HUT62653A - Process for producing recombinant avain poxvirus and vaccine comprising same - Google Patents

Description

REKOMBINÁNS SZÁRNYASHIMLŐ VÍRUS & -fAfiJTPiLM(AHP Ü416CW4

E^O aIm ' TÁS fc’KJÖ

IMMUNO Aktiengesellschaft, Bécs, Ausztria

Feltalálók:

Dr. DORNER Friedrich, Bécs

SCHEIFLINGER Friedrich, Orth/Donau

Dr. FALKNER Falko-Günter, Mannsdorf

AUSZTRIA

A bejelentés napja: 1992. 08. 26.

Elsőbbsége: 1991. 08. 26. (91 114 300.6) Európa

A találmány rekombináns szárnyashimlő vírusra (FPV), specifikus vektorokra, új erős promoterekre, új FPV gazdasejt törzsekre, valamint fehérjék rekombináns DNS technikával történő előállítására vonatkozik.

75518-1679-GI

-2A szárnyashimlő vírus a madár himlővírusok őstípusa, tipikus himlővírus szerkezettel rendelkezik. A vírus genetikai anyagának méretét 200-240 x 10® Daltonra becsülik.

Madarak himlője, jóllehet világszerte elterjedt, nem okoz közegészségügyi problémát, mivel a madár himlővírusok gazdaspecifikussága madarakra korlátozódik, és kizárja az emlősöket. Egy gazdaszervezet megfertőzése után megindul a vírus DNS szaporodása, a fertőzés 60-96. órájában lejátszódó korai fehérje-szintézis után pedig a késői fehérjék szintézise indul be. A fertőzőképes virionok összeállása a 72-96. órában történik meg.

Az FPV-t csirke embrió fibroblaszt (CEF) sejteken, csirke embrió dermális (CED) sejteken, valamint kacsa embrió fibroblaszt (DEF) sejteken sikerült növeszteni szövettenyészetben. Szövettenyészetben a vírus ciklusa hasonló, de gyorsabbnak tűnik mint a madarakban. A CED sejtekben a DNS replikáció a 12-16. órában kezdődik, és a fertőzőképes vírusok először 16 óra elteltével jelennek meg, és számuk a fertőzés utáni 48. óráig folyamatosan növekszik.

A vakcínia vírus (W) esetében, amely az orthopox vírusok őstípusú tagja, Panicali és Paoletti [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 79, 4927-4931 (1982)], valamint Mackett és munkatársai [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 79, 7415-7419 (1982)] egy in vivő rekombináció néven ismert technikát fejlesztettek ki, ami helyspecifikus rekombinációval lehetővé teszi az idegen DNS beépítését a vakcínia vírus genomjába. Ennek a technikának a kidolgozása vezetett a vakcínia vírusnak mint

-3eukarióta expressziós vektornak a felhasználásához élő rekombináns vakcinák előállításában. A rekombináns himlő vírusokat általában úgy állítják elő, hogy idegen géneket építenek be a virális genomnak azokba a régióiba, amelyek nem lényegesek ahhoz, hogy sejttenyészetben szaporodjanak. A rekombináns vakcínia vírusok esetében a timidin-kináz (tk) gén egy ilyen nem-esszenciális (NES) hely, amely emellett lehetővé teszi, hogy a tk-negatív rekombináns vírusokat szelektáljuk.

A rekombináns FPV készítésénél ahhoz hasonló elvet alkalmazunk, mint amelyet a rekombináns vakcínia vírusnál leírtak. Számos nem-esszenciális helyet közöltek, beleértve a szárnyashimlő vírus timidin-kináz génjét az FPV-M3 törzsben [Boyle és Coupar a PCT/AU87/00323 számú szabadalmi bejelentésben; Boyle and Coupar, Vírus Rés., 10, 343 (1988)], amely a vad típusú FP-1 törzsnek egy 900 bp méretű PvuII fragmensén található [Taylor et al., Vaccine, 6, 497-503, 504-508 (1988)], valamint az orf 7 és orf 9 nyitott leolvasási keretek közötti intergenikus régiót [Drillien et al., Virology, 160. 203-209 (1987); Spehner et al., J. Virol., 64, 527-533 (1990)].

Újabban számos kutatócsoport leírta az FPV rekombinánsok készítését. Noburu és munkatársai az EP-284 416 publikációban írnak le számos genomiális inszerciós helyet, amelyek nem esszenciálisak az FPV szövettenyészetben való növekedése során. Paoletti a WO-89/03429 számon közrebocsátott PCT bejelentésben FPV rekombináns előállításához való vektorokat ír le; ezek az idegen antigéneket kódoló gének • · ·

-4expresszióját különböző vakcínia promoterek szabályozásával írják le.

Emellett Binns és munkatársai a WO-90/04638 számon közrebocsátott PCT bejelentésben számos FPV promotert írnak le B-galaktozidázzal végzett tranziens vizsgálatok alapján. Drillien és Spehner az EP-314 569 számú leírásban olyan FPV rekombinánsok készítését írja le, amelyek vakcínia promoter szabályozása alatt álló kanyaró F fehérjét kódoló gént tartalmaznak. A gént az FPV genomba szövettenyészetben nem létfontosságú helyre építették be.

Cohen és Panicalli a WO-90/02191 számon közrebocsátott PCT bejelentésben egy olyan rekombináns szárnyashimlő vírust írnak le, amely patogének immunogén fehérjéit képes expresszálni. Ez a rekombináns FPV az alapja egy szárnyasokban valamint egyéb állatokban használható élővírus vakcinának.

Kutatásaink során felismertük, hogy az FPV HP1.441 törzsben egy érintetlen timidin-kináz génre van szükség ahhoz, hogy stabil, megjósolható genommal rendelkező rekombinánsokat kapjunk.

A mai napig nem tisztázódott tudományos alapossággal, hogy a tk gén milyen mértékben esszenciális az egyes FPV törzsek számára. Ennek a bizonytalanságnak a megszüntetésére egyéb olyan részeket kerestünk, ahova idegen DNS beépíthető, és azt találtuk, hogy az érintetlen tk gén és a 3' nyitott leolvasási keret közötti intergenikus régió egy előnyös inszerciós hely. A találmány tárgykörébe tartoznak továbbá olyan új FPV gazdatörzsek, amelyeket úgy módosítót

-5tunk, hogy egy vakolnia vírus timidin-kináz gént és egy Escherichia coli lacZ gént tartalmazzanak új nem-esszenciális helyként, ezzel lehetővé vált, hogy bármely olyan inszerciós plazmidot használni lehessen, amely a vakcínia vírus tk határoló régióit tartalmazza. A találmány tárgyát képezik továbbá új, erős promoterek, valamint számos előnyös plazmid konstrukció.

A találmány szerinti eljárás előnyeinek igazolására olyan FPV inszerciós plazmidokat készítettünk, amelyek az idegen marker gén inszerciója helyeként vagy a megszakított virális timidin-kináz gént, vagy az érintetlen tk gén és a 3' nyitott leolvasási keret közötti intergenikus régiót tartalmazzák. A mindkét típusú kísérletből származó rekombinánsok genomiális szerkezetének vizsgálata felfedte, hogy csak érintetlen timidin-kináz gén jelenlétében lehet stabil, megjósolható genommal rendelkező rekombinánsokat kapni. Ez az eredmény erősen azt sugallja, hogy az FPV tk génje teljes egészében lényeges a vírus sejttenyészetben való növekedése szempontjából.

A mellékelt 1. ábra a pFP-UV2 és pFP-UV2-PT szárnyashimlő vírus inszerciós plazmidok konstrukciós sémája. A rövidítések jelentése az alábbi:

FPV-tk = szárnyashimlő vírus timidin-kináz gén;

W-tk = vakcínia vírus timidin-kináz gén;

Pll = a vakcínia vírus fő, késői 11 kD polipeptidjének promotere;

P7.5 = a vakcínia vírus 7,5 kD méretű polipeptidj ének promotere;

•·· · ·«

-6lacZ = B-galaktozidázt kódoló Escherichia coli gén (a nyilak a transzkripció irányát mutatják).

A 2A-2C ábrák a pFP-UV2-PT inszerciós plazmidból származó FPV rekombinánsok Southern biot elemzési eredményeit mutatják. A fertőzött sejtekből össz-DNS-t izolálunk, EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, 1 %-os agaróz gélen elválasztjuk, majd nitrocellulóz membránra átvisszük. A membránt ³²P-vel jelzett FPV tk gén próbával (2A), egy lacZ gén próbával (2B) és egy protrombin gén próbával (2C) hibridizáljuk. Mindegyik ábrán az 1-5 jelű csíkok az f-PTl-blue FPV rekombinánsból származó DNS-eket jelent a tarfolt tisztítás különböző fázisaiban (3., 5., 7., 9. és 11. lépés). A

6. csík egy eltérő izolátum, az f-PT2-blue látható. A 7., 8. és 9. csík vad típusú FPV és két független fehér tarfolt izolátumot (f-PT-white-1 és -2) tartalmaz. Negatív kontrollként csirke embrió fibroblaszt DNS-t láthatunk a 10. csíkban. A 2A ábrán a nyíl hegye a vad típusú FPV tk-gén sávjára mutat. A jobboldalon megadott értékek ezer bázispár egységben (kb) vannak megadva.

A 3A ábra a mutáns és a vad típusú szárnyashimlő vírus tk kódoló helyének szerkezete. Az FPV tk génjének az 5,5 kb méretű EcoRI fragmensen, valamint a 2,48 kb méretű BamHI/Clal fragmensen elfoglalt helyét mutatja. (A tk gén kódoló régiójának közepén található egyetlen Ncol hasítási helyet használjuk a pFP-UV2 inszerciós vektor készítésénél.

Közvetlenül a tk gén után az intergenikus régiót módosítottuk, és oligonukleotiddal vezérelt helyspecifikus mutagenezissei meghosszabbítottuk, a tk gént és a 3' orf régi-7• ·· ······ • · · · · ···· ·· · · · ·« · ót érintetlenül hagyva, miközben egy transzkripciós stop jelet és számos előnyös restrikciós hasítási helyet építettünk be.

A 3B ábra a vad típusú FPV-nek és a módosított intergenikus régiónak a szekvenciája. A módosított intergenikus régió megtalálható a pTKm rekombináns plazmidon és származékain.

A 4A és 4B ábra a pTKm-spl-gpt, pTKm-Wtka és a pTKm-Wtkb FPV inszerciós plazmidok készítését mutatja. A konstrukciók részleteit a kísérleti részben részletesen tárgyaljuk. Az alkalmazott rövidítések jelentése:

sPll = szintetikus vakcínia vírus késői promoter, amely a vakcínia fő, késői 11 kD polipeptid promoteréből származik;

3'orf = a szárnyashimlő vírus tk génje utáni nyitott leolvasási keret;

gpt = az Escherichia coli xantin-guanin-foszforibozil-transzferáz enzimet kódoló gén.

A többi rövidítés jelentése ugyanaz, mint amit az 1. ábránál. A nyilak a transzkripció irányát mutatják.

Az 5. ábra a tisztított f-sPll 1 FPV rekombináns és a vad típusú FPV vírus EcoRI restrikciós enzimmel emésztett DNS-ének Southern biot elemzését mutatja.

A) A biottot az FPV tk-gén próbával hibridizáltuk. Az 1. csíkon a rekombináns f-sPll 1 FPV DNS-e látható; a 2. csíkon a HP1.441 vad típusú FPV vírus DNS-e látható, a 3. csíkon a Hindin restrikciós enzimmmel emésztett lambda DNS látható.

B) A blottot a gpt gén próbával hibridizáltuk; az 1. csíkon a HindlII restrikciós enzimmel emésztett lambda DNS látható; a 2. csíkon az f-sPll 1 rekombináns FPV DNS-e látható; a 3. csíkon a HP1.441 vad típusú FPV vírus DNS-e látható.

C) A blottot a lacZ génből és a lambda DNS-ből készített próbával hibridizáltuk; az 1. csíkon a HindlII restrikciós enzimmel emésztett lambda DNS látható, a 2. csíkon az f-sPll 1 rekombináns FPV DNS-e látható; a 3. csíkon a HP1.441 vad típusú FPV vírus DNS-e látható. (A jobboldalon megadott értékek standard ezer bázispároknak felelnek meg.)

A 6A-6C ábra az f-TK2a és f-TK2b FPV rekombinánsok Southern biot elemzését mutatja. A biottokat az FPV tk génből készített próbával (6A ábra) , a W-tk génből készített próbával (6B ábra) és a lacZ génnel, valamint a lambda DNSsel készített próbával hibridizáltuk. Az 1. csíkon a PstI restrikciós enzimmel emésztett FPV vad típusú DNS-ét (HP1.441) látjuk; a 2. csíkon a PstI restrikciós enzimmel emésztett f-TK2a DNS-t láthatjuk; a 3. csíkon a PstI restrikciós enzimmel emésztett f-TK2b DNS-t láthatjuk; a 4. csíkon a Clal restrikciós enzimmel emésztett FPV vad típusú DNS-ét (HP1.441) láthatjuk; az 5. csíkon a Clal restrikciós enzimmel emésztett f-TK2a DNS-t láthatjuk; a 6. csíkon a Clal restrikciós enzimmel emésztett pf-TK2b DNS-t láthatjuk; a 7. csíkon az EcoRI restrikciós enzimmel emésztett vad típusú FPV DNS-t (HP1.441) láthatjuk; a 8. csíkon az EcoRI restrikciós enzimmel emésztett f-TK2a DNS-t láthatjuk; a 9. csíkon az EcoRI restrikciós enzimmel emésztett f-TK2b DNS-t «·«· · *· « * t · -»'·*·♦· ·«· t · * · · » »· « ♦ ♦ ·» *

-ΟΙ áthat juk; a 10. csíkon a marker DNS-t láthatjuk; a 11. csíkon az EcoRl restrikciós enzimmel emésztett pTKm-Wtka DNS-t láthatjuk; a 12. csíkon az EcoRl restrikciós enzimmel emésztett pTKm-Wtkb DNS-t láthatjuk; a 13. csíkon a Clal restrikciós enzimmel emésztett pTKm-Wtkb DNS-t láthatjuk; a

14. csíkon a Clal restrikciós enzimmel emésztett pTKm-Wtkb DNS-t láthatjuk; a 15. csíkon a PstI restrikciós enzimmel emésztett pTKm-Wtka DNS-t láthatjuk.

A 6D ábra az f-TK2a szárnyashimlő gazdatörzs DNSének EcoRl, PstI és Clal restrikciós enzimekkel készített hasítási térképét mutatja. A számok a fragmensek becsült méretét mutatják ezer bázispár egységben (kb). Az alkalmazott rövidítések jelentése a következő:

FPV-tk = szárnyashimlő timidin-kináz génje;

sPll = szintetikus Pll promoter;

lacZ = Escherichia coli lacZ génje;

a nyilak a transzkripció irányát mutatják.

A 6E ábra az f-TK2b szárnyashimlő gazdatörzs DNSének EcoRl, PstI és Clal restrikciós enzimekkel készített hasítási térképét mutatja. A további információk és rövidítések magyarázata a 6D ábránál található.

A 7. ábra a vad típusú vírus és az új f-TK2a, valamint f-TK2b FPV gazdatörzsek timidin-kináz génje körülötti régió sematikus ismertetése. Az FPV gazdatörzsek tk-génje és a 3’ nyitott leolvasási kerete (orf) közé két új inszertet építettünk be, a vakcínia vírus tk génjét (W-tk) és az Escherichia coli lacZ génjét (lacZ). A nyilak az egyes gének transzkripciójának irányát mutatják.

-10Α 8. ábra a promoterfogó pFP-Zl és pFP-Z21 plazmidok készítésének sémája. A plazmidokat az ábrán bemutatott módon készítjük, és részletesen a kísérleti részben írjuk le. A rövidítések jelentése a következő:

FPV-tk = szárnyashimlő vírus timidin-kináz génje;

P7.5 = a vakcínia vírus 7,5 kDa méretű fehérjéje génjének promotere;

Pll = a vakcínia vírus 11 kDa méretű polipeptidje génjének promotere;

ssDNS = egyszálú DNS;

a nyilak a transzkripció irányát mutatják.

A 9. ábra a pTZgpt-P2a és a pTZgpt-P2b vakcínia vírus inszerciós plazmidok előállításának sémája. A készítés részleteit az ábrán mutatjuk be, és részletesen a kísérleti részben ismertetjük. Az rövidítések egy részének jelentése az 1. ábra ismertetésénél olvasható;

gpt = az Escherichia coli xantin-guanin-foszforibozil-transzferáz enzimet kódoló génje;

a nyilak a transzkripció irányát mutatják.

A 10A ábra az FPV P2 promoter és a P2 gén első tíz kodonja. Az iniciációs kodon A csoportját (vastagon szedve) határoztuk meg +1 pozíciónak. A -6 - -2 pozíciókban a vakcínia vírus késői promoterének mag-szekvenciája van jelen, a -19 - -13 pozíciókban pedig a vakcínia korai RNS stop-szignálja. Azokat a szekvenciákat aláhúztuk, amelyekben a vakcínia korai promoter kritikus, 16 bp-ból álló régiójához viszonyítva legalább 11 nukleotid azonos. Az upstream régió a -174 pozícióig terjed. A downstream régió (a P2 gén 30 nuk

-11leotidból álló kódoló szekvenciája) a +l-től a +30 nukleotidig terjed.

A 10B ábra az FPV2 promotert, a P2 gént és a downstream régiót tartalmazó Nsil-EcoRI restrikciós fragmens szekvenciája. Az aláhúzott részeket illetően lásd a 10A ábra magyarázatát. Az upstream régió a -174-es pozícióig terjed. A P2 gén kódoló szekvenciája a +1 - +399 pozíciók között található, és 133 aminosavat kódol. A P2 gén számított molekulatömege 14 806 Da. A downstream régió A és T bázisokban gazdag, és nem tartalmaz 4 kDa-nál nagyobb fehérjét kódoló nyitott leolvasási keretet.

A 11. ábra a P2 promoter összehasonlítása más poxvírus promoterekkel. A hisztogram a különböző poxvírus promoter-lacZ konstrukciók által indukált β-galaktozidáz expreszsziós szinteket mutatja. A jelzett rekombináns vírusokkal fertőzött CV-1 sejtek sejtkivonatát állítottuk elő, és vizsgáltuk az enzimatikus aktivitásukat a kísérleti részben leírtak szerint. A különböző rekombinánsok expressziós szintjeit a vFlsfi standard szintjével (100 %) hasonlítottuk össze.

A 12. ábra a különböző vakcínia rekombinánsokkal fertőzött CV-1 sejtek SDS poliakrilamid gélelektroforézissel végzett analízise. A sejteket a kísérleti részben leírtak szerint fertőztük. Az összes oldható fehérjét izoláltuk, és különböző mennyiségeket (5 pl és 10 pl) elemeztünk 10 %-os poliakrilamid gélen. 1. és 2. csík: a vad típusú vakcínia vírus által indukált fehérjék; 3. és 4. csík: a vFlsB rekombináns vakcínia vírussal indukált fehérjék; 5. és 6. csík: a

-12vP2a vírus által indukált fehérjék; 7. és 8. csíkok: a vP2b rekombináns vírus által indukált fehérjék; 9. és 10. csíkok: a W rekombináns vart által indukált fehérjék. A vFlsB referencia vírus (3. és 4. csíkok) a 117 kDa mérettartományban indukál egy új fehérjét (alsó nyíl), amely nem mutatható ki a vad típusú vírussal fertőzött sejtekben (1. és 2. csíkok). A fi-galaktozidáz/P2 gének fúziójával a rekombinánsokban (vP2a és vP2b, 5-8. csíkok) kapott fehérje mérete körülbelül 130 kDa (felső nyíl).

A 13A ábra a pFSgpt inszerciós plazmid konstrukciós sémája. A plazmidokat az ábrán látható módon készítjük. A rövidítések magyarázatát lásd az 1. ábránál.

A 13B ábra a pFSgpt többszörös klónozó helyének szekvenciája. A transzlációs stop-kodonok vastagon vannak szedve; a himlővírus korai transzlációs stop-kodonja alá van húzva.

A 14A ábra a pP2mxgpt inszerciós plazmid konstrukcióját mutatja, amely a mutáns P2 promoter szekvenciákat (mx) tartalmazza. Vagy a vad típusú, vagy a mutáns P2 promoter szekvenciákat oligonukleotidokat klónozunk a pFSgpt-be. Az Escherichia coli lacZ génjét a különböző promoterek mögé helyezzük, így hozzuk létre a pP2mxgpt-lacZ promoter teszt plazmidot. P2mx.l és P2mx.2 = a P2 promotert kódoló szintetikus linker szekvenciák. A további rövidítések magyarázata az 1. ábra alatti szövegben található.

A 14B ábra a pP2mxgpt inszerciós plazmid többszörös klónozó helyének szekvenciája. A transzlációs start és stopkodonok vastagon vannak szedve; a himlővírus korai transzk-13ripciós stop jele alá van húzva.

A 15. ábra a vad típusú és mutáns P2 promoterek szerkezete.

A 16. ábra a különböző P2 promoter mutánsok által indukált β-galaktozidáz aktivitás értékeket mutatja fertőzött CV-1 sejtekben.

a) késői promoterek aktivitása;

b) korai promoterek aktivitása.

A 17A és 17B ábra:

A) a pTZgpt-Fls és pTZgpt-ΡΙΙΜ vakcínia vírus inszerciós plazmidok készítésének sémája. A plazmidokat a kísérleti részben leírtak szerint készítjük. A rövidítések jelentése:

tk = vakcínia vírus timidin-kináz génje;

P7.5 = a vakcínia vírus 7,5 kDa méretű fehérjéje génjének promotere;

Pll = a vakcínia vírus 11 kDa méretű polipeptidje génjének promotere;

P11M = mutáns Pll promoter;

fi őri = fi replikációs origó;

gpt = Escherichia coli gpt gén (a xantin-guanin foszforibozil-transzferáz enzimet kódolja);

MCS = többszörös klónozó hely.

B) A pTZgpt-spll, pTZgpt-s4b és pTZgpt-sart (pTZgpt-sPx) promotervizsgáló vektorok készítésének sémája.

FPV-tk = a szárbyashimlő vírus timidin-kináz génje;

P7.5 = a vakcínia vírus 7,5 kDa méretű fehérjéje

-14génjének promotere;

-sPx jelentése a promoterek készítésében használt, megfelelő sPll, S4b és sart szintetikus linker szekvenciák;

gpt = Escherichia coli gpt gén (a xantin-guanin foszforibozil-transzferáz enzimet kódolja); a nyilak a transzkripció irányát mutatják.

A 18. ábra a promoter régiók szerkezetét mutatja. A mutáns promoter régiók nukleotid szekvenciáját mutatjuk be. A vakcínia vírus késői promoter konszenzus szekvenciája (vékony vonal), a transzlációs iniciációs kodonok (vastag vonalak) és különböző restrikciós hasítási helyek pozíciója látható.

Pllw = a Pll promoter vad típusú szekvenciája;

Pllm = mutáns Pll szekvencia;

sPll = szintetikus mutáns Pll szekvencia;

s4b = szintetikus FPV 4b promoter;

sart = szintetikus (mesterséges) késői promoter.

A 19. ábra a különböző himlővírus késői promoterekkel indukált lacZ konstrukciók β-galaktozidáz szintje. A különböző rekombinánsok expressziós szintjét a vFlsfi standard szinthez hasonlítjuk (100 %).

A találmány tárgya tehát rekombináns szárnyashimlő vírus (FPV) inszerciós plazmid, amelyet úgy készítünk, hogy az FPV-tk gén és a 3' nyitott leolvasási keret (3' orf) közötti intergenikus régiót annyira megnagyítjuk, hogy egy vagy több egyedi restrikciós hasítási hely jöjjön létre, és ezzel idegen DNS-nek ebbe az intergenikus régióba való inszerciójával az FPV tk génje érintetlen marad, és a teljes

-15timidin-kináz gént (TK) kódolja. Az említett megnagyobbított intergenikus régió például tartalmazhatja az alábbi szekvenciát:

AGTAATTAAGGTTTTTATCGATCCCGGGTACCGGTTTAGTGTAATAAATTTAATAA

---------->^J 1¹--------Η I--------Η I tk gén | 5TNT ¹------¹ Smal¹------| Clal Asp718

I

I megnagyobbított intergenikus régió

AATATTGACAAAATAGTTAAATGAATATATGAAAGTACATTATACACGGAATGGAG

II -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1 I----------->

megnagyobbított intergenikus régió 3'orf

Ezt a megnagyobbított intergenikus régiót helyspecifikus mutagenezissei állíthatjuk elő.

Egy olyan rekombináns FPV-t, amely képes idegen fehérje (ék) expressziójára, úgy állítunk elő, hogy a szárnyashimlő virális genomba idegen fehérjé(ke)t kódoló DNS szekvenciákat építünk be. Ez az idegen DNS szekvencia az idegen DNS-t hordozó inszerciós plazmid és az FPV genom gatároló szakaszai közötti in vivő rekombinációval integrálódik az FPV genomba. Az inszerciós szekvencia tartalmazza legalább az idegen DNS szekvenciát, a szárnyashimlő vagy egyéb himlő vírus promoteréhez kapcsolódva, amely az említett intergenikus régió és a határoló szekvenciák közötti régióval homológ

-16DNS szekvenciák között helyezkedik el. Tehát egy kiválasztott inszerciós plazmid legalább a következő elemeket tartalmazza:

(a) egy természetes vagy szintetikus promoter, egy expresszálandó idegen DNS szekvenciához kapcsolva;

(b) egy második himlővírus promoter, egy marker vagy indikátor tulajdonságot kódoló génhez kapcsolva, a rekombináns FPV szelektálása céljából;

(c) az FPV-nek olyan DNS szekvenciái, amelyek a konstrukció (a) és (b) elemeit veszik körül, mind a 3'-, mind az 5'-végeken, és az említett határoló DNS szekvenciái homológok a megnagyobbított intergenikus régió upstream és downstream szekvenciáival.

A fenti plazmid előnyösen tartalmaz egy további, prokarióta gazdaszervezetben működő replikációs origót, valamint egy olyan gént, amely egy transzformált prokarióta gazdaszervezet jelzésére vagy szelekciójára alkalmas.

A fenti plazmidban, valamint a rekombináns FPV-ben alkalmazott promoterek himlővírus promoterek, főleg FPV promoterek. Egy idegen fehérje hatékony expressziójához előnyös, ha a promoter közvetlenül szomszédos az idegen DNS szekvencia kódoló részével.

Az eddig előállított legtöbb W rekombináns klónozott W promotereket használt a kiválasztott idegen gének vezérlésére. Egy klónozott W promotert és egy idegen gént tartalmazó transzkripciós egység in vivő rekombinációja a W genom lényegtelen pontján általában azt eredményezi, hogy a promoter elemek megduplázódnak, másodlagos rekombinációk

-lefordulhatnak elő, és a rekombináns szegregál vagy instabil lesz. A genetikailag stabil poxvírus rekombinánsok konstrukciójánál tehát hasznos, ha vagy nem-homológ, vagy rövid szintetikus vírus promotereket használunk az idegen gén transzkripciójának szabályozására.

Egy előnyös promoter a P2 promoter (10B ábra). Ez a promoter upstream régiójában számos kritikus korai régiót tartalmaz, amelyeket a késői promoter konszenzus szekvencia követ. A funkcionális elemzés megerősítette, hogy a P2 promoter a vírus életciklusának mind a korai, mind a késői szakaszában aktív.

Az új FPV promoter erősségét számos ismert erős himlővírus erősségével hasonlítjuk össze vakcínia vírus rekombinánsokban. Megfigyelhető, hogy a P2 promoter az egyik legerősebb természetes promoter a W-vel fertőzött sejtekben.

A P2 promoter optimalizálására tett kísérlet során egy sorozat mutánst állítottunk elő (15. ábra). Az mutánsokban a P2 gén-fúziós szekvenciát eltávolítottuk, és a lacZ gén iniciációs kodonját a TAAAT késői promoter jel szomszédságában helyeztük el. Az mO mutánsban (TAAATG AAT TCC) a lacZ gén ATG-je közvetlenül a késői promoter magját képező szekvenciához kapcsolódik, ezzel a vad típusú P2 szekvencia -1 pozíciójában levő C csoportot kivágjuk, és ez a mutáció megnöveli a késői promoter hatékonyságát. Ez a szerkezet számos W promoterben megtalálható, és az a vélemény, hogy ez az optimális összhangot jelenti a késői promoter konszenzus szekvencia és az iniciációs kodon között [Davidson, A.

J., Moss, B. J., Mól. Bioi., 210, 749 (1989)].

.· i

-18Az ml mutáns (TAAACATG AAT TCC) a lacZ gén ATG triplettje közvetlenül a feltételezett P2 gén ATG-jéhez kapcsolódik.

Az m2 mutánst azért állítottuk elő, hogy vizsgáljuk a késői promoter régió előtt található kritikus korai promoter régiók jelentőségét. Az m2 mutáns szerkezete ugyanaz, mint az ml-é, azzal a különbséggel, hogy a késői promoter előtt található funkcionálisan fontos, T-ben gazdag régióban levő korai RNS stop jelet inaktiváljuk oly módon, hogy a -18 pozícióba egy TTG triplettet építünk be.

így, azok az előnyös FPV promoterek, amelyek a P2ből származnak (a 10A ábra szerint), valamint ezek funkcionális megfelelői. A promoterek erősségére vonatkozó kísérleti adatok a 16. ábrán láthatók.

A promoter régiókat előnyösen egy többszörös klónozó hely (MCS) követi, amely lehetővé teszi az idegen gének beépítését.

A P2 gént és az utána következő régiót szekvencia elemzéssel jellemezzük (10B ábra). A P2 gén 133 aminosavat kódol; számított molekulatömege 14806 Da. A downstream régió (415 bp) A-ban és T-ben gazdag, és nem tartalmaz 4 kDa-nál nagyobb fehérjéket kódoló nyitott leolvasási kereteket, azaz a genomnak ez a régiója valószínűleg egy nem-kódoló régió. A P2 gén downstream régiója tehát a genomnak egy nem lényeges része, amely arra használható, hogy idegen géneket az FPV genomba építsünk be.

Az előnyösen alkalmazható plazmidok olyan genetikai elemeket tartalmaznak, amelyek lehetővé teszik a rekombináns

-19FPV-k szelekcióját. Ezek az elemek olyan gének lehetnek, amelyek egy szelektálható markert vagy indikátort kódolnak egy himlővírus promoterrel együtt, amely az említett gén expressz ió ját szabályozza a rekombináns vírusban. Az indikátor gén promotere és markere a határoló FPV szekvenciák között található úgy, hogy ugyanezek ko-integrálódnak az FPV genomba. A rekombináns FPV-t ezután a marker vagy az indikátor expressziója alapján lehet kiválasztani.

Az azonosításhoz előnyösen használható gén az Escherichia coli lacZ génje, amely a β-galaktozidáz enzimet kódolja. Az ennek az enzimnek az expresszióján alapuló azonosítási eljárások leírása a szakirodalomban megtalálható. A szelekciós módszerek közé tartozik az antibiotikum rezisztencián alapuló szelekció, azaz például a xantin-guanin-foszforibozil-transzferázt kódoló gén alpú szelekció, amely a mikofenolsav elleni rezisztenciát biztosítja.

A találmány szerinti plazmidok előnyösen tartalmaznak még egy prokarióta gazdaszervezetben való replikádét lehetővé tevő replikont, valamint egy szelektálható indikátort vagy markert kódoló gént, amely lehetővé teszi a szelekciót és amplifikációt egy prokarióta gazdaszervezetben, például Escherichia coliban. A replikont bármely szokásos prokarióta plazmidból, például pBR322-ből állíthatjuk elő. A szelektálható gén lehet egy antibiotikum rezisztenciát biztosító gén.

A találmány szerinti specifikus plazmidokat úgy állíthatjuk elő, hogy a pTKm-sPll-gpt inszerciós plazmid lacZ génjét egy számunkra érdekes idegen génnel helyettesítjük.

-20Az expresszálandó idegen gént a marker vagy indikátor génekkel együtt tartalmazó DNS plazmidokat megfelelő FPV szekvenciák határolják, és ez utóbbiak lehetővé teszik az FPV-vel való rekombinációt és a határoló szekvenciák beépülését az FPV genomba. Ez a rekombináció az eukarióta gazdasejt citoplazmájában játszódik le. A rekombinációra alkalmas gazdasejteknek a következő feltételeknek kell eleget tenniük:

(1) fertőzhetők legyenek FPV-vel, és (2) transzfektálhatók legyenek a DNS vektorral.

Az ilyen sejtekre példa lehet a csirke-embrió fibroblaszt és csirke-embrió dermális sejt.

Az in vivő rekombinációhoz a sejteket először FPVvel fertőzzük, majd az inszerciós plazmiddal transzferáljuk. A vírus infekciót standard módszerekkel végezzük, amelyek ismertek az eukarióta sejtek FPV-vel való fertőzéséhez.

Ezt követően a sejteket az inszerciós plazmidokkal fertőzzük, bármely, a szakterületen jártas szakember számára ismert módszer alkalmazásával.

A fertőzés, majd az azt követő transzfekció után a sejteket standard körülmények között inkubáljuk, és a vírust hagyjuk replikálódni; ez alatt az idő alatt lejátszódik az in vivő rekombináció az inszerciós vektor homológ FPV szekvenciája és az FPV között úgy, hogy az idegen DNS szekvenciák beépülnek az FPV genomba.

A rekombináns FPV-t ezután a beépített marker vagy indikátor alapján választjuk ki, azaz például az Escherichia coli lacZ génjének a működése alapján (β-galaktozidázt-expresszál). Ehhez az enzimhez egy kromogén szubsztrátot hasz5

-21nálunk, például az 5-bróm-4-klór-3-indolil-6-D-galaktozidot, és a rekombináns vírusokat kék tarfoltok alapján mutatjuk ki.

A találmány egy másik lényeges megvalósítási módja szerint a rekombináns FPV inszerciós helyként az említett intergenikus régióban egy vakcínia vírus tk gént tartalmaz, amely egy nem lényeges helyként (NES) az inszercióhoz egy vagy több idegen DNS szekvenciát tartalmaz.

Egy előnyös módosítás szerint az említett FPV az említett megnagyobbított régióban egy szelekciós markert és/vagy egy riporter gént, valamint a W tk génjét tartalmazza tetszőleges sorrendben.

A legelőnyösebb módosítások azok, amelyek szerint a rekombináns szárnyashimlő vírusokban a vakcínia vírus tk génje és a lacZ gén inszertje a megnagyobbított intergenikus régióban találhatók. Két ilyen új gazdatörzsnek a genomiális szerkezetét a 7. ábrán mutatjuk be. Akár a szárnyashimlő vírus, akár a vakcínia vírus tk génje használható nem-esszenciális helyként idegen gének beépítésére. Az f-TK2a és az f-TK2b csak a vakcínia vírus tk génjének orientációjában különböznek. Ez lehetővé teszi, hogy a kiválasztott idegen gént homológ rekombinációval mindkét orientációban beépítsük. Ez előnyös lehet, ha a transzkripciós interferencia jelenségét akarjuk tanulmányozni.

Mivel egy új FPV gazdatörzsnek a fenti módosítása két érintetlen tk gént eredményez, ezért bármelyik használható idegen DNS inszertálására. Ez lehetővé teszi, hogy kiterjesszük azoknak a plazmidoknak a számát, amelyek vagy FPV tk vagy W tk határoló szekvenciát tartalmaznak.

-22A találmány tárgya tehát olyan rekombináns FPV, amelyet a fenti új FPV gazdatörzs és bármelyik itt ismertetett plazmid közötti homológ rekombinációval kaptunk, és amely lehetővé teszi, hogy az idegen DNS-t vagy az FPV tk génbe vagy a W tk génbe inszertáljuk.

Amint azt az előzőkben említettük, idegen fehérjéiké) t expresszálni képes rekombináns FPV-ket úgy állítunk elő, hogy az FPV genomjába az említett idegen fehérjé(ke)t kódoló DNS szekvenciát építünk be. Ezt in vivő rekombinációval hajtjuk végre, egy a fentiekben ismertetett inszerciós vektor alkalmazásával. A találmány szerinti specifikus vektorokat a pTZgpt-Fls vagy pTZgpt-ΡΙΙΜ inszerciós plazmidokkal állíthatjuk elő, a 17A ábra szerint, illetve a pP2mxgpt plazmiddal, a 14A ábra szerint.

A pTZgpt-Fls konstrukció (17A ábra) egy olyan plazmid, amely az előzőekben használt pTKgpt-Fls plazmidhoz képest (a 17A ábra felső része) előnyös annyiban, hogy az fi replikációs origót (fi őri) a pUC résznek a pTZ résszel való helyettesítésével juttatjuk be (PvuII fragmensek). Az fi origó lehetővé teszi egyszálú DNS előállítását, amely a szekvenáláshoz és az in vitro mutagenezishez szükséges. Ezáltal az M13 vektorokban történő időigényes szubklónozás feleslegessé válik.

A pTZgpt-ΡΙΙΜ plazmidban (17A ábra) a Pll késői promoter konszenzus régió TAATGAATTC szekvencia elmutáltuk, és a következő szekvenciává változtattuk: TAAATAAAGAATTC. Ez a konstrukció azzal az előnnyel rendelkezik, hogy a géneket a saját transzlációs-iniciációs kodonjuk (ATG) szabályozásé-23val lehet expresszálni.

A pTZgpt-dP plazmid (17A ábra) a határoló W tk szekvenciák és a P7.5 promoter szabályozása alatt álló gpt gén mellett egyetlen Hpal hasítási helyet tartalmaz. Ez a hely kényelmes lehetőséget biztosít a különböző promoter-idegen gén kazetták beépítésére.

A pP2m0gpt, pP2mlgpt, pP2m2gpt (pP2mxgpt; 14A ábra) inszerciós plazmidok a kiválasztott idegen gént az új szárnyashimlő vírus gazdatörzsekben (7. ábra) a vakcínia vírus tk génjébe irányítják. A P2mx rövidítés jelentése a 15. ábránál ismertetett elmutált P2 promotereket jelenti. Ezek az inszerciós plazmidok alkalmasak olyan nyitott leolvasási keretek magas szintű expressziójára, amelyeknek hiányzik a saját transzlációs iniciációs kodonjuk és a terminációs kodonjuk. A plazmidon találhatók még mindhárom leolvasási fázisban a transzlációt leállító transzlációs stop-kodonok. A pP2m0gpt, pP2mlgpt és pP2mgpt inszerciós plazmidok többszörös klónozó helyének további jellemzője, hogy transzkripciós stop-kodont tartalmaznak, amely leállítja a himlővírus korai gének expresszióját; a többszörös klónozó hely szekvenciáját a 14B ábrán mutatjuk be.

A pFSgpt plazmid (13A ábra) a kiválasztott idegen gént az új szárnyashimlő gazdasejtekben a vakcínia vírus tk génjébe irányítja (7. ábra). Ez a himlővírus-promoter idegen gén kazetták klónozására használható. A pFSgpt plazmid transzlációs stop-kodont is biztosít, valamint a himlővírus korai transzkripciós stopjelét. A többszörös klónozó hely a 13B ábrán látható.

-24A pTZgpt-sPx plazmidok (17B ábra) úgynevezett promoter teszt plazmidok, amelyeket azért készítettünk, hogy a különböző szintetikus promotereket (jelzésük a továbbiakban sPx) vizsgáljuk. Az sPx rövidítés jelzése az alábbi:

a) sPll = szintetikus W Pll promoter mutáns;

b) s4b = szintetikus FPV 4b promoter mutáns;

c) sart = szintetikus promoter mutáns.

A fenti promoterek erős késői promotereket tartalmaznak, amelyek mind W-ben, mind FPV-ben aktívak. Ezeket a promotereket a riporter génnel (lacZ) együtt vagy anélkül kivághatjuk, és így különböző vektor-rendszerekbe klónozhatók. Ezek a további promoterek megnövelik az elérhető promoterek számát, és többszörös expressziót tesznek lehetővé. Azzal az előnnyel is rendelkeznek, hogy azok a régiók, amelyek a virális genommal homológok, meglehetősen rövid szekvenciák, és ez a tény csökkenti a rekombinációk valószínűségét, valamint csökkenti a rekombináns vírusok instabilitását.

Amint az előzőekben ismertettük, idegen fehérje(ék) expressziójára használt rekombináns FPV-t in vivő homológ rekombinációval állítunk elő.

A találmány tárgya tehát egy idegen fehérje expreszszióját célzó eljárás. Ez a módszer abban áll, hogy a megfelelő gazdasejtet a találmány szerinti rekombináns FPV-vel fertőzzük. A gazdasejteket ezután tenyésztjük, hogy a kiválasztott fehérje expresszióját lehetővé tegyük, majd a fehérjét szokásos módszerekkel kinyerjük.

Az alkalmas sejtek vagy sejttenyészetek közé tartóz*· ·

-25nak a csirke embrió fibroblaszt sejtek vagy a csirke dermális fibroblaszt sejtek.

Bármely kiválasztott fehérje expresszálható az említett rekombináns FPV alkalmazásával, és megfelelő mennyiségben előállítható. Különösen fontos olyan fehérjék expressziója, amelyek poszt-transzlációs módosítást igényelnek, a gazdasejt által kivitelezett módon. Az ilyen fehérjék közé tartozik például a ΙΙ-es, V-ös, Vll-es, VlII-as, IX-es, Xes, Xl-es, ΧΙΙ-es Xlll-as faktor, a protein C, a protein S, a von Willebrand faktor, a plazminogén és származékai, amelyekben egy vagy több aminosavat helyettesítettünk, kivágtunk vagy beszúrtunk, ezeknek rész-szekvenciái és aktivált formái az apolipoproteinek, úgymint az apoAI és apoAII, valamint a virális antigének, például a hepatítisz-B antigének, a hepatítisz-C vírus antigénjei, a hepatítisz-E vírus antigénjei, a kullancsok által terjesztett enkefallítisz (TBE) vírus antigénjei, a HÍV, a HSV antigénjei, valamint a szamárköhögést, tetanuszt, maláriát, szárnyasok megbetegedését, Marek-féle betegséget, kokcidiózist és Newcastle-betegséget okozó antigének teljes vagy rész-szekvenciái, mivel az említett antigének vakcinaként használhatók.

Kísérleti rész

1. Módszerek

1.1. Vírusok és a sejtek

A szárnyashimlő HP1 vírus törzset [Mayr & Malicki, Zentralblatt f. Veterinármedizin, Reihe B, 13, 1-12 (1966)] és a HP1-441 attenuált törzset (a HP1 441-es átoltási száma) ♦ «

-26Prof. A. Mayr (München) bocsátotta a rendelkezésünkre. A primer csirke embrió fibroblasztokat (CEF) a 0 338 807 számú európai közrebocsátási iratban leírtak szerint állítottuk elő. A sejteket a 199-es jelű szövettenyésztő táptalajban (TCM 199; Gibco BRL) növesztjük, amelyet 5 % borjúmagzat szérummal, glutaminnal és antibiotikumokkal egészítünk ki. A vakcínia vírust (ATCC VR 119) Dr. B. Moss bocsátotta rendelkezésünkre. A vírus replikálódik CV-1 sejtekben, és a Mackett és munkatársai által ismertetett módszerrel tisztítható [D. M. Glover (szerk.): DNA Cloning: A Practical Approach; IRL Press, Oxford (1985)]. A CV-1 jelű (ATCC CCL 70) afrikai zöldmajom vesesejtvonalat az American Type Culture Collectiont-től szereztük be (Rockville, Maryland).

1.2. A szárnvashimlő vírus tisztítása

A tisztítást lényegében Joklik leírása alapján végezzük [Virology, 18, 9-18 (1962)], az alábbi módosításokkal: CEF egysejtréteget (175 cm²-es sejttenyésztő lombik) fertőzünk 1 pfu (tarfolt-képző egység)/sejt koncentrációban, majd 4-5 napon át +37 °C-on inkubáljuk 5 % CO2 koncentráció mellett. A sejteket a táptalajba kaparjuk, 20 percig 2000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk Sorvall RC3C centrifugában, H6000-A rotorral. Az üledéket 5 ml TRIS-HC1 pH=9es pufferben szuszpendáljuk, ultrahanggal feltárjuk, 1/10 térfogat 2,5 %-os tripszinnel kiegészítjük, majd 30 percig 37 °C-on inkubáljuk. Az extracelluláris vírus ülepítésére a felülúszót 2 óra hosszat +4 °C-on 17 000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk 19-es típusú Beckman rotorban. A trip♦ « színnel kezelt sejteket és a sejttenyészet felülúszó vírus üledékét egyesítjük, 36 %-os szacharóz párnára rétegezzük, és egy Beckman SW28-as rotorban +4 °C-on 80 percig

500/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. Az üledéket 1 ml 1 mmol/1 TRIS-HC1 pH=9-es pufferben szuszpendáljuk, ultrahanggal besugározzuk, egy 20-40 %-os szacharóz gradiensre rétegezzük, és +4 °C-on 50 percig 12 000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. A két vírus csíkot (a vírus intra- és extracelluláris formája) összegyűjtjük, egyesítjük, és 2 térfogat 10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=9 puffért adunk hozzá. A vírus üledéket centrifugálással ülepítjük (15 000/perc, 60 perc), majd 500 μΐ lpmol/l TRIS-HC1 pH=9, 1 mmol/1 NaCl összetételű pufferben szuszpendáljuk.

1.3. Seitfertőzés és tarfolt vizsgálatok

A tarfolt vizsgálatokat CEF-k egybefolyó sejtrétegén végezzük (szövettenyésztő lemezeken, 60 cm², körülbelül 6xl0⁶ sejt vagy hatlukas lemezeken, 10 cm², lxlO⁶ sejt/luk) vagy CV-1 sejteken hatlukas lemezeken (10 cm², lxlO⁶ sejt/luk). A vírus szuszpenziót hagyjuk a sejtekre adszorbeálódni 0,6 ml TCM 199-ben, óránként megrázogatva a lemezeket. A szuszpenziót leszívjuk a sejtekről, és egy olyan felső réteggel helyettesítjük, amely szérummentes DMEM-et, antibiotikumokat és 1 % alacsony olvadáspontú agarózt (LMA; Gibco BRL) tartalmaz. A CEF sejteken megtitrált FPV tarfoltokat 30 Mg/ml neutrál red festékkel (Sigma) festjük a fertőzés 5. vagy 6. napján. A CV-1 sejteken titrált vakcínia vírus tarfoltokat a fertőzés 3. napján 50 Mg/ml neutrál red ·> ·

I

festékkel festjük.

1.4. In vivő rekombináció cm²-es szövettenyésztő lemezekben levő CEF vagy

CV-1 sejteket fertőzünk 1 tarfoltképző egység (pfu)/sejt HP1-441 vagy W vírussal. A vírust egy óra hosszat 37 °C-on adszorbeáltatjuk 2,5 ml TCM 199 táptalajban. Ezt követően a táptalajt leszívatjuk, és a fertőzött egysejtréteget felülrétegezzük egy DNS-Ca-foszfát csapadékkal, amely 20 /xg plazmid DNS-t és 5 pg HP-441 vagy W vad típusú DNS-t tartalmaz Hepessel puffereit sóoldatban 1 ml végtérfogatban, Graham & Webb szerint [Virology, 52, 456-467 (1973)]. Miután 30 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten, 9 ml TCM 199 táptalajt adunk hozzá, és az inkubálást további 4 óra hosszat folytatjuk 37 °C-on. A táptalajt 10 ml friss TCM 199 táptalajra cseréljük le, majd a lemezeket 2 napon át inkubáljuk. A sejteket ezután belekaparjuk a táptalajba, és az üledékeket három egymást fagyasztás - olvasztás ciklussal feltárjuk. Az utódvírusok között vizsgáljuk a rekombinánsok jelenlétét.

1.5. A rekombinánsok szelekciója és tarfolt-tisztítása

1.5.1. Kék tarfolt szelekció

A lacZ gén inszerteket tartalmazó vírusokat a kék tarfolt vizsgálati eljárás segítségével lehet azonosítani, Chakrabarti és munkatársai leírása szerint [Mól. Cell. Bioi., 5, 3403-3409 (1985)], az alábbi módosítások alkalmazásával: CEF sejteket (60 cm²-es szövettenyésztő edények♦ 4

-29ben) vagy CV-1 sejteket (hatlukas lemezekben) a rekombinációs kísérletekből származó nyers vírus-készítménnyel fertőzzük, majd 1 % LMA-t tartalmazó szérummentes DMEM-mel rétegez z ük felül. 5-6 nap elteltével a CEF esetében és 3 nap elteltével a CV-1 esetében az egysejtrétegeket egy második felülrétegzéssel festjük, amely 1 % LMA-t tartalmaz foszfáttal puffereit sóoldatban (PBS), valamint 600 jxg/ml 5-bróm-4-klór-3-indolil-B-D-galaktozidot (X-gal) kromogén szubsztrátként. A kék tarfoltok 4-12 órával később jelentek meg.

1.5.2. qpt szelekció

A gpt gén inszerteket tartalmazó FPV vírusokat a mikofenolsav (MPA) elleni rezisztenciájuk alapján lehet azonosítani, lényegében Falkner és Moss leírása alapján [J. Virol., 62. 1849-1854 (1988)], az alábbi módosítások alkalmazásával: a CEF sejtek egysejtrétegét rekombináns vírussal fertőzzük, majd 125 Mg/ml xantinnal, 5-25 Mg/ml MPAval és 1 % LMA-val kiegészített DMEM-mel felülrétegezzük.

5-6 nap elteltével a tarfoltokat egy második felülrétegzéssel láthatóvá tesszük, amely PBS-ben oldott 1 % LMA, benne 30 /xg/ml neutrálvörös. A gpt- és lacZ-pozitív rekombinánsok esetében a felülrétegző oldat emellett még 600 Mg/ml X-gal-t is tartalmaz. A tarfoltokat többszörös tarfolt tisztításnak vetjük alá.

A CV-1 sejtek egysejtrétegét rekombináns vakcínia vírussal fertőzzük, és 250 /zg/ml xantint, 15 Mg/ml hipoxantint, 25 Mg/ml MPA-t és 1 % LMA-t tartalmazó DMEM-mel felülrétegezzük. 2-3 nap elteltével a tarfoltokat egy második fe-30lülrétegzéssel tesszük láthatóvá, amely PBS-ben oldott 1 %os MPA-ban 50 Mg/ml neutrálvöröst és 600 ^g/ml X-galt-t tartalmaz. A tarfoltokat többszörös tarfolt tisztításnak vetjük alá.

1.6. Tranziens expressziós vizsgálatok

A vizsgálatot lényegében Cochran és munkatársai módszerével végezzük [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82, 19-23 (1985)], az alábbi módosítások alkalmazásával: A CV-1 sejtek egybefolyó egysejtes rétegét (körülbelül 10⁷ sejt) 5-10 tarfoltképző egység vad típusú vakcínia vírussal fertőzzük, majd 30 gg DNS-sel transzfektáljuk DNS-Ca-foszfát csapadék formájában, Graham és van dér Eb leírása szerint [Virology, 52, 456-467 (1973)]. A sejteket a fertőzés után 24 órával centrifugálással kinyerjük, és 100 μΐ PBS-ben szuszpendáljuk. A fertőzött sejtek citoplazmatikus kivonatát ultrahangos besugárzással állítjuk elő, és vizsgáljuk a β-galaktozidáz aktivitásukat.

1.7. β-galaktozidáz vizsgálat

A CV-l sejtek egybefüggő egysejtréteges tenyészetét (8xl0⁶) sejt) 10 tarfoltképző egység rekombináns vakcínia vírussal fertőzzük, a fertőzés után 24 órával kinyerjük, és 100 μΐ PBS-ben szuszpendáljuk. A citoplazmatikus kivonatok előállításához a sejteket három egymást követő fagyasztás! felolvasztásj ciklussal és ultrahangos kezeléssel feltárjuk. A fehérje-kivonatok mennyiségét Bradford módszerével határozzuk meg [Analytical Biochemistry, 72. 248-254 (1976)]. Az

-31·· ♦ enzimvizsgálatokat lényegében Miller módszerével végezzük [Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; 352-355 (1972)], az alábbi módosítások alkalmazásával: az összes reagenst 28 °Cra előmelegítjük, a lizátumokat jégen tartjuk. A reakciókat 770 μΐ lxZ pufferben hajtjuk végre (0,6 mól/liter Na2HPC>4, 0,4 mól/liter NaH2PÜ4, 0,1 mól/liter KC1, 0,01 mól/liter MgSO₄, 0,5 mol/liter β-merkapto-etanol, pH=7). Az O-nitro-fenil-B-D-galaktopiranozid (ONPG) kromogén szubsztrátból 200 μΐ-t (koncentrációja 4 mg/1 0,1 mol/liter foszfát pufferben, pH=7) adunk hozzá, és a reakciót 30 μΐ hígított (1:100) sejtkivonat hozzáadásával indítjuk. 3 percig szobahőmérsékleten tartjuk, majd a reakcióelegyet egy Beckman DU8 fotométerbe visszük át. Az optikai sűrűséget 420 μιιι-en mérjük (15 perc 28 °C) PBS mintához viszonyítva. Az eredményeket azzal erősítjük meg, hogy a poli(akril-amid) géleket UV-VIS denzitométerrel (Hirschmann) olvassuk le.

1.8. Szekvenálás

A szekvenciákat T7 polimeráz szekvenáló kit alkalmazásával határozzuk meg (Pharmacia), a didezoxi-láncterminációs módszerrel [Sanger és Coulson: Journal of Molecular Biology, 94, 441 (1975)], specifikus indító molekulák alkalmazásával. A plazmidokat standard módszerekkel állítjuk elő [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) ].

·*·· · ·« ·„ * 9 « « ··* _β , ♦·* ♦ · · ·· · >· · *· ·· ·

2. Inszerciós plazmid készítése

2.1. pFPtk5

Első lépésként az FPV timidin-kináz génjét klónozzuk, az alábbiak szerint: a szárnyashimlő vírus (HP1 törzs, München) DNS-ét EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, majd a pTZ19R vektor (Pharmacia) EcoRI helyére klónozzuk. A tk gént tartalmazó plazmidot (jelzése pFPtk5) telephibridizálással azonosítjuk, az 5'-CAG TTA TTG TGG CCG CGC TTA ACG GTG A-3' oligonukleotid próba alkalmazásával. A plazmid egy 5,5 kb méretű EcoRI fragmenst tartalmaz.

2.2. pFPtklQ.4

A pFPtk5 plazmidot Clal, BamHI és Scal restrikciós enzimmel emésztjük, Klenow polimerázzal kezeljük, majd a pTZ19R vektorral ligáijuk, amelyet PvuII, EcoRI és foszfatáz enzimekkel kezeltünk. A keletkező plazmid, jelzése pFPtkl0.4, tartalmaz egy 2,48 kb méretű BamHI-Clal inszertet, amely tartalmazza a szárnyashimlő vírus tk génjét [Boyle et al., Virology, 156, 355-356 (1987)].

2.3. pFP-UV2i

A pFPtkl0.4 tk-t kódoló régiójában levő egyetlen Ncol hasítási helyre a pUVl-ből származó 2,3 kb méretű Sspl fragmenst építjük be [Falkner et al., Nucleic Acids Research, 15, 7192 (1987)]; a fragmens tartalmazza a Pll promotert [Bertholet et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82., 2096-2100 (1985)], a P7.5 promotert [Cochran et al., J.Virol., 54, 30-37 (1985)] és a lacZ gén

-33·· ·· ♦ • · · *e • · V·· C· • · · ·*· ·* »·Λ

5' részét.

2.4. DFP-UV2

A pFP-UV2 plazmidot úgy klónozzuk, hogy a 2,3 kb méretű lacZ fragmenst (a lacZ gén 3' részét) a pFP-UVi intermedier plazmidba építjük be.

2.5. DFP-UV2-PT

Az alábbi kísérletben a protrombin cDNS szekvenciáját klónozzuk a pFP-UV2 plazmidba. Ezt a kísérletet úgy végezzük, hogy a pPt 12 plazmidból kivágjuk a 2,0 kb méretű EcoRI fragmenst, amelyet a 90 101 számú európai közrebocsátási iratban írtak le. A teljes humán protrombin cDNS-t ezután az EcoRI enzimmel és foszfatázzal kezelt pFP-UV2 vektorba klónozzuk. Ebben a konstrukcióban a protrombin cDNS transzlációs start-kodonja pontosan fúziónál a vakcínia vírus késői 11K polipeptidje promoterének természetes startkodonjával. A kapott plazmid jele pFP-UV2-PT.

2.6. pTKm

Ezt a plazmidot a pFPtklO.4-ből állítjuk elő helyspecifikus mutagenezissei, egy foszforotioát-alapú mutagenezis eljárást (Amersham) alkalmazva. Az FPV timidin-kináz intergenikus régiójának megnagyobbítására és módosítására használt indító molekula szekvenciája:

5'-TTA CAC TAA ACC GGG GAT CGA TAA AAA CCT TAA TTA CTA-3'.

A mutáció struktúráját szekvenálással ellenőrizzük az 5'-CCATTCCGTGTATAATGTAC-3' indító molekula alkalmazásé-34val, amely a megváltoztatott szekvencia után 46 bázispárral található.

2.7. pFP-ZsPll

A pFP-Z21 plazmidban (lásd 2.15) a lacZ gént számos restrikciós hasítási hely határolja, de nem tartalmaz promoter szekvenciát. A pFP-Z21 PstI és Smal hasítási helyére egy szintetikus promotert szúrunk be (ez egy módosított változata a vakcínia Pll promoterének) a lacZ gén elé, egy szintetikus linker ligálásával, amely az egymáshoz illesztett I-es és ΙΙ-es oligonukleotidokat tartalmazza. (I-es oligonukleotid: 5'-GCC TAT TTA TAG CAT AGA AAA AAA CAA AAT GAA ATT TTA CTA TAT TTT TAT ATA CAT ATA TTC TAA CCC-3'; a ΙΙ-es oligonukleotid: 5'-GGG TTA GAA TAT ATG TAT GTA AAA ATA TAG TAG AAT TTC TTC ATT TTG TTT TTT TCT ATG CTA TAA ATA GGC TGC A-3').

2.8. pTKm-sPll

A 3.3 kb méretű Smal/Ball fragmenst, amely az Escherichia coli szintetikus vakcínia promoterrel vezérelt lacZ génjét tartalmazza, a pFP-ZsPll plazmidból állítjuk elő, és a Smal restrikciós enzimmel linearizált pTKm vektorba építjük be. A kapott plazmid jelzése pTKm-sPll.

2.9. pTKm-sPll-qpt

A pTKm-sPll plazmidot Smal restrikciós enzimmel linearizáljuk, majd a pTKgpt-Fls plazmidból kivágott génkazettával ligáljuk [Falkner and Moss; J. Virol., 62, 1849-1854 (1988)]. A keletkező plazmid jelzése pTKm-sPll-gpt.

2.10. pTKm-Wtka és b

Ezeket a plazmidokat úgy állítjuk elő, hogy a vakcínia vírus teljes timidin-kináz génjét {amelyet a pGS50 plazmid 1,1 kb méretű Dral fragmense formájában állítunk elő Mackett and Smith módszerével [J.Gen.Virol., 67 2067-2082 (1986)]} a Smal restrikciós enzimmel linearizált pTKm-sPll vektorba építjük be. A kapott plazmidok jelzése pTKm-Wtka és b.

2.11· M13mpl8-UVl

Első lépésként a pFP-UV2 inszerciós vektorból (lásd 2.4) származó 1,2 kb méretű PstI/Saul fragmenst M13mpl8 vektorban klónozzuk. Ez a fragmens tartalmazza a 11K [Pll, Bertholet et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82, 2096-2100 (1985)], illetve 7.5K [P7.5, Cochran et al., J.Virol., 54, 30-37 (1985)] fehérjéket kódoló vakcínia vírus gének promotereit, valamint a lacZ gén egy részét. A kapott plazmid jelzése M13mpl8-UVl.

2.12. M13mpl8-Eco2

Helyspecifikus mutagenezist használunk (Amersham, Inc) egy második EcoRI hasítási hely beépítésére az M13mpl8-UVl lacZ génje ATG triplettje elé 7 bp távolságban, így állítjuk elő az M13mpl8-Eco2 intermedier plazmidot. A lacZ upstream régió megváltoztatására használt mutagén indító molekula szekvenciája: 5'-ACC ATA TGT AAG GAA TTC CTT AGA TAA-3'

2.13. DFP-UV2-ECO2

Az M13mpl8 plazmidból előállított módosított Pstl/Saul promoter fragmenst a Pstl/Saul restrikciós enzimekkel hasított pFP-UV2 plazmidba építjük be, és a keletkező vektornak a pFP-UV-2-Eco2 jelzést adjuk.

2.14. DFP-Z1

A pFP-Zl plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pFP-UV2-Eco2 plazmidból kihasítjuk a 0,9 kb méretű EcoRI P11/P7.5 fragmenst, ezáltal egy többszörös klónozó helyet illesztünk közvetlenül a lacZ gén elé.

2.15. DFP-Z21

A pFP-Z21 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy egy szintetikus kapcsoló molekulát (szekvenciája: 5'-CGA TTG GCC AGG ATC CGT CGA CAG GCC TAT-3'; komplementer szál: 5'-CGA TAG GCC TTGT CGA CGG ATC ATG GCC AAT-3') építünk be a Clal restrikciós enzimmel részlegesen emésztett pFP-Zl vektorba. Ez a módosítás lehetővé teszi, hogy a lacZ gént egyszerűen kihasítsuk.

2.16. pFP-2

A pFP-2 plazmidot egy olyan könyvtárból állítjuk elő, amelyet úgy készítünk, hogy az SspI/EcoRV restrikciós enzimekkel részlegesen emésztett FPV-DNS (HP1-441) random fragmenseit a Smal restrikciós enzimmel linearizált pFP-Z21 plazmidba építjük be.

2.17. PFP-ZP2

A 0,6 kb méretű, a P2 promoter aktivitást hordozó EcoRI/Nsil fragmenst pFP2 plazmidból állítjuk elő. Ezt a fragmenst*1igáijuk az EcoRI/PstI enzimekkel linearizált pFP-Z21 vektorral.

2.18. pTZqpt-P2a és DTZgpt-P2b

Ezeket a plazmidokat úgy állítjuk elő, hogy a pFP-ZP2 plazmidból származó P2-lacZ gén-kazettát (ez egy 3,7 kb méretű Smal/Stul fragmens) beépítjük a Hpal restrikciós enzimmel linearizált pTZgpt-dP plazmidba (lásd 2.27). A keletkező vektorok jelzése pTZgpt-P2a és pTZgpt-P2b.

2.19. PFS50

Az első lépésben a pTZ19R plazmidot (Pharmacia) PvuII restrikciós enzimmel emésztjük, hogy a többszörös klónozó helyet és a szomszédos szekvenciákat tartalmazó 349 bp méretű fragmenst kihasítsuk. Ezt a vektor fragmenst ligái juk egy 1,1 kontroll méretű vakcínia tk gén fragmenssel, amelyet a pGS50 plazmidból állítunk elő Dral restrikciós enzimes emésztéssel. A kapott plazmid jelzése pFS50.

2.20. PFS51

A pFS50 plazmidot Clal és EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, majd egy szintetikus kapcsoló szekvenciával ligáljuk (P-MCS1 és -2). Ennek a vektornak a jelzése pFS51. A kapcsoló molekula készítésében használt oligonukleotidok szekvenciája:

-38P-MCS-1: 5'-CGA GCA GCTG CAT ATG AGG CCT GGA TCC CGG GTC

GAC GCG GCC GCT AAC TGA CTG ATT TTT CTC-3 '

P-MCS-2: 5¹-AAT TGA GAA AAA TCA GTC AGT TAG GCG CCG CGT CGA CCC GGG ATC CAG GCC TCA GCA GCT GCT-3'

2.21. pFSgpt

A pFSgpt plazmidot úgy állítjuk elő, hogy egy 0,98 kb méretű P7.5-gpt kazettát szubklónozunk, amelyet a pTKgpt-Fls-ből állítunk elő [Falkner and Moss; J. Virol.,

62. 1849-1854 (1988)] Ndel és Dral restrikciós enzimes hasítással, a PvuII/Ndel restrikciós enzimekkel hasított pFS51 plazmidba.

2.22. pP2m0gpt

A mutáns mO P2 promotert kódoló szintetikus oligonukleotidokat illesztjük és erőltetett klónozással beillesztjük az Ndel/BamHI enzimekkel linearizált pFSgpt vektorba. Ezeknek a oligonukleotidoknak a nukleotid szekvenciája az alábbi:

mO.l: 5'-TAC GGC TTG GTA TAG CGG ACA ACT AAG TAA TTG TAA

AGA

AGA

AAA

CGA

AAC

TAT

CAA

AAC

CGT

TTA

TGA

AAT

GAT

AGA

AAA

AAG

AAT

ATA

AAT

AAT

CCT

GTA

TTT

TAG

TTT

AAG

TAA

CAG

TAA

AAT

AAT

GAG

TAG

AAA

ATA

CTA

TTT

TTT

ATA

GCC

TAT

AAA

TGA

ATT

CG-3 '

mO. 2:

5'-GATC

CGA

ATT

CAT

TTA

TAG

GCT

ATA

AAA

AAT

AGT

ATT

TTC

TAC

TCA

TTA

TTT

TAC

TGT

TAC

TTA

AAC

TAA

AAT

ACA

GGA

TTA

TTT

ATA

TTC

TTT

TTT

CTA

TCA

TTT

CAT

AAA

CGG

TTT

TGA

TAG

TTT

CGT

TTT

CTT

CTT

TAC

AAT

TAC

TTA

GTT

GTC

CGC

TAT

ACC AAG CCG-3'.

♦ ·

-39A kapott plazmid jelzése pP2m0gpt.

2.23. DP2miqpt

A pP2mlgpt szintetikus ml.l és ml.2 kapcsoló szekvenciáit illesztjük, és az Ndel/BamHI restrikciós enzimekkel linearizált pFSgpt vektorral ligáijuk. Az oligonukleotidok szekvenciája az alábbi:

ml.l:

5».

-ATC

GGC

TTG

GTA

TAG

CGG

ACA

ACT

AAG

TAA

TTG

TAA

AGA

AGA

AAA

CGA

AAC

TAT

CAA

AAG

CGT

TTA

TGA

AAT

GAT

AGA

AAA

AAG

AAT

ATA

AAT

AAT

CCT

GTA

TTT

TAG

TTT

AAG

TAA

CAG

TAA

CCT

AAT

GAG

TAG

AAA

ATA

CTA

TTT

TTT

ATA

GCC

TAT

AAA

TCA

TGA

ATT

cg-:

3’;

ml. 2:

5'-

-GAT

CCG

AAT

TCA

TGA

TTT

ATA

GGC

TAT

AAA

AAA

TAG

TAT

TTT

CTA

CTC

ATT

ATT

TTA

CTG

TTA

CTT

AAA

CTA

AAA

TAC

AGG

ATT

ATT

TAT

ATT

CTT

TTT

TCT

ATC

ATT

TCA

TAA

ACG

GTT

TTG

ATA

GTT

TCG

TTT

TCT

TCT

TTA

CAA

TTA

CTT

AGT

TGT

CCG

CTA

TAC

CAA

GCC

G-3 1

1

A kapott pl jelzése pP2mlgpt.

2.24. pP2m2qpt

A pP2m2gpt vektort úgy állítjuk elő, hogy az egymáshoz illesztett m2.1 és 2.2 oligonukleotidokat az Ndel/BamHI restrikciós enzimekkel hasított pFSgpt plazmidba ligáljuk. A klónozásban használt oligonukleotidok szekvenciája az alábbi:

m2.1: 5'-TAC GGC TTG GTA TAG CGG ACG ACT AAG TAA TTG TAA AGA AGA AAA CGA AAC TAT CAA AAC CGT TTA TGA AAT GAT AGA

AAA AAG AAT ATA AAT AAT CCT GTA TTT TAG TTT AAG TAA CAG

-40ΤΑΑ ΑΑΤ ΑΑΤ GAG TAG ΑΑΑ ΑΤΑ CTA TTT TGT ΤΤΤ ΑΤΑ GCC TAT

AAA TCG TGA ATT CG-3’

í ·

m2.2 :

5'-GATC

CGA

ATT

CAT

GAT

TTA

TAG

GCT

ATA

AAA

CAA

AAT

AGT

ATT

TTC

TAC

TCG

TTG

TTT

TAC

TGT

TAC

TTA

AAC

TAA

AAT

ACA

GGA

TTA

TTT

ATA

TTC

TTT

TTT

CTA

TCA

TTT

CAT

AAA

CGG

TTT

TGA

TAG

TTT

CGT

TTT

CTT

CTT

TAC

AAT

TAC

TTA

GTT

TGC

CGC

TAT

ACC

AAG

CCG-

3 ' .

A kapott plazmid jelzése pP2m2gpt.

2.25. pP2m0gpt-lacZ, pP2mlgpt-lacZ és pP2m2gpt-lacZ (pP2mxqpt-lacZ)

A pP2m0gpt-lacZ, pP2mlgpt-lacZ és pP2m2gpt-lacZ plazmidokat úgy állítjuk elő, hogy Escherichia coli lacZ génjét egy 3,2 kb méretű EcoRI/Ball fragmens formájában (amely a pFP-Z21 plazmidból származik) az EcoRI/Smal restrikciós enzimekkel linearizált pP2m0gpt, pP2mlgpt és pP2m2gpt vektorokba építjük be.

2.26. pTZgpt-Fls

A pTZgpt-Fls vakcínia vírus inszerciós vektort úgy állítjuk elő, hogy a pTKgpt-Fls plazmid 2,4 kb méretű PvuII fragmensét (eredetileg a pUC18 plazmidból származik) [Falkner and Moss; J. Virol., 62, 1849-1854 (1988)] helyettesítjük a pTZ19R plazmidból (Pharmacia) származó PvuII fragmenssel. Az ampicillin rezisztencia gén és a plazmid replikációs origó mellett (amely a 2,4 kb méretű pUC PvuII fragmensen is jelen van) az fi bakteriofág replikációs origóját is beépítjük ezzel a klónozási lépéssel a pTKgpt-Fls plazmidba.

2.27. pTZgpt-dP

A pTZgpt plazmid promoterét PstI és Hpal restrikciós enzimekkel emésztve kihasítjuk, és a nagy vektor fragmenst ligáijuk Hpal linkerekkel (5'-GGTTAACC-3', Pharmacia). A kapott plazmid jelzése pTZgpt-dP.

2.28. M13mpl8-UV3

Az M13mpl8-UV3 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy az M13mpl8-UVl plazmid Pll promoterén oligonukleotiddal irányított helyspecifikus mutagenezist végzünk (lásd 2.11.). A promoter régió megváltoztatására használt oligonukleotid szekvenciája: 5'-TAGCTATAA ATAAAGATT CCTGCAG-3’.

2.29. pTZqpt-PllM

A pTZgpt-Pl1M vakcínia vírus rekombináns plazmidot úgy állítjuk elő, hogy egy az M13mpl8-UV3 plazmidból származó 600 bp méretű, Klenow fragmenssel kezelt HindIII/Asp718 fragmenst építünk be a Hpal restrikciós enzimmel emésztett pTZgpt-dP plazmidba. Ez a fragmens tartalmazza a mutáns Pll promotert.

2.30. pFP-ZsPll

Az sPll(3) és sPll(4) oligonukleotidokat egymáshoz illesztjük, és a Smal/PstI restrikciós enzimekkel hasított pFP-Z21 vektorba klónozzuk (lásd 2.15.). Az sPll(3) és sPll(4) szekvenciái:

5'-GCCTATTTAT AGCATAGAAA AAAACAAAAT GAAATTCTAC

TATATTTTTA CATACATATA TTCTAACCC-3', illetve

-426 '-GGGTTAGAAT ATATGTATGT AAAAATATAG TAGAATTTCA

TTTTGTTTTT TTCTATGCTA TAAATAGGCT GCA-3'.

A kapott plazmid jelzése pFP-ZsPll.

2.31. pTZqpt-sPll

A pFP-ZsPll plazmidot Smal/BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a 3,3 kb méretű, a lacZ génhez kapcsolt szintetikus promotert tartalmazó fragmenst a pTZgpt-dP vakcínia vírus inszerciós vektorba (lásd 2.27) klónozzuk. A kapott plazmid jelzése pTZgpt-sPll.

2.32. pFP-Zs4b

Az s4b(3) és s4b(4) oligonukleotidokat egymáshoz illesztjük, és a Smal/Pstl restrikciós enzimekkel hasított pFP-Z21 vektorba klónozzuk (lásd 2.21). Az s4b(3) és s4b(4) szekvenciák az alábbiak:

'-GCCTATTTAT ATTTGATAGT TTTTTACTTG TAACGTATCA AAATAAGTAC CTAAAGAGAC CTAACCCC-3 · illetve '-GGGGTTACGT CGCTTTAGGT ACTTATTTTG ATACGTTACA AGTAAAAAAC TATCAAATAT AAATAGGCTG CA-3 ' .

A kapott plazmid jelzése pFP-Zs4b.

2.33. pTZgpt-s4b

A pFP-Zs4b plazmidot Smal/Ball restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a lacZ génhez kapcsolt szintetikus promoter szekvenciát tartalmazó 3,3 kb méretű fragmenst a pTZgpt-dP vakcínia vírus inszerciós vektorba klónozzuk (lásd 2.27). A kapott plazmid jelzése pTZgpt-s4b.

-43····· ·· ·« · • · · · · · · « · • · · ·· · * · · ** * ·« · · ,

2.34. pFP-Zsart

A sart(3) és sart(4) oligonukleotidokat egymáshoz illesztjük, és a Smal/PstI restrikciós enzimekkel hasított pFP-Z21 vektorba klónozzuk (lásd 2.15). A sart(3) és sart(4) szekvenciák az alábbiak:

5'-GCCTATTTAT ATGCCAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAGCTTC CC-3' illetve

5'-GGGAAGCTTT ΤΤΤΤΊΤΤΤΤΤ TTTTTTTGGC ATATAAATAG GCTGCA-3'.

A kapott plazmid jelzése pFP-Zsart.

2.35. pTZgpt-sart

A pFP-Zsart plazmidot Smal/BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, és a 3,3 kb méretű fragmenst, amely a lacZ génhez kötött szintetikus promoter szekvenciát tartalmazza, a pTZgpt-dP vakcínia vírus inszerciós vektorba (lásd 2.27.) klónozzuk. A kapott plazmid jelzése pTZgpt-sart.

A vflsfi, vPll, vPllm és vart rekombináns vírusok a pTKgptFlB [Falkner and Moss; J. Virol., 62, 1849-1854 (1988)], a pTZgpt-sPll, pPllm-lacZ [T. Langmann, Diplomarbeit, Universitát Wien (1991)], illetve a pTZgpt-s4b és pTZgpt-sart rekombináns plazmidokból származnak.

3. A szárnyashimlő vírus timidin-kináz génjének jelentősége a sejttenyészetek növekedésében

3.1 Az FPV inszerciós plazmid készítése a PFP-UV2 inszerciós plazmidból és a PFP2-UV2-PT plazmidból

Az első típusú előállított plazmidokban, a pFP-UV2 és pFP-UV2-PT plazmidokban a szárnyashimlő vírus tk génjét kódoló szekvenciát a beépített idegen szekvencia két fragmensre vágja. A pFP-UV2 plazmid hasonló szerkezettel rendelkezik, mint a pUVl vakcínia vírus inszerciós plazmid [Falkner et al., Nucleic Acids Research, 15, 7192 (1987)]. A pUVl-ben az Escherichia coli lacZ riporter génjét a vakcínia vírus korai/késői P7.5 promotere vezérli [Cochran et al., J. Virol., 54, 30-37 (1985)]. A vakcínia vírus fő késői 11K polipeptidjének a promoterét [Bertholet et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82, 2096-2100 (1985)] a többszörös klónozó hely követi, és a beépítendő idegen gén szabályozó elemeként szolgál. Mindkét komponenst a vakcínia vírus tk génjének szekvenciái határolják (1A ábra). A pFP-UV2 plazmid elrendezése hasonlít a lacZ riporter gén és a promoterek elrendezéséhez. Ezeket azonban a szárnyashimlő vírus tk génjének szekvenciái határolják (1A ábra). A pFP-UV2 in vivő rekombinációval való beépítése az FPV genomiális tk lókuszába, a pUVl esetéhez hasonlóan, a vírus tk génjének inaktiválását eredményezi. Ennek a plazmádnak az előállításához a pUVl promoter-lacZ génkazettát két lépésben az FPV tk génben található egyetlen Ncol hasítási helyre klónozzuk, az 1A ábra szerint. A pFP-UV2-PT rekombináns plazmid előállításához a humán protrombin gén cDNS-ét illesztjük be a pFP-UV2 vektorba, a vakcínia 11K promotere után. A pFP-UV2-PT plazmidot használjuk az FPV rekombinánsok első sorozatának előállítására.

·« ··

-453.2. A pFP-UV2-PT-ből származó FPV rekombinánsok genomiális jellemzése

A pFP-UV2-PT plazmid működési tulajdonságainak vizsgálatához, egy in vivő kísérletet végzünk csirke embrió fibroblaszt sejtekben. A lacZ riporter gén miatt a rekorobináns vírust a kék tarfoltos screen alapján lehet vizsgálni. Számos kék tarfoltot izoláltunk, és háromszoros tarfolt tisztításnak vetettük alá. Az FPV rekombinánsokkal fertőzött sejtekből tisztított össz-DNS Southern hibridizálása az FPV tk génjéből, illetve a lacZ génből készült próbákkal azonban kiderült, hogy a restrikciós fragmensek várt mintázata (egy új, körülbelül 8,3 kb méretű csík a lacZ génnel mint próbával és két csík, az egyik körülbelül 1,9, a másik körülbelül 8,3 kb méretű az FPV tk génnel mint próbával) nem figyelhető meg. Ehelyett egy komplex mintázat figyelhető meg, amely tartalmazza a vad típusú tk gén csíkját is. Egy tipikus vírus izolátumot, jele f-PTl blue, választottunk ki a további tarfolt tisztításokhoz és Southern biot elemzéshez. Kiindulva a háromszoros tarfolt tisztításnak alávetett izolátumból, összesen 11 egymást követő tarfolt tisztítás sem változtatta meg lényegesen a csíkok komplex mintázatát. A 2A és 2B ábra 1-5 sávjaiban látható a vírus DNS-ek 3., 5., 7., 9. és 11. tarfolt tisztítás utáni restrikciós mintázata, az FPV tk gén próbával (2A ábra) illetve a lacZ gén próbával (2B ábra) láthatóvá téve. Egy másik izolátum, az f-PT2 blue, hasonló, de nem azonos DNS restrikciós mintázatot mutatott (2A és 2B ábra, 6. sáv).

A tarfolt tisztítás minden egyes lépésében gyakran

-46fehér tarfoltok figyelhetők meg. Két fehér tarfoltot, az fPT1 és f-PT2 white tarfoltokat az f-PT blue izolátumokkal együtt analizáltuk. Ezek hibridizálódnak a lacZ génből készült próbához, de nem szineződtek kékre (2B ábra, 8. és 9. sáv). Az FPV tk génnel mint próbával végzett hibridizálás minden esetben igazolta a vad típusú tk gén jelenlétét (2A

ábra, 1-9. sávok,	nyílhegy). Az FPV vad típusú kontroll lát-
ható a 7. sávban,	a negatív kontroll (csirke embrió fibro-
blaszt DNS) a 10.	sávban. Annak igazolására, hogy ezek a

váratlan eredmények nem egy részleges EcoRl restrikciós enzimes emésztés következményei, ugyanazt a biottot, mint amely a 2A ábrán látható, egy protrombin génből készült próbához hibridizáljuk. Amint az a 2C ábrán minden esetben látható (kivétel a 6. sáv; ezek a nagyobb csíkok egy bonyolultabb rekombinációs esemény következményei lehetnek az f-PT2 kék genomban), csak egy csík, a 2,0 kb méretű protrombin csík mutatható ki, jelezve, hogy a restrikciós emésztés teljes volt. A 2A és 2B ábrákon látható komplex csíkok tehát nem a vírus DNS részleges emésztéséből származó műtermékek, hanem azt mutatják, hogy a virális tk génnek a pFP-UV2-PT inszerciós plazmiddal való inaktiválásával nem kapható genomiálisan monoklonális szárnyashimlő rekombináns.

3.3. A pTKm-sPll-qpt jelű FPV inszerciós plazmid előállítása

Annak a hipotézisnek az ellenőrzésére, hogy a tk gén létfontosságú a HP1.441 FPV törzs számára, egy új inszerciós plazmidot készítettünk, jele pTKm. Egy idegen génnek ebbe a *·»· · «« ,_Η , • · · 9 · . .

. · · · ·····

-47plazmidba való beillesztésének helye a tk gén és a tk gén utáni nyitott leolvasási keret (3') orf közötti intergenikus régió. A tk gén és a 3' orf közötti vad típusú intergenikus régió nem tartalmaz egyedüli restrikciós hasítási helyeket, amelyek alkalmasak idegen gének beépítésére. Ezért ezt a régiót a 3. ábrán látható módon módosítottuk. Közvetlenül a tk gén stop-kodonja után egy vakcínia korai transzkripciós stop-jelet [Rohrmann G. et al., Cell, 46, 1029 (1986)] és egyedüli hasítási helyként Clal, Smal és Asp718 felismerési helyeket építettünk be helyspecifikus mutagenezissei. A pTKm plazmid módosított megnövelt intergenikus régiójába a szintetikus Pll promoter-lacZ génkazettát és a P7.5-gpt génkazettát építettük be két lépésben. A végezetül kapott plazmid jele pTKm-sPll-gpt (4. ábra); ez tartalmazza a lacZ gént a kék tarfolt alapú szűrővizsgálathoz, és szelekciós markerként a gpt gént. A virális genomba való integrációval ez nem hasad szét, és nem inaktiválja az FPV tk gént.

3.4. Rekombináns szárnvashimlő vírusok érintetlen

FPV tk génnel

Ezután a pTKm-sPll-gpt plazmidot használjuk az FPV rekombinánsok in vivő rekombinációval való előállítására csirke embrió fibroblasztban. Az összes, gpt szelekcióval kapott tarfolt kékre festődött, ha a felülrétegző közegben X-gal volt. Csak két tarfolt tisztítási lépésre volt szükség (gpt szelekcióval) ahhoz, hogy megkapjuk a vírus izolátumokat.

Ezután az egyik izolátumot, jele f-sPll 1, nagy mennyiségben előállítjuk és tisztítjuk. A rekombináns és vad

-48típusú vírusokból származó virális DNS-t EcoRi restrikciós enzimmmel emésztjük, agaróz gélen elválasztjuk, és Southern blottal analizáljuk. Az 5A-C ábránál különböző próbákat használtunk; az egyes sávok jelentése az alábbi:

(A) Az FPV tk génből készített próbával való hibridizáció. Az 1. sávban látható az f-sPll 1 FPV rekombináns DNS-e, a 2. sávban látható a HP1.441 jelű vad típusú FPV DNS-e; a 3. sávban a Hindin restrikciós enzimmel emésztett lambda DNS látható.

(B) A gpt génből készített próbával végzett hibridizálás. Az 1. sávban a HindlII restrikciós enzimmel emésztett lambda fág DNS látható; a 2. sávban az f-sPll 1 FPV rekombináns DNS-e látható, a 3. sávban a HP1.441 jelű FPV vad típusú vírus DNS-e látható.

(C) A lacZ génből és lambda fág DNS-ből készített próbával való hibridizálás. Az 1. sávban a Hindin restrikciós enzimmel emésztett lambda fág DNS látható; a 2. sávban az f-sPll 1 FPV rekombináns DNS-e látható, a 3. sávban a HP1.441 jelű FPV vad típusú vírus DNS-e látható. A jobboldalon összehasonlítás céljából megadott értékek kilobázisban megadott standardoknak felelnek meg.

Az 5A. ábrán a restrikciós fragmenseket az FPV tk génjéből készített próbával hibridizáltuk. A rekombináns DNS-ben két új, 5,2 és 4,7 kb méretű fragmens látható (1. sáv); a kontroll DNS-ben az 5,5 kb méretű vad típusú tk csík látható. A gpt génből készített próbával való hibridizálás után (5B. ábra), a tk gén egy részét és a gpt szekvenciákat tartalmazó 5,2 kb méretű fragmens látható (2. sáv), míg a

-49vad típusú vírusnál (3. sáv) nincs látható jel. Végezetül, a lacZ génből, illetve a lambda fágból készített próbákkal való hibridizálással (5C ábra) a rekombináns vírusnak egy 4,7 kb méretű lacZ gént tartalmazó fragmense válik láthatóvá (2. sáv), valamint a marker csíkok (1. sáv). A vad típusú vírus (3. sáv) ismét nem hibridizálódik.

Ebből a kísérletből azt a következtetést lehet levonni, hogy az FPV tk-génje és a 3'-orf közötti intergenikus régió nem lényeges, és egy érintetlen tk-gén lehetővé teszi a legitim FPV rekombinánsok tisztítását.

3.5. Új FPV qazdasejtek; f-TK2a és F-TK2b

Technikai és biológiai okokból sokkal nehezebb és időigényesebb rekombináns FPV-t előállítani. Ezért mielőtt a kiválasztott gént az FPV-be beillesztjük, rendszerint egy hasonló vakcínia vírus rekombinánst állítunk elő, hogy a megfelelő gének működését tanulmányozzuk. Ahhoz, hogy ugyanezeket a vakcínia inszerciós plazmidokat használhassuk a szárnyashimlő rekombinánsok előállításában is, a vakcínia vírus tk génjét, az Escherichia coli lacZ génnel együtt beépítettük a szárnyashimlő vírus tk génje és 3' orf-ja közötti intergenikus régióba. A pTKm-Wtka és pTKm-Wtkb plazmidokat úgy állítjuk elő, hogy a működő W tk gént a pTKm-sPll intermedier plazmidba klónozzuk (4. ábra) . A pTKm-Wtka és b plazmidoknak a vad típusú FPV vírussal való rekombinálásával két új gazdatörzset állítottunk elő (jelzésük f-TK2a és f-TK2b) . Tehát az új gazdatörzs két működőképes tk gént és a lacZ gént tartalmazza, és mindezek használhatók nem-esszen

-50ciális helyként a megfelelő inszerciós plazmidokkal rekombinációs szubsztrátként. Az új törzsek Southern biot analízise látható a 6A-C ábrákon. A vad típusú HP1.441 vírus DNS-ét, a két FPV rekombinánst és a pTKm-Wtka és pTKm-Wtkb plazmidokat PstI, Clal és EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, 1 %os agaróz gélen elválasztjuk, és nitrocellulóz membránra visszük át. A 6A-C ábrákon látható biottokat hibridizáljuk az FPV tk génjéből készített próbával (6A ábra), a vakcínia vírus tk génjéből készített próbával (6B ábra), valamint a lacZ génből és a lambda DNS-ből készített próbával (6C ábra) . Mindegyik emésztésnél a várt csíkozat (lásd a 6D és 6E ábrákat) figyelhető meg. A Clal emésztések esetében a 6B ábra 5. és 6. sávjában látható körülbelül 0,5 és 0,7 kb méretű kis hibridizálódó fragmensek a Clal restrikciós enzimmel emésztett kiindulási plazmidban nem láthatók (13. és 14. sáv a 6B ábrán). Ez annak a ténynek a következménye, hogy a plazmid DNS-eket a HB101 Escherichia coli törzsből izoláltuk, amely törzs metilezi a megfelelő Clal hasítási helyet. Egy kontroll kísérletben ez a hasítási hely hasítható, ha a DNS-t Dam metilációra nézve negatív Escherichia coli törzsből állítjuk elő.

4. Szárnvashimlő vírus korai/késői promotere a vakcínia vírus rekombinánsokban

4.1. A szárnvashimlő vírus promotereinek azonosítása Egy olyan transzkripciós egység, amely egy vakcínia vírus promotert, és lacZ gén kódoló szekvenciáját tartalmaz, aktív Escherichia coli-ban és az X-gal kromogén szubsztrát jelenlétében növesztett baktérium telepeket B-galaktozidáz pozitív fenotípusúvá alakítja. Ez a jelenség akkor figyelhető meg, ha az Escherichia coli lacZ génjét tartalmazó vakcínia vírus inszerciós plazmiddal lacZ negatív Escherichia coli törzsekben dolgozunk [Chakrabarti et al., Mól. Cell. Bioi., 5, 3402-3409 (1985)]. Mivel az FPV és a vakcínia vírusok promoter szekvenciái működés szempontjából ekvivalensek [Boyle and Coupar; J. Gén. Virol., 62, 1591-1600 (1986); Taylor et al., Vaccine, 6, 497-503 (1988)], ezért a szárnyashimlő promotereknek működniük kell Escherichia coliban. Ezeknek a megfontolásoknak az alapján dolgoztunk ki egy stratégiát a szárnyashimlő vírus promoter elemeinek azonosítására.

Első lépésként előállítottuk a pFP-Zl és pFP-Z2 plazmidokat (8. ábra); mindkét plazmid egy promoter nélküli lacZ gént tartalmaz. Kiindulási plazmidként a pFP-UV2-t választottuk. Ez tartalmazza az Escherichia coli lacZ génjét a vakcínia vírus P7.5 promoterével szabályozva, a Pll promotert és klónozási célokra egy többszörös klónozó helyet, valamint szárnyashimlő vírus tk szekvenciák határolják. Abból a célból, hogy a vakcínia promotereket kivágjuk, egy új EcoRI hasítási helyet építettünk be 7 bázissal a lacZ gén iniciációs kodonja elé. Az EcoRI restrikciós enzimmel végzett emésztés és újraligálás eredményeképpen kaptuk a pFP-Zl plazmidot, amely a promoter nélküli lacZ gén szomszédságában egyedi restrikciós hasítási helyeket tartalmaz. A következő lépésben a HP1-441 szárnyashimlő vírus DNS-ét Sspl és EcoRV restrikciós endonukleázokkal emésztjük, és a pFP-Zl plazmid

-52lacZ génje szomszédságában levő egyedi Smal helyre klónozzuk (9. ábra). A plazmidokat a B-galaktozidáz negatív Escherichia coli NM 522 törzsbe transzfektáljuk, és ampicillint, valamint X-gal-t tartalmazó agarlemezekre szélesztjük. Egy éjszakán át való növesztés után a telepeknek kis százaléka kékül meg. Néhány telepet kiválasztunk, és a plazmid DNSeket CV-t sejtekben tranziens expressziós vizsgálatban tanulmányozzuk, hogy előidéznek-e vakcínia vírus specifikus gén-expressziót (nem közölt adatok). A plazmid DNS-ek különböző mennyiségű β-galaktozidáz aktivitást visznek be a vakcínia tranziens expressziós vizsgálatokba. A további elemzés céljára a legmagasabb aktivitást mutató kiónt (2. számú klón) választjuk, a promoter jelzése ’'P2, a plazmid jelzése pFP-2 (9. ábra).

4.2. A P2 szárnvashimlő vírus promoter szerkezete

A pFP-2 plazmid 2,5 kb méretű P2 promoter inszertjét restrikciós térképezéssel elemezzük. Az 560 bp méretű EcoRI-Nsil fragmenst találjuk a lacZ gén szomszédságában, tehát valószínűleg ez tartalmazza a promoter szekvenciákat. Ezt a fragmenst a pFP-Z21 plazmidba építjük be (a pFPZ21 a pFP-Zl plazmid származéka amely a lacZ gén 3' végén egy polilinker inszertet tartalmaz (8. ábra). A promoter lacZ gén-kazettát ezután kivágjuk, és a pTZgpt-dP plazmid egyedi Hpal hasítási helyére klónozzuk, így kapjuk a pTZgpt-P2b és pTZgpt-P2b plazmidokat (9. ábra). Mivel a promoter idegen gén transzkripciós egység orientációja befolyásolhatja a transzkripció szintjét, ezért mindkét plazmidot felhasználjuk a további

-53vizsgálatokban. A promoter inszert szekvenálását a pTZgptP2a plazmidot templátként használva végeztük el. A promoter primer szerkezete és a P2 gén első tíz kodonja a 10A ábrán látható. Az 5' nem-transzlálódó régió 174 bp hosszú, és egy Nsil hellyel indul. Az iniciációs kodon előtt található a himlővírus promoter konszenzus szekvenciája, a TAAAT (10A ábra, -6-tól -2-ig), amely a késői promoterek jellemzője, de megtalálható néhány korai promoternél is. Az upstream régió első 174 bp hosszú részében számos kritikus korai régió található, amelyet egy korai transzkripciós stopjel (TTTTTNT) követ. A korai transzkripciós stopjel átfed a késői promoter működés szempontjából fontos T-ben gazdag régiójával.

A pTZgpt-P2a plazmidban a P2-lacZ transzkripciós egység egy fúziós gén. Az iniciációs kodont 360 bp méretű P2 gén követi, amely leolvasási fázisban fúzionált az 5' nemtransz lálódó régióval és a lacZ kódoló régiójával (nem közölt adatok). A fúziós gén számított molekulatömege 133 kD.

4.3. A P2 promoter és más himlővírus promoterek erősségének összehasonlítása

A pTZgpt-P2a és pTZgpt-P2b plazmidokat használjuk a vP2a és vP2b vakcínia vírus rekombinánsok készítésére. A P2 promoter erősségét mindkét rekombinánsban más erős himlővírus promoterek erősségével hasonlítottuk össze. A vFlsB vakcínia rekombináns [Falkner and Moss; J. Virol., 62, 1849-1854 (1988)] tartalmazza a vakcínia Pll promoter vad típusú verzióját. A vakcínia rekombináns vart a szintetikus késői

-54promoternek egy módosított verzióját tartalmazza, amely 1,4szer erősebb, mint a Pll vad típusú promoter. Az összes vírusban a lacZ riporter gén közvetlenül a megfelelő himlővírus promoterekkel határos.

A β-galaktozidáz aktivitás vizsgálatokhoz CV-1 sejteket fertőzünk közvetlenül a Módszerek részben ismertetett vírusokkal. A 11. ábrán a különböző vírus konstrukciók által indukált enzim-aktivitások láthatók a CV-1 sejtekben. A vFlsfi-ban levő vad típusú Pll promoter aktivitását 100 %nak határozzuk meg. Érdemes megjegyezni, hogy az FPV P2 promoter b orientációja 190 %-os aktivitást indukál, jelezve, hogy a P2 promoter e legerősebb himlővírus promoterek közé tartozik. 24 órás inkubálás után a β-galaktozidáz egyike a legnagyobb mennyiségben előforduló fehérjéknek, és az összes oldható sejtfehérje 6,3 %-át teszi ki. Az a orientációjú P2 promoterrel rendelkező rekombináns vírus által indukált β-galaktozidáz aktivitás 150 %-os nagyságú, a vFlsB által indukált standard értékhez viszonyítva. A β-galaktozidáz aktivitásmérések három független kísérlet átlagai. Ezeknek az értékeknek egy független, második módszerrel való igazolásához a fertőzött CV-1 sejtek 24 órás kivonatát 10 %-os poli(akril-amid) gélen elválasztjuk, és egy denzitométerrel pásztázzuk. A β-galaktozidáz csúcsokat a 42 kDa méretű aktin csíkhoz, mint belső standardhoz viszonyítva értékeljük menynyiségileg. A vFlsB-val kapott érték ismét 100 %-os értékű standardnak számít. A pásztázás adatai jól egyeznek a enzimatikusan meghatározott aktivitás adatokkal, amint az az alábbi táblázatból látható.

-55Táblázat

Relatív β-galaktozidáz expresszió (az oldható fehérjék β-galaktozidáz tartalma)

Vírus %-os aktivitás Pásztázás %

vFlsB	100	(3,3	%)	100
vP2a	150	(5,0	%)	150
vP2b	190	(6,3	%)	195
vart	140	(4,6	%)	n. a

Annak igazolására, hogy a fertőzés után 24 órával készített sejtkivonatokban a β-galaktozidáz nagy mennyiségben van jelen, az össz-fehérjének egy Coomassie blue-val festett poli(akril-amid) géljéről készült felvétel látható a

12. ábrán. A referencia vírus, a vFlBs, valamint a rekombináns vart új csíkot indukál a 117 kD-os tartományban (3.,

4., 9. és 10. sáv; alsó nyíl), amely nem látható a vad típusú kontrolinál (1. és 2. sáv). Amint azt a szekvencia elemzés sugallja, a vP2a és vP2b vírusok által indukált β-galaktozidáz fúziós fehérje nagyobb, mint a natív enzim, ezzel igazolva fúziós természetét (5. és 8. sáv, felső nyíl).

4.4. A P2 promoter optimalizálása

A P2 promoter optimalizálására tett próbálkozások során egy sor új inszerciós plazmidot készítettünk, amelyekben a P2 promoter régiót a lacZ génhez kapcsoljuk. Első lépésként egy olyan plazmidot állítottunk elő, amely egyszerű

-56en lehetővé teszi kétszálú prokarióta oligonukleotidok beépítését, és egy minimális P7.5-gpt gén-kazettát tartalmaz szelekciós célokra. Ennek a plazmidnak (jele pFSgpt) a konstrukciója látható a 13. ábrán. Ennek a plazmidnak az egyedi Ndel és BamHI hasítási helyére építettük be a különböző mutáns promoter oligonukleotidokat (mO, ml és m2). A kapott plazmidok jelzése pP2m0gpt, pP2mlgpt és pP2m2gpt (pP2mxgpt, 14. ábra). A következő lépésben az Escherichia coli lacZ génjét építettük be a promoter szekvenciák után, így kaptuk a pP2m0gpt-lacZ, pP2mlgpt-lacZ és pP2m2gpt-lacZ (pP2mxgpt-lacZ, 14. ábra) plazmidokat.

Az mO mutáns promoterben (TAAATG AAT TCC) a lacZ gén ATG triplettje közvetlenül fúziónál a késői promoter szekvenciával, ezáltal kivágja a P2 szekvencia -1-es pozíciójában levő C csoportot, és ez egy olyan mutáció, amelynek meg kell javítania a késői promoter hatékonyságát (15. ábra). Ezt a struktúrát számos késői vakcínia promoterben megtaláltuk, és úgy véljük, hogy a késői konszenzus promoter és az iniciációs kodon optimális környezete.

Az ml mutánsban (TAAACATG AAT TCC) a lacZ gén második kodonja közvetlenül fúziónál a feltételezett P2 gén ATGjével. Ebben a mutánsban a lacZ gént a P2 vad típusú promoter vezérli (15. ábra).

Az m2 mutánst azért állítottuk elő, hogy vizsgáljuk a korai promoter kritikus régióinak szerepét a P2 gén upstream régióiban. Az m2 mutáns promoternek ugyanolyan a szerkezete, mint az ml-nek, azzal a különbséggel, hogy a működés szempontjából fontos, a késői promoter előtti T-ben gazdag régióban levő korai RNS stopjelet egy TTG inszercióval inaktiváljuk a -18-as pozícióban (15. ábra).

4.5. A mutációk hatása a korai és késői fiqalaktozidáz expresszióra

A plazmidokat használtuk vakcínia vírus rekombinánsok készítésére és CV-1 sejtek fertőzésére. A citoplazmatikus sejtkivonatoknak vizsgáltuk a β-galaktozidáz aktivitását. Az eredmények a 16. ábrán láthatók.

Claims (33)

1. Plazmid, azzal jellemezve, hogy legalább az FPV tk-gént, egy downstream intergenikus régiót és a szárnyashimlő vírus (FPV) azt követő 3' nyitott leolvasási keretét tartalmazza, ahol az említett intergenikus régió úgy van módosítva, hogy egy megnagyobbított intergenikus régió jöjjön létre, amelyben egy vagy több egyedi restrikciós enzim hasítási hely található, és ezek lehetővé teszik idegen DNS beépítését oly módon, hogy az FPV tk-génje érintetlen marad, és a teljes timidin-kináz gént (tk) kódolja.

2. Az 1. igénypont szerinti plazmid, azzal jellemezve, hogy a tk gén szekvenciáját egy himlővírus korai transzkripciós stop jel követi.

3. Az 1. igénypont szerinti plazmid, azzal jellemezve, hogy az említett megnagyobbított intergenikus régió az alábbi szekvenciát tartalmazza:

AGTAATTAAGGTTTTTATCGATCCCGGGTACCGGTTTAGTGTAATAAATTTAATAA ---------->^J 1^{1 * * 4 5}--------Η I--------Η I tk gén | 5TNT ¹------¹ Smal¹-------¹

Clal Asp718

I megnagyobbított intergenikus régió AATATTGACAAAATAGTTAAATGAATATATGAAAGTACATTATACACGGAATGGAG -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------1 I---------->

megnagyobbított intergenikus régió 3'orf

4. Az 1. igénypont szerinti plazmid, azzal jellemezve, hogy helyspecifikus mutagenezissei állítjuk elő.

5. A 3. igénypont szerinti plazmid, azzal jellemez• · · « ·

4 * · * ···«· • · · «4 · · * · ·· · ·· ·· ·

-59νβ, hogy a vad típusú szekvenciából helyspecifikus mutagenezissel állítjuk elő, az alábbi szekvencia alkalmazásával:

5' -TTACACTAAATCGGTACCCGGGATCGATAAAAACCTTAATTACTA-3 '

6. A 4A ábrán látható pTKm plazmid.

7. Idegen DNS-nek in vivő homológ rekombinációval FPV-be való beépítésére alkalmas plazmid, amely plazmidot az 1-6. igénypontok bármelyike szerint állítjuk elő, azzal jellemezve, hogy az alábbi elemeket tartalmazza:

(a) egy természetes vagy szintetikus himlővírus promoter, egy expresszálandó idegen DNS szekvenciához kapcsolva;

(b) egy második himlővírus promoter, egy marker vagy indikátor tulajdonságot kódoló génhez kapcsolva, a rekombináns FPV szelektálása céljából;

(c) az FPV-nek olyan DNS szekvenciái, amelyek a konstrukció (a) és (b) elemeit veszik körül, mind a 3' mind az 5' végeken, és az említett határoló DNS szekvenciái homológok a megnagyobbított intergenikus régió upstream és downstream szekvenciáival.

8. A 7. igénypont szerinti plazmid, azzal jellemezve, hogy tartalmaz még egy prokarióta gazdaszervezetben való replikációra alkalmas replikont, valamint egy szelektálható markert vagy indikátort kódoló gént, a plazmidnak egy transzformált prokarióta gazdaszervezetben való szelektálására.

9. A 7. és 8. igénypontok szerinti plazmid, azzal jellemezve, hogy a promoter közvetlenül az idegen gén kódoló szekvenciája előtt található.

10. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti plazmid, • « · « « · · • ·· ··»··· * · · · · ···· *· · ·· »« ·

-60azzal jellemezve, hogy a himlővírus promoter az FPV P2 promotere, amelynek részleges vagy teljes DNS szekvenciája az alábbi:

Nsil-125

ATGCATTTGT TAGAGCTTGG TATAGCGGAC AACTAAGTAA TTGTAAAGAA

-99 -95-86

GAAAACGAAA CTATCAAAAC CGTTTATGAA ATGATAGAAA AAAGAATATA

AATAATCCTG TATTTTAGTT TAAGTAACAG TAAAATAATG AGTAGAAAAT -19-1 +1

ACTATTTTTTATAGCCTATAAATC ATG GAA AAG AAA CTG ATT CAA GAG TAT GAA, illetve ennek funkcionális megfelelője.

11. A 7-10. igénypontok bármelyike szerinti plazmid, azzal jellemezve, hogy a himlővírus promoter az FPV P2 promoterének egy mutánsa, amelynek DNS szekvenciája a 15. ábrán látható.

12. A 7. igénypont szerinti plazmid, azzal jellemezve, hogy a 4A ábrán látható pTKm-sPll-gpt inszerciós plazmidnak felel meg, amelyben a lacZ gént az expresszálandó DNS szekvencia helyettesíti.

13. Egy rekombináns FPV egy idegen fehérje expreszsziójára vagy vakcinaként való alkalmazásra, azzal jellemezve, hogy in vivő rekombinációval kapjuk a vad típusú FPVből, a 7-12. igénypontok bármelyike szerinti plazmiddal.

14. Rekombináns FPV f-TK2a és f-TK2b gazdavírusok, azzal jellemezve, hogy legalább egy érintetlen FPV tk-gént, valamint egy W tk-gént tartalmaznak, és ezek közül bárme-61- lyik lehet egy egy vagy több idegen DNS szekvencia beépítésére alkalmas nem-esszenciális hely (NES).

15. A 14. igénypont szerinti rekombináns FPV, azzal jellemezve, hogy még egy szelekciós markert és/vagy egy riporter gént is tartalmaz.

16. A 9. ábra szerinti pTZgpt-P2a jelű plazmid.

17. A 9. ábra szerinti pTZgpt-P2b jelű plazmid.

18. A 14A ábra szerinti pP2m0gpt, pP2mlgpt és pP2m2gpt (pP2mxgpt) jelű plazmidok.

J

19. A 13A ábra szerinti pFS50 jelű plazmid.

20. A 13A ábra szerinti pFS51 jelű plazmid.

21. A 13A ábra szerinti pFSgpt jelű plazmid.

22. A 17A ábra szerinti pFSgpt-Fis jelű plazmid.

23. A 17A ábra szerinti pFSgpt-ΡΙΙΜ jelű plazmid.

24. Idegen DNS beépítésére, majd ezt követően a 14. igénypont szerinti gazdatörzsekbe in vivő rekombinációval való integrálására alkalmas plazmid, azzal jellemezve, hogy az alábbi plazmidokból választható:

a) PFP-UV2 (1. ábra); pTKm (4A ábra); pFS50, pFS51 és pFSgpt (13A ábra); pP2mxgpt (14A ábra); pTZgpt-Fls és pTZgpt-PllM (17A ábra); és

b) pTKm-sPll-gpt (4A ábra); pTZgpt-P2A és pTZgpt-P2b (9. ábra) és pTZgpt-sPx (17B ábra), aholis ezekben a plazmidokban az idegen DNS-t az expresszálandó DNS-sel helyettesítjük.

25. A 24. igénypont szerinti plazmid, azzal jellemezve, hogy a pTZgpt-sPx konstrukciókban sPx jelentése sPll, s4b és sart, a 18. ábra szerint.

·♦« · V • ·

26. Rekombináns FPV idegen fehérjék expressziójára vagy vakcinaként való alkalmazásra, azzal jellemezve, hogy a 14. igénypont szerinti gazdatörzs és a 24. igénypont bármelyik plazmidja közötti in vivő rekombinációval állítjuk elő.

27. A 13. vagy 26. igénypont szerinti rekombináns FPV-vel fertőzött gerinces sejtek in vitro tenyészete.

28. A 27. igénypont szerinti in vitro tenyészet, azzal jellemezve, hogy lehet csirke embrió fibroblaszt (CEF) vagy csirke embrió dermális (CED) sejt is.

29. Eljárás egy fehérje előállítására rekombináns úton, azzal jellemezve, hogy gerinces gazdasejteket vagy sejttenyészeteket fertőzünk egy, bármelyik előző igénypont szerinti rekombináns vírussal, az említett vírus az említett fehérjét kódoló DNS-t tartalmaz, majd az említett fehérjét kinyerjük.

30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi fehérjék közül az egyet expresszálunk: ΙΙ-es, V-ös, VH-es, VIII-as, IX-es, X-es, ΧΙ-es, XlI-es, XIII-as faktor, protein C, protein S, von Willebrand faktor, plazminogén és származékai, amelyekben egy vagy több aminosavat helyettesítettünk, kivágtunk vagy beszúrtunk, valamint ezek aktivált formái, apolipoproteinek, például az apoAI és apoAII, virális antigének, például a hepatítisz-B, hepatítisz-C és hepatítisz-E antigének, a kullancs által terjesztett enkefalítisz (TBE) vírus antigénjei, a HÍV, SIV antigénjei, valamint teljes vagy részleges szekvenciái az olyan szervezetek antigénjeinek, amelyek szamárköhögést, tetanuszt, maláriát, szárnyas betegségeket, Marek-féle betegsé- ···< ···*«·«· • * ♦ · 9 » 9 « · · ····«· « « · · · · ♦» 4 ·· « * * * · «

-63get, iLT-t, fertőző bronchitist, kokcidiózist és Newcastle betegséget okoznak, és a fenti antigének vakcinaként használhatók.

31. Szárnyasokat és gerinceseket fertőző patogének elleni vakcina, azzal jellemezve, hogy a vakcina egy, a 13-

15. és 26. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns FPV-t tartalmaz.

32. A 10. igénypont szerinti FPV P2 promoter DNS szekvenciája, annek részleges szekvenciája vagy funkcionális ekvivalense.

33. Az FPV P2 promotert, a P2 gént és a 3* szekvenciát kódoló DNS szekvencia, az alábbiak szerint: