JP2001514518A - 発現の向上したベクター並びにその製造および使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 発現の向上したベクター並びにその製造および使用方法が開示されクレームされている。発現の向上は、少なくとも一つの第一の核酸分子および少なくとも一つの第二の核酸分子の実質的に同時の発現によるものである。第二の核酸分子は、転写因子または翻訳因子もしくは転写因子と翻訳因子をコード化する。同時の発現は、第一と第二の核酸分子を一つのプロモータに操作可能に結合させることにより、または第一の核酸分子を第一のプロモータに、そして第二の核酸分子を第二のプロモータに操作可能に結合させ、ここで、第一と第二のプロモータが実質的に同時に機能することにより行うことができる。したがって、第一と第二の核酸分子は、ベクターの同一の遺伝子座または異なる遺伝子座にあっても差し支えない。第二の核酸分子は、一つの転写因子または複数の転写因子；もしくは、一つの翻訳因子または複数の翻訳因子；もしくは、少なくとも一つの転写因子と少なくとも一つの翻訳因子をコード化することができる。転写因子は、ワクシニアＨ４Ｌ、Ｄ６、Ａ７、Ｇ８Ｒ、Ａ１Ｌ、Ａ２Ｌ、Ｈ５Ｒ、またはそれらの組合せからのものであって差し支えない。翻訳因子は、Ｋ３Ｌオープンリーディングフレーム、Ｅ３Ｌオープンリーディングフレーム、ＶＡＩ ＲＮＡ、シグマ３オープンリーディングフレーム、ＴＲＢＰオープンリーディングフレーム、またはそれらの組合せからのものであって差し支えない。ベクターは、弱毒化ポックスウイルス、例えば、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣのようなポックスウイルスであって差し支えない。

Description

【発明の詳細な説明】 発現の向上したベクター並びにその製造および使用方法 関連出願 ここに引用する、Tartaglia等の「Vectors Having Enhanced Expression，And Methods of Making and Uses Thereof」と題する本願と同時に出願された米国 特許出願第08/815,809号を参照する。また、Paoletti等の同時係属出願である、 米国特許出願第08/417,210号、同第08/303,275号、同第08/709,209号、同第08/1 84,009号（米国特許第5,378,457号がそれから発行された米国特許出願第07/805, 567号を引用している）および同第08/521,016号、並びに米国特許第5,378,457号 、同第5,225,336号、同第5,453,364号、同第5,494,807号、同第5,505,941号、お よび同第5,110,587号を参照する。発明の属する技術分野 本発明は、向上したベクター、並びにその製造および使用方法に関するもので ある。本発明のベクターは、向上した転写または翻訳もしくは向上した転写およ び翻訳および／または発現、例えば、関心のあるヌクレオチド配列からの向上し た転写または翻訳もしくは転写および翻訳および／または発現を有することがで きる。 いくつかの出版物がこの出願において参照されている。これらの出版物の完全 な引用が、引用されている箇所または請求の範囲の直前の明細書の最後もしくは 出版物が述べられている箇所に見られる。これらの出版物の各々をここに引用す る。これらの出版物は、本発明の関する最先端の技術に関連しているが、これら のうちどの出版物も実際の従来技術であるとは認められない。発明の背景 プラスミドまたは裸のＤＮＡのようなＤＮＡ、およびウイルスベクター、例え ば、ワクシニアウイルスおよびごく最近にはその他のポックスウイルスのような 他のベクターが、異種遺伝子からの挿入および発現に用いられてきた。異種遺伝 子を生感染性ボックスウイルス中に挿入する基本技術としては、供与体プラスミ ド中の異種遺伝要素に隣接したポックスＤＮＡ配列と、供与体プラスミド中に存 在する同種配列と、レスキューポックスウイルス中に存在する同種配列との間の 組換えが挙げられる（Piccini等、1987）。組換えポックスウイルスは、米国特 許第4,769,330号、同第4,772,848号、同第4,603,112号、同第5,505,941号、およ び同第5,494,807号で知られている、またそこに記載されている方法と同等の工 程で構築される。これらの特許をここに引用する。ベクターを開発する目的は、 例えば、安全性の向上した、例えば、そのベクターを免疫組成物またはワクチン 組成物に用いてもよいような弱毒化ベクターにある。 例えば、ワクシニアのコペンハーゲン株から特定の毒性および宿主範囲遺伝子 を欠失することにより誘導したＮＹＶＡＣ（Tartaglia等、1992）が、発現され た異種抗原に対して防御免疫応答を誘発する組換えベクターとして有用であるこ とが証明された。同様に、カナリヤポックスウイルスのワクチン株であるＡＬＶ ＡＣベクターもまた、組換えウイルスワクチンベクターとして効果的であること が証明された（Perkus等、1995）。非鳥類宿主において、これら両方のベクター は、生産的に増殖しない（ＮＹＶＡＣに関していくつかの例外がある）。全ての ポックスウイルスは、細胞質中で増殖し、ウイルス転写に必要とされるタンパク 質の全てではないかもしれないがそのほとんどをコード化するので（Moss 1990 ）、ポックスウイルスプロモータの制御下で適切に操作された異種暗号配列は、 ウイルスが生産的に増殖されないときに転写され、翻訳される。 向上したベクター、例えば、向上した転写または翻訳もしくは転写および翻訳 および／または発現を有するベクター、例えば、弱毒化されたベクターを提供す ることは、最先端の技術より優れた改良であろう。特に、弱毒化により、発現レ ベルおよび／または持続性（persistence）の問題が増大するかもしれないので 、そのような問題に対処することは進歩であろう。発明の目的および概要 ワクシニア増殖についての最近の研究により、ウイルス転写および翻訳の調節 において役割を果たすあるポックスウイルスコード化機能が明らかにされた（Mo ss，1990;Moss，1992で概説されている）。驚くべきことに、これらのワクシニ アコード化機能のいくつか（例えば、Ｅ３Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｈ４Ｌ、およびそれらの 組合せ）を用いて、ベクター（例えば、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣベクター） 中の遺伝子発現（例えば、異種遺伝子発現）のレベルおよび持続性を増大させた 。これらの機能は、本発明のベクターおよび方法の例である。 本発明の目的は：ベクターによる暗号ヌクレオチド配列のような、ベクターに よる少なくとも一つの関心のあるヌクレオチド配列からの転写または翻訳もしく は転写および翻訳および／または発現を増大させる方法を提供すること；向上し た転写または翻訳もしくは転写および翻訳を有するベクター；向上した転写また は翻訳もしくは転写および翻訳を有するベクターを産生する方法を提供すること ；ベクターからの転写または翻訳もしくは転写および翻訳および／または発現を 向上させる方法を提供すること；ポックスウイルスベクターのような改良ベクタ ー、例えば、改良ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣまたはＴＲＯＶＡＣベクターを提供す ること；およびそれからの産生物のうちの少なくとも一つを含む。 したがって、本発明は、少なくとも一つの第一のヌクレオチド配列の向上した 発現のためのベクターを提供する。このベクターは、転写因子または翻訳因子も しくは転写因子および翻訳因子をコード化する少なくとも一つの第二のヌクレオ チド配列を含むように修飾されている。そのベクターは、前記第一のヌクレオチ ド配列を含むように修飾されていても差し支えない。これら第一と第二のヌクレ オチド配列からの発現は、実質的に同時に起きる。その発現は、特定の表現型を 有する細胞内で起こり、好ましくは、第一と第二のヌクレオチト配列の発現は、 その細胞の表現型に関するものである。したがって、第二のヌクレオチド配列の 発現は、転写または翻訳もしくは転写および翻訳を向上させることにより、第一 のヌクレオチド配列の発現を向上させる。 前記第一のヌクレオチド配列は第一のプロモータに操作可能に結合されていて も差し支えなく、前記第二のヌクレオチド配列は第二のプロモータに操作可能に 結合されていても差し支えなく、これら第一と第二のプロモータは、好ましくは 、実質的に同時に機能的である。したがって、これら第一と第二のヌクレオチド 配列は、前記ベクター内の異なる遺伝子座にあっても差し支えない。該第一と第 二のヌクレオチド配列は、前記第一と第二のプロモータを用いることにより、ま たは第一と第二のヌクレオチド配列をあるプロモータに操作可能に結合させるこ と により、ベクター内の同一遺伝子座にあっても差し支えない。 前記転写因子は、例えば、ワクシニアウイルスからの、ポックスウイルス起源 であっても差し支えない。この転写因子は、Ｈ４Ｌ、Ｄ６、Ａ７、Ｇ８Ｒ、Ａ１ Ｌ、Ａ２Ｌ、Ｈ５Ｒ、およびこれらの組合せからなる群より選択されるオープン リーディングフレームからのものであっても差し支えない。前記翻訳因子は、ｅ ＩＦ−２αリン酸化反応の阻害またはＰＫＲリン酸化反応の阻害、もしくはそう でなければＰＫＲを活性化するのに必要な濃度を実際に増大させるｄｓＲＮＡの 隔離を行うことができる。この翻訳因子は、Ｋ３Ｌオープンリーディングフレー ム、Ｅ３Ｌオープンリーディングフレーム、ウイルス関連ＲＮＡ Ｉ（ＶＡＩ） 、ＥＢＥＲ ＲＮＡ、シグマ３オープンリーディングフレーム、ＴＲＢＰオープ ンリーディングフレーム、およびそれらの組合せからなる群より選択されても差 し支えない。 前記第一のヌクレオチド配列は、外因性、例えば、関心のあるエピトープ、生 体応答調整物質、成長因子、認識配列、治療(therapeutic)遺伝子、融合タンパ ク質またはそれらの組合せをコード化するものであって差し支えない。 前記ベクターは、ポックスウイルスのような組換えウイルス、例えば、オルソ ポックスウイルスまたはアビポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス、 または鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、好ましくは、弱毒化ポックスウイル スのような弱毒化ウイルス、例えば、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、またはＴＲＯＶ ＡＣであって差し支えない。 本発明はさらに、前記ベクターを前記少なくとも一つの第二のヌクレオチド配 列を含むように修飾することを含む本発明のベクターを産生する方法を提供する 。本発明の方法はまた、前記少なくとも一つの第一のヌクレオチド配列を含むよ うに前記ベクターを修飾する工程も含んでも差し支えない。好ましくは、このベ クターは、第一と第二のヌクレオチド配列の発現が実質的に同時に起こるように 修飾されている。より好ましくは、そのベクターは、この発現が前記細胞の表現 型に関するように修飾されている。本発明の方法は、前記第一のヌクレオチド配 列を第一のプロモータに、前記第二のヌクレオチド配列を第二のプロモータに操 作可能に結合させ、ここで、これら第一と第二のプロモータが実質的に同時に機 能 的である工程を含んでも差し支えない。本発明の方法はまた、第一と第二のヌク レオチド配列をあるプロモータに操作可能に結合する工程を含んでも差し支えな い。 本発明はさらに、少なくとも一つの本発明のベクターおよび薬剤的に許容され ているキャリヤまたは希釈剤を含む免疫、ワタチンまたは治療組成物を提供する 。 本発明はさらにまた、宿主（動物、ヒト、脊椎動物、哺乳類等）に少なくとも 一つの本発明の組成物を投与する工程を含む、該宿主内に免疫または治療応答を 生じさせる方法を提供する。 本発明はさらに、少なくとも一つの第一のヌクレオチド配列の発現を、この第 一のヌクレオチド配列を含むベクターにより増大させる方法を提供する。この方 法は、前記ベクターを、転写因子または翻訳因子もしくは転写因子および翻訳因 子をコード化する少なくとも一つの第二のヌクレオチド配列を含むように修飾す る工程を含む。好ましくは、これら第一と第二のヌクレオチド配列の発現は、実 質的に同時に起こる。発現は、特定の表現型を有する細胞内で行われても差し支 えなく、その発現がこの細胞の表現型に関するものであることがより好ましい。 前記第二のヌクレオチド配列の発現は、転写または翻訳もしくは転写および翻訳 を向上させることにより、前記第一のヌクレオチド配列の発現を向上させる。本 発明の方法はさらに、前記ベクターを、関心のある第一のヌクレオチド配列を含 むように修飾する工程を含んでも差し支えない。 本発明はさらなる実施の形態において、適切な細胞を少なくとも一つの本発明 のべクターで感染させる、またはトランスフェクションさせる工程を含む、少な くとも一つの遺伝子産物をインビトロ(in vitro)で発現する方法を提供する。そ れから発現された産物は、治療、免疫またはワクチン組成物を配合する上で、ま たはモノクローナル抗体のような抗体を産生するのに、例えば、抗体を検出する ための、診断組成物のようなアッセイ、キット、試験等において有用である、関 心のあるエピトープまたは免疫原であっても差し支えない。 したがって、本発明は、インビトロで、少なくとも一つの本発明のベクターを 含む、転写または翻訳もしくは転写および翻訳および／または発現を行う組成物 および方法、例えば、遺伝子産物（治療、免疫またはワクチン組成物、または診 断または検出キット、アッセイまたは方法、例えば、抗体の存在または不在を確 認するため、またはモノクローナル抗体のような抗体を産生するため、例えば、 診断または検出キット、アッセイまたは方法における免疫原またはエピトープと して使用することのできる）を産生する方法、および／または半ビボで少なくと も一つの本発明のベクターを含む、転写または翻訳もしくは転写および翻訳およ び／または発現を行う組成物および方法、例えば、宿主（例えば、動物、哺乳類 、脊椎動物、ヒト）中の自己輸血(reinfusion)のために細胞を刺激する遺伝子産 物を産生する方法を提供することができる。 さらに、さらなる実施の形態において、本発明は、少なくとも一つの本発明の ベクターを宿主（ヒト、動物、脊椎動物、哺乳類等）に投与することを含む、イ ンビトロで少なくとも一つのヌクレオチド配列（例えば、少なくとも一つの第一 のヌクレオチト配列）を発現する方法を提供する。このヌクレオチド配列は、免 疫原または関心のあるエピトープを発現することができる。本発明の方法は、抗 体を得ることができる。抗体を産生することにより、モノクローナル抗体を産生 することができる。または、抗体は、例えば、抗原を検出するための、アッセイ 、キット、試験または診断組成物に有用である。 本発明は、したがって、インビボ(in vivo)で、本発明のベクターを含む、転 写または翻訳もしくは転写および翻訳および／または発現を行う方法および組成 物、例えば、少なくとも一つの本発明のベクターまたは少なくとも一つの本発明 のベクターを含む組成物、例えば、少なくとも一つの本発明のベクターおよび適 切なキャリヤまたは希釈剤（例えば、家畜またはヒトの医薬に適した）を含む治 療、免疫またはワクチン組成物を投与する方法および組成物を提供する。 これらと他の実施の形態が、以下の詳細な説明に開示されているか、またはそ れから明らかであり、それに包含されている。図面の簡単な説明 以下の詳細な説明は、例としてであって、本発明を記載された特定の実施の形 態に限定することを意図したものではなく、ここに引用する図面とともに理解さ れよう。 図１は、Ｈ６プロモータの元で突然変異誘発されたＨ４Ｌ ｏｒｆおよびｌａ ｃＺ ｏｒｆを含有するｖＰ１３８０中の挿入物のヌクレオチド配列（配列番号 ）を示している。 図２は、Ｈ６／Ｈ４２発現カセットを含有するＡＬＶＡＣ Ｃ８挿入部位のヌ クレオチド配列（配列番号）を示している。 図３は、Ｈ６／Ｋ３ＬおよびＥ３Ｌ発現カセットを含有するＡＬＶＡＣ Ｃ６ 部位のヌクレオチド配列（配列番号）を示している。 図４は、修飾Ｔ５ＮＴモチーフを有するＦＨＶ ｇＢの暗号領域のＤＮＡ配列 （配列番号）を示している。 図５は、Ｈ６プロモートＦＨＶ ｇＢ供与体プラスミドｐＣ３Ｈ６ＦＨＶＢの ＤＮＡ配列（配列番号）を示している。 図６および７は、ｖＣＰ１４３３およびｖＣＰ１４５２中の挿入物のＤＮＡお よびアミノ酸配列（配列番号）を示している。 図８は、ｖＣＰ１４５２中のＫ３Ｌ Ｅ３ＬのＤＮＡ配列（配列番号）を示し ている。詳細な説明 ここに引用するPaoletti等への米国特許第5,494,807号は、弱毒化された毒性 および向上した安全性を有するように、不活化されたウイルスコード化遺伝子機 能を有する修飾組換えウイルスに関するものである。Paoletti等の特許に開示さ れたウイルスは、ポックスウイルス、例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリヤ痘ウ イルス、例えば、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣのようなワクシニ アウイルスまたはアビポックスウイルスであって差し支えない。ＡＬＶＡＣは、 ブダペスト条約の条件下で、米国、20852、メリーランド州、ロックビル、12301 パークローンドライブのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ） に、ＡＴＣＣアクセス番号ＶＲ−２５４７で寄託された。ＴＲＯＶＡＣも同様に 、ブダペスト条約の条件下で、ＡＴＣＣアクセス番号２５５３で寄託された。そ して、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）、ｖＰ９９４、ｖＣＰ２０５、ｖＣＰ１４３３ 、ｐｌａｃＺＨ６Ｈ４Ｌｒｅｖｅｒｓｅ、ｐＭＰＣ６Ｈ６Ｋ３Ｅ３およびｐＣ３ Ｈ６ＦＨＶＢも、ブダペスト条約の条件下で、それぞれ、ＡＴＣＣアクセス番号 、 、 、 、 、および で寄託された。 Paoletti等に発行された米国特許のように、1994年4月24日に出願された米国 特許出願第08/235,392号に基づく、1995年11月9日に出願されたFalkner等の国際 特許公開第WO95/30018号（両方ともここに引用する）は、毒性に関連する遺伝機 能の遺伝子座（すなわち、「基本的」機能の遺伝子座）が外因性ＤＮＡの挿入に 用いられるボックスウイルスに関するものである。 さらに、組換え体が、初期（ＤＮＡ^-）および後期欠損突然変異体（Condit an d Niles,"Orthopoxvirus Genetics"pp 1-39，In:Poxviruses，Edited by R.W.Mo yer and P.C.Turner(Springer-Verlag，1990),およびその中に引用された文献を 参照のこと、これらここに引用する）から、または後期に不稔（abortive）であ ると言われているＭＶＡから作成することができる。欠損突然変異体、不稔後期 ウイルス、基本的遺伝機能が欠失または中断されたウイルス、または生産的複製 のない発現を有するウイルス（例えば、哺乳類系におけるＡＬＶＡＣ）からの組 換え体は、弱毒化されていると言ってもよい。 弱毒化ベクター、例えば、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣベクターのようなある ベクターは、哺乳類細胞内の後期遺伝子発現において遮断または制限されている 。したがって、初期プロモータは、異種遺伝子産物からの発現のために、そのよ うなベクター、例えば、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣベースの組換えインビボで 通常用いられる。 ワクシニアは、初期ウイルス転写に必要とされることが示されたＨ４Ｌと称さ れるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコード化する(Ahn and Moss 19 92，Zhang等，1994)。このＨ４Ｌ ＯＲＦは、ウイルス性ＤＮＡ複製の開始後に 発現される（後期機能）94ｋＤａの必須タンパク質をコード化する。このＨ４Ｌ タンパク質は、ウイルス性ＲＮＡポリメラーゼ複合体と密接に関連することが分 かっており、ワクシニア初期転写因子（ＶＥＴＦ）とともに機能して初期ウイル ス性メッセージを開始し、転写すると考えられている（Ahn and Moss，1992）。 Ｈ４Ｌは、後期に発現されるが、初期に必要とされる。これは、ＶＥＴＦにつ いて観察されるウイルス粒子と同様のウイルス粒子中にパッケージされているタ ンパタ質と一致する。このことにより、感染後の初期に存在するＨ４Ｌの量は少 なく、おそらく制限されていることが示唆された。それゆえ、不稔初期ベクター^- 内で異種遺伝子発現、例えば、ウイルス−宿主相互作用を増大させる手法の一 つは、内因性後期プロモータよりもむしろワクシニア初期／後期プロモータを用 いてＨ４Ｌ ＯＲＦを発現することにより、初期相中に得られるＨ４Ｌタンパク 質の量を増大させることである。Ｈ４Ｌからの初期発現は、異種遺伝子トランス クリプト(transcript)のレベルを増大させるだけでなく、全タンパク質レベルを 増大させるかもしれない他のワクシニア初期遺伝子（例えば、Ｅ３Ｌ）のレベル も増大させるかもしれない。 他のウイルス性転写因子もある；例えば、ポックスウイルス起源の初期および ／または後期ウイルス性転写因子；例えば、ワクシニアＤ６、ワクシニアＡ７、 ワクシニアＧ８Ｒ、ワクシニアＡ１Ｌ、ワクシニアＡ２Ｌ、またはワクシニアＨ ５Ｒからのもの（ＶＬＴＦ−１、−２、−３、−４、Ｐ３、ＶＬＴＦ−Ｘ；Kova cs等，J．Virology，October 1996，70(10):6796-6802、およびその中に引用さ れた文献を参照のこと、これらをここに引用する）。これらと他の転写因子、お よびそのヌクレオチド配列またはその相同体、例えば、別のポックスウイルスか らのものが、本発明を実施する上で有用である。 適切な転写因子の選択は、当業者の範囲内である。例えば、当業者は、ベクタ ーの不稔表現型に基づいて転写因子を選択することができる。例えば、ＭＶＡは 、後期不稔であると言われており、後期または初期もしくは初期／後期転写因子 をこのベクターに用いてもよい。ＡＬＶＡＣは、初期不稔であり、初期または初 期／後期転写因子をこのベクターに用いてもよい。そのベクターは、ｔｓ（温度 感受性）突然変異体であっても差し支えない（本発明の実施に使用できる初期（ ＤＮＡ^-）および後期欠損突然変異体に関する。前出のCondit and Nilesを参照 のこと）。このように、転写および／または翻訳因子および少なくとも一つの関 心のあるヌクレオチド配列を、前記ベクターの表現型に対して、初期、後期（中 間を含む）、または初期／後期に発現することが好ましい。 異種遺伝子発現を増大させる別の手段としては、翻訳、例えば、ウイルスｍＲ ＮＡ翻訳のようなｍＲＮＡの翻訳の全体的効率を向上させることが挙げられる。 二つのワクシニアコード化機能（Ｅ３ＬおよびＫ３Ｌ）が、ウイルス翻訳の規制 にある役割を果たすものとして最近同定された（Beattie等，1995a，1995b，199 1;Chang等，1992;Davies等，1993）。両方の機能は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ ）により活性化されたときに、翻訳開始因子ｅＩＦ−２αをリン酸化し、ｍＲＮ Ａ翻訳の開始を阻害することとなる細胞タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）の作用を 阻害することができる（Jacobs and Langland，1996で検討されている）。した がって、ウイルス転写中のｄｓＲＮＡを産生するワクシニアウイルスは、ｅＩＦ −２αへのＰＫＲの負の作用をブロックする機能を発展させ、ウイルスｍＲＮＡ を効率的に翻訳することができる（非対称転写がｄｓＲＮＡを生じる；どのよう なウイルス感染またはプラスミド由来発現もそれを生じる；ｄｓＲＮＡがＰＫＲ を活性化させる；ＰＫＲが自動的にリン酸化されて、ｅＩＦ−２αがリン酸化さ れる）。 前記ワクシニアＫ３Ｌ ＯＲＦが、ｅＩＦ−２αに対する著しいアミノ酸相同 性を有することが示された（Goebel等，1990;Beattie等，1991;米国特許第5,378 ,457号;Beattie等，1995a，1995bも参照のこと）。このタンパク質は、ＰＫＲの 偽性基質として機能すると考えられ、ｅＴＦ−２α結合部位に関して競合する（ Carroll等，1993;Davies等，1992）。このＫ３Ｌ遺伝子産物は、活性化されたＰ ＫＲと結合することができ、したがって、翻訳開始への結果としての負の影響に よりｅＩＦ−２αのリン酸化を阻害することができる。 前記ワクシニアＥ３Ｌ遺伝子は、ｄｓＲＮＡに特異的に結合できるタンパク質 をコード化する（Watson and Jacobs，1991;Chang等，1992）。これは、感染細 胞中のｄｓＲＮＡの量を低下させ、したがって、活性化ＰＫＲのレベルを減少さ せる傾向にある。Ｅ３Ｌがワクシニアから欠失されたときに、得られたウイルス は、このキナーゼ阻害機能を失い、さらに、２’５’オリゴアデニレートシンセ ターゼ／ＲＮａｓｅ Ｌ経路を活性化し、その結果として、ｒＲＮＡの分解を増 大させることができる（Beattie等，1995a，1995b）。このように、Ｅ３Ｌは、 二つのレベル；ｍＲＮＡ安定性およびｅＩＦ−２αリン酸化の制限で、ワクシニ ア感染細胞中の効率的なｍＲＮＡ翻訳に関して重大であるように思われる。 前記ＡＬＶＡＣゲノムが、塩基配列決定され、Ｅ３Ｌ／Ｋ３Ｌに対する、また は既知のｄｓＲＮＡ結合モチーフに対する相同性について研究された。その結果 は、これら二つのワクシニアＯＲＦに対するＡＬＶＡＣ ＯＲＦの著しい相同性 も、ｄｓＲＮＡ結合モチーフの存在も示さなかった。 したがって、組換えＡＬＶＡＣベクター中の発現レベルを改良する手法の一つ は、初期ワクシニアプロモータの制御下でＡＬＶＡＣ内でワクシニアＥ３Ｌ／Ｋ ３Ｌ ＯＲＦを発現することであった。感染細胞中のＰＫＲの阻害により、異種 遺伝子発現のレベルおよび持続性を増大させることができた。 それゆえ、本発明のベクターおよび方法の実施例として、転写または翻訳もし くは転写および翻訳レベルで異種遺伝子発現を向上させるために、ここに論じた ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ組換え体を産生した。 したがって、挿入された異種遺伝子の発現のレベルまたは持続性を向上または 増大させるために、初期発現Ｈ４Ｌ ＯＲＦを有するＮＹＶＡＣ組換え体および ワクシニアＥ３Ｌ／Ｋ３Ｌ遺伝子からの発現を有するＡＬＶＡＣ組換え体をここ に例示する。異種遺伝子発現のアップ調節(up-regulation)には、これら新しい ベクター由来の組換え体が投与または接種された宿主内の治療または免疫応答の 誘発に深い影響があり、それによって、免疫応答、例えば、防御応答が向上した り、治療応答が向上したりすることがある。 本発明の範囲、すなわち、転写および／または翻訳因子、例えば、Ｈ４Ｌ、Ｅ ３ＬおよびＫ３Ｌからの発現を操作して、それによって、転写または翻訳もしく は転写および翻訳および／または発現の効率を向上させることが、他の真核ベク ター系（すなわち、ＤＮＡ、ウイルス）に拡張することができる。 実際、他の科のウイルスも、ＰＫＲ活性化により翻訳ダウン調節(down-regula tion)の細胞抗ウイルス応答を克服する機構を発展させた。アデノウイルスにお いて、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩにより転写されたＶＡＩ ＲＮＡが、よく特徴付 けられ、ＰＫＲに直接的に結合し、したがって、ｄｓＲＮＡによりその活性化を 妨げることが示された（Mathews and Shenk，1991）。このアデノウイルスゲノ ムからＶＡＩを欠失することにより、複製が乏しく、後期遺伝子発現のレベルが 不足した突然変異体が得られる（Thimmappaya等，1982）。同様に、ヘルペスウ イルスであるエプスタイン−バーウイルスが、キナーゼに直接結合することによ りＰＫＲ活性化を妨げるように機能する、ＥＢＥＲと呼ばれる相同性ＲＮＡを有 する（Clark等，1991;Sharp等，1993）。レオウイルスシグマ３遺伝子産物が、 ｄｓ ＲＮＡと結合し、したがって、ＰＫＲの活性化を妨げる上で、ワクシニアＥ３Ｌ と同様な様式で機能することが示された（Imani and Jacobs，1988;Beattie等， 1995aも参照のこと）。実際に、ある研究により、前記レオウイルスシグマ３遺 伝子は、部分的に、Ｅ３Ｌの欠失したワクシニア組換え体を補えることが示され た（Beattie等，1995a）。さらに、ＨＩＶ感染の際に活性化された細胞タンパク 質（ＴＲＢＰ）が、ＰＫＲの活性を阻害することが示された（Park等，1994）。 したがって、本発明は、広く、発現の操作に関し、好ましくは、少なくとも一 つの転写因子、例えば、少なくとも一つの初期および／または後期ウイルス転写 因子、または少なくとも一つの翻訳因子、例えば、真核ベクター系内のＰＫＲ活 性化により翻訳ダウン調節の細胞抗ウイルス応答を克服する産物をコード化する ヌクレオチド配列、または少なくとも一つの転写因子および少なくとも一つの翻 訳因子を用いて、発現を向上または増大させることによる発現の操作に関するも のである。そして、本発明は、プラスミドまたは裸ＤＮＡベクター、ポックスウ イルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス等のようなウイ ルスベクターを含むベクター系に関するものである。したがって、前記ヌクレオ チド配列は、例えば、前記ベクター系の観点から適切なＲＮＡまたはＤＮＡであ って差し支えない。 したがって、本発明は、少なくとも一つの転写因子、少なくとも一つの翻訳因 子、または少なくとも一つの転写因子および少なくとも一つの翻訳因子をコード 化する少なくとも一つのヌクレオチド配列を含むように修飾されたベクター；ベ クターにより転写および／または翻訳および／または発現を増大させるまたは例 えば、本発明のベクターを前記少なくとも一つのヌクレオチド配列を含むように 修飾することにより本発明のベクターを調製する方法に関するものである。 これらの方法は、(i)少なくとも一つの関心のあるヌクレオチド配列を含む第 一のヌクレオチド配列および(ii)転写因子をコード化する少なくとも一つのヌク レオチド配列、または翻訳因子をコード化する少なくとも一つのヌクレオチド配 列または転写因子および翻訳因子をコード化する少なくとも一つのヌクレオチド 配列を含む第二のヌクレオチド配列：から実質的に同時の発現を含んでも差し支 えない。前記ベクターは、前記少なくとも一つの関心のあるヌクレオチド配列を 含 むように修飾しても差し支えない。該少なくとも一つの関心のあるヌクレオチド 配列は、少なくとも一つの暗号ヌクレオチド配列であっても差し支えない。前記 ベクターは、好ましくは、前記第一と第二のヌクレオチド配列の実質的に同時の または同時の発現を有している。 この実質的に同時の発現は、ほぼ同じ時期または段階の感染で機能的な前記第 一と第二のヌクレオチド配列のためのプロモータを用いることにより行うことが できる。したがって、この関心のあるヌクレオチド配列および前記因子をコード 化するヌクレオチド配列は、前記ベクター中の異なる遺伝子座に位置することが できる。あるいは、実質的に同時の発現は、前記第一と第二のヌクレオチド配列 を同一の遺伝子座内に位置させることにより行うことができる。したがって、実 質的に同時の発現は、前記関心のあるヌクレオチド配列および／または前記関心 のあるヌクレオチド配列、転写因子をコード化するヌクレオチド配列、翻訳因子 をコード化するヌクレオチド配列、または転写因子および翻訳因子をコード化す るヌクレオチド配列に操作可能に結合したプロモータに操作可能に結合すること により行うことができる。 前記転写因子は、いかなる適切な系からのものであって差し支えない。好まし くは、その転写因子は、ポックスウイルス源のものであり、例えば、ワクシニア ウイルスからのものである。該転写因子は、Ｈ４Ｌ、Ｄ６、Ａ７、Ｇ８Ｒ、Ａ１ Ｌ、Ａ２Ｌ、Ｈ５Ｒ、その相同体およびそれらの組合せからなる群より選択され たオープンリーディングフレームからの発現からのものであって差し支えない。 また、転写因子をコード化するヌクレオチド配列を含む実施の形態がポックスウ イルスベクター系を含むことが好ましい。 前記翻訳因子も同様に、いかなる適切な系からのものであって差し支えない。 好ましくは、その翻訳因子は、ｅＩＦ−２αリン酸化の阻害またはＰＫＲリン酸 化の阻害を行うか、もしくはそうでなければ、ｄｓＲＮＡの効果的な濃度を減少 させる細胞ｄｓＲＮＡ含有量を減少させることができる。この翻訳因子は、Ｋ３ Ｌオープンリーディングフレーム、Ｅ３Ｌオープンリーディングフレーム、ＶＡ Ｉ ＲＮＡ、ＥＢＥＲ ＲＮＡ、シグマ３オープンリーディングフレーム、ＴＲ ＢＰオープンリーディングフレーム、その相同体、およびそれらの組合せからな る群からの発現より選択することができる。ｄｓＲＮＡ濃度に関する「効果的」 という用語は、ＰＫＲおよび／またはｅＩＲ−２αリン酸化を活性化させるｄｓ ＲＮＡの量を意味する（このｄｓＲＮＡは、そのための形態にある）。ＲＮＡベ ースの因子、例えば、ＶＡＩ ＲＮＡ、ＥＢＥＲ ＲＮＡに関して、当業者は、 不必要な実験を行わずに、ＤＮＡベクター系中に使用するためにそのＲＮＡから 適切なＤＮＡを得ることができる。そして、ＤＮＡベースの因子に関して、当業 者は、不必要な実験を行わずに、ＲＮＡベクター系中に使用するためにそこから 適切なＲＮＡを得ることができる。 「実質的に同時の発現」という用語は、前記転写または翻訳もしくは転写およ び翻訳の因子をコード化するヌクレオチド配列が、前記少なくとも一つの関心の あるヌクレオチド配列とほぼ同じ感染段階中に発現されることを意味する。 例えば、ポックスウイルス遺伝子は、時間的様式で調節されている（Coupar等 ，Eur．J．Immunol.，1986，16:1479-1487，at 1479）。したがって、感染の直 後に、「初期」遺伝子の一群が発現される（同著者）。「初期遺伝子」は、感染 の「後期」段階（ＤＮＡ複製の開始）の前の感染後の時間で発現されるのをやめ る（すなわち、初期プロモータが機能をやめる）。チミジンキナーゼ（「ＴＫ」 ）遺伝子およびＴＫプロモータは、直ちに「初期」の遺伝子およびプロモータの 例である（Hruby等，J．Virol.，1982，43(2):403-409，at 403）。このＴＫ遺 伝子は、感染から約４時間後に「オフ」に切り換えられる。「後期遺伝子」は、 ＤＮＡ複製が開始されるまで発現されない遺伝子の一群である（Coupar等、前出 ）。Coupar等により用いられたＰＬ１１プロモータは、「後期」プロモータの例 である。このように、Coupar等において、ＰＬ１１プロモータにより調節された ＨＡ遺伝子発現は、ＴＫ領域内にあるにもかかわらず、ＤＮＡ複製後まで行われ なかった。 規範的な「初期」遺伝子および「後期」遺伝子とは対照的に、7.5ｋＤ遺伝子 および7.5ｋＤプロモータは、「初期および後期」遺伝子およびプロモータの例 である。「調節転写に対する明らかな例外である」（Davison and Moss，"Struc ture of Vaccinia Virus Early Promoters"J．Mol．Biol.，210-69，249-69（19 89）at 749）7.5ｋＤプロモータは、「初期および後期両方の転写に関する調節 信号 を含有している」（Coupar等、前出）。実際に、「7.5ｋＤ遺伝子のプロモータ 領域内に独立した初期および後期ＲＮＡ開始部位」がある（Cochran等，J．Viro l.，59(1):30-37(April，1985)）。 Coupar等は、「プロモータＰＦ［初期］、Ｐ７．５［初期および後期］および ＰＬ１１［後期］によるＨＡ発現の時間調節が、それらプロモータが転移されて 、［ワクシニアウイルス］のＴＫ遺伝子を妨げたときに維持された」ことを観察 した（同著者、at 1482）。すなわち、Corpar等は、初期ワクシニアプロモータ の制御下の異種遺伝子発現が「初期」に起こり、後期ワクシニアプロモータの制 御下の異種遺伝子発現が「後期」に起こり、初期および後期ワクシニア7.5ｋＤ プロモータの制御下の異種遺伝子発現が初期および後期の両方で起こったことを 観察した（同著者、at 1479："[p]romoter sequences transposed to within th e thymidine kinase（TK）gene continue to function in a temporally regula ted manner"(引用省略)）。 したがって、転写または翻訳もしくは転写および翻訳因子をコード化するヌク レオチド配列は、第一の種類のプロモータの制御下にあって差し支えなく、前記 少なくとも一つの関心のあるヌクレオチド配列または前記暗号ヌクレオチド配列 は、第二の種類のプロモータの制御下にあって差し支えなく、ここで、これら第 一と第二のプロモータは、両方とも初期、両方とも後期（中間を含む）、または 両方とも初期および後期である；または第一のプロモータが初期または後期であ っても差し支えなく、第二のプロモータが初期および後期であり；または第一の プロモータが初期および後期であっても差し支えなく、第二のプロモータが初期 または後期であっても差し支えない。前記関心のあるヌクレオチド配列および転 写または翻訳もしくは転写および翻訳因子をコード化するヌクレオチド配列は、 同一の遺伝子座または異なる遺伝子座、または同一のプロモータの制御下にあっ ても差し支えない。 したがって、本発明は、転写または翻訳もしくは転写および翻訳および／また は発現の向上したベクターを調製する方法、または少なくとも一つの関心のある ヌクレオチド配列への操作可能な結合を含む、ベクター内で転写または翻訳もし くは転写および翻訳および／または発現を増大または向上させる方法、または少 なくとも一つの転写および／または少なくとも一つの翻訳因子に関する少なくと も一つのヌクレオチド配列、例えば、転写因子に関する少なくとも一つのヌクレ オチド配列、または翻訳因子に関する少なくとも一つのヌクレオチド配列または 転写因子および翻訳因子に関する少なくとも一つのヌクレオチド配列に操作可能 に結合したプロモータに関するものである。好ましくは、前記翻訳因子は、ｅＩ Ｆ−２αリン酸化の阻害を行うおよび／またはＰＫＲのリン酸化の阻害を行うお よび／またはｅＩＦ−２αのリン酸化の原因である細胞キナーゼの阻害を行うお よび／またはｄｓＲＮＡの濃度を効果的にする。したがって、本発明はまた、そ のような方法からのベクターに関するものである。 あるいは、本発明の方法は、ベクター内で、少なくとも一つの関心のあるヌク レオチド配列を第一の種類のプロモータに操作可能に結合させることおよび少な くとも一つの転写および／または翻訳因子をコード化する少なくとも一つの第二 のヌクレオチド配列を第二の種類のプロモータに操作可能に結合することを含み 、ここで、該第一と第二のプロモータが、感染の同じ時期または同じ段階で両方 とも機能的であり、例えば、第一と第二のプロモータが、両方とも初期、両方と も後期（中間を含む）、または両方とも初期および後期、もしくは第一のプロモ ータが初期または後期であり、第二のプロモータが初期および後期であり、もし くは第一のプロモータが初期および後期であり、第二のプロモータが初期または 後期である。もちろん、前記第一と第二のプロモータは、二つ以上の異なる遺伝 子座で同一プロモータであっても、一つの遺伝子座で同一プロモータであっても 差し支えない。そして、本発明は、そのような方法からのベクターに関するもの である。 そして、ここで用いている「ヌクレオチド配列」という用語は、核酸分子を意 味することができる。したがって、ヌクレオチド配列は、単離された核酸分子、 例えば、外因性ＤＮＡであって差し支えない。 したがって、本発明は、好ましくは、少なくとも一つの関心のあるエピトープ 、および少なくとも一つの転写因子または少なくとも一つの翻訳因子もしくは少 なくとも一つの転写因子および少なくとも一つの翻訳因子をコード化する、少な くとも一つの外因性ヌクレオチド配列を含有するように修飾されたベクターであ っ て、ここで、前記外因性ヌクレオチド配列および前記因子が実質的に時間的に共 に発現される（実質的に同時に発現される）ベクター、およびそのようなベクタ ーを製造および使用する方法並びにそれからの産生物を提供する。向上または増 大した発現が、本発明のベクターおよび方法により得られる。この向上または増 大した発現は、発現の向上したレベルおよび／または持続性を意味する。 本発明は、挿入されたヌクレオチド配列、例えば、異種遺伝子のレベルおよび ／または持続性を向上および／または増大させる手段として、初期に不稔である ベクター、例えば、初期に発現された転写因子、例えば、初期に発現されたＨ４ Ｌオープンリーディングフレームを有するポックスウイルスベクター、例えば、 ＮＹＡＶＣ、ＡＬＶＡＣまたはＴＲＯＶＡＣ組換え体（またはその相同体、例え ば、ワクシニア以外のようなポックスウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイ ン−バー、アデノウイルス、プラスミドまたは裸ＤＮＡ等のような別のベクター 系からのもの）を提供する。本発明はまた、挿入されたヌクレオチト配列、例え ば、異種遺伝子のレベルおよび／または持続性を向上および／または増大させる 手段として、後期に不稔である（中間の不稔を含む）ベクター、例えば、後期に 発現された転写因子、例えば、発現されたＧ８Ｒ、Ａ１Ｌ、Ａ２Ｌ、Ｈ５Ｒ（Ｖ ＬＴＦ−１、−２、−３、−４、Ｐ３、ＶＬＴＦ−Ｘ）オープンリーディングフ レームを有するポックスウイルスベクター、例えば、ＭＶＡ組換え体（またはそ の相同体、例えば、ワクシニア以外のようなポックスウイルス、ヘルペスウイル ス、エプスタイン−バー、アデノウイルス、プラスミドまたは裸ＤＮＡ等のよう な別のベクター系からのもの）を提供する。 本発明はさらに、挿入されたヌクレオチド配列、例えば、異種遺伝子のレベル および／または持続性を向上および／または増大させる手段として、ベクター、 例えば、ワクシニアＥ３Ｌおよび／またはＫ３Ｌからの発現を有するポックスウ イルスベクター、例えば、ＡＬＶＡＣまたはＴＲＯＶＡＣ組換え体（またはその 相同体、例えば、ワクシニア以外のようなポックスウイルス、ヘルペスウイルス 、エプスタイン−バー、アデノウイルス、プラスミドまたは裸ＤＮＡ等のような 別のベクター系からのもの：ＰＫＲ活性化による翻訳ダウン調節の細胞抗ウイル ス応答を克服するウイルス機構の前出の議論を留意のこと）を提供する。 さらに、本発明は、挿入されたヌクレオチド配列、例えば、異種遺伝子のレベ ルおよび／または持続性を向上および／または増大させる手段として、初期に発 現された転写因子、例えば、初期に発現されたＨ４Ｌオープンリーディングフレ ーム（またはその相同体）およぴ／または初期に発現された転写因子、例えば、 発現されたＧ８Ｒ、Ａ１Ｌ、Ａ２Ｌ、Ｈ５Ｒ（ＶＬＴＲ−１、−２、−３、−４ 、Ｐ３、ＶＬＴＲ−Ｘ）（またはその相同体）、例えば、後期に不稔（中間に不 稔を含む）、例えば、ＭＶＡ組換え体、およびワクシニアＥ３Ｌおよび／または Ｋ３Ｌ（またはその相同体）からの発現を有するベクター、例えば、ポックスウ イルスベクター、例えば、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣまたはＴＲＯＶＡＣ組換え体 を提供する。 以下の実施例に示したように、前記Ｋ３Ｌ／Ｅ３Ｌ因子を含有するＡＬＶＡＣ −ＨＩＶ組換え体ｖＣＰ１４５２は、ｖＣＰ１４３３またはｖＣＰ３００と比較 して、ヒトの細胞に向上した発現を有した。実際に、向上した発現が、ヒトおよ びイヌの細胞中のＥ３Ｌ／Ｋ３Ｌ翻訳因子に観察される。 Ｅ３Ｌ／Ｋ３Ｌのような翻訳因子により向上した発現は、細胞の種類に依存し ているかもしれない。例えば、Ｅ３Ｌ／Ｋ３Ｌにより向上した発現は、ヒトおよ びイヌの細胞中に観察されるけれども、マウスおよびネコの細胞中には観察され ない。この開示および従来技術の知識から、当業者は、不必要な実験を行わずに 、特定の細胞の種類に使用するのに適した翻訳因子を選択することができる。例 えば、当業者には細胞間の差が分かることは言うまでもない。したがって、翻訳 因子は、向上した発現が観察される細胞中で発現される、例えば、使用する翻訳 因子は細胞に関することが好ましい。 さらに、マウスの予備免疫原性研究により、Ｅ３Ｌ／Ｋ３Ｌ翻訳因子により向 上した免疫原性の証拠は示されていない。このことは、マウス細胞中で向上した 発現が観察されないことに対応している。したがって、この開示および従来技術 の知識から、当業者は、不必要な実験を行わずに、所望の動物中で向上した免疫 原性を提供する翻訳因子を提供することができる。向上した発現が特定の翻訳因 子により特定の細胞系統中に、例えば、ヒトまたはイヌの細胞中のＥ３Ｌ／Ｋ３ Ｌ中にインビトロで観察された場合には、当業者は、前記細胞がその特定の翻訳 因子により由来された動物（ヒトを含む）中にインビボで向上した免疫原性、例 えば、前記Ｅ３Ｌ／Ｋ３Ｌ翻訳因子からのヒトおよびイヌ中の向上した免疫原性 を予測することかできる。 さらに、マウス細胞において、ＡＬＶＡＣ発現の制限因子が転写レベルにある 。したがって、適切な転写因子を使用することにより、マウス系において向上し た発現を観察できないことを克服することができる。それゆえ、細胞の起源は、 ベクターの性質、例えば、ベクターの表現型であるように、本発明のインビトロ またはインビボ用途における因子であるかもしれない（Ｈ４データを留意のこと ）。しかし、細胞およびベクター表現型並びに因子および異種および／または外 因性ＤＮＡからの発現の時間の適切な選択は、不必要な実験の必要なく、この開 示および従来技術の知識から、当業者の範囲に含まれる。 また、以下の実施例は、ＮＹＶＡＣ組換え体ｃＶＰ１３８０が、ｖＰ９９４と 比較して向上した発現レベルを有することを示している。おそらく、ｖＰ１３８ ０中の向上したレベルの一部は、ｖＰ１３８０中の発現に含まれる転写および翻 訳が向上しているように、Ｅ３Ｌのようなウイルス特異的産物からの向上した転 写および発現によるものであろう。ベクターがより大きいレベルの発現およびよ り持続性の高いレベルの発現を得る本発明によれば、外因性ＤＮＡから、ｖＰ１ ３８０中でより持続性の高いレベルの発現が多くある。 ｖＰ９９４よりもマウス中でより免疫原性であるｖＰ１３８０により示される ように、マウス系中の向上した発現プロフィール（profile）が、マウス中の向 上した免疫原性を提供した。向上プロフィールがここに記載した不稔初期ＮＹＶ ＡＣ組換え体中の制限初期細胞内に見られたけれども、このプロフィールは、生 産的複製のあった細胞、例えば、ＶＥＲＯまたはＣＥＦには観察されなかった。 これは、前記因子および異種ＤＮＡが実質的に同時に発現されることが好ましい かもしれず、すなわち、好ましくは、実質的に同一の時期または段階で共発現が 行われ、発現の時間、例えば、初期、後期、初期および後期が、前記ベクターの 表現型（例えば、初期に不稔、後期に不稔）と合わせられるべきである、すなわ ち、ウイルス複製が損なわれていない系（許容系）、または発現がベクターの表 現型に合わせられていないときに複製が中止される系は最適発現を得られないか もし れないことを示唆している。したがって、ＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣのような 初期に不稔の系において、好ましくは、外因性ＤＮＡおよび転写または翻訳もし くは転写および翻訳因子を初期に発現し、後期に不稔の系においては、好ましく は、外因性ＤＮＡおよび転写または翻訳もしくは転写および翻訳因子を後期また は初期および後期に発現する（初期のみの発現は、許容系における発現と似てい るかもしれない、すなわち、最適な発現が必ずしも得られないかもしれない）。 ベクターまたは組換え体を産生する方法は、米国特許第4,603,112号、同第4,7 69,330号、同第5,174,993号、同第5,505,941号、同第5,338,683号、同第5,494,8 07号、および同第4,733,848号、国際特許公開第WO95/30018号、Paoletti，"appl ications of pox virus vectors to vaccination:An update,"PNAS USA 93:1134 9-11353，October 1996，Moss，"Genetically engineered poxviruses for reco mbinant gene expression，vaccination，and safety,"PNAS USA 93:11341-1134 8，October 1996，Smith et al.，米国特許第4,745,051号（recombinant baculo virus），Richardson，C.D1.(Eiditor)，Methods in Molecular Biology 39，"B aculovivurs Expression Protocols"(1995 Humana Press Inc.)，Smith et al. ，"Production of Huma Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Ba culovirus Expression Vector,"Molecular and Cellular Biology，Dec.，1983 ，Vol.3，No.12，p.2156-2165;Pennock et al.，"Strong and Regulated Expres sion of Escherichia Coli 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毒素からの、抗原または免疫原またはその免疫学的活性断片の免疫学的関連領域 である。 関心のあるエピトープは、病原または毒素の抗原から、もしくは、前記病原に 関する応答を誘発する別の抗原または毒素から、もしくは、例えば：麻疹ウイル ス属抗原、例えば、ＨＡまたはＦのようなイヌジステンパーウイルスまたは麻疹 または牛疫抗原；狂犬病糖タンパク質、例えば、狂犬病糖タンパク質Ｇ；鳥類イ ンフルエンザ抗原、例えば、ヌデオタンパタ質（nudeoprotein：ＮＰ）のような ニワトリ／ペンシルバニア／１／８３インフルエンザ抗原、シチメンチョウイン フルエンザＨＡ；ウシ白血病ウイルス抗原、例えば、ｇｐ５１、３０外被；ニュ ーカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）抗原、例えば、ＨＮまたはＦ；ネコ白血病ウイ ルス抗原（ＦｅＬＶ）、例えば、ＦｅＬＶ外被タンパク質；ＲＡＶ−１；感染性 気管支炎ウイルスのマトリクスおよび／またはプレプロマー(preplomer)；ヘル ペスウイルス糖タンパク質、例えば、ネコヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイ ルス、ウシヘルペスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、イヌヘルペスウイルス、Ｈ ＳＶ、マレック病ウイルス、またはサイトメガロウイルスからの糖タンパク質； フラビウイルス抗原、例えば、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）抗原、黄熱病抗原、 またはデング熱ウイルス抗原；マラリア（プラスモディウム）抗原、免疫不全ウ イルス抗原、例えば、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）抗原またはサル免疫不全 ウイルス（ＳＩＶ）抗原またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原；パルボウ イルス抗原、例えば、イヌパルボウイルス、ウマインフルエンザ抗原；ポックス ウイルス抗原、例えば、エクトロメリア抗原、カナリアポックスウイルス抗原ま たは鶏痘ウイルス抗原；または感染性包性病ウイルス抗原、例えば、ＶＰ２、Ｖ Ｐ３、ＶＰ４のような、前記病原に関する応答を誘発する別の抗原または毒素か ら調製することができる。 関心のあるエピトープは、ヒトの病原または毒素の抗原から、または該病原に 関する応答を誘発する別の抗原または毒素、または、例えば：麻疹ウイルス抗原 、例えば、ＨＡまたはＦのような麻疹ウイルス抗原；狂犬病糖タンパク質、例え ば、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ；インフルエンザ抗原、例えば、インフルエ ンザウイルスＨＡまたはＮ；ヘルペスウイルス抗原、例えば、単純性疱疹ウイル ス（ＨＳＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、エプスタイン−バー； フラビウイルス抗原、ＪＥＶ、黄熱病ウイルスまたはデング熱ウイルス抗原；肝 炎ウイルス抗原、例えば、ＨＢｓＡｇ；免疫不全ウイルス抗原、例えば、ｇｐ１ ２０、ｇｐ１６０のようなＨＩＶ抗原；ハンターン(Hantaan)ウイルス抗原；C.t etani抗原；おたふくかぜ抗原；肺炎球菌抗原、例えば、ＰｓｐＡ；ボレリア属 抗原、 例えば、ボレリアブルグドルフェリ、ボレリアアフゼリおよびボレリアガリニイ のようなライム病に関連するボレリア属のＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣ；水痘 （水痘−帯状疱疹）抗原；またはプラスモディウム抗原のような前記病原に関す る応答を誘発する別の抗原または毒素からのものであって差し支えない。 もちろん、上述した列記は、前記関心のあるエピトープはどのような獣医学ま たはヒトの病原の抗原から由来していても差し支えないので、典型的な例を意図 したものである。さらに、関心のあるエピトープを得るために、（本発明が少な くとも一つの抗原をコード化する関心のある前記外因性または異種核酸分子を包 含するように）どのような獣医学またはヒトの病原の抗原を発現することかでき る。 前記異種ＤＮＡは成長因子または治療遺伝子であっても差し支えないので、本 発明の組換え体を遺伝子療法に使用することかできる。遺伝子療法は、遺伝情報 の伝達を含む。遺伝子療法および免疫療法に関して、米国特許第5,252,479号お よびその中に引用された文献、並びに国際特許公開第WO94/16716号および1994年 1月19日に出願され、許可された米国特許出願第08/184,009号およびその中に引 用された文献を参照のこと。これらの文献をここに引用する。前記成長因子また は治療遺伝子は、例えば、闘病(disease-fighting)タンパク質、癌を治療する分 子、腫瘍抑制遺伝子、サイトカイン(cytokines)、腫瘍関連抗原、またはインタ ーフェロンをコード化することができる。そして、この成長因子または治療遺伝 子は、例えば、アルファグロブリン、ベータグロブリン、ガンマグロブリンをコ ード化する遺伝子、顆粒細胞マクロファージ−コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子 、インターロイキン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒細胞コロニー刺激 因子、エリスロポイエチン、肥満細胞成長因子、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３、網膜芽 細胞腫、インターフェロン、メラノーマ関連抗原またはＢ７からなる群より選択 することができる。 本発明はさらに、本発明のベクターおよび許容されるキャリヤまたは希釈剤（ 例えば、獣医学的に許容される、または薬剤的に許容される）を含有する免疫原 性、または免疫またはワクチン組成物に関するものである。前記ベクター（また はその発現産物）を含有する免疫組成物は、局所的または全身の免疫応答を誘 発する。この応答は、必要ではないか、防御的であり得る。前記本発明の組換え 体（またはその発現産物）を含有する免疫原性組成物は、同様に、必要ではない が、防御的であり得る局所的または全身の免疫応答を誘発する。ワクチン組成物 は、局所的または全身の防御応答を誘発する。したがって、「免疫組成物」およ び「免疫原性組成物」という用語は、（これら二つの用語は防御組成物であり得 るので）「ワクチン組成物」を含む。 したがって、本発明は、宿主脊椎動物に、本発明の組換えウイルスまたはベク ターおよび許容されるキャリヤまたは希釈剤を含む免疫原性、免疫またはワクチ ン組成物を投与することを含む、該動物中に免疫応答を誘発する方法も提供する 。この明細書の目的に関して、「動物」は、ヒトを除く全ての脊椎動物を含み、 「脊椎動物」は、動物（ここで用いられているような「動物」）およびヒトを含 む全ての脊椎動物を含む。もちろん、「動物」の部分集合は「哺乳類」であり、 これは、この明細書の目的に関して、ヒトを除いた全ての哺乳類を含む。 ヒトへの投与に関して、本発明の組換え体またはベクターは、生産的複製を必 要とせずに、発現の利点を提供することができる。したがって、このことにより 、免疫無防備状態の個体に本発明の組換え体を使用する能力が提供され、そして 、本発明の組換え体と接触した作業者に対してあるレベルの安全性が提供される 。したがって、本発明は、宿主に組換えウイルスまたはベクターを投与または接 種することにより、タンパク質を増幅または発現させ、それによって、その宿主 が前記組換えウイルスまたはベクターの自然の宿主ではなく、生産的複製の必要 のない発現がある方法を包含する。 前記外因性または異種ＤＮＡ（またはワクチンウイルスに対して異種のＤＮＡ ）は、列記した、上述した関心のあるエピトープのいずれをコード化するＤＮＡ であっても差し支えない。この点に関して、ボレリア属ＤＮＡについては、米国 特許第5,523,089号、国際特許公間第WO93/08306号、国際特許出願第PCT/US/0869 7号、Molecular Microbiology(1989)，3(4)，479-486，および国際特許公開第WO 93/04175号、並びに国際特許公開第WO96/06165号を参照のこと。これらをここに 引用する。 関心のある肺炎球菌エピトープに関しては、Briles等の国際特許公開第WO92/1 4488号を、腫瘍ウイルスに関しては、Molecular Biology of Tumor Viruses，RN A TUMOR VIRUSES（Second Edition，Edited by Weiss et al.，Cold Spring Har bor Laboratory 1982）(e.g.，page 44 et seq．-Taxonomy of Retroviruses)を 参照のこと。これらをここに引用する。 関心のあるエピトープをコード化するＤＮＡに関しては、ここに引用した文献 、前出と後出の引用文献：例えば、米国特許第5,174,993号および同第5,505,941 号（例えば、組換えアビポッタスウイルス、ワクシニアウイルス；狂犬病糖タン パク質（Ｇ）、遺伝子、シチメンチョウインフルエンザ血球凝集素遺伝子、ｇｐ ５１、ウシ白血病ウイルスの３０外被遺伝子、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤ Ｖ）抗原、ＦｅｌＶ外被遺伝子、ＲＡＶ−１ ｅｎｖ遺伝子、ＮＰ（ニワトリ／ ペンシルバニア／１／８３インフルエンザウイルスのヌデオタンパク質遺伝子） 、感染性気管支炎ウイルスのマトリクスおよびプレプロマー；ＨＳＶ ｇＤ）、 米国特許第5,338,683号（例えば、組換えワクシニアウイルス、アビポックスウ イルス；特にヘルペスウイルス糖タンパク質をコード化するＤＮＡ）、米国特許 第5,494,807号（例えば、組換えワクシニア、アビポックス；特に、狂犬病、Ｂ 型肝炎、ＪＥＶ、ＹＦ、デング熱、麻疹、仮性狂犬病、エプスタイン−バー、Ｈ ＳＶ、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＨＶ、ＢＨＶ、ＨＣＭＶ、イヌパルボウイルス、ウマ インフルエンザ、ＦｅＬＶ、ＦＨＶ、ハンターン、Ｃ．テタニ(tetani)、鳥類イ ンフルエンザ、おたふくかぜ、ＮＤＶをコード化する外因性ＤＮＡ）、米国特許 第5,503,834号（例えば、組換えワクシニア、アビポックス、麻疹ウイルス属、 例えば、特に、麻疹Ｆ、血球凝集素）、米国特許第4,722,848号（例えば、組換 えワクシニアウイルス；特に、ＨＳＶ ｔｋ、ＨＳＶ糖タンパク質、例えば、ｇ Ｂ、ｇＤ、インフルエンザＨＡ、Ｂ型肝炎、例えば、ＨＢｓＡｇ）、イギリス国 特許第2269820B号および米国特許第5,514,375号（組換えポックスウイルス；フ ラビウイルス構造タンパク質）；国際特許公開第WO92/22641号および米国特許出 願第08/417,210号および同第08/372,664号（例えば、組換えポックスウイルス； 特に、免疫不全ウイルス、ＨＴＬＶ）、国際特許公開第WO93/03145号および許可 された米国特許出願第08/204,729号および同第08/303,124号（例えば、組換えポ ックスウイルス；特に、ＩＢＤＶ）、国際特許公開第WO94/16716号および1994年 1月19日に出願さ れた、許可された米国特許出願第08/184,009号（例えば、組換えポックスウイル ス；特に、サイトカインおよび／または腫瘍関連抗原）、米国特許出願第08/469 ,969号（狂犬病組合せ組成物）、米国特許出願第08/746,668号（レンチウイルス 、レトロウイルスおよび／または、特に、ネコ免疫不全ウイルスを含む、免疫不 全ウイルス）、米国特許第5,529,780号および許可された米国特許出願第08/413, 11８号（イヌヘルペスウイルス）、米国特許出願第08/471,025号（ネコカリチウ イルス）、国際特許公開第WO96/3941号および米国特許出願第08/658,665号（サ イトメガロウイルス）、および国際特許出願第PCT/US94/06652号（マラリア原虫 の生活周期の各々の段階からのようなプラスモディウム抗原）を参照のこと。 ワクチンまたは免疫組成物に使用する抗原に関しては、ここに引用した文献に 述べられた文献および議論を参照のこと（例えば、前出の文献を参照のこと）。 また、Stedman's Medical Dictionary(24th edition，1982，e.g.，definition of vaccine)も参照のこと（ワクチン配合物に使用される抗原のリストに関して 、そのような抗原またはそれらの抗原からの関心のあるエピトープは、本発明の 組換えウイルスまたはベクターの発現産物として、または本発明の組換えウイル スまたはベクターもしくはそれからの発現産物を含有する多価組成物中のいずれ かで本発明に使用することができる）。 関心のあるエピトープに関して、当業者は、不必要な実験を行わずに、アミノ 酸およびペプチドまたはポリペプチドの対応するＤＮＡ配列の知識から、並びに 特定のアミノ酸の性質（例えば、サイズ、電荷等）およびコードン辞書から、ペ プチドまたはポリペプチドのエピトープまたは免疫優性領域、それゆえ、その暗 号ＤＮＡを決定することができる。 タンパク質のどの部分を免疫組成物に使用するかを決定する一般的な方法は、 関心のある抗原のサイズおよび配列に焦点を当てている。「一般的に、大きいタ ンパク質は、それらがより多くの潜在的な決定基を有しているので、小さなもの よりも良好な抗原である。抗原かより異種であるほど、すなわち、耐性を誘発す る自己形状と似ていないほど、免疫応答を引き起こす上でより効果的である。」 Ivan Roitt，Essential Immunology，1988。 サイズに関して、当業者は、ウイルスベクター中に挿入すべきＤＮＡ配列によ りコード化されるタンパク質のサイズを最大化させることができる（そのベクタ ーのパッケージング制限を心に留めておくこと）。発現されるタンパク質のサイ ズを最大にしながら、挿入されるＤＮＡを最小にするために、そのＤＮＡ配列は 、イントロン（転写されるが、その結果として一次ＲＮＡトランスクリプトから 切除される遺伝子の領域）を除外することができる。 最小で、前記ＤＮＡ配列は、少なくとも８または９のアミン酸長のペプチドを 暗号化することができる。これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答（ウイルス感染細胞また は癌細胞を認識する）を刺激するためにペプチドが必要とする最小長さである。 13から25までのアミノ酸の最小ペプチド長さは、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答（病原を飲 み込んだ細胞を示す特定の抗原認識する）を刺激するのに有用である。前出のKe ndrewを参照のこと。しかしながら、これらは最小長さであるので、これらのペ プチドは、免疫応答、すなわち、抗体またはＴ細胞応答を産生する傾向にあり、 しかし、防御応答（ワクチン組成物からのような）に関しては、より長いペプチ ドが好ましい。 前記配列に関して、ＤＮＡ配列は、好ましくは、少なくとも、抗体応答または Ｔ細胞応答を産生するペプチドの領域をコード化する。ＴおよびＢ細胞エピトー プを決定する方法の一つには、エピトープ遺伝子図作製がある。関心のあるタン パク質を、タンパク質分解酵素でオーバーラップペプチドに断片化する。次いで 、個々のペプチドを、自然のタンパク質により誘発される抗体に結合する能力も しくはＴ細胞またはＢ細胞の活性化を誘発する能力について試験する。この手法 は、前記Ｔ細胞が、ＭＨＣ分子と複合体を形成した短い線状ペプチドを認識する ので、Ｔ細胞エピトープの遺伝地図作製の際に特に有用であった。この方法は、 Ｂ細胞エピトープはしばしば線状アミノ酸ではなくむしろ折り畳まれた三次元タ ンパク質の三次構造から生じるので、Ｂ細胞エピトープを決定するのにはそれほ ど効果的ではない。Janis Kuby，Immunology，（1992）pp.79-80。 関心のあるエピトープを決定する別の方法は、親水性のタンパク質の領域を選 択することである。親水性残基は、しばしば、そのタンパク質の表面上にあり、 したがって、しばしば、抗体に接触可能なタンパク質の領域である。Janis Kuby ，Immunology，（1992）p.81。 関心のあるエピトープを決定するさらに別の方法は、抗原（全長）−抗体複合 体のＸ線結晶構造解析を行うことである。Janis Kuby，Immunology，（1992）p. 80。 Ｔ細胞応答を生じることのできる関心のあるエピトープを選択するさらに別の 方法は、前記タンパク質配列から、ＭＨＣ分子に結合しやすいことが知られてい るペプチド配列である潜在的なＨＬＡアンカー結合モチーフを同定することであ る。 Ｔ細胞応答を生じる、推定上の関心のあるエピトープであるペプチドは、ＭＨ Ｃ複合体中に表されるべきである。そのペプチドは、好ましくは、前記ＭＨＣ分 子に結合するための適切なアンカーモチーフを含有し、十分に高い結合力で結合 して免疫応答を生じるべきである。考えられる要因としては：免疫化することが 予測される患者（脊椎動物、動物またはヒト）のＨＬＡ種類、適切なアンカーモ チーフの存在および他の生命細胞中のペプチド配列の発生が挙げられる。 免疫応答は、一般的に、以下のように生じる：Ｔ細胞が、タンパク質を、その タンパク質がより小さなペプチドに開裂され、別の細胞の表面上に位置する「主 要組織適合性複合体ＭＨＣ」と呼ばれる複合インビボに提示されたときのみ認識 する。ＭＨＣ複合体には二つのクラス−クラスＩおよびクラスIIがあり、各々の クラスは、多くの異なる対立遺伝子から構成されている。異なる患者は、異なる 種類のＭＨＣ複合体対立遺伝子を有しており、それらは、「異なるＨＬＡ型」を 有すると言われている。 クラスＩのＭＨＣ複合体は、実質的に全ての細胞上に見つかり、その細胞の内 側で産生されたタンパク質からのペプチドを提示する。したがって、クラスＩの ＭＨＣ複合体は、ウイルスに感染したときに、または癌遺伝子の発現の結果とし てガン細胞となったときにその細胞を殺すのに有用である。それら表面にＣＤ８ と呼ばれるタンパク質を有するＴ細胞は、Ｔ細胞受容体を介してＭＨＣクラスＩ ／ペプチド複合体に特異的に結合する。これにより、細胞溶解エフェクター活性 が生じる。 クラスIIのＭＨＣ複合体は、抗原提示細胞上のみに見つかり、それら抗原提示 細胞によりエンドサイトーシスが行われた循環病原からのペプチドを提示するの に用いられる。ＣＤ４と呼ばれるタンパク質を有するＴ細胞は、Ｔ細胞受容体を 介してＭＨＣクラスII／ペプチド複合体に結合する。これにより、免疫応答を刺 激する特定のサイトカインが合成される。 あるタンパク質が、Ｔ細胞応答を刺激する関心のあるエピトープであるかを決 定する上でのガイドラインとして、ペプチド長さか挙げられる。そのペプチドは 、クラスＩのＭＨＣ複合体中に適合するには、少なくとも８または９のアミノ酸 長さ、クラスIIのＭＨＣ複合体中に適合するには少なくとも13-25のアミノ酸長 さであるべきである。この長さは、前記ペプチドが前記ＭＨＣ複合体に結合する のに最小である。細胞が、発現されたペプチドを切断するかもしれないので、そ れらペプチドが、これらの長さよりも長いことが好ましい。前記ペプチドは、そ のペプチドを免疫応答を生じるのに十分に高い特異性で様々なクラスＩまたはク ラスIIの分子に結合させることのできる適切なアンカーモチーフを含有すべきで ある（Bocchia，M．et al，Specific Binding of Leukemia Oncogene Fusion Pr otein Peptides to HLA Class I Molecules，Blood 85:2680-2684;Englehard，V H，Structure of peptides associated with class I and class II MHC molecu les Ann．Rev．Immunol．12:181(1994)）。これは、不必要な実験を行わずに、 関心のあるタンパク質の配列を、ＭＨＣ分子に関連するペプチドの公表されてい る構造と比較することにより行うことができる。Ｔ細胞受容体により認識される タンパク質エピトープは、そのタンパク質分子の酵素分解により生じたペプチド であり、クラスＩまたはクラスIIのＭＨＣ分子に関連する細胞表面上に提示され る。 さらに、当業者は、そのタンパク質配列をタンパク質データベースに列記され た配列と比較することにより、関心のあるエピトープを確認することができる。 さらにまた、別の方法として、単に、関心のあるタンパク質の一部を産生また は発現し、関心のあるタンパク質のその部分に対する単クローン性抗体を産生し 、それらの抗体が、そのタンパク質が由来された病原のインビトロ増殖を阻害す るか否かを確認することがある。当業者は、それに対する抗体がインビトロ増殖 を阻害するか否かの分析のために関心のあるタンパク質の一部を産生または発現 する、この開示および従来技術に述べられた他のガイドラインを用いても差し支 えない。例えば、当業者は：タンパク質の８から９または13から25のアミノ酸長 さ 部分を選択する、親水性領域を選択する、抗原（全長）−抗体複合体のＸ線デー タから結合することが示された部分を選択する、他のタンパク質とは配列の異な る領域を選択する、潜在的なＨＬＡアンカー結合モチーフを選択する、もしくは これらの方法または従来技術で知られている他の方法の組合せにより、関心のあ るタンパク質の一部を産生することができる。 抗体により認識されるエピトープは、タンパク質の表面上に発現される。抗体 応答を最も刺激しそうなタンパク質の領域を決定するために、当業者は、好まし くは、上述した一般的な方法、または従来技術で知られている他の遺伝地図作製 方法を用いて、エピトープの遺伝地図を作製することができる。 上述したことから分かるように、この開示および従来技術の知識から、不必要 な実験を行わずに、当業者は、Ｔ細胞、Ｂ細胞および／または抗体応答を得るた めに、関心のあるエピトープのアミノ酸および対応するＤＮＡ配列を確認するこ とかできる。さらに、1991年5月28日に発行されたGefter等の米国特許第5,019,3 84号およびそれに引用された文献を参照のこと（特に、この特許の「関連する文 献」のセクション、並びに「多数のエピトープが、関心のある様々な生物につい て定義されている。特に、中和抗体が関連するそれらのエピトープに関心が持た れている。そのようなエピトープが、関連する文献のセクションに引用された文 献の多くに開示されている。」ことを開示しているこの特許の第13段落に留意す る）。これらをここに引用する。 生体応答調整物質に関して、1993年9月30日に発行されたWohlstadterの「選択 方法」と題する国際特許公開第WO93/19170号およびそこに引用された文献を参照 のこと。これらをここに引用する。 例えば、生体応答調整物質は、生物活性を調整する。例えば、生体応答調整物 質は、非ＮＭＤＡ興奮性アミノ酸に関連する、ＡＭＰＡ結合の結合性をアロステ リック的に調節する高分子量タンパク質のような調整成分である（Kendrew、前 出参照のこと）。本発明の組換え体は、そのような高分子量タンパク質を発現す ることができる。 より一般的に、自然は、生体応答調整物質の多数の先例を提供している。活性 の調整は、単純な存在／不在系、例えば、発現／分解系に対するアロステリック 誘発された四次変化と同じくらい複雑で込み入った機構により行われるかもしれ ない。実際に、多くの生体分子の発現の抑制／活性は、それ自体、その活性が様 々な機構により調整することのできる分子により媒介されている。 73頁のNeidhardt等のPhysiology of the Bacterial Cell(Sinauer Associates Inc.，Publishers，1990)の表２には、細菌タンパク質に対する化学修飾が列記 されている。その表に示されているように、ある修飾は適切なアセンブリ中に含 まれ、他の修飾は含まれないが、いずれの場合においても、そのような修飾は、 機能を調整することができる。その表から、他の細胞のタンパク質に関する類似 の化学修飾を、不必要な実験を行わずに決定することができる。 ある場合には、生体機能の修飾は、単に、分子の適切／不適切な局在により媒 介されるかもしれない。分子は、それらが特定の位置を対象としている場合のみ に、成長利点または欠点を提供するように機能するかもしれない。例えば、ある 分子は、典型的に、ある細胞により、その分子の機能が、分解に関する酵素の分 泌によってその細胞により最初に分解されるので、摂取されたり、使用されたり しないかもしれない。したがって、組換え体によって酵素が産生されることによ り、細胞による分子の使用または摂取を調節することができる。同様に、その組 換え体は、分子の摂取または使用に必要な前記酵素に結合する分子を発現し、そ れによって、同様にその摂取または吸収を調節することができる。 信号ペプチドの開裂により行われるタンパク質を対象とする局在は、別の種類 の修飾または調節である。この場合、前記組換え体により、特定のエンドプロテ アーゼ触媒活性を発現することができる。 機能の修飾が行われるかもしれない機構の他の例は、ＲＮＡウイルスポリタン パク質、アロステリック効果、および一般的な共有結合と非共有結合の立体障害 である。ＨＩＶは、非機能的ポリタンパク質構築物を発現するＲＮＡウイルスの よく研究された例である。ＨＩＶにおいて、「ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖの ポリタンパク質は、それぞれ、ウイルス構造タンパク質ｐ１７、ｐ２４、および ｐ１５−−逆転写酵素およびインテグラーゼ−−並びに二つの外被タンパク質ｇ ｐ４１およびｇｐ１２０を産生するように処理される」（Kohl et al.，PNSA US A 85:4686-90(1988)）。前記ポリタンパク質の適切な開裂は、ウイルスの複製に とって必須であり、不活性突然変異体ＨＩＶプロテアーゼを担持するウイルス粒 子は非感染性である（同著者）。これは、それらの活性をダウン調節するタンパ ク質の融合の別の例である。したがって、あるタンパク質の自然の発現を阻害ま たは向上させるために（干渉または開裂を向上させることにより）、エンドプロ テアーゼと干渉する、またはエンドプロテアーゼを提供する分子を発現する組換 えウイルスを構築することができる。 酵素の機能的有用さもまた、反応を触媒できるそれらの能力を変更することに より調節されるかもしれない。修飾分子の例としては、チモーゲン、多重サブユ ニット機能的複合体の形成／分解、ＲＮＡウイルスポリタンパク質鎖、アロステ リック相互作用、一般的な立体障害（共有結合および非共有結合）並びにリン酸 化、メチル化、アセチル化、アデニル化、およびウリデニル化のような様々な化 学修飾が挙げられる（前出のNeidhardtの315頁の表１および73頁の表２を参照の こと）。 チモーゲンは、酵素活性の調節を行う天然に生じるタンパク質融合の例である 。チモーゲンは、制限されたタンパク質分解により活性状態に転化されるタンパ ク質の一つのクラスである。Reich，Proteases and Biological Control，Vol.2 （1975）at page 54の表３を参照のこと。自然は、トリプシンのようなある酵素 の活性をダウン調節する機構を、アミノ末端に追加の「リーダー」ペプチド配列 を有するこれら酵素で発現することにより発生させている。余分なペプチドによ り、その酵素は、不活性チモーゲン状態にある。この配列が開裂されることによ り、このチモーゲンは、酵素活性状態に転化される。このチモーゲンの全体の反 応速度は、「対応する酵素のものの約10⁵−10⁶倍も遅い」（前出のReichの54頁 の表３を参照のこと）。 したがって、単に、その末端の一つにペプチド配列を追加することにより、あ る酵素の機能をダウン調節することができる。例えば、この特性の知識により、 組換え体は、一方または両方の末端に追加のアミノ酸を含有するペプチド配列を 発現することができる。 多重サブユニットの酵素の形成または分解は、調節が行われるかもしれない別 の方法である。異なる機構が、多重サブユニット酵素の形成または分解の際に活 性の調節の原因であるかもしれない。 したがって、適切な特定のサブユニット相互作用を立体的に妨げることにより 、その酵素活性がダウン調節される。したがって、本発明の組換え体は、生体機 能を調節するように、天然に生じる酵素または酵素複合体を立体的に妨げる分子 を発現することができる。 ある酵素阻害因子は、共有結合立体障害または修飾により、機能的ダウン調節 の良好な例を与える。活性部位において触媒的に重要なアミノ酸で酵素の活性部 位に不可逆的に結合する自殺（suicide）基質は、酵素活性部位を立体的に遮断 する共有結合修飾の例である。自殺基質の例は、キモトリプシンのＴＰＣＫであ る（Fritsch，Enzyme Structure and Mechanism，2nd ed;Freeman & Co．Publis hers，1984）。この種の修飾は、適切な自殺基質を発現し、それによって、生体 応答を調節する組換え体により機能である（例えば、酵素活性を制限することに より）。 多くの抑制因子分子を含む非共有結合立体障害の例もある。本発明の組換え体 は、立体的に妨げることかでき、したがって、特定のＤＮＡ−ＲＮＡポリメラー ゼ相互作用を妨げることによりＤＮＡ配列の機能をダウン調節することのできる 抑制因子分子を発現することができる。 アロステリック効果は、ある生体系で修飾が行われる別の方法である。アスパ ラギン酸トランスカルバモイラーゼは、よく特徴付けられたアロステリック酵素 である。調節領域は、触媒サブユニットと相互作用する。ＣＴＰまたはＵＴＰに 結合することにより、その調節サブユニットは、ホロ酵素内の四次構造変化を誘 発して、触媒活性のダウン調節を行うことができる。これとは対照的に、ＡＴＰ が調節サブユニットに結合すると、触媒活性のアップ調節を行うことができる（ Fritsch、前出）。本発明の方法を使用することにより、結合し、調節の四次ま たは三次変化を生じることのできる分子を発現することができる。 さらに、様々な化学修飾、例えば、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニ ル化、およびウリデニル化が、機能を調節するように行われるかもしれない。こ れらのような修飾が、多くの重要な細胞成分の調節において重要な役割を果たす ことが知られている。前出のNeidhardtの73頁の表２には、そのような修飾を受 け る異なる細菌酵素が列記されている。そのリストから、当業者は、同一または同 様の修飾を受ける他の系の他の酵素を不必要な実験を行わずに確認することがで きる。さらに、ヒトの病気に関連する多くのタンパク質もそのような化学修飾を 受ける。例えば、多くの癌遺伝子が、リン酸化により修飾される、またはリン酸 化または脱リン酸化により他のタンパク質を修飾することが分かった。したがっ て、本発明により与えられる、機能を調節または変更できる調整物質、例えば、 リン酸化を発現する能力は重要である。 上述したことから、当業者は本発明を用いて、不必要な実験を行わずに、生体 応答調整物質を発現することができる。 本発明の組換え体による融合タンパク質の発現に関して、Sambrook，Fritsch ，Maniatis，Molecular Cloning，A LABORATORY MANUAL（2d Edition，Cold Spr ing Harbor Laboratory Press，1989）(especially Volume 3)，およびKendrew 、前出を参照のこと。これらをここに引用する。Sambrook等の教示は、この開示 から、不必要な実験を行わずに、当業者が融合タンパク質を発現する組換え体ま たはベクターを産生するために適切な変更しても差し支えない。 遺伝子療法および免疫療法に関して、米国特許第4,690,915号および同第5,252 ,479号とそこに引用されている文献、並びに国際特許公開第WO94/16716号および 1994年1月19日に出願された米国特許出願第08/184,009号とそこに引用された文 献を参照のこと。これらをここに引用する。 成長因子は、組織および機能の個体発生および維持の両方を制御する、多機能 性の局所的に作用する細胞間信号ペプチドとして定義することができる（前出の Kendrew、特に455頁以下を参照のこと）。 この成長因子または治療遺伝子は、例えば、闘病（desease-fighting）タンパ ク質、癌を治療する分子、腫瘍抑制遺伝子、サイトカイン、腫瘍関連抗原、また はインターフェロンをコード化することができ；その成長因子または治療遺伝子 は、例えば、アルファグロブリン、ベータグロブリン、ガンマグロブリンをコー ド化する遺伝子、顆粒細胞マクロファージ−コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、 インターロイキン（例えば、インターロイキン１から14、または１から11、もし くはそれらの組合せから選択されるインターロイキン）、マクロファージコロニ ー刺激因子、顆粒細胞コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、肥満細胞成長因 子、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３、網膜芽細胞腫、インターフェロン、メラノーマ関連 抗原またはＢ７からなる群より選択することができる。米国特許第5,252,479号 には、遺伝療法のためにアデノウイルス系内で発現できるタンパク質のリストが 提供されており、当業者にはその開示が分かる。国際特許公開第WO94/16716号お よび1994年1月19日に出願された許可された米国特許出願第08/184,009号は、サ イトカインおよび腫瘍関連抗原の遺伝子並びに半ビボ方法を含む免疫療法の方法 を提供するものであり、当業者には、その開示が分かる。 したがって、当業者は、不必要な実験を行わずに、この開示および従来技術の 知識から、成長因子または治療遺伝子を発現する組換え体またはベクターを産生 し、その組換え体またはベクターを使用することができる。 さらに、上述したことおよび従来技術の知識から、当業者が、関心のあるエピ トープ、生体応答調整物質、成長因子、認識配列、治療遺伝子、または融合タン パク質を発現する本発明の組換え体またはベクターを構築する、もしくは、当業 者がそのような組換え体またはベクターを使用するのには、不必要な実験は必要 ない。 本発明の組換え体またはベクターは、インビトロで遺伝子産物を発現するのに 用いることができるので、タンパク質精製技術を本発明の実施に用いても差し支 えなく、そのような技術は一般的に、以下を含む。 手短に言うと、細胞を分裂させ、関心のあるタンパク質を水性「抽出物」中に 放出する。細胞を崩壊させる方法は数多くあり、それらの方法は、比較的穏やか な条件から激しい条件にまで亘り、方法の選択は供給材料に依存する。動物組織 は、非常に壊れやすい赤血球から、血管および他の平滑筋組織中に見られるよう な丈夫な膠原材料にまで及ぶ。細菌は、消化酵素または浸透圧衝撃により壊れる ことのあるかなり脆い微生物から、崩壊のために激しい機械的処理を必要とする 、厚い細胞壁を有するより弾性力のある種までに及ぶ。 穏やかな技術としては、細胞溶解、酵素消化、化学的可溶化、手動の均質化お よびきざみ（または粉砕）が挙げられ；細胞崩壊の中位の技術としては、羽根均 質化および研磨材料、すなわち、砂またはアルミナによる研磨が挙げられ；激し い技術としては、フレンチプレス、超音波、ビーズミルまたはManton-Gaulinの 均質化が挙げられる。上述した技術の各々が従来技術で認識されており、出発材 料、並びにこの中と従来技術の教示に基づいて、細胞崩壊の適切な方法を決定す るには、当業者の知識の範囲内にある。 細胞崩壊後に、不溶性材料を遠心分離して除くことにより、抽出物を調製する 。この段階で、関心のあるタンパク質をできるだけ多く含有する抽出物が調製さ れ、適切な場合には、微粒子およびほとんどの非タンパク質材料が除去されてい るので、精製方法を行ってもよい。 様々な塩濃度での関心のあるタンパク質の溶解性を用いることによる沈殿、有 機溶剤、高分子および他の材料による沈殿、親和性沈殿および選択的変性；高速 液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換、アフィニティー、イムノア フィニティーまたは色素−リガンドクロマトグラフィーを含むカラムクロマトグ ラフィー；イムノプレシピテーションおよびゲル濾過の使用、電気泳動法、限外 濾過および等電点電気泳動法を含む、タンパク質精製の標準技術を用いて、関心 のあるタンパク質をさらに精製してもよい。上述した方法の各々か当業者の知識 に含まれ、上述したものと文献に概説した標準的方法論、並びに以下の実施例の 教示を用いて、本発明の組換え体またはベクターの発現から関心のあるエピトー プまたはタンパク質を精製するのに不必要な実験は必要ない。 発現産物は抗原、免疫、または防御（ワクチン）応答を提供できるので、本発 明はさらに、それからの産生物、すなわち、抗原およひその使用に関するもので ある。特に、前記発現産物は、それら産物の投与またはそれら産物を発現する組 換え体またはベクターの投与により抗体を誘発することができる。その抗体は、 単クローン性抗体であって差し支えなく、抗体または発現産物は、キット、アッ セイ、試験および結合を含む同等物に用いることができ、したがって、本発明は 、これらの使用にも関する。さらに、本発明の組換え体またはベクターを用いて 、ＤＮＡを複製することができるので、本発明は、ベクターとしての本発明の組 換え体、および細胞をその組換え体に感染またはトランスフェクションさせ、そ こからＤＮＡを収穫することによりＤＮＡを複製する方法に関するものである。 得られたＤＮＡは、プローブまたはプライマーとしてまたは増幅に用いることが で きる。 本発明の組換え体またはベクターまたはそれからの発現産物、免疫、抗原また はワクチン組成物もしくは治療組成物のような本発明の組成物の投与方法は、非 経口経路（皮内、筋肉内または皮下）によるものであって差し支えない。そのよ うな投与により、全身の免疫応答が可能となる。投与は、粘膜経路、例えば、経 口、鼻、陰部等によるものであって差し支えない。そのような投与により、局所 的免疫応答が可能となる。 より一般的に、本発明の抗原、免疫またはワクチン組成物または治療組成物は 、薬剤、医学または獣医学の当業者によく知られた標準技術に従って調製するこ とができる。そのような組成物は、特定の患者の品種または種属、年齢、性別、 体重、および状態、並びに投与経路のような要因を考慮に入れて、医学または獣 医学の当業者によく知られた技術により、所定の投与量で投与することができる 。それら組成物は、単独で投与しても差し支えなく、もしくは本発明の他の組成 物とともに、または他の免疫、抗原またはワクチンまたは治療組成物とともに、 同時にまたは続いて投与しても差し支えない。そのような他の組成物は、精製さ れた天然の抗原またはエピトープ、または本発明の組換え体またはベクターもし くは別のベクター系による発現からの精製された抗原またはエピトープを含み、 上述した要因を考慮に入れて投与される。 本発明の組成物の例としては、懸濁液、シロップまたはエリキシルのような、 開口部、例えば、口、鼻、肛門、陰部、例えば、膣等の投与のための液体製剤； 無菌懸濁液または乳濁剤のような、非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈投与 （例えば、注射）のための製剤が挙げられる。そのような組成物において、前記 組換え体またはベクターは、無菌水、生理食塩水、グルコース等のような、適切 なキャリヤ、希釈剤、または賦形剤との混合物内にあってよい。 抗原、免疫またはワクチン組成物は、典型的に、アジュバントおよび所望の応 答を誘発する量の前記組換え体またはベクターもしくは発現産物を含有すること ができる。ヒトを対象とする用途において、ミョウバン（リン酸アルミニウムま たは水酸化アルミニウム）が典型的なアジュバントである。サポニンとその精製 成分であるQuil A、フロイント完全アジュバントおよび研究および獣医学用途で 用いられている他のアジュバントは、ヒト用のワクチンへの潜在的な使用を制限 する毒性を有している。ムラミルジペプチドのような化学的に定義された製剤、 モノホスホリルリピドＡ、Goodman-Snitkoff et al．J．Immunol．147:410-415( 1991)により記載され、ここに引用されるもののようなリン脂質、Miller et al. ，J．Exp．Med．176:1739-1744(1992)により記載され、ここに引用されるような プロテオリポソーム内の前記タンパク質の被包、およびNovasome（商標）リピド 小胞（ニューハンプシャー州、ナシュアのMicro Vescular Systems，Inc.,）の ようなリピド小胞中の前記タンパク質の被包を用いても差し支えない。 前記組成物は、非経口（すなわち、筋肉内、皮内または皮下）投与または開口 部投与、例えば、舌下（すなわち、口）、胃内、口内、肛門内、膣内を含む粘膜 等の投与による免疫化のために一回の供与量の形態で包装してもよい。再度、効 果的な供与量および用途経路は、前記組成物の性質により、前記発現産物の性質 により、前記組換え体が直接用いられる場合の発現レベルにより、そして、宿主 の品種または種属、年齢、性別、体重、状態および性質のような既知の要因、並 びにＬＤ₅₀および知られている他のスクリーニング方法により決定され、不必要 な実験を必要としない。発現産物の供与量は、数マイクログラムから数百マイク ログラム、例えば、５μｇから500μｇまでに亘っても差し支えない。本発明の 組換え体またはベクターは、これらの供与量レベルでの発現を達成するのに適し た量で投与することができる。本発明のウイルス組換え体は、約10^3.5ｐｆｕの 量で投与することができる。そして、本発明のウイルス組換え体は、好ましくは 、少なくともこの量で；より好ましくは、約10⁴ｐｆｕから約10⁶ｐｆｕまでの量 で投与される。しかしながら、約10⁴ｐｆｕから約10¹⁰ｐｆｕまで、例えば、約1 0⁵ｐｆｕから約10⁹ｐｆｕまで、例えば、約10⁶ｐｆｕから約10⁸ｐｆｕまでのよ うなより高い供与量を用いても差し支えない。プラスミドまたは裸ＤＮＡ組成物 中の本発明のプラスミドまたは裸ＤＮＡの適切な量は、１μｇから100ｍｇ、好 ましくは、0.1ｍｇから10ｍｇまでであるが、0.1ｍｇから２ｍｇまでまたは好ま しくは1-10μｇのようなより低いレベルを用いてもよい。他の適切なキャリヤま たは希釈剤は、防腐剤の有無にかかわらず、水または緩衝生理食塩水であって差 し支えない。前記発現産物または組換え体もしくはベクターは、投与時に再懸濁 のために凍結 乾燥されていてもよく、または溶液状態であっても差し支えない。 前記キャリヤは、高分子により放出が遅延される系であってもよい。合成高分 子は、放出の制御された組成物を配合するのに特に有用である。この初期の例は 、Kreuter，J.，Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacol ogy，M．Donbrow(Ed)．CRC Press，P.125-148に報告されている、１ミクロン未 満の直径を有する球体中にメタクリル酸メチルを重合させて、ナノ粒子を形成す ることであった。 微小被包は、微小被包された薬剤の注射に適用されて、放出を制御してきた。 多数の要因が、微小被包のための特定の高分子の選択に寄与する。高分子合成お よび微小被包方法の再現性、微小被包材料および方法のコスト、毒性学の概要、 変動性の放出運動学の必要条件および前記高分子と抗原との物理化学的相溶性が 、考慮しなければならない全ての要因である。有用な高分子の例としては、ポリ カーボネート、ポリエステル、ポリウレタン、ポリオルトエステルおよびポリア ミド、特に、生分解性のものが挙げられる。 薬剤用の、ごく最近には、抗原用のキャリヤとして、ポリ（ｄ，１−ラクチド −コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）が頻繁に選択される。これは、受食性(erodibl e)縫合、骨板および毒性を示していない他の一時的人工装具における医学用途に 長い歴史のある生分解性ポリエステルである。ペプチドおよび抗原を含む様々な 薬剤がＰＬＧＡマイクロカプセル中に配合されてきた。例えば、Eldridge，J.H. ，et al．Current Topics in Microbiology and Immunology，1989，146:59-66 により概説されているように、抗原の制御された放出へのＰＬＧＡの適用につい て多数のデータが蓄積されている。直径が１から10ミクロンまでのＰＬＧＡ微小 球体中への抗原の捕捉には、口から投与を行うときに著しいアジュバント効果が あることが示された。このＰＬＧＡ微小被包方法では、油中水型乳剤の相分離を 用いている。関心のある化合物を水溶液として調製し、ＰＬＧＡを塩化メチレン および酢酸エチルのような適切な有機溶剤中に溶解させる。これら二つの不混和 性溶液は、高速撹拌により共に乳化される。次いで、高分子の非溶剤を加え、水 性液滴の周りにこの高分子を析出させて、胚体マイクロカプセルを形成する。こ のマイクロカプセルを採集し、試薬（ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ゼラチ ン、 アルギン酸塩、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、メチルセルロース）の組合せ のうちの一つにより安定化させ、真空乾燥または溶剤抽出のいずれかにより、溶 剤を除去する。 このように、固体含有液体を含む、固体、液体、およびゲル（「ゲルキャップ 」を含む）組成物が考えられる。 さらに、本発明のベクターまたは組換え体は、所望の免疫化または投与処方； 例えば、獣医学の従来技術におけるような毎年のワクチン接種またはヒトの医学 の従来技術におけるような周期的なワクチン接種のような周期的なワクチン接種 の一部として、もしくは本発明のベクターまたは組換え体が、関心のある同一ま たは異なるエピトープの、またはそのような関心のある同一または異なるエピト ープを発現する組換え体またはベクター（そのような関心のある同一または異な るエピトープを発現する本発明の組換え体またはベクターを含む）の投与の前後 いずれかに投与される最初の追加免疫処方に用いることかできる。例えば、米国 特許出願第08/746,668号のようなここに引用されている文献を参照のこと。 さらに、本発明のベクターまたは組換え体並びにそれからの発現産物は、動物 中に免疫または抗体応答を刺激することができる。従来技術でよく知られた技術 により、それらの抗体から単クローン性抗体を調製することができ、それらの単 クローン性抗体を既知の抗体結合アッセイ、診断キットまたは試験に用いて、抗 原の存在または不在、そしてそれよりその抗原の天然の原因物質の存在または不 在を決定する、もしくはその物質または抗原に対する免疫応答が単に刺激された か否かを決定することができる。 単クローン性抗体は、ハイブリドーマ細胞により産生された免疫グロブリンで ある。単クローン性抗体は、一つの抗原決定基と反応し、従来の血清由来抗体よ りも優れた特異性を提供する。さらに、多数の単クローン性抗体をスクリーニン グすることにより、所望の特異性、結合活性およびイソタイプを有する個々の個 体を選択することが可能になる。ハイブリドーマ細胞系統は、化学的に同一の抗 体の一定の安価な供給源を提供し、そのような抗体の調製は、容易に標準化する ことができる。単クローン性抗体を産生する方法は、当業者、例えば、1989年4 月1日に発行された、Koprowski，H.等の米国特許第4,196,265号によく知られて いる。 この特許をここに引用する。 単クローン性抗体を使用することが知られている。そのような使用の一つは、 診断方法、例えば、1983年3月8日に発行された、David，G.およびGreene，H.の 米国特許第4,376,110号によるものがある。この特許をここに引用する。 単クローン性抗体は、免疫吸着クロマトグラフィー、例えば、Milestein，C. ，1980，Scientific American 243:66，70による材料に回収にも用いられてきた 。この文献をここに引用する。 さらに、本発明の組換え体またはベクターもしくはそれからの発現産物を用い て、患者に続いて自己輸血するために、インビトロまたは半ビボで細胞中の応答 を刺激するのに使用することができる。その患者が血清反応陰性である場合には 、その自己輸血は、免疫応答、例えば、活性免疫化のような免疫または抗原応答 を刺激する。血清反応陽性である個体においては、その自己輸血は、病原に対す る免疫系を刺激または追加免疫する。 本発明の組換え体またはベクターは、ハイブリッド可能なＤＮＡの存在または 不在を検出するまたはＤＮＡを増幅する、例えば、試料中の病原を検出するのに 使用できるＰＣＲプライマーのまたはプローブのＤＮＡを産生するのに、または ＤＮＡを増幅するのに有用である。複製に必要なウイルスタンパク質を産生する ために、ウイルスにはウイルスｍＲＮＡの翻訳が必要であるので、感染細胞中の ＰＫＲの作用を遮断する機能には、ウイルスタンパク質の発現に正の効果がある ことが明白である。したがって、前記ワクシニアＥ３Ｌ／Ｋ３Ｌ遺伝子産物、も しくはＥ３Ｌおよび／またはＫ３Ｌの相同体の同一様式の共発現(co-expression )により、一般的なベクターにより、異種遺伝子産物の発現レベルを向上させる 一般機構が提供されるかもしれない。Ｅ３Ｌ／Ｋ３Ｌまたは同種機能は、天然抗 ＰＫＲ機構を向上または増大させ、したがって、タンパク質の発現レベルおよび ／または持続性を増大させる。これにより、免疫化ビヒクルのような真核ウイル ス系の効率を最適化することに対する有用な要素が提供される。この手法はさら に、ＤＮＡベースの免疫原、例えば、裸ＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡベクター 系の改良にまで拡大しても差し支えない。さらに、転写因子、例えば、初期およ び／または後期ウイルス転写因子のヌクレオチド配列を用いることを、翻訳因子 のヌ クレオチド配列を用いることにより翻訳を向上させることと組み合わせると、転 写および翻訳を増大または向上させることにより、発現を向上または増大させる ことができる。したがって、発現のレベルまたは残存率を増大または向上させる ことができる。 本発明およびその多くの利点が、図面により与えられた以下の非制限実施例か らよりよく理解される。 実施例 実施例１−Ｈ４Ｌを含有するＮＹＶＡＣ組換え体 プラスミドｐｌａｃＺＨ６Ｈ４ＬおよびｐｌａｃＺＨ６Ｈ４Ｌｒｅｖｅｒｓｅ （ＡＴＣＣ寄託番号）を、レスキューウイルスｖＰ９９４（ＡＴＣＣ寄託番号； ここに引用した米国特許第5,494,807号；ワクシニアＨ６プロモータ／ＨＴＶ１ ＮＭ env-noncleavable，secreted gp140，in HA insertion site）とのイン ビボ組換えの供与体プラスミドとして用いた。これらの供与体プラスミドは、同 種組換えにより、Ｈ４Ｌの暗号配列および異種プロモータを置換するように設計 した。得られた組換えウイルスは、ｖＰ１３７９およびｖＰ１３８０と称した。 ｖＰ１３７９は、頭対頭の形状でＨ６ｌａｃＺ／Ｈ６Ｈ４Ｌカセットを含有し、 ｖＰ１３８０は、頭対尾の形状でＨ６ｌａｃＺ／Ｈ６Ｈ４Ｌを含有する（配列番 号；図１）。 前記プラスミドを以下のように構築した：Ｈ４Ｌ発現カセット Goebel等,1990におけるように非線状構造にされたＨ４Ｌオープンリーディン グフレーム（ｏｒｆ）は、コペンハーゲン（ワクチン）株ワクシニアウイルスゲ ノム配列中の位置94830-92446に対応している。ｐＳＤ４０４ＶＣは、ｐＵＣベ クターのバックグラウンド中に挿入されたコペンハーゲンワクシニアウイルスの 8.6ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ Ｈ断片を含有している。ｐＳＤ４０４ＶＣを、Ｐｖ ｕＩＩで消化し、前記Ｈ４Ｌ暗号配列および隣接(flanking)配列を含有する3860 ｂｐ断片を単離した。この3860ｂｐ断片をｐＢＳｅｃｏｇｐｔ（ｐＢＳ ＳＫベ クター中のコペンハーゲンの制御下にある大腸菌ｇｐｔ遺伝子（ＡＴＣＣ番号37 145）（Stratagene La Jolla，CA.））の鈍端にされたＢａｍＨＩ部位中に挿入 し、プ ラスミドｐＲＷ９３５を得た。 ｐＲＷ９３５をＥｃｏＲＩで線状にし、ＤｒａＩで部分的に消化して、Ｈ４Ｌ 暗号配列の５’末端を含有する970ｂｐの断片を除去した。一連のポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、Ｈ４Ｌ暗号配列を再度操作して、修飾ワクシニア Ｈ６プロモータの制御下においた（Perkus等1989）。ＰＣＲ増幅において、プラ スミド鋳型ｐＲＷ９３５およびプライマー対ＲＷ５００／ＲＷ５０２とＲＷ５０ １／ＲＷ５０３を用いて、５’Ｈ４Ｌ配列を再生した。さらに、オリゴヌクレオ チドＲＷ５０２が、前記予測したアミノ酸配列を変更せずに、Ｈ４Ｌ暗号配列（ ＡＴＧのＡから位置341-348）をＴＴＴＴＴＴＴＴからＴＴＴＴＣＴＴＣに修飾 して、初期転写停止信号を除去した（Yuan,L．and Moss，B.，1987）。前記修飾 Ｈ６プロモータを、オリゴヌクレオチドＲＷ５０４およびＲＷ５０７を用いてプ ラスミド鋳型ｐＲＷ９３６から増幅した。相補配列を有するオリゴヌクレオチド ＲＷ５０５およびＲＷ５０６を直接的にＰＣＲ増幅した。四つのＰＣＲ反応をプ ールし、プライマー対ＲＷ５００およびＲＷ５０５を用いてさらに増幅した。得 られたＰＣＲ断片をＤｒａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＤｒａＩおよびＥｃｏ ＲＩで消化したｐＲＷ９３５中にクローニングして、ｐＲＷ９３９を産生した。 ｐＲＷ９３９の暗号領域の５’末端におけるＰＣＲ導入による誤りを修正して、 プラスミドｐＲＷ９４７を得た。具体的には、ｐＲＷ９３９中に導入されたＰＣ Ｒ誤り（Ｈ４Ｌコードン１５５はＡＡＡであり、正しいコードンはＧＡＡである べきである）は、600ｂｐのｐＲＷ９３９ ＡｆＩＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、 ｐＲＷ９３５からの同等の断片と置き換えることにより修正して、ｐＲＷ９３９ を産生した。上述のように同定したオリゴヌクレオチド（ＲＷ５００およびＲＷ ５０１からＲＷ５０７；配列番号：）の各々のオリゴヌクレオチド配列は以下の とおりである： プラスミドｐＲＷ９４７をＸｈｏＩで消化して、二つの断片を産生した。ｐＢ ＳＳＫベクターのバックグラウンド中にＨ６促進（promoted）Ｈ４Ｌを含有する 7036ｂｐの断片を精製し、自己ライゲーションして、プラスミドｐＨ６Ｈ４Ｌを 得た。ワクシニアＨ６プロモータの制御下でＬａｃＺ発現カセットを含有するプ ラスミドｐＲＷ９７３ＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断した。この3.3Ｋｂｐの断片を 精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ消化されたｐＨ６Ｈ４Ｌ中にライゲーションし、それに よって、ｐＬＡＣＺＨ６Ｈ４Ｌｒｅｖｅｒｓｅ（頭対尾の形態にあるＨ６促進Ｌ ａｃＺおよびＨ６促進Ｈ４Ｌ遺伝子）、およびｐｌａｃＺＨ６Ｈ４Ｌ（頭対頭の 形態にあるＨ６促進ｌａｃＺ遺伝子およびＨ６促進Ｈ４Ｌ遺伝子）を産生した。実施例２−ＡＬＶＡＣ組換え体 ｐＭＰＣ６Ｈ６Ｋ３Ｅ３（ＡＴＣＣ番号）をレスキューウイルスｖＣＰ２０５ （ＡＴＣＣ番号；米国特許出願第08/417,210号、これをここに引用する；ＨＩＶ 発現カセット−ワタシニアＨ６プロモータ／ＨＩＶ切形ｅｎｖ ＭＮ株、ＡＬＶ ＡＣ Ｃ３挿入部位にプロテアーゼを有するＩ３Ｌｇａｇ）とのインビボ組換え において供与体プラスミドとして用い（Piccini等，1987）、得られた組換え体 をｖＣＰ１４３１Ａ（Ｃ６遺伝子座におけるＥ３Ｌカセットおよびワクシニ アＨ６／Ｋ３Ｌ）と称した。 ｐＣ８Ｈ６Ｈ４をｖＣＰ２０５とのインビボ組換えにおける供与体プラスミド として用い、得られた組換えウイルスをｖＣＰ１４３５（Ｃ３遺伝子座でのＨＩ ＶカセットおよびＣ８遺伝子座でのワクシニアＨ６／Ｈ４Ｌ発見カセット；図２ に示したＡＬＶＡＣ Ｃ８挿入部位配列（配列番号： ）が隣接したＨ６／Ｈ４ Ｌ発現カセット）と称した。 ｖＣＰ１４３１Ａも、プラスミドｐＣ８Ｈ６Ｈ４を用いたインビボ組換えにお けるレスキューウイルスとして用いて、ｖＣＰ１１４３７Ａ（Ｃ３遺伝子座での ＨＩＶカセット、Ｃ６遺伝子座でのＨ６／Ｋ３ＬおよびＥ３Ｌカセット、および Ｃ８遺伝子座でのワタシニアＨ６／Ｈ４Ｌカセット）と称する組換え体を産生し た。ＡＬＶＡＣ Ｃ６挿入部位配列が隣接した外因性プロモータを有するワクシ ニアＥ３Ｌ遺伝子およびＨ６／Ｋ３Ｌ発現カセットについて、図３（配列番号： ）を参照のこと。 ｐＣ３Ｈ６ＦＨＶＢ（ＡＴＣＣ番号； 図５の配列番号： ；ＡＬＶＡＣ Ｃ３遺伝子座の左および右のアームが隣接した５’および３’末端両方で初期転 写および翻訳停止信号を有するＨ６促進ＦＨＶ ｇＢオープンリーディングフレ ーム）をＡＬＶＡＣ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２５４７）とのインビボ組換えに用い て、ｖＰ１４５９（脱オープンリーディングフレームされたＣ３挿入遺伝子座に おけるＨ６促進ＦＨＶ ｇＢ発現カセット）を産生した。二つの内部Ｔ₅ＮＴモ チーフが突然変異誘発されているＦＨＶ−１ ｇＢ暗号領域に関しては、図４（ 配列番号： ）を参照のこと。 ｐＣ３Ｈ６ＦＨＶＢをｖＣＰ１４３１Ａとのインビボ組換えで用いて、ｖＣＰ １４６０（脱オープンリーディングフレームされたＣ３挿入遺伝子座におけるＨ ６促進ＦＨＶ ｇＢ発現カセットおよびＣ６遺伝子座におけるワクシニアＥ３Ｌ ／Ｋ３Ｌ遺伝子）を産生した。 ｐＣ３Ｈ６ＦＨＶＢをｖＣＰ１４３７とのインビボ組換えで用いて、ｖＣＰ１ ４６４（脱オープンリーディングフレームされたＣ３挿入遺伝子座におけるＨ６ 促進ＦＨＶ ｇＢ発現カセット、Ｃ６遺伝子座におけるワクシニアＥ３Ｌ／Ｋ３ Ｌ遺伝子およびＣ８遺伝子座におけるＨ６促進ワクシニアＨ４Ｌオープンリーデ ィングフレーム）を産生した。 ｐＭＰＣ５Ｈ６ＰＮ（ＡＬＶＡＣ Ｃ５遺伝子座におけるＨＩＶ ｐｏｌ／ｎ ｅｆ「一連のビーズ（string of beads）」カセット）をｖＣＰ２０５との組換 えに用いて、ｖＣＰ１４３３（ＡＴＣＣ寄託番号 ）を得た。このようにして、 Ｃ５として知られている挿入部位で、既知のＰｏｌ ＣＴＬエピトープの全て（ Nixson and McMichael;1991）および既知のヒトＮｅｆ ＣＴＬエピトープの全 てを含有する合成ポリペプチドをコード化する発現カセットをｖＣＰ２０５中に 挿入することにより、組換え体ＡＬＶＡＣ−ＭＮ１２０ＴＭＧＮＰｓｔ（ｖＣｐ １４３３）を産生した。 ｐＭＰＣ６Ｈ６Ｋ３Ｅ３（ＡＴＣＣ寄託番号 ；ＡＬＶＡＣ Ｃ６挿入部位配 列が隣接した外因性プロモータを有するワクシニアＥ３Ｌ遺伝子およびワクシニ アＨ６／Ｋ３Ｌ発現カセットを含有する）をｖＣＰ１４３３との組換えに用いて 、ｖＣＰ１４５２を得た。図６および７が、ｖＣＰ１４３３およびｖＣＰ１４５ ２挿入物のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示している。図８は、ｖＣＰ１４ ５２におけるＣ６中のＫ３Ｌ Ｅ３Ｌを示している。ｖＣＰ１４５２は、ＩＩＩ Ｂ単離体由来のＨＩＶ１型ｇａｇおよびプロテアーゼ遺伝子、ＭＮ単離体由来の ｇｐ１２０エンベロープ配列、およびＨＩＶ−１ ＮｅｆおよびＰｏｌからの既 知のヒトＣＴＬエピトープを包含するポリペプチドをコード化する配列（Ｎｅｆ １およびＮｅｆ２ ＣＴＬエピトープ、およびＰｏｌ１、Ｐｏｌ２およびＰｏｌ ３ ＣＴＬエピトープ）を含有している。この発現されたｇｐ１２０部分は、外 被糖タンパク質の膜内外（ＴＭ）アンカー配列（28アミノ酸）に連結されている 。ＨＩＶ暗号配列に加えて、ｖＣＰ１４５２は、Ｃ６部位に挿入されたワクシニ アウイルスＥ３ＬおよびＫ３Ｌ暗号配列を含有している。この構築物の挿入部位 およびプロモータ結合が以下の表に示されている。 ｖＣＰ３００は、米国特許出願第08/417,210号に記載されているように、ＨＩ Ｖｇｐ１２０ＴＭ（ＭＮ）、ｇａｇ／ｐｒｏ（ＴＩＩＢ）（Ｃ３遺伝子座）、Ｎ ｅｆ（Ｃ６遺伝子座）、およびＰｏｌ（Ｃ５遺伝子座）を含有するＡＬＶＡＣ組 換え体である。この出願をここに引用する。 これらの組換え体を調製するプラスミドを以下のように調製した：ＡＬＶＡＣ中へのワクシニアＨ４Ｌ発現カセット プライマー対Ｈ４ＡおよびＨ４Ｂを用いて、ｐＢＡＭＭ１１．６（ｐＢＳＳＫ ベクターバックグラウンド中のＡＬＶＡＣ１１．６ｋｂ ＢａｍＨＩ Ｍ断片） からの900ｂｐ断片を増幅し、プライマー対Ｈ４ＣおよびＨ４Ｄ（配列番号： ）を用いて、ｐＢＡＭＭ１１．６からの940ｂｐ断片を増幅することにより、ｐ ＣＰＭ６ＬＤＥＬを産生した。 増幅からのＰＣＲ産物およびプライマー対Ｈ４ＡとＨ４Ｄを用いた融合ＰＣＲ反 応により、1840ｂｐのＰＣＲ融合断片を得て、次いで、これを配列を確認するた めに、Ｔ／Ａクローニングベクター中にクローニングした。この配列は、位置80 54でＰＣＲ欠失を有することが分かった。前記1840ｂｐ断片を、ＢａｍＨＩによ る消化により、このＴ／Ａベクターから除去した。次いで、この断片をＢａｍＨ Ｉ消化されたｐＢＳＳＫ ΔＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩベクター中にクローニングし た。前記欠失は、前記構築物をＨｉｎｄＩＩＩで消化して、右アームの250ｂｐ 断片を除去し、再度ライゲーションして、ｐＣＰＭ６ＬＤＥＬを得ることにより 修 復した。 ｐｌａｃＺＨ６ＬｒｅｖｅｒｓｅをＰｓｐＡＩおよびＡｓｐ７００で消化して 、Ｈ６プロモータおよびＨ４Ｌ遺伝子の５’の1780ｂｐを含有する1920ｂｐ断片 を得た。Ｈ４Ｌ遺伝子の残りの59０ｂｐを、プライマー対Ｈ４ＡおよびＨ４Ｂを 用いたプラスミド鋳型ｐｌａｃＺＨ６Ｈ４ＬｒｅｖｅｒｓｅからのＰＣＲ増幅に より産生した。プライマー対Ｈ４ＡおよびＨ４Ｂのオリゴヌクレオチド配列（配 列番号： ）は以下のとおりである： オリゴヌクレオチド配列 この590ｂｐのＰＣＲ断片をゲル精製し、配列を確認するためにＴＡクローニ ングベクター（Invitrogen San Diego，CA．98121）中にクローニング化た。３ ’のＨ４Ｌ配列を含有するこの590ｂｐの挿入物を、ＰｓｐＡＩおよびＡｓｐ７ ００での消化によりＴＡベクターから切除した。前記1920ｂｐおよび590ｂｐ断 片を、ＰｓｐＡＩ消化したｐＣＰＭ６ＬＤＥＬプラスミドベクター（脱オープン リーディングフレームされたＡＬＶＡＣ Ｍ６Ｌ挿入部位を含有する）中に方向 性クローニングして、Ｍ６Ｌ挿入部位でＡＬＶＡＣ配列に隣接したＨ６／Ｈ４Ｌ 発現カセットを含有するプラスミドｐＭ６ＬＤＥＬＨ６Ｈ４を産生した。 ＡＬＶＡＣ ｐＣ８挿入ベクターは以下のようにして産生した：前記Ｃ８ Ｏ ＲＦおよび隣接配列を含有するＰＣＲ Ｊ３６を、ＡＬＶＡＣ ＤＮＡにＪＰ１ ２１（ＣＡＴ−ＣＡＴ−ＧＡＧ−ＣＴＣ−ＡＣＴ−ＴＡＴ−ＴＡＣ−ＡＴＣ−Ｃ ＴＡ−ＣＴ）およびＪＰ１２２（ＴＡＣ−ＴＡＣ−ＧＧＴ−ＡＣＣ−ＴＴＴ−Ａ ＡＴ−ＡＡＧ−ＣＡＡ−ＴＣＡ−ＣＴ）（配列番号： ）を用いて産生した。得 られた約1.7ｋｂのバンドをＡｓｐ７１８／ＳａｃＩで消化し、Ａｓｐ７１８／ ＳａｃＩ消化したｐＢＳＳＫ₊中にライゲーションさせた。配列分析により確認 した後、得られたプラスミドをｐＣＰＦ８５Ｓ３Ｌと称した。Ｃ８ ＯＲＦのほ とんどを除去し、転写および翻訳停止をＭＣＳとともにｐＣＰＦ８５Ｓ３Ｌ中に 導入するために、このプラスミドをＳｎａＢＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、約11 5ｂｐ のＰＣＲ Ｊ６１８Ｉ ＳｎａＢＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片にライゲーションさせ て、ｐＣ８を産生した。ＰＣＲ Ｊ６１８Ｉは、プライマーＪＰ５１６（ＴＡＧ −ＧＡＡ−ＧＡＴ−ＡＣＧ−ＴＡＴ−ＴＡＴ−ＴＴＴ−ＡＴＡ−Ｃ）およびＪＰ ５１９（ＡＴＣ−ＣＣＡ−ＴＴＡ−ＴＧＡ−ＡＡＧ−ＣＴＴ−ＡＴＡ−Ｇ）を用 いたＰＣＲ Ｊ６１６およびＪ６１７の融合ＰＣＲ産物である。ＰＣＲ Ｊ６１ ６は、プラスミドｐＣＰＦ８５Ｓ３ＬにおいてプライマーＪＰ５１６およびＪＰ ５１７（ＣＴＣ−ＧＡＧ−ＣＴＧ−ＣＡＧ−ＧＡＴ−ＡＴＣ−ＡＴＣ−ＧＡＴ− ＧＧＡ−ＴＣＣ−ＴＴＴ−ＴＴＡ−ＴＡＧ−ＣＴＡ−ＡＴＴ−ＡＧＴ−ＣＡＣ− ＧＴＡ−ＣＣＴ−ＴＴＡ−ＴＣＡ−ＴＴＡ−ＧＴＡ−ＡＣＡ−ＡＡＴ）を用いて 産生した。ＰＣＲ Ｊ６１７は、プラスミドｐＣＰＦ８５Ｓ３Ｌにおいてプライ マーＪＰ５１８（ＧＧＡ−ＴＣＣ−ＡＴＣ−ＧＡＴ−ＧＡＴ−ＡＴＣ−ＣＴＧ− ＣＡＧ−ＣＴＣ−ＧＡＧ−ＴＴＴ−ＴＴＡ−ＴＧＡ−ＣＴＡ−ＧＴＴ−ＡＡＴ− ＣＡＣ−ＧＧＣ−ＣＧＣ−ＴＣＡ−ＡＴＡ−ＴＴＧ−ＴＡＴ−ＴＧＧ−ＡＴＧ− ＧＴＴ−ＡＧ）およびＪＰ５１９を用いて産生した。Ｃ８挿入プラスミドである プラスミドｐＣ８を配列分析により確認した。このプラスミドは、約440ｂｐの 左アーム、約1162ｂｐの右アーム、転写および翻訳停止配列の両方が隣接した、 独特のＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩ、およびＸｈｏＩ部位を有 するＭＣＳを含有している。 前記プラスミドｐＭ６ＬＤＥＬＨ６Ｈ４から、ＳｍａＩで2.5ＫｂｐのＨ６／ Ｈ４発現カセットを切除し、得られた2.5ＫｂｐのＳｍａＩ断片を精製し、Ｅｃ ｏＲＶ部位でＡＬＶＡＣ ｐＣ８ベクター中に挿入し、ｐＣ８Ｈ６Ｈ４を産生し た。Ｋ３Ｌ発現カセット Ｋ３Ｌ暗号配列を、米国特許第5,378,457号に記載されているように、鋳型と してコペンハーゲンワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ断片を含有するｐＳＤ４０７ ＶＣを用いて、ＰＣＲ増幅により合成した。これらオリゴヌクレオチドＭＰＳＹ Ｎ７６３およびＭＰＳＹＮ７６４（配列番号： ）は、ＰＣＲ反応のプライマー として用いた。 約325ｂｐのＰＣＲ断片をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、315ｂｐの断 片を産生した。この325ｂｐ断片をアガロースゲルからの単離により精製し、Ｘ ｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＢＳＳＫ₊ベクター（Stratagene LA Jolla ，CAからの）にライゲーションした。この核酸配列を、修飾Ｔ７ポリメラーゼ（ Tabor，S．and Richardson，C．C．1987）およびシーケナーゼ（U.S．Biochemic als Cleveland，OH.からの）を用いて、Hattori，M．and Sakaki，Y.，1986に記 載されているようにアルカリ変性プラスミド鋳型から直接確認した。このプラス ミドをｐＢＳ ７６３／７６４と称した。ｐＢＳ ７６３／７６４をＮｒｕＩお よびＸｈｏＩで消化することにより、Ｋ３Ｌ遺伝子を含有するｐＢＳ ７６３／ ７６４からの340ｂｐ断片がＨ６プロモータの隣に指向性に向けられて、ｐＭＰ ＴＫＨ６Ｋ３Ｌを産生できるように、ＮｒｕＩ（部分的）およびＸｈｏＩでの消 化により調製した、ＮＹＶＡＣｔｋ−挿入ベクターバックグラウンド内の不適切 な遺伝子を制御するワクシニアＨ６プロモータを有するカセットを含有するプラ スミドベクターｐＭＭ１５４中へのクローニングのために、340ｂｐ断片を単離 した。昆虫ポックス42ｋプロモータの制御下で優性選択性マーカーＥｃｏ ｇｐ ｔ遺伝子を含有するプラスミドｐＭＰ４２ＧＰＴ（pRATT d．AND sUBRAMANI s． 1983）をＳｍａＩおよびＢａｍＨＩで消化して、0.7Ｋｂｐの42ｋ−Ｅｃｏ ｇ ｐｔ発現カセットを産生した。この0.7Ｋｂｐの断片を精製し、ＳｍａＩおよび ＢａｍＨＩで切断したｐＭＰＴＫＨ６Ｋ３Ｌ中にライゲーションして、プラスミ ドｐＭＰＴＫＨ６Ｋ３Ｌｇｐｔを産生した。このプラスミドをＸｈｏＩで消化し て、Ｈ６／Ｋ３Ｌおよび４２ｋ／Ｅｃｏｇｐｔ発現カセットを含有する1.2Ｋｂ ｐ断片を産生し、次いで、これをゲル精製した。この1.2Ｋｂｐ断片を、（米国 特許第5,494,807号に記載された）ＡＬＶＡＣ Ｃ６挿入プラスミドｐＣ６Ｌの ＸｈｏＩ部位に挿入して、ｐＭＰＣＨ６ＨＫ３Ｌｇｐｔを産生した。Ｅ３Ｌ／Ｋ３Ｌ ＡＬＶＡＣ発現カセット Ｅ３Ｌ遺伝子全体は、コペンハーゲンワクシニアからのＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ断 片のクローンを含有した、ｐＳＤ４０１ＶＣから単離した2.3ＫｂｐのＥｃｏＲ Ｉ断片内に含まれている。この2.3ＫｂｐのＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＩで部 分的に消化されたｐＭＰＣ６Ｈ６Ｋ３Ｌｇｐｔ中に挿入して、プラスミドｐＭＰ Ｃ６Ｈ６Ｋ３Ｅ３ｇｐｔを産生した。このプラスミドＰＭＰＣＨ６Ｋ３Ｅ３ｇｐ ｔをＸｈｏＩで消化し、得られた6.8Ｋｂｐのベクター断片を精製し、自己ライ ゲーションさせて、プラスミドｐＭＰＣ６Ｅ３を得た。プラスミドｐＭＰＴＫＨ ６Ｋ３ＬをＰｓｐＡＩで消化し、Ｈ６／Ｋ３Ｌ発現カセットを含有する得られた 560ｂｐ断片を、ＰｓｐＡＩで消化したｐＭＰＣ６Ｅ３中にライゲーションさせ て、プラスミド構築物ｐＭＰＣ６Ｈ６Ｋ３Ｅ３を得た。Ｈ６促進ＦＨＶ ｑＢ供与体プラスミドの構築 ネコ１型ヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＢ（ＦＨＶ−１ ｇＢ）の全暗号領 域か、ｐＪＣＡ０７９（５’および３’のＴ５ＮＴ配列が突然変異誘発されてア ミノ酸配列に影響を与えずに初期転写停止信号が変更されたＦＨＶ ｇＢ暗号領 域；Ｉ３ＬワクシニアプロモータがｇＮ ＯＲＦの５’末端に連結されている； 図４を参照のこと、配列番号： ）のＰｓｔＩでの消化と、アガロースゲルから の３Ｋｂｐの断片の単離により得られた。精製したＰｓｔＩ断片を、ＰｓｔＩで 消化されたＡＬＶＡＣ Ｃ３挿入プラスミド（ｐＶＱＨ６ＣＰ３ＬＳＡ）中にク ローニングした（ｐＶＱＨ６ＣＰ３ＬＳＡ中の特異的なＢａｍＨＩ部位は、Ｂａ ｍＨＩでの消化、クレノーポリメラーゼによる端部の鈍端化および再ライゲーシ ョンにより以前に不活化された；ｐＶＱＨ６ＣＰ３ＬＳＡは、米国特許第5,494, 807号に論じられたｐＶＱＨ６ＣＰ３ＬのＮｏｔＩおよびＮｓｉＩでの消化によ り得た。そこから6623ｂｐの断片を単離し、アニールされたオリゴヌクレオチド ＣＰ３４（５’ＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＡ３’）およびＣＰ３５（５ ’ＴＧＴＣＧＡＣＧＣ３’）にライケーシヨンした（配列番号： ））。得られ たプラスミドｐＲＡＣ５を、Ｈ６プロモータに関するｇＢ暗号領域の適切な方向 についてスクリーニングした。Ｈ６プロモータをＦＨＶ ｇＢ開始コードンに適 切に連結するために、オリゴヌクレオチドＲＧ７８９（配列番号： ）（５’− ＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＧＣＧＡＴＡＴＣ−ＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴ Ａ ＡＴＧＴＣＣＡＣＴＣＧＴＧＧＣＧＡＴＣ−３’）およびＲＧ７８７（配列番号 ： ）（５’−ＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣＡＧＡＧＧＣＡＧ−３’）を用いて、ｐＪ ＣＡ０７９から800ｂｐのＰＣＲ断片を増幅した。この精製した断片をＮｒｕＩ ／ＢａｍＨＩで消化し、ＮｒｕＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＲＡＣ５中にライゲ ーションした。得られたプラスミドは、ＦＨＶ ｇＢ供与体プラスミドｐＣ３Ｈ ６ＦＨＶＢであった。「一連のビーズ」のカセット ｎｅｆおよびｐｏｌ ＣＴＬエピトープの「一連のビーズ」の発現カセット（ Ｈ６／Ｐｏｌ ３／Ｎｅｆ Ｃ末端／Ｐｏｌ ２／Ｎｅｆ 中央／Ｐｏｌ １） を、ｐｏｌエピトープに関して鋳型ｐＨＸＢＤ２およびＮｅｆエピトープに関し て鋳型２−６０−ＨＩＶ．３を用いて、以下に詳述するようにＰＣＲ（ポリメラ ーゼ連鎖反応）により産生した。最初のアセンブリは２部であった：(1)Ｈ６（ 部分プロモータ）／Ｐｏｌ ３／Ｎｅｆ Ｃ末端（Ｎｅｆ ２）；(2)ｐＢＳＳ Ｋ中のＰｏｌ ２／Ｎｅｆ 中央（Ｎｅｆ １）／Ｐｏｌ １。これらを組み合 わせ、次いで、Ｈ６プロモータ全体のアセンブリのためにｐＢＳＨ６−１１に移 動させ、次いで、Ｈ６／ＨＩＶカセットをＣ５挿入プラスミドに移動させた。( １) Ｈ６／Ｐｏｌ ３／Ｎｅｆ Ｃ未満（Ｎｅｆ ２） 230ｂｐ断片（Ａ）をＰＣＲにより誘導して、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳ ＹＮ７８３およびＭＰＳＹＮ７８４並びに鋳型ｐＨＸＢＤ２を用いて、Ｈ６結合 （linkage）およびＰｏｌ３を得た。ｐＨＸＢＤ２を、ラムダ−Ｊ１（Shaw et a l.，1994）中にクローニング化たＨＴＬＶ−ＩＩＩ感染したＨ９細胞からのＸｂ ａＩ消化されたＤＮＡの組換えファージライブラリーからのＮＩＨ／ＮＣＩ（Dr ．Nancy Miller）で誘導した。このプラスミドは、ＨＩＶ ＩＩＩＢ単離体の全 プロウイルスＤＮＡ配列を含有している。 110ｂｐ断片（Ｂ）を、ＰＣＲにより誘導して、オリゴヌクレオチドＭＰＳＹ Ｎ７８５／ＭＰＳＹＮ７８６並びに鋳型ｐ２−６０−ＨＩＶ．３を用いてＮｅｆ ２を得た（米国特許出願第417,210号に記載されているように）。 ＰＣＲ断片ＡおよびＢをＰＣＲ中で鋳型として組み合わせて、外部プライマー ＭＰＳＹＮ７８３／ＭＰＳＹＮ７８６（配列番号： ）を用いてＨ６結合／Ｐｏ ｌ３／Ｎｅｆ２を含有する300ｂｐ断片を得た。この300ｂｐの断片をＸｈｏＩ／ ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、290ｂｐの断片を単離し、同様に消化したｐＢＳＳＫ とライゲーションして、ｐＢＳ７８３／７８６を産生した。その配列を確認した 。 ( ２) ２／Ｎｅｆ 中央（Ｎｅｆ １）／Ｐｏｌ １ Ｐｏｌ２を含有する210ｂｐ断片（Ｃ）を、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹ Ｎ７８７／ＭＰＳＹＮ７８８（配列番号： ）および鋳型ｐＨＸＢＤ２を用いて ＰＣＲにより誘導した。 Ｎｅｆ１を含有する270ｂｐ断片（Ｄ）を、合成オリゴヌクレオチドＰＭＳＹ Ｎ７８９／ＭＰＳＹＮ７９０（配列番号： ）および鋳型ｐ２−６０−ＨＩＶ． ３を用いてＰＣＲにより誘導した（米国特許出願第08/417,210号に記載されてい る）。 Ｐｏｌ１を含有する170ｂｐ断片（Ｅ）を、プライマーＭＰＳＹＮ７９１／Ｍ ＰＳＹＮ７９２（配列番号： ）および鋳型ｐＨＸＢＤ２を用いてＰＣＲにより 誘導した。 断片ＣおよびＤを、外部プライマーＭＰＳＹＮ７８７／ＭＰＳＹＮ７９０（配 列番号： ）を用いて、Ｐｏｌ２／Ｎｅｆ１に関するＰＣＲにおいて鋳型として 組み合わせ、460ｂｐのＰＣＲ産物（Ｃ＋Ｄ）を得た。 断片ＤおよびＥを、外部プライマーＭＰＳＹＮ７８９／ＭＰＳＹＮ７９２（配 列番号： ）を用いて、Ｎｅｆ１／Ｐｏｌ１に関するＰＣＲにおいて鋳型として 組み合わせ、420ｂｐ断片（Ｄ＋Ｅ）を単離した。 断片（Ｃ＋Ｄ）および（Ｄ＋Ｅ）を、外部プライマーＭＰＳＹＮ７８７／ＭＰ ＳＹＮ７９２（配列番号： ）によるＰＣＲにおける鋳型として組み合わせて、 Ｐｏｌ２／Ｎｅｆ１／Ｐｏｌ１を含有する610ｂｐ断片を得た。この610ｂｐ断片 をＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩで消化した。得られた590ｂｐ断片を、ＨｉｎｄＩ ＩＩ／ＰｓｔＩで切断したｐＢＳＳＫとライゲーションして、ｐＢＳ７８７／７ ９２を産生した。その配列を確認した。 （配列番号： ） カセット全体のアセンブリ 590ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ断片をｐＢＳ７８７／７９２から単離し 、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩで切断したベクターｐＢＳ７８３／７８６とライゲ ーションして、ｐＢＳ７８３／７９２を産生した。ｐＢＳ７８３／７９２をＥｃ ｏＲＶおよびＰｓｔＩで切断して、880ｂｐの断片を産生し、次いで、これを同 様に切断したベクターｐＢＳＨ６−１とライゲーションして、ｐＢＳＨ６ＰＮを 産生した。プラスミドｐＢＳＨ６ＰＮをＢａｍＨＩで消化し、1060ｂｐの断片を 単離した。総称的なＣ５供与体プラスミドであるｐＶＱＣ５ＬＳＰ１をＢａｍＨ Ｉで消化し、ｐＢＳＨ６ＰＮからの1060ｂｐ断片とライゲーションした。得られ たプラスミドｐＭＰＣ５Ｈ６ＰＮは、ＡＬＶＡＣ Ｃ５遺伝子座においてＨＩＶ ｐｏｌ／ｎｅｆ「一連のビーズ」カセットを含有している。実施例３−発現研究 実施例３．１−ＮＹＶＡＣ発現結果 細胞の融合性単層を含有する皿を２の感染多重度（ｍｏｉ）で感染させた。特 定の期間に亘る保温後、１時間に亘り細胞を標識培地内で保温した。この保温の 終わりに、記載したイムノプレシピテーション分析（Harlow，E and Lane，D(19 88);Langone，J．(1982)）のために細胞を収穫した。 細胞を２ｐｆｕ／細胞のｍｏｉで感染させ、特定の期間に亘り保温した。感染 後の適切な時間で、細胞溶解産物をＲＮＡ分析のために調製した。培地を吸引し 、細胞を収穫した。ＲＮＡを単離し、ＴＲＩ−試薬（Molecular Research Cente r Inc．Cincinnati，OH．45212）を製造業者の指示にしたがって用いて、調製し 、スロットブロットにより分析した。放射線標識されたＤＮＡプローブを用いて 、特定のＲＮＡ種を検出した。 ＨＩＶ ｅｎｖ切形（truncated）ＭＮ株の発現への、親ウイルスｖＰ９９４ と比較したｖＰ１３７９およびｖＰ１３８０の効果を、ＣＥＦ細胞についての感 染後の特定の時問での放射線標識付けにより研究した。ＨＩＶ ｅｎｖ切形ＭＮ 株（ｍＡｂ Ｋ３Ａ）に対する単クローン性抗体に関するＩＰ分析により、ｖＰ ９９４親ウイルスまたはｖＰ１３７９いずかれと比較して、感染後の初期でのｖ Ｐ１３８０感染細胞に関するデノボ合成が著しく増大したことが分かった。同様 の傾向が、感染後の後期にも観察される。ウサギ抗Ｈ４Ｌ抗血清（Dr．S．Shuma n，Sloan-Kettering Institute，NYにより提供された）に関するＩＰ分析は、ｖ Ｐ１３８０感染細胞のみが感染の初期にＨ４Ｌ産物を発現したことを示している 。ｖＰ９９４またはｖＰ１３７９のいずれに感染した細胞も、感染の初期にはＨ ４Ｌを発現しなかった。全ての試料は、感染の後期のＨ４Ｌのデノボ合成を示し ているが、発現率は、ｖＰ９９４またはｖＰ１３７９感染細胞いずれかの場合よ りもｖＰ１３８０感染細胞のほうが高い。構成ワクシニアタンパク質であるＥ３ Ｌ産物のＩＰ分析は、デノボ合成が、ｖＰ９９４またはｖＰ１３７９感染細胞の いずれかにおけるよりも、ｖＰ１３８０感染細胞において、感染後の全ての時で 高い率で生じることを示している。 これらの結果は、ｖＰ１３７９が、感染後の初期および後期にＨ４Ｌを発現す るｖＰ１３８０とは異なり、親ウイルスと同一の発現パターンを有する欠損組換 え体であることを示している。この初期Ｈ４Ｌ発現は、明らかに、感染後の初期 での研究されている前記タンパク質（ＨＩＶ ｅｎｖおよびＥ３Ｌ）の向上した 発現と相関関係にある。 以下の研究は、ｖＰ１３７９が感染後の初期にＨ４Ｌ産物を発現しないので、 ｖＰ１３８０およびｖＰ９９４について行った。ＨｅＬａ細胞（非許容系）にお ける感染後の異なる時期での発現率をＩＰ分析により研究した。抗Ｈ４Ｌに関す るＴＰ研究は、ｖＰ１３８０感染細胞が、感染後の全ての時期（３、６、24およ び48時間）でＨ４Ｌ産物を発現したことを示している。ｖＰ９９４感染細胞にお いては、感染後のいずれの時期においても産物は検出されなかった。時間ととも に増大する持続性デノボ合成が察される。ＨＩＶ Ｅｎｖ産物の分析は、産物発 現レベルは、ｖＰ９９４感染細胞に対してｖＰ１３８０感染細胞のほうが全ての 時期で高いけれども、最も著しい差は、24および48時間の後期に見られることを 示しており、Ｈ４Ｌの発現がＨＩＶ Ｅｎｖ産物の発現についてあるレベルで影 響がなければならないことを示唆している。Ｅ３Ｌ産物の発現も、ｖＰ９９４と 比較するとｖＰ１３８０感染細胞において増大している。 Ｌ９２９細胞について行った実験も同様の結果を示した。最も著しい差は、感 染後の全ての時期でＨ４Ｌ産物の発現率は非常に低いけれども、ＨＩＶ Ｅｎｖ 成分のデノボ合成率において劇的な差があることであった。Ｅｎｖ合成率の差は 24時間でピークに達し、ｖＰ９９４と比較して、ｖＰ１３８０感染細胞において は５から10倍増大した。 Ｈ４Ｌ産物は初期転写因子であるので、発現レベルで得られた結果が、ｖＰ１ ３８０感染細胞におけるＨ４Ｌメッセージにおける増加と相関関係にあるか否か を決定するのに関心のあるものである。スロットブロットによるＲＮＡ分析は、 Ｈ４Ｌメッセージが、ｖＰ１３８０感染細胞において感染後の全ての時期におい て検出可能であり、感染から６時間後に安定した状態を達成したことを示してい る。 ＨＩＶ Ｅｎｖメッセージレベルは、感染から３時間後に安定状態のレベルま で急速に増大し、ｖＰ１３８０感染細胞において全ての時期でそれらのレベルで 維持された。一方で、ｖＰ９９４感染細胞は、感染から６時間後にＨＩＶ ｅｎ ｖメッセージのピークを示し、12時間後に低下し始めた。ｖＰ１３８０感染細胞 におけるＥ３Ｌメッセージが、ｖＰ９９４感染細胞と比較して、感染後の全ての 時期で高いレベルで存在する。ＲＮＡレベルのこのパターンは、前記タンパク質 レベルでデノボ合成率のパターンと矛盾がない。 マウスを０日目と28日目に腹腔内経路により免疫化した。最初の免疫化前に始 まり、その免疫化後に２週間間隔で、マウスより眼後方そう(retroorbital plex us)から採血した。血清を、標準的な凝固技術により採取した血液から調製し、 ＨＩＶ外被糖タンパク質に対して反応性の抗体に関する速度論ＥＬＩＳＡに使用 するまで-20℃で冷凍貯蔵した。 高供与量のｖＰ９９４またはｖＰ１３８０が同様のレベルの抗体を誘発した（ 以下の表）。しかしながら、最低の供与量、５×10⁶ｐｆｕでは、ｖＰ１３８０ のみがＨＩＶ抗体を産生することができた。さらに、その低供与量により誘発さ れた抗体のレベルは、最高の供与量、５×10⁷ｐｆｕにより誘発された抗体のレ ベルに匹敵した。 ワクシニアＨ４を欠如しているが、ｖＰ１３８０に対してはその他の全ての点 で同一のｖＰ９９４が抗体応答を誘発するのに低すぎる供与量では、ｖＰ１３８ ０は、試験した最高供与量により誘発されたものと同等の抗体応答を誘発した。 したがって、ＮＹＶＡＣにおけるワクシニアＨ４Ｌの過剰発現により、体液性応 答を誘発する潜在能力が増大するかもしれない。 表：組換え体ＨＩＶ−１ ＭＮ／ＢＲＵ ｇｐ１６０に対する抗体応答 上述したように、おそらくは、ｖＰ１３８０中の向上したレベルの一部は、Ｅ ３Ｌのようなウイルス特異性産物の向上した転写および発現によるものであり、 したがって、ｖＰ１３８０における発現に向上した転写および翻訳が含まれる。 ベクターがより大きいレベルの発現およびより持続性のレベルの発現を得ている 本発明によれば、ｖＰ１３８０においてはより持続性のレベルで外因性ＤＮＡの 発現が多かった。マウスにおいてｖＰ９９４よりも免疫性であるｖＰ１３８０に より示されているように、マウス系における向上した発現プロフィールは、マウ スにおける向上した免疫原性を提供した。向上したプロフィールは、ここでの不 稔初期ＡＬＶＡＣ組換え体中の制限初期細胞内に見られたが、生産的複製があっ た細胞、例えば、ＶＥＲＯまたはＣＥＦにおいてはそのプロフィールは観察され ず、前記因子および異種ＤＮＡは、好ましくは、実質的に同時に発現されるべき であることを示唆している、すなわち、好ましくは、実質的に同時または同じ段 階で共発現があるべきであり、発現の時期、例えば、初期、後期、初期および後 期が、ベクターの表現型（例えば、初期に不稔、後期に不稔）と一致すべきであ り、すなわち、ウイルス複製が損なわれていない系（許容系）または発現がベク ターの表現型と一致していないときに複製が不稔である系においては、最適な発 現が得られないかもしれないと示唆していることが観察されている。したがって 、ＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣのような初期に不稔の系においては、好ましくは 、外因性ＤＮＡおよび転写または転写および翻訳因子を初期に発現し、後期に不 稔の系においては、好ましくは、外因性ＤＮＡおよび転写または転写および翻訳 因子を後期または初期および後期に発現する（初期のみの発現は、許容系におけ る発現に類似しているかもしれない、すなわち、必ずしも最適発現を得られない かもしれないので）。実施例３．２−ＡＬＶＡＣ発現結果 ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ組換え体 イムノプレシピテーション（ＩＰ）を用いて、ＭＲＣ−５感染細胞中のＡＬＶ ＡＣ組換え体に含まれたＨＩＶ−Ｉカセットの時間的発現の半定量比較を提供し た。ＨＩＶ患者からの熱不活化血清を得て、本発明の方法に記載したようにＩＰ に用いた。この抗血清は、120ＫＤａのｅｎｖタンパク質およびｇａｇタンパク 質前駆体からの様々な開裂産物を沈殿させる。このＩＰデータの分析において、 Ｅ３Ｌ／Ｋ３Ｌカセットを含有するＡＬＶＡＣ組換え体ｖＣＰ１４３１Ａおよび ＶＣＰ１４３７Ａは、Ｅ３Ｌ／Ｋ３Ｌカセットを含まないＡＬＶＡＣ組換え体ｖ ＣＰ２０５と比較した場合、感染後の全ての時期で発現のレベルが著しく増大し たことが明らかである。 面白いことに、ｖＣＰ１４３１ＡおよびｖＣＰ１４３７Ａは同様の発現プロフ ァイルを有した。ＡＬＶＡＣ Ｅ３Ｌ／Ｋ３Ｌバックグラウンド中へのＨ６／Ｈ ４Ｌの挿入により、発現をＥ３Ｌ／Ｋ３Ｌより上に向上させず、ワクシニアＨ４ Ｌは必ずしもＡＬＶＡＣにおいては機能的ではないことを示唆している。しかし 、ＡＬＶＡＣ転写因子の操作により向上した発現が導かれるであろう。カナリヤ ポックスにおいてワクシニア転写因子の相同体があるけれども、カナリヤポック ス中の必要条件は生化学的に異なっているかもしれない。しかし、これらの差は 、この開示および従来技術の知識から、不必要な実験を行わずに、当業者により 確かめることができる。さらに、本発明は、ワクシニアウイルスを用いて、カナ リヤポックスまたは鶏痘における転写分析のためのインビトロ系を提供する。 ＲＮＡスロットブロットを用いて、ＡＬＶＡＣ組換え体ｖＣＰ２０５およびｖ ＣＰ４１３１ＡおよびｖＣＰ１４３７Ａに感染したＭＲＣ−５細胞における時間 的転写発現を評価した。この分析において、ｅｎｖおよびｇａｇタンパク質をコ ード化するＨＩＶ−Ｉカセットから転写されたｍＲＮＡのレベルについて比較を 行った。Ｅ３Ｌ／Ｋ３Ｌカセットを含有するＡＬＶＡＣ組換え体（ｖＣＰ１４３ ＩＡおよびｖＣＰ１４３７Ａ）は、ＡＬＶＡＣ組換え体ｖＣＰ２０５のものより も高いｅｎｖおよびｇａｇ遺伝子に関するｍＲＮＡのレベルで著しい増大を示さ なかった。 ワクシニア感染細胞においてＰＫＲをダウン調節し、それによって、翻訳を変 調させる上でのＥ３Ｌ／Ｋ３Ｌの果たす前述した役割は、ワクシニアＥ３Ｌ／Ｋ ３Ｌ機能を含有するＡＬＶＡＣ組換え体においても機能するように思われる。前 記データは、前記Ｅ３Ｌ／Ｋ３Ｌ遺伝子を含有するＡＬＶＡＣ組換え体に感染し た細胞中で翻訳が著しく向上するが、転写レベルの著しい増大は検出されていな いことを示している。これは、Ｅ３Ｌ／Ｋ３Ｌ発現のポックスウイルス感染細胞 における翻訳効率への影響を例示するものである。 前述したように（Taylor et al.，1990）、ＡＬＶＡＣ親ウイルス、ＡＬＶＡ Ｃ−ＭＮ１２０ＴＭＧ（ｖＣＰ２０５）、ＡＬＶＡＣ−ＭＮ１２０ＴＭＧＮＰｓ ｔ（ｖＣＰ１４３３）、ｖＣＰ１４５２およびｖＣＰ３００に感染したＣＥＦ細 胞由来の放射線標識した溶解産物を用いて、イムノプレシピテーションを行った 。ヒトの血清は、ＨＩＶ血清陽性の個体から誘導した（抗ＨＩＶ）。この分析に よ り、前記親ウイルスではなく組換え体において、120ｋＤａの分子量を有する外 被配列および55ｋＤａの分子量を有するＧａｇ前駆体タンパク質の発現が確認さ れた。しかしながら、本発明によれば、ｖＣＰ３００はｖＣＰ１４５２と比較し て、減少した発現を示した、すなわち、ｖＣＰ１４５２は驚くべきことに、転写 および／または翻訳因子の発現のために向上した発現を示した。 ヒト抗ＨＩＶ抗体についてのＦＡＣ走査分析は、ＡＬＶＡＣ−ＭＮ１２０ＴＭ ＧＮＰｓｔ（ｖＣＰ１４３３）に感染したＨｅＬａ細胞の表面にｇｐ１２０の発 現を示した。ＡＬＶＡＣ親ウイルスに感染した細胞上には、蛍光が検出されなか った。 さらに、挿入されたＨＩＶ遺伝子の適切な発現を、ｖＣＰ１４３３またはｖＣ Ｐ１４５２に感染したＭＲＣ５細胞の放射線標識付け溶解産物について行ったイ ムノプレシピテーション分析（ＨＩＶに感染した個体からの多クローン性血清プ ールを用いた）により確認した。この分析により、ｖＣＰ１４５２において、12 0ｋＤａの分子量を有する外被配列および55ｋＤａの分子量を有するＧａｇ前駆 体タンパク質の発現を確認した。 ｖＣＰ１４５２は、ｖＣＰ１４３３およびｖＣＰ３００と比較してヒト細胞の 発現を向上させた。実際に、向上した発現が、ヒトおよびイヌの細胞において、 Ｅ３Ｌ／Ｋ３Ｌ翻訳因子について観察された。 マウスにおける予備免疫原性研究は、Ｅ３Ｌ／Ｋ３Ｌ翻訳因子による向上した 免疫原性の証拠を示さなかった。このことは、マウス細胞中で向上した発現が観 察されなかったことに対応している。 さらに、マウス細胞において、ＡＬＶＡＣ発現の制限因子が転写レベルにある 。したがって、適切な転写因子を使用することにより、マウス系において向上し た発現が観察できないことを克服することができる。したがって、細胞の起源は 、ベクターの性質、例えば、ベクターの表現型（例えば、不稔、および初期に不 稔、後期に不稔のような時期に関する不稔）のように、本発明のインビトロまた はインビボ用途（上述したＨ４データに留意のこと）における重要な要因である かもしれない。しかし、細胞およびベクターの表現型並びに因子および異種およ び／または外因性ＤＮＡの発現の時期の適切な選択は、不必要な実験を行わずに 、こ の開示および従来技術の知識から、当業者の範囲に含まれる。ＡＬＶＡＣ−ＦＨＶ ｑＢ組換え体 ｖＣＰ１４５９、ｖＣＰ１４６０およびｖＣＰ１４６４に関する発現の分析を 、ヒツジ抗ＦＨＶ ｇＢ多クローン性血清を用いたイムノプレシピテーション分 析により行った。ヒトＭＲＣ−５細胞に、時間０にｍｏｉ＝５で接種し、この接 種から３、６、24、48および72時間後に、３⁵Ｓ標識付けメチオニンで１時間に 亘りパルスした。沈殿したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。こ れらのＩＰのオートラジオグラフを濃度計を用いて走査した。使用したこれらの 方法により、特定の時点でのＦＨＶ ｇＢ発現の半定量分析を提供する。 結果は、全ての組換え体が、適切なサイズの全長グリコシル化ＦＨＶ ｇＢポ リペプチド（約115ｋＤａの見かけ分子量）を発現することを示している。しか しながら、組換え体ｖＣＰ１４６０およびｖＣＰ１４６４は、ｖＣＰ１４５９と 比較して、ｇＢタンパク質の量が著しく増大した（約５倍）ことを示している。 さらに、これらの発現レベルは、接種から72時間後でさえも持続している。した がって、ＡＬＶＡＣ中のワクシニアＥ３Ｌ／Ｋ３Ｌの発現は、ＦＨＶ ｇＢ発現 のレベルおよび持続性に著しい影響を与えるようである。実施例４−追加のベクター ここに引用した文献および上述した実施例を含むここの教示を用いて、プラス ミドおよび裸ＤＮＡ、並びにポックスウイルス、例えば、ＮＹＶＡＣ、ＴＲＯＶ ＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＭＶＡ、ｔｓ（温度感受性）突然変異体、または初期（ＤＮ Ａ^-）および後期欠損突然変異体、アデノウイルス、例えば、ＣＡＶ２のような ＣＡＶ、ヘルペスウイルス、例えば、エプスタインバーを含む追加のウイルスベ クターを、向上した転写または翻訳もしくは転写および翻訳により、例えば、Ｈ ４Ｌ、ワクシニアＤ６、ワクシニアＡ７、ワクシニアＧ８Ｒ、ワクシニアＡ１Ｌ 、ワクシニアＡ２Ｌ、ワクシニアＨ５Ｒ（ＶＬＴＦ−１、−２、−３、−４、Ｐ ３、ＶＬＴＦ−Ｘ）Ｅ３Ｌ、Ｋ３Ｌ、ＶＡＩ、ＥＢＥＲ、シグマ３、ＴＲＢＰ、 またはこれらの組合せを用いて、前記ベクターを少なくとも一つの転写因子また は少なくとも一つの翻訳因子もしくは少なくとも一つの転写因子および少なくと も一つの翻訳因子を含むように修飾することにより産生する。したがって、外因 性暗 号核酸分子（ここに引用した、またはそうでなければ従来技術において知られて いるような文献から、もしくはそれらの教示をここの教示とともに適用すること から得られるものを含む外因性暗号核酸分子のような）の向上した発現が得られ る。 本発明の好ましい実施の形態を詳細に記載してきたけれども、請求の範囲によ り定義された本発明は、その多くの明らかな変更例が本発明の精神および範囲か ら逸脱せずに可能であるので、上述した記載に述べられた特定の詳細に限定され るものではないことが理解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コックス，ウィリアム アイ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 12153 サンド レイク メイプル トレイル 1379 (72)発明者 ゲティッグ，ラッセル アール アメリカ合衆国 ニューヨーク州 12018 アヴェリル パーク ボックス 421シ ー アールディー ２ (72)発明者 マーティネツ，ヘクター アメリカ合衆国 ニューヨーク州 12204 メナンズ パーク レイン イースト 15 アパートメント ９ (72)発明者 パオレッティ，エンゾ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 12054 デルマー マーレイ アヴェニュー 297 (72)発明者 ピンカス，スティーヴン イー アメリカ合衆国 ニューヨーク州 12061 イースト グリーンブッシュ トロイ ロード 78

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．特定の表現型を有する細胞中の少なくとも一つの第一の核酸分子の発現を向 上させるベクターであって、該ベクターが、該第一の核酸分子および転写因子 または転写因子と翻訳因子をコード化する少なくとも一つの第二の核酸分子を 含むように修飾されており、前記細胞の表現型に関して前記第一と第二の核酸 分子の実質的に同時の発現があり、それによって、該第二の核酸分子の発現が 、転写または転写と翻訳を向上させることにより、前記第一の核酸分子の発現 を向上させることを特徴とするベクター。 ２．前記第一の核酸分子が第一のプロモータに操作可能に結合され、前記第二の 核酸分子が第二のプロモータに操作可能に結合され、該第一と第二のプロモー タが実質的に同時に機能的であることを特徴とする請求の範囲第１項記載のベ クター。 ３．前記第一と第二の核酸分子が前記ベクター内の異なる遺伝子座にあることを 特徴とする請求の範囲第２項記載のベクター。 ４．前記第一と第二の核酸分子が前記ベクター内の同じ遺伝子座にあることを特 徴とする請求の範囲第２項記載のベクター。 ５．前記第一の核酸分子と前記第二の核酸分子が一つのプロモータに操作可能に 結合されていることを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクター。 ６．前記転写因子がポックスウイルス起源のものであることを特徴とする請求の 範囲第１項記載のベクター。 ７．前記転写因子がワクシニアウイルスからのものであることを特徴とする請求 の範囲第６項記載のベクター。 ８．前記転写因子が、Ｈ４Ｌ、Ｄ６、Ａ７、Ｇ８Ｒ、Ａ１Ｌ、Ａ２Ｌ、Ｈ５Ｒ、 およびこれらの組合せからなる群より選択されるオープンリーディングフレー ムからのものであることを特徴とする請求の範囲第７項記載のベクター。 ９．前記第二の核酸分子が、少なくとも一つの転写因子および少なくとも一つの 翻訳因子を含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクター。 10．前記翻訳因子が、ｅＩＦ−２アルファリン酸化の阻害またはＰＫＲリン酸化 の阻害を行って、もしくはそうでなければ、ｄｓＲＮＡを隔離して、ｄｓＲＮ Ａの有効濃度を増大させることを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクター 。 11．前記少なくとも一つの第二の核酸分子が、Ｋ３Ｌオープンリーディングフレ ーム、Ｅ３Ｌオープンリーディングフレーム、ＶＡＩ ＲＮＡフレーム、ＥＢ ＥＲ ＲＮＡＮシグマ３オープンリーディングフレーム、ＴＲＢＰオープンリ ーディングフレーム、およびそれらの組合せからなる群より選択されることを 特徴とする請求の範囲第10項記載のベクター。 12．前記第一の核酸分子が、関心のあるエピトープ、生体応答調整物質、成長因 子、認識配列、治療遺伝子および融合タンパク質からなる群より選択される分 子をコード化することを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクター。 13．組換えウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクター。 14．組換えポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第13項記載のベ クター。 15．請求の範囲第１項記載のベクターを調製する方法であって、該ベクターを前 記少なくとも一つの第二の核酸分子を含むように修飾し、必要に応じて、該ベ クターを前記第一の核酸分子を含むように修飾して、それゆえ、前記細胞の表 現型に関して、該第一と第二の核酸分子の発現が実質的に同時である各工程を 含むことを特徴とする方法。 16．前記第一の核酸分子を第一のプロモータに、前記第二の核酸分子を第二のプ ロモータに操作可能に結合させる工程を含み、該第一と第二のプロモータが実 質的に同時に機能的であることを特徴とする請求の範囲第15項記載の方法。 17．前記第一と第二の核酸分子を一つのプロモータに操作可能に結合させる工程 を含むことを特徴とする請求の範囲第15項記載の方法。 18．請求の範囲第１項記載のベクターおよび製剤的に許容されるキャリヤまたは 希釈剤を含む免疫、ワクチンまたは治療組成物。 19．宿主内に免疫または治療応答を発生させる方法であって、該宿主に請求の範 囲第18項記載の組成物を投与する工程を含むことを特徴とする方法。 20．少なくとも一つの第一の核酸分子の発現を該第一の核酸分子を含むベクター により増大させる方法であって、該発現が特定の表現型を有する細胞内で行わ れ、該方法が、前記ベクターを、転写因子または転写因子と翻訳因子をコード 化する少なくとも一つの第二の核酸分子を含むように修飾する工程を含み、前 記細胞の表現型に関して、該第一と第二の核酸分子の発現が実質的に同時であ り、それによって、該第二の核酸分子の発現が、転写または転写と翻訳を向上 させることにより、該第一の核酸分子の発現を向上させることを特徴とする方 法。 21．遺伝子産物をインビトロで発現する方法であって、適切な細胞に請求の範囲 第１項記載のベクターを感染またはトランスフェクションさせる工程を含むこ とを特徴とする方法。 22．前記第一の核酸分子をインビボで発現させる方法であって、請求の範囲第１ 項記載のベクターを宿主に投与する工程を含むことを特徴とする方法。 23．ｖＣＰ１４５２またはｖＣＰ１４３３。