SK264092A3 - Recombinant-virus of poultry mallpox - Google Patents

Description

Rekombinsntní vir drilbežích nešťovio j

I

Oblast techniky —'

Tento vynález se týká rekombinantního víru dräbežích neštovic (FPV), špecifických vektord, nových silných promótor ii, nových hostitalských kmenú. FPV a také zpúsobu r q kombinantní prípravy proteinú.

Dosavadní stav techniky

Vír drúbežích neštovic, typický člen virú. ptačioh neštovio, má typickou strukturu neštovicového víru. Molekulová hmota vírového genomu je ohľadov ána na 200 až 240 000 000.

Neštovice ptákú, i když jsou celosvetové rozšírený, nejsou považovaný za. obecný zdravotní problém, protože oblast hosti telil víril ptečích neštovic je omezena na ptáky a vylučuje savoe· Po infekci hostitele začína replikace vírové DNA, po syntéze časných proteiná, mezi 60 a 96 hodinami po infekci a nasleduje syntéza pozdních proteinú· K sestaveni infekčních virionú dochází mezi 72 a 96 hodinami.

K rustu FPV v tkánové kultuŕe bunék dochází u fibroblastových bunék kučecího zárodku (CEP), u kožních (dermálnioh) bunék kurecího zárodku a u fibroblastových bunék kachniho zárodku (DEF). Vírový cyklus je v tkánové kultufe podobný a zdá se být v kul tufe rýchlejší než u ptákil. V bunkách OED začíná replikace DNA mezi 12 a 16 hodinou, infekční vírové častice se objevují poprvé po 16 hodinách a jsjich počet stoapá až do 43 hodín po infekci·

Pro vírus vekcinie (W), typický člen víru skupiny neštovio, (Panicali a Paoletti» Proc. Netl· Acad. Sci. , 22.

4927 až 493i (1932) s také Mackett a spol.í Proc. Netl.

Acad. Sci. 7>· 7415 až 7419 (1932).) by Ja podie uvedených citací vyvxnutaf znárn^ technik^, jako in vivo rekombinace, která umožňuje inzerci cizí DNA do genomu víru vakcínie místné špecifickou rekombinací. Tato technika vede k

- 2 použití viru vakclnie jako eukaryotiokého expresnlho vektoru pro vytvorení živých. rekombinantnlch vakcín. Konstrukče rekomblnantních virú neätovie se obvykle provádí inseroí cizlch genú. do oblastí vírového genomu, které nejsou podstatné pro rúst v bunéóné kul túre. Pro rekombinantní víry vakclnie je takovým nepodstatným mlstern (NES) gen thymidinkinasy (tk), který nsvío umožňuje výbér tk-negativních rekombinantní ch virú.

Pri konstruovánl rekombinantního FPV ee používaj! stejné zásady jako jsou ty, které jsou popsány u rekombinantnlho víru vakclnie. Je popa áno né kolík nepodstatných mís t zahrň*· jící gen thymidinkinasy viru drábežích neštovio u kmene FPV-M3 (Boyle a Coupsr: PGT/srpen 1987í 00523» Boyle a Coupar» Vírus Res. 10. 543 (1988).), oblast s fragmentom PvuII o 900 párech nukleotidú pŕírodního viru kmene FP-1 (Taylor a spol.: Vaccine 6, 497 až 503 a 503 až 5θ8 (1988)·) a intergenová oblast mezi otevrenou čtecí oblastí orf 7 a otevrenou čteoí oblasti orf 9 (Drillien a spol.t Virology 160» 203 až 209 (1937), Spehner a spol·t J· Vlrol. 64, 527 až 553 (1990).).

V nedávné dob nékolik skupín popsalo koostrukci rekombinantú FPV. Noboru a spol. popisujl v evropském patentu 284 416 četná genomová ineertní místa, ktorá nejsou podstatná pro rást FPV v tkánové kultufe. Paoletti popisuje v PGT/JO 89/03429 vektory pro prípravu FPV rekombinantä. Objevili expresi génu kodujlcích cizí antigény pod kontrolou ruzných promotorú vakclnie. Dále pak Binns a spol. v PCT/KO 90/04638 popisuj! četné FPV promotory používajíoí dočasnou analýzu s β-galaktosidasou. Dreillen a Spehner popisujl v v evropském patentu č. 314 569 konstruknl FPV rekombi^an^fiú. obsahujících gen, který kóduje spálový F proteín za kontroly promotorem vakclnie. Tento gon byl vložen do FPV genomu v místé, které nenl podstatné pro r&st v tkánové kultufe·

Cohen a Panicalli v PCT/WO-9O/O2191 popisujl rekombinantní vir drúbežích nežtovic, který je sohopen expres!

poskytovať iiaunogenní protein pathogenú. Tento rekombinantní FPV poskytuj© živou vakcínu pro drúbež a další zvíŕata.

Podstata vynálezu

Autori tohoto vynálezu si uvšdomili, že prítomnosť neporušeného génu thimidin-kinasy je v FPV kmeňu HP1.441 potrebná pro to, aby se zíekaly stabilní rekombinanty s pŕedpoveditelnými genomy.

Až do dnešní doby nebylo vedecky objasnšno do jakého rozsahu je tk-gen podstatný pro rúzné FPV-kmeny. Pro pŕekonáni této nejistoty autori tohoto vynálezu zkoumali další místa pro vložení cízí DNA. Zjistili, že intergercvá oblást ipezi neporušeným tk—genem a 3*otevŕenou čtecí oblasti je výhodným místem pro inserci. Podie tohoto vynálezu se získávají také nové FPV hostitelské kmeny, které byly modifikovány tak, aby obsahovály thymidin-kinasový gen viru vakcinie a lacZ gen E.ooli, jako nové ne-podstatné místo. Tím je umožnéno použít jakýkoliv insertni plasmid, který nese oblasti obklopující tk viru vakcinie. Podie tohoto vynálezu se také získavají nové silné promotory a četné výhodné plasmidové konstrukce.

Aby se ukázaly výhody podie tohoto vynálezu, byly zkonstruovány FPV insertní plasmidy, které jako mlsto inserce génu ciziho markeru používaj! buJ neporušený gen virové thymidin-kinasy nebo intergénovou oblast mezi neporušeným tkgenem a 3*otevŕenou čtecí oblastí. Analýza genomových struktur rekombinsntú odvozených od obou ty pá pokusú ukázala, že stabilní rekombinanty s pŕedpovéditelnými genomy byly získány pouze v prítomnosti neporušeného génu thymidinkinasy. Tento výsledek jasné ukazuje, že FPV tk-gen je podstatný ve 8vé celistvosti pro rust viru v bunečné kultuŕe.

V následujíci části Jsou stručná ^oggá^ g^^^en^gbiázky.

Obrázek li Konštrukční schéma íviru drúbežích neštovic, pFP-UV2 a pFP-UV2-PT. Zkratky máji následující významy: FFV—tk znamená gen thymidin-kinasy viru drúbežích neštovic,

- 4 W-tk znamená gen thymidin-kinasy víru vekoínie. Pil znamená promotor hlavniho pozdniho polypeptidu víru vakcinie o molekulové hmoté 11 000, P7.5 znamená polypeptid viru vakclnie o molekulové hmoté 7 500, lacZ znamená E.coli gen kodujlci β-galaktosidasu (sipky označuj! smery transkripce).

Obrázky 2A až 201 Southernova blotová analýza FPV rekombinantá odvozených od insertniho plasmidu pFP-UV2—P'ľ. Celková DNA byla pripravene z infektovenýoh bunek, rozštépena pôsobením EooRI, oddélena na 1% agarosovém gélu a prenesene ne nitrocelulosovou membránu. Membrána byla hybridizována ^²P značenou FPV tk-genovou sondou (obr. 2A), laoZ génovou sondou (obr. 2B) a protrombinovou génovou sondou (obr, 2C). Pásy 1 až > ve všech obrázcioh znamenaj! DNA z EPV rekombinantu f-PTl-blue v ražných stadilch čistení plaku (5·» 5*» 7., 9· a 11· kolo). Pás 6 ukazuje jiný isolát, f-PT2—blue. Pásy 7, 3 a 9 ukazuj! isoláty FPV pŕirodnlho a dvou nezávislých bilých plakú (f-PT-white 1 s 2). Jako negatívni kontrole j o v pásu 10 uvedená fibroblastová DNA kuŕeoiho zárodku. Špička šípky na obrázku 2A smeruje na pás FPV pŕirodnlho tk-genu. Hodnoty uvedené na pravé strané odpovldají štandardám v pároch nukleotidú (pn).

Obrázek 3A« Štruktúra tk-mlsta pŕirodnlho a mutovaného viru. Jsou ukázána umlsténl FPV tk-genu ve fragmentu EcoRI o 5500 párech nukleotidú a ve fragmentu BamHI/Clal o 2480 pároch nukleotidú (Jediné misto Nool ve stredu kodujlci oblasti tk-genu bylo použito pro zkonstruovánl insertniho vektoru pFP-UV2.). Bezprostredné po améru vlákne tk-genu byle intergenová oblast modifikováne a zvétšena oligonukleotidem rizenou rautageDesi. Zústalo tak j'orf a samotný tk-gen neporušený. Současné byl zaveden transkripčnl stop signál a nékolik vhodných restrikčnlch mlst.

Obrázek 53’ Sekvence FPV pŕirodnlho typu 8 modifikované intergeaové oblasti, kodifikovaná intergenová oblast je prítomna v rekombiantním plasmidu pi Km a v jeho derivátech.

Obrázek 4A a 4Bi Konstrukce FPV insertnich plasmidú pTKmsPll-gpt, pTKm-Wtka a pTKm-UVtkb. Podrobnosti konstruk— ce jsou popsány v experimentálni části. sPll znamená syntetický pozdni promotor viru vakcinie odvozený od promotoru hlavniho pozdniho polypeptidu vakoínie o molekulové hmoté 11 000, 3* orf znamená otevŕenou čteoi o Has t po sméru vlákna tk-genu viru drúbežíoh neštovic, gpt znamená E.ooli gen kodujíci enzým xanthin-guanin-fosforibosyl-trsnsferasu. Dalši skratky znamenaji stejné jako je to shora uvedeno v popisu obrázku 1. šipky označuji smer transkripce.

Oblast 51 Southernova blotová analýza DNA rozstépené fW púsobenim EooRI vyčištených/rekombinantú f-sPllč.l a FPV pŕirodniho typu virové DNA. A) í Blot je hybridizován FPV t k-génovou sondou. Pás 1 znamená DNA FPV rekombinantu f-sPll č.l, pás 2 znamená DNA FPV pŕirodniho typu viru HP1.441, pás 5 znamená lambda DNa rozštepenou púsobenim Hind III. B): Blot byl hybridizován sondou gpt-genu. Pás 1 znamená lambda DNA rozstépenou púsobenim Hind ΙΠ, pás 2 znamená DNA FPV rekombinantu f-sPll č.l, pás 3 znamená DNA FPV pŕirodniho typu viru HP1.441. C): Blot byl hybridizován sondami lacZ génu a fágové lambda DNA. Pás 1 znamená lambda DNA rozštšpenou púsobenim HindlII, pás 5 znamená DNA FPV pŕirodniho typu viru HP1.441 a pás 2 znamená DNA FPV rekombinantu f-sPll č.l (Hodnoty uvedené na pravé strane znamenaji štandardy v párech nuk<£eotidú (pn)Q.

Obrázaky 6A až 6Cx Southernova blotová analýza DNA FPV rekombinantu f-TK2a a f-TK2b. Bloty byly hybridizovány sondou FPV tk-genu (obrázek 6A), sondou VV-tk-genu (obrázek 6B) a sondou lacZ génu a lamda DNA (obrázek 60). Pásy 1 znamenaj! FPV pŕirodni DNA (HPl.^4-1) rozštepenou púsobenim Petl, pásy 2 znamenaj! f-TK2a DNA rozštšpenou púsobenim PstI, pásy 3 znamenaj! f-TK2b DNA rozštepenou púsobenim Pstl. pásy 4 znamenaj! FPV DNA pŕirodniho typu (HP1.44-1) rozštšpenou púsobenim Clal, pásy 5 znamenaji f-TK2a DNA rozštépenou púsobenim Clal, pásy 6 znamenaj! f-TK2b DNA rozštepenou púsobenim Clal, pásy 7 znamenaji FPV DNA pŕirodniho typu (HP1.441) rozštšpenou púsobenim EcoRI, pásy 8 znamenaji f-TK2a DNA rozštepenou pôsobením EcoRI, pásy 9 znamenaj!

- 6 f-TK2b DNA rozštiepenou pôsobením EcoRi, pásy 10 znamenaj! markerovou DNA, pásy 11 znamenaj! pTKm—Wtka DNA rozštépenou pôsobením EcoRi, pásy 12 znamenaj! pTKm-VVtkb DNA rozštépenou pôsobením EcoRi, pásy 15 znemenají pTKm-VVtka DNA rozštšpenou pôsobením Olal, pásy 14 znamena ji pTKm-Wtkb DNA rozštepenou pôsobením Olal a pásy 15 znamenaj! pTKm-Wtka DNA rozštépenou pôsobením PstI.

Obrázok 6D: Jsou uvedený reštrikční mapy štepení hostiteľského kmene f-TK2a víru drôbežích neštovic enzymy EcoRl_v PstI a Ciel, Čísla označuj* predpokladanou velikost fragmentô v tisícich, párú nukleotidú (pn). FPV-tk znamená gen thymidin-kinasy víru drôbežích neštovie, W-tk znamená gen thymidin-kinasy víru vakoíni^ sPll znamená syntetický Pil promotor, lacZ znamená E· coli lacZ gen a šípky označuj! smér transkripce.

Obrázek 6Eí Na tomto obrázku jsou uvedený reštrikční mapy Stépení hostiteľského kmene F-TK2b víru drôbežích. neštovie enzymy EcoRi, PstI a Clal. Ďalší íoformaoe a zkratä sou uvedený v popisu obrázku 6D.

Obrázek 7» Schematické znázornšní oblasti kolem mís ta FPV thymidin-kinasy (tk) pŕírodního typu víru 8 nových FPV hostiteľských kmeňu f-TK2a a f-TK2b. FPV hostiteľské kmeny vložily do intergenové oblasti mezi FPV tk-gen s 5*-otevŕenou čtecí oblast (orf) dva nové inserty, tk-gen víru vakcínie (W-tk) a lacZ gen E.coli (IecZ). Šípky označuj! smés transkripce príslušných genô.

Obrázek 3 s Konštrukční schéma promotorové části” plasmidô pFP-Zl a pFP-Z21. Tyto plasmidy byly zkonstruovány tak, jak je to uvedeno v grafu a jak je to pope no v experimentálni části. FPV-tk znamená gen thymidin-kinasy víru drôbežích neštovic, P7.5 znamená promotor génu proteinu víru vakcínie o molekulové hmoté 7 5θ°» PH znamená promotor génu polypeptidu viru vakcínie o molekulové hmoté 11 000, ssDNA znamená jednovláknovou Div A a šípky ozná č u j í smér transkripce.

Obrázek 9: Schéma konstrukce insertních plasmidá víru vakcinie pTZgpt-P2a a PTZgpt-P2b. Podrobnosti konstrukce jsou uvedený v grafu a popsány v experimentálni čýsti. Část použitých zkratek je uvedens v popisu obrázku 1, gpt znamená gen kodujicí E. coli xanthin-guanin-foeforibosyltransferasu a šípky označuj! smér transkripce.

Obrázek 10^ Sekvence FíV P2 promotoru a prvních deset kodoná génu P2. Zbytek A iniciačního kodonu (tučným typem) byl definován jako poloha *1. V polohách -6 až -2 je prítomna strední část sekvence pozdního promotoru viru vakcínie a v polohách -19 až -13 je píítomen stop kodon, stop signál časné BNA vakcinie. Sekvence, které se podobaj! minimálni v U nukleotidech kritické oblasti Časného promotoru vakcinie o 16 párech nuk^eotidá, jsou podi/Bženy. Oblast proti sméru vlákna jde až do polohy -174·. Oblast po smšru vlákna (30 nukleotidá sekvence kodující gen P2) se rozkládá od polohy +1 do polohy +30.

Obrázek lOBt Sekvence Neil-EcoRI fragmentu obsahujlei promotor FPV P2, gen P2 a oblast po smšru vlákna. Pro podtržené části viz popis u obrázku 10A. Oblast proti smeru vlákna sahá až do polohy -174. Sekvence kodující gen P2 se rozkládá od polohy +1 do polohy +399 a kóduje 135 aminokyselín. Vypočtená molekulová hmota génu P2 je 14 806. Oblast po smeru vlákna (415 párú. nukleotidú) je bohatá na A a T a neobsahuje otevrené čtecí oblasti kodující proteiny vétší než proteíny o molekulové hmoté 4 000.

Obrázek 111 Srovnání promotoru P2 s jinými promotory viru neétovic. Histogram ukazuje hladiny exprese β-galaktoaidasy indukované ráznými koncentraoemi promotor viru neštovio-laoZ. Byly pripravený cytoplasmové extrakty bunék CV-1 infektovaných. označenými re kombiné n tnimi viry e byla analyzována jejioh enzymová aktivita podie postupu, který je popsán v experimentálni části. Hladiny exprese rúzných rekombinantu. byly srovnávány se štandardní hladinou vFlsp (100 %)<

Obrázek 12: SDS-PAGE analýza bunšk CV-1 infektovaných nižnými rekombinanty vakcínie. Bunky byly infektovány podie postupu, který Je popsán v experimentálni části. Byly pripravený celkové rozpustné proteíny. Rdzná množství (5 ^ul a 10 /Ul) téchto proteind byla analyzována na 10% polyakrylamidovém gélu. Pásy 1 a 2 ukazuj í protein indukovaný pŕirodním virem vakcínie, pásy 3 a A ukazuj í proteíny indukované rekombinantem vakoínie vFle3, pásy 5 a 6 ukazuj! proteíny indukované virem vP2a, pásy 7 a 8 ukazuj! proteíny indukované W rekombi^ntem vP2b a pásy 9 a 10 ukazuj! proteíny indukované W rekombinantem várt. Referenční vír νΡΙββ (pásy 3 a 4) indukuje nový protein v oblasti mol Jalové hmoty 117 000 (nižší šipka), který nemdže být detegován v bunkách infektovaných pŕlrodním virem (pásy 1 a 2). Napojený protein

0-galaktOBidaea/P2 gen získaný s rekombinanty vP2a a vP2b (pásy 5 až 8) má molekulovou hmotu asi 130 000 (horní Šipka).

Obrázek 13A> Sohema konstrukce insertního plasmidu pFSgpt. Tyto plaemidy byly zkonstruovány postupom podie obrázku. Vysvetlení použitých zkratek je uvedeno pri pops^u obrázku 1.

Obrázek 13Β» Schéma násobného klonovacího mista pFSgpt. Translaôní stop kodony jsou uvedený tučným typem písma. Stop signál časné transkripoe víru neštovic je podtržen.

Obrázek 14á: Konstrukce insertních plasmidd pP2mxgpt obsahujících mutované sekvence P2 promotoru (mx). Oligonukleotidy kodující bučí prírodní nebo mutovanou P2 promotorovou sekvenci byly ligovány do pFSgpt. E.coli lacZ gen byl umís· tšn po smeru vlákna rdzných promotord. Vytvoŕily se tak promotorové testovací plasmidy pP2^gpt^lacZ/P2mx.l a P2mx,2 = » syntetické linkerové sekvence kodující P2 promotor. Vysvetlení dalších zkretek je uvedeno v popisu obrázku 1.

Obrázek 14B: Sekvence násobného klonovacího mista insertního plasmidu pP2mxgpt. Počáteční kodon a stop kodon translace jsou uvedený tičným písmem. Stop signál časné transkripce víru neštovic je podtržen.

Obrázek 15» Štruktúra pŕírodníoh a mutovaných promotorú. P2.

Obrázok 16» Srovnání P-gslaktosidasových aktivít indukovaných mutanty promotoru P2 v infektovaných bunkách GV—1 a to a) pozdní promotorové aktivity e b) čašník promotorové aktivity.

Obrázok 17 A: Konštrukční sohems insertních plesmidu víru vakcinie pTZgpt-Fle a pTZgpt-ΡΙΙΜ. Tyto plasmidy byly zkonstruovány podie popisu, který je uveden v experimentálni části. tk znamená gen thymidin-kinasy víru vakcinie, P?.5 znamená promotor génu proteinu víru vakcinie o molekulové hmotô 7 500» Pil znamená promotor génu proteinu víru vakcini® o molekulové hmoté U 000, P11& znamená mutovaný Pil promotor, fl ori znamená pocátek rAikace fl, gpt znamená E.coligpt gen (kodujlcí enzým xentbin-guanin^fosforibosyl-transferasu) a MCS znamená násobné klonovaci místo.

Obrázek 173» Schéma konstrukce promótorových testovacích vektoru pTZgpt-sPll, pTZgpt-s4b a pTZgpt-sart (pTZgpt-sPx). FFV-tk znamená gen thymidin-kinasy viru drňbežích neštovic» P7.5 znamená promotor génu proteinu viru vakcinie o molekulové hmote 7 500, -sPx označuje príslušné sekvence syntetického linkeru sPll₀ 54 b e sart použité pro zkonstruování promotor <1. gpt znamená E.coli gpt gen (kódujlei enzým xanthin»guanin-íosforibosyl-transferasu) a šípky ozná čuji smer transkripce.

Obrázek 13» Štruktúra promótorových oblastí. Je ukázána nukleotidová sekvence oblastí mutovaného promotoru. Jsou označený souhlasné sekvence pozdního promotoru viru vakcinie (tenká čára), kodony iniciace translace (silné Čáry) a poloha nékolika restrikÄLch míst. Pllwt znamená priadni sek— venci promotoru PH, Pllm znamená mutovanou Pil sekvenci, sPll znamená syntetickou mutovanou Pil sekvenci, s4b znamená syntetický FPV 4b promotor a sart znamená syntetický (umelý) pozdní promotor.

Obrázek 19» Srovnání hladín exprese P-galektosidapy indukovaných ruznými konstrukcemi promotorového lacZ génu víru vakcínie. Hladiny exprese rúzných. rekombinantú. jsou srovnány se štandardní hladinou vFls3 (100 $).

Tento vynález ee tedy týká rekombinantního insertního plasmidu víru drábežíoh neátovic (FPV), vyznačujíciho se tím» že intergénová oblast mezi FPV tk-genem b 3*otevŕenou čtecí oblastí (3*orf) je zvétšena. Vytvorí se tak jedno nebo více jedinečných restrikčních mist. Insercí cizí DNA do táto intergenové oblasti zústává FPV tk-gen neporusen a kóduje celou thymidin-kinasu (TK). Shora uvedená zvet» äená intergenové oblast milžo napríklad obsahovať následující sekvenc!:

tk-gen

AGTAAMAAQGTTTTTATCGATCCOG<1GMOOGGTMAGTGMATAAATTTAAIAAAA

5™%X-Jssír^__1 ^GlaI Asp718 zvétšená inter gen.oblast

TATTGACAAAATAGTTjftAATGAATATATGAAAGTACATTATACACGGAATGGAG ς—► orf

zvétäená intergenová oblast

Tatu modifikaoe prírodní intergenové oblasti se miiže získa t místné špecifickou amtagenesí.

Rekombinantní FPV schopný expresí poskytovať cizí protein (cizí proteiny) se pripravuje integraoí DNA sekvenee kodující cizí protein (oizí proteiny) do vírového genomu drúbežích neátovic· Tato cizí DNA sekvence se integruje do FPV genomu in vivo rekombinací mezi insertní plasmid nesoucí oizí DNA sekvenci a obklopující sekvence FPV genomu. Tento insertní plasmid obsahuje alespoň oizí DNA sekvenci napojenou na promotor viru drábežíoh neštovic nebo jiných neátovic umístenou mezi DNA sekvence, které jsou homologní se shora uvedenou intergenovou oblastí a obklopujícimi sekvenoemi. ^elektovatelný insertní plasmid tedy obsahuje alespoň» a) prírodní nebo syntetický promotor viru neátovic napojený na cizí DNA sekvenoi, která má být získávána expresí, b) druhý promotor viru neštovic napojený na gen kodujíoí m^3*er nebo indikátor pro výbšr (selekoi) rekombinantní·· ho FPV, c) DNA sekvenoe FPV obklopující konstrukci prvku ad a) a ad b) ne obou koncích (5*a 3*)» uvedené obkloýpjící sek>vence jsou homologní se sekvencemi proti smeru vlákna i po smeru vlákna zvštšené intergenové oblasti.

- 11 Shofca uvedený plasmid s výhodou dále obsahuje replikon pro replikaoi v prokaryotickéan hostiteli a gen kodující eelektovetelný marker nebo indikátor pro selekoi v transformovaném prokaryotickém hostiteli·

Promotory používané ve shora uvedeném plasmidu a také také v rekombinantním FPV jsou promotory víru neštovic, zvlášte FPV promotory. Pro účinnou expresi oizího proteinu je výhodné, aby promotor byl bezprostredné pŕilehlý ke kodujicí sekvenci uizich DNA sekvenci.

Vétšina z dosud zkonstruovaných VV rekombinantú používá klonované W promotory pro vnesení oizího génu, o který se jedná. In vivo rekombinaoe transkripční jednotky eestávajlcí z klonovaného W promotoru a oizího génu do ne-podstatného místa W genomu obvykle vede k duplikaci promótorových prvkň a milže vést k sekundárnim rekombinacím, k segregaci a k nestabilité rekombinantú. Pro zkonstruování geneticky stabilních rekombinantú víru neštovic je tedy žádouaí použít buž nehomologni nebo krátké špecifické vírové promotory, které kontrolují transkripci oizího génu.

Výhodným promotorem je P2 promotor (obrázek 10B)· Tento promotor obsahuje ve své části proti smeru vlákna nékolik kritických časných oblasti následovaných souhlasnou sekvenci pozdního promotoru. Funkční analýza potvrdila, že P2 promotor je aktívni časné a pozdné v cyklu života viru.

Sila nového FPV promotoru by la srovnávána s ne kolika známými silnými promotory viru neštovic v rekombinantech viru vakcinie. Bylo zjlšteno, že P2 promotor patrí mezi jeden z nejsilnšjších pŕirodních promotoru ve W infektovanýoh bunkách.

Pri pokusu optimalizovet P2 promotor byla zkonstruována šerie rautantú (obrázek 15). Ve všech mutacích je odstránená sekvence napojení génu P2 a iniciační kodon génu laoZ je umístén tak, že pŕiléhá k signálu pozdního promo— toru TAAAT. V mutaci mO (TAAATG AAT TOG) ATG génu lacZ je

- 12 pŕimo na po jen s© stredovou sekvenci pozdního promotoru. Tím s© deletuje C zbytek v poloze -1 sekvence P2 pŕírodního typu markeru, která zlepšuje účinnosť pozdnilio promotoru. Tato štruktúra se naohází v mnohá pozdníoh promotoreoh. Pŕedpokládá se, že je optimálnim spojením pozdního promotoru a inicíačního kodonu (Davidson A. J. a Moss B.; J. Mol.

Biol. 210. 749 (1989).).

Mutant ml (TAAACATG AAT TCC) má ATG génu lacZ pŕimo napojen s ATG domnelého génu P2.

Jdutaoe m2 byla zkonstruována pro etudlum významu kritických oblastí časného promotoru na oháze jíoích se proti smeru vlákna oblasti pozdního promotoru. Mutovaný promotor m2 má stejnou strukturu jako ml až na to, že časný RNA stop signál ve funkčné duležité na T bohaté oblasti proti smeru vlákna motifu pozdního promotoru byl inaktivován insercí TTG do polohy -18.

Výhodnými EPV promotory jsou tedy P2 promotor, který má DNA sekvenci odvodítelnou z obrázku 10A a jeho funkční ekvivalenty. Experimentálni dáte, pokud jde o silu promotoru, jsou uvedená ne obrázku 16.

Po tôchto promótorových oblastech s výhodou nasleduje násobné klonovací ml sto (MOS), které umožňuje inseroi cizích genú.,

P2 gen a oblast po smeru vlákna byly charekterizovány sekvenační analýzou (obrázek 10B). Gen P2 kóduje 135 aminokyselín. Vypočtená molekulová hmota je 14 806. Oblasť po smeru vlákna (415 páru, nukleotidá) je bohatá na A a T a neobsahuje otevŕené čtecí oblasti kodující proteíny vetší než o molekulové hmote 4 000, tj. tato oblasť genomu je prevdépodobnš ne-kodují oblasť. Oblasť po smeru vlákna génu P2 je tedy novým ne-podstatným místem, které máže být použito pro vložení cizích genii do FPV genomu.

Výhodné plasmidy obsahují geneticky prvky, které u- 15 možňují výbér rekombinantniho FPV. Tyto prvky obsahujl gen kodujici selektovatelný marker nebo indikátor společné s promotorem víru neštovio, který kontroluje expres! uvedeného génu v rekombinantnim víru. Tento promotor a tento marker nebo indikátor génu jsou umistény mezi obklopujicími FPV eekvenoemi, takže jsou kointegrovány do FPV genomu. Rekombinantni FPV se pak milže vybrat na zakladé toho, že pri expres! docházi k expresi markeru nebo indikátoru.

Výhodným genem pro identifikeci je E. coli lacZ gen, který kóduje enzým 0-galaktosidasu. Zpilsoly identifikaoe, které jsou založený na expresi tohoto , enuy:nu, jsou diskutovány v literatúre. Mezi selekéni metódy patri selekoe rešiet enci aa léčivo, napŕiklad selekce genem kódu jícim xanthin-guanin-fosforibosyl-transferasu, která udéluje resistenci na mykofenolovou kyselinu.

Plasmidy podie tohoto vynálezu také koduji s výhodou replikou pro replikaoi v prokarytiokém hostiteli a rovnéž i gen kodujicí selektovatelný indikátor nebo marker, který umožnuje selekci a amplifikaci v prokaryotiokém hostiteli, jako je napŕiklad E. coli. Tento replikon Ize ziskat z jaké_ hokoliv prokaryotického plasmidu, jako je napŕiklad pBRJ22. Selektovatelným markerem rnáže být gen, který udéluje resisstenci na antibiotika.

Špecifické plasmidy podie tohoto vynálezu méhou být zkonstruovány náhradou génu laoZ ineertniho plasmidu pTKm-sPll-gpt oizím genem, který nás zajímá.

DNA plasmidy obsahujicl DNA sekvenai, která má být ziskávána expresi spolu s gény markeru nebo indikátoru, jsou obklopený príslušnými FPV sekvencemi, které umožuuji rekombinaci s FPV a integraci obklopených gená do FPV genomu. K této rekombinaci docházi v oytoplasmé eukaryotické hostitelské bunky. Príslušné hostitelské bunky pro rekombinaoi vyžaduj!, aby 1) byly infektovatelné FPV a 2) byly transfektovatelné DNA vektorem. Príklady takových bunék jsou fibroblasty kuŕeciho zárodku a dermálni (kožní) bunky kuŕeciho zárodku.

Pri rekombianci in vivo se bunky ne.jdŕíve infektují FPV, naéež se transfektuji insertním plasmidem. Vírové infekoe se dosáhne standardnimi technikami infekce eukaryotiokých bunék FPV, Potom se bunky transfektuji insertním plaemidem jakýmikoliv konvenôními transfekčními technikami.

Po infekci a následné transfekoi se bunky inkubuji za standardních podminek a vir se nechá replikovat. Bšhem této doby docházi k in vivo rekombinaci mezi homolognimi FPV sekvencemi insertniho vektoru a FPV takže se sekvence oizi DNA vloží do FPV genomu· n

Rekombiantní FPV se pak výbere pomoci vloženého markeru nebo indikátoru, napr, E. coli lacZ genem, který exprebí poskytuje 3~galsktosidasu, JestliŽe se použije chromogenni substrát pro tento enzým, napríklad 5-brom-4-chlor-5indoly 1-0-D-galaktosid., rekombinantni viry se detegují jako modré plaky.

Podie jiného podstatného uspoŕádání tohoto vynálezu rekombinantni FPV obsahuje insertni místo ve shora uvedené intergenové oblasti tk-genu viru vakcínie, které slouží jako ne-podstatné místo (NES) pro inserci jedné nebo víoe eekvenoí cizí DNA.

Jako výhodná modifikace uvedený rekombinantni FPV obsahuje ve shora uvedené zvétšené intergenové oblasti gen selekóniho markeru a/nebo reporterový gen a W-tk-gen v jakémkoliv jiném žádoucím poradí.

Nejvýhdjonč j ši modifikaoe nestáva jí z rekombinantnich víri drôbežích neštovic, které ve zvetšené intergenové oblasti obsahují inserci tk-genu viru vakcinie s gen laoZ, Genomové štruktúry takových dvou nových hostitelských kmeni jsou uvedený na obrázku 7. Jako ne-podstatné mletá pro vložení cizích geni je možné použít tk-gen buJ drubežích neštovic nebo viru vakcinie. Kmeny f-TK2a a f«TK2b se liši pouze v orientaci tk-genu viru vakcinie. Toto umožňuje inserei homologní rekombinace cizich genú, o které jde, ve

- 15 dvou orientacích. To mú.že být výhodné pri studiu transkripčních interferenčníoh jevd.

Jelikož shora uvedená modifikace nového FFV hostiteľského kmeň® obsahuj® dva neporušené tk-geny, je možné použiť pro inseroi cizi DNA kterýkoliv z nich. To umožňuje apli— kači rozsáhlé oblasti plasmidá, které máji buá FPV tk nebo VV tk obklopujici sekvenci.

Tento vynález tedy obsahuje rekombinantní FPV, který byl získán homologni rekombinaoi shora uvedeného nového FPV hostitelského kmene a jakéhokoliv zde popsaného plasmidu, který umožňuje inserci cizi DNA buň do FPV tk-génu nebo do VV ®k-genu.

Jak bylo shora popsáno, rekombinantni FPV, který je schopen expreeí poskytovať oizi protein (proteiny), se produkuje integraoi DNA sekvence kodujicí uvedený oizi protein (uvedené cizi proteiny) do FPV genornu. To se provádí in vivo rekombinaoi insertním vektorem jak shora popsáno. Špecifické vektory podie tohoto vynálezu se mohou zkonstruovat pomoci insertních plasmidú pTZgpt-Fls nebo pTZgpt-PHM jak je to uyedeno na obrázku 17A a pP2mxgpt jak je to uvedeno na obrázku 14A.

Konstrukce pTZgpt-Fls (obrázek 17A) predstavuje plasmid, který je výhodný pri srovnání s dŕíve používaným pĹLaemidem pTKgpt-Fls (horní část obrázku 17-A) v tom, že počátek replikace fl (fl ori) byl zaveden substitucí pTZ části v místé pUC části (PvuII fragmenty). Inserce fl ori umožňuje produkoi jednovláknové DNA, jak je to vyžadováno pro sekvenování a pro in vitro mutagenesi. Pri této oestš jsou reklonovací pokusy do vektorú M15, které spotrebovávaji čas, zbytecnými.

V plasmidu pTZgpt-Pllai (obrázek 17A) je Pil konvenční oblasť pozdniho promotoru TAAATGAATTC mutován® a prevedená na následující sekvenoi: TAAATAAAGAATTCj tato konstrukce je výhodné v tom, že tyto gény se mohou získávat expresí za kontroly jejioh vlastním! kodony (^TG) iniciaoe translace.

- 16 Plasmid pTZgpt-dP (obrázek 17A) obsahuje vedie obklopujíoíoh W tk sekvenoí a génu gpt pod kontrolou pro— motoru P7.5 jediné misto Hpal. Toto misto vhodné slouží pro inserci ráznych kazet promotor-oizí gen.

Insertní plasmidy pP2mOgpt, pP2mlgpt, pP2m2gpt (pP2mxgpt, obápzek 14 A) smerují cizí gen, který se jedná, do tk-genu viru vakcínie nových hostitelských kmenú. viru drábežíoh neštovic (obrázek 7). Zkratks P2mx znamená mutované P2 promotory, jak je to popsáno na obrázku 1$. Tyto insertní plasmidy jaou vhodné pro expresi otevŕených čtecích oblasti, kterým chybí jejich vlastni translačni iniciační a terminačni kodony, ve vysokých hladinách. Translačni stop kodony, které ukončuj! translaci ve všech tŕeoh čteoich oblasteoh, jsou dodávány plasmidy. Další vlastností násobných klonovacich mist plasmidú. pP2m0gpt, pP2mlgpt a pP2m2gpt je trans^^ní stop signál, který končí expresi časného génu viru neštovic. Sekvenoe násobného klonovaclho mista je uvedená na obrázku 14B.

Plasmid pFSgpt (obrázek 13A) sméŕuje cizí gen, o který se jedná, do tk-genu viru vakcínie nových hoetitelskýofc. kmenú virú drábežich neštovic (obrázek 7). Môže být^pro^^ klonování kazety oizí gen promotoru - vir neštovic. Plasmid pFSgpt rovnéž poskytuje translačni stop kodony a časný transkripční stop signál viru neštovic. Tato sekvence násobného klonovacího mista je uvedená na obrázku 1JB.

Plasmidy pTZgpt-sPx (obrázek 17B) jsou '’proiiotorové testovací plasmidy”, které byly zkonstruovány pro testování rúzných syntetických promotoru (zde označených jako sPx). Zkratka sPx máže mít následující vyznamys a) aPll e syntetický W Pil promotorový mutant, b) s4b = syntetický FPV 4b promotorový mutant, c) sart = syntetický promotorový mutant.

Shora uvedené proiaotorjy obsahuji silné pozdni promoto— ry, které jsou aktívni ve W stejné jako FPV. Tyto promotory mohou být vyštšpeny s nebo bez reporterového génu (lacZ) a mohou být tedy klonovány do ráznych vektorových systénul. Tyto ďalší promotory zvétšují souhrn dostupných promotorú. a umožňuj! násobnou expres i. Jsou výhodné také v tom, že oblasti, které jsou homogénni s vírovým genomem, jsou omezeny spíše na kratší sekvenoe, což je skutečnost, ktexá snižuje možnost rekombinaci e tedy snižuje nestabilitu rekombinantních víril.

Jak bylo shore popsáno, rekombinantní FPV, který se používá pro expres! oizlho proteinu (oizích proteinú), se ziskává in vivo homologní rekombinací.

Tento vynález obsahuje také zpúsob exprese ciziho proteinu. Tento zpúsob sestává z infektování príslušných hostitelskýoh bunék rekombinantním FPV podie tohoto vynálezu. Hostiteľské bunky se pak kultivují, aby se umožnila exprese žádaného proteinu. Protein se pak isoluje koavenčními zpúsoby.

Vhodnými bunkami nebo bunéčnou kulturou jsou fibroblastové bunky kuŕecího zárodku nebo kožní (deriaální) kúrení fibroblsstové bunky.

Jakýkoliv žádaný protein múže být ziskán expres! pomoci shora uvedeného rekombinaircniho FPV v cios ta točných množstvích. Zvlášté duležité je, aby došlo k expres! proteinu, které vyžaduji post-translacní modifikaoi tak, jak to provádéjí hostiteľské bunky. Takovými proteiny jsou napríklad, faktory II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, Xllj, protein C, protein S, von 'úlllebiaodilv fak/ot, pl-osminogen e jeho deriváty, v niohŽ je jedne nebo více aminokyselín nahrazena, deletována nebo vložená, částečné sekvence a jejich aktivované formy, apolipoproteiny, Jako jsou napríklad apo^I s a po/. II, e vírové antigény, jako je ne príklad cnrigoc hepatitídy B, antigény víru hepatitídy C, antigény viru hepatitídy E, antigény viru encefalitidy pocházejici od klíštéte (Túb), antigény HIV, HSV e celé nebo částečné sekvence tukových y.ntígenú, které zpiisobují černý kasel, tetanus, malárii, onemocnení o drúbaže, ďžarkovu chorobu, ILT, infekční chroby, bronchitídu, kokcidiosu a Newoastlovu nemoc, skoré uvedené antigény jsou užitočné jako vakcíny.

- 18 Príklady provedení vynálezu

Príklad 1

Zpisoby a materiály

1.1 Vír a bunky

Vir drdbežího moru kmeň HP1 (Mayr a Maličkí: Zentralblatt f. Veterinärmedizin, Reihe B, 13· 1 až 12 (1966).) a zeelabený kmeň HP1-441 (pasážové číslo 441 HP1) byly laskavč dodány profesorom A. Mayrem z Mníchova. Primárni fibroblasty kuŕecího embrya (CEP) byly pripravený podie postupu, který je uveden v evropském patentovém spisu Č. 0 538 807· Bunky byly nechány rust v tkánovém kultivaoním médiu 199 (TOM 199» Gibco BRL) doplnšném o 5 % plodového telecího séra, glutamin a antibiotika. Vir vakcínie (ATCC č. VR 119» kmeň WR) byl laskavé poskytnúť Dr· B· Mossem. Tento vir byl replikován v bunkách. CV—1 a vyčiäten zpásobem podie Macketta a spol.· (v D. M. Glover (red.) (1985)« DNA Cloning: A Practioal Approaoh”, IRL preša, 6xford.). Bunečná línie ledvin africké zelené opice (ATCG č, CCL 70) byla ziakána z Amert/lan Type Culture Colleotion, R oo kvíli e, Mar y la nd.

1.2 Čiätční víru drdbežíoh nestovio

Čišténí se v podstatč provádí podie Joklika (Virology 18, 9 až 18 (1962)·) s následujícími modifikacemi« Monovrstvy CEP (dvaoet banék pro kultivaoi bunék (75 om )) byly infektovány 1 pfu (plak tvorící jednotka) na bunku a inkublvány čtyŕi až pet dná. pri teploté + .37 °C s 5 % oxidu uhličitého. Bunky byly naškrabány do medie, odstre— kovány dvaoet minút pri 2000 otáčkach za mínu tu v odstŕe^. divce H6000A-rotor Sorwall RC3G . Peleta se suspenduje v 5 ml lOmM Tris, pH 9, sonikuje (púsobí se ultrezvukem), doplní se 1/10 objemu 2,5% trypsinem a inkubuje se tŕicet minút pri * 57 °C· Aby se vytvoŕily palety extrscelulárníh.o víru supernatant se odstrekuje pri 17 000 otáčkach, zs minutú dve hodiny pri + 4 °C v odstŕedivce Beckaan type 19 rotor. Trypsinizované bunky a vírová peleta aupernatantu bunščné kul tury se spojí, nanesou se na polštár 56% sagčarosy a odstrekuj! b& osmdesát minút pri 15 500 otáčkáoh za minutu v odstredivce Beckman SW2B rotor pri + 4 °C₀ Peleta se re— suspenduje v 1 ml lmM Tris, pH 9, nechá se ne ní. pusobit ultrazvuk, prevrství se na 20 až 40% sacharosový gradient a odstrekuje se pri 12 000 otáčkách za minutu 50 minút pri teplote + 4 °C. Dva vírové pásy (intracelulárrí a extracelulární formy víru) se spojí. Pŕidají se dva objemy lOmM Tris, pH 9. Vírová paletá se isoluje po odstŕeáování pri 15 500 otáčkách za minutu po dobu 60 minút a resu.spenduje se v 500 yul lmlá Tris a lmM chloridu sodného, pH 9.

1.5 Infetjkování bunék a analyzová plakä

Analýza plakú se provádi na konfluentních monovrstvách GEF (v miskách pro kultivaci bunék, 60 cra^, približné 6 2

6.10 bunék, nebo na deskách se šesti jamkami, 10 cm ,

1.10 bunék na jamku) nebo CV-1 bunék na deskách se sesti

P 6 jamkami (10 cm , l»10 bunék ne jamku). Vírová suspense se nechá adsorbovat na bunkách v objemu 0,6 ml. TCM 199 s občasným zatŕepáním jednu hodinu. Suspense se odstráni odpipetovánim a nahradí se prevrstvením vrstvou sestávajioi z DMEM bez séra, antibiotík s 1 % nízkotajicí agarosy (MA, Gibro BRL). FPV-plaky titrované na CEF-buňky se obarví 50 ^ug/ml neutrálni červené (Sigma) pátý nebo šestý den infekce.

Plaky víru vakcínia titrované na CV-1 bunky byly obarveny 50 /Ug/ml neutrálni červení tretí den infekce.

1.4 In vivo rekombinaoe

CEF bunky nebo CV-1 bunlsy (v 60cm^ miskách pro tkáňové kultury) se infektují jednou plak tvoŕící jednotkou (pfu) ne bunku HP1-441 nebo VV. Vír se adscrbuje jednu hodinu pri + 37 °G ve 2,5 ml TOM 199· Potom se médium odpipetuje a infektované mouovrstvy se prevrství sraženinou DNA-Ga-fosforečnen obsahující 20 ,ug plasmidové DNA a 5 /Ug HP1-441 nebo W prírodní DNA v Áepes pufrovaném solném roztoku na konečný objem 1 ml podie Grahame a van der Eba (Virology

52. 456 až 467 (1973)·)· Po tŕiceti^utové inkubaci za tep loty místnosti se pridá 9 ml TCM 199 a v inkubaci se pokračuje další čtyŕi hodiny pri teplote + 37 °C. Médium se nahradí lo ml čerstvého TOM 199 p desky se inkubují dve dny. Potom se bunky naškrabou do medie e pelety se lysují tremi po sobé následujícími cykly zmrazení e roztátí. Progenový vír se pak analyzuje na prítomnosť rekombinantd.

1.5 Selekce a éišténí plakd rekombinantú

1.5.1 Testování modrých plakú.

Víry s ineerty lacZ génu se identifikují testováním modrých plaku podie zpdsobu popsaného Ohkrabartym a spol. (Mol. Oeil. Biol. 5403 až 3409 (1935).) s následující

mi modifikaceni:

kultury) nebo CV-1 bunky (na deskách ee šesti jamkami) se infektují vírovým surovým zásobním roztokem odvozeným od rekombinantních pokusu a prevrství se DMEM bez séra obsahujícím 1 % IJäA. Po péti až šesti dnech u CEF a po tŕech dnech u CV-1 se monovrstvy obarví druhým prevrstvením vrstvou, která sestává 3 1% LMA ve fosforečnanem pufrovaném solném

4-chlor-3-indolyl-3-D-galektosidu (X-gal). Modré plaky se objevily asi po Čtyŕech až dvanácti hodinách.

1.5.2 gpt-selekce

Rekombiantní FPV viry s gpt-genovými inserty byly identifikovaný na základé jejich resistenoe na mykofenolovou kyselinu (HRA) v podstate tak, jak to popisují Falkner a Moss (J. Virol. 62, 1349 ai 1854 (1983).) s následujícími modifikBoemi: monovrstvy GEF bunék byly infektovány rekombinantnim virer^ prevrstvený DMF'M doplnôným o 125 /Ug/ml xanthinu, 5 až 25 /Ug/ml MPA 8 1 % LMA. Po péti až šesti

utrální červene. V prípade prevrstvení gpt- a lacZ positivnich rekombinantú vrstva obsahovala dáLe 600 ,ug/ml X-gal.

Plaky byly nekolikxát prečistený. Monovrstvy OV-1 bunék byly infektovány rekombinantním virem vakcínie s prevrstvený

plaky zviditelní obarvením druhou vrstvou, která sestává z 1 % MPA v PBS obs 600 /Ug/ml X— gsl. P

1.6 Analýza prechodné expres©

Analýzy byly provádény v podstate podie toho, jak popisuje Coohren a spol. (Proc. Natl. Aced. So i. USA 82. 19 až 23 (1985).) a modifikovány následujícím zpôsobem: Kon7 fluentní monovrstvy CV-1 bunék (asi 1.10' bunék) byly infektovány 5 nebo 10 plak tvoŕicími jednotkami pŕírodního viru vakcinie a transfektovány 30 /Ug plasmidové DNA ve forme DliA-Ca-precipitátu pripraveného podie Grshama 8. van der Eba (Virology 52₁ 456 až 457 (1973)·). Bunky se isolují 24 hodín po infekci odstŕeclováním a resuspendováním ve 100 yUl PBS. Cytoplasmové extrakty infet^ovaných bunék byly pripravený pôsobením ultrazvuku a aaalyzovány na β-galaktosidasovou aktivitu.

1.7 β-Galaktosidasové analýzy

Konfluentní monovrstvy CV-1 bunék (3.10θ bunék) byly infektovány 10 plak tvoiícími jednotkami vakcinie, isolovány 24 hodín po infekci odstŕeíováním a re suspendovaný ve 100 ,ul PBS. Pro prípravu cytopiasmových ex trakt ú byly bunky rozbitý trojnásobným opakováním cyklu zmrazení a rotátí a pôsobením ultrazvuku. Proteínové extrakty byly kvantitatívne vyhodnoceny podie Bradforda (Anál. Bioohem. 72. 248 až 254 (1976).)„ Enzymstické analýzy byly provádény v podstate podie toho, jak to popeal Miller (v Experimente in liolecular Genetios, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 352 až 355 (1972).) s následující modifikacís Véechna reakční činidla byla pŕedem ohŕáta na 28 °C, lysáty byly uchovávány v ledu. Reakce se provádí v 770 /ul 1 x Z pufru (0,61i hydrogenfosforečnan sodný, 0,4M dihydrogenfoeforečnan aodný, 0,llfl chlorid draselný, 0,01M síran hoŕecnatý, 0,5M .S-merkaptoethanol, pH 7). Pridá se 200 ^ul chromogenního substrátu o-nitrofenyl-^-D-galaktopyrsnosidu ONPG, 4 íag/ml v O,1M fosforečnanovém pufru, pH ’7,u). Reakční smés se nechá reagovst pŕidáním 30 /U1 zŕedéného bunečného extraktu (1 t 100).

Po tŕech minutách za teploty místnosti se analýzy pŕenesou do Becka^tnova fotometru IXJ8. Optická hustota byla zaznsmenávána petnáct minút pri 420 /um pri 23 C vzhledem k PBS vzorku. Výsledky byly potvrzeny vyhodnotením polyakrylamido- 22 r vých gelú UV-Vis densitometrem (Hirschmann).

1.8 Sekvenování

Sekvence byly stanovovány sekvensční sestavou T7 polymerase sequenoing kit” (Pharmseie) dideoxymetodou (Sanger a Coulson: J. Mol. Biol. 94» 441 (1975)·) špecifickými pri— mery. Zkonstruování plasciidú bylo provádeno podie standardních teohnik jak je to popsáno Sambrookem a spol. (Molecular Cloning, Oold Spring Harbor Laboratory, 1989·).

Príklad 2

Konstrukce insertních plasmidú

21. Plasmid pFPtkS

Jako první stupeň byl klonován gen FPV thymidin-kinasy následujícím zpusobem: DNA víru drúbeäích neštovie rozštepená púsobením EcoRI (k.;©n UPI, Mníchov) se klonuje do EcoRI místa vektoru pTZ19R (Pharmacia). Plasmid, který obsahuje tk—gen, označený pFPtk5, byl identifikován hybridisací kolónií na filtru pomoci oligonukóeotidové sdhy: 5*^mG-AG TTA TTG TGG OCG GGC TTA ÁJG GTG A-3*. Plasmid obsahoval EcoRI fragment o 5 500 párech nukoeotidú.

2.2 Plaamid pFPtkl0.4

Plasmid pFPtk$ se rozsvépí púsobením vial, BamHI a Scal, neohá se zreagovať s Klenowovou polymerasou a liguje se s vektorem pTZ19R, který byl zpracován 8 PvuII, EaoEE a fosfotásou. Výsledný plasmid, p.FPtkl0.4 mel BamHI-Clal insert o 2 480 páreoh nukíootidu, který obsahuje tlc-gen viru drúbežioh neštovic (Boyle s spol.: Virology 156* 555 až 556 (1987).).

2,5 Plasmid pFP-UV2i

Do jedinečného místa Ncol v tk-kodujíci oblasti plešín idu pFPtkl0.4 se vloží SspI fragment o 2 500 párech nuk~ leotidú z plasmidu pUVl (Falkner a spol.: Nucl. ícids Res. 15» 7192 (1987). Tento fragment obsahuje Pll-promotor (Bertholet a spol.: Proc. hiatl. Acad. Sci. USA 82, 2096 až 2100 (1985)·)» p7.5 promotor (Cochran a spol.i J. Virol. 54.

30 až 37 (1985).) a 5'-část lacZ génu.

2.4 Plasmid pFP-UV2

KLonování plasmidu pFP-JV2 e© ukončí vložením fragmentu lacZ o 2300 párech nukleotidú (3'část génu lacZ) do msziproduktu - plasmidu pFP-UV2i.

2.5 Plasmid pFP-UV2-PT

V následujícím pokusu se cDNA sekvence pro protrombin klonuje do plasmidu pFP-UV2. Tento pokus se provádí tak, že se vystrihne EcoRl fragment z plasmidu pPT č. 12 o 2 000 páreoh nukleotidd, který je popsán v evropské patentové pŕihlášoe Ô. 90 101 613.8· Úplná lidská. protrombinová o DNA bo pak klonuje do vektoru pEP-LV2, který se pŕedem nechá zreagovat s FcoRI a fosfateeou. V této konstrukci počáteční kodon translace protrombinové o DNA je presne nepojen na prirozené se vyskytuyící počáteční kodon promotoru nlavního pozdního polypeptidu 11K viru vakcinie. Výsledný plasmid byl oznaôen pFP-4JV2-PT.

2.6 Plasmid pTKia

Tento plasmid byl zkonstruován z plasmidu pFPtklO.4 oligonukleotidem ŕíženou mutagenesí fosfothioátovým postupem (Amersham, Inc.). Mutagenní primer, který byl použit pro zvétšenl a modifikování intergenové oblasti génu FPV thymidin-kinasy, mšl sekvencií 5’-TTA CAO TA A ACO GGT A 00 CGG GAT CGA TAA AAA OCT TA A TTA CTA-3*· Štruktúra mutece byla potvrzena sekvenováním pomoci primoru 5*-C0ATTC0GTG TATAATGTAO-3*» který je umístén 46 páru nukleotidú po smeru, vlákna pôzménéné sekvence.

2.7 Plasmid pEP-ZeSU

V plasmidu pF.-Z21 (viz 2.15) je lacZ gen obklopen nškolika restrikčními mlaty, ale neobsahuje 3ekvence promotoru. Do mís t PstI a Sxnal plasmidu pFP-Z21 se po smeru vlákna lacZ génu vloží syntetický promotor (modifikovaná verše promotoru Pil vakcinie) ligscí syntetického linkeru, který sestává z anelovaných oligonukleotidú. I a II (oligonukleotid I» 5'-GCC TAT TTA TAG OaT AGA AAA AAA CAA AAT GAA ATT TTA OTA TA T TTT TAT A TA CAT A TA TTC TAA ÔOC-3*, oligo nukleotid II: 5-GGG TTA GAA TAT ATG TAT GTA AAA ATA TAG TAG AAT TTG ATT TTG TTT TTT TCT ATG CTA TAA ATA GGC TGC A-3*)·

2.8 Plasmid pTKm-sPll

Fragment Smal/Ball o 5 500 párech nukleotidú obklopující E.coli laoZ gen regulovaný syntetickým pozdnim promotorem vakcínie se pripraví z plasmidu pFI-ZsPll a vloží se do vektoru pTKh linearizovaného púsobaním SmsI. Výsledný plasmid. byl označen pTKm-sPll.

2.9 Plasmid pTKm-sPll-gpt

Plasmid pTKm-sPll se linearizuje pôsobením Smal. Potom se llguje s kazetou Hpal-Drs I P?.5-gpt gen o 1 100 párech. nukleotidú vystŕiženou z plasmidu pTKgpt-Fls (Falkner a. Moss. : J. Virol. 62, 1349 až 1854 (1980).). Výsledný plasmid se označí pTXm-sPll-gpt·

2.10 Plasmid pTKmrWtka a b

Tyto plasmidy se zkonstruují vložením úplného génu thymidin-klnasy viru vskcínie pripraveného jako hra I fí’agment o 1 100 párech nukleotidú. z pGS50 (Maokett e Smith: J. Gen. Virol. 67. 2067 až 2032 (1936)·) do Smal linearizovaného vektoru pTKm-sPll. Výsledné plasmidy ee označí pTKm-Wtka a b·

2.11 Plasmid MlJmplS-UVl

Jako první stupeň se Pstl/Saul fragment o 1 200 párech nuklet/oidú odvozený od insertního vektoru pFP-UV2 (víz 2.4) subklonuje do plasmidu M5mpl3· Tento fragment obsahuje promotory genú. viru vakoínie kodující 11K (Pil, Bextholet a spol,: Proc. Natl. Aoad. 3ci. U82, 2096 až 2100 (1935)·)» 7.5K polypeptida (Ρ7.5» Oochran a spol.: J. Virol. £4, 5θ až 57 (1935).) a část laoZ génu. Výsledný pl-.smid. se označí M13mpl8-UVl.

2.12 Plasmid M15mpl3-Eco2

Pro zavedení druhého EcoRI místa 7 párd nukleotidú. proti smôru vlákna ATG lacZ génu plasmidu M15mpl3_UVl se použije oligonukleotidem rízené mutagenese (Amersham, Inc.). Vytvorí ee tak meziprodukt - plas.’.íd M15mpl.8-Hco2. Ilutagenní

- 25 primer, který se použije pro zmenu oblasti laoZ proti sméru vlákna mél sekvenci: 9*~ACC A TA TGT AAG GAA TTC CTT AGA ŤAA-3*.

2.13 .lasmid pFP-UV2-Eco2

Modifikovaný Pstl/Saul promotorový fragment, pripravený z plasmidu M13mpl3-Eco2, se vloží do pFP-UE, který se rozštépi pisobenim PstI a Seul, Výsledný vektor se označí pFP-UV-2-Eco2.

2.14 Plasmid pFP-Zl

Plasmid pFP-Zl se zkonstruuje t&k, že se vynechá (dele tuje) EcoEI P11/P7.5 fragment o 900 párech nukleotidd z plasmidu pFP-B^-Eco2. Tím se umlstí násobné klonovaoí místo bezprostredne proti smČru vlákna laoZ génu.

2.15 Plasmid pFP-Z21

Plasmid pFP-Z21 skonštruujeme tek, že se za vede sekven_ oe syntetického linkeru (5*-CGA TTG GCC AGG ATC CGT CGA CAG GCC TAT-3Í doplnkové vlákno i 5'-oGA TAG GCC TGT CGA CGG ATC CTG GCC AAT-3*) do vektoru pFP-Zl, který se částečné roz— štépí pisobenim Ciel. Tato modifikace umožňuje jednoduché vystépení laoZ génu.

2.16 Plasmid pFP-2

Tento plasmid se isoluje z banky zkonstruované inserci náhodných fragmenti FPV-DNA (HP1-441) rozčtépené pôsobením SspI a EcoRV do plasmidu pFP-Zl llnearizovaného pusobením Sffial.

Plasmid pFP-ZP2 t²·¹?)

EcoRI/Nsil fragment o C00 párech nuli»eotidíl obsahující P2 promotorovou aktivitu se pripraví z plasmidu pFP-2. ^ento fragment se liguje s vektorem pFP-Z21, který se linearizuje pôsobením EcoRI a PstI.

2.13 Plasmidy pTZgpt-P2a a pTZgpt~P2b

Ty to plasmidy se zkonstruuují tak, ze se vloží kazeta P2-lacE gen odvozená od plasmidu pFP-ZP2 (Sinsl/Stul fragment o 3 700 párech nukieotidč. do plasmidu pTZgpt-ďP (víz 2.27), který se linearizuje pôsobením Hpal. Výsledné vektory se označí pTZgpt-P2a 8 pTZgpt-P2b.

- 26 2.19 Plasmid pFS50

V prvním stupni se plasmid pTZ19R (Pharmacia) rozštšpí púsobením Pvu II. Ľeletuje se tak fragment o 34-9 párech nukleotidú obsahující násobné klonovací místo a pŕilehlé sekvence. Tento vektorový fragment se liguje s fragmentom tk-genu vakcinie o 1 100 párech nukleotidú, který se pripraví z plasmidu pGS50 rozštépením púsobením Dral. Výsledný plasmid se označí pFS^O.

2.20 Plasmid pFS51

Plasmid pFS50 se rozštépí pôsobením Clal a EcoRI a liguje se se syntetickým linkerem (P-MCS1 a 2). Tento vektor byl oznaóen pFS51. Oligonukleotidy, které byly použitý pro konstrukci linkeru, mély tyto sekvenoe: P-J&3S1: 5'-CGA GGA GCTG CAT ATG AGG CCT GGA TCC CGG GTC GAG GCG GCC GCT AACTGA CTG ATT TTT CTC-3'a P-MCS2: 5*-AAT TGA GAA AAA TCA GTC AGT TAG CGG CCG GGT CGA CCC GGG ATC CÄG GCC TCA TAT GOA GCT GCT-3*.

2«21 Plasmid pFSgpt

Plasmid pFSgpt se generuje subklonováním kazety P7.5-gpt gen o 980 párech nukleotidú, která se pripravuje z plasmidu pTKgpt-Fls (Falkner a Mcss» J. Virol. 62, 184-9 až 1854 (1988).) rozštépením púsobením Ndel a Dral, do plasmidu pFS51 rozštepeného púsobením PvuII/Ndel.

2.22 Plasmid pP2m0gpt

Syntetické oligonukleotidy kodující mutovaný mO P2 promotor se aneluji a vloží násilným klonováním do vektoru pFSgpt lineaxizovaného púsobením NdeI/BamHI₍, Nukleotidové sekvenoe téchto oligonukleotidú jsou následujícíi mO.lt 5*-TAC GGC TTG GTA TAG CGG AGA ACT AAG TAA TTG TA A AGA AGA

AAA

CGA

AAC

TAT

CAA

AAC

CGT

TTA

TGA

AAT

GAT

AGA

AAA

AAG

AAT

ATA

AAT

AAT

CCT

GTA

TTT

TAG

TTT

AAG

TAA

CAG

TAA

AAT

AAT

GAG

TAG

AAA

ATA

CTA

TTT

TTT

ATA

GCC

TAT

AAA

TGA

ATT

CG—3*8 m0.2s

5*—GATC

CGA

ATT

CAT

TTA

TAG

GCT

ATA

AAA

AAT

AGT

ATT

TTC

TAC

TCA

TTA

TTT

TAC

TGT

TAC

TTA

A A C

TAA

AAT

ACA

GGA

TTA

TTT

ATA

TTC

TTT

TTT

CTA

TCA

TTT

CAT

AAA

CGG

TTT

TGA

TAG

TTT

CGT

TTT

CTT

CTT

TAC

AAT

TAC

TTA

GTT

GTC

CGC

TAT

A CC

AAG

CCG—3*.

Vý-

sledný plasmid byl označen pP2m0gpt.

- 27 2,2J Plasmid pP2mlgpt

Pri konstrukci pP2mlgpt se sekvence syntetických linkerú ml.l a ml.2 anelují a liguji s vektorom pFSgpt, který se linearizuje pôsobením Ndel/BamHI. Tyto oligonukleotidy

mélj

' následujíci

. sekvence» ml.li

5*—TAC

GGC

TTG

GTA

TA G

CGG

ACA

ACT

AAG

TAA

TTG

TAA

AGA

AGA

AAA

CGA

AAC

TA T

CAA

AAC

CGT

TTA

TGA

AAT

GAT

AGA

AAA

AAG

AAT

ATA

AA3?

AAT

CCT

GTA

TTT

TA G

TTT

aag

TAA

CAG

TAA

AAT

AAT

GAG

TA G

AAA

ATA

CTA

TTT

TTT

ATA

GCC

TA T

AAA

TCA

TGA

CG-3*a ml.2i

i 5*-GAT

CCG

AAT

TCA

TGA

TTT

ATA

GGC

TAT

AAA

AAA

TA G

TA T

TTT

CTA

CTC

ATT

ATT

TTA

CTG

TTA

CTT

AAA

CTA

AAA

ŤA C

AGG

ATT

ATT

TA T

ATT

CTT

TTT

TCT

ATC

ATT

TCA

TAA

ACG

GTT

TTG

ATA

GTT

TCG

TTT

TCT

TCT

TTA

CAA

TTA

CTT

AGT

TGT

CCG

CTA

TAC

CAA

GCC

G-3

’. Vý^Gedný plaamid byl

označen pP2mlgpt.

2.24 Plasmid pP2m2gpt

Vektor pP2m2gpt se vytvorí ligací anelovaných oligonukleotidú m.ž.1 a m2.2 s plasmidem pFSgpt rozštšpeným pôsobením Ndel/BamHI. Oligonukleotidy použité pro klonování môly následujíoi sekvencei m2.1« 5*-TAC GGC TTG GTA TAG CGG

AGA

ACT

AAG

TAA

TTG

TAA

AGA

AGA

AAA

CGA

AAC

TST

GAA

AAC

CGT

TTA

TGA

AAT

GAT

AGA

AAA

AAG

AAT

ATA

AAT

AAT

CCT

GTA

TTT

TAG

TTT

AAG

TAA

CAG

TAA

AAT

AAT

GAG

TAG

AAA

ATA

CTA

TTT

TGT

TTT

ATA

GCC

TAT

AAA

TCA

TGA

ATT

CG—3*» sekvence

m2.2» 5

-GATC

CGA

ATT

CAT

GAT

TTA

TAG

GCT

ATA

AAA

CAA

AAT

AGT

TTT

TTC

TAC

TCA

TTA

TTT

TAC

TGT

TAC

TTA

AAC

TAA

AAT

ACA

GGA

TTA

TTT

ATA

TTC

TTT

TTT

CTA

TCA

TTT

CAT

AAA

CGG

TTT

TGA

TAG

TTT

CGT

TTT

CTT

CTT

TAC

AAT

TAC

TTA

GTT

GTC

TAT

ACC

AAG

CCG-3*.

Ten-

to plasmid byl označen pP2m2gpt.

2.25 Plasmidy pP2mQgpt-lacZ, pPPmlgpt-lscZ a pp2m2gpt-lacZ (,|?$2xgpt-la c Z )

Zkonstruovéní plasmidu pP2m0gpt-lacZ, pP2mlgpt-lacZ a pP2m2gpt->lacZ se provede vložením E.coli lacZ génu jako EooRI-Ball fragmentu o 3 200 párech nukleotidu (odvozeného od plasmidu pFP-Z21) do vektorú pP2m0gpt, pP2mlgpt a pP2m2gpt, které se linearizují pôsobením ScoRI a Smal.

2.26 Plasmid pTZgpt—Fls

Insertní vektor pTZgpt-Fls víru vakcínia se skonštruuje tak, $e se nahradí Pvull fragment o 2 400 pátech nukleotidú (pilvodné odvozený od plasmidu pUC 18) z plasmidu pTKgpt-Fls (Falkner a Moss.i J. Virol. 62, 1849 aŽ 1854 (1988).) PfuII fragmentem o 2 5θθ párech nukleotidú z plasmidu pTZ19B (Pharmacia, Inc.). Vedie génu ampicilinové resistenoe a počátku replikaoe plasmidu (také prítomného v Pvull fragmentu o 2 400 párech nukleotidú) byl tímto klonováním vložen do pTKgpt-Fls počátek replikace bakteriofágu fl.

2.27 Plasmid pTZgpt-dP

Promotor Pil z plasmidu pTZgpt-Fls se deletuje rozštepením púsobením PstI a Hpal. Velký vektorový fragment se liguje s Hpal litery (5^/-GGTTAAGC-3^/, Pharmacia, Inc·). Výsledný plasmid se označí pTZgpt-dP.

2.28 Plasmid M13mpl8-(JV3

Plasmid M13mpl8-UV3 se z konštruuj e oligonukleotidem fízenou in vitro inutegenesí (Pharmacia, Inc.) Pil profcotoru do vektoru M13mpl8-UVl (víz 2.11). Oligonukleotid, který ae používá pro zménu promotorové oblasti, má sekvencií 5*-TAGCTATAA ATAAAGAATT OCTGCAG-3'.

2.29 Plasmid pTZgpt-PHM

Rekombinantnl plasmid viru vakcínie pTZgpt-ΡΙΙΜ se zkonstruuje tak, že se Hind III/Asp?18 fragment o 600 párech nukleotidú, zpracovaný s KLenowovou polymerasou odvozený od MlJmpia-UVJ, vloží do plasmidu pTZgpt-dP rozštépeného pôsobením Hpal. Tento fragment obsahuje mutovaný Pil promotor (PlDá).

2·3θ Plasmid pFP-ZsPll

Oligonukbotldy sPll(5) s sPll(4) se snelují a klonují do vektoru pFP—Z£1 (viz 2.15) rozštépeného pôsobením Smal s PstI. Sekvence sPll(3) a sPll(4) bylys 5*-GCGTATTTAT AGCATAGAAA AAAACAAAAT GAAATTCTAC TATATTTT2PA CATACATATA TTCTAACCO-3* a 5'-GGGTTAGAAT ATATGTATGT AAAAATATAG TAGAATTTGA TTTTGTTTTT TTCTATGCTA TAAATAGGGT GGA-3'. Výsledný plasmid se označí pFP-ZaPll.

2.51 Plasmid pTZgpt-sPI.l

Plasmid pFP—ZsPll se rozštep! pôsobením Smal/Bell. Fragment o 5 500 párech nukleotidú obsahující sekvenci syntetického promotoru neváženého na lacZ gen byl klonován do insertního místa vektoru viru vakcínie pTZgpt-dP (víz 2.27). Výsledný plasmid byl označen pTZgpt-sPli.

2.52 Plasmid pF£UZs4b

Oligonukleotidy s4b(3) a s4b(4) se anelují a klonuj! do vektoru pFr’-Z21 (víz 2.15) rozštépeného pôsobením Smal/ /PstI· Sekvence oligonukleotidú sdb(J) a s.4b(4) bylyi á'-GíMíTATDIáT ATTTGATAGT TTTTTAGTTG TAAGGTATGi. AAATAAGTAC CTAAAGAGAO CTAACCCC-5' a 5 '-GGGGTTACGT CTCTITAGC-T ACTTATTTTG ATACGTTACA AGTAAAAAAC MCAAATAT AAA’ľAGGOTG CA-3*. Výsledný plasmid se označí pFP-ľs4b.

2.35 plasmid pTZgpt-s4b

Plasmid pFP-Zs4b se rozštep! pôsobením Gmul/Eall, Fragment o 5 300 páreoh nukleotidú obsahujicí sekvenci syntetického promotoru neváženého na lacZ gen byl klonován do insertního vektoru viru vakcínie pTZgpt-čLP (viz 2.27)· Výsledný plasmid se označí pTZgpt-s4b.

2·34 Plasmid pFP-Zsart

Oligonukleotidy sart(3) ε sart(4) se anelují a klonují do vektoru pFP-Z21 (viz 2.15) rozštepeného pôsobením 8mal a PstI· Sekvence oligonukleotidú. byly: sert(5)í 5^Z-QCC TAii'TAÍ ATGCGAA.AAA AAAAAAAAAA AAAAACOTC'G S&rt(4):

5'-GGGAAG0TTT TT'l’TTTTTTT TTTTTTTGG-3 ATA2AAA1AG GJTGJA-;/. Výsledný plasmid ee označí pFP-Zsc.rt.

2·35 Plasmid pTZgpt-sart

Plasmid oFP-Ž3art so rozštčpí pôsobením Smal/Bsll. Fragment o 33θθ párech nukleotidú obsahující sekvenci syntetického promotoru n o váženého nr. l&cZ gen byl klonován do insertního vektoru viru vakcínie pTZgpt-dP (viz 2,27). Výsledný plasmid se označí pTZgpt-sart.

xtekombinaatní viry vFlsč, vPll, vPllm, v4b a várt byly odvozený od rekombinantních plaemidú pTKgptFlč (Falk·* ner a Ilossx J. Virol. 62, 134-9 až 1854 (1988).), pTZgpt-sPll, pPllm-lacZ (T. Langmannx Diplomová práce na Universitš ve Vídal, 1991) a pTZgpt-s4b a pTZgpt-sart.

Príklad 3

Význam génu thymidin-kinasy víru drúbežích neätovic pro rúst v bunóčné kultuŕe

3.1 Konstrukce FPV insertního plasmidu pFF-UV2 a pFP-U2-PT

U prvních ty pá konštruovaných pla smidu, pFP-UV2 a píT-UV2-PI, se sekvence kodujici tk gen víru drúbežíoh neätovic rozétepí na dva fragmenty insercemi cizíhť? génu . -lasmid pFP-U2 zná podobnou strukturu jako insertni plasmid pUVl víru vakcinie (Eclkner s spol. í Nuol. Aoicls nes. 15» 7192 (1937).)· V pUVl je E.coli lacZ reporterový gen ŕízen časným/pozdnim Ρ7·5 promotorem víru vakcinie (Cochran a spol.: J. Virology 54, 3^ až 37 (1935)·). Promotor hlavniho pozdniho 11K polypeptidu víru vakcinie (Bertholet a spol.1 Proc, Kati. Acad. Sci. USA 32. 2096 až 2100 (1935)·) je uásledován násobným klonovacím místem a slouží jako regulaôni prvé k oizího génu, který má být vložen. Obe složky jsou obklopený sekvencemi tk-genu vakcinie (obrázek 1A). Plasmid pFP-UV2 má stojné uspoŕádání laoZ repoJbrového génu a promotorú. Je však obklopen sekvenci tk-genu víru drábežích nestovic (obrázek 1A). Inserce pFP-UV2 do genomového tk-mista FPV in vivo rekombinaoe povede, jako v prípade pUVl, k inaktivaci vírového tk-genu. Pri konštruovaní tohoto plasmidu se kazeta promotor-lacZ gen z pUVl klonuje ve dvou stupních do jedinečného místa Ncol v FPV tk-genu, jako je to uvedeno na obrázku 1A. Pri konštruovaní rekombinantniho pl e smidu pFP-UV2-P'T s e c DNA lidského protrombinu vloží do vektoru pFP-4JV2 po smeru vlákna UK promotoru vakcinie. Plasmid pFP-UV2-PT se použije pro zkonstruování první rady FPV rekombinantú.

3.2 Genomová charakterizaoe FPV rekoubinantú odvozených od pFP-UV2-PT

Aby bylo možné studovat funkční vlastnosti plasmidu

pFP-T?V2-PT, byl pro vede η pokus i v vivo rekombinsce ve fibroblastech kuxecihc embrya. Vzhledem k prítomnosti lacZ reporterového génu Ize rekombinsntni vír idsnti.fi ková t testováníi. modrých plskú. Ľylo vy br áno nekolík modrých plakú. Plaky byl?; trikrát vyčišteny. Southernova hybridisace celkové DNA z bur?*k i afektovaných FPV r e kombiné nty sondou EPV t k-génu a la o Z génu však odhalila/, žs nobyxy poz-orovány predpovedeué pásy tidô a lacZ gon··?^ leotidú se sondou žitý komplex oáeu (jeden nevý pás n asi 3 >00 páry nukloca dva pásy s asi 1 9'00 a β 3θθ páry nuk— FP? tk-genu.^ Kí sto toho byl nalazen slovČetno pánu pŕirodniho tk-genu, Pro dal ši krok čistení pláka n Southernovu analýzu byl vybrán jeden typický vírový x.jolát označený f-?Tl blue. 8 pdvodními trení čištšniini isolátu pŕes plak o?. Ikon jedenáct či.ŠtSní isolátu pŕes plak nezmenilo významne složitost komplexu pás á. V.-·: -loupcich 1 až 5 na obrázku 2A a obrázku 2B je ukázána Southernova analýza vírových DNA tretí, pátý, eedmý, devátý e jedenác-tý stupeň čištční pácií po zviditelnení sondou FPV tk-genu (obrázek 2A) a sondou lacZ génu (obrázek.

2B). Jlný ísclát, f-PT2 blue, vykcx/.oveypodobný- ale nikoliv identický systém DNA pásu (obrázek 2A a 2B, sloupec 6).

Behom všech stupňu nebo kel Šižtčni pŕes plak byly Často pozorovaný bíié plnky. Dva bílé plaky, f-PTl a 2 white, byly analyzovaný spolôČne s isoláty f—FT blue. Hybrid! zovaly sondu lacZ génu, ale nevyvinuly modrou barvu (obrázek 2B, sloupce 3 a 9). Hybridizácii sondou FPV tk-genu odhalila ve všech prípadoch pŕitcnnont pŕirodniho tk-genu (obrázek 2A, pasy 1 až 9» špička šipky). í'PV prírodní kontrola je videt nc aloupči 7 s negatívni kontrola (DHa fibroblastd kurecího embrya) ve sloupci 10. ŕro demonstrování toho, že tyto nečakané objavy neezietují díky částočnému štepení F.coítl, byl stejný blot jako je blot uvedený os obráz ku 2Am hybrinizován sondou ganu protrombínu. Jak bylo ukázá— no na obrázku 20, ve všoch pŕípadech (vyjma sloupca 6j tyto prúbehu v genomu f-xT2 bluo) byl detonován pouze jeden cás, pás protrombinu s 2 000 páry nukleotidu. To ukazuje, že reštrikční štépení bylo úplné. Složité pásy, které jsou vidét na obrázku 2A a 2B, gejšou tedy artefakty vzniklé díky vetší pásy nohou existovat díky slo ži tá j ši; ju rekombiaa č olmu

- 32 částečnému štépení vírové DNA, ale odrážejí. skuteČnost, že inaktivací vírového tk-genu insertním plasmidem pFP-UV2-PT nelze získat genomovč xuonoklonální rekombinant drábežích neštovic.

3.3 Konstrukce í’PV in;_ertního pla smidu pTKm—sPll—gpt

Aby byle možné zkontrolovat hypotézu, že tk-gen je podstatným v FPV kmeňu HP1.441, zkonstruuje se nový insertní plasmld, pTKm. Msto inserce cizího génu v tomto plaemidu je umísténo v intergeaové oblasti mezi tk-genem a otevrenou čtecí oblastí po sméru vlákna tk-genu (j'orf). Prírodní intergenpvá oblast mezi tk-genem a 3*orf neobsahuje jedinečná reštrikční místa pro inserci cizích génu. Tato oblast tedy byla modifikována jak ukazuje obrázek 3· Místaé ŕízenou mutagenesi byl bezprostredne po smšru vlákna stop kodonu tk-genu zaveden časný transkripční stop signál vakcinie (Pohralan G. a spol. 1 Celí 46, 1029 (1906)®) a jedinečná reštrikční místa 01eI_t Smal a Asp718. Do této modifikované zvétšené intergénové oblasti plasmidu pTKm byly ve dvou stupních vložený kazeta syDtetioký Pil promotor—laoZ gen a kazeta P7*5-gpt gen. Získaný plasmld byl oznaÔen pTKm-sPll-gpt (obrázek 4). Tento plasmid obsahuje lacZ gen pro testování modrých pla kú. a gpt-rgen jeko selekční merker. Po íntegraci do vírového genomu nebude štšpit a desaktivovat FPV tk-gen.

J.4 Rekombinantní vir drubežích nestovic s neporušeným

FFV tk-genem

Plasmid pTKm-sPll-gpt se postupné použije pro zkonetruování FPV rekombina ntň in vi vo rekombinacd ve fibroblasteoh kuŕecího zárodku. Všeohny plaky, ktoré se získají pod gpt-selekcí, se také barvily modré v prítomnosti X-gal v prevrstvené vrstvé. Bylo nutné pouze dvojí čištení piakň (pod gpt^selekcí), aby se získaly vírové isoláty. .Potom se jeden z isolátô označený f-ePllč.l, nechá rust ve velkém meŕítku a vyčistí se. Vírová DNA rekombinantu z pŕírodního viru se rozštepí pôsobením E00RI, rozdelí se na agarosovém gélu a analyzuje se Southernovým blotováním. Na obrázku 5A až 5G byly použitý rúzné sondy. Jednotlivé pásy znamenaj!: A) hybridizsce FPV tk—sondou génu. Päs 1 znamená DNA FPV

- 33 rekombinantu f-sPll č. 1, pás 2 znamená DNA FPV pŕírodního viru HP1.441, pás 3 znamená lambda DNA rozštépenou púsobením HindlIX. B) Hybrídizaoe sondou gpt-genu. Pás 1 znamená lambda DNA rozštépenou pôsobením HindlII, pás 2 znamená DNA FPV rekombinantu f-sPll č. 1, pás 3 znamená DNA FPV pŕírodního viru HP 1.441. G) Hybridizace sondami la o Z génu a fágové lambda DNA« Pás 1 znamená lambda DNA rozštépenou púsobením Hindlll, pás 2 znamená DNA FPV rekombinantu f-aPll o. 1, pás 3 znamená DNA FPV pŕiiodního viru HP1.444. Hodnoty, které jsou uvedený vpravo pro srovnání znamenají štandardy v tisioích pári nukleotidú. Na obrázku JA byly reštrikční fragmenty hybridizovány sondou FPV tk—génu. V rekombinantní DNA jsou viditelné dva nové fragmenty o J 200 páreoh nukleotidú a 4 700 páreoh nukleotidú (pás 1). U kontroly je viditelný tk-pás pŕírodnxao typu o J JOO páreoh nukleotidú. Po hybridizaci sondou gpt-genu (obrázek JB) byl ziskán fragment o 5 200 pároch nukleotidú. (pás 2), který obsahuje Část tk—génu a gpt-sekvenoe, zatímoo u viru pŕírodního typu nebyl pozorován žáďný signál, (pás 3). A konečné, hybridizace sondami lacZ génu a fágu lambda (obrázek JG) odhalila laoZ gen o 4 700 páreoh nukleotidú obsahující fragment rekombinantního viru (pás 2) a marker (pás 1). A opžt - vir pŕírodního typu (pás 3) nehybridizoval. Z tohoto pokusu lze vyvodít, že intergenová oblast mezi FPV tk-genem a 3*orf je ne-podstatná a že neporušený tk-gen ήπιο žňu j© čistení príslušných FPV rekombinantu..

3.5 Nové FPV hostitelské kmeny; f-TK2a a f-!K2b

Z technických a biologických dúvodú je obtížnčjší a viae času potŕebujici zkonstx-uovat rekombinantní FPV. Pred vložením génu, o který se jedná, do FPV, se proto obvykle zkonstruuje rekombinant podobného viru vakcínie, aby se študovala funkce príslušného génu. Aby bylo možné používat tj^ejné insertní plasmidy vakcínie také pro zkonstruování rekombinantu drúbežíoh neštovic, tk-gen viru vakcínie spolu s E.coli lacZ genem se vloží do intergeQOvé oblasti tk-genu a 3*orf viru drúbežíoh neštoviG. Flasmidy pTKm-VVtka a pTKm-VVtkb se zkonstruuji klonováním funkčniho VV tk-genu dí2 meziproduktu - do plasmidú pTKm-sPll (obrázek 4). Po rekombinaoi pTKm-Wtka a b s FPV pŕírodním viram se vytvorí

- 54 dva nové FPV hostitelské kmeny (pojmenované f—TK2a a fTK2b)· Nový hostitelský kmeň tedy obsahuje dva funkční tk-geny’ s lacZ gen. Všochny an nohou používa t j^ko nové—nepodstatná místu s príslušnými insertními plasmidy jako substráty pro rekombinací. Southernova blotová analýza nových kmeňu je uvedená ne obrázku 6Λ až 60, DNA pŕírodního viru KP1.441, n>v/ dva /rokombinanty a p la smidy p'fKm-Wtka a pTKm-VVtkb se rozštépi restrikôními enzymy PstI, ^lal a KcoRl, rozdélí se na 1% agarosovém gélu a prenesou se na nitrocelulosu. Bloty na obrázcíoh 6a až 60 se hybridizu.jí sondou FPV-tk-genu (obrázok 6A), sondou tk-genu viru vakcínie (obrázok 5B) a sondami lacZ génu a lambda DNA (obrázok 60). Ve v sôch štépanich lze pozorovať pŕedpovédéné sestavy pásu (väz obrázek 6D a 6E). V prípade spotení píisobením Olal malé hybridizujíoí fragmenty o asi 500 párech nukleotidi a 700 párech nukleotidú. v pásoch 5 a 6 na obrázku 6B nejeou videí pri št.épení pdvodnich. olasmidl pusobením Clal (pásy 15 a 14 na obrázku 6B). a e tomu tak proto, že plasinidové DNA se isolují z E.ooli kmene HB101, kmene, ktorý methyluje príslušné Clal Jnísto. Pri kontrolních pokuseoh bylo toto místo ätépitelné, jestliže se DNA pripraví z E.coli kmene negativniiio na Dani methylaci·

Príklad 4

Sasný/pozdni promotor viru drubežích neštovic v rekombirianteoh. viní vakcínie

4.1 Identifikace promotoru drubežích neštovic

Transkrinčn.i jednotka, která sestává z nroraotoru víru i %vakcínie a z kodující sekvence lacZ génu, je aktívni v bunkách E.coli. Výeledkem je fenotyp bakteriálních. kolonii, které rostou v prítomnosti chromogenniho substrátu X-gal, positivní na β-gslcktosidasu. Tento jev byl pozorován, jestliže se pracuje s insertní. mi plasmidy vakcínie, které obsahuj! E.coli lacZ gen v lacZ negativních E.coli kmenech (Chekraberti a spol. í Mol. Celí Biol. 5.» 540? ež 5409 (1985).). Jelikož promotorové sekvence FPV a vakcínie jsou funkčné ekvivalentní(Boyle a Coupars J. Gen. Virol.

67, 1591 až 1600 (1986), Taylor a spol·s Vaccine 6, 497 až 5θ5 (1933).)> milý by být autivuí v Ľ.coli také promotory drôbežíoh ne st ovi c. Na základe voho by la vypracováva stratégie identlfikace prvku promotoru DNA viru drubežioh. nestovic.

Jako pi’vní stupeň se zkovstruují plasmidy plľP—Z1 u pFP-Z21 (obrázok 3) · 0Oba plasmidy obsahují bezpxoinotorový la c Z gen. Jako rodičovský pla smi d byl vy brán plasmíd pEP-UV2. Obsahuje E.coli lacZ gen kontrolovaný 1'7.5 promotorem viru vakcínie, Pil promotorem a násobným klonovacím místem. pro účely klonovaní a j s obklopon tk-sekvencemi viru dxôbežích neštovic. Pro deletování promotoru vakoínie se zavede nové mícto EooRl. 7 pärô.uaiiíL·proti smeru vlákna iniciačního kodonu laoZ génu. Štepení pôsobením EcoRL a opätovná ligaoo vede k plssmidu pEP-Zl, který obsahuje jedinečná reštrikční raísta pŕilehlá k bezpromotorovámu laoZ génu. V daláím stupni se DNA kaene HF1-441 viru ôrubežích neštovic rozštépí pôsobením restrikčních endonuklsas Sspl a Ľcoitť a klonuje se do jedinečného mís ta Smal pňílehlého k la c Z génu plasmidu pEP-21 (obrázek 9)· Tyto plcamidy se ta?ausf©ktují do E.coli kmene NM552 negativniho na β-galaktosidaBu a vysejí se na agarové desky obsahujíci umpicilin a X-gal. Nechájí se rôst preš noc. U malého proces ta kolonií se vývine modrá barva· Eekteré kolonie se vyberou. Plasmidová iÄA se analyzuje analýzou prechodné exprese v CV*1 bunkách na expresi génu špecifického pro vir vakoínie (lata neuvedená). Plasmidová DNA induková ly (plasmidové DNA indukovaly) ruzná množství β-galaktosidasové aktivity analýzou prechodné exprese ve vakcínii. Pro další analýzu se vyber© kloň, který má nejvyssí úcínnoat (kloň č. 2), probotor se označí P2 a plaania se označí pJP-2 (obrazek 9).

4.2 Štruktúra promotoru P2 viru drôbežích neštovic

LNA P2 promo borového insertu o 2 500 pároch nukleotidu z plasmidu pl'T-2 se analyzuj© rostrikčníu mapovaním. Bylo zjišteno, že EcoSI/Nsitfragment o 550 pároch uukleotidô j© vedie lacZ génu a že tedy by mol obsamovar promotorové sekvenc©. Tento fragment se vloží do plasmidu pFP-221, derivátu plasmldu pEF-Zl, který má na 5’konci lacZ gen a —

polylinkerový insext (obrázek 3). Kazeta promotorového lacZ génu se pek vystrihne .? klonuje so do jediného místa

Hpal plasialdu pPZgpt-dP. Výsledkom jaou plcsmidy pTZgpt-P2a a pTZgpt-P2b (obľazoJ k 9)· Jelikoš orientaco tranykripční jednotky promotorového cizícuo génu mize ovlivnít hladinu transkripoe, oba plasmidy byly použitý pro daläí výskumy. Sekvenování-promotorového insext?. se íťéovádí pomoci plasmidu pTZgpt-Pkfi jako t om.pl átu. Primárni štruktúra promotoru a prvních dese t kodonu P2 génu je uvedená na obrázku 10A. 5*—Neprekladaná oblest má d.élku 174 párá nukleotidu a začiná v místé Nsil. Proti smeru vlákna iniciačního kodonu je prítomna, žachovaná. promotorová konvenční aekvence vi.ru neštovic TA.A/T (obrázok 10A, polohy -6 až -ž), která je typická pro pozdni promotory, ale nachází se také v nškterýoh čaenýoh promotorech. Uvnitŕ oblasti prvních 174 páru nukleotidú. proti smer u vl.ikno je prítomno také nékolik kritických časných oblasti násleoovcných stop signálem časné transkripce (TIlTTlvi). 3top signál časné transkripce se pŕekrývá s funkčné duležitou oblastí o ohotou na T pozdnich promotorú.

P2-lacZ t-x-ónskiipČní jednotka v plasmidu pTZgOt-Páa . je napojený geu. Po iniciačním kolenu následuj? 380 páru nukleotidu P2-genu napojeného ve fázi s 39 nukleotidy 5* nepŕekládané oblasti e kodující oblasti lacZ génu (dáte nejsou uvedená). Vypoctená molekulová Jxiota napojeného génu je 133 000.

4.3 Srcvnání sily P2 procftoru s jinými pxomoťory víru nestovio

Pro zkonstruování rekoainincntú. v?2s e vP2b vi.ru vakcínie použijí plaam.trly pTZgpt-P2a ó pľZupt-F2b„ i-íla· Pr proÄoru v obou rokomblnantech byle srovnávánu se silou jejich

várt obsahuje modifikovanou verši syntetického pozdního promotoru, který je 1,4 krát silnejší než Pil prírodní pronotor.

Ve vŠech vireoh je lack reporterový gen bezprostredné pŕilehlý k prírodním promotorCun víru nestovic·

- 37 ľro anal^ýzu β-galaktosidasové aktivity se CV-1 bunjjy infektují víry tak, jak je to popsáno v prvním príkladu. Obrázek 11 ukazuje enzymatické aktivity indukované rdznými vírovými kons t ruke emi v CV—1 bunkách. Aktivita pŕírodního Pil promotoru v vFls0 byls definovaná jako 100 %. Jq pozoruhodné o že b” orientaoe FPV P2 promotoru indukuje aktivitu 190 %. To ukazuje, že P2 proAor patrí k nejsinejším promotorum viru neštovic. Po dvacetictyrhodinové inkubační periodé je 0-galaktoeidasová aktivita jední a z nejhojneji se vyskytujících proteinú. Jeho množstvi je asi 6,3 % z celkového množstvi rozpustných bunéčných proteinú. Rekombinantní vír, který má ^Ma^M oriontaci P2 promotoru, indukoval 15θ % β-galaktosidaaové aktivity, což je asi 5 % rozpustných bunéčných proteinú. Bylo zjišténo, že vir várt indukuje 140 % β-galaktosidasové aktivity ve srovnání se standardními hodnotami indukovanými vllsP. iäerené β—galaktoóidasové aktivity znamenajl strední hodnotu ze tri na aobô nezávislých mšŕení, pokusú. Aby βθ potvrdily tyto hodnoty nezávislou druhou metódu, rozdelí se dvacetiótyiäiodinové extrakty infsktovaných 07-1 bunék na 10% polyskrylsmídových gelech a vyhodnotí se densitometrem. β-Galaktosidasová maxima byla kv^titstivné vyhodnocována vzhledem k pásu o molekulové hmoté 42 000 jako vnitŕnímu štandardu (aktin). Hodnota, která se získá pro vFls$, opét slouží jako štandardní hodnota 100 %. Dáte získaná tímto vyhodnocením jsou v dobrém souladu s enzymaticky etanovenými daty aktivít, jak ukazuje následující tabulka.

Tabulka relatívni exprese β-galaktoeidagy (procentá β-galaktosidasy v rozpustných proteinech) vir----^:----% aktivity % vyhodnocení

v)ľls3	100 (3,5 %)	100
vP2a	150 (5,0 %)	150
vPhb	190 (6,5 %)	195
várt	140 (4,6 %)	neetanovována

Pro ilustrování hojného výskytu P-galaktosidasy v bunečných extraktech 24 hodiny po infekci je na obrázku 12 ukázán poly® kry lanidový gel. obarvoný modrí oomassie obsahu jí c í veškeré rozpustné proteíny, Referenční vír, vľlsfJ, a rekombinant vert indukují nový pás v oblasti molekulové hmoty 117 000 (vis '4 j 5 Ú 10, nižší šípka), který neni vidét u kontrolního pí'írodnlho viru (pásy 1 a 2). Jak ukazuje sekvenačnl analýza, 3-galaktosidssový napojený protein indukovaný viry vF2a ·? vF2b je vetší než prírodní enzým, což protežuje jeho charakter jako napojeného génu (pásy 5 až 8, horní Šípte).

4.4 Optimalizace P2 promotoru

Pri pokusu optima1isovat P2 génový promotor byl zkonstruován panel nových insertních plasmidá, které obsahuj! mutované P2 promotorové oblasti napojené uo lacZ gen. Jako první stupeň se získá plasmid, který umožňuje prosté vložení dvouvláknových promótorových oligonukleotidu a obsahuje minimálni kazetu P7.5-gPt gen kväli selekci, Zkonstruování tohoto plasmidu., pFSgpt, j® uvedeno ne obrázku 13. Do jedinečných ľiiíst tohoto plasmidu Ndel a Ββπύίί se vloží ražné mutované promotorové oligonukleotidy mO, ml a m2. Výsledná p la smidy se označí pP2mOgpt, pP2mlgpt á pPžmkgpt (pPSmxál, obá/$&ek 14). V dalším stupni se E.ooli lacZ gen umíetí po smeru vlákna promotorcvých sekvencí. To vede k plasmidiim pP2mOgpt-.LacZ, pP.2mlgpt-lncZ a pP2m2gpt«lacZ (pPžmxgpt-.lac Z, obrázek 14).

V mutovaném promotoru mO (TAAATG ΛΑΤ TCO) je íTG lacZ génu pŕimo napojen na strední sekvenci pozdního promotoru. Dochási tak k deleci C-zbyt-ku v poloz» -1 prírodní P2 sekvence e tedy ke vzniku mutacc, která by mohla zlepšit učinnost pozdního proinotoru (obrázek 13). Tato štruktúra se nalézé v ranohr pozdních promotorech vakcínie a je považována za optimálni souvislost pozdního proiaotoru a iniciačního kodonu.

V mutantu ml (TAAACAľG· AAT TUU) je druhý kodon laoZ génu pMmo napojen na ATQ zdanlivého P z génu. V tomto mutantu je lacZ gen ŕizen P2 pŕirozeným promotorem (obrázek 15).

- 59 *

Mutaoe m2 byla zkonstruována proto, aby byle zkoumána úloha kritickýoh oblastí časného promotoru naoházejíoíoh se proti snčru vlákna v oblasti 1'2 génu. iľutovauý promotor m? má stojnou ..'rukturu jnko ml až na tom že kto p signál časná RNA uvnitŕ Ťunkžné dal·) žité na T bohaté oblasti proti smeru vlákna motiíu pozjtilho promotoru byl desaktivován lasami TTC do polohy -13 (obrázok 15).

Λϊ

4.5 VI.i v mutmí na čnsnou ~ požení oxoreci β-£β1

-y to nlcsmidy byly douč i ty pr o zkonstraovtni rakorabinantu víru vekeinin a pro infektováni CV-1 bunék. Oytoplasmové extrakty byly analyzovaný na Č-galaktosidasovou aktivitu. Výsledky jsou uvedený ne: obrázku 16.

Claims (3)

PATENTOVÉ N Á R O K Y

1 X

Λ O

C3

CC o o UJ —f

-P <x x

X

K

N o CO

Λ ’X · *>

« · tx!

*p ή

-P é, x o

ĹL·

c.

Cx * X

x.

/X

-T . J

1>V

EcoRI

Pvull

Ndel, Stul BamHI, Smal

Sali, Notl

VV-tk syntetici-ý linker

P-MCS(1)&(2) tk pFS50 (3550 pn) pFS51 (3700 nn) pTKgptFis

C7100 pn)

Λ

VV-tk

VV-tk

-s

Ndel

Stul.BamHI

Smal, Sali Notl pFSgpt o

Ό \3 co

U e*. K. Q cq

Q Si

CO

I i • Ο Cľ- » oligonukleoticrv

P-P2mx.1 & P-P2mx,2

Ndel BamHl '/'/ -tk

P V lí? pO -91.

-P ·*„ J Ή

O •H y

:c no vú/po ly 1 i n ko r o v á so kve n c o

I •Λ « ' X, r·

CC o o

UJ

4'

-P ···.. .·.·.. T?\11, -( - ^: '.· >

r>

-P • «

OJ ;-H

I p>

f·, r

Χ.Ί x

O

O -p

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 t

; Oiii: j i ti:'; riíi 1J.11O

Γ3

Ô

O O

ΙΛ ΝΛ r—1 < -¾

7^ ίΐΌ rcKoiniiaiiantníno f-'l’K'2b o o

ΚΛ i—I

Γ5 / \

W «Q '> iu Ľergonovč oblá t;1;i

-vložiť Psťl/Saui fragment (P7.5/P11) o 1200 n. čo kl>pl3 — Oňipraviť jednovláknovou xj-íh

- vložiť linkerovou seh-enci ne 3'konec i r» 7. rpjj.

EcoRI Pstl Sali Smal

FPV-tk

I o 900 celia:

FPV-

r-EcoRI | / Pstl í Í o ¹ Sali Smal í í - Kpnl j -f FPV-tk HP1-4

41 DNA (čpprox.SOOkb) •·Χ':

OS'

1 I.— zvetsená intergenová oblast

3*orf

4. Plasmid podie bodu 1, vyznačujici se že je ho možné získat místne níženou mutagenesí.

tím,

5. Plasmid podlo bodu 3, vyznačujici se tím, že je ho možné získať místne níženou mutag^nesí prírodní sekvur.ce sekvoncí primeru ^'-TTACACTAAATCQ^aCCCGGGATGG A TA A A A A CCTTA Z TTA OTA- 3 * ·

6. Plasmid po^vle |ZfKm na obrázku. 4A.

7. Plasmid pro inserci cizi DNA do FPV in vivo homologní re— kombinécí, v y z n a Č u j í c i tím, že

- 41 se uvedený plasmid pripravuje z pla smidu podie bodá 1 až

6 a obsahuje·:

a) prírodní nebo syntetický promotor viru aostovic napojený na cizí DNA sekvenci, ktorú se expresuje,

b) druhý promotor víru nečtovic napojený na gen kodující marker nebo indikátor pro výber (selekci) rekombinantního í'PV a

c) DNA sekvence xŕV obklopující konstrukci prvkú. podlo acl

a) a ad b) na obou 5* a 3* kone ich., pri Čcmž uvedené obklopujici DNA sekvence jsou hoziologní se sekvencemi proti smúxu vlákna a po smeru vlúkru. cvetsená inteigenové oblasti·

8,. Plasmid podie bodu 7, v y z n a č a J í c i s e tím, áe dále obsahuje replikou pre replikaci plasaidu v prokaryotickém hostiteli a gen kódujíci selektovatelný narker nebo indikátor pro selekci (výbek.) plasmidu v trsnsformovariém prokaryotickém hostitelí.

9· Plasmid podie bodu 7 a 3, vyznačujici s e tím , že promotor je bezprostredné prilehiý 2:e kodující sekvenci cíz-líw génu.

10. Plasmid podie bodu 7 až 9, vyznačujici se tím , že se jako promotor víru neštovic používá FPV P2 promotor, který má částesnou nebo úplnou sekvenci DNA jak niže uvedeno:

Nsi

GAAAAGGáAA. CÍA'ívAaAAG

-125 íAxAGGGGAC AAGl’AáGTAA TTGTAAAGAA

-99 -95 ύύϊϊϊΑ'ÍGuil. rGATAG^AA^AAGAΑΊ'Α TA

ACTATTTTTTATAGCCTATAAATC ATG GAA AAG AAA CTG ATT GAA

GAG TA T GAA nebo jeho funkční ekvivelent.

11. Plasmid podie bodu 7 až 10, vyznašující se tím , že se jako promotor víru neštovic používá mutant FPV P2 promotoru, který má DNA sekvenoi uvedenou na obrázku 15.

12. Plasmid podie bodu 7, vyznačujíoí se tím , že se používá insertni plasmid pTEm-sPll-gpt z obrázku 4A, v nemá laoZ gen je nahrazen DNií sekvancí, která má být expresována.

13. Rekombinantní VPF pro expres i cizího proteinu nebo jako vakcína, který ja získatalný in vivo rekombinací príroda ního FPV plasmidem podie bodu 7 až 12.

14. Rekombinantní FPV f-TK2a a f-TK2b jako hostitalský vir, vy z n. a δ u j í c í se tím , že obsahuje alespoň neporušený FPV tk-gen a také Vv tk-gen, z niohž kterýkoliv múže sloužit jako ne-podstatné misto (NES) pro inserci jedné nebo více cizích DNA sekvencí.

15. Rekombinantni FPV podie bodu 14, v y z n a č u j í c í s e tím , že dále obsahuje gen selekčniho markeru a/nebo reportaru.

16. Plasmid podie pTZgpt-P2a na obrázku 9.

17. Plasmid podie pTZgpt-P2b na obrázku 9.

18. Plasmidy podie pP2m0gpt, pPSmlgpt a pP2ai2gpt (pP2mxgpt) na obrázku 14A.

_xpodle

19. PlasmidYpFS50 na obrázku 13A.

_xpodle

20. PlssmidYpFS51 na obrázku 13A.

21. Plasmid podie pFSgpt na obrázku 13A.

\Ppdle

22. PlasaidrpTZgpt-Fls na obrázku 1/A,

23· Plasmid podie pTZgpt-PllM na obrázku 1?A

24. Plasmid pro vložení cizí DNA a následnou integraci do hostitelských kmeni podlo codu 14 in vivo rekombinací, vyznačujúci se tím , že jde o jeden z následujícícli plasmidô:

a) pFP—U2 na obrázku 1, pTKm na obrázku 4A, pFS^O. pFS^l s pFSgpt na obrázku 13A, pP2mxgpt na obrázku 14A, pTZgpt-Fls a p'ľZgpt-l'llJá ne obrázku 17 A a

b) pTRm-sPll-gpt na obrázku 4A_t p'2Zgpt-P2a a pí'Zgpt—P2b na obrázku 9 a pIZgpt-sPx na obrázku 17B, pri čemž laoZ génové inserty v týchto plasmidech jsou nahrazeny DNA eekvencemi, kieré moji být expresovány.

25. Plasmid podie bodu 24, vyznaČujíoí se tím , že sFx v konstrukoi plasmidu plZgpt-sPx znamená sPll, S4b nebo sart jak je to uvedeno na obrázku 18.

26. Rekombinantni FPV pro expresi cizího proteínu nebo jako vakcína, který je získatelný in vivo rekombinací hostite lského kmene podie bodu 14 a kteréhokoliv z plasmidu podie bodu 24.

27. In vitro kultúra vertebrálníoD bunék, vyznačuj! cí se tím , že je infektovana rekombinantním FPV podie bodu 13 nebo 26.

28. In vitro kultura podie bodu 27, vyznačující s e tím , že sectává z ŕibroblastových bunék kurec í ho zárodu. (GEN) nebo kožních (dermálních) bunék kurecího zárodku (JED).

29. Spôsob rekombinantni prípravy proteínu, vy z n a č u j í c í so tím , že se vertebráiní hostitelské bunky nebo bunečné kul rúry infektují rekombinantním virem podie ktoréhokoliv z pžedoházejlcích bodu, pri čemž uvedený rekombinantni vír obsahuje DNA kodující uvdený protein a uvedený protein se isoluje.

30. Zpúsob podie bodu 29, vyznačujúci se tím , že dochází k expresi jednoho z následujících proteinús faktor II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII a XIII, proteín U, proteín 3, von Willebrand-faktor, dseninogen e jeho deriváty, v nichž jedna nebo více aminokyselín je substituováno, vynacháno nebo vloženo, čá3tečných sekvencí e jejic.h nktivovaiiých forera, apolíproteiny, jako je napríklad apoAI e apoAII, a vírové antigony, jako je napríklad antigen(y) hepatitídy B, antigény^viru hepatitídy C, antigény viru hepatitídy E, antigenyhénoe· falitidy prenášané klíótetem (TBE), antigény HLV, HSV s celé nebo částečné sekvenoe takových. ontigenú organistu, které zpúsobují pertusis (černý kašel), tetanus, malárii, choroby drúbeže, Markovu chorobu, ILT, infekční choroby, bronchitídu, kokoidiosu a Newaastlovu nomoo, snom uvedené .antigény jsou užitočné jiako vaKcíny·

31. Vakcín© proti antigénom pethogenä infikv>.jícich pt&ky e. obratlovce, v y z n a č u j í o í s e t í m , že obsahují rekombinaatní FPV podie bodú 13 až 15 a 26,

52. DNA sakvence FFV r 2 promotoru podie bodu 10, ,její částečná sekvonce nebo její funkční ekvivalenty.

35. DNA sekvence obsahujíoí FPV P2 promotor , P2 gen a 3* sekvenci jako uvedeno niže:

líšil -125

ATGOATTTGT 1AGAGCT1*GG TATAGCGGAC A/CTAAGTAĹ TTGÍAAAGAA

-99 -95 -86

GAAAACGAAA CTATCAZ UC CGTTTATGAA ATGATAGAAA AAAGAATATA

AA1AATJC1V lATTTTAGTT TAAGTAACAG

--19 -1+1

AOTá'.JTl’tTTATAC^CTATA /kčTCATGGAA *4 <2

TAAAATAATG ACTAGAZA'T

Á^hAAACTGA TTCAAGAGTA

ΤΘΛ

TCTCTTÍACG

AGGCAGGTAG ľTATCTGC.U

GGTGGC.

TGC-A OAACAT GACTAáGTTA

ATTaG'KtAOG TATTTAGAAG AT'TGGCTGGA GGTAGTAGOA AAGCACCCAC

CGA GA. AGTCG GA TA TTGATA AGuCaGaGCC OvAriGw'I'AGC GAAOCCGAAA AAGAOTCTTC A CCCGA. A A ΑΛ GGCTCTTCTA

TACGTAA1AA AGAAi/xTAAT ATATTATTAT TTAATTTAAA TA TA TTTTG-C TCTA G T C OCA

k TATATATTAA TGTTTTAA CT ACATCCGTTC TTTATOACGT TTTATCATTA CTTTTTGT.AA GCAGATi'TAA T^: -Γ; •'Π·*’ x 1'71 VJ.J.V.1U x GCACCCAAAA A TA A TA T CG T CTATA'TGTTT .ATATOACCAA

nebo jújí Cč&tecíjéi 3e

54. Bekojublnaiitiií I-rV, že 3*—oblást pi> feifiexu.

ne— po<2& va c*ne 71.1 s o o pi¹

CGATGCCTCC TTCTAATG.AT GCTGGTTCTG gaaagtaaac cacccgagca acgctctccc TAGTAAACCA TCAGATCAAC CTACTCCCOA GCAAACCGGG TACAGATATC TTTAGTGGTT TTTTGAAAGA ACTGTTGGAG CATTTAIOCA TCAATTGAGT TAATGT.UTA ACTTTTTACA AATAC’GAAAT TAGCAAAAAA TAATGATTAT TAATAATTAA TTTATAAAAT ATTTATTGTC TATCGTACGT GGTAGGTAGT TATGGATGTT TGA TA GTA A A TAGTATCAGA

GA TA TA ΟΛΑ T ACATGTATTA AGGATTAvOC GATOTGTAAŤ ATATAA ΑΛΛΤ AAATACCATA TCATGGTAAA AATAGTGTTT GTGATGäaTTC

EcoKE cveuce nebo j e j í funkční ekvivalent, ryznačujici se tím, vlákna 1^?PV P2 génu ee použivá Jako ineorci cizí DNA.

pC u- cv-rr&ki ₍ ZtZ

A) pFP-UV2

P7.5

Ssp I

Nael

I 'í

Ä^rSOV ;

» -. f O c d _t ^Λ“^- á vy n ·

123456789 10

500 υη

5p00 m

2C00 pn ' ( u f 1/ ruJ:i;ura I''PV-obla:jti v insertnírn enú intor/genová obl-ic

C-Ž

Ci

Cl·

Cl· c <;

H’

Nae pTZ

FP

Clal

Smal

Asp718 pTKm (5000

EcoRI

Pstl ρΤΖ

FPV-tk

FPV-tk £ b

Sna!

3 on

Smal

Scal

FP ιη^ε •J.S O jSUlľl

3 'orf

Scal

FPV-tk

Nael gpt pTKmsP11-gpt

VV-tk

Dral t

-F1s pTK-gpt nu.

tk ,<Λ

U

x.

x.

• > -X

L

1. Plasmid, vyznačujici se t i m , že obsahuje alepoň FPV tk-gen, po smeru vlákna intexgénovou oblasť a nás.ledující 3* otevŕenou čtecí oblasť (3 *oxf) viru drúbožích neätovic (FPV), kde uvedená iatergeňová oblast je modifikovane tak, aby tvorila zvetženou interne novou. oblast, která obsahuje jedno nebo více jedinečných restrikčních míst, což umožňuje inserci oizi DNA takovým zpúsobem., že FPV tk-gen zústává neporuáen a kóduje celou thymidin-kinasu (TK).

2) promotonová aktivita

P1/ Mol p vFlsb vmO tmi vm2 w-wt

b) časná oroaiotorová aktivita vPTx vm3 unl vm2 vFlsft γι/

Hindlll

Pvull

Pvull

Pvull t k

Pvull f 1 pTKgpt-F1 s í 7100

P11M pTZgpt-P11 M

V2 3

Asp718

P11 M-mcs

Hindlll

-Hind III, Asp718. Klenow pol

Hindlll

Pvull pTZ19R pTZgpt-dP (6700

Pvull — pTZgpt-F1 s f 1 -ori

M13mp18-UV3 nshrad.it pUC Prali fragment pTZ Pvull fragmen

Hpa l Bam Hl Hinc II Sal I, Z Pst I Eco Rl

-Pstl, Hpa I, Klenow pol

Hpa l-linker (7500 pn;

Obnásel·: 17-4 (2700/cn)

M.3fäOV . ·? ;·; λ Λ O d d : dv'dn ^:

Srna I

Bam Hl

Hinc II

Pvull

Hindlll

Pvull f 1 - o r i íh'T χη-.π?.κ_(ο

-ζ 1 Ό *-< ____ λ- Ό Εΰ / ζ ^{> Τ >} Ό ι Ό 7 ο 1 -I Ο£ ΓΧΙ Μ Α *8 Λ s •ο

*

tn (Λ Ln <Λ cn * ω ' •U * 1 O T ·—* 1 G) Cr { o o G> o o Ώ <n > O -3 > ►J >-3 o •-3 > o > G O > H O > t-3 •-3 O > »-q t-3 »-2 Ó > ,-3 ►-Ô H »•3 G) H •-3 h3 v-9 > > ♦j O •-3 t—2 O O -9 i-3 •-3 > S O >-9 K L i-Ξ > »-5 »-3 ..5 > Ó ._í >-9 G) 2. > O c5 O > > A »—2 í-2 > > > O O > > O > > >-3 -3 > 1-3 »-3 -3 > •-3 > O O G) > > n > O-, o H -9 Ό |J -3

2.5kb

IscZ t

tzcZ

Sali Pstl EcoRI

Scal

Ζ-»

BarriHI

P7. 5 pTZgpt

P2a

FPV-tk

V V -1 k

FPV-tk

Stul Sali Barr.HI Balí pFP-Z2\

EcoR

FPV-tk pTZgpt

/_äcz ,ý pTZgpt ^V⁷'⁷·^ EccRI Me. /pHHir.c Pstl ’Z; X Sali - / P v u! P 2 —M/x' p TZ /L-.- \ .. S Ξ ! / ' ’ · r 1

' * Kje 11/ ο

>

>

>

H

O > 0 A >-3 O H O H O o > > h-3 i-3 0 •-9 > 0 > o CH »-2

> O H > i-g h

t-3

H > H > 0 ry

Q

H >

H >

>

>

H O

> £-3 > 0 0 > > -3 O > O 0 »-3 H > 1 0 *>J ⁰³ > CÄ 0 > •-2 > > > >-3 0 > > 0 > O h-3 0 > 0 h9 > > O

>

i-3

O >

>

h-3 > H H

O >

>

>

>-3 >

i >-> m Ui w το

< o 0 o < H H H < E^-1 < < o < 0 -x* < O O O o o < < H H O < O < o H (J < C9 r , Eh < O H o o O H S H u H < o < o < H H 0 H < H o o < 0 0 . x Eh < H < Ch o < < o r \ < H O < o o o < r i < H < H u o H H H H H H < o < o < H < ^r* C O < < o o U H H < < < o 0 o 0 H < <

.< < O Eh < c _^Λ O Eh Eh 0 Ch < H U 0 Eh r , 0 < < < < 0 0 O < Eh H < O 0 O 0 U 0 < Επ’ Eh Eh Eh Eh 0 Eh < < o O O Eh Eh U <- U o 0 Eh Eh Eh < Eh 1¾ Q o 0 O Eh < Eh < O Eh 0 0 o H En O Eh Eh Eh 0 C 0 H O Eh Eh < εζ 0 Eh Eh Eh < Q 0 0 O 0 Eh 0 < Eh Eh 0 •H 0 0 C <' Eh < Eh Eh < Eh < Eh Eh o Q Eh Eh Eh 0 < H Eh O < < Eh <* Eh Eh 0 Eh 5h .< 0 < Eh < < 0 < < U O Eh < O < Eh < < H < < < < O O 0 < En H Eh H < 0 < O U 0 < Eh C-( Eh O 0 Eh o O Ch Q < < < 0 0 < o o Eh Q Eh H < Eh ω rtí En O En Eh 0 < O Eh Eh o H < < < Eh Eh u Eh 0 < <; Eh H Eh Eh < o < Eh < o O H Eh 0 Eh .< Eh Eh o o o Eh En Eh < 0 o O O o o U < H Eh < o O O o Eh O Eh ŕť Eh < < Eh o Q o Eh Eh 0 Γζ < H 0 U Eh Eh 0 Eh Eh Eh 0 0 H Eh O O Eh Eh Eh < < < 0 H 0 0 Eh O Eh Eh < 0 Eh < U < Eh O Eh O C Eh 0 < Eh H Eh < Q O Eh Eh Eh Eh < O H 0 O 0 O < < .< < H < O < 0 < Ch H Eh 0 <

Eh < < C < < < Eh Eh Eh Eh Eh O Eh Eh Q 0 Q Q 0 0 ŕČ Eh < Eh < 0 ŕí < < < Eh Eh 0 0 < ŕť Eh < Ch O .< Eh <] Eh 0 ŕť Eh Eh 0 Eh Eh O << Eh Q 0 0 Eh Eh 0 Ch < U ' En < O 0 Eh Eh Eh < 0 Eh C“¹ 0 0 Eh 0 0 Eh Eh Eh H < < 0 0 < < < 0 Eh 0 0 0 Eh En < < 0 0 O < Eh .< Eh 0 Eh < H ω Ch 0 H 0 0 Eh < En < Eh Cť H < < < 0 < 0 ŕť Eh 0 < < 0 Eh .22 < < U Eh 0 C H Q Eh < υ < 0 < 0 O C-1 < Eh < [h Eh ľj < — < O < ŕť Eh 0 Eh Eh < Eh Eh 0 0 0 o O 0 Eh < 0 En 0 < Eh ŕ—< .< o < 0 < O Ch < 0 O 0 < •5 C-i < o < < H .< [h 0 * -*j 0 < 0 0 fZ, Eh 0 < < u < ^H < E-h 0 0 0 < H “—1 0’ 0 0

/.ť

-2.0 /

-I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

- 2.3

2. Plasmid podie bodu 1, vyznačujici se tím , že po sokvenci tk-genu nasleduje stop signál časné transkripoe viru neštovic.

3· Plasmid podie bodu 1, vyznačujici se tím, že uvedená zvetsená intergenová oblast obsahuje uaásledujíci sekvonoií

AGTAATTAAGGTTTTTATCGATCCCGGGTACOGGTTTAGTG'TAATäAATTTAAT tk-gen

SmalL---Asp?18 zve t sená iŽe^gen. oblast

AA A ATATTGA CAAAA TA GTTAAATGAA TA TA TGAAAGTA CA TTA TA CA CGGAATGGAG i

> ►-3 Q > > O H > H O > 1 > > •-3 •-3 ►3 _ -3 > > 1 O > > > >-3 > > > g 3 h3 > > > i-3 H > > o -1 > >-3 > o

-η.

VLQHO ⁴. ου