JPH05502380A - 低―動物毒性と高殺細胞活性の改良シュードモナス外毒素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 低−動物毒性と高殺細胞活性の 改良シュードモナス外毒素 本発明は概して組換えキメラ外毒素を作成することに関する。更に具体的には、 本発明は低−ａ物毒性の（動物に試験した場合低毒性の）そして適当な標的剤に 接合させると高殺細胞特性を示す組換えシュ−ドモナス外毒素（ｒＰＥ）の改良 型を工夫して作成することに関する。

ここに記載されている性質と特性を持つ活性キメラ外毒素は以前に知られておら ず報告もされていなかった。

本発明の背景 天然毒素のドメインＩａにおける欠失を含む組換えシュードモナス外毒素とそれ が低い副作用を示すことは米国特許第４．８９２．８２７号に記載されている。

しかしながら、ＰＥ分子のいろいろのドメインにおける各々のアミノ酸、その単 独のまたは他のアミノ酸配列との組み合わせたの役目は知られていなかった。と はいうものの、ドメインＩａが標的細胞へのＰＥ分子の結合に要求されるという ことは示されていた。

発明の概要 従って、本発明の目的はＰＥ分子の動物毒性に関与するアミノ酸配列残基または 配列を同定することである。

ＰＥ分子の動物毒性に影響する特定のアミノ酸の役目を決定した後に、低−動物 毒性であるが、適当な標的剤と接合させた時に、他の細胞に実質的に影響を与え ずに、より大きい細胞毒性がある、新規形の組換えＰＥ分子（ｒＰＢ）を構成す ることである。

本発明の別の目的は、改しただ、活性あるキメラ毒素をいろいろ用意することに より標的細胞を殺滅するための効果的方法を提供することである。

他の目的と利点は、下記の本発明の詳細な記述により明筺になるであろう。

略号 本願で使用するいろいろの略号、記号、術語等を次に記載する。

ＰＥ−４０は約４０，０００ＭｒのＰＥ分子を意味しそしてドメインＩｔは、毒 素を細胞質ゾル中へ移送するのに必要な領域である（フワング他、１９８７年。

Ｃｅ１ｌ　４８：１２９−１３６）。

ＩＬ６−ＰＥ６６−４Ｇ１ｕは、約６６．０００ＭｒのＩＬ２とＰＥ分子からな るキメラタンパク質であり、その中では４個の十に荷電したアミノ酸がグルタミ ン酸（Ｇｌｕ）に置換されており、ＩＬ２は標的剤である。

従って、標的剤がＴＧＲαまたはＣＤ４および同様のもののような異なる実体で ある場合は、従って、キメラタンパク質は、ＴＧＦα−またはＣＤ４−ＰＥ６６ −４Ｇ１ｕおよび同様のものである。従って、もしも置換するアミノ酸がグルタ ミン酸でない場合は、グリシンが「ＧｌｙＪ　と命名されるように、置換するア ミノ酸が命名される。

例えばＰＥ−Ｇ１ｕ５７Ｇ１ｙ２４６，２４７，２４９のような番号付けが行わ れる時、それは、天然ＰＥの配列中の位置５７におけるアミノ酸がグルタミン酸 により置換されそして位置２４６，２４７と２４９におけるアミノ酸がグリシン （Ｇ　１　ｙ）により置換されていることを意味する。

２４１−２５０．またはＤ３８４−３８０のように、記号「△」またはｒＤＪが 使用される場合、文字ｒＤＪまたは「△」に続くアミノ酸配列、即ち、これらの 例に含まれるアミノ酸２４１ないし２５０までまたはアミノ酸３６４−３８０が 欠失していることを意味する。

図面の簡単な説明 本発明のこれらと他の目的、特徴およびそれに付随する特徴は、下記の図面を参 照することによりさらによく理解されるであろう。

図１は、ＰＥ変異体の発現ベクターの構造を線図で示している。そのベクターは 、開始コドンの前に適当に配置されているリボゾーム結合位置を持つＴ７プロモ ーターの下流でＰＥをコードしている配列を含む（チャウドパリ−他、１９８８ 年、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａ、ｃａｄＳｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　８５：２９３９ −２９４３：スツジールとモハッｌ−、１９８６年、Ｊ、Ｍｏ］、Ｂｉタンパク 質の発現は、このプラスミドを持つＥ、ｃ。

１１　ＢＬ２１（λＤＥ　３）の培養物のＩ　ＰＴＧ誘導により実施される。Ｏ ｍｐＡシグナル配列があるので、そのタンパク質はべりブラズム中に分泌される 。シグナル配列が存在しないと、それらは細胞内に蓄積する。シグナル配列のプ ロセシングの後で三個のアミノ酸延長（ａｌａ　ａｓｎ　１ｅｕ）が残っている 。水平方向の太線の矢印は翻訳の方向を示している。ＰＥの残部は一周しており 、１は成熟ＰＥの第１番目のアミノ酸である（グレイ他、１９８４年、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８１　：２６４５−２６４９）。

始めのｐＶＣ４５はＴ７翻訳ターミネータ−（Ｔ）並びにファージ起源（ｆ＋） が欠如している。垂直方向の矢印はシグナル配列の切断部位である。

図２は、ＩＬ６−ＰＥ４０誘導体を線図で示したものである。

図３は、ＰＥ変異タンパク質のドデシル硫酸ナトリウムーボ１ノアクリルアミド ゲルの電気泳動を示している。

試料をラメリ緩衝液中で煮沸し、１０％ドデシル−ポリアクリルアミドゲル（Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥ）上に適用する。タンパク質をクーマッシエ青Ｒ−２５０で染色 する。

レーン１と２．ＰＥ；３と４．ＰＥ”″”　；５と８．　ＰＥ”２””””　（ ＰＥ　Ｂ　６−４　Ｇ　１　ｕ）　ニア　ト３　、　Ｐ　Ｅ　Ｇｌ′１６７、２ ４１１４７．２４＠。

レーン１．３．５と７は、ペリプラズムの試料であり、レーン２，４．６と８は 、Ｍｏｎｏ　Ｑ　フラクションである。標準分子量マーカーをｋＤａで示す。

図４Ａ−４Ｄは、ＰＥ変異タンパク質のＭｏｎｏ　Ｑのプロフィールを示す。タ ンパク質はファージエフターミネータ−を持つプラスミドを使用して発現した。

培養液１５０ｍ１に等量の各々のペリプラズムの試料をＭ。

ｎｏ　Ｑカラム（ＨＲ５１５）上に適用しそしてそのカラムをＮａＣ］　（２０ ｍＭＴｒ　ｉ　ｓ、ｐＨ７，・６中で０−４０−４Ｏ０直線グラジエントで溶離 する。

１ｍｌのフラクションを採取した：Ａ、ＰＥ；Ｂ、ｐ　ＥＧ＋＋＋ｌ＋７　、　 Ｃ，ｐ　ＥＧｌｕ２４＃・２４７・２４９：およびり、ＰＥ”’・６７、２４１ ２４’ｌ・２４９゜垂直の矢印は興味のあるピークの位置を示している。

図５は、５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３　細胞に対するＰＥ変異体の細胞毒性を示す。タン パク質いろいろの希駅液を５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３　細胞に添加し、タンパク質合成 を測定した。結果を、Ｉ・キシンが添加しない対照の％として表現する・ ０−０．ＰＥ；　ローーーロＩ　ＰＥ”５”　：■−−−■、ＰＥ”＋２４０． ２４？・２４１；および△−−−△　Ｐ　Ｅ　ＧｌｕＴｈＴ、　２４６．２４７ ．２４９０図６は、発現した１Ｌ６−ＰＥ４０−ＰＥ４０　（レーン１）、ＩＬ ６−ＰＥ４０−ＩＬ６　（レーン２）。

（Ｉ　Ｌ６−ドメインｌｌ−ＰＥ４０（レーン３）、ＩＬ６−ＰＥ４０（レーン ４）、ＩＬ６−ＰＥ４０Ｄ３６４−３８０（レーン５）およびＩ　Ｌ６−ＰＥ６ ６””（レーン６）のＮａＤｏｄＳｏ、／ＰＡＧＥを示す。

１０．０％タンパク質ゲルをクーマツシー青（Ｃｏ。

ｍ　ａ　ｓ　ｓ　ｉ　ｅ　Ｉ）　１　ｕ　ｅ　）で染色する。標準分子量をｋＤ ａで示す。

図７は、Ｕ２６６細胞へ（ＤＩＬ６−ＰＥ４０誘導体の殺細胞活性を示す。キメ ラ毒素をいろいろの濃度で細胞（５Ｘ１０”細胞／ｍ１）に添加し、　細胞タン パク質への　［３Ｈ１０イシンの取込みを測定する。

ＩＬ６−ＰＥ４０　（０）、ＩＬ６−ＰＥ４０−ＰＥ４０（・）、ＩＬ６−ドメ インｌｌＰＥ　（Ｘ）、ＩＬ８−ＰＥ４０　（Ｘ）、ＩＬ６、−ＰＥ４０−１１ ，６　（ロ）、ＩＬ６−ＰＥ６６””（■）。

図８は、Ｕ２６６細胞ｒ細胞１０’細胞／ｍ１］を使用するＩＬ６競合検定の結 果を示す。

Ｉ　Ｌ　６−ＰＥ　６６””トＭＬ　６−ドメイ：ｚ［［−ＰＥ４０を、１００ ０ｎｇのｒ　ＩＬ６の存在下または非存在下細胞に添加する。細胞を２４時間イ ンキュベートし、タンパク質合成を細胞毒性検定と同様にして測定した。

図９は、結合置換検定の結果を示す。

Ｌｏｎｇの　１２＋１ｌ−ＩＬ６の存在下、ＩＬ６キメラタンパク質を細胞へ、 いろいろの濃度（同じモル比）で添加する： ｒｌＬ８　（０）、ＩＬ８−ＰＥ４０　（・）、ＩＬ６−ＰＥ４０−ＩＬ６　（ ロ）、ＩＬ６−ＰＥ６６””（■）。

発明の詳細な説明 本発明の上述のそしているいろな他の目的と利点は、ドメインＩａのアミノ酸配 列中の特定の点変異といろいろの欠失を含む変形組換えＰＥ分子の多数を作成す ることによりそしてそれらからのキメラタンパク質の多数を合成することにより 実施できる。そのような分子の実体に含まれるものは、ｐＢ０１ｍ！４１・２４ ７・２４８゜Ｐ　Ｅ（ｌ１ｍ＠マ、２４１　！４７．２４１　、　Ｐ　Ｅ　０１ ｗ５Ｔ、１）Ｉｙ２４１２４’１．２４８゜ＰＥ””’　△２４１−２５０．Ｉ Ｌ６−ＰＥ”′”−”’−２４１，２４９、１１，６−ドメインｌｌ−ＰＥ４０ ．ＴＧＦａ　−ＰＥ６６’°ｌ′Ｉ、ＣＤ４−ＰＥ６６”’″′および同様のも のである。

本発明を上述の新規の分子実体の多数の合成と試験により例示したので、いろい ろの他の分子実体はここに記述した方法により同様に合成できそしてこの発明の 範囲に包含されることに注目する。

他に定義しない限りは、全ての技術術語と科学術語は、この発明の分野に属する 当業者に理解されるのと同様の意味を持つ。しかし、ここに記述したそれらと同 様または同等の方法と物質は、本発明の実施と試験に使用でき、好ましい方法と 物質はここで記述する。以下述べる公刊物は引用によりここに包含される。他に 記述のない限り、ここで使用または考慮される技術は当業者に周知の標準的方法 である。物質、方法および例は説明だけのものであって、限定を意図していない 。

術語の「組換え」変異体、分子、またはＰＥおよび同様のものは、ここでは変異 体、分子またはＰＥ等を意味し、天然の産物ではなく、分子生物学および同等の ものの技術により計画的に作成されたものである。

術語の「実質的影響のない」は、細胞の正常機能が検出できる程度に影響を受け ていないことを示す。

変異体は、標準のオリゴヌクレオチドを用いた変異誘発により発生させた（ノン ノ他、１９８８年、Ｊ、Ｂｉｏ１．ｃｈｅｍ、　２６３：１３２０３−１８２０ ７）。

変異を含むＤＮＡ断片を、ＰＥ発現ベクターｐＶＣ４５（チャウトハ＋Ｊ　−他 、　ｆり　＊り１ｔｐＶｃ　４５　ｆ　＋Ｔ（ジンノ他、１９８９．Ｊ、Ｂｉｏ １．Ｃｈｅｍ、２８４　：１５９５３−１５９５９）中ヘサブクローンした。

ある種の変異は新しい制限酵素部位も導入した。

変異は、シークエカーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｌｓ）を使用するＤＮＡ配列決定法により最終的に決定した。

タンパク質の発現と精製 プラスミド（スツジールとモハット、　裏りを担持しているＥ、ｃｏｌｉ株ＢＬ ２１（λＤＥ　３）の培養液をアンピシリン（１００μｇ　／　ｍ　１　）を含 有するＬＢ培地中で生育した。０．６−０．８のＯＤｌ、。で培地に１ｍＭのＩ 　ＰＴＧを誘導し、３７°Ｃで約９０分間にわたり農産した。Ｏｍ、　ｐ　Ａシ グナル配列の存在は、ＰＥ変異体タンパク質をペリプラズム中へ分泌する原因に なる。ＰＥを下記のようにしてペリプラズムから抽出した；誘導期間の最終点で 、１５０ｍ１の培地を１０分間にわたり２０００Ｘｇで遠心分離し、ベレットを ７．５ｍｌの面精溶液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，４，１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ中２０％蔗糖）中にけん濁し氷上１０分間放置した。その面精けん濁液を 、１０・分間５０００Ｘｇで遠心分離し、ベレットを回収した。ベレットを６ｍ ｌの冷水中に静かにけん濁し、１０分間氷上に置き、１０分間１０，０００Ｘｇ で遠心分離した。この上澄み液（ペリプラズム）を回収し、ファルマシアＰＰＬ Ｃ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＰＰＬＣ）に付いているＭ　ｏ　ｎ　。

Ｑ　カラム（ＨＲ５１５）上に適用した。５ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ　ＨＣＩ、ｐＨ７，６）で洗浄し、４０ｍ１のＮａＣ１（緩衝液Ａ中０−４０ ０ｍＭ）で、次いでＮａＣ１の急勾配グラジェントで展開した。　ＰＥ変異タン パク質を、０．２２−０．２６ＭＮａＣ１で抽出した。

分析検定と動物毒性 ＡＤＰ−リボシル化活性は、コリールとカンデル（１９７１年、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、１４６＋　１４９６−１５０８）により記述されているようにして推 定された。細胞毒性活性を測定するためには、５ｗ１ｓｓ３Ｔ３　細胞ＩＯ’／ ｍｌを、毒素を添加する前に、２４孔血中で２４時間接種した。精製したタンパ ク質を、０．２％のヒト血清アルブミン（ＨＳ　Ａ）を含有するズルベコ燐酸緩 衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）中で希釈し、細胞に１６−１８時間添加した。細胞を［ ３Ｈ］−ロイシンで９０分間にわたりパルス−標識化し、トリクロロ酢酸（ＴＣ Ａ）沈澱性細胞随伴放射活性は、タンパク質合成の尺度として測定された。結果 を、毒素が添加されていない対照のパーセントとして表した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥ をラエムリ（１９７０年、Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５）により記述 されたようにして実施した。タンパク質のバンドをクーマツシー青Ｒ−２５０（ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ　Ｒ−２５０）で染色することにより可視化した 。タンパク質の濃度を、ウシ血清アルブミンを標準として使用して、クーマツシ ー青Ｇ−２５０結合検定（バイオ　ラド　プロティン検定（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ａ ｓ５ａｙ））により測定した。

動物毒性を試験するために、精製した毒素を、０．　２％Ｈ８Ａを含有するＤＰ ＢＳで希釈し、０．５ｍｌを８週令のマウスに１．Ｐ、注射し、４８時間後に死 亡したマウスの数を測定した。

ＰＥの発現とＰＥの変異型 新規の変異体のヌクレオチド配列を、表Ｉに示しである。複数の変異をしたタン パク質は、連続するサブクローニングにより作成した。マウス中と細胞培養物中 におけるＰＥの変異体の細胞毒活性を分析するためには、これらのタンパク質の 大量を殆ど同質になるまで精製する必要がある。これは、Ｔ７プロモーターに基 づく発現ベクター（その中でＰＥをコードしている配列の前にＯｍｐＡシグナル 配列がある。（図１））を構成することにより達成された。このベクターを使用 して、大量の可溶性のＰＥをペリプラズム中に分泌する。典型的な試験では、Ｐ Ｅはペリプラズム中に約２０−５０％のタンパク質を包含しく図３）、レーン！ 、３．５と７）、７０％純度またはそれより高い純度の分子はＭｏｎｏ　Ｑ上の 一回のイオン交換精製段階により得られる（図４Ａ−Ｄと図３．レーン２．４． ６と８）。変異に依存して、タンパク質は０．２２ないし０．２６ＭのＮａＣ１ １１度で溶離される。

例えば、４個の塩基性残基が酸性残基に変換したｐ　Ｅ　１）Ｉｎｓ７．２４１ １．２４７．２４ｓハ、ＰＥより後に溶離された６図４Ａと４Ｄ）　。０Ｄｅｂ ｏ　Ｏ，８で誘導した培地１１からの典型的な収率は、実質的に純粋な（〉９０ ％）タンパク質で１５−４５ｍｇの範囲にある（表ＩＩ）。

ＰＥと変異型ＰＥの細胞毒性と動物毒性表１．ｌＩ　ｉ：：示シタヨウ！：：、 ＰＥ”””　、！−ＰＥ△６−２２５は、３Ｔ３細胞に同等の細胞毒活性を持ち そしてマウスについても同等の毒性（Ｌ　Ｄ　ｓ。＝１μｇ）を持つが、一方ア ミノ酸４−２５２の欠失を持つＰＥ４０は、３Ｔ３細胞に対する毒性は検出でき ず、マウスに対してかなりより低い毒性（ＬＤ＋、、＝５ｏμｇ）を持つ。

Ｐ　Ｅ”””　トＰ　Ｅ△６−２２５　（Ｄ高細胞毒活性に関与するドメインＩ のカルボキシル末端における配列を精密に決定するために、ドメイン■の増加す る量を除去する一連の欠失の創作を行った。

これらの変異体の３Ｔ８への細胞毒活性を表■に示す。

ドメインＩａの殆ど全ては、３Ｔ８細胞へのこれら変異体の活性を減らさずに除 けた。例えば、アミノ酸６−２４５の欠失を持つ変異分子はｐＥＧ１ｍｌ＋７と 同等の活性を持つ。これらデータは、アミノ酸２４６−２５２が高細胞毒性に寄 与していることを示しているだろうことを示している。Ｌ　ｙ　ｓ　＠　？はＧ ｌｕに変換すると細胞結合を減らしそしてアミノ酸２４１−２５０が欠失される こと（ＰＥ”’″７・２４１−２６゜）が一つの実験で確定された。この分子も 、３Ｔ３細胞に対しは検出できる前活性を持っていなかった（表ＩＶ）。

シュードモナス外毒素の位置２４６，２４７と２４９に三個の塩基性のアミノ酸 を有するドメインＩａのカルボキシル末端は、ドメインよりにおける３６９，８ ６８と３６７のアミノ酸に水素結合していることは注目された（アルレッド他、 １９８１３．Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８３　 二　１３２０−ｉ３２４）。従って、これらのＰＥ伝達毒性における塩基性アミ ノ酸の役目を検討することに決めた。従って、これらのアミノ酸は単独にまたは 組み合わして変異する（表Ｖと図５）。これをするために、全長のＰＥ分子を利 用し、その中でＰＥ受容体を介する細胞結合を減少させるかまたは無くすために １ｙｓｉｎ（リジン）５７をグルタミン酸に変換した。２４６，２４７と２４９ における三個のアミノ酸をグルタミン酸またはグリシンの何れかに変換すると、 ３Ｔ３細抱えの細胞毒活性は大きく減少し、ＰＥ４０に見られるレベルまで到達 した。しか（）、それらを個々に変換すると、細胞毒活性の減少は観察されなか った（表Ｖ）。

２４６（ヒスチジン）、２４７（アルギニン）、および２４９（ヒスチジン）に おける陽電気で荷電したアミノ酸は他の荷電したアミノ酸で置換できるかを決め るために、若干数の他の置換した変異体を構成した。全ての３種のアミノ酸をリ ジンに変換した場合は、細胞毒活性は影響を受けなかった（表■）。

更に２４６と２４９における２個のヒスチジンをアルギニンに変換した場合も、 細胞毒の活性は影響を受けなかった。しかし、２４５，２４７と２４８の位置に グルタミン酸を導入すると、３７３細胞への細胞毒活性は大きく減少しモしてＩ Ｄ５ｏは約６００　ｎ　ｇ　／　ｍ　１へ増加した。いろいろなＰＥ変異体の細 胞毒活性は、ドメインＩａ上のカルボキシル末端に存在するアミノ酸の電荷に関 連するように見える（表■）。もしも２４５と２４９の位置における電荷だけを 考慮するならば、正味の正電荷の保持は細胞毒活性を維持するが、一方中性また は負電荷の存在は大きく細胞毒活性を減少させる。いろいろのＰＥ変異体の毒性 は、若干数の精製した変異体毒素をマウスに注射することによっても検討した。

表Ｖｌに示したように、２個だけがマウスにおいて低毒性を持っていた。

これらの一つは、ＰＥ　４０　（ＰＥΔ４−２５２）　’ｔｌす、他の一つはＰ 　Ｅ　ＧＩ″６Ｔ・２４６・２４７・２４１である。

１、　ｙｓ６？を０１１】に変換する変異とＰＥ６−２２９゜ＰＥＡ−２３９七 ＰＥＡ−２４５におけるような周辺の配列の多数の欠失は、マウスにおける約１ μｇのＬＤ。

を持つ分子を生産した。同様にして、２４６，２４７と２４９における塩基性ア ミノ酸をグルタミン酸に変換し、そして位置５７におけるリジンを保存した変異 体においても、マウスにおけるＬＤ、。は約１μｇであった。ＰＥ　Ｏ１＋＋Ｍ Ｔ、　２４１１．２４丁・２４ｎにおけるように二型の変異を組み合わせた時に のみ、細胞毒活性の大きな減少がありそして動物毒性はＰＥ４０におけるように アミノ酸４−２５２の欠失に等しい。

新規のキメラタンパク質の細胞毒活性：　Ｉ　１６−ＰＥ４０とその誘導体の研 究 酵素と化学品は標準の購買源から購入した。インク・−ロイキン６は、シーガル 他、１９９０年、Ｍｏ１．Ｃｅ１１　Ｂｉｏ、に記述されているようにして合成 し、精製した。ＡＤＰ−リボシル化検定は、コリール他、１９７１年、Ｊ、Ｂｉ ｏ１．Ｃｈｅｍ、２４６　：１４９６−１５０３に記述されているようにして行 った。放射性物質はアメルシャム・コーポレーシヨン（ｔ　ｈ　ｅ　Ａ、　ｍ　 ｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（イリノイ州、アーリントン・ハイ所 在）から購入した。

動物、細胞系および菌株 ＩＬ６−ＰＥ４０と誘導体についての毒性と血清レベル検定では、８週令の体重 １８−２０ｇのヌードマウスを使用した（株　Ｂａ１ｂ／Ｃ；フレデリック　カ ンサー　リサーチ　７ｙシリテイ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ　Ｆａｃｉｌｆｔｙ））。

Ｈ９２９とＨ１１１２細胞はＡ、ガズダール（Ｇａｚｄａｒ）（ＮＣＩ）の贈り 物であった。他の全ての細胞株はＡＴＣＣ（メリーランド州、ロツクヴイレ）か ら購入した。プラスミドは、Ｅ、ｃｏｌｉ株ＨＢＩＯＩ中で増殖し、導入可能な Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つＥ、ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（λＤＥ　３）中 で発現した。

プラスミド ＩＬ６−ＰＥ４０をコードしているプラスミドｐＣ３６８は、（シーガル他、１ ９８９．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５　：　９７３８ ）に記述されているようにして作成した。ＩＬｆ３−ＰＥ４０−ＰＥ４０とＰＥ ４Ｏ−ＩＬ６ＰＥ４０を構成するには、ＰＥ４０をコードしているＤＮＡをプラ スミドｐＶＣ３８７５（シーガル他、１９８９．Ｊ、Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ、２６ ４：１４２５６；シーガル他、１９８９．ＦＡＳＥＢ　Ｊ　３，２６４７）から 取り出し、部位変異に処しくクンケル他、１９８５．Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８２＋４８８）：そしてその変異は、ＮｄｅＩ 制限部位を、ＰＥ４０中の最後のコドンの後とＰＥ４０中の最初のコドンの前に 導入した。生成したプラスミド、ｐＣ３Ａ２０／Ａ２１をＮｄｅｌで切断し、１ ０８０ｂｐＰＥ４０遺伝子を、ＮｄｅＩで部分的に切断したプラスミドｐｃｓｅ ｓにリゲートシた。ＩＬ６−ドメイン［丁−ＰＥ４０とドメインＩＩ−ＩＬ８− ＰＥ４０を構成するためには、ｐＶＣａ８７５を部位変異に処し、そしてその変 異はＮｄｅＩ制限部位を、ＰＥ４０の最初のコドンの前とアミノ酸３６４をコー ドしているドメイン［１の最後のコドンの後に導入した。得られたプラスミド： 　ｐＣ３Ａ２０／Ａ２２は、ＮｄｅＩで制限し、３３３ｂｐ断片を、ＮｄｅＩで 部分的に切断したｐｃｓｅｓにリゲートした。

ＩＬ６−ＰＥ４０△３６４−１８０を構成するには、ＩＬ６−ＰＥ４０を５ａｌ Ｉで部分的に切断し、ＢａｍＨｌで完全に切断し、そしてｐｃｓ９　（シーゲル 他、１９８９年、Ｊ、Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ、２６４　：１４２５Ｇ）からの５ａ ｌＩ、ＢａｍＨＩ断片にリゲートした。

ＩＬ６−ＰＥ４０−ＩＬ６を構成するには、ＩＬ６をＢｓｔＸＩとＢａｍＨＩで 切断し；ＢｓｔＸ１部位に近い方に位置しているＩＬ６配列、アミノ酸Ａ１ａ、 Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｖａｌをコードしているセ グメント、および末端であってＰＥ中のアミノ酸５５６におけるＰｐｕＭＩ部位 に到るまで位置しているＰＥ配列を含む二重のオリゴヌクレオチドにリゲートし た。生成した中間体のベクター、ｐＪＬ［！ｉｎｔをＰｐｕＭＩとＥｃｏＲＩで 切断し、５８０ｂｐ断片を、同様にして切断してｐｃｓｅｓから得られた４ｋｂ ＤＮＡ分子にリゲートした。

ＩＬＬ−ＰＥ６６’°Ｉｌ＋を構成するためには、ｐＣ３６８をＮｄｅＩで部分 的に分解し、ＥｃＯＲＩで完全に切断して、Ｔ７プロモーターとＩＬ６を含着す る３０００ｂｐベクタ一断片を得た。全長の変異したＰＥをコードしているｃＤ ＮＡをＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、同様に切断したｐｃｓｅａ断片中に断片 −トした。

変異体のＰＥは、プラスミドｐＪＹ３Ａ１１３６−１．３　（ｐＶＣ４５／４Ｅ ）中に搬入した。

ＩＬ６−リンカー−ＰＥ４０を構成するためには、ｐｃｓｅｓをＮｄｅＩで部分 的に切断し、モしてＢｓｕ３６Ｉで完全に切断した。

（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３　（リンカ−）をコードン、ソシて配列に沿って５′末端 上のＢｓｕ３６Ｉ部位に続いていてその３′末増にＮｄｅ１部位を形成している 残りのＩＬ６配列を含む、二重のオリゴヌクレオチドは、調製したｐＣＳ６８ベ クター中にリゲートされた。

ＩＬ６−　ＩＬ６−ＰＥ４０を構成するために、ｐｃｓｅｓを部分的にＮｄｅｌ で切断しそして両方の（−カ所で切断した）直線ベクターと（二カ所で切断した ）挿入部のバンドを精製し、互いにリゲートした。

図２はいろいろの構造を線画で図示しそして表Ｖｌ［はプラスミドの番号とここ に記述した方法に従ってそれらから誘導した該当するキメラタンパク質を掲示し た。

１Ｌ８−ＰＥ４０と誘導体の発現と精製全ての融合タンパク質を、旦、ｃｏｌｉ ＢＬ２１　（ＤＥ３）中で発現し、旦、ｃｏｌｔの不溶画分（顆粒画分）から、 （シーゲル他、１９８９年、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８５：９７３８）に記述されているようにして 単離、精製した。簡単に説明すると、７Ｍ　グアニジン−ＨＣｌ中での顆粒画分 の変性と燐酸塩緩衝液中の再生後、融合タンパク質は陰イオン交換とゲルろ過ク ロマトグラフィーを使用して均一になるまで精製しそして各々の精製した毒素調 製物のＡＤＰ−リボシル化活性を標準法により測定した。

ＩＬ６−ＰＥ４０と関連融合タンパク賃金てのＩＬ６−毒素融合タンパク質の毒 性は、各々の試験で使用された未処理の腫瘍細胞に対する処理腫瘍細胞における タンパク質合成のレベルを検定することにより測定した（シーゲル他、１９８９ 年、Ｐｒｏｃ、Ｎｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８５　：　９７３８） 。

キメラタンパク質をいろいろな濃度で細胞に添加し、２４時間にわたり３７℃で インキュベートした。次に、細胞タンパク質中への［３Ｈ１０イシンの取込みを 測定した（シーゲル他、１９８９年、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、８５：９７３８）。

競合解析を、腫瘍細胞へのＩＬ６−毒素の添加直前のｒｌｌ、６の添加により行 なった。

受容体結合解析 １２″Ｉ−Ｉ　Ｌ　６の特異的結合と標識化工程は、上述したようにして行った 。これらの実験においては、　＋２ｆｉ　１−ＩＬ６の一定量（０，５ｎｇ）を 細胞に添加しｒｌｌ６とＩＬ６−毒素のいろいろな量で競合せしめた。ｒｌｌ６ とＩＬ６−毒素はそれらの各々のモル重量を使用して等モル量になるように調節 した。　”’Ｉ−ＩＬ６と競合体を細胞に添加した後、５分間に一度橿やかに攪 拌しなから０℃で１５０分間にわたりインキュベートした。

次いで、細胞を、大過剰の結合緩衝液と共に少な（とも３回遠心分離し、未結合 の　１！６ｌ−ＩＬ６を除いた。

次いで５細胞に付随した放射活性をベックマンガンマカウンター中で測定した。

ＩＬ６誘導体の動物毒性と血清レベル ２−４匹のマウス群を使用して、ＩＬ６−ＰＥ４０゜ＩＬ６−ドメイン［１，− ＰＥ４０とＩＬ６−ＰＥ６６””の毒性を測定した。キメラ毒素を一回用量で腹 腔内（■、ｐ、　）投与し、その動物を３日間にわたり観察した。血清のレベル を、キメラトキシンの一回Ｎ、Ｐ、投与の後、血清レベルをいろいろの時間に測 定した。生物活性は、上述したようにしてＵ２６６細胞への血清試料の細胞毒性 を測定することにより測定した。キメラ毒素の濃度は、Ｕ２６６細胞への精製キ メラ毒素の添加により作成した標準曲線と、各々の血清試料のＩＤ、。を比較す ることにより推定した。

図６は、若干数の異なるキメラタンパク質の５ＤＳ−ＰＡＧＥを示している。こ の研究で使用した全てのキメラタンパク質は９５％以上の純度であって、期待し たＡＤ　Ｐ　−ＩＪボシル化活性（データを示していない。）を持っていた。

ＩＬ６−ＰＥ４０誘導体の細胞毒性 図７に示しそして表ＶＩＩに纏めたデータは、ＩＬ６〜ＰＥ４０誘導体が骨髄腫 細胞Ｕ２６Ｇへの細胞毒性に基づいて４種の群に分類されることを示している。

群１誘導体は、Ｕ２６６細胞に対してＩＬ６−ＰＥ４０より毒性が高く、群２は ＩＬ６−ＰＥ４０に等価の毒性であり、群３誘導体はＩＬ６−ＰＥ４０より約３ 倍毒性が少ないが、一方群４誘導体はＵ２６６細胞に毒性がなかった。

群１は２種の毒素からなり、その一番目は、位置５７゜２４６．２４７と２４９ に変異を持つ天然のＰＥ（８６ｋＤａ）に融合したＮＬ８を含有しているＩＬ８ −ＰＥ５８４Ｇ１ｍである。元々はリジン、ヒスチジン、アルギニンとヒスチジ ンをコードしているこれらのアミノ酸はその各々がグルタミン酸に変換していた 。ＩＬＬ−ＰＥ６６４０１＋＋は、骨髄種細胞Ｕ２６６への活性がＩＬＬ−ＰＥ ４０より８倍高くて、ＩＤ５ｏ＝　１　、Ｏｎ　ｇ／ｍ　１　（表■１１）であ る。

群工の第２の部員は、ＰＥ４０が続いて付いているＰＥドメインｌ［（アミノ酸 ２５３−３６４）に、融合したＩＬ６からなるＩＬ６−ドメイン［ｆ−ＰＥ４０ である。

ドメイン■は、細胞膜を通過する毒素のプロセシングと転移に関与する。ＪＬ６ −ドメインｌｌ−ＰＥ４０は、骨髄腫細胞Ｕ２６６に対してＩＬ６−ＰＥ４０よ り１゜６倍活性が高く、Ｉ　Ｄ＋、＋１＝　５　ｎ　ｇ／　ｍ　１　（表Ｖｌ＋ ）である。

群２も２種の部員、ＩＬ６−ＰＥ４０△３６５−３８０とＩＬ６−リンカー−Ｐ Ｅ４０を含む。ＩＬ６−ＰＥ４０Δ３６５−３８０はアミノ酸３６５−３８［］ 　（ドメインＩＢの半分のアミノ基）を欠失したＰＥ４０分子に融合したＩＬ６ からなる。ジスルフィド橋を含有するアミノ酸３６５−３８０の除去はＴＧＦα −ＰＥ４０の活性を増すことが見出された。ＰＥ４０△３６５−３８０のＩ　Ｌ 　６変換においては、Ｕ２６６細胞に対する細胞毒性はＩＬ６−ＰＥ４０のそれ （Ｉ　Ｄ　ｓｏ＝　８　ｎ　ｇ　／　ｍ　Ｉ　）と同等であったが、この構成は ＩＬ８−ＰＥ４１）よりキメラ毒素のより高い収率をもたらした（データを示さ ず。）。

群３には２種の誘導体がある。ＩＬ６−ＰＥ４０−ＰＥ４０は２個の連続するＰ Ｅ４０分子に融合したＩＬ６からなる。融合タンパク質のＰＥ４０部分を二重に することにより、２個の酵素的に活性であるドメインを含有することにより分子 の細胞毒活性を増加しようと試みた。

新規の融合タンパク質ＩＬ６０−ＰＥ４０−ＰＥ４　ＱはＵ２６６細胞に毒性が あるが、それはＩＬ６−ＰＥ４０より３倍毒性が少なかった。

ＰＥ４０に融合した２個の隣接するＩＬ６分子からなるＩＬ６−ＩＬ６−ＰＥ４ ０は、ＩＬ６受容体への結合を増す目的で開発した。Ｕ２６６細胞への細胞毒活 性では、ＩＬ６−　ＩＬ６−ＰＥ４０はＩＬ６−ＰＥ４０より３倍毒性が低（、 ＩＤ、。は２５ｎｇ／ｍｌであることを示した。

群４は３部員、ＰＥ４Ｏ−ＩＬ６−ＰＥ４０．　ドメインＩＩ−ＩＬ６−ＰＥ４ ０およびＩＬ６−ＰＥ４０−ＩＬ６からなる。２種の誘導体ＰＥ４０−　ＩＬ６ −ＰＥ４０とドメインＩｆ−ＩＬ６−ＰＥ４０は、ＰＥ４０分子またはドメイン Ｉｌ（アミノ酸２５３−３６４）のいずれもＩＬ６−ＰＥ４０のアミノ末端に結 合しているという点で類似している。これら分子のいずれもＵ２ｆ３６ｍｌ？ｉ ！）に対して毒性がなく　（ＩＤｓｅ＞２５０ｎｇ／ｍ１．）　、低収量のタン パク質を生産した（データを示さず。）。

ＩＬ６のＮ−末端はこれらの付加によりブロックされるので、受容体へのＩＬ６ の結合はブロックされているかも知れない。ＩＬ６−ＰＥ４０−ＩＬ６はＰＥ４ ０のアミノ末端とカルボキシル末端に融合しているＩＬ８からなる。この融合タ ンパク質も実質的には不活性であった。この結果は、ＰＥ４０のカルボ午シル末 端上のＩＬ６はキメラタンパク質の１活性を阻害していることを示している。

Ｕ２６６細胞へのｒ　ＩＬ６とのＩＬ６−）キシン誘導体の競合 Ｕ２６６細胞への増加した細胞毒性を持つ２種のＩＬ８−ＰＥ４０誘導体のＩＬ ８受容体への結合を評価するために、ＩＬ６競合検定を実施した。この試験では 、Ｕ２６６細胞上へのＩＬ６−毒素の細胞毒の影響に競合させるために、ｒ　Ｉ Ｌ６を過剰に添加した。図８に示したように、ｒＩＬ６の１０００ｎＨの添加は 、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ６−ＰＥ６６””の細胞毒活性を減らして、Ｕ２５５細 胞上のタンパク質合成を１５％から９８％にした。同様な結果は、２５ｎｇ／ｍ ｌのＩＬ６−ドメイン［１−ＰＥ４０を使用した時にも得られた（図８）。

これらのデータは、Ｉ　Ｌ　６−　Ｐ　Ｅ　６６　””とＩＬ８−ドメインｌｌ −ＰＥ４０の両方は、ＩＬ６受容体を介して特異的に作用することを示している 。

ＩＬ６受容体の異なる量を発現する細胞上のＩＬ６−ＰＥ４０、Ｉ　Ｌ　６−ド メイン［ＩおよびＩＬ６−ＰＥ６６’°１″の影響 ＩＬ６−ＰＥ４０は、ＩＬ６受容体の異なる数量を発現する骨髄腫と肝臓癌細胞 系細胞の両方に細胞毒があることが以前に示された（シーゲル他、１９９０年、 上述）ｏ　ＩＬ６−ドメイン［ｌ−ＰＥ４０とＩＬ６−ＰＥ６６’°１″′がＩ Ｌ６受容体を発現する他の細胞により毒性があるかどうかを正確に決めるために 、いろいろの腫瘍細胞を測定して見た。更に、これらの同じ腫瘍細胞系へのＰＥ ６６””とＰＥ（天然）の細胞毒性を決定した。それらの結果は、表Ｖ［［Ｉに 纏めである。

ＩＬ６−ドメイン［１−ＰＥ４０は、肝臓癌細胞系ＰＬＣ／ＰＲＦ１５．ＭＥＰ 　３ＢおよびＨＥＰ　Ｇ２に対して、ＩＬ６−ＰＥ４０より細胞毒性があり（表 ＶｊＩＩ）、ＩＬ６−ＰＥ６６”１″は、ＩＬ６−ドメインｌ［−Ｐ　Ｅ　４０ またはＩＬ６−ＰＥ４０よりも、肝臓癌細胞系ＰＬＣ／ＰＲＦ１５およびＨＥＰ 　Ｇ２に対して、毒性が高かった。驚くべきことに、Ｉ　Ｌ　６−ＰＥ　６６” ”は、ＩＬ６−ドメインｌｌ−ＰＥ４０：ｊ”りｌ；！ＩＬ６−ＰＥ４０（Ｄ’ イずれよりも、ＨＥＰ　３Ｂ細胞に対して僅かに毒性が低かった。肝臓癌細胞系 ５Ｋ−ＨＥＰは全てのＩＬ６−毒素分子に対して感受性がなかった（表Ｖ［ＩＩ ）。

類表皮系の癌細胞系Ａ４３１とＫＢについても、ＩＬ６−毒素キメラ類に対する その感受性を評価した。ＩＬ６−ＰＥ４０に対して感受性のないＡ４３１細胞は 、ＩＬ６−ドメインｌｌ−ＰＥ４０とＩＬ６−ＰＥ６６’°１ｍに対して中程度 に活性がある。細胞系、ＫＢは全てのＩＬ６−毒素分子に対して感受性がない。

更に、骨髄腫細胞系Ｈ９２９も、全て３種のＩＬ６毒素に対して感受性であるこ とが見出されている。

これらの同じ細胞系に対する天然ＰＥと転換変異したＰＥ、ＰＥ６６’°１″の 細胞毒性も測定した。ＰＥは試験した全ての細胞系に対して細胞毒性があった（ 　Ｉ　Ｄ　ｈ。＝５ｎｇ／ｍｌないし６８ｎｇ／ｍｌ）。ＰＥ６６””は試験し た細胞系のいずれに対しても細胞毒性がなかったということは（ＩＤｓｏ＞６２ ５ｎｇ／ｍｌ）、キメラ分子における可能性のある有用性を示している（表Ｖ［ ｌ［）。

競合解析も、類表皮癌細胞であるＡ４３１と肝臓癌細胞であるＰＬＣ／ＰＲＦ１ ５とＨＥＰ　Ｇ２への競合剤としてｒ　ＩＬ６を使用して実施した。そめ結果は 、ＩＬ６−ドメイン［ｌ−ＰＥ４０とＩＬ６−ＰＥ６６”’−は工Ｌ６受容体に 特異的であることを確定した（データを示さず。） ｒｌＬ６．ＩＬ６−ＰＥ４０および誘導体による　ｌｌａ　Ｊ−ＩＬ６の置換 キメラ毒素工Ｌ６−ドメインｌｌ−ＰＥ４０とＩＬ６−ＰＥ６６”’″はＩＬ６ −ＰＥ４０より毒性が高いので、増加した活性は増加した結合によるのかどうか を決めることは興味のあることである。この実験のために、”’Ｉ−ＩＬ６を結 合解析のためのリガンドとして使用した。骨髄腫細胞Ｕ２６６を、結合緩衝液７ ０μｍ中５×１０＠個の細胞当り０．５　ｎｇ／ｍｌの　１″■−■Ｌ６と共に 、そして次第に増やして添加する量のｒｌＬ６、ＩＬ６−ＰＥ４０．ＩＬ６−ド メインｌｌ−ＰＥ４０およびＩ　Ｌ　６−ＰＥ　６６４’ｌ”と共にまたはなし で、インキュベートした。

結果はｒｌＬ６はＩＬ６−ＰＥ６６””よりも僅かに多く　”’Ｉ−ＩＬ６をＩ Ｌ６受容体から立ち退かすことを示している（図９）。しかし、ＩＬ６−ドメイ ン１ｌ−ＰＥ４０とＩ　Ｌ　６−ＰＥ　６６４”−が、”５Ｉ−ＩＬ６をＩＬ６ −ＰＥ４０と同程度に立ち退かすことは、キメラ毒素類がＩＬ６受容体に同程度 の親和性でもって結合していることを示している。従って、ＩＬ６−ドメイン【 ｌ−ＰＥ４０とＩ　Ｌ　６−ＰＥ　６６”１″の増加する活性は、細胞への増加 する結合によるのではな（て、キメラタンパク質の他の性質によると結論した。

ヌードマウスにおけるＩＬ６−ＰＥ４０と誘導体の毒性抗癌剤としてのＩＬ６− ＰＥ４０．ＩＬ６−ドメイン１ｌ−ＰＥ４０．およびＩ　Ｌ　６−　Ｐ　Ｅ　６ ６　””の可能性のある有用性を決めるために、それらの動物における毒性を測 定した。抗腫瘍感応性を検討するためにヌードマウスを使用するので、それらを キメラ毒素の毒性を検討するのにも使用した。マウス（２−４匹／群）に、ＩＬ ６−ＰＥ４０については５μｇないし５０μｇ、ＩＬ６−ドメインｌ１−ＰＥ４ ０については５μｇないし３０μｇそしてＩＬ６−ＰＥ６６’６１″については ５μｇないし２０μｇの範囲のＩＬ６−毒素類を単一薬量で１．Ｐ、投与した（ 表［Ｘ）。動物を死亡率について７２時間にわたり観察した。ＬＤＢ。は、ＩＬ ６−ＰＥ４０とＩＬ６−ドメイン［１−ＰＥ４０については２０μｇそしてＩＬ ６−ＰＥ６６””については１０μｇであった。

ヌードマウスにおけるＩＬ６−毒素類の血清レベルヌードマウスに、ＩＬ６−Ｐ Ｅ４０．ＩＬ６−ドメインＩ［−ＰＥ４０とＩ　Ｌ　６　Ｐ　Ｅ　６６　”’” を１．Ｐ、注射しそして血清試料を５分間、３０分間、１時間、２時間、４時間 、８時間および２４時間で採取した。キメラ毒素の血Ｉｔノベルを、投与後のい ろいろな時間におけるマウス血清中に見出される生物的に活性のある物質の細胞 毒性を測定することにより測定した。

表Ｘに示したように、ＩＬ６−ＰＥ４０．ＩＬ６−ドメイン［１−ＰＥ４０とＩ Ｌ６−ＰＥ６６’°１の全ては、１時間以内に最高の血清濃度に達しそして８時 間後まで検出できた。最高のレベルは、ＩＬ６−ＰＥ４０．　ＫＬ６−ドメイン ［ｆ−ＰＥ４０とＩＬ６−ＰＥ６６”１″について、それぞれ３μｇ／ｍｌ、６ 　ｕ　ｇ／ｍ　ｌおよび１２μｇ／ｍｌであった。

表Ｘ丁とＸＩＩは、同様に作成したＴＧＦａ−ＰＥ６６’°１′ｌとＣＤ４−Ｐ Ｅ６６’°１゛の性質を示している。

概括すると、ここに示したデータは、四速に新規の、改良した、高い細胞毒特異 性を持つシュードモナス変異体とキメラ毒素が得られたことを示している。動物 で試験すると、これらの組換え的に作成したキメラタンパク質は該当する未変異 分子よりより低い動物毒性を持っている。本発明に従った標的特異性の細胞毒的 組成物は、本発明のキメラ毒素の細胞毒的量を滅菌した、無毒性の担体中に包含 する。

標的細胞を殺滅する方法は、殺滅するのを所望する細胞を、他の細胞への実質的 副作用なしに、単一用量または繰り返し用量で本発明のキメラ毒素の細胞毒量に 接触させることからなる。

勿論標的剤は、他の細胞への実質的影響なしに殺滅されると標的された細胞を認 識する部分であればどれであってもよい。そのような標的剤の例は、抗体、ホル モン、サイトカイン、受容体、成長因子、抗賭および同様のものである。

ここに記述した方法は好ましくそして本発明を実施するための最良の方法である が、ここに教示したように、当業者に周知の方法も同様の結果と生物学的に活性 なキメラ毒素等を得るのに使用されてもよいということを特に言及する。

寄託 プラスミドｐｖｃ　４５／４　ＥとｐＣ３６４Ｇ（これからは、本発明に従って いるいろなキメラ毒素が作成されリーランド州、ロックヴイＩ〕、バークローン ・ドライブ１２３０１）に各々寄託番号第６８３１０号と第６８３１３号で、１ ９９０年４月１９日と２３Ｂに行われた。

寄託物は、生存して保存されていなければならず、特許の有効期間、寄託から３ ０年間の期間、または寄託試料への要求の最後の日から５年間の何れか長い期間 にそれらがもしも生存しなくなったら交換しなければならず、そして特許が発行 されれば、法律の定める所に従って制約なしに公衆に人手されるようになってい なければならず、特許商標局長は要求があれば寄託物を入手しなければならない 。

上述の実施例と実施態様は、ここでは説明だけのために記述したものであり、そ れらに照らしたいろいろな変化、経路と変形は、当業者に示唆されたものである だろうこととそしてそれらは本出願の精神と範囲と付属した請求項の範囲内に包 含されるべきであることは理解される。

表■ 変異体の配列 新規制限部位 表【１ Ｍｏｎｏ　Ｑ　の後の変異ＰＥ分子の回収ＰＥ　４６　＞９５ ＰＥ”ｗ６’　３９　９５ ｐＦ、０１ｍ２４・・　２４丁・　２４１　１９　７０表１１１ Ｓｗｉ　ｓ　ｓ　３７３細胞上とマウスにおけるＰＥとＰＥの変異型の毒活性 毒活性 ＰＥ””’　１００　１ ＰＥ△６−２２５　１００　１ 表［Ｖ ドメインＩ欠失変異体の ８Ｔ３細胞上への細胞毒活性 ＰＥΔ４−２５２　＞２０００ 表Ｖ ドメインエの点変異体の ３Ｔ３細胞変異体への細胞毒活性 Ｐ　Ｅ　Ｏ１ｍ！４磐、２４Ｔ、ｉ４１　、　（３）ＰＥＯＩ−８７１００、（ ＋３） ｐ　Ｅｏｔ、ｓｖ、２４ｓ　ｌ　３５　（＋　１　）ｐＢｏ＋−ｓ７．ｚｎｉ　 ６Ｑ　（＋１）ｐ　Ｅ＋１１１１３７・　２４”　６０　（＋１）ＰＥ”’藝丁 、！４−８２４７．２４＊　＞　２　ｏ　ｏ　Ｑ　、　（３）ｐ　Ｅ　＋１ｌａ ６？、５１ｒｆｆｉ４＃、２４フ””　＞２０００　（Ｑ）ｐ　Ｅｏｔ−ｓｖ、 Ｌ１２４１２４Ｔ、２４１　ｌ　Ｑ　Ｏ（＋　３）ＰＥ””マ、　Ａｒｍ！４・ 、ｉ４ｓ　５０　（＋３）ｐ　ＥＧｌ＋＋ＡＴ、２４８．２４１２４＄　６００ 　（１）性または塩基性残基の数に基づく。

表Ｖｌ マウスにおけるＰＥ変異体の前活性 ＰＥΔ４−２５２　５０ ＰＥΔ８−２２４　１ ＰＥΔ６−２３９　１ ＰＥΔ６−２４５　１ ＰＥ”罵Ｓ丁　Ｉ Ｐ　Ｅ　（ｌ１ｗ２４−・　２４丁、２４Ｍ　ｌ二〇 〇二 鑓隼 ：二」 −へ　閃　マ　ロ識ロ責 駄　砿　貼　駄　−１ 表ｆＸ ＬＤｓａ解析 分子　注射量　＃死亡数／＃マウス数 表Ｘｌ ＣＤ４（１７８）ＰＥ６６”’″　１．５ゝ−Ｔ７プロモーター　で？コ　結合 ドメイン（１）ロ　リボゾーム結合部位　ロ　翻訳ドメイン（ＩＩ）図１ フラクション番号 フラクション番号 フラクション番号 図４０ フラクション番号 ＩＬ６動ｌｎｇ）　−１０００−１０００要約書 低動物毒性と高い殺細胞活性の改良シュートモカス外毒素が記述されている。陽 性に荷電したアミノ酸残基を陽電荷のないアミノ酸残基で置換すると、顕著に変 化した外毒素が得られる。新規の外毒素を適当な標的剤と結合すると、所望の細 胞体を殺滅するための殺細胞特異性を提供する。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４年１１月１１日−

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．ｐＶＣ４５／４ＥとｐＣＳ６４Ｇからなる群がら選択されたプラスミド。
2. ２．ＡＴＣＣに第６８３１０号の寄託番号で寄託されているｐＶＣ４５／４Ｅで ある請求項１記載のプラスミド。
3. ３．ＡＴＣＣに第６８３１３号の寄託番号で寄託されているｐＶＳ６４Ｇである 請求項１記載のプラスミド。
4. ４．少なくとも一個の標的剤と一個の細胞毒のＰＥ断片からなるキメラタンパク 質を製造する方法であって；請求項２に記載のプラスミドに標的剤をコードして いる遺伝子を付加することにより新規のプラスミドを構成し、次いで適当な発現 ベクター中の新規プラスミドを発現することにより該標的剤を含むキメラタンパ ク質を取得する段階からなる方法。
5. ５．陽性に荷電したアミノ酸残基を、陽電荷のないアミノ酸残基で置換した組換 え変異シュードモナス外毒素（ＰＥ）であって、その結果該変異ＰＥは未置換の 外毒素分子に比較してより低い動物毒性を持っている外毒素。
6. ６．少なくとも３個の陽性に荷電したアミノ酸残基が置換されている請求項５記 載のＰＥ。
7. ７．陽電荷のない該アミノ酸残基がグルタミン酸、グリシンまたはそれらの組み 合わせである請求項６記載のＰＥ。
8. ８．ＰＥ−Ｇｌｕ−５７，２４６，２４７，２４９、ＰＥ−Ｇｌｕ−５７Δ２４ １−２５０、およびＰＥ−Ｇｌｕ−５７−Ｇｌｙ２４６，２４７，２４９からな る群から選択された請求項７記載のＰＥ。
9. ９．殺滅すると標的にした細胞上の特異部位を認識する標的剤に結合した請求項 ５記載のＰＥであって；生成した、標的剤に結合したＰＥが、同じ標的剤に結合 した未置換ＰＥ分子と比較して改善された性質を持つＰＥ。
10. １０．該標的剤が抗体またはその断片、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカ イン、抗原または受容体である請求項９記載のＰＥ。
11. １１．該標的剤が抗体またはその断片である請求項１０記載のＰＥ。
12. １２．該標的剤がペプチドホルモンである請求項１０記載のＰＥ。
13. １３．該標的剤が成長因子である請求項１０記載のＰＥ。
14. １４．該標的剤がサイトカインである請求項１０記載のＰＥ。
15. １５．該標的剤が受容体である請求項１０記載のＰＥ。
16. １６．該標的剤が抗原である請求項１０記載のＰＥ。
17. １７．ＩＬ６−ＰＥ６６−４Ｇｌｕ，ＩＬ６−ＰＥＧｌｕ５７Ｇｌｙ２４６，２ ４７，２４９、ＴＧＦα−ＰＥ６６−４ＧｌｕおよびＣＤ４−ＰＥ６６−４Ｇｌ ｕである請求項１０記載のＰＥ。
18. １８．ＩＬ６−ＰＥ６６−４Ｇｌｕである請求項１７記載のＰＥ。
19. １９．ＩＬ６−ＰＥＧｌｕ５７Ｇｌｙ２４６，２４７，２４９である請求項１７ 記載のＰＥ。
20. ２０．ＴＧＦα−ＰＥ６６−４Ｇｌｕである請求項１７記載のＰＥ。
21. ２１．ＣＤ４−ＰＥ６６−４Ｇｌｕである請求項１７記載のＰＥ。
22. ２２．請求項９記載のＰＥの殺細胞量と薬学的に許容できる担体からなる組成物 。
23. ２３．殺滅すると標的にした細胞を、請求項２２記載の組成物の細胞毒量と接触 させることからなる標的にした細胞毒性を発揮する方法であって；該標的細胞は 、他の細胞への実質的な影響なしに標的剤により認識されるそれらである方法。
24. ２４．ＩＬ５６−ドメインＩＩ−ＰＥ４０。
25. ２５．ＩＬ６受容体を持つ細胞を殺滅するために有効な量の請求項２４記載のＰ Ｅ分子、および薬学的に許容できる担体からなる組成物。
26. ２６．ＩＬ６受容体を発現する細胞を殺滅する方法であって； ＩＬ６受容体を発現する細胞に、請求項２５記載の組成物の殺細胞量を接触させ ることからなる方法。
27. ２７．標的にした細胞毒性を発揮するのに使用する組成物であって； 抗体またはその断片、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン、抗原および 受容体からなる群から選択された標的剤に結合した、陽電荷のない陽性に荷電し たアミノ酸を持つ組換え変異シュードモナス外毒素の殺細胞量；および薬学的に 許容できる担体からなる組成物。
28. ２８．標的にした細胞毒性を発揮するための薬剤の製造において、 抗体またはその断片、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン、抗原および 受容体からなる群から選択された標的剤に結合した、陽電荷のない陽性に荷電し たアミノ酸を持つ組換え変異シュードモナス外毒素の殺細胞量；および薬学的に 許容できる担体からなる組成物を使用する方法。
29. ２９．ＩＬ６受容体を発現する細胞を殺滅するのに使用する組成物であって； ＩＬ６受容体を持つ細胞を殺滅するのに有効な量のＩＬ５６−ドメインＩＩ−Ｐ Ｅ４０、および薬学的に許容できる担体からなる組成物。
30. ３０．ＩＬ６受容体を発現する細胞を殺滅するための薬剤の製造において、 ＩＬ６受容体を持つ細胞を殺滅するのに有効な量のＩＬ５６−ドメインＩＩ−Ｐ Ｅ４０、および薬学的に許容できる担体からなる組成物を使用する方法。