CS18991A2 - Recombinant plasmid - Google Patents

Description

Rekombinentní plasmid

Oblast techniky

í L?

O í/> f > ° O ·' Č?ro ~ '

Vynález se týká způsobu přípravy-rekombinantního plasmidu/ •lekční znak-/smi/, alespoň je den promotor /při/ a DNA sekvence·..... z genomu pox viru ohraničující tento promotor, postupu přípra-vy rekombinantního pox viru, použití rekombinantního pox viru,buněčné linie, peptidu nebo polypeptidu, složení, vakciny a vi-rové vakciny, diagnostického činidla a použití vakcin.

Dosavadní stav techniky Díky rozvoji moderních metod genového inženýrství bylomožné identifikovat a isolovat úctyhodné množství genů bílkovin,které mají diagnostický, profylaktický a terapeutický význam,tzn. genů pro koagulační faktory nebo entigenní virové bílkovi-ny. S tím souvisí i potřeba spolehlivých a výkonných expresiv-ních systémů v prokaryotních a eukeryotních buňkách zajištují-cích vyšší produkci žádané bílkoviny buS z infikovaných tkánínebo infikovaných buněčných kultur nebo nepř. využitím imuno-genních vlastností bílkovin "in vivo" pro imunizaci. Eukaryot-n£;./virové vektorové systémy mají v této souvislosti obzvlášt-ní význam.

Jedním ze známých eukeryotních vektorových systémů je pa-pova virus SV40. SV40 má poměrně malý genom s 5,3 kb,,, jehožuspořádání je poměrně dobře známo. Malý genom tohoto viru mána jedné straně výhodu plynoucí z toho, že být manipulován docílené podoby jestliže je použita vhodná endonukleasa. Avšakna druhé straně je nevýhodné, že klonovací kapacita je značněomezena odpovídájícně malým obalem viru a pevným, částečně sepřekrývajícím uspořádáním esenciálních genů. Vývoj eukaryotního vektorového systému, založeného na vi-ru kravských neštovic byl popsán v řadě nejnovějších prací/např.EP-A-0243029 /. Virus kravských neštovic patří meziorthopox viry. Jeho lineární genom tvoří dvouřetězcová DNA,asi 185 kb. Velikost viru kravských neštovic znemožňuje kon-strukci rekombinantního genomu rozštěpením původního genomu restrikční endonukleasou a následující ligací s vhodnou cizoro-dou DNA. A i když by byl tento proces proveditelný, produkce vi-rů ε rekombinoveným genomem by vyžadovala přítomnost pomocnéhoviru, protože virová DNA přenášená "in vitro" sama o sobě neníinfekční. Transkripce viru kravských neštovic vyžaduje mimo ji-né i odpovídající RNA polymerasu, která nemůže být nahrazenaeukaryotní RNA. polymerasou II a musí být přenesena do hostitel-ské buňky spolu s virovými částicemi. Z toho plyne, že viruskravských neštovic má speciální promotory rozpoznatelné RNA po-lymerasou kodovanou virem. To ovšem znamená další potíže přikonstrukci rekombinantú, které mají přepisovat cizorodé genyvčleněné do genomu viru kravských neštovic v eukaryotních buň-kách. Použití virů kravských neštovic jako expresivních vektorůtedy vyžaduje, aby transkripce a replikace mohla být prováděnapřirozenými enzymy viru kravských neštovic, nezávisle na hosti-teli, to znamená na jedné straně, že nemohou být klonovány ese-nciální oblasti viru a na druhé straně, geny umožňující expresimusí být pod kontrolou promotorů viru kravských neštovic. Z tohoto důvodu je obvykle používán proces zahrnující dvakroky. Nejdříve je konstruován plesmid, který obsahuje požado-vané cizorodé geny v kombinaci s promotorem viru kravských neš-tovic, a poté je tento rekombinantní plasmid včleněn "in vivo"do genomu viru kravských neštovic pomocí homologní rekombinecemezi virovou a plasmidovou DNA. Rekombinantní virus kravskýchneštovic např. popsán v EP-A-0243029, byl konstruován dle pos-tupu popsaného výše a je používán pro expresi obalové bílkovinyHIV-1t Plasmid pSC25 užívaný ve zmíněném aplikačním Evropskémpatentu je vektorem, který je neobyčejně vhodný pro expresi oba-lové /env/ bílkoviny.

Avšak oba plasmidy, pSC25 a rodičovský plasmid pSCII, jsouzcela nevhodně pro další vývoj, to jest pro včlenění další cizo-rodé DNA. Na jedné straně pSC25 nemá další vhodné klonovecí mís-to, a na druhé straně prekursor plasmidu pSC11 má označeno pouzejedno Smál místo.

Klonování do Smál místa vyžaduje ve většině případů opraco- vání včleněných restrikčních fragmentů, protože Smál je restrik- ční enzym vytvářející zarovnané konce. Mimoto je nemožné klono- vat genové fragmenty do plasmidu pSC11, který neobsahuje žádné translační signály tzn. startovací nebo terminační kodon, Ačkoliv plasmid pSCI 1 má mnoho výhod pro klonování nekom-pletních genů, genových fragmentů nebo dokonce syntetizovenéDNA, jeho použití vyžaduje rozsáhlé a nepříjemné konstrukčníprocesy.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je příprava dostupného plasmidu, který,pokud je to možné, usnadňuje klonování cizorodé DNA v plasmidua je schopen rekombinace s pox virem.

Tento proces je umožněn rekombinantním plasmidem dle úvod-ního patentového nároku tím, Že multi-funkční kazeta DNA sek-vencí je umístěnana okraji promotoru /prl/.

Rekombinantní plasmid dle vynálezu je charakterizován tím,že multi-funkční kazeta DNA sekvencí je umístěna na okraji zapromotorem. Tento způsob konstrukce je výhodný tím, že mohoubýt včleňovány různé funkční sekvence podle požadavků jakého-koliv, předem stanovéného problému. To je např. možné při pou-žití kazet sekvencí využívajících startovací kodon GUG, kterýje používán méně často ve srovnání s nejčastěji používaným ko-donem AUG. Dají se používat kazety s jedním nebo několika ter-minačními kodony, které mohou být stejné nebo různé a zabraňu-jí .vzniku amber, ochre nebo opal supresorů. Systém vedle tohoumožňuje včlenění polyadenylových signálů a jiných signálníchstruktur současně vedle včleňování žádaného cizorodého genunebo genového fragmentu.

Plasmid dle vynálezu obsahuje s výhodou ve své multi-fun-kční kazetě DNA sekvencí mnohonásobné klonovací místo. Obvyklejsou zde upřednostňovány klonovací místa pro restrikční endo-nukleasy rozpoznávající hexamer, které vytvářejí lepivé konce.Využití těchto míst štěpených restrikčními endonukleasami umož-ňuje cílené klonování DNA fragmentů z genomu každého potřebné-ho organismu. Z míst pro štěpení restrikčními endonukleasami,které jsou umístěny v multi-funkční kazetě DNA sekvencí, jsoupřednostně vybíraná místa vhodná pro komerčně vyráběné restrik-ční endonukleasy, což je doporučováno i z ekonomických důvodů. Příklady takových míst pro štěpení restrikčními endonukle-asami jsou místa štěpení pro enzymy Stel, AvrlI, Sáli, A.ccl,HindlI, Nhel♦ Avšak dle vynálezu mohou být použita místa štěpe- 4 ní všech známých restrikčních endonukleas. V této souvislostije možné odkázat na početný seznam známých restrikčních endo-nukleas /Kessler,C.,Hdltke,H.J.: Gene 47. str.1 a následující,1956/. Použitelnost jednotlivých restrikčních endonukleas jev nejlepšítn případě omezena skutečností, že další štěpící mís-ta pro tyto restrikční endonukleasy jsou již přítomny v plas-midu dle vynálezu. V tomto případě rozhodne zkušený odborník,zda-li použije alternativní enzym nebo změní plasmid místněspecifickou mutagenezí do takového tvaru, že má odpovídajícíštěpící místa pro restrikční endonukleasu nebo použije částeč-ně štěpenou DNA pro ligaci. S výhodou umožňuje multi-funkční kazeta DNA sekvencí pře-pis startovacích a terminačních kodonů. Tyto kodony jsou při-měřeně použity v takové podobě, že mohou ovládat řadu obvyklýchmíst rozpoznávaných restrikčními endonukleasami. To znamenánapř.že sekvence ATG je včleněna do 5*oblasti místa štěpenéhorestrikčními endonukleasami v takové podobě, že je možné klono-vání v následujícím místě štěpení v několika různých sestavách,Při sledování oblasti obsahující místa štěpená restrikčnímiendonukleasami je patrné, že by mělo být použito několik termi-načních kodonů, hlavně v takovém tvaru,kdy končí přepis ve všechmyslitelných podobách. K zajištění 100% ukončení přepisu je vý-hodné, když různé terminační kodony následují jeden za druhým.

Podle vynálezu je promotor /pr1/ upotřebitelný multi-fun-kční 'kazetou DNA sekvencí. Navíc existuje možnost včlenění dal-šího promotoru /pr2/ do jednoho z klonovacích míst, přednostnědo místa štěpení restrikční endonukleasou umístěného v 5*obles-ti kazety sekvencí. To samo o sobě nabízí využití promotorů,které mohou např.být indukovány nebo které mají, v jiném ohledu,výhody ve srovnání s již existujícím promotorem /při/.

Mimo to může být multi-funkční kazeta DNA sekvencí navícsestavena do takového' tvaru, který obsahuje zesilující DNA sek-vence v 5*nebo 3'oblasti násobných klonovacích míst /mCs/. Ta-kové zesilující sekvence jsou především známy u virů, např.SV40,polyoma viru, papova viru a dalších. Jedná se o sekvence, kteréjsouschopné náhrady, např. 72 opakujících se párů baží z SV40.Identifikované sekvence DNA se zesilovací schopností mají dél-ku od několiko málo párů baží do 72 párů baží.

Poněvadž funkce povahy klonovaných genů je exprimována a - 5 - s tím i spojené vlastnosti, např. rychlost exprese, toxicitabuňky a další, je výhodné vzít do úvahy bílkoviny s hydrofob-ními v membráně zakotvenými nebo signálními proteiny. Podletoho DNA sekvence mohou být včleněny do multi-funkční kazetyDNA sekvencí, které mohou být kódem buď pro hydrofobní v mem-bráně zekotvené peptidy nebo pro poradovaný signální peptid,který se skládá převážně z hydrofilních N-terminálních oblastía následujícího hydrofobního podílu. Zkušený odborník zná z li-teratury řadu použitelných signálních peptidů. S výhodou obsahuje multi-funkční kazeta DNA sekvencí sek-vence na svém 5*a/nebo 3'konci, které jsou komplementární keznámým nukleotidovým primerům. Obecně lze říci, Že se to týkánukleotidů obvykle používaných pro klonování. S výhodou sekvence komplementární ke známým primerům,uspo-řádané ne 5 a/nebo 3'konci, odpovídají takovým sekvencím, kteréjsou např. rozpoznatelné SP6 polymerasou nebo T7 polymerasou.Známé primery, které se Vážou např. k SP6 nebo T7 promotorovéoblasti jsou 5- CACATACGATTTAGG -3'/15-mer/ end/or 5- ATCGAAATTAATACG -3 /15-mer/. Příprava vhodných komplementárních sekvencík takovým oliginukleotidúm je výhodné, protože sekvence včleně-ného fragmentu DNA, který obsahuje cizorodý genový fragment,může být kontrolována kdykoliv známou metodou pro sekvenovánídvouřetězcové DNA. S výhodou plesmid- dle vynálezu obsahuje následující multi-funkční kazety DNA sekvencí: 5'- GCACATACGATTTAGGCCTAGGATGTCGACTAGTTAGCTAGCGTATTAATTTCGATC-3*

Funkce nukleotidů je podrobněji vysvětlena na obr.1.

Plasmid sestavený dle vynálezu je s výhodou používán u ob-vyklých mikroorganismů, např. prokaryotních organismů, s výho-dou u gram-negativních bakterií. Z tohoto důvodu plasmid dlevynálezu obsahuje oblasti sekvencí, které jsou nezbytné proreplikaci a amplifikaci všech požadovaných prokaryot, např.počátek replikace v návaznosti na jeho funkci nutnou pro rekom-binaci v cytoplasmě eukaryotních buněk. Replikou zodpovědný zareplikaci plasmidu u prokaryot : možné je používat ori1. Propřípravu rekcmbinantního plasmidu je výhodné, že transformacea emplifikace rekombinantního plasmidu probíhají u grem-negativ-ních bakterií, např. u Escherichia coli. Takže Col F 1 replikou 6 z Escherichia coli je speciálně výhodný replikon.

Avšak různé kroky nutné pro konstrukci nebo amlifikecirekombinantního plasmidu mohou také probíhat u eukaryot. V tom-to případě je vhodným organismem kvasinke. Kvasinky patří mé*-zi dobře známé eukaryotní organismy, se kterými se poměrněsnadno pracuje* V tomto případě se může s výhodou použít např.replikon 2u plasmidu ze Saccharomyces.

Postupy nutné pro konstrukci plasmidu dle vynálezu např.selekce transformovaných bakterií je usnadněna použitím vhodné-ho selekčního znaku. Výhodný selekční znak pro transformaciprokaryotů je např. inaktivace antibiotik. Zkušený odborníkzná pluralitu rezistentních genů pro expresi bílkovin inskti-vujících antibiotika u gram-negativních a gram-positivníchorganismů.

Jestliže je, na druhé straně, prováděna příprava rekombi-nantního plasmidu v eukaryotech, např.v kvasinkách, mohou býtjako selekční znak využity geny metabolismu aminokyselin a nu-kleových kyselin. Použijí-li se vhodné mutanty kvasinek, můžebýt selekce prováděna pomocí transformovaných kvasinek, kteréjsou schopny exprimovat poškozené geny v transformovaném kmeni.Isolované kvasinkové geny mohou rovněž sloužit pro komplementa-ci mutantů metabolismu aminokyselin u několika eukaryotníchorganismů, např. primitivních ras, Physarum nebo Dictyostelium. Výhodou vynálezu je použití promotoru pr1 jako speciálněsilného promotoru, za účelem zvýšení exprese požadovaných cizo-rodých genů. Je nutné používat promotor, který je rozpoznán poxRNA polymerascu v pox systému. Jak již bylo výše podotknuto,přepis pox genů probíhá v cytoplasmě eukaryotních buněk 8 jeprováděna výlučně vlastními pox- RNA polymerasami.

Speciálně výhodným promotorem je promotor viru kravskýchneštovic, promotor p7,5, který je zodpovědný za polypeptid smolekulovou hmotností 7,5 kD produkovaný divokým typem virukravských neštovic. Tento promotor je zvláštní tím, že expre-se genu, kterou kontroluje, je prováděna téměř po celou dobureplikačního cyklu viru kravských neštovic. Promotor p7,5 jejediným charakterizovaným promotorem, o kterém je známo, žemá celistvou expresi během úplného životního cyklu viru kravs-kých neštovic. Dále je promotor p7,5 s výhodou nahrazen chemicky synteti- lou promotoru pox viru. Semozřejmě může být také použit jakýko-liv jiný promotor systému pox viru.

Promotor používaný s výhodou pro tyto účely je pozdnípromotor pil, který kóduje polypeptid s molekulovou hmotností11 kD v divokém typu viru kravských'neštovic. P11 je také sil-ným promotorem, který způsobuje expresi dostatečného množství/4 -galaktosidasy, takže je možné enzym detegovat pomocí výšezmíněného chromogenního substrátu.

Vedle lacZ genu jako sm2 lze alternativně použít dominan-tního selekčního znaku. Příkladem takového dominantního selek-čního znaku je nepř.gpt gen, který kóduje xantin qu8nin fosfo-ribosyl transferasu. Tento enzymje produktem genu z Escherichiacoli, analogicky k hypoxantin quanin fosforibosyl tránsferasez buněk savců. Enzym ze savčích buněk katalyzuje kondenzacifosforibosyl pyrofosfátu s hypoxantinem nebo quaninem ze vzni-ku inosinu nebo quanylové kyseliny /IMP e/nebo GMP/. Avšak bak-teriální enzym má navíc schopnost fosforylovet xantin za vznikuXMP. Tuto reakci enzym ze savčích buněk nemůže provádět buď vů-bec nebo pouze velmi slabě. Rekombinantní virus, který nese gptgen umožňuje tudíž savčím buňkám infikovaným tímto virem synte-tizovat GMP a tudíž i dGTP a DNA za přítomnosti XM? syntetizo-vané v přítomnosti raykofenolové kyseliny, zatímco syntéza XMPv přítomnosti mykofenolové kyseliny je v neifikovaných buňkáchinhibována, utilizace nabízeného xantinu je nemožná vzhledemk různé specifitě analogického enzymu savčích buněk.

Alternativa exprese gpt genu jako selekčního znaku by bylopoužití genu pro hygromycin-S-fosfotransferasu. Hygromycin-Sje antibiotikum syntetizované Streptomyces, které inhibujesyntézu bílkovin u prokaryot/a eukaryot, inhibicí ribosomálnítranslokace a tudíž interferuje s aminoacyl-ť-RNA rozpoznávacíschopností. Působení antibiotika může být inaktivováno fosfo-transferasovou aktivitou isolovanou z Escherichia coli.

Plasmid, který je k dispozici dle vynálezu, může být pou-žíván pro klonování kompletních genů. Nadbytek promotorů, kterýv souvislosti s tím může vyskytnout, je nevýznamný pokud pouzevlastní pox promotor se.bude projevovat v cytoplesmě buněk infi-kovaných pox virem.

Avšak, plasmid podle vynálezu slouží s výhodou pro klono- vání sekvencí, které neobsahují žádný translační a transkrip- - 9 - ční startovací signál. To se aplikuje nap?, při cíleném klono-váníoblastí s výjimečnou funkcí ε/nebo klonování antigenníchčástic. Klonování takovýchto částí má stoupající význam pře-devším ve spojení s přípravou vakcín. Ve speciálních případechrepiikační funkce viru získaného pomocí rekombinace s plasmi-dem dle vynálezu, může být omezena vložením kompletního genunebo buňka může být předčasně poškozena v příliš velkém rozsahu.Mimo to v mnoha případech pouze části bílkovin jsou nezbytnépro specifické účely. DNA včleněná do plasmidu dle vynálezu může být jak přírod-ního tak syntetického původu. DNA přírodního původu bude před-nostně buS přímo DNA genomu, např.Isolovaná z genomu prokaryo-ta nebo cDNA ze složitějších eukaryotických genů. Zvláštnostísystému pox viru je to, že není možné detegovat žádný sestřihmRNA. To lze pravděpodobně připsat na vrub skutečnosti, že vše-chny na viru závislé procesy probíhají v cytoplasmě infikova-ných buněk, zatímco buněčný aparát sestřihu je umístěn v jádru.Takže musí být věnována pozornost konstrukci plasmidů, kteréjsou používány pro rekombinaci s virem kravských neštovic kdyDNA bez intronu je použita v případě použití eukaryotních genů.

Zpravidla syntetická DNA je předem sestavena z oligonu-kleotidů připravených synteticky a následně přenesena do plas-midu dle vynálezu. Použití syntetické DNA má výhodu, že můžebýt modifikována tak, aby vyhověla pozdějším požadavkům běhemprodukce,a že místa pro štěpení restrikčními endonukleasami,později využívaná při klonování, mohou být umístěna na koncích,Mimo to, spojení přírodní a syntetické DNA. je umožněno v důsle-dku toho, že další kazeta je včleněna do již existujícího mcs,které obsahuje štěpící místo pro restrikční endonukleasu nutnépro speciální klonovací problém. Bílkoviny klonované přednostně jsou bílkoviny nebo jejichderiváty z patogenů, které mohou např. být používány pro imuni-zaci. Příkladem jsou černý kašel, tetanus, malarie, AIDS, klíš-tóvá encefalitida, žloutenka B a herpes infekce. Tento výčetnení samozřejmě uzavřený. Ve většině případů bílkoviny používa-né pro imunizaci indukují neutralizující protilátky a/nebo odez-vu na T buňky. To se ve většině případů týká obalových bílkovin. Příklady, které to potvrzují jsou viry chřipky,herpes a flavivirus. 10

Delší možnost využití plasmidu dle vynálezu pro produkcirekombinantních pox virů je produkce bílkovin s biologickýmifunkcemi alespoň jedné z následujících bílkovin : jeden z koa-gulačních faktorů II, VIII, IX, XII, XIII, von Willebrendůvfaktor, bílkovina C a S, antitrombin III, plasminogen, hirudin,NGF, FGF,TNF, B-buňku stimulující faktory, bílkoviny z inter-leukinové skupiny, apolipoproteiny nebo'glykoproteiny nebonestrukturální bílkoviny virů. Prokazatelná výhoda isolace těchto bílkovin z expresního systému pox viru je fakt, že napřikoagulační faktor, který se běžně isoluje z krevního séra, ne-bude kontaminován jinými viry, např. AIDS viry. Isolace těchtofaktorů z buněčné kultury navíc umožňuje využití v provoznímměřítku. Produkce rekombinantníno pox viru za použití plasmidudle vynálezů je proveden "in vivo" za použití rekombinace hra-ničních sekvencí pox viru tj. genových sekvencí thimidin kinasyplasmidu š pox virem. Původní intaktní virální gen je nerušena potom inaktivován rekombinecí. S výhodou se využívá plasmid dle vynálezu, což je pSC11-Orth. pSC 11-Qrth^je odvozen od známého plasmidu pSC11. Způsobpřípravy je znázorněn na obr.2. pSC11-Orth byl uložen s DSMv Braunschweigu 9.ledna 1990 a obdržel depoziční Číslo DSM 5734 Příprava rekombinantních pox virů je uskutečněna infiko-váním vhodné buněčné linie jako je TK~buněčná linie, která jeinfikovaná aktivním pox virem např. virusem kravských neštovicadaptovaným na laboratorní podmínky ve zvláštním vakcínovémkmeni. Preferovanými viry jsou atenuované viry, např. takovékmeny jehož hr /vyskytující se v lidském hostiteli/gen neboVGF /růstový faktor viru kravských neštovic/ gen je inaktivnív důsledku úplné nebo částečné delece nebo mutace. Příkladytakových virů jsou popsány v Altenburger a kol., Arch.Virol.105. str.15 až 27, 1989 a C.Kaplan, Arch.Virol. 106, str. 127až 139, 1989.

Mezi známé procesy, které používají zkušení odbornícipři transformaci patří např. srážení fosforečnanem vápenatým,fúze liposomů, elektroporace» Plasmid dle vynálezu, který bylpřenesen do buňky za účelem transformace, bude rekombinován"in vivo" s již přítomným genomem viru bez dalšího přispěníexperimentátora. Jak již bylo podotknuto výše, úspěšná tran-sformace může být může být testována přidáním X-gal, když sm2 je gen pro (j - gelaktosidasu. Úspěšnost rekombinace musí býtmimo to ověřena bromdesoxyuridinovou selekcí. Pouze rekombi-n8ntní TK” viry přežívají v TK buňkách, protože nemohou včle-nit nabízený bromdesoxyuridin do své DMA.

Rekombinantní pox viry jsou tvořeny rekombinací, kterázahrnuje, vedle přírodních pox částic, cizorodý gen nebo části,které jsou pod kontrolou přidaného promotoru jako funkce povahyplasmidu dle vynálezu. Jako'vyjádření funkce povahy promotoru,tento cizorodý gen je přepisován bučí během časné nebo pozdnífáze přepisu viru nebo po celou dobu přepisu. S výhodou jsou výše uvedená pox viry,viry kravských nešto-.·vic. Systém viru kravských neštovic je již velmi dobře chara-kterizován a nabízí velké výhody s ohledem na množství vhodnýchznalostí. *

Jak již bylo podotknuto, pox viry dle vynálezu mohou býtpoužívány pro expresi DNA sekvencí cizorodých pro pox virus.Systém poxu viru nenabízí pouze výhodu schopnosti exprese, alemimo to výhodu, která v kontrastu s expresí u prokaryotů, za-jištuje, že vznikající produkty jsou správně modifikovány,

Vznikající přepisy jsou překládány v cytoplasmě infikova-ných buněk a následně post-translačně modifikovány tzn. např.glykosylovány, karboxylovány a ecetylovány. Systém dle vynále-zu může být tedy použit pro expresi cizorodých eukaryotníchDNA. sekvencí v pox viru a vede k autenticky modifikovaným bíl-kovinám. Bílkoviny, které mohou být s výhodou produkovány tímto sys-témem jsou např. již výše zmíněné funkční bílkoviny z patogenů.Rekombinantí pox viry kódují jak funkci plasmidu použitého přorekombinacil·bílkovin, tak jejich derivátů nebo také částí ta-kových bílkovin. Důležité patogeny, jejich? bílkoviny mohou být produkoványtímto způsobem jsou např. černý kašel, tetanus, malarie,AIDS,klíštová encefalitida, žloutenka B a herpes.

Koagulační faktory II,VIII, IX, XII, XIII, von Willebran-dův faktor, bílkovina C a S, antitrombin III, plasminogen, hiru-din, NGF, FGF, TNF, B-stimulační faktory buňky, bílkoviny zinterleukinové skupiny, apolipoproteiny nebo glykoproteiny nebonestrukturální bílkoviny např.. FSSSE virus může být produkovántímto způsobem. Rekombinantní viry kravských neštovic dle vyná- lezu mohou být udržovány v buněčných kulturách. Z hlediska tr -venlivosti je vhodné buněčnou kulturu infikovanou viry dle vy-nálezu lyofilizovat nebo zmrazit.

Buněčná kultura s výhodou používaná,se skládá z TK buněknebo Věro buněk pro vytvoření většího množství virů, např. bu-něk linie TK”143 /CNCM ; 1-732 /.

Peptid nebo polypeptid kódovaný cizorodou DNA je synteti-zován v buněčné kultuře dle vynálezu plynule nebo pouze po ur-čitou dobu virového cyklu s ohledem na funkci používaného pro-motoru. Peptidy nebo polypeptidy produkované tímto způsobem mo-hou být isolovány z buněk metodami, které jsou známy zkušenýmodborníkům a čištěny obvyklými metodami používenými v chemiibílkovin. Zvláštní výhodou systému jeto, že bílkoviny exprimo-vené pod kontrolou promotoru p7,5 mohou být včleněny do vnějšímembrány, jestliže mají kotevní sekvence a potom mohou být jižrozpoznány jako antigeny.

Peptidy nebo polypeptidy dle vynálezu jsou vhodné pro pro-dukci skladby, která může obsahovat volně pouze jeden , nebo ta-ké několik z produkovaných bílkovin, aby produkovala např. poly-valentní vakcinu. Skladba může obsahovat fysiologicky tolero-vatelná aditiva, k tomu ještě peptidy nebo polypeptidy, jejichžpodstata bude záviset na zamýšleném použití skladby. Možná edi-tiva jsou např. adjuvans, stabilizátory, pufry, osmoticky aktiv-ní látky.

Skladba dle vynálezu může být potom použita pro přípravu vakcíny. Jako funkce podstaty produkovaného peptidu nebo pó-ly peptidu, produkovaného v buňkách, může být tato vakcina pou-žitau lidí i u zvířat např.domácí zvířata a domácí dobytek.

Skladba dle vynálezu může být navíc použita jako diagno-stické 'činidlo. V tomto případě detekce protilátek proti spe-cifickým bílkovinám patogenního viru v infikovaných jedincíchby např. bylo možné reakcí antigen/protilátka mezi peptidem ne-bo polypeptidem produkovaným dle vynálezu a sérem lidského ne-bo zvířecího pacienta. 12 a

Popis k obrázkům. 0br.1A ukazuje 57 bp-insert, který byl vložen do vektoru pSCMdle vynálezu. V obrázku jsou zdůrazněna různá místa pro štěpe-ní restrikčními endonukleasami, vhodná pro přípravu rekombinen-tních plasmidů, dále oblasti sekvencí, které hybridizují s SP6primerem nebo T7 primerem ; translační startovací kodon obsa-žený v 57 bp-insertu a terminační kodony jsou zvýrazněny růz-nými ·rámečky. 0br.1B ukazuje sekvenci gel, na které byla ověřena sekvenceinsertu, za použití SP6 primeru /vzorek na levé straně/ najedné straně a na druhé straně za použití T7 primeru. Sekven-ce gel ukazuje jasně, že plasmid pSCl1-Orth dle vynálezu obsa-huje sekvenci s 57 páry baží.

Obr. 2 ukazuje schéma konstrukce,na kterém je založena konstru-kce a isolace plesmidu pSC11-Orth.

Obr, 3 dokládá včlenění DNA sekvence popsané v příkladě 2, kte-rá kóduje část povrchového antigenu HIVu-1. HIV-1 jsou konstruovány vektorovými sekvencemi popsanými kurzivou.

Obr.4- dokládá příklad 3, ve kterém je popsána inserce sekvenceDNA, která kóduje část povrchového antigenu glykoproteinu EFSME viru. Při konstrukci vektoru odvozeného z pSC11-Orth, kte-rý exprimuje povrchový antigen, musel býív^tomto případě včle-něn syntetický adaptor, aby nebyl narušen překlad. Tento’adap-tor je odlišen od sekvencí plasmidů dle vynálezu výrazným ty-pem písma. Sekvence mající původ v TBE viru jsou popsány kur-zívou. 13 Příklady provedení vynálezu - .................- Příklad 1

Konstrukce pleamidu pSC11-Orth Při konstrukci plasmidu pSC11-Orth, odvozeného z plasmidupSC11,byla dvouřetězcová sekvence, složená z 57 párů baží, včle-něna do rodičovského plasmidu pSC1í /DSM 4381 ; Chakrabarti akol., Mol.end Cell. Biol. str.3404 a? 3409, 1985/, kterýobsahuje několik funkčních sekvencí. Tento postup je zachycenna obr.2. Všechny kroky prováděné v popsaném postupu jsou známy zku-šeným odborníkům a jsou popsány např. T.Maniatis a kol, "Mole-,cular Cloning", Cold Spring Harbor, 1982. Příklad 2 Včlenění DNA sekvencejkodující část povrchového antigenu gpl60 HIVu-1 . DNA pSC11-Orth plasmidu byla linearizována pomocí restrik-ční endonukleasy Sáli. Vyčnívající 5zkonce v pSC11-Orth, vznik-lé po linearizaci restrikční endonukleesou, byly degradovány S1nukleasou za vzniku PvuII/BglII fragmentu /Hehn a kol., Nátuře312, str.166 až 169, 1984/ z plasmidu pBH10 /Rather a kol.,AidsRes. and Human Retroviruses J, str.57 až 65, 1987/, který kódu-je část povrchového antigenu gpl60. Po tomto kroku byla včleně-na DNA pro ligaci s HlV-specifickým fragmentem Pvu/BglII /536bp/.Pro tento příped BglII konec fragmentu PvuII/BglII byl bud oše-třen S1 nukleasou nebo vyplněn Klenow DNA polymerasou, k získá-ní zarovnaného klonovatelného 3'konce /5 konec PvuII štěpenéhomísta je již zarovnaný/. V každém případě ATG pochází z pSC11-Orth. Jestliže je použita Klenow pólymeras pro vyplnění, amino-kyseliny jsou postupně získávány na 3 konci. Terminační kodonypocházejí naopak z pSC11-Orth; .po vyplnění místa štěpeného BglIIpřepis končí na "stop 1"/viz obr.1/, po natrávení vyčnívajícíchjednořetězcových sekvencí S1 nukleasou končí na ~stop3". 14

Správná poloho HIV insertu byla kontrolována pomocí ana-lýzy různými restrikčními endonukleasemi. Příklad 3 Včlenění DNA sekvence kódující část povrchového antigenu gly-koproteinu E TBE viru DNA pSCIl-Orth plasmidu byla linearizováre restrikčníendonukleasou Sáli a defosforylována. Sekvence oblasti kódu-jící část glykoproteinu E byla vyštěpena z cDNA-klonu pA5 /DSM4382 ; Mandl a kol., Virology 166, str.197 až 205, 1988/ viruTBE restrikční endonukleasou PvuII a vzniklý fragment byl iso-lován z agarosového gelu. Insercí tohoto PvuII fragmentu doSáli místa plasmidu by nevznikla přeložitelná nukleotidová sek-vence. Tudíž musel být použit Sall/Smal adaptor. Adaptor, kterýmá 10 nukletidů byl nejdříve ligován cestou zarovnaných koncůs PvuII fragmentem. V druhém kroku byla vytvořena požadovanástruktura s přečnívajícími Sáli konci na adaptoru a dále byllinearizován pSC11-Orth vektor Seli. Eyla vytvořena přeložitel-ná sekvence nukleuotidu, která však má čtyři nebo pět amino-kyselin navíc na 5'konci nebo na 3'konci FSME sekvence. Aby seupevnila poloha FSME fragmentu s ohledem na vektor, byla DNAanalyzována dalšími restrikčními endonukleasemi. Při této kon-strukci končí překlad na "stop 2". / (ClC^ t JUDr. Jarmila Traplová

Claims (50)

/in-za
1. ~ ’ ! 1 ~ >'c PATENTOVÉ Ν/Λ 0 K Y 1/ Rekombinantní plasmid obsahující alespoň jeden replikon/oril/, alespoň jedeYt selekční znak /smi/, alespoň jeden promotor /pří/'a DNA' sekvence z genomu pox viru ohraničující tento promotor, vyznačují se tím, že multi-funkční kazeta DNA sekvencí je napojena po směru promotoru.
2. 2/ Plasmid dle bodu 1, vyznačují se t í m ,. žemulti-funkční kazeta DNA sekvencí obsahuje násobné klonovacímísto /mcs/.
3. 3/ Plasmidy dle bodů 1 nebo 2,, vyznačují se tím,že klonovací místa pro jeden nebo několik z následujícíchenzymů jsou přítomny : Stel. AvrlI, Sáli, AccI. HindlI. Spěl. Nhel.
4. 4/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 1 až 3, vyznaču-jící se t í m , že multi-funkČní kazeta DNA sekvencízajištuje překlad startovacího a terminačního kodonu.
5. 5/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 1 až 4, vyzneču-j í c í s e tím ., že multifunkční kazeta DNA. sekvencí obsa-huje promotor /pr2/.
6. 6/ Plasmid dle elespoň jednoho z bodů 1 až 5, vyznaču-jící se t í m , že multi-funkční kazeta DNA sekvencí obsa-huje aktivované DNA sekvence.
7. 7/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 1 až 6, vyznaču-jící se tím, že multi-funkční kazeta DNA sekvencí obsa-huje DNA sekvence pro hydrofobní peptidy zakotvené v membráněnebo signální peptidy.
8. 8/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 1 až 7, vyznaču- jící se tím, že multi-funkční kazeta DNA sekvencí obsa- huje sekvence na svém 5*konci a/nebo 3 konci, které jsou komple- 16 mentární ke známým oligonukletidovým příměrům.
9. 9/ Plasmid dle bodu 8, vyznačují se tím, žesekvence jsou komplementární k primářům SP6 polymerasy neboT7 polymerasy na 5*a/nebo 3*konci.
10. 10/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 1a? 9, vyznaču-jí s e t í m , že multi-funkční kazeta DNA sekvencí má nás-ledující sekvence : 5*-GCACATACGATTTAGGCCTAGGATGTCGACTAGTTAGCTAGCGTATTAATTTCGATC-3
11. ' 11/ Plasmid dle slespoň jednoho z bodů 1 až 10, vyzna-čují 8 e tím, že replikon /ori1/ slouží pro replikaciplasmidu v prokaryotech, s výhodou v gram-negativních bakterií.
12. 12/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 1 až 10, vyzna-čují se tím, že replikon /ori1/ slouží pro replikaciplasmidu v eukaryotech, s výhodou v kvasinkách.
13. 13/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 1 až 11, vyzna-čují se tím, že selekční znak /snil/ slouží pro selekciu prokaryotů, s výhodou u gram-negativních bakterií.
14. 14/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 1 až 10 nebo 12, "vy-značují se tím, že selekční znak slouží pro selekciu eukaryotů, s výhodou u kvasinek.
15. 15/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 1 až14, vyzna-čují se tím,že promotor /pr1/ je silným pox promoto-rem.
16. 16/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 1 až 15, vyzna-čují se tím, že promotor /pr1/ je promotorem z virukravských neštovic.
17. 17/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 1 až 16, vyzna-čují se tím, že promotor p7,5 pro polypeptid s mole-kulovou hmotností 7,5 kD je používán jako promotor viru krav-ských neštovic. 17
18. 18/Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 15 e? 17, v y z n e -Sují se t í π , fe promotor /pr1/ je pox promotorem změ-něným mutagenezí nebo je syntetickým promotorem.
19. .19/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 1 až 18, vyzná-č u j í se t í m , že hraniční DNA sekvence viru kravskýchneštovic se shodují s neesenciálními oblastmi virového genomu.
20. 20/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 1 až 19, vyzná-čující se tím, Že hraniční DNA sekvence se shodujíúplně nebo částečně s genem pro thymidin kinasu.
21. 21/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 1 až 20, vy zn.a -čující se tím,, že obsahuje druhý selekční znak /sm2/.
22. 22/' Plasmid dle bodu 21, vyznačuj í.cí se tím,že selekčním znakem /sm2/ je lacZ gen.
23. 23/ Plasmid dle bodu 21, vyznačující se tím,že selekční znak /sm2/ je dominantní.
24. 24/ Plasmid dle bodu 23, vyznačující se tím,že selekční znak /sm2/ je genem pro xanthin quanin fosforibosyltransferasu.
25. 25/ Plasmid dle bodu 23, vyznačující se tímže selekční, znak /sm2/ je genem pro bílkovinu inaktivujícíantibiotikum hygromycin.
26. 26/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 21 až 25, vyzna-čující se tím, že exprese selekčního znaku /sm2/ jepod kontrolou promotoru pox viru.
27. 27/ Plasmid dle bodu 26, vyznačující se tím,že promotor p11 pro polypeptid s molekulární hmotností 11 kD jepoužíván jako promotor viru kravských neštovic.
28. 28/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 1 až 27, vyzna-čující se t í m , že celá kódovací sekvence genu je 18 včleněna do mcs / násobného klonovacího místa/.
29. 29/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 1 až 28, vyzna-čující se tím, Že kódovací sekvence, pro funkčníoblasti a/nebo antigenních částic bílkovin, jsou včleněny.
30. 30/ Plasmid dle každého z bodů 28 nebo 29, vyznaču-jí c í se t í m , že včleňované DNA je přírodního a/nebosyntetického původu.
31. 31/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 28 až 30, vyzna-čující se tím, že včleňovaná DNA se shoduje úplněnebo částečně s kódujícími sekvencemi pro bílkoviny nebo je-jich deriváty z patogenů.
32. 32/ Plasmid dle bodu 31, vyznačující se tím,že patogeny jsou patogeny působící nákazu černým kašlem, te-tanem, malarií, AIDS, klíštovou encefalitidou / CentrálníEvropskou encefalitidou /, žloutenkou B nebo herpes.
33. 33/ Plasmid dle. alespoň jednoho z bodů 28 až 32, vyzna-čující se tím, že včleňovaná cizorodá DNA kódujeúplně nebo částečně bílkovinu vykezující biologickou akti-vitu', alespoň jednu z následujících bílkovin : koagulační fak-tory II, VIII, IX, XII, XIII, von Willebrandův faktor, bílkovi-nu C a S, antitrombin III, plasminogen, hirudin, NGF, FGF, TNF,B-buňku stimulující faktory, bílkoviny z interleukinové skupi-ny, apolipoproteiny nebo glykoproteiny z virů.
34. 34/ Plasmid dle alespoň jednoho z bodů 1 až 10, vyzna-čující se tím, Že to je pSC11-Orth /DMS 5734/.
35. 35/ Způsob přípravy rekombinantního pox viru, vyznaču-jící se tím, že pox virus je rekombinován s plasmidemdle alespoň jednoho z bodů 1 až 34.
36. 36/ Způsob dle bodu 35, vyznačující se tím, Že pox virus je atenuovaným virem, s výhodou pomocí inaktivacehr genů nebo VGF genu. 19
37. - 37/ Rekocbinar.tní pox virus,v y z η a č u jí c í s ·tím, že obsahuje cizorodé geny, které jsou pod kontro-lou dodatečného promotoru, mimo částí jeho přírodní DNA a můžebýt produkován způsobem dle bodů 35 nebo 36.
38. 38/- Rekomb-inantní -pox-virus dle bodu 37,......v y z-n a d u j í - cí se tím, že je to virus kravských neštovic.
39. 39/ Použití rekombinantního pox viru dle bodu 37 nebo 38pro expresi DNA sekvencí cizorodých pro pox virus.
40. 40/ Použití rekombinantního pox viru dle bodu 39, vyzná-čující se tím, že DNA sekvence cizorodé pro poxvirus kódují úplně nebo částečně bílkoviny nebo jejich deri-váty z patogenů.
41. 41/ Použití rekombinantního pox viru dle bodu 40, vyzna-čující se tím, že patogeny mohou způsobit nákazučerným kašlem, tetanem, malarií, AIDS, klíštovou encefalitidou,žloutenkou B a herpes.
42. 42/ Použití rekombinantního pox viru dle bodu 39, vyzna-čující se tím, že DNA sekvence cizorodé pro poxvirus kódují úplně nebo částečně bílkovinu vykazující biolo-gickou aktivitu; alespoň jednu z následujících bílkovin :koagulační faktory II, VIII, IX, XII, XIII, von Willebrandůvfaktor, bílkovinu C a S, antitrombin III, plesminogen, hirudin,NGF, FGF, TNF, B-buňku stimulující faktory, bílkoviny z inter- .leukinové skupiny, apolipoproteiny nebo glvkoproteiny z virů»
43. 43/ Buněčná kultura, vyznačující se tím, žeobsahuje pox virus dle bodu 37 nebo 38.
44. 44/ Buněčná kultura dle bodu 43, vyznačující setím , že to je kultura TK” buněk, s výhodou TK” 143 / CNCM ; I - 732 /.
45. 45/ Peptid nebo polypeptid, vyznačující se tím,že může být produkován v buněčné kultuře dle bodu 4-^ nebo 44. 20
46. 46/ Farmaceutická skladba, vyznačující se tímže obsahuje jeden nebo více peptidů ε/nebo polypeptidů dlebodu 45.
47. 47/ Vakcina, vyznačující se tím, že obsahu-je jeden nebo několik peptidů a/nebo polypeptidů dle bodu 45.
48. 48/ Virová vakcina, vyznačující se tím, žeobsahuje alespoň jeden rekombinarttní pox virus dle bodů 37nebo 38.
49. 49/ Diagnostické činidlo, vyznačující se tím,že obsahuje jeden nebo několik peptidů a/nebo polypeptidů dlebodu 45.
50. 50/ Použití vakciny dle bodů 47 nebo^48 pro produkci protilá-tek. JODr. Jarmfía Traplová