CN103930443A - 通过拮抗il-6受体抑制肿瘤生长的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于抑制或减弱对象中的肿瘤生长的方法，通过向对象施用IL-6拮抗剂。在某些实施方案中，本发明的方法用于抑制对象中的抗VEGF抗性肿瘤的生长。IL-6拮抗剂可以是例如特异性结合IL-6R的抗体。IL-6拮抗剂可以与VEGF拮抗剂和/或EGFR拮抗剂组合施用。

Description

通过拮抗IL-6受体抑制肿瘤生长的方法
发明领域
本发明涉及用于抑制或减弱对象中的肿瘤生长或增殖的组合物和方法。更具体而言，本发明涉及这样的方法，所述方法包括向具有肿瘤的对象施用白介素-6(IL-6)拮抗剂。
背景
血管内皮细胞生长因子(VEGF)的拮抗剂已经在多个实验和临床设计中表现出有效抑制肿瘤生长。VEGF拮抗剂通过靶向肿瘤血管来产生其治疗效果。然而，已经观察到在某些情况下肿瘤可以发展出对于抗VEGF活性剂的抗性。因此，本领域需要新的用于治疗肿瘤的治疗方法，包括抑制已发展出对于抗VEGF疗法的抗性的肿瘤的生长的方法。
白介素-6(IL-6)是在多种癌症类型中表达的促炎性细胞因子。临床研究显示，增加的血清IL-6水平与更差的患者结果相关。升高的IL-6表达可以是由原癌信号传递通路激活导致的，和/或是慢性炎症的结果，后者与癌症发展相关。IL-6信号通过其异源二聚受体IL-6R/gp130来激活JAK/STAT和Ras信号传递通路。特别的是，IL-6强烈激活STAT3，后者表现出促进肿瘤细胞增殖、侵入和存活。在若干种临床前期模型中，用针对IL-6或IL-6R的单克隆抗体抑制IL-6信号传递表现出抑制肿瘤生长，提示IL-6通路是有吸引力的癌症治疗靶。然而，尚未描述过IL-6水平与抗VEGF抗性之间的相关性，或使用IL-6拮抗剂治疗抗VEGF抗性肿瘤。
发明概述
本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现，即，抗VEGF抗性肿瘤表达升高的IL-6水平，并且当IL-6的拮抗作用(例如，通过使用抗IL-6R抗体)与抗VEGF疗法组合时，能够克服肿瘤的抗VEGF抗性，因而提供了针对之前被视为不响应VEGF拮抗作用的肿瘤的强大的抗肿瘤活性。
因此，根据本发明的一个方面，提供了用于抑制或减弱对象中的抗VEGF抗性肿瘤生长的方法和组合物。根据本发明这一方面的某些实施方案，提供了癌症治疗的方法，所述方法包括：(i)测量来自对象的肿瘤活组织检查中的IL-6/STAT3信号传递水平；(ii)如果肿瘤活组织检查表现出增加的IL-6/STAT3信号传递，则向对象施用IL-6拮抗剂。根据本发明这一方面的方法还包括向对象施用IL-6拮抗剂和VEGF拮抗剂。根据本发明的这一方面，提供了包含至少一种IL-6拮抗剂和至少一种VEGF拮抗剂的组合物。
根据本发明的另一个方面，提供了用于增强IL-6拮抗剂的抗肿瘤活性的方法。根据本发明这一方面的方法包括向具有肿瘤的对象施用至少一种额外的抗肿瘤剂与IL-6拮抗剂的组合。额外的抗肿瘤剂可以是例如VEGF拮抗剂、EGFR拮抗剂或其组合。
本发明的拮抗剂分子可以是例如抗原特异性结合蛋白，包括特异性结合例如IL-6、IL-6R、VEGF、VEGFR1、VEGFR2、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3和/或ErbB4的抗原特异性结合蛋白。本发明的抗原特异性结合蛋白包括抗体及其抗原结合片段。抗原特异性结合蛋白还包括融合多肽，所述融合多肽包含一个或多个受体分子的配体结合部分。在某些示例性的实施方案中，IL-6拮抗剂是特异性结合IL-6R的抗体，VEGF拮抗剂是结合VEGF的融合分子，其包含VEGFR1、VEGFR2的VEGF结合结构域和多聚化的结构域(VEGF-Trap)，并且EGFR拮抗剂是特异性结合EGFR(ErbB1/HER1)的抗体，或特异性结合ErbB3的抗体，或特异性结合ErbB4的抗体。然而，其他的拮抗剂也可用于本发明上下文中，如本文别处所述的。
鉴于之后详细的说明书，本发明的其他实施方案是显而易见的。
附图简介
图1显示了对培养的A549、Calu3和Du145肿瘤细胞进行Western印迹的结果，以评估在用10μg/ml人Fc对照蛋白(第1道)、10μg/ml抗IL-6R mAb1(第2道)、10ng/ml IL-6加10μg/ml hFc(第3道)或10ng/mlIL-6加10μg/ml抗IL-6R mAb1(第4道)处理后，细胞内的磷酸化-STAT3和总STAT3的水平。
图2，A图显示了对从培养的A431-P或A431-V2细胞中收集的条件化培养基实施ELISA的结果，以测量IL-6的浓度。
图2，B图显示了对用hFc对照蛋白(10μg/ml)或抗IL-6R mAb1(10μg/ml)处理的A431-P或A431-V2细胞实施的Western印迹的结果，以测量磷酸化-STAT3的水平(相对于肌动蛋白对照)。
发明详述
在描述本发明前，应理解本发明不限于所述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件是可变的。还应理解，本文使用的术语仅仅是出于描述特定实施方案的目的，而并非意在限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求的限制。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文中使用的，术语“约”当用于指特别陈述的数值时，意味着所述数值可自所陈述的值变化不超过1％。例如，如本文中使用的，表述方式“约100”包括99和101，以及两者之间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然可以使用与本文所述的方法和材料相似或等价的任何方法和材料来实践本发明，但优选的方法和材料描述如下。
用于抑制或减弱肿瘤生长的方法
本发明提供了用于抑制或减弱对象中的肿瘤生长的方法。本发明包括向具有肿瘤的对象施用IL-6拮抗剂。IL-6拮抗剂可以与一种或多种额外的治疗剂组合施用。可以与根据本发明方法的IL-6拮抗剂组合施用的示例性的治疗剂包括，例如，血管内皮细胞生长因子(VEGF)的拮抗剂和/或表皮生长因子受体(EGFR)的拮抗剂(本文定义的)。本文其他地方描述了可以与根据本发明方法的IL-6拮抗剂组合施用的治疗剂的其他例子。
本发明的方法可用于治疗脑和脑膜、口咽部、肺和支气管树、胃肠道、雄性和雌性生殖道、肌肉、骨骼、皮肤和附属器、结缔组织、脾、免疫系统、成血细胞和骨髓、肝和尿道、和特殊的感觉器官如眼中产生的原发性的和/或转移的肿瘤。根据本发明方法可治疗的具体癌症包括，例如，肾细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、结肠直肠癌、恶性间皮细胞瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌和黑色素瘤。
在某些实施方案中，本发明的方法可用于治疗对象中的抗VEGF抗性肿瘤。如本文中使用的，“抗VEGF抗性肿瘤”意指不应答或仅部分应答使用抗VEGF活性剂(如抗VEGF抗体、抗VEGF受体抗体或任何其他VEGF特异性结合蛋白(包括例如本文定义的VEGF-trap))的治疗的肿瘤。例如，抗VEGF抗性肿瘤可以是例如这样的肿瘤，当接触通常能够抑制或减弱至少一种肿瘤类型的生长的一定量的VEGF拮抗剂时，所述肿瘤在体外或体内(例如，在细胞培养物中或移植到动物体内)继续生长和/或增殖。抗VEGF抗性肿瘤可以是源自最初应答抗VEGF疗法的肿瘤细胞的肿瘤，但通过选择、突变或适应，已获得了对一种或多种抗VEGF活性剂的抗性。
使用本发明的方法可治疗的对象包括诊断患有癌症，或鉴别具有肿瘤的任何对象。在某些实施方案中，对象是已被诊断或鉴别为具有至少部分地抵抗于抗VEGF治疗的肿瘤的患者。用于诊断具有抗VEGF抗性肿瘤的患者的方法是本领域普通技术人员已知的，并且可使用常规的诊断方法实践。
如本文实施例所示，抗VEGF治疗抗性的肿瘤细胞表现出表达比亲代非抗性肿瘤细胞更高水平的IL-6和磷酸化-STAT3。因此，本发明还包括癌症治疗的方法，包括(i)测量对象中(例如，在从对象获得的血清样品、组织样品、肿瘤活组织检查等中)的IL-6/STAT3信号传递水平；(ii)如果对象(或从中获得的样品/活组织检查)表现出增加的IL-6/STAT3信号传递，则向对象施用IL-6拮抗剂。
根据本发明的某些实施方案，表述方式“增加的IL-6/STAT-3信号传递”意指在肿瘤活组织检查中测量到的IL-6的量和/或磷酸化-STAT3的量比在对于抗VEGF疗法敏感的(即，非抗性)肿瘤中高至少3x(例如，4x、5x、6x、7x或更高)。根据本发明的某些实施方案，“增加的IL-6/STAT-3信号传递”意指在自对象采集的样品中的磷酸化-STAT3与不变的对照蛋白的比例(例如，P-STAT3/肌动蛋白比例)大于约2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或更高。根据本发明的某些实施方案，“增加的IL-6/STAT-3信号传递”意指在自对象采集的肿瘤样品中的IL-6浓度大于约50pg/ml、55pg/ml、60pg/ml、65pg/ml、70pg/ml、75pg/ml、80pg/ml、85pg/ml、90pg/ml、95pg/ml、100pg/ml、110pg/ml、120pg/ml、130pg/ml、140pg/ml、150pg/ml、160pg/ml、170pg/ml、180pg/ml、190pg/ml、200pg/ml或更高。可以使用例如Western印迹、ELISA或任何其他本领域已知的免疫化学方法测量IL-6和磷酸化-STAT3的水平。
类似的，本发明还包括用于确定具有肿瘤的患者是否具有抗VEGF抗性肿瘤的方法。根据本发明的该方面的方法包括测量来自患者的样品(例如肿瘤活组织检查)中的IL-6/STAT3信号传递的水平，其中样品中“增加的IL-6/STAT3信号传递”(如上文定义的表述方式)鉴别了具有抗VEGF抗性肿瘤的对象。由于本发明人已证实抗VEGF抗性肿瘤是对IL-6拮抗作用敏感的，在某些实施方案中，根据本发明的该方面的方法还包括向患者施用IL-6拮抗剂和/或VEGF拮抗剂。
拮抗剂
本发明包括这样的方法，所述方法包括向有需要的对象施用IL-6拮抗剂、VEGF拮抗剂、EGFR拮抗剂和/或其组合。如本文中使用的，“IL-6拮抗剂”是与IL-6结合或相互作用，且在体外或体内抑制IL-6的正常生物学信号传递功能的任何活性剂。术语“IL-6拮抗剂”还包括IL-6受体的拮抗剂(“IL-6R”，即“IL-6R拮抗剂)。IL-6R拮抗剂可以是与IL-6R结合或相互作用，且在体外或体内抑制IL-6R的正常生物学信号传递功能的任何活性剂。
VEGF拮抗剂可以是与VEGF或VEGF受体(VEGFR1，也被称为Flt1；或VEGFR2，也被称为Flk1或KDR)结合或相互作用的任何活性剂。
EGFR拮抗剂可以是与表皮生长因子受体结合或相互作用，且在体外或体内抑制受体的正常生物学信号传递功能的任何活性剂。如本文中使用的，表述方式“EGFR拮抗剂”包括表皮生长因子受体家族的任何一个或多个成员的拮抗剂。例如，EGFR拮抗剂可以是EGFR(也被称为ErbB1或HER1)的拮抗剂、EGFR变体(如EGFRvIII)的拮抗剂、ErbB2(也被称为HER2或Neu)的拮抗剂、ErbB3(也被称为HER3)的拮抗剂和/或ErbB4(也被称为HER4)的拮抗剂。
IL-6、IL-6R、VEGF、VEGF受体和EGFR的拮抗剂包括小分子拮抗剂，以及抗原特异性结合蛋白，如本文别处所述。
抗原特异性结合蛋白
可用于本发明方法中的拮抗剂包括抗原特异性结合蛋白。例如，本发明包括这样的方法，所述方法包括向对象施用特异性结合白介素-6(IL-6)或IL-6受体(IL-6R)的抗原特异性结合蛋白。本发明还包括这样的方法，所述方法包括向对象施用特异性结合血管内皮细胞生长因子(VEGF)、或VEGF受体(VEGFR)的抗原特异性结合蛋白，或特异性结合表皮生长因子受体(EGFR、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3和/或ErbB4)的抗原特异性结合蛋白。
如本文中使用的，表述方式“抗原特异性结合蛋白”意指包含至少一个特异性结合特定抗原的结构域的蛋白质。抗原特异性结合蛋白的示例性类别包括抗体、抗体的抗原结合部分、与特定抗原特异性相互作用的肽(例如，肽体(peptibodies))、与特定抗原特异性相互作用的受体分子，和包含与特定抗原特异性结合的受体的配体结合部分的蛋白质。
如本文中使用的，术语“特异性结合”等意指抗原特异性结合蛋白或抗原特异性结合结构域与特定抗原形成复合物，其特征是解离常数(KD)为500pM或更小，和/或在普通测试条件下不结合其他不相关的抗原。“不相关的抗原”是彼此具有低于75％氨基酸同一性的蛋白质、肽或多肽。用于确定两个分子是否彼此特异性结合的方法是本领域普遍已知的，包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。例如，本发明上下文中使用的抗原特异性结合蛋白或抗原特异性结合结构域包括结合特定抗原(例如，IL-6、IL-6R、VEGF、VEGFR和/或EGFR)的分子或其部分，其具有小于约500pM、小于约400pM、小于约300pM、小于约200pM、小于约100pM、小于约90pM、小于约80pM、小于约70pM、小于约60pM、小于约50pM、小于约40pM、小于约30pM、小于约20pM、小于约10pM、小于约5pM、小于约4pM、小于约2pM、小于约1pM、小于约0.5pM、小于约0.2pM、小于约0.1pM或小于约0.05pM的KD，如等离子体共振测定法中测量的。
如本文中使用的，当在表面等离子体共振测定法中在25℃测试与不相关抗原的结合时，如果蛋白质或结合结构域表现出大于1000pM的KD，或者在这类测定法或其等价形式中未能表现出任何结合，则抗原特异性结合蛋白或抗原特异性结合结构域“不结合”不相关抗原。
如本文中使用的，术语“表面等离子体共振”指允许通过检测生物传感器基质中的蛋白质浓度的改变，分析实时相互作用的光学现象，例如使用BIAcoreTM系统(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare,Piscataway,NJ)。
如本文中使用的，术语“KD”意指特定的蛋白质-蛋白质相互作用(例如，抗体-抗原相互作用)的平衡解离常数。除非另外指出，本文公开的KD值指通过表面等离子体共振测定法在25℃确定的KD值。
抗体和抗体的抗原结合片段
如上所述，抗原特异性结合蛋白可以包含特异性结合特定抗原的抗体或抗体的抗原结合片段(例如，抗IL-6抗体、抗IL-6R抗体、抗VEGF抗体、抗VEGFR抗体和/或抗EGFR抗体，或其抗原结合片段)，或由上述抗体或抗体的抗原结合片段组成。
如本文中使用的，术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子包含四条多肽链，通过二硫键相互连接的2条重链(H)和2条轻链(L)，及其多聚体(例如IgM)。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含1个结构域(CL1)。VH和VL区可以进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的超变区，中间散布有更保守的、被称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由3个CDR和4个FR构成，按下列顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施方案中，抗体(或其抗原结合片段)的FR可以与人种系序列相同，或者可以是天然或人为修饰的。可以基于对2个或多个CDR的并排分析，定义氨基酸共有序列。
如本文中使用的，术语“抗体”还包括完整抗体分子的抗原结合片段。如本文中使用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或遗传改造的多肽或糖蛋白，所述多肽或糖蛋白特异性地结合抗原，形成复合物。抗体的抗原结合片段可以源自例如完整的抗体分子，使用任何合适的标准技术，如蛋白水解消化或涉及操作和表达编码抗体可变结构域、任选恒定结构域的DNA的重组遗传改造技术。这类DNA是已知的和/或可方便获得自，例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)、或者可以是合成的。DNA可以进行测序，化学操作或使用分子生物学技术进行操作，例如将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构象，或导入密码子、生成半胱氨酸残基、修饰、添加或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性例子包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体超变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，分离的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)，或限制性的FR3-CDR3-FR4肽。其他改造的分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、移植CDR的抗体、二价体(diabody)、三价体(triabody)、四价体(tetrabody)、微体(minibody)、纳米抗体(例如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药剂(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域，也涵盖在本文使用的表述方式“抗原结合片段”中。
抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何大小或氨基酸组成，并一般包含至少一个CDR，所述CDR与一个或多个框架序列相邻或符合一个或多个框架序列的读框。在具有与VL结构域相关联的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可以位于相对彼此合适的任何排列方式中。例如，可变区可以是二聚化的并含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。可选的，抗体的抗原结合片段可含有单体的VH或VL结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可见于本发明的抗体的抗原结合片段中的可变结构域和恒定结构域的非限制性的示例构象包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构象中，包括任何上述示例性构象，可变结构域和恒定结构域可以直接彼此连接或者可以通过完整的或部分的铰链区或接头区连接。铰链区可以由至少2个(例如，5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸组成，所述氨基酸导致在单个多肽分子的相邻可变和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性的连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可包含彼此和/或与一个或多个单体VH或VL结构域(例如通过二硫键)非共价关联的上文列举的任何可变和恒定结构域构象的同源二聚体或异源二聚体(或其他多聚体)。
本发明的分子可包含人抗体和/或重组人抗体，或其片段，或由人抗体和/或重组人抗体，或其片段组成。如本文中使用的，术语“人抗体”包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。然而，人抗体也可包括例如在CDR中，特别是CDR3中的不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变，或通过体内的体细胞突变导入的突变)。然而，如本文中使用的，术语“人抗体”并非意在包括这样的抗体，其中源自另一种哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经被移植到人框架序列上。
本发明的分子可包含重组人抗体或其抗原结合片段，或由重组人抗体或其抗原结合片段组成。如本文中使用的，术语“重组人抗体”意在包括通过重组手段制备、表达、生成或分离的所有人抗体，如使用转染到宿主细胞(下文将进一步描述)中的重组表达载体表达的抗体，从重组的、组合的人抗体文库(下文将进一步描述)中分离的抗体，从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)中分离的抗体(参见例如，Taylor等人，(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或通过任何其他涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的手段制备、表达、生成或分离的抗体。这类重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，对地这类重组人抗体进行了体外诱变(或者，当使用人Ig序列转基因的动物时，进行体内的体细胞诱变)，因而重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，所述序列虽然源自人种系VH和VL序列且与其相关，但可以不天然地存在于体内的人抗体种系库中。
抗IL-6R抗体及其抗原结合片段
根据某些实施方案，本发明的方法包括向对象施用抗IL-6R抗体或其抗原结合片段。如本文中使用的，术语“白介素-6受体”、“IL-6R”等意在指特异性结合白介素-6(IL-6)的人细胞因子受体。人IL-6R的胞外结构域具有SEQ ID NO:1所述氨基酸序列。抗IL-6R抗体提及在例如美国专利号5,795,695；5,817,790；6,410,691；6,670,373和7,582,298中。任何上述出版物提及和/或描述的任何抗IL-6R抗体，或其抗原结合片段都可用于本发明的上下文中。可用于本发明的上下文中的非限制性的示例性抗IL-6R抗体是这样的抗IL-6R抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2/3的HCVR/LCVR氨基酸对的重链和轻链CDR。例如，抗IL-6R抗体可以是抗体或其抗原结合片段，包含分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)；和分别具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
VEGF拮抗剂
根据某些实施方案，本发明的方法包括向对象施用VEGF拮抗剂。如本文中使用的，表述方式“VEGF拮抗剂”意指任何阻断、降低或干扰VEGF的正常生物学活性的分子。VEGF拮抗剂包括干扰VEGF与天然的VEGF受体之间的相互作用的分子，例如，与VEGF或VEGF受体结合和阻止或者阻碍VEGF与VEGF受体之间的相互作用的分子。特定的示例性VEGF拮抗剂包括抗VEGF抗体、抗VEGF受体抗体和基于VEGF受体的嵌合分子(在本文中也被称为“VEGF-Trap”)。
基于VEGF受体的嵌合分子包括嵌合多肽，所述嵌合多肽包含两个或多个VEGF受体如VEGFR1(也被称为Flt1)和/或VEGFR2(也被称为Flk1或KDR)的免疫球蛋白(Ig)样结构域，并且还可以含有多聚化结构域(例如，协助两个或多个嵌合多肽多聚化【例如二聚化】的Fc结构域)。示例性的基于VEGF受体的嵌合分子是被称为VEGFR1R2-FcΔC1(a)的分子，其由SEQ ID NO:10的核酸序列编码。VEGFR1R2-FcΔC1(a)包含3种组分：(1)包含SEQ ID NO:11的第27至129位氨基酸的VEGFR1组分；(2)包含SEQ ID NO:11的第130至231位氨基酸的VEGFR2组分；和(3)包含SEQ ID NO:11的第232至457位氨基酸的多聚化组分(FcΔC1(a))(SEQ ID NO:11的C末端氨基酸[即，K458]可以包括或不包括在本发明方法使用的VEGF拮抗剂中；参见例如美国专利7,396,664)。SEQ ID NO:11的第1-26位氨基酸是信号序列。
组合疗法
根据某些实施方案，本发明的方法包括向对象施用与一种或多种额外的治疗剂(如VEGF拮抗剂和/或EGFR拮抗剂)组合的IL-6拮抗剂。如本文中使用的，表述方式“与……组合”意指额外的治疗剂在IL-6拮抗剂之前、之后或共同施用。例如，当在IL-6拮抗剂“之前”施用时，可以在施用IL-6拮抗剂之前约72小时、约60小时、约48小时、约36小时、约24小时、约12小时、约10小时、约8小时、约6小时、约4小时、约2小时、约1小时、约30分钟、约15分钟或约10分钟施用额外的治疗剂。当在IL-6拮抗剂“之后”施用时，可以在施用IL-6拮抗剂之后约10分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时或约72小时施用额外的治疗剂。与IL-6拮抗剂“共同”施用意指在施用IL-6拮抗剂少于5分钟内(之前、之后或同时)，以独立的剂量形式向对象施用额外的治疗剂，或作为包含额外的治疗剂和IL-6拮抗剂的单一组合的剂量制剂(例如，包含抗IL-6R抗体+VEGF Trap的单一制剂；或包含抗IL-6R抗体+抗EGFR抗体的单一制剂；或包含抗IL-6R抗体+抗ErbB3抗体的单一制剂；等)向对象施用额外的治疗剂。
药物组合物和施用方法
本发明包括包含IL-6拮抗剂的药物组合物。本发明还包括包含IL-6拮抗剂和第二活性组分(如VEGF拮抗剂和/或EGFR拮抗剂)的药物组合物。例如，本发明包括包含抗IL-6抗体和VEGF-Trap分子的药物组合物；本发明还包括包含抗IL-6R抗体和抗EGFR抗体的药物组合物。本发明的范围内还涵盖了包括向患者施用这类药物组合物的治疗方法。
用合适的载体、赋形剂和其他活性剂配制本发明的药物组合物，所述活性剂提供了合适的转移、递送、耐受等。多种恰当的制剂可见于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA中。合适的制剂包括例如粉末、糊剂、软膏、胶冻剂、蜡、油、脂类、含脂(阳离子型或阴离子型)的囊泡(如LIPOFECTINTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水型乳剂、乳剂聚乙二醇(carbowax)(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶剂，和含有聚乙二醇的半固体混合物。额外的合适的制剂还描述在Powell等人"Compendium of excipientsfor parenteral formulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol52:238-311中。
多种递送系统是已知的，并且可用于施用本发明的药物组合物，例如囊封在脂质体、微粒、微胶囊中、能够表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如Wu等人，1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。施用方法包括但不限于皮肤内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可以通过任何常规途径施用组合物，例如通过灌注或丸剂注射，通过表皮或粘膜皮肤内层吸收(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)，并且可以与其他生物学活性剂共同施用。
可以用标准的针头和注射器皮下或静脉内递送本发明的药物组合物。此外，对于皮下递送，可应用笔式递送装置方便地递送本发明的药物组合物。这类笔式递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔式递送装置一般利用了含有药物组合物的可更换药筒。一旦药筒内的所有药物组合物都被施用且药筒变空，则可以方便地丢弃空药筒，并用含有药物组合物的新药筒替换。然后可以重复使用笔式递送装置。在一次性的笔式递送装置中，没有可更换的药筒。一次性的笔式递送装置是用保存在装置内部储池中的药物组合物预装填的。一旦储池的药物组合物排空，则丢弃整个装置。
多种可重复使用的笔式和自动注射器式递送装置已用于皮下递送本发明的药物组合物。例子包括但不限于AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM注射笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX75/25TM注射笔、HUMALOGTM注射笔、HUMALIN70/30TM注射笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I、II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM注射笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPENPROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，举例而言。可用于皮下递送本发明的药物组合物的一次性笔式递送装置的例子包括但不限于SOLOSTARTM注射笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)、和KWIKPENTM(EliLilly)、SURECLICKTM Autoinjector(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM注射笔(Abbott Labs,Abbott Park IL)，举例而言。
在某些情况下，可以用受控释放系统递送本发明的药物组合物。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer，见上文；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料；参见Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(编著)，1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在仍然另一个实施方案中，可以将受控释放系统放置在组合物的靶附近，因而仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release，见上文，第2卷，第115-138页)。其他的受控释放系统在Langer,1990,Science249:1527-1533的综述中进行了讨论。
可注射制品可包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、点滴注射等的剂量形式。可以通过已知的方法制备这些可注射制品。例如，通过在常规用于注射的无菌水性基质中或油性基质中溶解、悬浮或乳化上述抗体或其盐，来制备可注射制品。作为用于注射的水性基质，有例如生理盐水、含有葡萄糖和其他佐剂的等渗溶液等，其可与恰当的助溶剂组合使用，例如醇类(例如乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂【例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)】等。作为油性基质，使用例如芝麻油、豆油等，其可与助溶剂组合使用，如苯甲酸苄酯、苯甲醇等。如此制备的注射液优选装填在恰当的安瓿中。
有利地，将上述用于口腔或不经肠道使用的药物组合物制备成适合活性成分的一次剂量的单位剂量的剂型。这类单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。
剂量
可以施用给对象的活性成分(例如，IL-6拮抗剂、VEGF拮抗剂、EGFR拮抗剂等)的量一般是治疗有效量。如本文中使用的，词组“治疗有效量”意指当施用给具有肿瘤的动物时，相对于阴性对照，导致肿瘤生长或重量减少至少5％的抗原特异性结合蛋白和/或抗原结合分子的剂量(参见例如本文的实施例1)。例如，IL-6R特异性结合蛋白、VEGF特异性结合蛋白和/或EGFR特异性结合蛋白的“治疗有效量”包括例如这类抗原特异性结合蛋白的这样的量，当向具有肿瘤的动物施用所述量时，导致肿瘤生长或重量相对于阴性对照治疗的动物减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％或100％。
在本发明的抗原特异性结合蛋白的情况下(例如，抗IL-6R抗体、抗EGFR抗体、抗ErbB3抗体和/或VEGF-Trap分子)，治疗有效量可以是从约0.05mg至约600mg；例如，约0.05mg、约0.1mg、约1.0mg、约1.5mg、约2.0mg、约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约200mg、约210mg、约220mg、约230mg、约240mg、约250mg、约260mg、约270mg、约280mg、约290mg、约300mg、约310mg、约320mg、约330mg、约340mg、约350mg、约360mg、约370mg、约380mg、约390mg、约400mg、约410mg、约420mg、约430mg、约440mg、约450mg、约460mg、约470mg、约480mg、约490mg、约500mg、约510mg、约520mg、约530mg、约540mg、约550mg、约560mg、约570mg、约580mg、约590mg或约600mg的各种抗原特异性结合蛋白。例如，根据其中施用抗IL-6R抗体(例如，本文讨论的mAb1)的某些特定实施方案，可以向对象施用剂量为100mg、150mg或200mg的抗体(例如，频率为每周1次、每两周1次等)。
可以用每千克患者体重的抗体毫克数(即，mg/kg)表示包含在单次剂量中的本发明的抗原特异性结合蛋白的量。例如，可以向患者施用剂量为约0.0001至约50mg/kg患者体重(例如0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、5.0mg/kg、10mg/kg、12.5mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、26mg/kg、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg等)的本发明的抗IL-6R抗体、抗EGFR抗体、抗ErbB3抗体和/或VEGF-Trap分子。根据某些示例性的实施方案，在特定剂量中，向患者施用的VEGF-Trap分子的量是4mg/kg或6mg/kg。
活性成分(例如，抗IL-6R抗体、抗EGFR抗体、抗ErbB3抗体和/或VEGF-Trap分子)可以等量存在于本发明的组合物中，或者可选的，可以0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5或更多倍数不同于彼此的量存在。本领域的普通技术人员使用常规实验可以确定，为了产生理想的治疗效果，本发明的组合物中的单个组分所必需的恰当的量。
施用方案
根据本发明的某些实施方案，可以在定义的时间段内，向对象施用多次剂量的本发明的组合物(例如，包含IL-6拮抗剂、VEGF拮抗剂和/或EGFR拮抗剂的组合物)。根据本发明该方面的方法包括向对象顺序施用多次剂量的本发明的组合物。如本文中使用的，“顺序施用”意指在不同的时间点，例如在相隔预定的间隔(例如，数小时、数天、数周或数月)的不同天向对象施用每次剂量的本发明的组合物。本发明包括这样的方法，所述方法包括向患者顺序施用初始剂量的本发明的组合物，随后施用一次或多次第二剂量的组合物，和任选地随后施用一次或多次第三剂量的组合物
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”指施用本发明组合物的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也被称为“基线剂量”)；“第二剂量”是在初始剂量之后施用的剂量；“第三剂量”是在第二剂量之后施用的剂量。初始、第二和第三剂量都可以含有相同量的活性成分，但一般在施用频率上彼此不同。然而，在某些实施方案中，包含在初始、第二和/或第三剂量中的活性成分的量将随治疗过程彼此不同(例如，恰当地调高或调低)。
在本发明的一个示例性实施方案中，在上一次剂量1至30天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多天)后施用每次第二和/或第三剂量。如本文中使用的，词组“上一次剂量”意指在多次施用顺序中，在施用顺序中的下一次剂量之前向对象施用的本发明组合物的剂量，之间没有插入剂量。
根据本发明该方面的方法可包括向患者施用任何数量的第二和/或第三剂量的本发明组合物。例如，在某些实施方案中，仅向患者施用一次第二剂量。在其他实施方案中，向患者施用两次或多次(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多次)第二剂量。同样的，在某些实施方案中，仅向患者施用一次第三剂量。在其他实施方案中，向患者施用两次或多次(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多次)第三剂量。
在涉及多次第二剂量的实施方案中，每个第二剂量可以与其他第二剂量相同的频率施用。例如，可以在上一次剂量1至29天后施用每个第二剂量。类似的，在涉及多次第三剂量的实施方案中，每个第三剂量可以与其他第三剂量相同的频率施用。例如，可以在上一次剂量1至60天后施用每个第三剂量。可选的，向患者施用第二和/或第三剂量的频率可以随治疗方案的过程而改变。还可以在临床检验后，由医生根据每个患者的需要在治疗过程中调整施用频率。
实施例
下列实施例的提出是为本领域普通技术人员提供关于本发明的方法和组合物如何制备和使用的完整公开和说明，而并非意在限制发明人视为其发明的范围。对于所使用的数值(例如，量、温度等)，已努力确保其精确性，但也应该考虑一些实验错误和偏差。除非另外指出，部分是按重量计的部分，分子量是平均分子量，温度是按摄氏度计，压力是大气压或接近大气压。
实施例1.抗IL-6R单克隆抗体作为单一活性剂和与其他抗肿瘤剂的组合抑制肿瘤异种移植物生长
治疗剂
该实施例证实了向具有肿瘤的小鼠单独施用抗IL-6R抗体或与VEGF-Trap、抗EGFR抗体或抗ErbB3抗体组合施用抗IL-6R抗体。该实施例中使用的抗IL-6R抗体在本文中也被称为“抗IL-6R mAb1”，是包含分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和分别具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的抗体(即，在美国专利号7,582,298中被称为VQ8F11-21的抗IL-6R抗体)。用于该实施例中的VEGF-Trap是2个融合多肽的二聚体，每个融合多肽包含：(1)包含SEQ ID NO:11的第27至129位氨基酸的VEGFR1组分；(2)包含SEQ ID NO:11的第130至231位氨基酸的VEGFR2组分；和(3)包含SEQ ID NO:11的第232至457位氨基酸的多聚化组分(“FcΔC1(a)”)(即，在美国专利号7,396,664中被称为VEGFR1R2-FcΔC1(a)的VEGF-Trap)。用于该实施例中的抗EGFR抗体在本文中也被称为“抗EGFR mAb2”，是针对人EGFR/ErbB1/HER1的胞外结构域生成的完整的人抗体。用于该实施例中的抗ErbB3抗体也被称为“抗ErbB3mAb3”，是针对ErbB3生成的完整的人抗体(即，在2012年9月21日提交的美国专利申请号13/623,885中被称为H4H1821N的抗体)。
实验方法和结果
作为初步实验，用(i)10μg/ml人Fc对照蛋白(“hFc”)，(ii)10μg/ml抗IL-6R mAb1，(iii)10ng/ml IL-6加10μg/ml hFc，或(iv)10ng/ml IL-6加10μg/ml抗IL-6R mAb1处理培养的A549、Calu3和Du145细胞。向培养的细胞中添加人Fc或抗IL-6R mAb116小时，并向hFc或抗IL-6R mAb1预处理的细胞中添加IL-630分钟。然后裂解细胞，实施Western印迹，评估磷酸化-STAT3和总STAT3的水平。如图1所示，所有3个肿瘤细胞系都表现出组成性和IL-6-诱导性的磷酸化-STAT3，其被抗IL-6R mAb1抑制。
之后，测试抗IL-6R mAb1、VEGF-Trap或抗IL-6R mAb1加VEGF-Trap的组合对Du145人前列腺癌细胞生长的效果。简而言之，向6-8周龄SCID小鼠(Taconic,Hudson,NY)的侧腹皮下植入5x106个Du145细胞(ATCC)。在肿瘤达到～200mm3的平均体积后，将小鼠随机分入处理组(n＝5只小鼠/组)。向小鼠施用人Fc对照蛋白(25mg/kg)、抗IL-6R mAb1(25mg/kg)、VEGF-Trap(25mg/kg)或抗IL-6R mAb1加VEGF-Trap的组合(25+25mg/kg)。所有蛋白质都通过皮下注射施用，每周2次。在实验过程中，每周测量肿瘤体积2次(在植入后第35、39、42、46、49、53、56、60、63和67天)。计算每组从治疗开始时的平均肿瘤生长。与Fc对照组相比，计算肿瘤生长的百分比减少。结果概括在表1中。
表1：SCID小鼠中的Du145肿瘤异种移植物生长的抑制
对构成表1概括的结果的原始数据的分析验证了以下结论，即：相比在单独用抗IL-6R mAb1处理的小鼠中观察到的降低，在用抗IL-6R mAb1+VEGF-trap组合处理的小鼠中观察到的肿瘤生长降低是统计学显著的(p＝0.0004)。
从用hFc(25mg/kg)或抗IL-6R mAb1(25mg/kg)处理的小鼠中切出Du145肿瘤，并切片。用磷酸化-STAT3或切割的caspase3(作为凋亡标志物)特异性的抗体实施免疫组化。用抗IL-6R mAb1处理的肿瘤表现出较少的磷酸化-STAT3染色，和增加的切割的caspase3染色，提示Du145肿瘤具有活跃的IL-6/STAT3信号传递，该信号传递有助于肿瘤细胞存活。这提示了IL-6为肿瘤细胞提供存活信号。
在下一个实验中，测试了抗IL-6R mAb1，抑制性抗EGFR抗体(“抗EGFR mAb2”)，或抗IL-6R mAb1加抗EGFR mAb2的组合对Calu3人肺腺癌异种移植物生长的效果。简而言之，向6-8周龄SCID小鼠(Taconic,Hudson,NY)的侧腹皮下植入5x106个Calu3细胞(ATCC)。在肿瘤达到150-200mm3的平均体积后，将小鼠随机分入处理组(n＝5只小鼠/组)。向小鼠施用人Fc对照蛋白(25mg/kg)、抗IL-6R mAb1(12.5mg/kg)、抗EGFR mAb2(12.5mg/kg)或抗IL-6R mAb1加抗EGFR mAb2的组合(12.5+12.5mg/kg)。所有蛋白质都通过皮下注射施用，每周2次。在实验过程中，每周测量肿瘤体积2次(在植入后第34、37、41、44、48、51、54和57天)，在结束实验切出肿瘤时确定肿瘤重量。计算每组从治疗开始时的平均肿瘤生长和肿瘤重量。与Fc对照组相比，计算肿瘤生长和肿瘤重量的百分比减少。结果概括在表2和3中。
表2：SCID小鼠中的Calu3肿瘤异种移植物生长的抑制
表3：SCID小鼠中的Calu3肿瘤异种移植物重量的改变
对构成表2概括的结果的原始数据的分析验证了以下结论，即：相比在单独用抗IL-6R mAb1(p<0.0001)或单独用抗EGFR mAb2(p＝0.0005)处理的小鼠中观察到的降低，在用抗IL-6R mAb1+抗EGFR mAb2组合处理的小鼠中观察到的肿瘤生长降低是统计学显著的。
在下一个实验中，测试了抗IL-6R mAb1，抑制性抗ErbB3抗体(“抗ErbB3mAb3”)，或抗IL-6R mAb1加抗ErbB3mAb3的组合对A549人肺腺癌异种移植物生长的效果。简而言之，向6-8周龄SCID小鼠(Taconic,Hudson,NY)的侧腹皮下植入1x107个A549细胞(ATCC，货号CCL-185)。在肿瘤达到400mm3的平均体积后，将小鼠随机分入处理组(n＝6只小鼠/组)。向小鼠施用人Fc对照蛋白(25mg/kg)、抗IL-6RmAb1(12.5mg/kg)、抗ErbB3mAb3(12.5mg/kg)或抗IL-6R mAb1加抗ErbB3mAb3的组合(12.5+12.5mg/kg)。所有蛋白质都通过皮下注射施用，每周2次。在实验过程中，每周测量肿瘤体积2次(在植入后第59、62、66、69、74、77、80、83、87和90天)，在结束实验切出肿瘤时确定肿瘤重量。计算每组从治疗开始时的平均肿瘤生长和肿瘤重量。与Fc对照组相比，计算肿瘤生长和肿瘤重量的百分比减少。结果概括在表4和5中。
表4：SCID小鼠中的A549肿瘤异种移植物生长的抑制
表5：SCID小鼠中的A549肿瘤异种移植物重量的改变
最后，研究了抗IL-6R mAb1对A549人肺腺癌异种移植物生长的效果。简而言之，向6-8周龄SCID小鼠(Taconic,Hudson,NY)的侧腹皮下植入5x106个A549细胞(ATCC，货号CCL-185)。在肿瘤达到～100mm3的平均体积后，将小鼠随机分入处理组(n＝5只小鼠/组)。向小鼠施用人Fc对照蛋白(25mg/kg)、抗IL-6R mAb1(2.5mg/kg)或抗IL-6R mAb1(25mg/kg)。所有蛋白质都通过皮下注射施用，每周2次。在实验过程中，每周测量肿瘤体积2次。计算每组从治疗开始时的平均肿瘤生长。与Fc对照组相比，计算肿瘤生长的百分比减少。结果概括在表6中。
表6：SCID小鼠中的A549肿瘤异种移植物生长的抑制
结论
该实施例示例了抗IL-6R mAb1作为单一活性剂抑制Du145、Calu3和A549肿瘤异种移植物的生长。此外，抗IL-6R mAb1加VEGF-Trap的组合治疗比任一个单一活性剂更有力地抑制了Du145肿瘤异种移植物的生长。以及抗IL-6R mAb1加抑制性抗EGFR抗体(抗EGFR mAb2)的组合治疗比任一个单一活性剂更有力地抑制了Calu3肿瘤异种移植物的生长。
这些结果显示，抗IL-6R mAb1优先抑制表现出自分泌型IL-6/STAT3信号传递的肿瘤的生长，提示了这样的可能性，即，肿瘤活组织检查的IL-6和/或磷酸化-STAT3水平的免疫组化分析可能可用于鉴别最可能受益于抗IL-6R治疗的患者。此外，抗IL-6R mAb1减少肿瘤异种移植物中的磷酸化-STAT3并增加切割的caspase-3水平，提示IL-6/STAT3信号传递有助于肿瘤细胞存活。
实施例2.抗IL-6R单克隆抗体与VEGF拮抗剂的组合抑制抗VEGF抗性肿瘤的生长
介绍
通过在体内存在VEGF-Trap的条件下连续传代，分离A431人表皮样癌细胞系的具有VEGF Trap效应抗性的变体。变体细胞系在本文中被称为“A431-V2”，亲代A431细胞系在本文中被称为“A431-P”。
首先进行评估相比A431-P细胞系，A431-V2细胞系表达的IL-6的相对水平的实验。出于该目的，收集来自培养的A431-P或A431-V2细胞的条件培养基，并实施ELISA以测量人IL-6的浓度。如图2(a)所示，A431-V2表达比亲代A431细胞系高得多的IL-6水平(178pg/ml vs29pg/ml)。
然后，测量变体和亲代A431细胞中的磷酸化-STAT3的水平。具体而言，用人Fc(10μg/ml)或抗IL-6R mAb1(10μg/ml)处理培养的A431-P和A431-V2细胞。制备细胞裂解液，并实施Western印迹以评估磷酸化-STAT3的水平。如图2(b)所示，相比A431-P细胞，A431-V2细胞中的磷酸化-STAT3的基础水平是增加的，并被抗IL-6R mAb1处理显著降低。
根据上述实验观察结果，该实施例然后测试了包含完整人抗IL-6R抗体加VEGF-Trap的组合治疗对A431-V2肿瘤异种移植物生长的效果。
实验方法和结果
简而言之，向6-8周龄SCID小鼠(Taconic,Hudson,NY)的侧腹皮下植入1x106个A431-V2细胞。在肿瘤达到～200mm3的平均体积后，将小鼠随机分入处理组(n＝5只小鼠/组)。向小鼠施用人Fc对照蛋白(25mg/kg)、抗IL-6R mAb1(25mg/kg)、VEGF-Trap(25mg/kg)或抗IL-6R mAb1加VEGF-Trap的组合(25+25mg/kg)。所有蛋白质都通过皮下注射施用，每周2次。在实验过程中，每周测量肿瘤体积2次(在植入后第15、18、22、25和28天)。计算每组从治疗开始时的平均肿瘤生长。与Fc对照组相比，计算肿瘤生长的百分比减少。结果概括在表7中。
表7：SCID小鼠中的A431-V2肿瘤异种移植物生长的抑制
构成表7概括的结果的原始数据的分析验证了以下结论，即：相比在单独用抗IL-6R mAb1(p＝0.0001)或单独用VEGF-trap(p＝0.0041)处理的小鼠中观察到的肿瘤生长的改变，在用抗IL-6R mAb1+VEGF-trap组合治疗的小鼠中观察到的肿瘤生长降低是统计学显著的。
结论
如该实施例所示，A431-V2肿瘤对VEGF-Trap单一活性剂治疗具有抗性，相对于对照治疗对象，仅产生36％的肿瘤生长减少。然而，这些肿瘤响应抗IL-6R mAb1加VEGF-Trap组合治疗，提示IL-6对A431-V2肿瘤的VEGF-Trap抗性表型有贡献。初步数据指出，A431-V2肿瘤中增加的IL-6信号传递不阻止VEGF-Trap减少肿瘤血管供应的能力，提示当肿瘤血管系统的功能受损时，IL-6信号传递增强了肿瘤细胞增殖和/或存活的能力。该观察结果还与抗IL-6R mAb1加强VEGF-Trap在Du145肿瘤中的效应的能力一致(参见实施例1)。
总而言之，上文展示的数据指出IL-6/STAT3信号传递的水平可用于鉴别抗VEGF抗性肿瘤，并且IL-6拮抗作用(例如，用抗IL-6R mAb1治疗)是用于治疗多种癌症类型的有效治疗对策，不论是作为单一活性剂或与VEGF拮抗剂组合，尤其是在抗VEGF抗性肿瘤的上下文中。
本发明不限于本文所述具体实施方案的范围。实际上，除本文所述外，根据上述说明书和附图，本发明的多种修饰对本领域技术人员而言是显而易见的。这类修饰预期落入所附权利要求的范围内。

Claims (40)

1.包含抗IL-6R抗体或其抗原结合片段的药物组合物，所述药物组合物用于抑制或减弱对象中的抗VEGF抗性肿瘤的生长。
2.包含抗IL-6R抗体或其抗原结合片段的药物组合物，所述药物组合物用于抑制或减弱对象中的肿瘤生长，其中肿瘤表现出增加的IL-6/STAT3信号传递。
3.权利要求1或2的药物组合物，其中抗IL-6R抗体或其抗原特异性结合片段包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中HCVR包含SEQ ID NO:2的互补决定区(CDR)，且其中LCVR包含SEQ ID NO:3的CDR。
4.权利要求3的药物组合物，其中HCVR包含具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的CDR；且其中LCVR包含具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的CDR。
5.权利要求1至4中任一项的药物组合物，还包含EGFR拮抗剂。
6.权利要求5的药物组合物，其中EGFR拮抗剂选自由抗EGFR抗体、抗EGFRvIII抗体、抗ErbB2抗体、抗ErbB3抗体，和抗ErbB4抗体组成的组。
7.权利要求1至4中任一项的药物组合物，还包含VEGF拮抗剂。
8.权利要求7的药物组合物，其中VEGF拮抗剂是特异性结合VEGF的抗原特异性结合蛋白。
9.权利要求8的药物组合物，其中抗原特异性结合蛋白是包含VEGFR1的Ig结构域2、VEGFR2的Ig结构域3，和多聚化结构域的融合蛋白。
10.权利要求9的药物组合物，其中VEGFR1的Ig结构域2包含SEQID NO:11的第27至129位氨基酸，VEGFR2的Ig结构域3包含SEQ IDNO:11的第130至231位氨基酸，并且多聚化结构域包含SEQ ID NO:11的第232至457位氨基酸。
11.用于抑制或减弱对象中的抗VEGF抗性肿瘤的生长的方法，所述方法包括向对象施用IL-6拮抗剂和VEGF拮抗剂。
12.癌症治疗方法，包括：(i)测量来自对象的肿瘤活组织检查中的IL-6/STAT3信号传递的水平；和(ii)如果肿瘤活组织检查表现出增加的IL-6/STAT3信号传递，则向对象施用IL-6拮抗剂。
13.权利要求12的方法，还包括向对象施用VEGF拮抗剂。
14.权利要求11或12的方法，其中IL-6拮抗剂是特异性结合IL-6的抗原特异性结合蛋白。
15.权利要求14的方法，其中抗原特异性结合蛋白是抗IL-6抗体或其抗原结合片段。
16.权利要求11或12的方法，其中IL-6拮抗剂是特异性结合IL-6受体(IL-6R)的抗原特异性结合蛋白。
17.权利要求16的方法，其中抗原特异性结合蛋白是抗IL-6R抗体或其抗原结合片段。
18.权利要求17的方法，其中抗IL-6R抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中HCVR包含SEQ IDNO:2的互补决定区(CDR)，且其中LCVR包含SEQ ID NO:3的CDR。
19.权利要求18的方法，其中HCVR包含具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的CDR；且其中LCVR包含具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的CDR。
20.权利要求11或13的方法，其中VEGF拮抗剂是特异性结合VEGF受体的抗原特异性结合蛋白。
21.权利要求20的方法，其中VEGF受体是VEGFR1或VEGFR2。
22.权利要求21的方法，其中抗原特异性结合蛋白是抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段。
23.权利要求21的方法，其中抗原特异性结合蛋白是抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段。
24.权利要求11或13的方法，其中VEGF拮抗剂是特异性结合VEGF的抗原特异性结合蛋白。
25.权利要求24的方法，其中抗原特异性结合蛋白是抗VEGF抗体。
26.权利要求24的方法，其中抗原特异性结合蛋白是包含VEGFR1的Ig结构域2、VEGFR2的Ig结构域3，和多聚化结构域的融合蛋白。
27.权利要求24的方法，其中VEGFR1的Ig结构域2包含SEQ IDNO:11的第27至129位氨基酸，VEGFR2的Ig结构域3包含SEQ ID NO:11的第130至231位氨基酸，并且多聚化结构域包含SEQ ID NO:11的第232至457位氨基酸。
28.用于抑制或减弱对象中的抗VEGF抗性肿瘤的生长的方法，方法包括向对象施用IL-6拮抗剂和VEGF拮抗剂；
其中IL-6拮抗剂是抗IL-6R抗体或其抗原结合片段，所述抗IL-6R抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的重链互补决定区(HCDR)；且包含含有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的轻链互补决定区；和
其中VEGF拮抗剂是包含SEQ ID NO:11的第27至457位氨基酸的VEGF特异性结合蛋白。
29.用于确定具有肿瘤的患者是否具有抗VEGF抗性肿瘤的方法，方法包括测量来自对象的肿瘤活组织检查中的IL-6/STAT3信号传递的水平，其中肿瘤活组织检查中增加的IL-6/STAT3信号传递将患者鉴别为具有抗VEGF抗性肿瘤。
30.权利要求29的方法，所述方法还包括如果发现肿瘤活组织检查表现出增加的IL-6/STAT3信号传递，则向患者施用IL-6拮抗剂。
31.权利要求29的方法，所述方法还包括如果发现肿瘤活组织检查表现出增加的IL-6/STAT3信号传递，则向患者施用IL-6拮抗剂和VEGF拮抗剂。
32.用于抑制或减弱对象中的肿瘤生长的方法，方法包括向对象施用IL-6拮抗剂和EGFR拮抗剂。
33.权利要求32的方法，其中IL-6拮抗剂是特异性结合IL-6的抗原特异性结合蛋白。
34.权利要求33的方法，其中抗原特异性结合蛋白是抗IL-6抗体或其抗原结合片段。
35.权利要求32的方法，其中IL-6拮抗剂是特异性结合IL-6受体(IL-6R)的抗原特异性结合蛋白。
36.权利要求35的方法，其中抗原特异性结合蛋白是抗IL-6R抗体或其抗原结合片段。
37.权利要求36的方法，其中抗IL-6R抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中HCVR包含SEQ IDNO:2的互补决定区(CDR)，且其中LCVR包含SEQ ID NO:3的CDR。
38.权利要求37的方法，其中HCVR包含具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的CDR；且其中LCVR包含具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的CDR。
39.权利要求32的方法，其中EGFR拮抗剂选自由抗EGFR抗体、抗EGFRvIII抗体、抗ErbB2抗体、抗ErbB3抗体，和抗ErbB4抗体组成的组。
40.权利要求39的方法，其中抗原特异性结合蛋白是抗EGFR抗体或其抗原结合片段。
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