DE4002521A1 - Rekombinantes plasmid - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein rekombinantes Plasmid, enthaltend mindestens ein Replikon (ori1), mindestens einen Selektionsmarker (sm1), mindestens einen Promotor (pr1) und diesen Promotor flankierende DNA-Sequenzen aus einem Poxvirusgenom, ein Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Poxvirus, ein rekombinantes Poxvirus, die Verwendung des rekombinanten Poxviruses, eine Zellinie, ein Peptid oder Polypeptid, eine Zusammensetzung, einen Impfstoff und einen Lebendimpfstoff, ein diagnostisches Mittel und die Verwendung der Impfstoffe.

Durch die Entwicklung moderner gentechnischer Methoden konnte eine Vielzahl von Genen für diagnostisch, prophylaktisch und therapeutisch bedeutsame Proteine identifiziert und isoliert werden, z. B. die Gene für Blutgerinnungsfaktoren oder antigene Virusproteine. Im Zusammenhang damit wächst der Bedarf an zuverlässigen und effizienten Expressionssystemen in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen, um die gewünschten Proteine so entweder aus infiziertem Gewebe oder infizierter Zellkultur isolieren zu können oder z. B. die immunogenen Eigenschaften in vivo exprimierter Proteine zur Immunisierung zu nutzen. Eine besondere Bedeutung haben dabei eukaryontische virale Vektorsysteme erlangt.

Eines der bekannten eukaryontischen Vektorsysteme ist das Papovavirus SV40. SV40 hat mit 5,3 kb ein vergleichsweise kleines Genom, dessen Organisation relativ gut bekannt ist. Das kleine Genom dieses Virus hat zwar einerseits den Vorteil, daß es bei Verwendung von geeigneten Restriktionsendonukleasen gezielt manipuliert werden kann, andererseits jedoch den Nachteil, daß die Klonierungskapazität durch eine entsprechend kleine Virushülle und durch die dichte, teilweise überlappende Anordnung essentieller Gene stark eingeschränkt ist.

In neueren Arbeiten wurde die Entwicklung eines eukaryontischen Vektorsystems auf der Grundlage von Vacciniavirus beschrieben (z. B. EP-A-02 43 029). Das Vacciniavirus ist ein Orthopoxvirus mit einem linearen Genom aus doppelsträngiger DNA von ungefähr 185 kbp. Die Größe des Vacciniavirusgenomes macht die Konstruktion rekombinanter Genome durch Spaltung mit Restriktionsendonukleasen und anschließendem Ligieren mit geeigneter Fremd-DNA unmöglich. Selbst dann, wenn dieses Verfahren anwendbar wäre, würde die Produktion von Viren mit dem rekombinanten Genom die Anwesenheit eines Helfervirus erfordern, da die in vitro manipulierte Virus-DNA selbst nicht infektiös ist. Die Transkription des Vacciniavirus erfordert nämlich u. a. eine vacciniaviruscodierte RNA-Polymerase, die nicht durch die eukaryontische RNA-Polymerase II ersetzt werden kann und in Viruspartikel verpackt bei der Infektion mitgebracht werden muß. Dementsprechend weist das Vacciniavirus spezielle, auf die viruscodierte RNA-Polymerase zugeschnittene Promotoren auf. Dies bedeutet eine weitere Schwierigkeit bei der Konstruktion von Rekombinanten, die fremde, in das Vacciniavirusgenom insertierte Gene in eukaryontischen Zellen exprimieren sollen. Die Verwendung von Vacciniaviren als Expressionsvektoren setzt somit voraus, daß die Transkription und Replikation wirtsunabhängig durch vacciniaeigene Enzyme durchgeführt werden kann, d. h., daß zum einen durch die Klonierung keine essentiellen Virusbereiche betroffen werden dürfen und daß zum anderen zur Expression vorgesehene Gene unter der Kontrolle von Vacciniapromotoren stehen müssen.

Aus diesem Grund wird allgemein ein zwei Schritte umfassendes Verfahren angewendet, in dem zuerst ein Plasmid konstruiert wird, daß das gewünschte Fremdgen in Verbindung mit einem Vacciniaviruspromotor enthält und dieses rekombinante Plasmid durch homologe Rekombination zwischen Virus- und Plasmid-DNA in vivo in das Vacciniavirusgenom eingeführt wird. Beispielsweise ist in der EP-A-02 43 029 ein rekombinantes Vacciniavirus beschrieben, das nach dem obenbeschriebenen Prinzip konstruiert worden ist und zur Expression des HIV env-Proteins verwendet wird. Das in der genannten europäischen Patentanmeldung verwendete Plasmid pSC25 ist ein für die geplante Expression des env-Proteins höchst geeigneter Vektor. Es hat jedoch den Nachteil, genau wie das Parentalplasmid pSC11, für eine Weiterentwicklung, d. h. für die Insertion weiterer und anderer Fremd-DNA, vollkommen ungeeignet zu sein. So ist für pSC25 in der genannten europäischen Patentanmeldung keine weitere sinnvolle Klonierungsstelle angegeben, für das Vorläuferplasmid pSC11 lediglich eine einzelne SmaI-Stelle. Eine Klonierung in eine SmaI-Stelle setzt in den meisten Fällen eine Manipulation der Restriktionsfragmente, die in die Stelle eingesetzt werden voraus, da SmaI ein glatte Enden erzeugendes Restriktionsenzym ist. Darüberhinaus ist es nicht möglich, im Plasmid pSC11 Genfragmente zu klonieren, die keine eigenen Translationssignale, d. h. ein Start- oder ein Stop-Codon enthalten.

Die Verwendung des prinzipiell sehr vorteilhaften Plasmides pSC11 für die Klonierung von unvollständigen Genen, Genfragmenten oder gar synthetischer DNA erfordert daher jedesmal umfangreiche und umständliche Konstruktionsabläufe.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Plasmid zur Verfügung zu stellen, das die Klonierung von Fremd-DNA in ein Plasmid, das zur Rekombination mit Poxvirus in der Lage ist, soweit wie möglich erleichtert.

Diese Aufgabe wird durch ein rekombinantes Plasmid gemäß Oberbegriff des Hauptanspruches gelöst, indem dem Promotor (pr1) folgend eine multifunktionelle DNA-Sequenzkassette angeordnet ist.

Das erfindungsgemäße rekombinante Plasmid, bei dem dem Promotor folgend eine multifunktionelle DNA-Sequenzkassette angeordnet ist, bietet den Vorteil, daß in Abhängigkeit von der jeweiligen für die Konstruktion des Plasmides maßgebenden Aufgabenstellung verschiedene funktionelle Sequenzen eingesetzt werden können. So ist es z. B. denkbar, Sequenzkassetten zu verwenden, die neben dem am häufigsten auftretenden Translationsstartcodon AUG das weniger häufig gebrauchte Startcodon GUG verwenden. Gleichermaßen ist es möglich, Kassetten mit einem oder mehreren Stopcodonen einzusetzen, die gleich oder verschieden sein können, um eventuell auftretende Amber, Ochre- oder Opalsupression zu verhindern. Das System gestattet darüberhinaus die Insertion von Polyadenylierungssignalen und anderen Signalstrukturen jeweils zusätzlich zur Insertion des gewünschten Fremdgenes bzw. -fragments.

Das erfindungsgemäße Plasmid enthält in seiner multifunktionellen DNA-Sequenzkassette bevorzugt eine Aneinanderreihung von Klonierungsstellen. Dabei sind gebräuchliche Klonierungsstellen für Hexamer-erkennende Restriktionsendonukleasen bevorzugt, die überstehende Enden erzeugen. Die Verwendung solcher Restriktionsendonuklease-Schnittstellen in der multifunktionellen DNA-Sequenzkassette ermöglicht die gerichtete Klonierung von DNA-Fragmenten aus dem Genom jedes gewünschten Organismus. Bevorzugt sind die in der multifunktionellen DNA-Sequenzkassette enthaltenen Restriktionsendonuklease-Schnittstellen so ausgewählt, daß es sich dabei um die Schnittstellen für kommerziell erhältliche Restriktionsendonukleasen handelt, deren Verwendung auch unter ökonomischen Gesichtspunkten empfehlenswert ist.

Beispiele für solche Restriktionsendonuklease-Schnittstellen sind die Schnittstellen für die Enzyme SteI, AvrII, SalI, AccI, HindII, SpeI, NheI. Erfindungsgemäß können jedoch Schnittstellen für alle bekannten Restriktionsendonukleasen verwendet werden. In diesem Zusammenhang wird auf die umfassende Aufzählung von bekannten Restriktionsendonukleasen von Kessler, C. und Höltke, H-J. (Gene 47, S. 1ff, 1986) hingewiesen. Die Verwendbarkeit einzelner Restriktionsendonukleasen wird allenfalls dadurch eingeschränkt, daß für eben diese Restriktionsendonuklease in dem erfindungsgemäßen Plasmid bereits weitere Schnittstellen vorhanden sind. Der Fachmann wird in diesem Fall entscheiden, ob er entweder auf ein alternatives Enzym ausweicht oder das Plasmid durch stellenspezifische Mutagenese so verändert, daß es die entsprechende Restriktionsendonuklease-Schnittstelle nicht mehr aufweist oder partiell geschnittene DNA zur Ligation einsetzt.

In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die multifunktionelle DNA-Sequenzkassette Translationsstart- und Translationsstopcodons zur Verfügung. Sinnvollerweise sind diese Codons so angeordnet, daß sie eine Reihe von gebräuchlichen Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen flankieren. Das bedeutet beispielsweise, daß im 5′-Bereich der Restriktionsendonuklease-Schnittstellen die Sequenz ATG so eingefügt, daß eine Klonierung in die darauf folgenden Schnittstellen in mehreren verschiedenen Rastern möglich ist. Dem den Restriktionsendonuklease-Schnittstellen enthaltenden Bereich folgend sollten mehrere Translationsstopcodons angeordnet sein, und zwar ebenfalls so, daß sie eine in allen denkbaren Rastern mögliche Translation terminieren. Bevorzugt ist es dabei, daß verschiedene Stopcodonen aufeinanderfolgen, um die Translationstermination 100%ig sicherzustellen.

Erfindungsgemäß wird von der multifunktionellen DNA-Sequenzkassette bereits ein Promotor (pr1) zur Verfügung gestellt. Darüberhinaus besteht die Möglichkeit, in eine der Klonierungsstellen der multifunktionellen DNA-Seqenzkassette, bevorzugt eine im 5′-Bereich der Sequenzkassette angeordnete Restriktionsendonuklease-Schnittstelle, einen weiteren Promotor (pr2) einzusetzen. Dabei bietet es sich an, Promotoren zu verwenden, die beispielsweise induzierbar sind oder sonst einen Vorteil gegenüber den bereits vorhandenen Promotor (pr1) aufweisen.

Darüberhinaus kann die multifunktionelle DNA-Sequenzkassette so konstruiert werden, daß sie aktivierende DNA-Sequenzen im 5′- oder 3′-Bereich der mcs (multiple cloning site) enthalten. Solche aktivierenden Sequenzen sind bisher vor allem aus Viren bekannt, z. B. aus SV40, aus Polyomavirus, Papovavirus und anderen. Dabei handelt es sich um Sequenzen, die in der Lage sind, beispielsweise die Funktion der 72-Basenpaare langen Repitition aus SV40 DNA zu ersetzen. Bisher identifizierte DNA-Sequenzen mit Aktivatorfunktion sind zwischen nur wenigen Basenpaaren und 72 Basenpaaren lang.

In Abhängigkeit von der Natur eines zu exprimierenden klonierten Genes und den damit verbundenen Umständen, beispielsweise Expressionsrate, Zelltoxizität und ähnlichem, ist es angebracht, die Proteine mit hydrophoben Membranankern oder Signalpeptiden zu versehen. Dementsprechend können in die multifunktionelle DNA-Sequenzkassette DNA-Sequenzen eingebaut werden, die entweder für den hydrophoben Membrananker oder für ein gewünschtes Signalpeptid, das meistens aus einem hydrophilen N-terminalen Bereich und einem darauf folgenden hydrophoben Anteil besteht, eingesetzt werden. Dem Fachmann sind dafür aus der Literatur eine Vielzahl möglicher verwendbarer Signalpeptide bekannt.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die multifunktionelle DNA-Sequenzkassette an ihrem 5′- und/oder 3′-Ende Sequenzen, die komplementär zu bekannten Oligonucleotidprimern sind. Dabei kann es sich beispielsweise um allgemein übliche Oligonucleotide für die Sequenzierung handeln.

In einer bevorzugten Ausführungsform entsprechen die am 5′- und/oder 3′-Ende angeordneten Sequenzen mit Komplementarität zu bekannten Primern solchen Sequenzen, die beispielsweise von der SP6-Polymerase oder der T7-Polymerase erkannt werden. Bekannte Primer, die beispielsweise an den SP6- oder T7-Promotor-Bereich binden, sind 5′-CACATACGATTTAGG-3′ (15-mer) beziehungsweise 5′-ATCGAAATTAATACG-3′ (15-mer). Die Bereitstellung von zu solchen Oligonucleotiden komplementären Sequenzen bietet den Vorteil, daß mit Doppelstrangsequenzierungsmethoden in an sich bekannter Weise die Sequenzen des insertierten DNA-Fragmentes inklusive des Fremdgen-Fragmentes jederzeit überprüft werden können.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Plasmid die folgende multifunktionelle DNA-Sequenzkassette:

5′-GCACATACGATTTAGGCCTAGGATGTCGACTAGTTAGCTAGCGTATTAATTTCGATC-3′

Die Funktion der Nucleotide ist in Fig. 1 näher erläutert.

Die Konstruktion des erfindungsgemäßen Plasmides erfolgt bevorzugt in üblicherweise verwendeten Mikroorganismen, z. B. in prokaryontischen Organismen, bevorzugt in Gram-negativen Bakterien. Aus diesem Grund enthält das erfindungsgemäße Plasmid neben seinen für die Rekombination im Cytoplasma einer eukaryontischen Zelle notwendigen Funktionen Sequenzbereiche, die für die Replikation und Amplifikation in jeweils gewünschten Prokaryonten notwendig sind, beispielsweise einen Replikationsursprung. Üblicherweise wird als ori1 ein die Replikation eines Plasmides im Prokaryonten ermöglichendes Replikon verwendet. Für die Konstruktion des rekombinanten Plasmides ist es dabei bevorzugt, daß Transformation und Amplifikation des rekombinanten Plasmides in Gram-negativen Bakterien, z. B. in Escherichia coli, durchgeführt werden. Ein besonders bevorzugtes Replikon ist daher das Col E 1 Replikon aus Escherichia coli.

Die verschiedenen, zur Konstruktion bzw. Amplifikation des rekombinanten Plasmides notwendigen Schritte können jedoch gleichfalls in Eukaryonten durchgeführt werden. In diesem Falle wäre als bevorzugter Organismus Hefe zu nennen; Hefen sind vergleichsweise einfach zu handhabende, gut charakterisierte eukaryontische Organismen. Ein bevorzugt zu verwendendes Replikon wäre in diesem Falle z. B. das Replikon des 2µ-Plasmides aus Saccharomyces.

Die zur Konstruktion des erfindungsgemäßen Plasmides notwendigen Schritte, beispielsweise die Selektion transformierter Bakterien, wird durch die Verwendung eines geeigneten Selektionsmarkers erleichtert. Ein bevorzugter Selektionsmarker bei der Transformation von Prokaryonten ist z. B. die Inaktivierung von Antibiotika. Dem Fachmann sind dabei eine Vielzahl von Resistenzgenen für die Expression Antibiotika-inaktivierender Proteine in Gram-negativen und Gram-positiven Organismen bekannt.

Wird die Konstruktion des rekombinanten Plasmides dagegen in den Eukaryonten, beispielsweise Hefe, durchgeführt, so können als gebräuchliche Selektionsmarker Gene aus dem Aminosäure- oder Nukleinsäure-Metabolismus der Hefe verwendet werden. Bei Verwendung entsprechender Hefemutanten kann dabei auf solche transformierten Hefen selektioniert werden, die zur Expression des im transformierten Stamm defekten Stoffwechselgenes fähig sind. Ebenso können isolierte Hefegene zur Komplementation von Aminosäurestoffwechselmutanten in mehreren eukaryontischen Organismen, z. B. niederen Algen, Physarum oder Dictyostelium, dienen.

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird als Promotor pr1 ein besonders starker Promotor verwendet, um die Expression des gewünschten Fremdgenes zu verstärken. Dabei ist es notwendig, einen Promotor zu verwenden, der im Poxsystem von der Pox-RNA-Polymerase erkannt wird. Wie bereits erwähnt, findet die Transkription von Poxgenen im Cytoplasma der eukaryontischen Zelle statt und erfolgt ausschließlich durch poxeigene RNA-Polymerasen.

Ein besonders bevorzugter Promotor ist dabei der Vaccinia-Promotor p7,5, der im Wildtyp-Vacciniavirus für ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 7,5 kD zuständig ist. Dieser Promotor weist die Besonderheit auf, daß die Expression des durch ihn gesteuerten Genes zu fast jeder Zeit des Vaccinia-Replikationszykluses stattfindet. Der Promotor p7,5 ist der einzige charakterisierte Promotor, von dem z. Z. bekannt ist, daß er eine gleichmäßige Expression über den gesamten Vaccinia-Lebenszyklus ermöglicht.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen wird der Promotor p7,5 durch chemisch synthetisierte Promotoren oder durch durch Mutagenese veränderte Promotoren ersetzt, die ebenfalls von der poxeigenen RNA-Polymerase erkannt werden können. In dem Fachmann bekannter Weise läßt sich z. B. der Promotor p7,5 durch Austausch einzelner Basen verändern, die Wirksamkeit des veränderten Promotors in vivo testen und gegebenenfalls ein derart veränderter Promotor in das erfindungsgemäße Plasmid einbauen.

Durch die Rekombination des erfindungsgemäßen Plasmides mit dem Wildtyp-Poxvirus darf die Integrität des Virusgenomes nicht zerstört werden, d. h., durch die aus der Rekombination folgende Integration von Fremd-DNA darf kein essentielles Virusgen gestört werden. Es ist bereits etabliert, als die der Rekombination dienende Sequenz einen DNA-Bereich aus dem Thymidinkinasegen des Vacciniavirus zu verwenden. Das Thymidinkinasegen ist ein im Wildtyp-Virus vorhandenes, jedoch in normalen eukaryontischen Wirtszellen nicht unbedingt notwendiges Gen, das bereits isoliert ist. Werden zwei Fragmente dieses Gen flankierend zu einem für die Insertion in das Pox-Virus vorgesehenen DNA-Fragment angeordnet, so findet man nach der Rekombination dieses DNA-Fragment an den entsprechenden Stellen des Virusthymidinkinasegenes.

Die Verwendung des Thymidinkinasegenes hat dabei den besonderen Vorteil, daß bei gleichzeitiger Verwendung von TKWirtszellen nach der Transformation mit dem erfindungsgemäßen Plasmid eine Bromdesoxyuridinselektion durchgeführt werden kann. Somit können auf einfache Weise solche Zellen identifiziert werden, bei denen durch Rekombination des intrazellulär vorliegenden intakten Vacciniavirus mit dem erfindungsgemäßen Plasmid die Funktionsfähigkeit des Thymidinkinasegenes des Wildtyps-Virus zerstört worden ist.

Darüber hinaus ist es auch möglich, anstelle nicht essentieller Bereiche des Poxvirusgenomes aus dem Thymidinkinasegen DNA-Sequenzen aus anderen, nicht essentiellen Bereichen zu verwenden. Die Voraussetzung für die Verwendung eines bestimmten DNA-Bereiches ist lediglich, daß die Zerstörung der entsprechenden viralen Kopie die Lebensfähigkeit des rekombinanten Virus nicht beeinträchtigen darf.

Das erfindungsgemäße Plasmid enthält bevorzugt einen zweiten Selektionsmarker (sm2), der der Identifizierung transformierter Zellen dient. In einer bevorzugten Ausführungsform wird als zweiter Selektionsmarker das lacZ-Gen verwendet. Die Expression des Genproduktes des lacZ-Gens, der β-Galactosidase, läßt sich mit Hilfe des chromogenen Substrates 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal) leicht nachweisen, so daß in einer Zellkultur mit dem erfindungsgemäßen Plasmid transformierte Zellen relativ leicht identifiziert werden können.

Die Expression des zweiten Selektionsmarkers muß ebenfalls unter der Kontrolle eines Pox-Viruspromotors stehen. Selbstverständlich kann jeder andere, im Poxvirus-System funktionierende Promotor ebenfalls verwendet werden.

Ein für diese Zwecke bevorzugt verwendeter Promotor ist der "späte" Promotor p11, der im Wildtyp-Vacciniavirus für ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 11 kD codiert. p11 ist ebenfalls ein starker Promotor, der die Expression einer ausreichenden Menge β-Galactosidase bewirkt, um das Enzym mit dem genannten chromogenen Substrat nachweisen zu können.

Eine Alternative zur Verwendung des lacZ-Genes als sm2 ist die Verwendung eines dominanten Selektionsmarkers. Ein Beispiel für einen solchen dominanten Selektionsmarker ist beispielsweise das gpt-Gen, das für die Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase codiert. Dieses Enzym ist ein der Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase aus Säugerzellen analoges Genprodukt aus E. coli. Wie das Säugerzellenenzym katalysiert es die Kondensation von Phosphoribosyl-Pyrophosphat mit Hypoxanthin oder Guanin zu Inosin bzw. Guanylsäure (IMP bzw. GMP). Darüber hinaus hat das bakterielle Enzym jedoch auch die Eigenschaft, Xanthin in XMP umwandeln zu können, eine Reaktion, die das Enzym aus Säugerzellen nicht oder nur schlecht durchzuführen vermag. Ein rekombinantes Virus, das das gpt-Gen trägt, kann daher in Anwesenheit von Mycophenolsäure mit diesem Virus infizierte Säugerzellen durch Bereitstellen von XMP zur Synthese von GMP und damit dGTP und DNA befähigen, während in nicht infizierten Zellen die Synthese von XMP durch die Mycophenolsäure inhibiert ist, die Verwertung des angebotenen Xanthins aufgrund der unterschiedlichen Spezifität des analogen Säugerzellenenzyms jedoch nicht möglich ist.

Eine Alternative für die Expression des gpt-Genes als Selektionsmarker wäre die Verwendung des Genes für die Hygromycin-B-Phospho-Transferase. Hygromycin-B ist ein von Streptomyceten synthetisiertes Antibiotikum, das die Proteinsynthese sowohl im Prokaryonten als auch im Eukaryonten inhibiert, indem es die ribosomale Translokation hemmt und so die Aminoacyl-t-RNA-Erkennung eingreift. Dieses Antibiotikum kann durch eine aus E. coli isolierte Phosphortransferase inaktiviert werden.

Das erfindungsgemäß zur Verfügung gestellte Plasmid kann zur Klonierung vollständiger Gene verwendet werden. Die damit eventuell auftrtende Redundanz von Promotoren ist insofern unbedeutend, als im Cytoplasma einer mit Poxvirus infizierten Zelle, soweit bisher bekannt, nur der poxeigene Promotor erkannt werden wird.

Bevorzugt dient das erfindungsgemäße Plasmid jedoch der Klonierung von Sequenzen, die keine endogenen Transkriptions- bzw. Translations-Startsignale mehr enthalten. Dies trifft z. B. zu für die gezielte Klonierung ausschließlich funktioneller Bereiche eines Proteins und/oder der Klonierung von antigenen Determinanten. Die Klonierung solcher Fragmente gewinnt steigende Bedeutung vor allen Dingen im Zusammenhang mit der Produktion von Impfstoffen. Darüber hinaus kann in bestimmten Fällen die Replikationsfunktion des durch Rekombination mit dem erfindungsgemäßen Plasmid erzeugten Virus durch die Insertion eines kompletten Genes vermindert werden oder die Zelle vorzeitig zu stark beschädigt werden. In vielen Fällen sind überdies nur Teile der Proteine für bestimmte Aufgaben vonnöten.

Die in das erfindungsgemäße Plasmid insertierte DNA kann sowohl natürlichen als auch synthetischen Ursprungs sein. Bei DNA natürlichen Ursprungs wird es sich vorzugsweise entweder direkt um genomische, beispielsweise aus dem Genom von Prokaryonten isolierte DNA handeln, oder um cDNA komplexerer, eukaryontischer Gene. Eine Besonderheit des Poxvirussystemes ist es, daß bisher kein Spleißen von mRNA nachgewiesen werden konnte. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, daß sämtliche virusabhängigen Abläufe im Cytoplasma der infizierten Zelle stattfinden, während sich der zelluläre Spleißapparat im Zellkern befindet. Es ist daher bei der Konstruktion der Plasmide, die zur Rekombination mit Vacciniavirus verwendet werden sollen, darauf zu achten, daß bei der Verwendung von eukaryontischen Genen intronfreie DNA verwendet wird.

Synthetische DNA wird in aller Regel zuvor aus synthetisch hergestellten Oligonucleotiden zusammengesetzt werden und anschließend in das erfindungsgemäße Plasmid übertragen werden. Die Verwendung synthetischer DNA hat dabei den Vorteil, daß sie bereits bei der Herstellung den späteren Anforderungen entsprechend modifiziert werden kann und daß die später für die Klonierung verwendeten Restriktions-Schnittstellen terminal eingebaut werden können. Darüber hinaus ist eine Verbindung von synthetischer und natürlicher DNA dadurch möglich, daß in die bereits bestehende mcs eine weitere Kassette eingesetzt wird, die die für das spezielle Klonierungsproblem erforderlichen Restriktionsendonuklease-Schnittstellen enthält.

Bevorzugte zu klonierende Proteine sind Proteine oder deren Derivate aus Krankheitserregern, die z. B. für Immunisierungszwecke verwendet werden können. Beispiele dafür sind Pertussis, Tetanus, Malaria, Aids, Frühsommer-Memingo-Encephalitis, Hepatitis B und Herpesinfektionen. Diese Aufzählung ist selbstverständlich nicht ausschließlich. In den meisten Fällen wird es sich bei den zur Immunisierung zu verwendeten Proteinen um neutralisierende Antikörper induzierende oder cytoxische T-Zellen bzw. Helfer-T-Zellen induzierende Proteine der entsprechenden Krankheitserreger handeln. Das bedeutet meistens, aber nicht immer, daß es sich dabei um Oberflächenproteine handelt. Beispiele dafür bieten Influenza-, Herpes- und Flaviviren.

Ein weiteres Gebiet für die Verwendung des erfindungsgemäßen Plasmides zur Herstellung rekombinanter Poxviren ist die Herstellung von Proteinen mit den biologischen Funktionen mindestens eines der folgenden Proteine: einer der Gerinnungsfaktoren II, VIII, IX, XII, XIII, von Willebrandfaktor, Protein C und S, Antithrombin III, Plasminogen, Hirudin, NGF, FGF, TNF, B-zellstimulierende Faktoren, Proteine aus der Interleukingruppe, Apolipoproteine, Glycoproteine oder nicht strukturelle Proteine aus Viren. Ein wesentlicher Vorteil der Gewinnung dieser Proteine aus dem Poxvirus-Expressionssystem ist die Tatsache, daß z. B. die Blutgerinnungsfaktoren, die herkömmlich aus Blutseren gewonnen werden, nicht mit anderen Viren, beispielsweise Aids-Viren, verunreinigt sein werden. Darüber hinaus ermöglicht die Gewinnung dieser Faktoren aus Zellkultur eine Anreicherung in großem Maßstab. Die Herstellung des rekombinanten Poxvirus unter Verwendung des erfindungsgemäßen Plasmides geschieht in vivo durch Rekombination der flankierenden Poxvirussequenzen, also bevorzugt der Thymidinkinasegensequenzen, des Plasmides mit dem Poxvirus. Durch die Rekombination wird das ursprünglich intakte virale Gen zerstört und somit inaktiviert.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Plasmid um pSC11-Orth. pSC11-Orth ist ein Derivat des bekannten Plasmids pSC11; das Schema seiner Konstruktion ist in Fig. 2 gezeigt. pSC11-Orth wurde am 09. 01. 1990 bei der DSM in Braunschweig hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer DSM 5734.

Die Herstellung rekombinanter Poxviren erfolgt, indem eine geeignete Zell-Linie, möglichst eine TKZell-Linie, die mit einem funktionsfähigen Poxvirus, beispielsweise einem an Laborbedürfnisse adaptierten Vacciniavirus, besonder bevorzugt einem Impfstamm, infiziert ist, mit dem erfindungsgemäßen Plasmid transformiert wird. Bevorzugte Viren sind attenuierte Viren, beispielsweise solche Stämme, deren hr-(human host range-)Gen oder VGF-(Vaccinia growth factor-)Gen durch vollständige oder partielle Deletion oder Mutation inaktiv ist. Beispiele solcher Viren sind beschrieben in Alterburger et al., Arch. Virol. 105, S. 15-27, 1989, und C. Kaplan, Arch. Virol. 106, S. 127-139, 1989.

Für die Transformation werden bekannte, dem Fachmann vertraute Verfahren eingesetzt, beispielsweise Calciumphosphatfällung, Liposomenfusion, Elektroporation. Ein in die zu transformierende Zelle gelangtes erfindungsgemäßes Plasmid wird in vivo ohne weiteres Zutun des Experimentators mit dem bereits vorliegenden Virusgenom rekombinieren. Wie bereits oben erwähnt, kann die erfolgreiche Transformation durch Zusatz von X-Gal getestet werden, sofern sm2 das Gen für die β-Galactosidase ist. Darüber hinaus muß die erfolgreiche Rekombination durch eine Bromdesoxyuridinselektion verifiziert werden. In den TKZellen überleben nur rekombinante TKViren, da diese das angebotene Bromdesoxyuridin nicht in ihre DNA einbauen können.

Durch die Rekombination entstehen rekombinante Poxviren, die in Abhängigkeit von der Beschaffenheit des erfindungsgemäß verwendeten Plasmids neben den natürlichen Poxbestandteilen ein unter der Kontrolle eines zusätzlichen Promotor stehendes Fremdgen oder Teile davon enthalten. In Abhängigkeit von der Natur des Promotors wird dieses Fremdgen entweder während der früher oder später Transkriptionsphase des Virus oder über die gesamte Transkriptionszeit transkribiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den oben erwähnten Poxviren um Vacciniaviren. Das Vacciniavirussystem ist bereits sehr gut charakterisiert und bietet in Anbetracht der Fülle verfügbaren Wissens große Vorteile.

Die erfindungsgemäßen Poxviren können, wie bereits erwähnt, zur Expression Poxvirus-fremder DNA-Sequenzen verwendet werden. Das Poxvirussystem bietet nicht nur den Vorteil einer effizienten Expression, sondern darüber hinaus im Gegensatz zur Expression in Prokaryonten den Vorteil, daß die entstehenden Produkte korrekt modifiziert werden.

Die entstehenden Transkripte werden im Cytoplasma der infizierten Zelle translatiert und anschließend posttranslational modifiziert, d. h., z. B. glycosyliert, carboxyliert oder acetyliert. Das erfindungsgemäße System kann daher zur Expression von poxvirusfremden eukaryontischen DNA-Sequenzen verwendet werden und führt zu authentisch modifizierten Proteinen.

Mit diesem System bevorzugt herstellbare Proteine sind z. B., wie bereits oben erwähnt, funktionelle Proteine aus Krankheitserregern. Die rekombinanten Poxviren codieren in Abhängigkeit von dem zur Rekombination eingesetzten Plasmid für Proteine oder deren Derivaten aus Krankheitserregern, oder aber auch für Teile solcher Proteine.

Wichtige Krankheitserreger, deren Proteine auf diese Art und Weise hergestellt werden können, sind z. B. Pertussis, Tetanus, Malaria, Aids, Frühsommer-Meningo-Encephalitis, Hepatitis B und Herpes.

Weiterhin können mit diesem System die Blutgerinnungsfaktoren II, VIII, IX, XII, XIII von Willebrandfaktor, Protein C und S, Antithrombin III, Plasminogen, Hirudin, NGF, FGF, TNF, B-zellstimulierende Faktoren, Proteine aus der Interleukingruppe, Apolipoproteine oder virale Glycoproteine oder nicht strukturelle Proteine, beispielsweise des FSME-Virus, hergestellt werden. Die erfindungsgemäßen rekombinanten Vacciniaviren können in Zellkulturen gehalten werden. Für eine dauerhafte Aufbewahrung empfiehlt es sich, mit den erfindungsgemäßen Viren infizierte Zellkulturen einzufrieren bzw. zu lyophilisieren.

Eine bevorzugte zu verwendende Zellkultur besteht dabei aus TKZellen oder Vero-Zellen zur Bereitstellung größerer Virusmengen, beispielsweise Zellen der Linie TK¯143 (CNCM; I-732).

In den erfindungsgemäßen Zellkulturen wird in Abhängigkeit von dem verwendeten Promotor kontinuierlich oder nur zu bestimmten Zeiten des Viruszyklus das durch die Fremd-DNA codierte Peptid oder Polypeptid synthetisiert. Die so hergestellten Peptide oder Polypeptide können aus den Zellen in einer dem Fachmann bekannten Weise isoliert und nach üblichen Verfahren der Proteinchemie gereinigt werden. Ein besonderer Vorteil des Systemes ist es, daß bei Verwendung des Promotors p7,5 die exprimierten Proteine, sofern sie Ankersequenzen o. ä. besitzen, in die äußere Membran eingebaut werden, und so selbst schon als Antigene erkannt werden können.

Die erfindungsgemäßen Peptide oder Polypeptide eignen sich für die Herstellung einer Zusammensetzung, die wahlweise nur eine der produzierten Proteinspezies, aber auch mehrere enthalten kann, um so z. B. einen polyvalenten Impfstoff herzustellen. Die Zusammensetzung kann neben den Peptiden oder Polypeptiden physiologisch verträgliche Zusatzstoffe enthalten, deren Natur sich nach der geplanten Verwendung der Zusammensetzung richten wird. Mögliche Zusätze sind z. B. Adjuvanzien, Stabilisatoren, Puffer oder osmotisch wirksame Substanzen.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können dann zur Herstellung eines Impfstoffes verwendet werden. In Abhängigkeit von der Natur des in den Zellen hergestellten Peptides oder Polypeptides kann dieser Impfstoff sowohl für die Applikation an Menschen als auch bei Tieren, z. B. bei Haus- und Nutztieren bestimmt sein.

Weiterhin kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung als diagnostisches Mittel verwendet werden. In diesem Fall wäre z. B. ein Nachweis von Antikörpern gegen bestimmte Proteine eines krankheitserregenden Virus in infizierten Individuen durch eine Antigen-Antikörperreaktion zwischen dem erfindungsgemäß hergestellten Peptid oder Polypeptid und dem Serum des menschlichen oder tierischen Patienten möglich.

Die Figuren und Beispiele erläutern die Erfindung:

Figurenbeschreibung

Fig. 1A zeigt das 57 bp-Insert, das erfindungsgemäß in den Vektor pSC11 eingefügt wird. Auf der Zeichnung sind verschiedene, für die Herstellung von rekombinanten Plasmiden verwendbare Restriktionsendonuklease-Schnittstellen angegeben, außerdem die Sequenzbereiche, die mit einem SP6-Primer oder T7-Primer hybridisieren; weiterhin sind das in dem 57 bp-Insert enthaltene Translationsstartkodon und Stop-Kodonen in verschiedenen Rastern kenntlich gemacht.

Fig. 1B zeigt ein Sequenzgel, auf dem die Sequenz des Inserts einmal unter Verwendung des SP6-Primers (linke Probe), zum anderen unter Verwendung des T7-Primers überprüft worden ist. Das Sequenzgel zeigt deutlich, daß das erfindungsgemäße Plasmid pSC11-Orth die angestrebte 57 Basenpaar-Sequenz enthält.

Fig. 2 zeigt das Konstruktionsschema, das der Konstruktion und Identifizierung des erfindungsgemäßen Plasmides pSC11-Orth zugrundegelegt worden ist.

Fig. 3 illustriert die in Beispiel 2 beschriebene Insertion einer DNA-Sequenz, die für einen Teil des Oberflächenantigenes von HIV-1 kodiert. Die HIV-1-Sequenzen sind durch Kursivschrift von den jeweiligen Vektorsequenzen abgehoben.

Fig. 4 illustriert das Beispiel 3, in dem die Insertion einer DNA-Sequenz, die für einen Teil des Oberflächenantigenes Glykoprotein E des FSME-Virus codiert, beschreibt. Bei der Konstruktion eines von pSC11-Orth abgeleiteten Vektors, der Oberflächenantigen exprimiert, mußte in diesem Fall zum Erhalt des Translationsrasters ein synthetischer Adaptor eingesetzt werden. Dieser Adaptor ist durch Fettdruck von den Sequenzen des erfindungsgemäßen Plasmides abgehoben. Die aus dem FSME-Virus stammenden Sequenzen sind in Kursivschrift dargestellt.

Beispiel 1 Konstruktion des Plasmides pSC11-Orth

Bei der Konstruktion des pSC11-Derivates pSC11-Orth wurde in das Parentalplasmid pSC11 (DSM 4381; Chakrabarti et al., Mol. and Cell. Biol. 5, S. 3403-3409, 1985) eine doppelsträngige Sequenz von 57 Basenpaaren eingefügt, die mehrere funktionelle Sequenzen enthält. Die Vorgehensweise ist in Fig. 2 dargestellt.

Alle Schritte werden nach dem Fachmann geläufigen Verfahren durchgeführt, die beispeilsweise in T. Maniatis et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor 1982, beschrieben sind.

Beispiel 2 Insertion einer DNA-Sequenz, die für einen Teil des Oberflächenantigens gp160 des HIV-1 kodiert

Die DNA des pSC11-Orth-Plasmids wurde mit der Restriktionsendonuklease SalI linearisiert. Zur Aufnahme eines PvuII/BgLII Fragmentes (Hahn et al., Nature 312, S. 166-169, 1984) aus dem Plasmid pBH10 (Ratner et al., Aids Res. and Human Retroviruses 3, S. 57-65, 1987), das für einen Teil des Oberflächenantigens gp160 kodiert, wurden die nach Linearisierung mit der Restriktionsendonuklease entstandenen überhängenden 5′-Enden im pSC11-Orth mit S1-Nuklease abgebaut. Nach dieser Behandlung wurde die DNA zu Ligationen mit dem HIV-spezifischen PvuII/BglII Fragment (536 bp) eingesetzt. Dazu wurde am PvuII/BglII Fragment das BglII-Ende entweder mit S1-Nuklease abgebaut oder mit Klenow-DNA-Polymerase aufgefüllt, um ein stumpfes, klonierbares 3′-Ende zu erhalten (die 5′-terminale PvuII-Schnittstelle ist bereits stumpf). In jedem Falle stammt das ATG vom pSC11-Orth. Bei Verwendung der Klenow-Polymerase zum Auffüllen erhält man zusätzlich Aminosäuren am 3′-Ende. Die Stop-Kodonen entstammen wiederum dem pSC11-Orth; nach Auffüllen der BglII-Schnittstelle wird die Translation bei Stop 1 (s. Fig. 1) beendet, nach Abbau überstehender Einzelstrangsequenzen mit S1-Nuklease bei Stop 3.

Die richtige Orientierung des HIV-Inserts wurde durch Analyse mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen bestätigt.

Beispiel 3 Insertion einer DNA-Sequenz, die für einen Teil des Oberflächenantigens Glykoprotein E des FSME-Virus kodiert

Die DNA des pSC11-Orth-Plasmids wurde mit der Restriktionsendonuklease SalI linearisiert und dephosphoryliert. Aus dem cDNA-Klon pA5 (DSM 4382; Mandl et al., Virology 166, S. 197-205, 1988) des FSME-Virus wurde mit der Restriktionsendonuklease PvuII der für einen Teil des Glykoproteins E kodierende Sequenzbereich herausgeschnitten und das entstandene Fragment aus dem Agarose-Gel isoliert. Die Öffnung des Plasmids an der SalI-Schnittstelle und die Verknüpfung mit dem PvuII-Fragment hätte zu keiner translatierbaren Nucleotidsequenz geführt, so daß in diesem Falle ein SalI/SmaI-Adaptor eingesetzt werden mußte. Der 10 Nucleotide zählende Adaptor wurde zuerst über stumpfe Enden mit dem PvuII-Fragment ligiert. Daraufhin konnte in einem zweiten Schritt mit den überstehenden SalI-Enden des Adaptors und des mit SalI linearisierten pSC11-Orth-Vektor das gewünschte Konstrukt gebildet werden. Dabei entstand eine translatierbare Nucleotidsequenz, die allerdings am 5′-Ende und am 3′-Ende der FSME-Sequenz vier bzw. fünf zusätzliche Aminosäuren aufweist. Um die Orientierung des FSME-Fragments in bezug auf den Vektor zu bestätigen, wurde die DNA mit weiteren Restriktionsendonukleasen analysiert. In diesem Konstrukt wird die Translation bei Stop 2 abgebrochen.

Claims (50)

1. Rekombinantes Plasmid, enthaltend mindestens ein Replikon (ori1), mindestens einen Selektionsmarker (sm1), mindestens einen Promotor (pr1) und diesen Promotor flankierende DNA-Sequenzen aus einem Poxvirusgenom, dadurch gekennzeichnet, daß dem Promotor (pr1) folgend eine multifunktionelle DNA-Sequenzkassette angeordnet ist.

2. Plasmid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die multifunktionelle DNA-Sequenzkassette eine Aneinanderreihung von Klonierungsstellen ("multiple cloning sites" = mcs) enthält.

3. Plasmid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Klonierungsstellen für eines oder mehrere der folgenden Enzyme vorhanden sind: SteI, AvrII, SalI, AccI, HindII, SpeI, NheI.

4. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die multifunktionelle DNA-Sequenzkassette Translationsstart- und Translationsstopcodons zur Verfügung stellt.

5. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die multifunktionelle DNA-Sequenzkassette einen Promotor (pr2) enthält.

6. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die multifunktionelle DNA-Sequenzkassette aktivierende DNA-Sequenzen enthält.

7. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die multifunktionelle DNA-Sequenzkassette die DNA-Sequenzen für einen hydrophoben Membrananker oder für Signalpeptide enthält.

8. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die multifunktionelle DNA-Sequenzkassette an ihrem 5′- und/oder 3′-Ende Sequenzen enthält, die zu bekannten Oligonucleotidprimern komplementär sind.

9. Plasmid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenzen am 5′- und/oder 3′-Ende SP6-Polymerase- oder T7-Polymeraseprimern komplementär sind.

10. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die multifunktionelle DNA-Sequenzkassette die folgende Sequenz hat: 5′-GCACATACGATTTAGGCCTAGGATGTCGACTAGTTAGCTAGCGTATTAATTTCGATC-3′.

11. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Replikon (ori1) der Replikation des Plasmides in Prokaryonten, bevorzugt Gram-negativen Bakterien, dient.

12. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Replikon (ori1) der Replikation des Plasmides in Eukaryonten, bevorzugt in Hefe, dient.

13. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Selektionsmarker (sm1) zur Selektion in Prokaryonten, bevorzugt Gram-negativen Bakterien, dient.

14. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Selektionsmarker zur Selektion in Eukaryonten, bevorzugt Hefe, dient.

15. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor (pr1) ein starker Pox-Promotor ist.

16. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor (pr1) ein Promotor aus dem Vaccinia-Virus ist.

17. Plasmid nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß als Vaccinia-Promotor der Promotor p7,5 für ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 7,5 kD verwendet wird.

18. Plasmid nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor (pr1) ein durch Mutagenese veränderter Pox-Promotor oder ein synthetischer Promotor ist.

19. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die flankierenden DNA-Sequenzen des Vaccinia-Virus nicht-essentiellen Bereichen des Virusgenomes entsprechen.

20. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die flankierenden DNA-Sequenzen ganz oder teilweise dem Gen für die Thymidinkinase entsprechen.

21. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß es einen zweiten Selektionsmarker (sm2) enthält.

22. Plasmid nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Selektionsmarker (sm2) dem lacZ-Gen entspricht.

23. Plasmid nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Selektionsmarker (sm2) dominant ist.

24. Plasmid nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Selektionsmarker (sm2) das Gen für die Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase ist.

25. Plasmid nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Selektionsmarker (sm2) das Gen für ein das Antibiotikum Hygromycin inaktivierendes Protein ist.

26. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des Selektionsmarkers (sm2) unter der Kontrolle eines Pox-Viruspromotors steht.

27. Plasmid nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß als Vacciniapromotor der Promotor p11 für ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 11 kD verwendet wird.

28. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die gesamte codierende Sequenz eines Genes in die mcs (multiple cloning site) insertiert ist.

29. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß codierende Sequenzen für funktionelle Bereich und/oder antigene Determinanten von Proteinen insertiert sind.

30. Plasmid nach einem der Ansprüche 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, daß die insertierte DNA natürlichen und/oder synthetischen Ursprungs ist.

31. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 28 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die insertierte DNA ganz oder teilweise den codierenden Sequenzen für Proteine oder deren Derivaten aus Krankheitserregern entspricht.

32. Plasmid nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheitserreger die Erreger für Pertussis, Tetanus, Malaria, Aids, Frühsommer-Meningo-Encephalitis, Hepatitis B oder Herpesinfektionen sind.

33. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 28 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß die insertierte Fremd-DNA ganz oder teilweise für ein Protein mit der biologischen Funktion mindestens eines der folgenden Proteine codiert: einer der Gerinnungsfaktoren II, VIII, IX, XII, XIII, von Willebrandfaktor, Protein C und S, Antithrombin III, Plasminogen, Hirudin, NGF, FGF, TNF, B-zellstimulierende Faktoren, Proteine aus der Interleukingruppe, Apolipoproteine oder Glycoproteine aus Viren.

34. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es pSC11-Orth (DSM 5734) ist.

35. Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Pox-Viruses, dadurch gekennzeichnet, daß ein Pox-Virus mit einem Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 34 rekombiniert wird.

36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß das Pox-Virus ein attenuiertes Virus ist, bevorzugt durch Inaktivierung des hr-Genes oder VGF-Genes.

37. Rekombinantes Pox-Virus, dadurch gekennzeichnet, daß es neben seinen natürlichen DNA-Bestandteilen ein unter der Kontrolle eines zusätzlichen Promotors stehendes Fremdgen enthält und durch ein Verfahren nach Anspruch 35 oder 36 herstellbar ist.

38. Rekombinantes Pox-Virus nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Vaccinia-Virus ist.

39. Verwendung des rekombinanten Pox-Virus nach Anspruch 37 oder 38 zur Expression von Pox-Virus-fremden DNA-Sequenzen.

40. Verwendung des rekombinanten Pox-Virus nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß die Pox-Virus-fremden DNA-Sequenzen ganz oder teilweise für Proteine oder deren Derivate aus Krankheitserregern kodieren.

41. Verwendung des rekombinanten Pox-Virus nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheitserreger Pertussis, Tetanus, Malaria, Aids, Frühsommer-Meningo-Encephalitis, Hepatitis B und Herpesinfektionen verursachen können.

42. Verwendung des rekombinanten Pox-Virus nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß die Pox-Virus-fremden DNA-Sequenzen ganz oder teilweise für ein Protein mit der biologischen Funktion mindestens eines der folgenden Proteine codieren: einer der Gerinnungsfaktoren II, VIII, IX, XII, XIII, von Willebrandfaktor, Protein C und S, Antithrombin III, Plasminogen, Hirudin, NGF, FGF, TNF, B-zellstimulierende Faktoren, Proteine aus der Interleukingruppe, Apolipoproteine oder Glycoproteine aus Viren.

43. Zellkultur, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein rekombinantes Pox-Virus nach Anspruch 37 oder 38 enthält.

44. Zellkultur nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine TKZellkultur ist, bevorzugt TK¯143 (CNCM; I-732).

45. Peptid oder Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer Zellkultur nach Anspruch 43 oder 44 hergestellt werden kann.

46. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eines oder mehrere der Peptide und/oder Polypeptide nach Anspruch 45 enthält.

47. Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, daß er eines oder mehrere der Peptide und/oder Polypeptide nach Anspruch 45 enthält.

48. Lebendimpfstoff, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens ein rekombinantes Pox-Virus nach Anspruch 37 oder 38 enthält.

49. Diagnostisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es eines oder mehrere Peptide und/oder Polypeptide nach Anspruch 45 enthält.

50. Verwendung eines Impfstoffes nach Anspruch 47 oder 48 zur Erzeugung von Antikörpern.