の細胞に対する免疫毒素
の毒性を増加すると考えられる。
公知のリシンＡ鎖接合体に関する別の問題は、Ｂ鎖が
リシン分子を細胞表面に結合せしめるという第一機能以
外に中毒プロセスに或る程度関与するという重大な第二
機能を有することから発生する。Ｂ鎖をモノクローナル
抗体の如き別の担体成分で置換すると第二機能が消滅す
る。
リシン分子を細胞表面に結合せしめるという第一機能以
外に中毒プロセスに或る程度関与するという重大な第二
機能を有することから発生する。Ｂ鎖をモノクローナル
抗体の如き別の担体成分で置換すると第二機能が消滅す
る。
Ａ鎖糖成分と細胞表面との相互作用を阻止し同時にＢ
鎖の毒性増化という第二機能を維持することができるな
らば、全リシン抗体接合体の健常細胞に対する毒性を低
減し標的細胞に対する毒性を増加し得、これにより免疫
毒素の治療指数を向上させ得るであろう。また、天然リ
シンＢ鎖がＮ−グリコシル化されＢ鎖の糖成分も非特異
的相互作用に寄与し得ることも知られている。更に、双
方の鎖の糖成分はリシン分子を肝内の網内細胞によつて
隔離することができ、従つて、このような糖成分が維持
されたリシン分子の一部又は全部をベースとする薬物
の、系からの迅速な排泄が惹起される。
鎖の毒性増化という第二機能を維持することができるな
らば、全リシン抗体接合体の健常細胞に対する毒性を低
減し標的細胞に対する毒性を増加し得、これにより免疫
毒素の治療指数を向上させ得るであろう。また、天然リ
シンＢ鎖がＮ−グリコシル化されＢ鎖の糖成分も非特異
的相互作用に寄与し得ることも知られている。更に、双
方の鎖の糖成分はリシン分子を肝内の網内細胞によつて
隔離することができ、従つて、このような糖成分が維持
されたリシン分子の一部又は全部をベースとする薬物
の、系からの迅速な排泄が惹起される。
化学的方法又は酵素学的方法によつて天然リシンから
糖成分を完全に除去する試みはこれまで成功していな
い。しかし乍ら、既知の全リシン−抗体接合体の使用に
対する主な障害は、リシンＢ鎖に２つのガラクトース結
合部位が存在することである。これらのＢ鎖ガラクトー
ス結合部位は、特にin vivoで使用されたとき、現行の
全リシン−抗体接合体の非特異的細胞相互作用の主因と
なる。天然毒素中にこれらの部位が存在すると、抗体に
よつて与えられる標的特異性は明らかに除去されるか又
は低減する。
糖成分を完全に除去する試みはこれまで成功していな
い。しかし乍ら、既知の全リシン−抗体接合体の使用に
対する主な障害は、リシンＢ鎖に２つのガラクトース結
合部位が存在することである。これらのＢ鎖ガラクトー
ス結合部位は、特にin vivoで使用されたとき、現行の
全リシン−抗体接合体の非特異的細胞相互作用の主因と
なる。天然毒素中にこれらの部位が存在すると、抗体に
よつて与えられる標的特異性は明らかに除去されるか又
は低減する。
リシン又はそれ以外のリシン型植物毒素をベースとし
ており前記の如き課題が解決された改良免疫毒素は、Ｎ
−グリコシル化が生じないように且つＢ鎖がガラクトー
ス認識部位を有していないように修飾されておりしかも
二次機能たる中毒促進性を維持している全毒素分子が標
的細胞に毒素を送出する担体成分に結合して構成されて
いる。これは、適当なモノクローナル抗体の如く腫瘍特
異的及び／又は細胞／組織特異的へビクルになり得る。
ており前記の如き課題が解決された改良免疫毒素は、Ｎ
−グリコシル化が生じないように且つＢ鎖がガラクトー
ス認識部位を有していないように修飾されておりしかも
二次機能たる中毒促進性を維持している全毒素分子が標
的細胞に毒素を送出する担体成分に結合して構成されて
いる。これは、適当なモノクローナル抗体の如く腫瘍特
異的及び／又は細胞／組織特異的へビクルになり得る。
リシン自体に的を絞つた出願人等のこれ迄の研究によ
れば、リシン（及び軽度に修飾されたＡ鎖とＢ鎖とを有
する２つのリシン様分子から成る近縁凝集素）の組立て
は、別々のmRNAの産生物の如くＡ鎖とＢ鎖との別々の合
成を含むのでなく、Ａ鎖とＢ鎖との双方の配列を含む１
つのポリペプチド前駆体を先ず形成することが判明し
た。このことは同じタイプの別の毒素の場合にも当ては
まると考えてよい。
れば、リシン（及び軽度に修飾されたＡ鎖とＢ鎖とを有
する２つのリシン様分子から成る近縁凝集素）の組立て
は、別々のmRNAの産生物の如くＡ鎖とＢ鎖との別々の合
成を含むのでなく、Ａ鎖とＢ鎖との双方の配列を含む１
つのポリペプチド前駆体を先ず形成することが判明し
た。このことは同じタイプの別の毒素の場合にも当ては
まると考えてよい。
本発明は、前記の如きリシン型の毒素の分子、又は、
このような毒素分子の一部、又は、（毒素分子自体に変
換され得る）前記の如き分子の前駆体を発現し得る微生
物を遺伝子操作によつて調製することができるという理
論に基く。該毒素分子は前記に教示したように修飾する
ことができ、且つ、該毒素分子を腫瘍特異的又は細胞／
組織特異的モノクローナル抗体又は別の担体成分例えば
ホルモン又はレクチンと組合せることによつて有効な毒
素接合体の構築に使用し得るものである。
このような毒素分子の一部、又は、（毒素分子自体に変
換され得る）前記の如き分子の前駆体を発現し得る微生
物を遺伝子操作によつて調製することができるという理
論に基く。該毒素分子は前記に教示したように修飾する
ことができ、且つ、該毒素分子を腫瘍特異的又は細胞／
組織特異的モノクローナル抗体又は別の担体成分例えば
ホルモン又はレクチンと組合せることによつて有効な毒
素接合体の構築に使用し得るものである。
リシンが前駆体ポリペプチドを経て形成されるので、
リシン前駆体を発現する細胞系を公知技術によつて構築
し得るであろう。次に、リシン前駆体産生物を化学的又
は酵素学的に所望の修飾リシンに変換し得る。本文中の
別のリシン型毒素の場合にも同様の技術を使用し得る。
別の技術としては、前駆体をコードするDNA配列からＡ
鎖とＢ鎖とを別々にコードする２つの配列を分割し、分
割されたこれらの配列を異なるクローニングベヒクルに
挿入し、得られた組換DNA分子を別々の宿主微生物に挿
入する方法である。このような宿主の１つはＡ鎖ポリペ
プチド配列を発現し、別の１つはＢ鎖ポリペプチド配列
を発現するであろう。次に、これらの配列が合一して所
望の修飾リシン分子を形成し得る。この技術はまた、Ａ
鎖及びＢ鎖が別々のmRNA遺伝子プールによつてコードさ
れているいかなるリシン型毒素にも使用され得ることは
明らかであろう。この方法では、Ａ鎖及びＢ鎖が別々に
発現されるので無毒性である。従つて安全性の見地から
この方法は好ましい。
リシン前駆体を発現する細胞系を公知技術によつて構築
し得るであろう。次に、リシン前駆体産生物を化学的又
は酵素学的に所望の修飾リシンに変換し得る。本文中の
別のリシン型毒素の場合にも同様の技術を使用し得る。
別の技術としては、前駆体をコードするDNA配列からＡ
鎖とＢ鎖とを別々にコードする２つの配列を分割し、分
割されたこれらの配列を異なるクローニングベヒクルに
挿入し、得られた組換DNA分子を別々の宿主微生物に挿
入する方法である。このような宿主の１つはＡ鎖ポリペ
プチド配列を発現し、別の１つはＢ鎖ポリペプチド配列
を発現するであろう。次に、これらの配列が合一して所
望の修飾リシン分子を形成し得る。この技術はまた、Ａ
鎖及びＢ鎖が別々のmRNA遺伝子プールによつてコードさ
れているいかなるリシン型毒素にも使用され得ることは
明らかであろう。この方法では、Ａ鎖及びＢ鎖が別々に
発現されるので無毒性である。従つて安全性の見地から
この方法は好ましい。
本発明によれば、リシンのＡ鎖を構成するかつ下記の
アミノ酸配列（Ａ）からなるポリペプチドをコードする
DNAであってかつ下記のヌクレオチド配列（Ａ）を有す
るか又は上記ヌクレオチド配列（Ａ）と遺伝暗号の縮重
の関係にあるヌクレオチド配列を有するDNA（ｉ）をイ
ンサートとして含有することを特徴とする組換DNA分子
が提供される。
アミノ酸配列（Ａ）からなるポリペプチドをコードする
DNAであってかつ下記のヌクレオチド配列（Ａ）を有す
るか又は上記ヌクレオチド配列（Ａ）と遺伝暗号の縮重
の関係にあるヌクレオチド配列を有するDNA（ｉ）をイ
ンサートとして含有することを特徴とする組換DNA分子
が提供される。
本発明によれば、更に、プロリシンを構成する下記の
アミノ酸配列（Ｂ）からなるポリペプチドをコードする
DNAであってかつ下記のヌクレオチド配列（Ｂ）を有す
るか又は上記ヌクレオチド配列（Ｂ）と遺伝暗号の縮重
の関係にあるヌクレオチド配列を有するDNA（ii）をイ
ンサートとして含有することを特徴とする組換DNA分子
が提供される。
アミノ酸配列（Ｂ）からなるポリペプチドをコードする
DNAであってかつ下記のヌクレオチド配列（Ｂ）を有す
るか又は上記ヌクレオチド配列（Ｂ）と遺伝暗号の縮重
の関係にあるヌクレオチド配列を有するDNA（ii）をイ
ンサートとして含有することを特徴とする組換DNA分子
が提供される。
本発明によれば、更に、下記のアミノ酸配列（Ｃ）か
らなるシグナルペプチドをコードするDNAであってかつ
下記のヌクレオチド配列（Ｃ）を有するか又は下記のヌ
ヌクレオチド配列（Ｃ）と遺伝暗号の縮重の関係にある
ヌクレオチド配列を有するDNAを前記DNA（ｉ）の５′末
端に有する前記の組換DNA分子が提供される。
らなるシグナルペプチドをコードするDNAであってかつ
下記のヌクレオチド配列（Ｃ）を有するか又は下記のヌ
ヌクレオチド配列（Ｃ）と遺伝暗号の縮重の関係にある
ヌクレオチド配列を有するDNAを前記DNA（ｉ）の５′末
端に有する前記の組換DNA分子が提供される。
前記インサートされるDNAは、前記組換DNAを得るため
に、プラスミド又はバクテリオファージであるクローニ
ングベクター中に導入されている。
に、プラスミド又はバクテリオファージであるクローニ
ングベクター中に導入されている。
本発明の別の目的は、前記の如き組織DNA分子を含む
遺伝的に変容された宿主微生物を提供することである。
遺伝的に変容された宿主微生物を提供することである。
本発明の組換DNA分子に於いて、Ｂ鎖をコードするヌ
クレオチド配列はガラクトース結合部位を除去又は失活
するように修飾され得、前駆体ポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列従つて成熟タンパク中のヌクレオチ
ド配列はガラクトース結合部位を除去又は失活するよう
に修飾され得、Ｎ−グリコシル化シグナルをコードする
配列は、該シグナルを無効又は除去するように修飾され
得る。このために有用な技術の例として欠失又はオリゴ
ヌクレオチド媒介突然変異がある。
クレオチド配列はガラクトース結合部位を除去又は失活
するように修飾され得、前駆体ポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列従つて成熟タンパク中のヌクレオチ
ド配列はガラクトース結合部位を除去又は失活するよう
に修飾され得、Ｎ−グリコシル化シグナルをコードする
配列は、該シグナルを無効又は除去するように修飾され
得る。このために有用な技術の例として欠失又はオリゴ
ヌクレオチド媒介突然変異がある。
宿主生物は植物細胞又は動物細胞又は微生物のいずれ
でもよく微生物が好ましい。
でもよく微生物が好ましい。
微生物は原核生物又は真核生物のいずれでもよい。原
核生物の例としては、グラム陰性菌、例えば、E.coli,M
ethylophilus methylotrophus及びAlcaligenes eutroph
us,並びに、グラム陽性菌、例えば、Streptmyces,Bacil
lus subtilis及びArthrobacterがある。真核生物の例と
して酵母、例えばSaccharomyces cerevisiaeがある。
核生物の例としては、グラム陰性菌、例えば、E.coli,M
ethylophilus methylotrophus及びAlcaligenes eutroph
us,並びに、グラム陽性菌、例えば、Streptmyces,Bacil
lus subtilis及びArthrobacterがある。真核生物の例と
して酵母、例えばSaccharomyces cerevisiaeがある。
組換DNA分子は、リシン型植物毒素の前駆体ポリペプ
チドの少くとも一部又はＡ鎖もしくはＢ鎖の少くとも一
部をコードするDNA配列が挿入されたプラスミド又はフ
アージベクターの如きクローニングベクターを含み得
る。
チドの少くとも一部又はＡ鎖もしくはＢ鎖の少くとも一
部をコードするDNA配列が挿入されたプラスミド又はフ
アージベクターの如きクローニングベクターを含み得
る。
クローニングベクターとしてはプラスミドが好ましい
がフアージベクターの使用も可能である。プラスミドは
自然産プラスミドでもよく、又は好ましくは別のプラス
ミドの断片から誘導された混成材料でもよい。混成プラ
スミドを使用するときは、該プラスミドがリシン遺伝子
の発現を改良するプロモータ配列を含むのが好ましい。
がフアージベクターの使用も可能である。プラスミドは
自然産プラスミドでもよく、又は好ましくは別のプラス
ミドの断片から誘導された混成材料でもよい。混成プラ
スミドを使用するときは、該プラスミドがリシン遺伝子
の発現を改良するプロモータ配列を含むのが好ましい。
クローニングベヒクルとして使用され得る適当なプラ
スミドの例として、特に、グラム陰性菌にはpBR322,pAT
153,pUC8,pGSS15及びpMB9があり、グラム陽性菌にはpVC
6があり、S.cerevisiaeにはpMA91,pMA230,YRp7,pLC544
及びYEp6がある。ベクターは予定した特定宿主に適する
ように選択されるであろう。
スミドの例として、特に、グラム陰性菌にはpBR322,pAT
153,pUC8,pGSS15及びpMB9があり、グラム陽性菌にはpVC
6があり、S.cerevisiaeにはpMA91,pMA230,YRp7,pLC544
及びYEp6がある。ベクターは予定した特定宿主に適する
ように選択されるであろう。
本発明は更に、組換DNA分子を得るための方法を提供
する。本発明方法は、リシン型植物毒素に存在するポリ
ペプチド配列をコードする二本鎖DNA配列を調製しこの
二本鎖DNA配列をクローニングベクターに挿入するステ
ツプを含む。
する。本発明方法は、リシン型植物毒素に存在するポリ
ペプチド配列をコードする二本鎖DNA配列を調製しこの
二本鎖DNA配列をクローニングベクターに挿入するステ
ツプを含む。
より詳細にはこのような方法は、リシンＡ及びＢ鎖前
駆体ポリペプチドをコードするmRNAを単離し、逆転写酵
素と適当なプライマーとを用いて前記mRNAから単離cDNA
を合成し、DNAポリメラーゼとS1ヌクレアーゼとを順次
用いて前記第一鎖から形成された鋳型に第二DNA鎖を組
合せ、得られた二本鎖cDNAをクローニングベクターに挿
入するステツプを含む。
駆体ポリペプチドをコードするmRNAを単離し、逆転写酵
素と適当なプライマーとを用いて前記mRNAから単離cDNA
を合成し、DNAポリメラーゼとS1ヌクレアーゼとを順次
用いて前記第一鎖から形成された鋳型に第二DNA鎖を組
合せ、得られた二本鎖cDNAをクローニングベクターに挿
入するステツプを含む。
又は、mRNAから組立てられたcDNAをリシン分子の別々
の部分例えばＡ鎖及びＢ鎖を夫々コードする別々の部分
に切断し、これらの部分を次に別々のクローニングベク
ターに挿入してもよい。
の部分例えばＡ鎖及びＢ鎖を夫々コードする別々の部分
に切断し、これらの部分を次に別々のクローニングベク
ターに挿入してもよい。
前記の如くクローニングベクターは好ましくはpBR32
2,pAT153又はpUC8の如きプラスミドであり、このプラス
ミドを、制限エンドヌクレアーゼPstＩによつて開裂
し、オリゴ（dG）テイルをつなぎ、オリゴ（dG）テイル
がつながれた二本鎖cDNAとアニールし得る。
2,pAT153又はpUC8の如きプラスミドであり、このプラス
ミドを、制限エンドヌクレアーゼPstＩによつて開裂
し、オリゴ（dG）テイルをつなぎ、オリゴ（dG）テイル
がつながれた二本鎖cDNAとアニールし得る。
本発明は更に、本発明の組換DNA分子を適当な宿主微
生物に導入するステツプを含む変容された形質転換宿主
の製法を提供する。
生物に導入するステツプを含む変容された形質転換宿主
の製法を提供する。
クローニング用宿主として使用される微生物は好まし
くはグラム陰性菌、より好ましくはE.coliである。
くはグラム陰性菌、より好ましくはE.coliである。
クローニング後、リシン前駆体（又は前駆体から形成
される別のリシン型毒素の前駆体）をコードするDNA配
列を宿主クローニングベクターから除去し得る。次にこ
の前駆体を毒素分子の別々の領域例えばＡ鎖及びＢ鎖を
コードする２つの部分に分割し、これらの部分を別々の
第２クローニングベクターに挿入し、得られた新しい組
換DNA分子の各々を用いて新しい宿主を変容してもよ
い。又は、全体を第２のクローニングベクターに導入し
てもよい。第２のクローニングベクターは適当なプロモ
ータ配列を含んでおり、全コード配列又はその一部の第
２クローニングベクターへの挿入の位置と方向とは、新
しい組換DNA分子を適当な宿主微生物例えばE.coli又は
S.cerevisiaeに導入した際に所望遺伝子の配列が得られ
るように選択される。
される別のリシン型毒素の前駆体）をコードするDNA配
列を宿主クローニングベクターから除去し得る。次にこ
の前駆体を毒素分子の別々の領域例えばＡ鎖及びＢ鎖を
コードする２つの部分に分割し、これらの部分を別々の
第２クローニングベクターに挿入し、得られた新しい組
換DNA分子の各々を用いて新しい宿主を変容してもよ
い。又は、全体を第２のクローニングベクターに導入し
てもよい。第２のクローニングベクターは適当なプロモ
ータ配列を含んでおり、全コード配列又はその一部の第
２クローニングベクターへの挿入の位置と方向とは、新
しい組換DNA分子を適当な宿主微生物例えばE.coli又は
S.cerevisiaeに導入した際に所望遺伝子の配列が得られ
るように選択される。
以下では、リシンＡ及びＢ鎖前駆体ポリペプチドをコ
ードするDNA配列を含有する形質転換宿主の調製につい
て、先ず概略を説明し、次に詳細を説明する。このプロ
セスは添付の第２図に要約されている。
ードするDNA配列を含有する形質転換宿主の調製につい
て、先ず概略を説明し、次に詳細を説明する。このプロ
セスは添付の第２図に要約されている。
先ず、この前駆体をコードするmRNAをシヨ糖濃度勾配
遠心法で公知の如く濃縮した。逆転写酵素を用いて公知
手順でこのmRNAと対応する単鎖形のcDNAとを合わせた。
この際、mRNAのポリアデニル化３′−末端に結合するオ
リゴ（dT）をプライマーとして使用しmRNAに先ず増殖点
を設けた。この反応直後の産生物はDNA−RNAハリブリツ
ドである。加水分解し単鎖DNAを完全形（intact）で残
してRNA鎖を除去する。これを遊離ヌクレオチドの存在
下でDNAポリメラーゼを用いて二本鎖形に変換するとヘ
アピン形分子が得られる。この分子の彎曲端を次に単鎖
特異的ヌクレアーゼS1で除去する。次に得られた二本鎖
cDNAに対し、ターミナルトランスフエラーゼを用いてオ
リゴ（dC）テイルをつなぎ、小分子除去又はその逆のた
めにサイズ分画し、PstＩで開裂しターミナルトランス
フエラーゼを用いてオリゴ（dG）テイルをつないでおい
たpBR322又はpAT153ベクターとアニールする。DNA塩基
上のシトシンテイルはベクター上のグアニンテイルと対
合する。
遠心法で公知の如く濃縮した。逆転写酵素を用いて公知
手順でこのmRNAと対応する単鎖形のcDNAとを合わせた。
この際、mRNAのポリアデニル化３′−末端に結合するオ
リゴ（dT）をプライマーとして使用しmRNAに先ず増殖点
を設けた。この反応直後の産生物はDNA−RNAハリブリツ
ドである。加水分解し単鎖DNAを完全形（intact）で残
してRNA鎖を除去する。これを遊離ヌクレオチドの存在
下でDNAポリメラーゼを用いて二本鎖形に変換するとヘ
アピン形分子が得られる。この分子の彎曲端を次に単鎖
特異的ヌクレアーゼS1で除去する。次に得られた二本鎖
cDNAに対し、ターミナルトランスフエラーゼを用いてオ
リゴ（dC）テイルをつなぎ、小分子除去又はその逆のた
めにサイズ分画し、PstＩで開裂しターミナルトランス
フエラーゼを用いてオリゴ（dG）テイルをつないでおい
たpBR322又はpAT153ベクターとアニールする。DNA塩基
上のシトシンテイルはベクター上のグアニンテイルと対
合する。
リシン前駆体ポリペプチドをコードするDNAセグメン
トを含有する得られたキメラプラスミドを用いて次にE.
coliDH1細胞を形質転換し、キメラプラスミドの存在
を、テトラサイクリン耐性でアンピシリン感受性を示す
細胞の選択によつて確認した。1600をこえるTetr，AmpS
クローンが得られた。各クローンから誘導されたコロニ
ーをニトロセルロースフイルターに移し、所望DNA配列
を含むクローンを、32P−末端ラベルした20merオリゴヌ
クレオチドプローブを用いて同定した。このプローブは
DNA配列 ACCTACAA▲A G▼TT▲C T▼TT▲A G▼CT▲A G▼CC を有しており、相補配列TGGATGTT▲T C▼AA▲G A▼AA▲T C
▼GA▲T C▼GG.を含むDNAにハイブリダイズする。リシン
前駆体ポリペプチドはアミノ酸配列−Trp−Met−Phe−L
ys−Asn−Asp−Gly−を含むことが知見されているの
で、この因となるDNA配列は前出の後の方の遺伝コード
であることがわかる。
トを含有する得られたキメラプラスミドを用いて次にE.
coliDH1細胞を形質転換し、キメラプラスミドの存在
を、テトラサイクリン耐性でアンピシリン感受性を示す
細胞の選択によつて確認した。1600をこえるTetr，AmpS
クローンが得られた。各クローンから誘導されたコロニ
ーをニトロセルロースフイルターに移し、所望DNA配列
を含むクローンを、32P−末端ラベルした20merオリゴヌ
クレオチドプローブを用いて同定した。このプローブは
DNA配列 ACCTACAA▲A G▼TT▲C T▼TT▲A G▼CT▲A G▼CC を有しており、相補配列TGGATGTT▲T C▼AA▲G A▼AA▲T C
▼GA▲T C▼GG.を含むDNAにハイブリダイズする。リシン
前駆体ポリペプチドはアミノ酸配列−Trp−Met−Phe−L
ys−Asn−Asp−Gly−を含むことが知見されているの
で、この因となるDNA配列は前出の後の方の遺伝コード
であることがわかる。
例えば、Singer−Sam等（1983）,Proc.Natl.Acad.Sci
（米国）,80巻,802−806頁、に記載の如き適当なハイブ
リダイゼーシヨン条件及び洗浄条件を用いて、所望DNA
配列を含む80個のプラスのクローンを選択し、これらの
クローンのうちからプラスミドpBR322中で最大のクロー
ン８個を先ず選出して以後の特性決定に用いた。ヒマレ
クチンに対するこれらクローンの関係をハイブリツド放
出翻訳アツセイ（hybrid release translation assay）
を用いて確認した。前記の８個のクローンから、夫々16
14,1950,1059及び1020塩基対の４つのクローンを選出し
て配列決定に用いた。
（米国）,80巻,802−806頁、に記載の如き適当なハイブ
リダイゼーシヨン条件及び洗浄条件を用いて、所望DNA
配列を含む80個のプラスのクローンを選択し、これらの
クローンのうちからプラスミドpBR322中で最大のクロー
ン８個を先ず選出して以後の特性決定に用いた。ヒマレ
クチンに対するこれらクローンの関係をハイブリツド放
出翻訳アツセイ（hybrid release translation assay）
を用いて確認した。前記の８個のクローンから、夫々16
14,1950,1059及び1020塩基対の４つのクローンを選出し
て配列決定に用いた。
詳細には、形質転換宿主を以下の如く調製した。
A.cDNA合成 1.mRNAの抽出及び分画 100−200gの熟成Ricinus種子を液体窒素中で凍結粉砕
して粉末にし、50mMトリス−HCl,pH9,150mM NaCl,5mM E
DTA及び５％SDS中でWaringブレンダーで１乃至２分ホモ
ゲナイズした。均質液を等容のフエノール：クロロホル
ム（1:1）で抽出し相を遠心して分離した。有機相と残
渣とを0.5倍容の20mMトリス−HCl,pH9.0と2mM EDTAとに
よつて再抽出し、得られた水相を最初の水相と合一し
た。合一した水相を界面に物質が存在しなくなるまで等
容のフエノール：クロロホルムで繰返し再抽出した。20
0mMのNaCl溶液にしてから倍容の低温エタノールを加え
てRNAを沈殿させた。
して粉末にし、50mMトリス−HCl,pH9,150mM NaCl,5mM E
DTA及び５％SDS中でWaringブレンダーで１乃至２分ホモ
ゲナイズした。均質液を等容のフエノール：クロロホル
ム（1:1）で抽出し相を遠心して分離した。有機相と残
渣とを0.5倍容の20mMトリス−HCl,pH9.0と2mM EDTAとに
よつて再抽出し、得られた水相を最初の水相と合一し
た。合一した水相を界面に物質が存在しなくなるまで等
容のフエノール：クロロホルムで繰返し再抽出した。20
0mMのNaCl溶液にしてから倍容の低温エタノールを加え
てRNAを沈殿させた。
−20℃で１晩沈殿後、MSE18又はMSE21遠心機で10,000
rpmで30分間遠心した。エタノール沈殿による上清中に
多糖が検出されなくなるまで3M NaAc,pH5.5中でペレツ
トを繰返し洗つた。最終ペレツトを300mM NaClに溶解
し、前記同様に沈殿した。
rpmで30分間遠心した。エタノール沈殿による上清中に
多糖が検出されなくなるまで3M NaAc,pH5.5中でペレツ
トを繰返し洗つた。最終ペレツトを300mM NaClに溶解
し、前記同様に沈殿した。
ポリ（Ａ）テイルを担うmRNA分子をオリゴ（dT）−セ
ルロースのアフイニテイクロマトグラフイーで抽出し
た。400mM NaCl,20mMトリス−HCl,pH7.6,0.2％SDS中室
温で30分間ハイブリダイゼーシヨン後、ビーズをペレツ
ト化し、前記バツフア中で３回次いで200mM NaCl,20mM
トリス−HCl,pH7.6,0.1％SDS中で２回洗つた。スラリを
カラムに注ぎ、溶出液のA260がバツクグラウンドレベル
になるまで最終バツフアで更に洗つた。次に、20mMトリ
ス−HCl,pH7.6を用いて50℃でポリ（Ａ）含有RNAを溶出
した。溶出液をISCO連続流UVセル（continuousflow UV
cell）でモニタした。倍容の−20℃の低温エタノールを
加えて200mM NaClからポリ（Ａ）含有RNAを１晩沈殿さ
せ、次に、70％エタノールで３回洗い、10mMトリス−HC
l,pH7.0に約１μg/μｌまで再溶解した。
ルロースのアフイニテイクロマトグラフイーで抽出し
た。400mM NaCl,20mMトリス−HCl,pH7.6,0.2％SDS中室
温で30分間ハイブリダイゼーシヨン後、ビーズをペレツ
ト化し、前記バツフア中で３回次いで200mM NaCl,20mM
トリス−HCl,pH7.6,0.1％SDS中で２回洗つた。スラリを
カラムに注ぎ、溶出液のA260がバツクグラウンドレベル
になるまで最終バツフアで更に洗つた。次に、20mMトリ
ス−HCl,pH7.6を用いて50℃でポリ（Ａ）含有RNAを溶出
した。溶出液をISCO連続流UVセル（continuousflow UV
cell）でモニタした。倍容の−20℃の低温エタノールを
加えて200mM NaClからポリ（Ａ）含有RNAを１晩沈殿さ
せ、次に、70％エタノールで３回洗い、10mMトリス−HC
l,pH7.0に約１μg/μｌまで再溶解した。
mRNAを65℃で２分間加熱し急冷した。100mMトリス−H
Cl,pH7.5,0.5％SDS,1mM EDTA中の10−30％リボヌクレア
ーゼ不含シヨ糖（Sigma）濃度勾配の一番上に約400μｇ
のポリ（Ａ）+RNAの層をのせ、SW27ロータを用いたBeck
man L5−65遠心機で25,000rpmで17℃で14時間遠心し
た。連続流UVセルを用いるISCO濃度勾配分画装置で400
μｌの画分を収集した。
Cl,pH7.5,0.5％SDS,1mM EDTA中の10−30％リボヌクレア
ーゼ不含シヨ糖（Sigma）濃度勾配の一番上に約400μｇ
のポリ（Ａ）+RNAの層をのせ、SW27ロータを用いたBeck
man L5−65遠心機で25,000rpmで17℃で14時間遠心し
た。連続流UVセルを用いるISCO濃度勾配分画装置で400
μｌの画分を収集した。
各画分をNaCl中で200mMにし、液体窒素中での凍結−
解凍を３回行なつて倍容の低温エタノールと共に沈殿さ
せ、Eppendorfマイクロ遠心機で４℃で30分間遠心して
回収し、70％のエタノールで１回洗浄し、10μｌの10mM
トリス−HCl,pH7.0に再溶解した。各画分から得た部分
サンプル（１μｌ）を網状赤血球溶解物無細胞系で翻訳
し、レクチン前駆体を免疫沈殿してレクチンmRNAに富む
画分を同定した。
解凍を３回行なつて倍容の低温エタノールと共に沈殿さ
せ、Eppendorfマイクロ遠心機で４℃で30分間遠心して
回収し、70％のエタノールで１回洗浄し、10μｌの10mM
トリス−HCl,pH7.0に再溶解した。各画分から得た部分
サンプル（１μｌ）を網状赤血球溶解物無細胞系で翻訳
し、レクチン前駆体を免疫沈殿してレクチンmRNAに富む
画分を同定した。
2.第一鎖合成 50mMトリス−HCl,pH8.3と10mM MgCl2と100mM KClと1m
MのdATP,dTTP及びdGTPと250μM dCTPと0.06μg/μｌオ
リゴ（dT）12-13と10mM DTTと0.4ユニツト／μｌの逆転
写酵素との存在中で、分画したポリ（Ａ）+RNAを0.5μg
/μｌで逆転写した。この逆転写酵素は鳥類骨髄芽球症
ウイルスから得られたものである。（3H）dCTP又はα−
（32P）dCTPを適宜反応に含ませた。
MのdATP,dTTP及びdGTPと250μM dCTPと0.06μg/μｌオ
リゴ（dT）12-13と10mM DTTと0.4ユニツト／μｌの逆転
写酵素との存在中で、分画したポリ（Ａ）+RNAを0.5μg
/μｌで逆転写した。この逆転写酵素は鳥類骨髄芽球症
ウイルスから得られたものである。（3H）dCTP又はα−
（32P）dCTPを適宜反応に含ませた。
反応混合物を42℃で45分間インキユベートし、ここで
等容の5mMトリス−HCl,pH8.3と5mM DTTと250μM dCTPと
を同量の前記酵素と共に加えた。更に45℃で45分間イン
キユベートして反応を継続し凍結によつて反応を停止し
た。第二鎖とS1ヌクレアーゼとの反応産物と共に１％変
性アガロースゲルで部分サンプルを分析した。
等容の5mMトリス−HCl,pH8.3と5mM DTTと250μM dCTPと
を同量の前記酵素と共に加えた。更に45℃で45分間イン
キユベートして反応を継続し凍結によつて反応を停止し
た。第二鎖とS1ヌクレアーゼとの反応産物と共に１％変
性アガロースゲルで部分サンプルを分析した。
3.第二鎖合成 第一鎖反応物を３分間沸騰させ急速に冷却してmRNA−
cDNAハイブリツドを変性した。Eppendorfマイクロ遠心
機で不溶物質を２分間ペレツト化し、上清を冷えた新し
い管に移した。標準反応のためにすでに存在している要
素に関わり無く以下の試薬を添加した。dATP,dGTP及びd
TTPを100μＭまで。Hepes−KOH,pH6.9を105mMまで。KCl
を92mMまで。適宜ラベルされたdCTPを80μＭまで。及び
0.1ユニツト／μｌのDNAポリメラーゼ。反応を20℃で６
時間進行させ、ここで、10mMトリス−HCl,pH7.6と20mM
のNaClと1mMのEDTAとの中の1mlのBio−Gel P60カラムで
ゲル過してcDNAを混合物から除去した。Cerenkov又は
液体シンチレーシヨンカウンテイングで画分をモニター
し、ピークを除いた画分をプールし、倍容の低温エタノ
ールを加えて0.3M NaAc,pH6から沈殿させた。Eppendorf
マイクロ遠心機で低温で30分間遠心分離して沈殿物を回
収し、約2.5μg/μｌのRNA−当量になるまで水に溶解し
た。
cDNAハイブリツドを変性した。Eppendorfマイクロ遠心
機で不溶物質を２分間ペレツト化し、上清を冷えた新し
い管に移した。標準反応のためにすでに存在している要
素に関わり無く以下の試薬を添加した。dATP,dGTP及びd
TTPを100μＭまで。Hepes−KOH,pH6.9を105mMまで。KCl
を92mMまで。適宜ラベルされたdCTPを80μＭまで。及び
0.1ユニツト／μｌのDNAポリメラーゼ。反応を20℃で６
時間進行させ、ここで、10mMトリス−HCl,pH7.6と20mM
のNaClと1mMのEDTAとの中の1mlのBio−Gel P60カラムで
ゲル過してcDNAを混合物から除去した。Cerenkov又は
液体シンチレーシヨンカウンテイングで画分をモニター
し、ピークを除いた画分をプールし、倍容の低温エタノ
ールを加えて0.3M NaAc,pH6から沈殿させた。Eppendorf
マイクロ遠心機で低温で30分間遠心分離して沈殿物を回
収し、約2.5μg/μｌのRNA−当量になるまで水に溶解し
た。
4.S1ヌクレアーゼ消化 二本鎖cDNAの単鎖領域を、300mM NaClと30mMのNaAc,p
H4.5と3mMのZnCl2との存在下でAspergillus oryzaeから
のS1ヌクレアーゼで消化した。37℃で15分間及び15℃で
15分間順次インキユベートして反応を継続し、トリス−
HCl,pH7.6を130mMまで及びEDTAを10mMまで加えて反応を
停止した。次に、等容のフエノール：クロロホルム：イ
ソアミルアルコール（25:24:1）で抽出し、倍容の低温
エタノールで300mM NaAc,pH6から沈殿させた。沈殿物を
0.25μg/μl RNA当量になるまで10mMトリス−HCl,pH8,
0.1mM EDTAに溶解した。
H4.5と3mMのZnCl2との存在下でAspergillus oryzaeから
のS1ヌクレアーゼで消化した。37℃で15分間及び15℃で
15分間順次インキユベートして反応を継続し、トリス−
HCl,pH7.6を130mMまで及びEDTAを10mMまで加えて反応を
停止した。次に、等容のフエノール：クロロホルム：イ
ソアミルアルコール（25:24:1）で抽出し、倍容の低温
エタノールで300mM NaAc,pH6から沈殿させた。沈殿物を
0.25μg/μl RNA当量になるまで10mMトリス−HCl,pH8,
0.1mM EDTAに溶解した。
5.DNAへのホモポリマーテイルの付加 140mMのカコジル酸カリウム,pH7.6と30mMトリス塩基
と0.1mM DTTと1mM CoCl2と75−150倍過剰量の（3H）又
は（32P）をラベルしたdCTPとの存在中で、0.001−0.01
μg/μｌのdCTPとターミナルトランスフエラーゼを用い
て、二本鎖DNAの３′末端にdCテイルをつないだ。反応
を37℃で６分間行なつた。Bray′s scintillantでカウ
ントして総放射能に対するTCA不溶放射能の割合を測定
しラベルが取込まれた程度を追跡した。
と0.1mM DTTと1mM CoCl2と75−150倍過剰量の（3H）又
は（32P）をラベルしたdCTPとの存在中で、0.001−0.01
μg/μｌのdCTPとターミナルトランスフエラーゼを用い
て、二本鎖DNAの３′末端にdCテイルをつないだ。反応
を37℃で６分間行なつた。Bray′s scintillantでカウ
ントして総放射能に対するTCA不溶放射能の割合を測定
しラベルが取込まれた程度を追跡した。
冷却しEDTAを10mMまで加えて反応を停止し、取込まれ
なかつた物質を前記の如きゲル過で除去した。テイル
の付いたcDNAを前記同様に沈殿させ、1M NaAc,pH8と10m
Mトリス−酢酸塩,pH8と1mM EDTAとに溶解し、分画処理
に備えた。
なかつた物質を前記の如きゲル過で除去した。テイル
の付いたcDNAを前記同様に沈殿させ、1M NaAc,pH8と10m
Mトリス−酢酸塩,pH8と1mM EDTAとに溶解し、分画処理
に備えた。
dGTPをdCTPに代えて用いPst I開裂pBR322DNAを同様に
処理した。
処理した。
6.テイルの付いたcDNAの分画 cDNAを、1M NaAc,pH8と10mMトリス−酢酸塩,pH8と1mM
EDTAとの中の５−20％直線シヨ糖濃度勾配で分画し、S
W50.1ロータ中で39,000rpmで１晩遠心した。pBR322DNA
のHinf I及びPst I消化物の混合物を充填した並列勾配
でDNA沈降を検査し、この勾配の画分を１％中性アガロ
ースゲルに流した。cDNA勾配からの画分を等容の水で希
釈し、倍容の低温エタノールで沈殿させ、次にプールし
て３つの最終画分を得た。即ち（2,200bpより大きい）
大cDNA画分と（1,000−2,200bp）の中間画分と（600−
1,000bp）の小さいcDNAを含む画分とを得た。600bp未満
のcDNA分子は廃棄した。
EDTAとの中の５−20％直線シヨ糖濃度勾配で分画し、S
W50.1ロータ中で39,000rpmで１晩遠心した。pBR322DNA
のHinf I及びPst I消化物の混合物を充填した並列勾配
でDNA沈降を検査し、この勾配の画分を１％中性アガロ
ースゲルに流した。cDNA勾配からの画分を等容の水で希
釈し、倍容の低温エタノールで沈殿させ、次にプールし
て３つの最終画分を得た。即ち（2,200bpより大きい）
大cDNA画分と（1,000−2,200bp）の中間画分と（600−
1,000bp）の小さいcDNAを含む画分とを得た。600bp未満
のcDNA分子は廃棄した。
３つの最終画分を、150mM RbClと10mMトリス−HCl,pH
7.6と0.2mM EDTAとに約5ng/μｌになるように溶解し
た。
7.6と0.2mM EDTAとに約5ng/μｌになるように溶解し
た。
B.アニ−リング及び形質転換 1.アニ−リング dC−テイル付きcDNAをほぼ等モル量のdG−テイル付き
pBR322又はpAT153と0.4ng/μｌのベクター濃度で混合し
た。バツフアは前記と同じである。混合物を70℃で30分
間加熱し、次に１晩室温に放冷し、徐々に４℃に冷却し
た。受容細胞（competent cells）を加え以下の如く形
質転換した。
pBR322又はpAT153と0.4ng/μｌのベクター濃度で混合し
た。バツフアは前記と同じである。混合物を70℃で30分
間加熱し、次に１晩室温に放冷し、徐々に４℃に冷却し
た。受容細胞（competent cells）を加え以下の如く形
質転換した。
2.受容細胞の調製及び形質転換 DH1細胞（recA1,nalA,▲ｒ- K▼，▲ｍ+ K▼，endo1-，
R-,relA1?）を10mlのpsiブロス培地（２％トリプトン,
0.5％酵母抽出物,10mM NaCl,20mM MgCl2,KOHでpH7.6に
調整、いずれもDifcoの細菌学的試薬）で増殖させ、37
℃の振盪水浴中でA550＝0.3まで増殖させた。次にその1
mlと25mlの同じ培地に接種し、A550＝0.48まで増殖させ
た。次に細胞を15分間氷冷し４℃のMSE21遠心機で5,000
rpmで５分間処理して回収した。次に、10mlの100mM RbC
l,50mM McCl2,10mM CaCl2,35mM NaAc,pH5.8,15％グリセ
ロールに再懸濁させ氷上に15分間維持した。
R-,relA1?）を10mlのpsiブロス培地（２％トリプトン,
0.5％酵母抽出物,10mM NaCl,20mM MgCl2,KOHでpH7.6に
調整、いずれもDifcoの細菌学的試薬）で増殖させ、37
℃の振盪水浴中でA550＝0.3まで増殖させた。次にその1
mlと25mlの同じ培地に接種し、A550＝0.48まで増殖させ
た。次に細胞を15分間氷冷し４℃のMSE21遠心機で5,000
rpmで５分間処理して回収した。次に、10mlの100mM RbC
l,50mM McCl2,10mM CaCl2,35mM NaAc,pH5.8,15％グリセ
ロールに再懸濁させ氷上に15分間維持した。
細胞を再度回収し、1mlの10mM RbClと75mM CaCl2と10
mM MOPS−KOH,pH5.8と、15％グリセロールとに再懸濁さ
せ、更に15分間氷上に維持した。
mM MOPS−KOH,pH5.8と、15％グリセロールとに再懸濁さ
せ、更に15分間氷上に維持した。
このように調製された細胞100μｌをアニールしたDNA
サンプルと混合し、氷上で30分間インキユベートし、次
に42℃で90−120秒間熱衝撃を与えた。1mlのpsiブロス
を加え、細胞を37℃で１時間増殖させた。次に細胞を軽
く遠心し、100μｌのpsiブロスに再懸濁させ、14μg/ml
のテトラサイクリンを含むLBプレートにプレートした。
（LBは、１％トリプトン,0.5％酵母抽出物,170mM NaCl,
1.5％塞天から成る）。
サンプルと混合し、氷上で30分間インキユベートし、次
に42℃で90−120秒間熱衝撃を与えた。1mlのpsiブロス
を加え、細胞を37℃で１時間増殖させた。次に細胞を軽
く遠心し、100μｌのpsiブロスに再懸濁させ、14μg/ml
のテトラサイクリンを含むLBプレートにプレートした。
（LBは、１％トリプトン,0.5％酵母抽出物,170mM NaCl,
1.5％塞天から成る）。
37℃で18−24時間増殖後、コロニーを計数し33μg/ml
のアンピシリンを含むLBプレートに塗抹して、環再形成
プラスミド又は非開裂プラスミドを含む形質転換体を同
定した。1600より多いTetrAmpsクローンを採取し、14μ
g/mlテトライクリンを含む大きいLBプレートに順序正し
い列状に移した。
のアンピシリンを含むLBプレートに塗抹して、環再形成
プラスミド又は非開裂プラスミドを含む形質転換体を同
定した。1600より多いTetrAmpsクローンを採取し、14μ
g/mlテトライクリンを含む大きいLBプレートに順序正し
い列状に移した。
C.スクリーニング 1.オリゴヌクレオチドのラベル付け リシンＢ鎖特異的オリゴマ（20mer）の末端をポリヌ
クレオチドキナーゼを用いてラベルした。50mMトリス,p
H8.5と10mM MgCl2と5mM DTTと0.1mMスペルミジン−HCl
と0.1mM EDTAとの中で500ngのオリゴヌクレオチドを60
μCir（32P）ATPと１μｌのポリヌクレオチドキナーゼ
（Boehringer）と共に37℃で35分間インキユベートし
た。等容の0.6M NH4ACを加えて反応を停止し、0.14M Na
Clと0.02Mトリス,pH7.6と0.005M EDTAと0.1％ SDSとの
中でセフアデツクスG25カラムに通して取込まれなかつ
たγATPのバルクを除去した。プローブを−20℃で冷凍
保存した。
クレオチドキナーゼを用いてラベルした。50mMトリス,p
H8.5と10mM MgCl2と5mM DTTと0.1mMスペルミジン−HCl
と0.1mM EDTAとの中で500ngのオリゴヌクレオチドを60
μCir（32P）ATPと１μｌのポリヌクレオチドキナーゼ
（Boehringer）と共に37℃で35分間インキユベートし
た。等容の0.6M NH4ACを加えて反応を停止し、0.14M Na
Clと0.02Mトリス,pH7.6と0.005M EDTAと0.1％ SDSとの
中でセフアデツクスG25カラムに通して取込まれなかつ
たγATPのバルクを除去した。プローブを−20℃で冷凍
保存した。
2.オリゴヌクレオチドプローブを用いたコロニーハイブ
リダイゼーシヨン テトラサイクリンを加えたLB上に重層したニトロセル
ロースフイルター（Schleicher ＆ Schuell 0.45μ）で
形質転換体を増殖した。３組のフイルターを200μg/ml
のクロラムフエニコールを含む37℃のLB−Tetプレート
に16時間を要して移した。0.5M NaOHで湿らせた3mmの２
枚の紙シートにフイルターのコロニー側を合せて室温で
15分間維持した。また、（１）1Mトリス,pH8.0及び
（２）1Mトリス,pH8と1.5M NaCl（30分間）を用いて同
じ手順で洗つた。フイルターを空気乾燥し80℃で乾燥し
た。
リダイゼーシヨン テトラサイクリンを加えたLB上に重層したニトロセル
ロースフイルター（Schleicher ＆ Schuell 0.45μ）で
形質転換体を増殖した。３組のフイルターを200μg/ml
のクロラムフエニコールを含む37℃のLB−Tetプレート
に16時間を要して移した。0.5M NaOHで湿らせた3mmの２
枚の紙シートにフイルターのコロニー側を合せて室温で
15分間維持した。また、（１）1Mトリス,pH8.0及び
（２）1Mトリス,pH8と1.5M NaCl（30分間）を用いて同
じ手順で洗つた。フイルターを空気乾燥し80℃で乾燥し
た。
二重シールポリテンバツグでプレハイブリダイゼーシ
ヨンとハイブリダイゼーシヨンとを行なつた。0.9M NaC
lと0.09Mトリス,pH7.4と0.006M EDTAと0.5％NP40と２×
Denhardtsと0.2％SDSと100μg/ml変性単鎖サケ精子DNA
と70μg/mlのtRNAとの中でフイルターをプレハイブリダ
イズした。プレハイブリダイゼーシヨンを55℃で４時間
行なつた。次に、プレハイブリダイゼーシヨンバツフア
をバツグから絞り出し、50ngのラベルしたプローブを含
む新しいバツフアを（最大バツフア濃度5ng/mlになるま
で）加えた。アニーリングを37℃で１晩維持した。
ヨンとハイブリダイゼーシヨンとを行なつた。0.9M NaC
lと0.09Mトリス,pH7.4と0.006M EDTAと0.5％NP40と２×
Denhardtsと0.2％SDSと100μg/ml変性単鎖サケ精子DNA
と70μg/mlのtRNAとの中でフイルターをプレハイブリダ
イズした。プレハイブリダイゼーシヨンを55℃で４時間
行なつた。次に、プレハイブリダイゼーシヨンバツフア
をバツグから絞り出し、50ngのラベルしたプローブを含
む新しいバツフアを（最大バツフア濃度5ng/mlになるま
で）加えた。アニーリングを37℃で１晩維持した。
室温の６×SSCで軽く洗つた。６×SSCを４回取換えて
３時間を要してフイルターを洗つた。次に３組のフイル
ターを、塩基組成とプローブの不整合度とに基いて決定
した３つの別々の温度で洗つた。プローブ中のＡ又はＴ
に２℃、Ｃ又はＧに４℃を用い洗浄温度を52℃,56℃及
び60℃に選択した。フイルターを６×SSC中で厳密な温
度で10分間洗い、次に完全に乾燥した。フイルターをＸ
線フイルムに１晩露光した。
３時間を要してフイルターを洗つた。次に３組のフイル
ターを、塩基組成とプローブの不整合度とに基いて決定
した３つの別々の温度で洗つた。プローブ中のＡ又はＴ
に２℃、Ｃ又はＧに４℃を用い洗浄温度を52℃,56℃及
び60℃に選択した。フイルターを６×SSC中で厳密な温
度で10分間洗い、次に完全に乾燥した。フイルターをＸ
線フイルムに１晩露光した。
D.ハイブリツド選択手順 1.DNA結合 プラスのクローン（群）から得たプラスミドDNAを精
製し、10乃至15μｇをEcoRIで直線化した。フエノー
ル：クロロホルム抽出とエタノール沈殿とを行なつてか
ら、ペレツトを0.5mlの0.1×SSCに溶解した。次に、0.5
mlの1M NaOHを加え、混合物を室温で15分間静置した。
予冷した4mlの中和溶液（1.5M NaCl,0.25M HCl,0.25Mト
リス−Cl,pH8.0）を加え、湿らせたSchleicher及びSchu
ellの0.45μフイルターデイスクを含むswinniesで5mlの
DNAサンプルを減圧吸引した。次に、5mlの６×SSCをフ
イルター（群）に通した。これらを空気乾燥し次に80℃
で２時間乾燥した。
製し、10乃至15μｇをEcoRIで直線化した。フエノー
ル：クロロホルム抽出とエタノール沈殿とを行なつてか
ら、ペレツトを0.5mlの0.1×SSCに溶解した。次に、0.5
mlの1M NaOHを加え、混合物を室温で15分間静置した。
予冷した4mlの中和溶液（1.5M NaCl,0.25M HCl,0.25Mト
リス−Cl,pH8.0）を加え、湿らせたSchleicher及びSchu
ellの0.45μフイルターデイスクを含むswinniesで5mlの
DNAサンプルを減圧吸引した。次に、5mlの６×SSCをフ
イルター（群）に通した。これらを空気乾燥し次に80℃
で２時間乾燥した。
2.ハイブリツド選択プロトコル フイルター（群）を5mlの容器に入れ、50％ホルムア
ミドと0.4M NaClと10mM PIPES−NaOH,pH6.4と4mM EDTA
と0.5μg/ml tRNAと10μg/mlポリ（Ａ）との中で41℃で
４時間プレハイブリダイズした。バツフアを除去し、フ
イルター（群）を一般には約20μｇのヒマ由来ポリ
（Ａ）+RNAを含む（上記）50％ホルムアミドバツフア中
で41℃で１晩ハイブリダイズした。バツフアを除去しフ
イルター（群）を、（１）室温の１×SSC,0.5％SDS,
（２）室温の0.1×SSC,0.1％SDS,（３）50℃の0.1×SS
C,0.1％SDS,（４）室温の0.1×SSC,0.1％SDSの各々を２
回ずつ用いて15分間ずつ洗つた。フイルター（群）を脱
水し、200μｌのハイブリツド遊離バツフア（90％ホル
ムアミド,10mM PIPES−NaOH,pH6.4,1mM EDTA,0.5％SD
S）を各フイルターに加え、40℃で30分間かき混ぜた。
バツフアを新しいEppendorfにあけ、NaClを0.2Mまで加
えた。遊離したmRNAをエタノールで沈殿させ、70％エタ
ノールで数回ゆすぎ、乾燥させて５μｌ無菌水に溶解し
た。サンプルを網状赤血球溶解物無細胞系で翻訳し、産
生物をSDS−ポリアクリルアミドゲルに直接流すか、又
は最初に適当な抗血清で免疫沈降した。
ミドと0.4M NaClと10mM PIPES−NaOH,pH6.4と4mM EDTA
と0.5μg/ml tRNAと10μg/mlポリ（Ａ）との中で41℃で
４時間プレハイブリダイズした。バツフアを除去し、フ
イルター（群）を一般には約20μｇのヒマ由来ポリ
（Ａ）+RNAを含む（上記）50％ホルムアミドバツフア中
で41℃で１晩ハイブリダイズした。バツフアを除去しフ
イルター（群）を、（１）室温の１×SSC,0.5％SDS,
（２）室温の0.1×SSC,0.1％SDS,（３）50℃の0.1×SS
C,0.1％SDS,（４）室温の0.1×SSC,0.1％SDSの各々を２
回ずつ用いて15分間ずつ洗つた。フイルター（群）を脱
水し、200μｌのハイブリツド遊離バツフア（90％ホル
ムアミド,10mM PIPES−NaOH,pH6.4,1mM EDTA,0.5％SD
S）を各フイルターに加え、40℃で30分間かき混ぜた。
バツフアを新しいEppendorfにあけ、NaClを0.2Mまで加
えた。遊離したmRNAをエタノールで沈殿させ、70％エタ
ノールで数回ゆすぎ、乾燥させて５μｌ無菌水に溶解し
た。サンプルを網状赤血球溶解物無細胞系で翻訳し、産
生物をSDS−ポリアクリルアミドゲルに直接流すか、又
は最初に適当な抗血清で免疫沈降した。
本文中で以後pBRCL6及びpBRCL17（RCL＝Ricinus comm
unis lectin）と指称される前記の２つのクローンの前
記リシン前駆体ポリペプチドをコードするDNA配列を、S
angerジデオキシ法（Sanger等、1977−Proc.Natl.Acad.
Sci.米国74,5463−67）とMaxam−Gilbert法（Maxam and
Gilbert,1980−Meth.Enzym.65,499−560）とを組合せ
て決定した。各インサートの末端の配列を決定するため
に、インサートをPst Iを用いてpBR322から切除し、Pst
I直線化，ホスフアターゼ処理プラスミドpUC8に結合し
た（Vierra and Mssing,1982−Gene 19,259−268）。こ
れらの組換プラスミドによつてE.coli DHI細胞を形質転
換した。これらの新しい組換プラスミドを本文中で以後
pRCL6及びpRCL17と指称する。
unis lectin）と指称される前記の２つのクローンの前
記リシン前駆体ポリペプチドをコードするDNA配列を、S
angerジデオキシ法（Sanger等、1977−Proc.Natl.Acad.
Sci.米国74,5463−67）とMaxam−Gilbert法（Maxam and
Gilbert,1980−Meth.Enzym.65,499−560）とを組合せ
て決定した。各インサートの末端の配列を決定するため
に、インサートをPst Iを用いてpBR322から切除し、Pst
I直線化，ホスフアターゼ処理プラスミドpUC8に結合し
た（Vierra and Mssing,1982−Gene 19,259−268）。こ
れらの組換プラスミドによつてE.coli DHI細胞を形質転
換した。これらの新しい組換プラスミドを本文中で以後
pRCL6及びpRCL17と指称する。
２つのインサートは共通配列領域を含んでおり合一し
て完全リシン前駆体配列を示すと考えられる。pRCL6及
びpRCL17中でインサートのオーバーラツプ領域のヌクレ
オチドは完全に等しい。
て完全リシン前駆体配列を示すと考えられる。pRCL6及
びpRCL17中でインサートのオーバーラツプ領域のヌクレ
オチドは完全に等しい。
次に、リシン前駆体ポリペプチドをコードする完全ヌ
クレオチド配列を含む新しい組換DNA分子を構築した。
このために、制限エンドヌクレアーゼSau961で消化して
pRCL17から長さ323bpの断片を単離し、Sau961で部分消
化してpRCL6から単離した長さ1561bpの断片に結合し
た。50mMトリスHCl（pH7.4）と10mM MgCl2と10mMジチオ
トレイトールと1mMスペルミジンと10mM ATPと0.1mg/ml
BSAとに５ユニツトの市販T4 DNAリガーゼを加えた液中
で結合を生じさせ、15℃で１晩インキユベートした。標
準フエノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿とを
行なつた後、結合DNAをペレツト化し、少量の10mMトリ
スCHl（pH7.4）と1mM EDTAとに溶解し、Pst Iで完全消
化した。得られた直線状DNAを次に、同量のPst I直線
化，ホスフアターゼ処理pUC8と（前記の如く）結合し
た。リシン前駆体の完全DNA配列を含む新しい組換DNA分
子をpRCL617と命名し、これを従来同様に用いてE.coliD
HI細胞を形質転換した。
クレオチド配列を含む新しい組換DNA分子を構築した。
このために、制限エンドヌクレアーゼSau961で消化して
pRCL17から長さ323bpの断片を単離し、Sau961で部分消
化してpRCL6から単離した長さ1561bpの断片に結合し
た。50mMトリスHCl（pH7.4）と10mM MgCl2と10mMジチオ
トレイトールと1mMスペルミジンと10mM ATPと0.1mg/ml
BSAとに５ユニツトの市販T4 DNAリガーゼを加えた液中
で結合を生じさせ、15℃で１晩インキユベートした。標
準フエノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿とを
行なつた後、結合DNAをペレツト化し、少量の10mMトリ
スCHl（pH7.4）と1mM EDTAとに溶解し、Pst Iで完全消
化した。得られた直線状DNAを次に、同量のPst I直線
化，ホスフアターゼ処理pUC8と（前記の如く）結合し
た。リシン前駆体の完全DNA配列を含む新しい組換DNA分
子をpRCL617と命名し、これを従来同様に用いてE.coliD
HI細胞を形質転換した。
pRCL617のヌクレオチド配列を第１図に示す。
この配列はクローンpRCL6及びpRCL17中の２つのオー
バーラツプDNAインサートから推定された（これら２つ
のクローンの各々のDNAインサートの範囲を以下に説明
する）。
バーラツプDNAインサートから推定された（これら２つ
のクローンの各々のDNAインサートの範囲を以下に説明
する）。
ヌクレオチド残基に対し５′→３′方向に番号をつけ
る。但し、成熟リシンＡ鎖のアミノ末端残基を特定する
コドンの第１残基の番号を１とし、残基１の５′側のヌ
クレオチドにはマイナス番号をつけた。５′末端配列は
mRNAの５′端まで伸びていないが、図示の３′末端配列
に27個の残基から成るポリ（dA）トラクトが続いてお
り、これは領域の完全配列を示す。ヌクレオチド配列の
下側に予想アミノ酸配列を示し、その下側に文献に発表
された成熟リシンＡ鎖及びＢ鎖のアミノ酸配列との違い
を示す。（G.Funatsu,M.Kimura及びM.Funatsu,Agric.Bi
ol.Chem.43巻,2221−2224ページ（1979），及びS.Yoshi
take,G.Funatsu及びM.Funatsu,Agric.Biol.Chem.42巻,1
267−1274ページ（1978））。発表されたアミノ酸配列
に無い残基には破線でアンダーラインを付け、発表され
た配列には存在したがここで推定された配列に無いアミ
ノ酸の位置は星印で示した。Ａ鎖のＣ末端とＢ鎖のＮ末
端とを連結する12個のアミノ酸配列の下側の点線はかつ
こで括つた。成熟Ａ鎖のアミノ末端残基からアミノ酸番
号をつけ、その手前の残基はマイナス番号で示す。アス
パラギン結合Ｎ−グリコシル化が可能な部位を黒枠で囲
み、可能なポリ（Ａ）シグナルにアンダーラインを引
く。pRCL6のインサートはヌクレオチド−102から残基15
12まで伸びておりpRCL17のインサートはヌクレオチド73
3から残基1782まで伸びている。
る。但し、成熟リシンＡ鎖のアミノ末端残基を特定する
コドンの第１残基の番号を１とし、残基１の５′側のヌ
クレオチドにはマイナス番号をつけた。５′末端配列は
mRNAの５′端まで伸びていないが、図示の３′末端配列
に27個の残基から成るポリ（dA）トラクトが続いてお
り、これは領域の完全配列を示す。ヌクレオチド配列の
下側に予想アミノ酸配列を示し、その下側に文献に発表
された成熟リシンＡ鎖及びＢ鎖のアミノ酸配列との違い
を示す。（G.Funatsu,M.Kimura及びM.Funatsu,Agric.Bi
ol.Chem.43巻,2221−2224ページ（1979），及びS.Yoshi
take,G.Funatsu及びM.Funatsu,Agric.Biol.Chem.42巻,1
267−1274ページ（1978））。発表されたアミノ酸配列
に無い残基には破線でアンダーラインを付け、発表され
た配列には存在したがここで推定された配列に無いアミ
ノ酸の位置は星印で示した。Ａ鎖のＣ末端とＢ鎖のＮ末
端とを連結する12個のアミノ酸配列の下側の点線はかつ
こで括つた。成熟Ａ鎖のアミノ末端残基からアミノ酸番
号をつけ、その手前の残基はマイナス番号で示す。アス
パラギン結合Ｎ−グリコシル化が可能な部位を黒枠で囲
み、可能なポリ（Ａ）シグナルにアンダーラインを引
く。pRCL6のインサートはヌクレオチド−102から残基15
12まで伸びておりpRCL17のインサートはヌクレオチド73
3から残基1782まで伸びている。
12個の媒介トリプレツトは、前駆体ポリペプチド中に
存在しており細胞中で酵素により除去されてＡ鎖とＢ鎖
とを分離するリンカーアミノ酸配列をコードする。Ａ鎖
及びＢ鎖は、リシン分子自体の形成中にジスルフイドブ
リツジにより接合される。このリンカー領域と予定され
たアミノ末端リーダー又はシグナル配列（アミノ酸−24
→−１）とはFunatsu等によつて発表された配列中には
存在しない。
存在しており細胞中で酵素により除去されてＡ鎖とＢ鎖
とを分離するリンカーアミノ酸配列をコードする。Ａ鎖
及びＢ鎖は、リシン分子自体の形成中にジスルフイドブ
リツジにより接合される。このリンカー領域と予定され
たアミノ末端リーダー又はシグナル配列（アミノ酸−24
→−１）とはFunatsu等によつて発表された配列中には
存在しない。
プレプロリシンは前記DNAインサートによりコードさ
れた完全ポリペプチド即ちアミノ酸−24からアミノ酸54
1でのポリペプチドである。プロリシンは生体中でプレ
プロリシンからアミノ酸リーダー配列が除去されて得ら
れたものでアミノ酸１からアミノ酸541まで伸びてい
る。
れた完全ポリペプチド即ちアミノ酸−24からアミノ酸54
1でのポリペプチドである。プロリシンは生体中でプレ
プロリシンからアミノ酸リーダー配列が除去されて得ら
れたものでアミノ酸１からアミノ酸541まで伸びてい
る。
第１図はpRCL617のヌクレオチド配列とプレプロリシン
のアミノ酸配列を示す図であり、第２図はcDNAの合成及
びクローニング過程を示す説明図である。
のアミノ酸配列を示す図であり、第２図はcDNAの合成及
びクローニング過程を示す説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フランシス・アイアン・ラム イギリス国、シー・ヴイ・８・２・エイ チ・ジエイ、ウオーリツクシヤー、ケニ ルワース・ヘンリー・ストリート・76 (72)発明者 リン・マーガレツト・ロバーツ イギリス国、ウオーリツクシヤー、レミ ングタン・スパ、リリントン、ブレイマ ー・ロード・48 (56)参考文献 特開 昭57−126455（ＪＰ，Ａ) Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．, Ｖｏｌ．42，Ｎｏ．６（1978）Ｐ．1267 −74 Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．, Ｖｏｌ．43，Ｎｏ．10（1979）Ｐ．2221 −24 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．198（1977) Ｐ．1056−63
Claims (13)
- 【請求項１】リシンのＡ鎖を構成するかつ下記のアミノ
酸配列（Ａ）からなるポリペプチドをコードするDNAで
あってかつ下記のヌクレオチド配列（Ａ）を有するか又
は下記のヌクレオチド配列（Ａ）と遺伝暗号の縮重の関
係にあるヌクレオチド配列を有するDNA（ｉ）をインサ
ートとして含有することを特徴とする組換DNA分子。 - 【請求項２】前記インサートされるDNAは、前記組換DNA
を得るために、プラスミド又はバクテリオファージであ
るクローニングベクター中に導入されている、特許請求
の範囲第１項に記載の組換DNA分子。 - 【請求項３】プロリシンを構成する下記のアミノ酸配列
（Ｂ）からなるポリペプチドをコードするDNAであって
かつ下記のヌクレオチド配列（Ｂ）を有するか又は下記
のヌクレオチド配列（Ｂ）と遺伝暗号の縮重の関係にあ
るヌクレオチド配列を有するDNA（ii）をインサートと
して含有することを特徴とする組換DNA分子。 - 【請求項４】前記インサートされるDNAは、前記組換DNA
を得るために、プラスミド又はバクテリオファージであ
るクローニングベクター中に導入されている、特許請求
の範囲第３項に記載の組換DNA分子。 - 【請求項５】下記のアミノ酸配列（Ｃ）からなるシグナ
ルペプチドをコードするDNAであってかつ下記のヌクレ
オチド配列（Ｃ）を有するか又は下記のヌクレオチド配
列（Ｃ）と遺伝暗号の縮重の関係にあるヌクレオチド配
列を有するDNAを前記DNA（ｉ）の５′末端に有する、特
許請求の範囲第１項に記載の組換DNA分子。 - 【請求項６】リシンのＡ鎖を構成するかつ下記のアミノ
酸配列（Ａ）からなるポリペプチドをコードするDNAで
あってかつ下記のヌクレオチド配列（Ａ）を有するか又
は下記のヌクレオチド配列（Ａ）と遺伝暗号の縮重の関
係にあるヌクレオチド配列を有するDNA（ｉ）をインサ
ートとして含有する組換DNA分子を含有する、形質転換
された大腸菌宿主細胞。 - 【請求項７】前項に記載のDNA（ｉ）であって、その
５′末端に下記のアミノ酸配列（Ｃ）からなるシグナル
ペプチドをコードするDNAであってかつ下記のヌクレオ
チド配列（Ｃ）を有するか又は下記のヌクレオチド配列
（Ｃ）と遺伝暗号の縮重の関係にあるヌクレオチド配列
を有するDNAを有するDNAをインサートとして含有する組
換DNA分子を含有する、特許請求の範囲第６項に記載の
大腸菌宿主細胞。 - 【請求項８】インサートとしての前記組換DNA分子が、
プラスミド又はバクテリオファージであるクローニング
ベクター中の導入されている組換DNA分子である、特許
請求の範囲第６項又は第７項に記載の大腸菌宿主細胞。 - 【請求項９】クローニングベクターはpRB322,pAT153,pU
C8,pGS15又はpMB9から選ばれたものである、特許請求の
範囲第６項〜第８項のいずれかにに記載の大腸菌宿主細
胞。 - 【請求項１０】プロリシンを構成する下記のアミノ酸配
列（Ｂ）からなるポリペプチドをコードするDNAであっ
てかつ下記のヌクレオチド配列（Ｂ）を有するか又は下
記のヌクレオチド配列（Ｂ）と遺伝暗号の縮重の関係に
あるヌクレオチド配列を有するDNA（ii）をインサート
として含有する組換DNA分子を含有する、形質転換され
た大腸菌宿主細胞。 - 【請求項１１】前項に記載のDNA（ii）であって、その
５′末端に下記のアミノ酸配列（Ｃ）からなるシグナル
ペプチドをコードするDNAであってかつ下記のヌクレオ
チド配列（Ｃ）を有するか又は下記のヌクレオチド配列
（Ｃ）と遺伝暗号の縮重の関係にあるヌクレオチド配列
を有するDNAを有するDNAをインサートとして含有する組
換DNA分子を含有する、特許請求の範囲第10項に記載の
大腸菌宿主細胞。 - 【請求項１２】インサートとしての前記組換DNA分子
が、プラスミド又はバクテリオファージであるクローニ
ングベクター中の導入されている組換DNA分子である、
特許請求の範囲第10項又は第11項に記載の大腸菌宿主細
胞。 - 【請求項１３】クローニングベクターはpRB322,pAT153,
pUC8,pGS15又はpMB9から選ばれたものである、特許請求
の範囲第10項〜第12項のいずれかに記載の大腸菌宿主細
胞。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH8319265 | 1983-07-15 | ||
| GB8319265 | 1983-07-15 | ||
| GB838319265A GB8319265D0 (en) | 1983-07-15 | 1983-07-15 | Recombinant dna molecules |
| GB848406569A GB8406569D0 (en) | 1984-03-13 | 1984-03-13 | Recombinant dna molecules |
| GB8406569 | 1984-03-13 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3172790A Division JPH05328990A (ja) | 1983-07-15 | 1991-07-12 | リシンａ鎖ポリペプチドの発現 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60102188A JPS60102188A (ja) | 1985-06-06 |
| JP2521657B2 true JP2521657B2 (ja) | 1996-08-07 |
Family
ID=26286615
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59145878A Expired - Lifetime JP2521657B2 (ja) | 1983-07-15 | 1984-07-13 | 組換ｄｎａ分子及びこれを含有する形質転換宿主細胞 |
| JP3172790A Pending JPH05328990A (ja) | 1983-07-15 | 1991-07-12 | リシンａ鎖ポリペプチドの発現 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3172790A Pending JPH05328990A (ja) | 1983-07-15 | 1991-07-12 | リシンａ鎖ポリペプチドの発現 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5622838A (ja) |
| EP (1) | EP0145111B1 (ja) |
| JP (2) | JP2521657B2 (ja) |
| DE (1) | DE3482192D1 (ja) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0145111B1 (en) * | 1983-07-15 | 1990-05-09 | The University Of Warwick | Dna sequence coding for a plant toxin of the ricin type, or a portion thereof |
| WO1985003508A1 (en) * | 1984-02-08 | 1985-08-15 | Cetus Corporation | Toxin conjugates |
| US5538868A (en) * | 1984-02-08 | 1996-07-23 | Cetus Oncology Corporation | Recombinant ricin toxin fragments |
| GB8417915D0 (en) * | 1984-07-13 | 1984-08-15 | Ici Plc | Microorganisms |
| US5840522A (en) * | 1984-09-20 | 1998-11-24 | Chiron Corporation | Recombinant lectins |
| US6084073A (en) * | 1985-03-25 | 2000-07-04 | Chiron Corporation | Recombinant ricin toxin |
| EP0196762A1 (en) * | 1985-03-29 | 1986-10-08 | Cetus Corporation | Recombinant ricin fragments, vectors and transformed hosts expressing the same, the modification of DNA sequences, and isolation of mRNA |
| US4946943A (en) * | 1985-06-20 | 1990-08-07 | Will Bloch | Purification of ribotoxins and their conjugates |
| US4962188A (en) * | 1985-12-06 | 1990-10-09 | Cetus Corporation | Recombinant ricin toxin A chain conjugates |
| AU601956B2 (en) * | 1986-03-07 | 1990-09-27 | Cetus Corporation | Recombinant ricin toxin |
| AU2136788A (en) * | 1987-07-24 | 1989-03-01 | Cetus Corporation | Production of ricin toxins in a baculovirus-insect cell expression system |
| DE69734656T2 (de) | 1996-04-30 | 2006-08-10 | Twinstrand Therapeutics Inc., Burnaby | Antivirale variante von ricin-proteinen |
| US7247715B2 (en) | 1997-04-30 | 2007-07-24 | Twinstrand Therapeutics Inc. | Ricin-like toxin variants for treatment of cancer, viral or parasitic infections |
| WO2001025267A2 (en) | 1999-10-04 | 2001-04-12 | Twinstrand Therapeutics Inc. | Improved ricin-like toxins for treatment of cancer |
| US6593132B1 (en) * | 1997-04-30 | 2003-07-15 | Twinstrand Therapeutics Inc. | Ricin-like toxin variants for treatment of cancer, viral or parasitic infections |
| ES2169968B1 (es) * | 1999-08-25 | 2003-11-16 | Univ Valladolid | Gen que codifica la proteina inactivadora de ribosomas de hojas de sambucus ebulus l. procedimiento para su obtencion y aplicaciones. |
| WO2001060393A1 (en) * | 2000-02-16 | 2001-08-23 | Bechtel Bwxt Idaho, Llc | Selective destruction of cells infected with human immunodeficiency virus |
| US6869787B2 (en) | 2002-02-27 | 2005-03-22 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Ricin vaccine and methods of making and using thereof |
| EP1730282A4 (en) * | 2004-03-24 | 2007-05-09 | Twinstrand Therapeutics Inc | GLYCOSYLATION VARIANTS OF RICINE-LIKE PROTEINS |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE52122B1 (en) * | 1980-08-25 | 1987-06-24 | Univ California | Somatostatin or somatostatin precursors |
| US4578355A (en) * | 1983-01-12 | 1986-03-25 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Plasmid cloning vector pAS1 |
| EP0145111B1 (en) * | 1983-07-15 | 1990-05-09 | The University Of Warwick | Dna sequence coding for a plant toxin of the ricin type, or a portion thereof |
| US4948729A (en) * | 1985-03-25 | 1990-08-14 | Cetus Corporation | Production of soluble recombinant proteins |
| EP0196762A1 (en) * | 1985-03-29 | 1986-10-08 | Cetus Corporation | Recombinant ricin fragments, vectors and transformed hosts expressing the same, the modification of DNA sequences, and isolation of mRNA |
-
1984
- 1984-07-13 EP EP84304801A patent/EP0145111B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-13 DE DE8484304801T patent/DE3482192D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-13 JP JP59145878A patent/JP2521657B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-03-23 US US07/327,434 patent/US5622838A/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-07-12 JP JP3172790A patent/JPH05328990A/ja active Pending
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．６（１９７８）Ｐ．１２６７−７４ |
| Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．１０（１９７９）Ｐ．２２２１−２４ |
| Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１９８（１９７７）Ｐ．１０５６−６３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0145111B1 (en) | 1990-05-09 |
| JPH05328990A (ja) | 1993-12-14 |
| EP0145111A1 (en) | 1985-06-19 |
| US5622838A (en) | 1997-04-22 |
| JPS60102188A (ja) | 1985-06-06 |
| DE3482192D1 (de) | 1990-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2521657B2 (ja) | 組換ｄｎａ分子及びこれを含有する形質転換宿主細胞 | |
| JP3375470B2 (ja) | ウレアーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列 | |
| Lee et al. | Comparison of the nucleotide sequences of the initial transcribed regions of the tryptophan operons of Escherichia coli and Salmonella typhimurium | |
| US5814506A (en) | Over-expression and purification of a truncated thermostable DNA polymerase by protein fusion | |
| Gerald et al. | Immunological identification of rat tissue kallikrein cDNA and characterization of the kallikrein gene family | |
| JPH01501840A (ja) | 繊維芽細胞成長因子の産生 | |
| CN111876399B (zh) | 北极来源的β-葡萄糖苷酶基因、及其编码的蛋白和应用 | |
| Gietl et al. | Mitochondrial malate dehydrogenase from watermelon: sequence of cDNA clones and primary structure of the higher-plant precursor protein | |
| JPS58996A (ja) | 細菌中での牛成長ホルモン遺伝子のクロ−ン化 | |
| Prickril et al. | Cloning and sequencing of the gene for rubrerythrin from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough) | |
| Arredondo-Peter et al. | Molecular Cloning of the Cowpea Leghemoglobin II Gene and Expression of Its cDNA in Escherichia coli (Purification and Characterization of the Recombinant Protein) | |
| JP3181660B2 (ja) | ビリルビンオキシダーゼの製造法 | |
| JP3010360B2 (ja) | 組換リシントキシン | |
| NZ249208A (en) | Malaria vaccine, merozoite surface protein 1 fragment, vector | |
| JPH057995B2 (ja) | ||
| KR890004807B1 (ko) | 우역 바이러스의 항원 단백질을 코드화 하는 dna | |
| AU653458B2 (en) | Ovine growth hormone gene and an expression thereof in E. coli | |
| CN115960929A (zh) | 一种耐热β-葡聚糖酶、编码基因及其在纤维素原料水解中的应用 | |
| IE922506A1 (en) | Nucleotide sequences coding for ribosome inactivating¹proteins | |
| JPH0759194B2 (ja) | Ｄｎａセグメント | |
| WO1993020191A1 (en) | Purified thermostable endonuclease | |
| FI68261B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en rekombinations-dna-molekyl vilken har en humant korionsomatomammotropin kodande nukleotidsekvens | |
| SU1739855A3 (ru) | Способ получени полипептида, обладающего активностью фактора некроза опухоли человека | |
| KR100322118B1 (ko) | 한탄바이러스속의외피단백질을제조하는방법및그러한외피단백질을생성하는형질전환세균 | |
| JPH0418099A (ja) | オスモチン様タンパク |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |