CN103596985B - 对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3特异的人单克隆抗体及其用途 - Google Patents

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    • G01N2400/40—Glycosaminoglycans, i.e. GAG or mucopolysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate, hyaluronic acid, heparin, heparan sulfate, and related sulfated polysaccharides

Abstract

本文描述了以高亲和力结合GPC3或GPC3上硫酸类肝素（HS）链的人单克隆抗体的鉴定。本文描述的抗体能够抑制HCC细胞生长和迁移。提供了对GPC3或GPC3上HS链特异的人单克隆抗体，包括免疫球蛋白分子例如IgG抗体以及抗体片段例如单结构域VH抗体或单链可变区片段（scFv）。还提供了包含结合GPC3或GPC3上HS链的抗体的组合物、编码这些抗体的核酸分子、包含所述核酸的表达载体和表达所述核酸的分离的宿主细胞。还提供了治疗癌症和/或抑制肿瘤生长或转移的方法。还提供了检测受试者中的癌症以及确认受试者的癌症的诊断的方法。

Description

对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3特异的人单克隆抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年4月19日提交的美国临时申请No.61/477,020的权益，该临时申请以引用的方式全文纳入本文。
技术领域
本公开内容涉及对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）或GPC3上的硫酸类肝素特异的抗体以及它们用于治疗癌症的用途。
背景技术
肝癌在世界上最流行的肿瘤中位居第五并且在癌症相关死亡的最常见原因中位居第三（Boschetal.,Gastroenterology127:S5-S16,2004；El-Seragetal.,Gastroenterology132:2557-76,2007）。根据美国癌症学会，肝细胞癌（HCC）占肝癌病例的约75％。往往直到晚期肝癌才会有症状。外科手术是肝癌的标准治疗，因为这种类型的癌症对大多数的化疗药物反应不好。因此，迫切需要开发具有不同作用机制的新药物。免疫治疗代表一种新方法，但是其仍然是一个挑战，这主要是因为没有良好的肿瘤特异性靶位。
硫酸类肝素蛋白聚糖中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族通过与糖基磷脂酰肌醇（GPI）共价连接而锚定到细胞表面。在脊椎动物中，已经鉴定了六个家族成员（GPC1-6）。磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白能够改变细胞信号通路并且促进细胞增殖和组织生长。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）在HCC和一些其他的人癌症包括黑色素瘤、肺的鳞状细胞癌和卵巢的透明细胞癌中高表达，但是在正常的组织中不表达（Ho和Kim,EurJCancer47(3):333-338,2011）。GPC3基因编码70kDa的前体核心蛋白，所述前体核心蛋白可被弗林蛋白酶切割产生40kDa的氨基（N）端片段和30kDa的膜结合羧基（C）端片段。所述C端具有两个硫酸肝素（HS）聚糖链。GPC3蛋白通过糖基磷脂酰肌醇锚连接到细胞膜。GPC3结合Wnt和Hedgehog信号蛋白（Capurroetal.,DevCell14:700-711,2008；Capurroetal.,CancerRes65:6245-6254,2005），并且还能够通过其HS聚糖链结合碱性生长因子例如成纤维细胞生长因子2（Songetal.,JBiolhCem272:7574-7577,1997）。
GPC3的功能丧失型突变引起过度生长综合症（Simpson-Golabi-Behmelsyndrome）——一种罕见的伴X染色体的过度生长疾病（Piliaetal.,NatGenet12:241-247,1996）。GPC3缺陷的小鼠具有类似的症状（Cano-Gaucietal.,JCellBiol146:255-264,1999）。在转基因小鼠中，过表达GPC3可抑制肝细胞增殖和肝再生（Liuetal.,Hepatology52(3):1060-1067,2010）。另外，Zittermann等人最近指出，用慢病毒感染的表达可溶性GPC3（sGPC3）的HCC细胞具有更低的细胞增殖速率（Zittermannetal.,IntJCancer126:1291-1301,2010）。这一发现可能暗示由感染的细胞分泌的sGPC3蛋白以自分泌的方式抑制细胞增殖。新近一项在人HEK-293细胞中使用没有GPI-锚定结构域的重组sGPC3（GPC3ΔGPI，氨基酸残基Q25-H559）的研究提供了sGPC3蛋白可在体外抑制HCC生长的直接证据（Fengetal.,IntJCancer128(9):2246-2247,2011）。然而，GPC3的确切生物功能和其在肿瘤发生中的作用仍是未知的。
HS蛋白聚糖（HSPG）是关键的分子效应物并且由于它们能够与许多重要的分子相互作用而在癌症和血管发生中具有多种功能。HSPG的大部分蛋白结合活性归功于HS链（Kimetal.,JEndocrinol209(2):139-151,2011）。平均HS链的长度为50-200个重复的二糖单元。肿瘤转移是癌症相关死亡的主要原因，但是对肿瘤转移的分子机制仍然知之甚少。已经广泛接受的是，蛋白酶例如基质金属蛋白酶的蛋白水解活性可促进癌症转移。最近，新出现的证据显示，癌症转移还伴随有能够切割HS蛋白聚糖的HS侧链的酶（例如类肝素酶）的活性（Arvatzetal.,CancerMetastasisRev30(2):253-268,2011）。
发明内容
本文提供了结合例如特异性结合GPC3或GPC3上HS链的人单克隆抗体。所提供的抗体包括免疫球蛋白分子例如IgG抗体以及抗体片段例如单结构域VH抗体或单链可变区片段（scFv）。还提供了包括结合例如特异性结合GPC3或GPC3上HS链的抗体的组合物、编码这些抗体的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体以及表达所述核酸分子的分离的宿主细胞。还提供了包含本文公开的抗体和效应分子例如毒素的免疫缀合物。
本文提供的抗体和组合物可用于多种目的，例如用于在受试者中确认表达GPC3的癌症例如HCC的诊断。因此，本文提供了一种确认受试者中癌症的诊断的方法：使来自被诊断患有癌症的受试者的样品与结合GPC3或GPC3上HS链的人单克隆抗体接触；并检测所述抗体与所述样品的结合。相对于所述抗体与对照样品的结合，所述抗体与所述样品的结合增加确认了所述癌症诊断。在一些实施方案中，所述方法还包括使特异性识别所述GPC3特异性抗体的第二抗体与所述样品接触并检测所述第二抗体的结合。
类似地，本文提供了一种在受试者中检测表达GPC3的癌症例如HCC的方法，其包括使来自所述受试者的样品与本文描述的人单克隆抗体接触；并检测所述抗体与所述样品的结合。相对于对照样品，所述抗体与所述样品的结合增加检测出所述受试者中的癌症。在一些实施方案中，所述方法还包括使特异性识别所述GPC3特异性抗体的第二抗体与所述样品接触，并且检测所述第二抗体的结合。
还提供了一种治疗患有癌症例如HCC的受试者的方法：选出患有表达GPC3的癌症的受试者，给予所述受试者治疗有效量的对GPC3或GPC3上HS链特异的单克隆抗体，或包含所述抗体的免疫缀合物。
在其他实施方案中，通过如下治疗或诊断所述癌症：给予包括SEQIDNO:2的氨基酸残基26-33、51-57和96-105的单克隆抗体；或者给予包括SEQIDNO:14的氨基酸残基26-33、51-58和97-105以及SEQIDNO:16或SEQIDNO:31的残基27-32、50-52和89-97的单克隆抗体。在具体实施方案中，提供了一种抑制受试者中肿瘤生长或转移的方法：选出患有表达GPC3的癌症的受试者，给予所述受试者治疗有效量的本文公开的组合物。
从以下参照附图进行的详细描述中，本发明上述的和其他目的、特征以及优点会变得更加清楚。
附图说明
图1A和1B示出了重组GPC3蛋白的产生。(A)野生型GPC3蛋白和没有HS链的突变型GPC3的SDS-PAGE。(B)蛋白质印迹分析。wt=野生型sGPC3-hFc；mu=没有HS链的突变型sGPC3(AA)-hFc。
图2示出了克隆HN3VH与来自公开数据库的已知人VH（SEQIDNO:2-10）的序列比对。
图3A是示出HN3-hFc的SDS-PAGE分析的凝胶。泳道1，5μg非还原的；泳道2，5μg还原的。图3B是一系列的流式细胞术曲线，其示出HN3结合GPC3阳性的G1细胞，而不结合GPC3阴性的A431细胞。HN3还结合一组HCC细胞系（Hep3B、HepG2、Huh-1、Huh-4、Huh7和SK-Hep1）。
图4A和4B是示出HN3对GPC3的高亲和力的曲线图。(A)使用包被在96孔板上的纯化的GPC3蛋白的ELISA测定。(B)对G1细胞系进行的流式细胞术。
图5A是多种重组GPC3蛋白的一级结构的示意图。His，六个组氨酸标记；hFc，人IgG1Fc标记；HS，硫酸类肝素糖胺聚糖。IAB-hFc被用作hFc同种型对照。图5B是示出噬菌体ELISA结果的曲线图，其证明了克隆HN3独立于其标记（Fc或His）结合全长GPC3，而不结合GPC3片段（单独的N端或C端）。
图6A-6D是示出HN3在体外抑制HCC细胞增殖的一系列图。(A)在暴露于慢病毒转染的靶向GPC3的shRNA或乱序（scr）shRNA后72小时，Hep3B细胞系中GPC3蛋白水平的免疫印迹分析。慢病毒的靶向GPC3的shRNAsh-1和sh-2有效地抑制了GPC3蛋白表达。(B)和(C)通过WST-8测定评估用GPC3-shRNA或乱序shRNA（scr）处理的HCC细胞。(D)用HN3人mAb或HN125处理四种HCC细胞系（Huh-7、Huh-4、Hep3B和A431）持续5天。通过WST-8方法测量细胞增殖。HN125被用作不相关的hFc对照。
图7A-7D是示出HN3诱导细胞周期停滞、细胞凋亡和yap失活的一系列图。(A)细胞周期分析。将细胞用HN3或HN125处理48小时，通过FACS进行细胞周期作谱（profiling）。与未处理的细胞（培养基）相比p<0.05。(B)细胞凋亡分析。将细胞用HN3或IAB-hFc处理72小时，然后进行膜联蛋白（Annexin）V/PI双重染色。与未处理的细胞相比p<0.05。(C)HN3诱导了Hep3B细胞中的PARP切割。将细胞与HN3或IAB-hFc一起孵育指示的时间。泳道1，HN3；泳道2，HN125；泳道3，仅培养基。HN125被用作不相关的hFc对照。(D)示出在体外在HN3处理的HCC细胞中yap失活和细胞周期蛋白D1下调的蛋白质印迹。Ctrl=HN125
图8A是纯化的重组GPC3蛋白的蛋白质印迹。GPC3-hFc，GPC3-人Fc融合物；GPC3(AA)-hFc，没有HS链的GPC3-人Fc融合物。图8B是示出了ELISA结果的曲线图。将一μg的纯化的重组蛋白包被在96-孔板上并用1G12抗-GPC3mAb探测。rFc-GPC3，兔Fc-GPC3融合物。
图9A和9B示出了针对GPC3的噬菌体Fv的富集的曲线图。(A)在每轮具有2×1012个输入噬菌体的淘选之后，计数输出菌落。(B)通过ELISA针对不同来源的GPC3测试每个噬菌体克隆。rFc-MSLN（兔Fc对照）和BSA被用作阴性对照。
图10示出了选出的scFv与HS20可变区重链（SEQIDNO:14）和轻链（SEQIDNO:16）结构域的氨基酸序列的比对。CDR是带阴影的。示出了ABQ50854.1（B组链球菌III型多糖的肽模拟表位；SEQIDNO:17）；ADP21081.1（犬树突细胞，SEQIDNO:18）；ABD59019.1（TREM样转录物1；SEQIDNO:19）和ABQ50855.1（B组链球菌III型多糖的肽模拟表位；SEQIDNO:20）的序列。CDR区根据Kabat（下划线）和IMGT（阴影）确定。
图11A是示出HS20结合细胞裂解物中的重组和天然GPC3的蛋白质印迹。图11B是示出细胞上HS20的流式细胞检测分析结果的曲线图。将细胞（A431、G1和HepG2）用不同浓度的HS20探测。通过流式细胞术用缀合PE的山羊抗人IgG第二抗体使所述结合可视。
图12是示出HCC组织中HS20的免疫组织化学分析的一系列图像。
图13A-13D是示出HS20的结合特性的图。(A)测试了所述HS20mAb与GPC3-hFc、GPC3(AA)-hFc和仅GPC3的结合。1G12被用作阳性对照。1AB-hFc（人Fc对照）和BSA被用作阴性对照。(B)HS20对GPC3和仅HS的结合特异性。HS20结合GPC3是仅HS的至少1000倍。(C)免疫沉淀。将G1（A431.GPC3+）细胞或Hep3B细胞裂解，用HS20或同种型对照进行沉淀（pulldown），然后用小鼠抗GPC3抗体检测（左图）。箭头指示了GPC3核心蛋白，括弧指示了糖基化的GPC3。还用相同的策略检测了GPC3敲低细胞（右图）。(D)竞争ELISA。将指示浓度的硫酸类肝素或肝素与HS20mAb（5μg/ml）预孵育。然后进行ELISA测定来检测HS20/GPC3亲和力。
图14A-14E是示出HS20通过妨碍GPC3与Wnt3a之间的相互作用而抑制HCC细胞中的细胞迁移的一系列图。(A)将Hep3B细胞和Huh-4细胞用100μg/ml的HS20或同种型对照处理。所述图像示出了使用Hep3B（上图）和Huh4（下图）细胞时伤口愈合测定的结果。(B)示出在Hep3B细胞上进行的伤口愈合测定的剂量反应（左图）和时间过程（右图）。数据表示为开放性伤口面积的百分数，表示为三个重复的平均值±标准差（*p<0.05）。(C)将Hep3B细胞用50μg/ml的IgG对照或HS20预处理3天，然后将GPC3用小鼠抗GPC3抗体免疫沉淀。检测到了GPC3与Wnt3a之间的相互作用。(D)将Hep3B细胞用50μg/ml的IgG对照或HS20预处理3天并进行RT-PCR以测量指示的Wnt-靶基因的RNA表达水平。(E)将Hep3B细胞用50μg/ml的IgG对照或HS20预处理3天，然后通过蛋白质印迹测量β-连环蛋白表达。
图15A示出了用（+）或不用（-）内切糖苷酶PNG酶处理的HS20野生型（Wt）mAb的SDS-PAGE。每个样品使用5μg的纯化蛋白。NR=非还原的；R=还原的。图15B是用（+）或不用（-）PNG酶处理的HS20WtmAb的蛋白质印迹。使用山羊抗人κ链抗体检测HS20轻链。图15C示出了HS20VL序列（SEQIDNO:16）与ABD59019.1的VL（TREM样转录物1；SEQIDNO:19）和ABQ50855.1的VL（B组链球菌III型多糖的肽模拟表位；SEQIDNO:20）的比较。通过在所述VL结构域的CDR2中将天冬氨酸（N）残基突变为丙氨酸（A）残基产生了HS20突变体（Mt）。
图16A示出了还原（R）和非还原（NR）条件下HS20Wt和HS20Mt的SDS-PAGE。每个样品使用5μg的纯化蛋白。M=分子量标记物。图16B是示出用于评估HS20Wt和HS20Mt对GPC3的结合亲和力的ELISA的结果的曲线图。将ELISA板用5μg/mL的GPC3-hFc或GPC3(ΔHS)-hFc包被并与1μg/mL的HS20Wt或HS20Mt一起孵育。山羊抗人κ链-HRP被用作第二抗体（1:5000稀释）。图16C是示出HS20Wt或HS20Mt与多种细胞系的提取物的结合的蛋白质印迹（每种样品为30μg的总蛋白）。5μg/ml的HS20Wt或HS20Mt被用作第一抗体，山羊抗人κ链-HRP被用作第二抗体（1:5000稀释）。
图17A-17C是示出HS20抑制HCC异种移植小鼠模型中的肿瘤生长的一系列图。(A)通过皮下注射将1000万个HepG2细胞植入裸鼠中。当肿瘤达到100mm3的体积时，每周两次通过静脉内注射用20mg/kg的HS20治疗小鼠。肿瘤体积（V）使用公式V=ab2/2（其中a和b分别表示肿瘤长度和宽度）定量。(B)用所述肿瘤组织通过co-IP测定检测GPC3和Wnt3A之间的相互作用。(C)检测Wnt信号转导下游基因的RT-PCR。
图18A-18B示出了使用Huh-7细胞作为异种移植物时HN3会抑制小鼠中的肿瘤生长。(A)示出在裸鼠中使用HCC异种移植模型时的结果的曲线图。箭头指示了注射HN3（60mg/kg）。(B)在小鼠中在HN3处理的HCC肿瘤中yap的失活和细胞周期蛋白D1的下调。Ctrl：载体。
图19A是HN3(VH)-PE38免疫毒素的示意图。为了制备抗GPC3免疫毒素，将HN3VH与截短的PE38融合。图19B是示出从mono-Q柱洗脱的HN3(VH)-PE38免疫毒素蛋白过TSK凝胶过滤体积排阻柱的曲线图。图19C示出了SDS-PAGE分析。从TSK柱收集的HN3(VH)-PE38免疫毒素级分被加载到所述凝胶上。
图20是示出HN3(VH)-PE38免疫毒素抑制HCC细胞系的细胞增殖的一系列图。将癌细胞与不同浓度的含HN3(VH)-PE38的抗GPC3免疫毒素或BL22孵育72小时。通过WST测定确定细胞增殖。虚线表示50%的细胞增殖抑制，其是与未用所述毒素处理的细胞相比使细胞活力降低达50%的毒素浓度。BL22：对CD22特异的免疫毒素，用作非特异性的对照。
图21是示出所述异种移植模型中HN3(VH)-PE38免疫毒素的抗肿瘤活性的曲线图。用300万个G1细胞皮下接种BALB/cnu/nu小鼠。当肿瘤达到100mm3的平均体积时，每隔一日给予小鼠0.4mg/kg的HN3(VH)-PE38免疫毒素，持续约一周。箭头：HN3(VH)-PE38注射。用公式V=ab2/2（其中a和b分别表示肿瘤长度和宽度）定量肿瘤大小。*p<0.05。
序列表
列于所附序列表中的核酸和氨基酸序列使用37C.F.R.1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母编码显示。只显示每个核酸序列的一条链，但是应理解任何提及所示链包括其互补链在内。在所附序列表中：
SEQIDNO:1为单结构域（VH）抗体HN3的核苷酸序列。
SEQIDNO:2为单结构域（VH）抗体HN3的氨基酸序列。
SEQIDNO:3-10为人抗体的VH结构域的氨基酸序列。
SEQIDNO:11为HS20scFv的核苷酸序列。
SEQIDNO:12为HS20scFv的氨基酸序列。
SEQIDNO:13为HS20（Wt）的VH结构域的核苷酸序列。
SEQIDNO:14为HS20（Wt）的VH结构域的氨基酸序列。
SEQIDNO:15为HS20（Wt）的VL结构域的核苷酸序列。
SEQIDNO:16为HS20（Wt）的VL结构域的氨基酸序列。
SEQIDNO:17为结合B组链球菌III型多糖的肽模拟表位的VH结构域的氨基酸序列（GenBank登录号ABQ50854.1）。
SEQIDNO:18为结合犬树突细胞的VH结构域的氨基酸序列（GenBank登录号ADP21081.1）。
SEQIDNO:19为抗TREM样转录物1的抗体的VL结构域的氨基酸序列（GenBank登录号ABD59019.1）。
SEQIDNO:20为结合B组链球菌III型多糖的肽模拟表位的VL结构域的氨基酸序列（GenBank登录号ABQ50855.1）。
SEQIDNO:21和22为引物序列。
SEQIDNO:23为PE-LR的氨基酸序列。
SEQIDNO:24为PE-LR/6X的氨基酸序列。
SEQIDNO:25为具有降低的免疫原性的PE的氨基酸序列。
SEQIDNO:26为PE-LR/8M的氨基酸序列。
SEQIDNO:27为PE38的氨基酸序列。
SEQIDNO:28为HN3-PE38的核苷酸序列。
SEQIDNO:29为HN3-PE38的氨基酸序列。
SEQIDNO:30为HS20Mt的VL结构域的核苷酸序列。
SEQIDNO:31为HS20Mt的VL结构域的氨基酸序列。
具体实施方式
I.缩写
BSA牛血清白蛋白
CDR互补决定区
cfu菌落形成单位
CTL细胞毒性T淋巴细胞
ECM细胞外基质
ELISA酶联免疫吸附测定
FACS荧光激活细胞分选
GPC3磷脂酰肌醇蛋白聚糖3
HCC肝细胞癌
hFc人Fc
HS硫酸肝素
HSPG硫酸类肝素蛋白聚糖
Ig免疫球蛋白
mAb单克隆抗体
PBS磷酸盐缓冲盐水
PE假单胞菌（Pseudomonas）外毒素
pfu空斑形成单位
rFc兔Fc
sGPC3可溶性磷脂酰肌醇蛋白聚糖3
II.术语和方法
除非另有说明，技术术语以常规用法使用。分子生物学中的常用术语的定义可见于BenjaminLewin,genesV,由OxfordUniversityPress出版,1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等(eds.),TheEncyclopediaofMolecularBiology,由BlackwellScienceLtd.出版,1994(ISBN0-632-02182-9)和RobertA.Meyers(ed.),MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReference,由VCHPublishers,Inc.出版,1995(ISBN1-56081-569-8)。
为了便于阅读本公开内容的各个实施方案，提供了以下对具体术语的解释：
抗体：包含至少轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体，其识别并结合（例如特异性地识别并特异性地结合）抗原例如GPC3或其片段的表位。免疫球蛋白分子由重链和轻链组成，所述重链和轻链各自具有可变区，称为重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）。所述VH区和VL区一起负责结合被抗体识别的抗原。
抗体包括完整的免疫球蛋白和变体以及本领域熟知的抗体的部分，例如单结构域抗体（例如VH结构域抗体）、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、单链Fv蛋白（“scFv”）和二硫化物稳定的Fv蛋白（“dsFv”）。scFv蛋白是其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过接头结合的融合蛋白，而在dsFv中，所述链被突变以引入二硫键来稳定所述链的连接。该术语还包括遗传工程形式例如嵌合抗体（例如人化鼠抗体）、异缀合抗体（heteroconjugateantibody）（例如双特异性抗体）。还可见于PierceCatalogandHandbook,1994-1995（PierceChemicalCo.,Rockford,IL）；Kuby,J.,Immunology,3rdEd.,W.H.Freeman&Co.,NewYork,1997。
通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键互相连接的重（H）链和轻（L）链。轻链有λ和κ两种类型。有5类决定抗体分子功能活性的主要重链（或同种型）：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。
每条重链和轻链均含有恒定区和可变区（所述区还称为“结构域”）。相结合，重链可变区和轻链可变区特异性地结合抗原。轻链和重链可变区含有被三个高变区（也称为“互补决定区”或“CDR”）隔开的“框架”区。已经根据Kabat等人（见Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,1991），和ImMunoGeneTics数据库（IMGT）（见，Lefranc,NucleicAcidsRes29:207-9,2001；和http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=humanIg）确定了框架区和CDR的范围。Kabat数据库在线维持（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）。不同的轻链或重链的框架区的序列在同一物种例如人内是相对保守的。抗体的框架区，也就是组成的轻链和重链的结合框架区，用于在三维空间中安置和排列所述CDR。
CDR主要负责与抗原的表位结合。每条链的CDR一般被称为CDR1、CDR2和CDR3，从N端开始顺序编号，一般还通过所述具体CDR所在的链来鉴定。因此，VHCDR3（或H-CDR3）位于其所在抗体的重链可变区，而VLCDR1（或L-CDR1）是来自其所在抗体的轻链可变区的CDR1。例如，结合GPC3的抗体会具有特定的VH区和VL区序列，并因此具有特定的CDR序列。具有不同特异性的抗体（即，对不同的抗原有不同的结合位点）具有不同的CDR。虽然抗体与抗体之间的CDR不同，但是仅CDR内有限数量的氨基酸位置直接涉及抗原结合。CDR内的这些位置被称为特异性决定残基（SDR）。
提及“VH”或“VH”时，是指免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。提及“VL”或“VL”时，是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。
“单克隆抗体”是由B-淋巴细胞的单个克隆或由被单一抗体的轻链和/或重链基因转染的细胞产生的抗体。单克隆抗体是由本领域技术人员所知晓的方法产生的，例如通过将骨髓瘤细胞和免疫脾细胞融合制备杂合的抗体形成细胞。单克隆抗体包括人化单克隆抗体。
“嵌合抗体”具有来自一个物种例如人的框架残基和来自另一物种的CDR（其一般赋予抗原结合），例如特异性结合GPC3的鼠抗体。
“人”抗体（也称为“全人”抗体）是包括人框架区和人免疫球蛋白的全部CDR的抗体。在一个实例中，所述框架和所述CDR是源自于相同的人重链和/或轻链氨基酸序列。然而，可以设计来自一个人抗体的框架以包括来自不同的人抗体的CDR。“人化”免疫球蛋白是含有人框架区和一个或多个来自非人（例如小鼠、大鼠或合成的）免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白被称为“供体”，提供框架的人免疫球蛋白被称为“受体”。在一个实施方案中，在一种人化免疫球蛋白中，所有的CDR均来自供体免疫球蛋白。恒定区不一定存在，但是如果存在则必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即，具有至少约85-90%，例如约95%或更高的同一性。因此，可能除了所述CDR外，人化免疫球蛋白的所有部分均与天然的人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。“人化抗体”是含有人化轻链和人化重链免疫球蛋白的抗体。人化抗体与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。人化免疫球蛋白或抗体的受体框架可能有有限数量的氨基酸被取自供体框架的氨基酸置换。人化或其他的单克隆抗体可以具有对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本没有影响的额外的保守性氨基酸置换。人化免疫球蛋白可以通过遗传工程方法构建（参见，例如，美国专利No.5,585,089）。
结合亲和力：是指抗体对抗原的亲和力。在一个实施方案中，亲和力是通过由Frankeletal.,Mol.Immunol.,16:101-106,1979描述的Scatchard方法的修改方法计算的。在另一实施方案中，结合亲和力是通过抗原/抗体的解离速率测量的。在另一实施方案中，高结合亲和力是通过竞争性放射免疫测定测量的。在另一实施方案中，结合亲和力是通过ELISA测量的。“特异性结合”抗原（例如GPC3）的抗体是以高亲和力结合所述抗原并且不显著结合其他不相关抗原的抗体。
化学治疗剂：在特征为异常细胞生长的疾病的治疗中有治疗用途的任何化学试剂。这样的疾病包括肿瘤、新生物（neoplasm）和癌症以及特征为增生性生长的疾病，例如银屑病。在一个实施方案中，化学治疗剂是用于治疗肝癌例如HCC，或另一肿瘤的试剂。在一个实施方案中，化学治疗剂是放射性化合物。本领域技术人员可容易地鉴定使用的化学治疗剂（见，例如，SlapakandKufe,PrinciplesofCancerTherapy,Chapter86inHarrison'sPrinciplesofInternalMedicine,14thedition；Perryetal.,Chemotherapy,Ch.17inAbeloff,ClinicalOncology2nded.,2000ChurchillLivingstone,Inc；Baltzer,L.,Berkery,R.(eds.):OncologyPocketGuidetoChemotherapy,2nded.St.Louis,Mosby-YearBook,1995；Fischer,D.S.,Knobf,M.F.,Durivage,H.J.(eds):TheCancerChemotherapyHandbook,4thed.St.Louis,Mosby-YearBook,1993）。联合化疗是给予多于一种的试剂来治疗癌症。一个实例是给予与放射性或化学化合物联合使用的可结合GPC3（或GPC3上HS链）的抗体。
保守变体：“保守”氨基酸置换是基本上不影响或降低蛋白的亲和力例如抗体对GPC3的亲和力的那些替换。例如，特异性结合GPC3的人抗体可包括至多约1、至多约2、至多约5、至多约10或至多约15个保守替换，并且特异性结合GPC3多肽。术语保守变化还包括使用取代的氨基酸代替未取代的亲本氨基酸，只要抗体特异性结合GPC3。非保守替换是降低活性或与GPC3结合的那些。
提供功能类似的氨基酸的保守氨基酸置换表是本领域技术人员所熟知的。以下六组是被认为是互为保守替换的氨基酸的实例：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
互补决定区（CDR）：共同限定天然Ig结合位点的天然Fv区域的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。Ig的轻链和重链各自具有三个CDR，分别称为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。
接触：以直接物理联系方式放置；包括固体形式和液体形式。
细胞毒性：分子例如免疫毒素对意欲靶向的细胞的毒性，而不是对生物其他细胞的毒性。在一个实施方案中，相反地，术语“毒性”是指免疫毒素对意图被所述免疫毒素的靶向部分靶向的那些细胞除外的细胞的毒性，术语“动物毒性”是指免疫毒素对动物的毒性，这是由于免疫毒素对意图被所述免疫毒素靶向的细胞除外的细胞的毒性。
简并变体：在本公开的上下文中，“简并变体”是指编码GPC3多肽或结合GPC3（或GPC3上HS链）的抗体的多核苷酸，所述多核苷酸包括遗传密码简并的序列。存在20种天然氨基酸，其中大多数由多于一种密码子编码。因此，所有的简并核苷酸序列都包括在内，只要所述核苷酸序列编码的GPC3多肽或结合GPC3的抗体的氨基酸序列没有改变。
诊断：鉴定病理状况例如但不限于肝癌、卵巢癌、黑色素瘤或肺癌的存在或性质。诊断方法的灵敏度和特异性有所不同。诊断测定的“灵敏度”是检测为阳性的患病个体的百分数（真阳性的百分数）。诊断测定的“特异性”是1减去假阳性率，其中假阳性率定义为没有患所述疾病而被检测为阳性的那些个体的比例。虽然某一具体的诊断方法可能不能提供对状态的明确诊断，但是如果所述方法提供可帮助诊断的阳性指示那它就是满足需求的。“预后”是指病理状况例如肝癌或转移的发展（例如严重程度）的可能性。
效应分子：意欲对嵌合分子靶向的细胞具有需要的效应的嵌合分子的部分。效应分子还被称为效应部分（effectormoiety，EM）、治疗剂或诊断剂或类似的术语。
治疗剂包括化合物例如核酸、蛋白质、肽、氨基酸或衍生物、糖蛋白、放射性同位素、脂质、碳水化合物或重组病毒。核酸治疗物和诊断部分包括反义核酸、与单链或双链DNA共价交联的衍生寡核苷酸、和三链形成寡核苷酸。或者，连接到靶向部分（例如抗GPC3的抗体）的分子可以为包裹系统（encapsulationsystem）例如脂质体或微团，所述脂质体或微团含有治疗组合物例如药物、核酸（例如反义核酸）或可被保护以免于直接暴露于循环系统的另一治疗部分。制备连接有抗体的脂质体的方法是本领域技术人员熟知的（参见，例如，美国专利No.4,957,735；和Connoretal.,Pharm.Ther.28:341-365,1985）。诊断剂或诊断部分包括放射性同位素和其他可检测标记。用于这种目的的可检测标记在本领域也是熟知的，包括放射性同位素例如35S、11C、13N、15O、18F、19F、99mTc、131I、3H、14C、15N、90Y、99Tc、111In和125I、荧光团、化学发光剂和酶。
表位：抗原决定簇。这些是具有抗原性（即可诱发特异性免疫应答）的分子上的特定化学基团或肽序列。抗体特异性结合多肽（例如GPC3）上的特定抗原表位。
框架区：介于CDR之间的氨基酸序列。框架区包括轻链可变框架区和重链可变框架区。框架区起到使CDR处于合适的方向以结合抗原的作用。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）：硫酸类肝素（HS）蛋白聚糖的磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成员，其通过糖基磷脂酰肌醇锚连接到细胞表面（FilmusandSelleck,JClinInvest108:497-501,2001）。GPC3基因编码约70kD的核心蛋白，所述核心蛋白可被弗林蛋白酶切割产生N端40kD片段和C端30kD片段。GPC3的C端部分上连接有两条HS链。GPC3和其他磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族蛋白在细胞分裂和细胞生长调节中起作用。GPC3在HCC和一些其他人癌症包括黑色素瘤、肺鳞状细胞癌和卵巢透明细胞癌中高表达（HoandKim,EurJCancer47(3):333-338,2011），但是在正常组织中不表达。GPC3还被称为SGB、DGSX、MXR7、SDYS、SGBS、OCI-5、SGBS1和GTR2-2。
人GPC3有四种已知的亚型（亚型1-4）。GPC3的四种亚型的核酸和氨基酸序列是已知的，包括GenBank登录号：NM_001164617和NP_001158089（亚型1）；NM_004484和NP_004475（亚型2）；NM_001164618和NP_001158090（亚型3）；以及NM_001164619和NP_001158091（亚型4）。在本公开的一些实施方案中，本文公开的抗体可结合所述四种人GPC3亚型的一种或多种，或其保守变体。
HAMA（人抗鼠抗体）应答：人受试者中对已经给予所述患者的鼠抗体的可变区和恒定区的免疫应答。重复的抗体给药可能导致抗体从患者血清中清除的速率增加，并且还可能诱发患者中的变态反应。
硫酸类肝素（HS）：碳水化合物的糖胺聚糖家族的成员，其在结构上与肝素非常密切相关。HS是发现于所有动物组织的线性多糖。发现HS为蛋白聚糖（PG），其中两条或三条HS链接近地连接到细胞表面或细胞外基质蛋白。HS以这种形式结合多种蛋白配体并调节多种生物活性，包括发育过程、血管发生、血液凝固和肿瘤转移。
肝细胞癌（HCC）：一种原发性的肝恶性肿瘤，一般发生在具有由病毒性肝炎、肝毒素或肝硬化（经常由酒精中毒引起）引起的炎症性肝的患者中。HCC也被称为恶性肝细胞瘤。
宿主细胞：在其中载体可以增殖并其且DNA可以表达的细胞。所述细胞可以是原核细胞或真核细胞。该术语还包括受试宿主细胞的任何后代。应理解，并不是所有的后代都与亲本细胞相同，因为在复制过程中可能会发生突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时，这类后代被包括在内。
免疫应答：免疫系统的细胞，例如B细胞、T细胞或单核细胞，对刺激的应答。在一个实施方案中，所述应答对于具体抗原是特异性的（“抗原特异性应答”）。在一个实施方案中，免疫应答是T细胞应答，例如CD4+应答或CD8+应答。在另一实施方案中，所述应答为B细胞应答，并且导致产生特异性抗体。
免疫缀合物：效应分子与抗体或其功能片段的共价连接。效应分子可以为可检测标记或免疫毒素。毒素的具体非限制性实例包括，但不限于，相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白、假单胞菌外毒素（PE，例如PE35、PE37、PE38和PE40）、白喉毒素（DT）、肉毒杆菌毒素，或其经修饰的毒素，或直接或间接地抑制细胞生长或杀死细胞的其他毒性试剂。例如PE和DT是一般通过肝毒性引发死亡的高毒性化合物。然而，PE和DT可通过除去所述毒素的天然靶向组分（例如PE的结构域Ia和DT的B链）并将其替换为不同的靶向部分（例如抗体）而被修饰为可用作免疫毒素的形式。“嵌合分子”是缀合（偶联）效应分子的靶向部分，例如配体或抗体。术语“缀合”或“连接”是指使两个多肽成为一个连续的多肽分子。在一个实施方案中，抗体被接合到效应分子。在另一实施方案中，接合到效应分子的抗体被进一步接合到脂质或其他分子形成蛋白或肽，以增加其在体内的半衰期。连接可通过化学或重组方式。在一个实施方案中，所述连接是化学连接，其中，抗体部分和效应分子之间的反应产生了在所述两个分子之间形成的共价键以形成一个分子。在所述抗体和效应分子之间可任选地包括肽接头（短的肽序列）。因为免疫缀合物最初由两个具有独立功能的分子（例如抗体和效应分子）制备，它们有时还被称为“嵌合分子”。因此，本文使用的术语“嵌合分子”是指缀合（偶联）效应分子的靶向部分，例如配体或抗体。
分离的：“分离的”生物组分（例如核酸、蛋白质（包括抗体）或细胞器）已经与所述组分天然存在的环境（例如细胞）中的其他生物组分（即，其他染色体和额外染色体DNA和RNA、蛋白质和细胞器）基本分离或被纯化。已经被“分离”的核酸和蛋白质包括用标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸。
标记：直接或间接地缀合到另一分子例如抗体或蛋白质以便于检测该分子的可检测的化合物或组合物。标记的具体非限制性实例包括荧光标签、酶连接物和放射性同位素。在一个实例中，“标记的抗体”是指在抗体中纳入另一分子。例如，所述标记为可检测的标记物，例如纳入放射性标记的氨基酸或连接到可通过标记的抗生物素蛋白检测的生物素基多肽（例如可以通过光学或比色方法检测的含有荧光标记物或酶活性的链霉亲和素）。多种标记多肽和糖蛋白的方法是本领域已知的并且可以使用。可用于多肽的标记的实例包括，但不限于如下：放射性同位素或放射性核苷酸（例如35S、11C、13N、15O、18F、19F、99mTc、131I、3H、14C、15N、90Y、99Tc、111In和125I）、荧光标记（例如异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明、稀土荧光体（lanthanidephosphor））、酶标记（例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶）、化学发光标示物、生物素基团、由第二报告物识别的预设多肽表位（例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签）或磁性试剂例如钆螯合物。在一些实施方案中，标记被不同长度的间隔臂连接以减少可能的空间位阻。
接头：在一些情况中，接头是抗体结合片段（例如Fv片段）内的肽，其起到使重链可变区与轻链可变区间接结合的作用。“接头”还可以指用于将靶向部分（例如抗体）与效应分子（例如细胞毒素或可检测标记）连接的肽。
术语“缀合”、“接合（join）”、“键合”、“连接”是指使两个多肽成为一个连续的多肽分子，或者是指将放射性核素或其他分子与多肽例如scFv共价连接。在具体上下文中，所述术语包括提及连接配体例如抗体部分与效应分子。所述连接可通过化学或重组的方式。“化学方式”是指所述抗体部分与效应分子之间的反应，其使得所述两个分子之间形成共价键以形成一个分子。
哺乳动物：该术语包括人和非人哺乳动物。类似的，术语“受试者”包括人受试者和兽医受试者。
黑色素瘤：一种源于黑色素细胞（产生黑色素的细胞）的癌症形式。黑色素细胞主要存在于皮肤，但是也存在于肠和眼睛。皮肤中的黑色素瘤包括浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、肢端黑色素瘤和恶性雀斑样痣（黑色素瘤）。上述类型中的任一种可产生黑色素或可以是无黑色素的。类似地，任何亚型可能表现出粘连形成（具有向神经性的稠密纤维反应），其是攻击行为和局部复发趋势的标记物。其他黑色素瘤包括透明细胞肉瘤、粘膜黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤。
瘤形成、恶性肿瘤、癌症和肿瘤：新生物是由过度细胞分裂引起的组织或细胞的异常生长。新生物生长可产生肿瘤。个体中肿瘤的量是“肿瘤负荷”，其可以以肿瘤的数目、体积或重量来测量。不转移的肿瘤称为“良性的”。侵袭周围组织和/或可转移的肿瘤称为“恶性的”。血液肿瘤的实例包括白血病，其包括急性白血病（例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性髓性白血病和成髓细胞白血病、前髓细胞白血病、骨髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病）、慢性白血病（例如慢性髓细胞（粒细胞）白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病）、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病（Hodgkin'sdisease）、非霍奇金淋巴瘤（无痛和高级别形式）、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤例如肉瘤和癌的实例，包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤，滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯氏瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌和中枢神经系统肿瘤（例如神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅神经胶质瘤(craniopharyogioma)、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜神经胶质瘤(menangioma)、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤）。
在若干实例中，肿瘤为肝癌，例如HCC或肝母细胞瘤、黑色素瘤、鳞状细胞癌例如肺鳞状细胞癌、透明细胞癌例如卵巢的透明细胞癌、甲状腺癌、维尔姆斯氏瘤、神经母细胞瘤或睾丸生殖细胞瘤。
可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列以有功能关系的方式放置时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列是可操作地连接的。例如，如果启动子例如异源性启动子影响编码序列的转录或表达，那么所述启动子与所述编码序列是可操作地连接的。当需要将两个蛋白编码区域连接时，所述可操作地连接的DNA序列通常是连续的并且位于相同的读码框中。
药剂：当正确地给予受试者或细胞时能够诱导预期的治疗或预防效应的化合物或组合物。
可药用载体：使用可药用载体是常规的。Remington’sPharmaceuticalSciences,byE.W.Martin,MackPublishingCo,Easton,PA,第15版,1975描述的组合物和制剂适用于本文公开的抗体的药物递送。
通常，所述载体的性质取决于采用的具体给药方式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射流体作为运载体（vehicle），所述可注射流体包括可药用和生理上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。对于固体组合物（例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式），常规的无毒固体载体可以包括，例如药品级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学中性载体之外，待给予的药物组合物还可以包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
预防、治疗或改良疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的全面发展。“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后改良其征象或症状的治疗性干预，例如减少肿瘤负荷或减小转移灶的数量尺寸。“改良”是指降低疾病例如癌症的征象或症状的数量或严重程度。
启动子：启动子是指导核酸转录的一系列核酸控制序列。启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如聚合酶II型启动子中的TATA元件。启动子还任选地包括位于离转录起始位点可以多达几千碱基对处的远端增强子或抑制子元件。可包括组成型和诱导型启动子（参见，例如，Bitteretal.,MethodsinEnzymology153:516-544,1987）。
启动子的具体非限制性实例包括衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子（例如金属硫蛋白启动子）或衍生自哺乳动物病毒的启动子（例如反转录病毒长末端重复序列；腺病毒后期启动子；牛痘病毒7.5K启动子）。还可使用通过重组DNA或合成技术产生的启动子。可将多核苷酸插入到含有启动子序列的表达载体中，所述启动子序列有助于宿主中所插入的基因序列的有效转录。表达载体一般含有复制起点、启动子以及允许对转化的细胞进行表型选择的特定核酸序列。
纯化的：术语纯化的并不需要绝对的纯净，而是一个相对的术语。因此，例如，纯化的肽制剂是其中肽或蛋白质比所述肽或蛋白在其细胞中的天然环境下更加富集的肽制剂。在一个实施方案中，纯化制剂以使所述蛋白质或肽占所述制剂总肽或蛋白质含量的至少50%。基本纯化表示从其他蛋白质或细胞组分进行纯化。基本纯的蛋白质是至少60%、70%、80%、90%、95%或98%纯的。因此，在一个具体非限制性实例中，基本纯的蛋白质是90%不含其他蛋白或细胞组分的。
重组体：重组核酸是具有非天然存在的序列或具有通过人工组合两个原本分离的序列片段而制备的序列的核酸。该人工组合往往通过化学合成或者通过人工操作分离的核酸片段（例如通过基因工程技术）完成。
重组毒素：其中细胞靶向部分与毒素融合的嵌合蛋白（Pastanetal.,Science,254:1173-1177,1991）。如果细胞靶向部分是抗体的Fv部分，那么所述分子被称为重组免疫毒素（Chaudharyetal.,Nature,339:394-397,1989）。在遗传上改变所述毒素部分以使其不能结合大多数正常细胞上存在的毒素受体。重组免疫毒素选择性地杀死被抗原结合域识别的细胞。这些重组毒素和免疫毒素可用于治疗癌症，例如表达GPC3的癌症。
样品（或生物样品）：获自受试者的含有基因组DNA、RNA（包括mRNA）、蛋白质或其结合物的生物样本。实例包括，但不限于，外周血、组织、细胞、尿、唾液、组织活检物、细针抽出物、外科手术样本和尸检材料。在一个实例中，样品包括HCC组织活检样品。
序列同一性：氨基酸或核酸序列之间的相似性被表示为所述序列之间的相似性，或者称为序列同一性。序列同一性经常通过同一性（或相似性或同源性）百分比来度量；所述百分比越高，两个序列越相似。当使用标准方法进行比对时，多肽或核酸分子的同系物或变体具有相对高程度的序列同一性。
用于比较的序列比对方法在本领域是熟知的。多种程序和比对算法描述于：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988；Higgins和Sharp,Gene73:237,1988；Higgins和Sharp,CABIOS5:151,1989；Corpet等NucleicAcidsResearch16:10881,1988以及Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988。Altschul等NatureGenet.6:119,1994提供了了序列对比方法和同源性计算的详细思路。
NCBI基础局部比对基本检索工具（BLAST）（Altschul等J.Mol.Biol.215:403,1990）可以从若干来源获得，包括美国国立生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI，Bethesda,MD）和互联网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx联合使用。互联网上的NCBI网站提供了如何使用该程序确定序列同一性的描述。
特异性结合GPC3多肽的抗体VL或VH的同系物和变体通常特征在于，当使用NCBIBlast2.0、空隙blastp设置为默认参数时，具有与所述抗体的氨基酸序列在全长比对上计得的至少约75%，例如至少约80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。为了比较超过约30个氨基酸的氨基酸序列，使用了Blast2sequences功能、采用设置为默认参数（空隙存在值为11，每个残基空隙值为1）的默认BLOSUM62矩阵。当比对短肽（少于约30个氨基酸）时，比对应使用Blast2sequences功能、采用设置为默认参数（开放空隙9，延伸空隙1罚分）的PAM30矩阵来进行。通过该方法评估时，与参考序列有更高相似性的蛋白会显示增加的同一性百分比，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。当比较不完整的序列的序列同一性时，同系物和变体通常在10-20个氨基酸的短窗口中具有至少80%的序列同一性，并且取决于它们与参考序列的相似性，可具有至少85%或至少90%或95%的序列同一性。确定在这样的短窗口上的序列同一性的方法可以从互联网上的NCBI网站获得。本领域的技术人员会理解，提供这些序列同一性范围仅用于指导，完全有可能获得落在所提供范围之外的强显著性同系物。
鳞状细胞癌：一种源于鳞状上皮细胞的癌症类型，所述鳞状上皮细胞是形成皮肤、眼睛、多种内脏器官的表面和中空器官的内层以及一些腺体导管（duct）的薄的、扁平的细胞。鳞状细胞癌还称为表皮样癌。一种类型的鳞状细胞癌是肺鳞状细胞癌。
受试者：活的多细胞有脊椎生物——一个包括人受试者和兽医受试者的类别，包括人和非人哺乳动物。
治疗有效量：足以在被治疗的受试者中达到需要效果的具体物质的量。例如，这可以是抑制或遏制肿瘤生长所必需的量。在一个实施方案中，治疗有效量是清除肿瘤、降低肿瘤的大小或防止肿瘤转移所必需的量。当给予受试者时，一般使用会达到靶组织浓度（例如在肿瘤中）的剂量，所述靶组织浓度已被表明可达到需要的体外效果。
毒素：对细胞有细胞毒性的分子。毒素包括相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白、假单胞菌外毒素（PE）、白喉毒素（DT）、肉毒杆菌毒素、皂草素、局限曲菌素或白树毒素，或其经修饰的毒素。例如PE和DT是一般通过肝毒性引发死亡的高毒性化合物。然而，PE和DT可通过除去所述毒素的天然靶向部分（例如PE的结构域Ia或DT的B链）并将其替换为不同的靶向部分（例如抗体）而被修饰为可用作免疫毒素的形式。
载体：被导入宿主细胞从而产生转化的宿主细胞的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包含本技术领域已知的一个或多个选择标记基因以及其他遗传元件。
除非另有说明，本文所用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同。除非文中另有明确说明，单数术语“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。类似地，除非文中另有明确说明，“或”意欲包括“和”。因此，“包含A或B”意指包括A或B，或A和B。还应该理解，为核酸或多肽给出的全部碱基大小或氨基酸大小以及全部分子量或分子质量值是近似值，用于表述目的。虽然与本文描述的方法和材料相似或等价的方法和材料可以用于本公开的实施或测试，但适合的方法和材料在下文描述。本文提到的所有的出版物、专利申请、专利和其他参考文献以引用的方式全文纳入本文。所有GenBank登录号以引用的方式纳入本文，如同它们在2011年4月14日出现在所述数据库中一样。如果出现冲突，以本说明书（包括对术语的解释）为准。另外，材料、方法和实施例仅是示例性的，不意欲进行限制。
III.引言
本公开描述了结合GPC，例如GPC3或GPC3上的硫酸类肝素（HS）链的单克隆抗体的鉴定。具体的实施方案公开了靶向人GPC3的单结构域VH人mAb（称为HN3）的分离和表征。本文公开的具体数据证明了HN3以高亲和力结合细胞表面相关的GPC3。还表明，HN3结合GPC3的核心蛋白中的构象敏感表位。HN3在体外和体内抑制HCC细胞生长，这为GPC3结合物（binder）可直接抑制HCC细胞增殖提供了证据。
本文还公开了GPC3上HS链特异性的人mAb（称为HS20）的产生和表征。HS20单链可变区片段（scFv）通过噬菌体展示被分离，并被转换为人IgG分子。HS20结合GPC3而不结合没有HS链的突变体形式的GPC3，指示了HS20的表位位于HS链上。免疫组织化学分析显示了HCC细胞的细胞膜上有强免疫染色，非癌细胞例如基质细胞上没有染色。此外，本文公开的伤口愈合测定的结果证明了HS20可抑制HCC细胞迁移，并且异种移植（xenograft）研究证明了HS20可在体内抑制HCC肿瘤生长。
IV.结合GPC3或GPC3上HS链的人单克隆抗体
本文公开了结合（例如特异性结合）GPC3核心蛋白或GPC3上HS链的人单克隆抗体。在一些实施方案中，所述人单克隆抗体为抗体片段，例如单结构域抗体，例如VH结构域。在其他实施方案中，所述抗体功能片段为scFv。在其他实施方案中，所述抗体为免疫球蛋白分子，例如IgG。
A.HN3——对GPC3特异的单（VH）结构域单克隆抗体
在本公开的一些实施方案中，对GPC3特异的人单克隆抗体是称为HN3的单结构域（VH）抗体。HN3的DNA和蛋白质序列示于下文，并且分别以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2列于序列表中。表1A和1B列出了通过Kabat（表1A）和IMGT（表1B）确定的HN3CDR的核苷酸和氨基酸位置。
HN3DNA序列(SEQIDNO:1)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTTATTTCGATTTCGATTCTTATGAAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGCCTAGAGTGGATTGGGAGTATCTATCATAGTGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACACCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAGAGTAAATATGGACCGATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAAGT
HN3蛋白质序列(SEQIDNO:2)
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASYFDFDSYEMSWVRQAPGKGLEWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTATYYCARVNMDRFDYWGQGTLVTVSSS
表1A.HN3序列中CDR的位置（根据Kabat）
CDR DNA序列（SEQ ID NO:1） 蛋白质序列（SEQ ID NO:2）
CDR1 核苷酸91-105 氨基酸31-35
CDR2 核苷酸148-195 氨基酸50-6515 -->
CDR3 核苷酸286-315 氨基酸96-105
表1B.HN3序列中CDR的位置（根据IMGT）
CDR DNA序列（SEQ ID NO:1） 蛋白质序列（SEQ ID NO:2）
CDR1 核苷酸76-99 氨基酸26-33
CDR2 核苷酸151-171 氨基酸51-57
CDR3 核苷酸286-315 氨基酸96-105
本文提供了结合（例如特异性结合）GPC3的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含本文在SEQIDNO:2（VH结构域抗体HN3的氨基酸序列）列出的氨基酸序列的至少一部分，例如一个或多个SEQIDNO:2的CDR。在一些实施方案中，所述抗体包含一个或多个（例如全部三个）使用Kabat方法确定的来自SEQIDNO:2的CDR序列。在其他实施方案中，所述抗体包含一个或多个（例如全部三个）通过IMGT确定的来自SEQIDNO:2的CDR序列。
在一些实施方案中，结合例如特异性结合GPC3的人单克隆抗体的重链，包含SEQIDNO:2的氨基酸残基31-35、SEQIDNO:2的氨基酸残基50-65或SEQIDNO:2的氨基酸残基96-105，或其任意组合。在一些实例中，所述人单克隆抗体的重链包含SEQIDNO:2的氨基酸残基31-35、50-65和96-105。
在一些实施方案中，特异性结合GPC3的人单克隆抗体的重链包含SEQIDNO:2的氨基酸残基26-33、SEQIDNO:2的氨基酸残基51-57或SEQIDNO:2的氨基酸残基96-105，或其任意组合。在一些实例中，所述人单克隆抗体的重链包含SEQIDNO:2的氨基酸残基26-33、51-57和96-105。
在具体的非限制性实例中，所述抗体的重链包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述人单克隆抗体为VH单结构域抗体、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、单链可变区片段（scFv）或二硫化物稳定的可变区片段（dsFv）。在一个非限制性实例中，所述抗体为VH单结构域抗体。在其他实例中，所述抗体为scFv或IgG。
在一些实施方案中，本公开的抗体可结合GPC3（重组蛋白或细胞表面的GPC3），解离常数（Kd）为约2nM或更低。在若干实施方案中，所述人单克隆抗体可结合GPC3，结合亲和力为约2nM、约1nM、约0.7nM、约0.6nM、约0.5nM、约0.4nM、约0.3nM、约0.2nM、约0.15nM或约0.1nM。
本文公开的分离的人单克隆抗体可以以例如用荧光标记、酶标记或放射性标记来标记。
本文还提供了包含治疗有效量的本公开的抗体和可药用载体的组合物。
还提供了包含本文公开的人单克隆抗体和效应分子的免疫缀合物。所述效应分子可以为例如毒素或可检测标记。在一些实例中，所述免疫缀合物包含与毒素例如假单胞菌外毒素或其变体（例如PE38）融合的HN3。在具体的实例中，所述免疫缀合物包含与SEQIDNO:29至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的氨基酸序列。在一个非限制性实例中，所述免疫缀合物的氨基酸序列包含SEQIDNO:29或由其组成。免疫缀合物的实例在下文第V部分中更详细地描述。还提供了包含治疗有效量的本文公开的免疫缀合物和可药用载体的组合物。
本文还提供了编码所公开的人单克隆抗体的分离的核酸分子。在一些实施方案中，编码所述人单克隆抗体的重链的核苷酸序列包含SEQIDNO:1的至少一部分，例如编码SEQIDNO:1中一个或多个CDR的部分。在一些实例中，所述人单克隆抗体的重链包含SEQIDNO:1的核酸序列。在一些实例中，所述分离的核酸分子与启动子可操作地连接。
还提供了包含本文公开的分离的核酸分子的表达载体。本文还提供了包含所述核酸分子或载体的分离的宿主细胞。在一些实例中，所述宿主细胞为T细胞，例如细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。
B.HS20——对GPC3上HS链特异的单克隆抗体
在本公开的一些实施方案中，对GPC3上HS链特异的人单克隆抗体包括被称为HS20的scFv抗体。HS20scFv的DNA和蛋白质序列示于下文，并且分别以SEQIDNO:11和SEQIDNO:12列于序列表中。下文还指定了HS20的野生型（Wt）和突变型（Mt）形式的VH和VL序列。表2A-2B和3A-3B列出了通过Kabat（表2A和3A）和IMGT（表2B和3B）确定的HS20CDR的核苷酸和氨基酸位置。
HS20scFvDNA序列(SEQIDNO:11):
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTCAGAAGCAGGGTCTGCCTACAgAGTACGCAGACTCCGTGAAGGGGCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAAATCGGGCTAAGTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCcAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAATGCATCCATGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAATCGGGGTTTTCCTCTGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
HS20scFv蛋白质序列(SEQIDNO：12)：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIQKQGLPTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNRAKFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYNASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNRGFPLTFGQGTKVEIK
HS20(wt)VH和VLDNA序列
VH(SEQIDNO:13):
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTCAGAAGCAGGGTCTGCCTACACAGTACGCAGACTCCGTGAAGGGGCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAAATCGGGCTAAGTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
VL(SEQIDNO:15):
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAATGCATCCATGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAATCGGGGTTTTCCTCTGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
HS20(wt)VH和VL蛋白质序列
VH(SEQIDNO:14):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIQKQGLPTQYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNRAKFDYWGQGTLVTVSS
VL(SEQIDNO:16):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYNASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNRGFPLTFGQGTKVEIK
如下文实施例3中所述，生成了Hs20mAb的修饰形式(称为Hs20Mt）以除去VL结构域中的N-糖基化位点。下文示出了HS20Mt的VL结构域的核苷酸和氨基酸序列。突变的核苷酸和氨基酸残基以下划线示出。
HS20MtVL-核苷酸序列(SEQIDNO:30)
GACATCcAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCATGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAATCGGGGTTTTCCTCTGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
HS20MtVL-氨基酸序列(SEQIDNO:31)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNRGFPLTFGQGTKVEIK
表2A.HS20VH序列中CDR的位置（根据Kabat）
CDR DNA序列（SEQ ID NO:13） 蛋白质序列（SEQ ID NO:14）
CDR1 核苷酸91-105 氨基酸31-35
CDR2 核苷酸148-198 氨基酸50-66
CDR3 核苷酸289-315 氨基酸97-105
表2B.HS20VH序列中CDR的位置（根据IMGT）
CDR DNA序列（SEQ ID NO:13） 蛋白质序列（SEQ ID NO:14）
CDR1 核苷酸76-99 氨基酸26-33
CDR2 核苷酸151-174 氨基酸51-5818 -->
CDR3 核苷酸289-315 氨基酸97-105
表3A.HS20VL序列中CDR的位置（根据Kabat）
表3B.HS20VL序列中CDR的位置（根据IMGT）
本文提供了分离的结合（例如特异性结合）GPC3上HS链的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含本文在SEQIDNO:14列出的氨基酸序列的至少一部分，例如SEQIDNO:14的CDR；或者所述抗体的轻链包含本文以SEQIDNO:16或SEQIDNO:31列出的氨基酸序列的至少一部分，例如SEQIDNO:16或SEQIDNO:31的CDR；或者同时存在上述两种情况。在一些实施方案中，所述抗体包含具有一个或多个（例如全部三个）来自SEQIDNO:14的CDR序列的重链并且/或者包含具有一个或多个（例如全部三个）来自SEQIDNO:16的CDR序列的轻链，所述CDR序列使用Kabat方法确定。在一些实施方案中，所述抗体包含具有一个或多个（例如全部三个）来自SEQIDNO:14的CDR序列的重链并且/或者包含具有一个或多个（例如全部三个）来自SEQIDNO:31的CDR序列的轻链，所述CDR序列使用Kabat方法确定。
在一些实施方案中，所述抗体包含具有一个或多个（例如全部三个）来自SEQIDNO:14的CDR序列的重链并且/或者包含具有一个或多个（例如全部三个）来自SEQIDNO:16的CDR序列的轻链，所述CDR序列通过IMGT确定。在其他实施方案中，所述抗体包含具有一个或多个来自SEQIDNO:14的CDR序列的重链并且/或者包含具有一个或多个（例如全部三个）来自SEQIDNO:31的CDR序列的轻链，所述CDR序列通过IMGT确定。
在一些实施方案中，本文提供了可结合（例如特异性结合）GPC3上HS的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQIDNO:14的氨基酸残基31-35、SEQIDNO:14的氨基酸残基50-66或SEQIDNO:14的氨基酸残基97-105，或其任意组合；或所述抗体的轻链包含SEQIDNO:16或SEQIDNO:31的氨基酸残基24-34、SEQIDNO:16或SEQIDNO:31的氨基酸残基50-56或者SEQIDNO:16或SEQIDNO:31的氨基酸残基89-97，或其任意组合。
在一些实例中，所述抗体的重链包含SEQIDNO:14的氨基酸残基31-35、50-66和97-105；或所述抗体的轻链包含SEQIDNO:16的氨基酸残基24-34、50-56和89-97；或者同时存在上述两种情况。在其他实例中，所述抗体的重链包含SEQIDNO:14的氨基酸残基31-35、50-66和97-105；或所述抗体的轻链包含SEQIDNO:31的氨基酸残基24-34、50-56和89-97；或者同时存在上述两种情况。
在一些实施方案中，本文提供了结合（例如特异性结合）GPC3上HS的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQIDNO:14的氨基酸残基26-33、SEQIDNO:14的氨基酸残基51-58或SEQIDNO:14的氨基酸残基97-105，或其任意组合；或所述抗体的轻链包含SEQIDNO:16或SEQIDNO:31的氨基酸残基27-32、SEQIDNO:16或SEQIDNO:31的氨基酸残基50-52或者SEQIDNO:16或SEQIDNO:31的氨基酸残基89-97，或其任意组合。
在一些实例中，所述抗体的重链包含SEQIDNO:14的氨基酸残基26-33、51-58和97-105；或所述抗体的轻链包含SEQIDNO:16的氨基酸残基27-32、50-52和89-97；或者同时存在上述两种情况。在其他实例中，所述抗体的重链包含SEQIDNO:14的氨基酸残基26-33、51-58和97-105；或所述抗体的轻链包含SEQIDNO:31的氨基酸残基27-32、50-52和89-97；或者同时存在上述两种情况。
在一些实例中，所述抗体的重链包含SEQIDNO:14的氨基酸序列；或所述抗体的轻链包含SEQIDNO:16的氨基酸序列；或者同时存在上述两种情况。在其他实例中，所述抗体的重链包含SEQIDNO:14的氨基酸序列；或所述抗体的轻链包含SEQIDNO:31的氨基酸序列；或者同时存在上述两种情况。
在一些实施方案中，所公开的抗体可结合GPC3，Kd为约2.5nM或更低。在若干实施方案中，所述人单克隆抗体可结合GPC3，结合亲和力为约1nM或者更低。在一些实例中，所述人单克隆抗体可结合GPC3，结合亲和力为约0.9nM、约0.8nM、约0.75nM、约0.7nM、约0.6nM或约0.5nM。
在一些实施方案中，所述人单克隆抗体为VH单结构域抗体、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、单链可变区片段（scFv）或二硫化物稳定的可变区片段（dsFv）。在一个非限制性实例中，所述抗体为scFv。在其他实例中，所述抗体为IgG。
本文公开的结合GPC3上HS链的分离的人单克隆抗体可以例如用荧光标记、酶标记或放射性标记来标记。
本文还提供了包含治疗有效量的所公开的抗体和可药用载体的组合物。
还提供了包含本文公开的对GPC3上HS特异的人单克隆抗体和效应分子的免疫缀合物。所述效应分子可以为例如毒素或可检测标记。免疫缀合物的实例在下文第V部分中更详细地描述。还提供了包含治疗有效量的本文公开的免疫缀合物和可药用载体的组合物。
本文还提供了编码所公开的人单克隆抗体的分离的核酸分子。在一些实施方案中，编码所述人单克隆抗体的重链的核苷酸序列包含SEQIDNO:13的至少一部分，例如编码一个或多个CDR的部分；或者编码所述人单克隆抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQIDNO:15或SEQIDNO:30的至少一部分，例如编码一个或多个CDR的部分；或者者同时存在上述两种情况。
在一些实例中，编码所述人单克隆抗体的重链的核苷酸序列包含SEQIDNO:13；或者编码所述人单克隆抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQIDNO:15或SEQIDNO:30；或者同时存在上述两种情况。在一些实例中，所述分离的核酸分子与启动子可操作地连接。
还提供了包含本文公开的分离的核酸分子的表达载体。本文还提供了包含所述核酸分子或载体的分离的宿主细胞。在一些实例中，所述宿主细胞为T细胞，例如CTL。
C.抗体和抗体片段
本文公开的单克隆抗体可以为任何同种型。所述单克隆抗体可以为例如IgM或IgG抗体，例如IgG1或IgG2。可特异性结合GPC3或GPC3上HS的抗体的种类可根据已知的方法彼此转换（例如，IgG可转换为IgM）。种类转换还可用于使一种IgG亚类转换成另一亚类，例如从IgG1转换成IgG2。
本公开还包括抗体片段，例如单结构域抗体（例如VH结构域抗体）、Fab、F(ab')2和Fv。这些抗体片段保留了选择性与所述抗原结合的能力。这些抗体包括：
(1)Fab，包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段，其可以通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体以产生完整轻链和一条重链的一部分而产生；
(2)Fab'，可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体、之后进行还原以产生完整轻链和重链的一部分而获得的抗体分子片段；每个抗体分子得到两个Fab'片段；
(3)(Fab')2，可以通过将完整的抗体用胃蛋白酶处理、但之后不进行还原而得到的抗体片段；F(ab')2是两个Fab'片段通过两个二硫键连接在一起的二聚体；
(4)Fv，含有表达为2条链的轻链可变区和重链可变区的基因程片段；
(5)单链抗体（例如scFv），含有轻链可变区和重链可变区并通过合适的多肽接头将其连接为遗传上融合的单链分子的基因工程分子；
(6)单链抗体的二聚体（scFV2），定义为scFV的二聚体（还被称为“微型抗体”）；和
(7)VH单结构域抗体，由重链可变区组成的抗体片段。
制备这些片段的方法在本领域是已知的（参见，例如Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,1988）。
在一些情况中，抗体片段可通过用蛋白酶水解所述抗体或者通过在宿主细胞（例如大肠杆菌（E.coli））中表达编码所述片段的DNA来制备。抗体片段可通过使用常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整的抗体来获得。例如，抗体片段可通过用胃蛋白酶对抗体进行酶切割以提供称为F(ab')2的5S片段来产生。可进一步使用巯基化合物还原试剂切割该片段，并且任选地为二硫键切割产生的巯基基团提供阻断基团，以产生3.5SFab'单价片段。或者，使用胃蛋白酶进行酶切割直接产生两个单价Fab'片段和Fc片段（参见美国专利No.4,036,945和美国专利No.4,331,647）。
还可使用切割抗体的其他方法，例如分离重链以形成单价轻-重链片段，进一步切割片段，或其他酶的、化学的或基因的技术，只要所述片段可结合被所述完整抗体识别的抗原。
本领域技术人员会了解，可以制备抗体的保守变体。用于抗体片段例如dsFv片段或scFv片段中的这类保守变体会保留所述VH和VL区之间正确折叠和稳定所必需的关键氨基酸残基，并且会保留所述残基的电荷特性以保持所述分子的低pI值和低毒性。可以在所述VH和/或VL区进行氨基酸置换（例如最多1个、最多2个、最多3个、最多4个或最多5个氨基酸置换）以增加产量。提供功能类似的氨基酸的保守氨基酸置换表是本领域普通技术人员所熟知的。以下六组是被认为是互为保守置换的氨基酸的实例：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
V.免疫缀合物
可将对本文描述的GPC3或GPC3上HS特异的人单克隆抗体缀合到治疗剂或效应分子。免疫缀合物包括但不限于，其中治疗剂与抗体共价连接的分子。治疗剂是针对具体靶分子或带有靶分子的细胞具有特定生物活性的试剂。本领域的技术人员会理解，治疗剂可包括多种药物（例如长春碱、道诺霉素等）、细胞毒素（例如天然的或经修饰的假单胞菌外毒素或白喉毒素）、本身含有药物组合物的包囊剂（例如脂质体）、放射性试剂（例如125I、32P、14C、3H和35S）和其他标记、靶部分和配体。
具体治疗剂的选择取决于具体的靶分子或细胞，以及所需要的生物效应。因此，例如，所述治疗剂可以为用于使具体靶细胞（例如肿瘤细胞）死亡的细胞毒素。相反地，在需要引起非致死性生物反应的情况下，可将所述治疗剂缀合至非致死的药剂或含有非致死药剂的脂质体。
使用本文描述的治疗剂和抗体，本领域技术人员可容易地构建含有功能等价核酸（例如序列不同、但编码相同的效应部分或抗体序列的核酸）的多个克隆。因此，本公开提供了编码抗体和缀合物及其融合蛋白的核酸。
效应分子可使用本领域技术人员已知的任何数量的方式连接至目的抗体。可使用共价和非共价连接方式。根据效应物的化学结构，连接所述效应分子和抗体的方法有所不同。多肽一般含有多个官能团；例如羧酸（COOH）、游离氨基（-NH2）或巯基（-SH）,其可用于与抗体上合适的官能团发生反应以与所述效应分子结合。或者，可将所述抗体衍生化以暴露或连接另外的反应性官能团。所述衍生化可包括连接任意的多种已知接头分子。所述接头可以是用于接合所述抗体与效应分子的任何分子。所述接头能够与所述抗体和效应分子形成共价键。合适的接头对于本领域技术人员是熟知的，包括但不限于直链或支链的碳接头、杂环碳接头或肽接头。在所述抗体和效应分子是多肽的情况下，所述接头可以通过其侧基（例如通过到半胱氨酸的二硫键）接合到组成氨基酸或者接合至末端氨基酸的α碳氨基和羧基。
在一些情况中，当所述免疫缀合物已经到达其靶位点时，需要从所述抗体释放所述效应分子。因此，在这些情况中，免疫缀合物会包含所述靶位点附近可切割的键。切割所述接头以将所述效应分子从所述抗体释放可以由酶活性引起，或由所述免疫缀合物在所述靶细胞内或靶位点附近所处的条件引起。
考虑到已经报道的大量用于将多种放射性诊断化合物、放射性治疗化合物、标记（例如酶或荧光分子）药物、毒素和其他试剂连接到抗体的方法，本领域技术人员将能够确定用于将给定试剂连接至抗体或其他多肽的合适方法。
可将本文公开的抗体或抗体片段衍生化或连接至另外的分子（例如另外的肽或蛋白质）。通常，衍生化所述抗体或其部分使得与靶抗原的结合不受所述衍生化或标记的不利影响。例如，所述抗体可以被功能性地连接（通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他）到一种或多种其他分子实体，例如另外的抗体（例如双特异性抗体(bispecificantibody或diabody)）、检测试剂、药剂和/或可介导所述抗体或抗体部分与另外的分子（例如抗生蛋白链菌素核区域或多组氨酸标签）缔合的蛋白质或肽。
一种类型的衍生抗体通过交联两个或更多个抗体（同一类型或者不同类型，例如以产生双特异性抗体）产生。合适的交联剂包括具有被适当间隔（例如间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯）分开的两个不同反应基团的异型双功能交联剂或同型双功能交联剂（例如双琥珀酰亚胺辛二酸酯）。这样的交联剂可商购。
可以用可检测部分标记可结合（例如特异性结合）GPC3或GPC3上HS链的人抗体。可用的可检测试剂包括荧光化合物，其包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲基氨基-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、稀土无机发光材料等。还可使用生物发光标记物，例如萤光素酶、绿色荧光蛋白（GFP）、黄色荧光蛋白（YFP）。还可以用可用于检测的酶来标记抗体，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。当抗体被可检测酶标记时，可以通过加入可被所述酶使用以产生可识别的反应产物的另外的试剂来检测所述抗体。例如，当存在辣根过氧化物酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯胺可产生可目视检测的有颜色的反应产物。还可用生物素标记抗体并通过间接测量其与抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的结合来检测。应注意，抗生素蛋白本身可用酶或荧光标记来标记。
可用磁性试剂例如钆来标记抗体。还可用稀土元素（例如铕和镝）和锰来标记抗体。顺磁性颗粒例如超顺磁性氧化铁也可用作标记。还可用可被第二报告分子（例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签）识别的预定多肽表位来标记抗体。在一些实施方案中，标记被不同长度的间隔臂连接以减少可能的空间位阻。
还可用放射性标记的氨基酸来标记抗体。放射性标记可用于诊断和治疗目的。例如，放射性标记可用于通过X-射线、发射谱或其他诊断技术来检测GPC3。用于多肽的标记的实例包括但不限于以下放射性同位素或放射性核苷酸：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。
抗体还可用化学基团例如聚乙二醇（PEG）、甲基或乙基或碳水化合物基团来衍生化。这些基团可用于改善抗体的生物特性，例如用以延长血清半衰期或增加组织结合。
可将本文描述的人单克隆抗体与毒素一起使用以产生免疫毒素。示例性的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素和其亚基以及肉毒杆菌毒素A-F。这些毒素可容易地从商业来源获得（例如，SigmaChemicalCompany,St.Louis,MO）。所考虑的毒素还包括本文描述的毒素的变体（参见，例如参见美国专利No.5,079,163和4,689,401）。在一个实施方案中，所述毒素为假单胞菌外毒素（PE）（美国专利No.5,602,095）。本文使用的“假单胞菌外毒素”是指全长的天然（天然存在）的PE或经过修饰的PE。这类修饰可包括但不限于除去结构域Ia、结构域Ib、II和III中的多个氨基酸缺失、单个氨基酸置换以及在羧基端加入一个或多个序列（例如，参见，Siegalletal.,J.Biol.Chem.264:14256-14261,1989）。
与本文描述的单克隆抗体一起使用的PE可以包括其天然序列、所述天然序列的细胞毒性片段以及天然PE及其细胞毒性片段的保守修饰的变体。PE的细胞毒性片段包括在靶细胞中在进行或不进行之后的蛋白水解或其他处理的情况下都有细胞毒性的那些。PE的细胞毒性片段包括PE40、PE38和PE35。对PE及其变体的另外的描述参见例如美国专利No.4,892,827；5,512,658；5,602,095；5,608,039；5,821,238；和5,854,044；PCT公开文本No.WO99/51643；Paietal.,Proc.NatlAcad.Sci.USA88:3358-3362,1991；Kondoetal.,J.Biol.Chem.263:9470-9475,1988；Pastanetal.,Biochim.Biophys.Acta1333:C1-C6,1997。
在一些实例中，所述PE为PE38，其包含如下的氨基酸序列：
GGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK(SEQIDNO:27)
本文还考虑抵抗蛋白酶的PE变体和免疫原性降低的PE变体，例如但不限于，PE-LR、PE-6X、PE-8X、PE-LR/6X和PE-LR/8X（参见例如，Weldonetal.,Blood113(16):3792-3800,2009；Ondaetal.,ProcNatlAcadSciUSA105(32):11311-11316,2008；和PCT公开文本No.WO2007/016150、WO2009/032954和WO2011/032022，其以引用的方式纳入本文）。
在一些实例中，所述PE为对溶酶体降解有抗性的变体，例如PE-LR(Weldonetal.，Blood113(16)：3792-3800，2009；PCT公开文本No.WO2009／032954)，其具有如下的氨基酸序列：
RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK(SEQIDNO:23)
在其他实例中，所述PE为被称为PE-LR／6X的变体(PCT公开文本No.WO2011／032022)，其具有如下的氨基酸序列：
RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEEGGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWAGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDAAGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYATSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEESGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDSEQAISALPDYASQPGKPPREDLK(SEQIDNO:24)
在其他实例中，所述PE变体为免疫原性降低的PE，例如具有如下序列的PE：
RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGXVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEEXGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWXGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDAXGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYXTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEXGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDXEXAISALPDYASQPGKPPREDLK(X=G,A或S；SEQIDNO:25)
在其他实例中，PE为被称为PE-LR/8M的变体(PCT公开文本No.WO2011／032022)，其具有如下的氨基酸序列：
RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGAVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEEGGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWAGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDAAGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYATSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEESGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDSEAAISALPDYASQPGKPPREDLK(SEQIDNO:26)
本文描述的抗体还可用于将任何数量的不同诊断或治疗性化合物靶向至其表面表达GPC3的细胞。因此，可以将本公开的抗体与要直接递送至表达细胞表面GPC3的细胞的药物直接连接或通过接头连接。可这样做以用于治疗、诊断或研究目的。治疗剂包括这样的化合物如核酸、蛋白质、肽、氨基酸或衍生物、糖蛋白、放射性同位素、脂质、碳水化合物或重组病毒。核酸治疗或诊断部分包括反义核酸、与单链或双链DNA共价交联的衍生寡核苷酸以及三链形成寡核苷酸。
或者，连接抗GPC3的抗体的分子可以为包裹系统例如脂质体或微团，所述脂质体或微团含有治疗组合物例如药物、核酸(例如反义核酸）或优选被保护而免于直接暴露于循环系统的另一治疗部分。制备连接有抗体的脂质体的方法是本领域技术人员熟知的（参见，例如，美国专利No.4,957,735；Connoretal.,Pharm.Ther.28:341-365,1985）。
本文描述的抗体还可共价或非共价连接至可检测标记。适用于这种用途的可检测标记包括可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测的任何组合物。可用的标记包括磁珠、荧光染料（例如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等）、放射性标记（例如3H、125I、35S、14C或32P）、酶（例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其他酶）和比色标记例如胶体金或有色玻璃或塑料（例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等）珠。
检测这类标记的方法是本领域技术人员熟知的。因此。例如，放射性标记可使用照相胶片或闪烁计数器检测，荧光标记物可使用光检测器检测发出的光来检测。酶标记一般通过为酶提供底物并检测所述酶对所述底物作用而产生的反应产物来检测，比色标记通过简单地目视所述有色标记来检测。
VI.组合物和使用方法
提供了包括在载体中的一种或多种结合（例如特异性结合）GPC3或GPC3上HS的抗体的本公开的组合物。还提供了包含免疫缀合物或免疫毒素的组合物。所述组合物可以以用于给予受试者的单位剂量形式制备。给药量和给药时间由治疗医生判断以达到需要的结果。所述抗体可被配制用于全身或局部（例如肿瘤内）给药。在一个实例中，所述抗体被配制用于肠胃外给药，例如静脉内给药。
用于给药的组合物可以包括溶于可药用载体（例如水性载体）的抗体的溶液。可以使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常不含不需要的物质。这些组合物可以通过熟知的常规灭菌技术灭菌。所述组合物可以含有接近生理条件所需要的可药用辅料例如pH调节剂和缓冲试剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠等。这些制剂中抗体的浓度可以有很大的差异，并且将主要基于流体体积、粘性、体重等根据所选择给药的具体方式和受试者需要来选择。
用于静脉内给药的一般药物组合物含有约0.1至10mg抗体/受试者/天。可以使用从0.1mg至最高约100mg/受试者/天的剂量，尤其当所述试剂被给药至隔离的位点而不进入循环系统或淋巴系统（例如进入到体腔或进入到器官的腔）时。制备可给药组合物的实际方法是本领域技术人员熟知的或者显而易见的，并且更详细地描述于出版物例如Remington'sPharmaceuticalScience,第19版,MackPublishingCompany,Easton,PA(1995)。
抗体可以以冻干形式提供并在给药前用无菌水再水化，但是它们也可以以已知浓度的无菌溶液的形式提供。然后，可以将所述抗体溶液加入到含有0.9%氯化钠（USP）的输注袋中，并且在一些情况中以0.5至15mg/kg体重的剂量给药。本领域有大量的抗体药物给药的经验，自从1997年被批准后抗体药物在美国已经上市。抗体可以通过缓慢输注来给予，而不是静脉推注或快速注射（bolus）。在一个实例中，给予较高的负荷剂量，然后给予较低水平的维持剂量。例如，可以在约90分钟时间内输注4mg/kg的初始负荷剂量，如果前剂量耐受良好，可以2mg/kg的每周维持剂量在30分钟时间内输注，持续4-8周。
受控释放肠胃外制剂可被制成埋植剂、油性注射剂或被制成颗粒系统。对于蛋白递送系统的全面综述，参见Banga,A.J.,TherapeuticPeptidesandProteins:Formulation,Processing,andDeliverySystems,TechnomicPublishingCompany，Inc.,Lancaster,PA,(1995)。颗粒系统包括微球体、微粒、微囊剂、纳米囊剂、纳米球和纳米颗粒。微囊剂含有所述治疗性蛋白质例如细胞毒素或药物作为中心核。在微球体中，所述治疗剂分散在整个所述颗粒。小于约1μm的颗粒、微球体和微囊剂通常被分别称为纳米颗粒、纳米球和纳米囊剂。毛细血管的直径为约5μm，因此只有纳米颗粒可静脉内给药。微粒直径通常为约100μm，经皮下或者肌内给药。参见，例如Kreuter,J.,ColloidalDrugDeliverySystems,J.Kreuter,ed.,MarcelDekker,Inc.,NewYork,NY,pp.219-342(1994)和Tice&Tabibi,TreatiseonControlledDrugDelivery,A.Kydonieus,ed.,MarcelDekker,Inc.NewYork,NY,pp.315-339,(1992)。
聚合物可以用于本文公开的抗体组合物的离子控制释放。用于受控药物递送的多种可降解和不可降解的聚合基质是本领域已知的（Langer,AccountsChem.Res.26:537-542,1993）。例如，嵌段共聚物polaxamer407在低温下以粘稠的流动液体形式存在，但是在体温下形成半固体凝胶。已表明它是配制和持续递送重组白细胞介素-2和脲酶的有效运载体（Johnston等，Pharm.Res.9:425-434,1992和Pec等，J.Parent.Sci.Tech.44(2):58-65,1990）。或者，羟磷灰石已被用作用于控制蛋白质释放的微载体（Ijntema等，Int.J.Pharm.112:215-224,1994）。又在另一方面，脂质体被用于脂质包裹的药物的控制释放以及药物靶向（Betageri等，LiposomeDrugDeliverySystems,TechnomicPublicationCo.,Inc.，Lancaster,PA(1993)）。已知有用于控制治疗性蛋白质递送的许多另外的系统（参见美国专利No.5,055,303；美国专利No.5,188,837；美国专利No.4,235,871；美国专利No.4,501,728；美国专利No.4,837,028；美国专利No.4,957,735；美国专利No.5,019,369；美国专利No.5,055,303；美国专利No.5,514,670；美国专利No.5,413,797；美国专利No.5,268,164；美国专利No.5,004,697；美国专利No.4,902,505；美国专利No.5,506,206；美国专利No.5,271,961；美国专利No.5,254,342和美国专利No.5,534,496）。
A.治疗方法
可给予本文公开的抗体、组合物和免疫缀合物以减缓或抑制肿瘤细胞的生长，或抑制所述肿瘤细胞的转移，例如HCC细胞。在这些应用中，以足以抑制癌细胞生长、复制或转移或足以抑制癌症的征象或症状的量，给予受试者治疗有效量的抗体。合适的受试者可包括被诊断患有表达GPC3的癌症例如但不限于HCC、黑色素瘤、肺癌或卵巢癌的那些。
在一个非限制性实施方案中，本文提供了一种通过选择患有表达GPC3的癌症的受试者并给予所述受试者治疗有效量的本文公开的抗体、组合物或免疫缀合物来治疗患有癌症的受试者的方法。
本文还提供了一种通过选择患有表达GPC3的癌症的受试者并给予所述受试者治疗有效量的本文公开的抗体、组合物或免疫缀合物来抑制肿瘤生长或转移的方法。
人GPC3特异性抗体或免疫缀合物的治疗有效量将取决于疾病的严重程度以及患者健康的一般状况。所述抗体的治疗有效量是指提供症状的主观缓解或由临床医师或者其他有资质的观察者注意到的可客观辨别的改善的量。
还可伴随给予其他抗癌剂或治疗性治疗（例如手术切除肿瘤）来给予本文公开的抗体和免疫缀合物。任何合适的抗癌剂可以与本文公开的抗体、组合物和免疫缀合物结合给予。示例性的抗癌剂包括但不限于化学治疗剂，例如有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入的抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗生存剂（anti-survivalagent）、生物应答调节剂、抗激素类（例如抗雄激素类）和抗血管生成剂。其他抗癌治疗包括放射治疗和特异性靶向癌细胞的其他抗体。
烷化剂的非限制性实例包括氮芥类（nitrogenmustard）（例如氮芥（mechlorethamine）、环磷酰胺、美法仑、尿嘧啶氮芥或苯丁酸氮芥）、烷基磺酸盐类（例如白消安）、亚硝基脲类（例如卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链佐星或达卡巴嗪）。
抗代谢物的非限制性实例包括叶酸类似物（例如氨甲蝶呤）、嘧啶类似物（例如5-FU或阿糖胞苷）和嘌呤类似物，例如巯基嘌呤或硫鸟嘌呤。
天然产物的非限制性实例包括长春花生物碱类（例如长春碱、长春新碱或长春地辛）、表鬼臼毒素类（例如依托泊苷或替尼泊苷）、抗生素类（例如更生霉素、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素或丝裂霉素C）和酶（例如L-天门冬酰胺酶）。
多种试剂的非限制性实例包括铂配位络合物（例如顺式二胺-二氯铂II，也称为顺铂）、取代的脲（例如羟基脲）、甲肼衍生物（例如丙卡巴肼）和肾上腺皮质（adrenocrotical）抑制剂（例如米托坦和氨鲁米特）。
激素和拮抗剂的非限制性实例包括肾上腺皮质类固醇类（例如泼尼松）、孕激素类（例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮（magestrolacetate））、雌激素类（例如二乙基己烯雌酚和炔雌醇）、抗雌激素类（例如他莫昔芬）和雄激素类（例如丙酸睾酮和氟甲睾酮）。最常用的化学治疗药的实例包括阿霉素、爱克兰、Ara-C、BiCNU、白消安、CCNU、碳铂、顺铂、环磷酰胺、柔红霉素、DTIC、5-FU、氟达拉滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、氮芥、紫杉醇（或其他紫杉烷类，例如多西他赛）、硫酸长春碱制剂、长春新碱、VP-16，而一些更新的药物包括吉西他滨（Gemzar）、赫赛汀、伊立替康（Camptosar，CPT-11）、克拉立平、诺维本、RituxanSTI-571、泰索帝、托泊替康（Hycamtin）、希罗达（卡培他滨）、Zevelin和骨化三醇。
可使用的免疫调制剂的非限制性实例包括AS-101（Wyeth-AyerstLabs.）、溴匹立明（Upjohn）、γ干扰素（Genentech）、GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；GeneticsInstitute）、IL-2（Cetus或Hoffman-LaRoche）、人免疫球蛋白（CutterBiological）、IMREG（来自NewOrleans,La.的Imreg）、SK&F106528和TNF（肿瘤坏死因子；Genentech）。
对于某些类型的癌症，另外的常见治疗是手术治疗，例如手术切除癌症或其部分。治疗的另一实例是放射治疗，例如向肿瘤部位给予放射性物质或能量（例如外线束疗法）以帮助消灭肿瘤或使其缩小，然后进行手术切除。
B.诊断和检测的方法
本文提供了在体外或体内检测GPC3表达的方法。在一些情况下，在生物样品中检测了GPC3表达。所述样品可以为任何样品，包括但不限于来自活组织检查、尸体解剖和病理标本的组织。生物样品还包括组织的切片，例如为组织学目的获取的冷冻切片。生物样品还包括体液，例如血液、血清、血浆、痰、脊髓液或尿。生物样品一般获自哺乳动物，例如人或非人灵长类。
在一个实施方案中，提供了一种通过使来自受试者的样品与本文公开的人单克隆抗体接触并检测所述抗体与所述样品的结合来确定所述受试者是否患有癌症的方法。与所述抗体和对照样品的结合相比，所述抗体与所述样品的结合增加可鉴定所述受试者患有癌症。
在另一实施方案中，提供了一种通过使来自被诊断患有癌症的受试者的样品与本文公开的人单克隆抗体接触并检测所述抗体与所述样品的结合来确认所述受试者的癌症的诊断的方法。与所述抗体和对照样品的结合相比，所述抗体与所述样品的结合增加可确认所述受试者的癌症的诊断。
在本公开的方法的一些实例中，所述人单克隆抗体被直接标记。
在一些实例中，所述方法还包括使特异性结合所述人单克隆抗体的第二抗体与所述样品接触并检测所述第二抗体的结合。与所述第二抗体和对照样品的结合相比，所述第二抗体与所述样品的结合增加可检测所述受试者的癌症或可确认所述受试者的癌症的诊断。
在一些情况下，所述癌症为HCC、黑色素瘤、肺癌或卵巢癌，或表达GPC3的任何其他类型的癌症。
在一些实例中，所述对照样品为来自未患有癌症的受试者的样品。在具体的实例中，所述样品为血液样品或组织样品。
在一些情况下，将结合（例如特异性结合）GPC3（或GPC3上HS链）的所述人抗体用可检测标记直接标记。在另一实施方案中，结合（例如特异性结合）GPC3的所述人抗体（第一抗体）是未标记的，并且可结合特异性结合GPC3的所述人抗体的第二抗体或其他分子是被标记的。如本领域技术人员所熟知的，可选择能够特异性结合特定种类和类型的第一抗体的第二抗体。例如，如果所述第一抗体为人IgG，那么所述第二抗体就可以为抗人IgG。可结合抗体的其他分子包括，但不限于蛋白质A和蛋白质G，其两者均可商购。
上文描述了用于所述抗体或第二抗体的合适标记，包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性试剂和放射性材料。合适酶的非限制性实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的非限制性实例包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素。合适荧光材料的非限制性实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基氨基荧光素、丹酰氯或藻红蛋白。非限制性示例性发光材料是鲁米诺；非限制性示例性磁性试剂是钆，非限制性示例性放射性标记包括125I、131I、35S或3H。
在替代的实施方案中，可利用用可检测物质标记的GPC3标准品和特异性结合GPC3的未标记人抗体通过竞争性免疫测定来测定生物样品中的GPC3。在该测定中，所述生物样品、标记的GPC3标准品和特异性结合GPC3的人抗体被合并，然后确定结合到所述未标记抗体的标记的GPC3标准品的量。所述生物样品中GPC3的量与结合到特异性结合GPC3的抗体的标记的GPC3标准品的量成反比。
本文公开的免疫测定和方法可用于多种目的。在一个实施方案中，特异性结合GPC3的所述人抗体可用于在细胞培养物中检测细胞中GPC3的产生。在另一实施方案中，所述抗体可用于检测生物样品中GPC3的量。
在一个实施方案中，提供了一种用于检测生物样品例如血液样品或组织样品中的GPC3的试剂盒。例如，为了确认受试者中的癌症诊断，可进行活组织检查以获得用于组织学检查的组织样品。或者，可获得血液样品以检测可溶性GPC3蛋白或片段的存在。用于检测多肽的试剂盒一般包含特异性结合GPC3的人抗体，例如本文公开的任何抗体。在一些实施方案中，所述试剂盒包括抗体片段，例如scFv片段、VH结构域或Fab。在另外的实施方案中，所述抗体是标记的（例如，用荧光标记、放射性标记或酶标记进行标记）。
在一个实施方案中，试剂盒包括公开结合GPC3的抗体的使用方法的说明性材料。所述说明性材料可以是书面的、电子形式（例如计算机磁盘或光盘）或者可以是可视形式（例如视频文件）。所述试剂盒还可以包括有助于该试剂盒被设计用于的具体应用的其他组分。因此，例如，所述试剂盒可以额外地含有检测标记的装置（例如酶标记的酶底物、检测荧光标记的滤光装置、适当的第二标记例如第二抗体等）。所述试剂盒可以额外地包括常规用于实施具体方法的缓冲液及其他试剂。这类试剂盒和适当的内容物是本领域技术人员所熟知的。
在一个实施方案中，所述诊断试剂盒包括免疫测定。虽然免疫测定的细节会随着所用的具体形式而有所不同，但是检测生物样品中GPC3的方法通常包括使所述生物样品与在免疫反应条件下与GPC3多肽特异性地反应的抗体接触的步骤。使所述抗体在免疫反应条件下特异性结合以形成免疫复合物，并且直接或间接地检测所述免疫复合物（结合的抗体）的存在。
确定细胞表面标记物存在或不存在的方法在本领域是熟知的。例如，可将所述抗体缀合至其他化合物，该化合物包括但不限于酶、磁珠、胶体磁珠、半抗原、荧光染料、金属化合物、放射性化合物或药物。所述抗体还可用于免疫测定例如但不限于放射免疫测定（RIA）、酶联免疫吸附测定（ELISA）或免疫组织化学测定。所述抗体还可用于荧光激活的细胞分选（FACS）。FACS采用多个颜色通道、低角度和钝角的光散射检测通道和阻抗通道以及其他更复杂水平的检测，以分离或分选细胞（参见美国专利No.5,061,620）。本文公开的结合GPC3（或GPCS上的HS链）的任何人抗体可用于这些测定。因此，所述抗体可用于常规免疫测定，包括但不限于ELISA、RIA、FACS、组织免疫组织化学、蛋白质印迹或免疫沉淀。
C.工程化的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）
本公开的单克隆抗体还可用于产生被工程化以表达嵌合抗原受体（CAR；也称为嵌合T细胞受体、人造T细胞受体或嵌合免疫受体）的CTL。通常，CAR包括结合部分、细胞外铰链和间隔物元件、跨膜区和进行信号转导功能的内结构域（endomain）（Cartellierietal.,JBiomedBiotechnol2010:956304,2010）。在许多实例中，所述结合部分为单克隆抗体的抗原结合片段，例如scFv。已经使用若干不同的内结构域来产生CAR。例如，内结构域可以由具有基于免疫受体酪氨酸的活化基序（ITAM）例如CD3δ或FcεRIγ的信号转导链组成。在一些实例中，所述内结构域还包括至少一个另外的共刺激结构域例如CD28和/或CD137的胞内部分。
表达CAR的CTL可用于靶向具体的细胞类型，例如肿瘤细胞。因此，本文公开的单克隆抗体可用于对表达CAR（含有GPC3特异性抗体的抗原结合片段）的CTL进行工程化，从而使所述工程化的CTL靶向至表达GPC3的肿瘤细胞。工程化的T细胞之前已经被用于针对一些类型的癌症的过继疗法（adoptivetherapy）（参见例如，Parketal.,MolTher15(4):825-833,2007）。使用表达CAR的T细胞比标准的基于CTL的免疫疗法更普遍，因为表达CAR的CTL不受HLA的限制从而可用于患有表达靶抗原的肿瘤的任何患者。
因此，本文提供了包含GPC3特异性抗体结合片段例如scFv的CAR。还提供了编码所述CAR的分离的核酸分子和载体以及含有所述核酸分子或载体的宿主细胞，例如CTL。表达包含GPC3特异性抗体结合片段的CAR的CTL可用于治疗表达GPC3的癌症，例如HCC。因此，本文提供了通过选择患有表达GPC3的癌症的受试者并给予所述受试者治疗有效量的表达靶向GPC3的CAR的CTL来治疗患有癌症的受试者的方法。
D.双特异性抗体
双特异性抗体是包含两种不同单克隆抗体的抗原结合片段的重组蛋白。因此，双特异性抗体结合两种不同的抗原。双特异性抗体可通过同时靶向CTL（例如CTL受体组分例如CD3）和肿瘤抗原而用于癌症免疫治疗。本文公开的GPC3特异性单克隆抗体可用于产生靶向GPC3和CTL的双特异性抗体，从而提供治疗表达GPC3的癌症的方法。
本文提供了包含GPC3特异性单克隆抗体或其抗原结合片段的双特异性单克隆抗体。在一些实施方案中，所述双特异性单克隆抗体还包含特异性结合T细胞受体的组分例如CD3的单克隆抗体或其抗原结合片段。还提供了编码所述双特异性抗体的分离的核酸分子和载体，以及包含所述核酸分子或载体的宿主细胞。包含GPC3特异性抗体或其抗原结合片段的双特异性抗体可用于治疗表达GPC3的癌症例如HCC。因此，本文提供了通过选择患有表达GPC3的癌症的受试者并给予所述受试者治疗有效量的靶向GPC3的双特异性抗体来治疗患有癌症的受试者的方法。
提供以下实施例以解释某些具体的特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为将本公开限定为所描述的具体特征或实施方案。
实施例
实施例1：HN3——结合细胞表面相关的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3并抑制HCC细胞增殖的人单结构域单克隆抗体
本实施例描述了针对肿瘤相关GPC3的高亲和力单结构域mAb的生成和表征。
A.材料和方法
细胞系
将人肝癌细胞系HepG2、Hep3B、HuH-1、HuH-4、HuH-7和SK-Hep1以贴壁单层培养物维持在补充有10%胎牛血清（HyClone,Logan,UT）、1%L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素（Invitrogen,Carlsbad,CA）的D-MEM培养基（Invitrogen,Carlsbad,CA）中，在37℃下在加入5%CO2的空气中孵育。收获细胞，每周两次更换所述培养基。确认了细胞为支原体阴性。将GPC3阴性细胞系A431（人上皮癌细胞系）通过用编码GPC3的质粒转染来进行工程化以表达高水平的GPC3。将A431和稳定转染的细胞系（称为G1）都按上述维持在D-MEM中。
噬菌体展示和淘选方法
先前构建了组合型人VH结构域文库，其估计大小为2.5×1010（Chenetal.,JMolBiol382:779-789,2008）。将文库细菌贮液（stock）接种至2.5升含2%葡萄糖和100μg/ml氨苄西林的2YT培养基中，并在37℃下以250rpm摇动培养。当达到对数中期（OD600为0.4-0.8）时，以5×109pfu/ml加入辅助噬菌体M13KO7来进行超感染。在连续培养一个小时之后，收集细胞并将其重悬于2.5升含100μg/ml氨苄西林和50μg/ml卡那霉素的2YT培养基中。然后，将所述细胞培养物再在25℃下过夜孵育。使所述细胞成为片状沉淀，上清液用0.22μm的膜过滤，然后保存于4℃下用于淘选。
重组GPC3在293F细胞中表达并如先前报道所述（Fengetal.,IntJCancer128(9):2246-2247,2011）通过镍柱层析来纯化。为了进行淘选，使用96孔ELISA板（Maxisorb,Nunc/ThermoFisherScientific,Rochester,NY）在4℃下过夜捕获磷酸盐缓冲盐水（PBS）中不同量（mount）的纯化GPC3。倒掉包被缓冲液，将所述板用封闭缓冲液（PBS中2%牛血清白蛋白（BSA））在室温下封闭1小时。同时，将30μl噬菌体上清液（一般含有1010-1011cfu）通过在Ependorf管中与30μl封闭缓冲液混合来进行预封闭。从所述板除去封闭缓冲液，向一个孔加入60μl预封闭的噬菌体上清液并在室温下孵育1小时以进行结合。除去未结合的噬菌体，将所述板用含0.05%吐温-20的PBS洗涤4次。将结合的噬菌体用100mMTEA洗脱。为了第一轮淘选，使用5μg固定的GPC3；为了第二轮、第三轮和第四轮淘选，使用0.5μgGP3。在进行4轮淘选之后，通过使用噬菌体ELISA和噬菌体FACS法挑选单个菌落并鉴定为GPC3结合物。
HN3-hFc表达和纯化
HN3-hFc在以悬浮方式在HEK-293F细胞中表达。分泌的GPC3蛋白根据制造商的说明使用蛋白A柱（GEhealthcare）进行纯化。
流式细胞术
将细胞收获在细胞解离溶液（Invitrogen）中，并在含5%BSA的冰冷PBS中洗涤和重悬。将细胞与10μg/mL的HN3-hFc和同种型对照人IgG（SouthernBiotech）一起孵育。用缀合藻红蛋白的山羊抗人IgG（Sigma-Aldrich,St.Louis,MO）检测结合。使用FACSCalibur（BDBiosciences,FranklinLakes,NJ）测量活细胞相关的荧光。
为了细胞的结合亲和力测量，将不同量的HN3-hFc与G1细胞一起孵育。几何平均值与相应HN3-hFc浓度相关，kD值使用单点结合法通过软件Prism5.0确定。
为了进行噬菌体FACS，将30μl噬菌体上清液用FACS缓冲液在冰上预封闭1小时，然后与G1细胞悬浮液混合。通过小鼠抗M13和缀合PE的山羊抗小鼠抗体检测结合。
ELISA
在4℃下使用PBS缓冲液中1μg/ml的纯化GPC3以50μl/孔过夜包被96孔板。除去所述包被缓冲液之后，加入HN3-hFc溶液，将所述板在室温下孵育以使结合发生。在除去HN3-hFc溶液之后，将板用含有0.05%吐温20的PBS缓冲液洗涤两次。通过山羊抗人HRP缀合物（Biosource）检测结合。
为了进行噬菌体ELISA，将30μl噬菌体上清液用封闭缓冲液预封闭，然后根据标准的ELISA方法进行处理。通过缀合HRP的小鼠抗M13抗体（GEhealthcare）检测结合。
为了进行HN3-hFc亲和力测量，孵育了不同量的HN3-hFc。OD450值与相应的HN3-hFc浓度相关，kD值使用单点结合法通过软件Prism5.0（GraphPadSoftware）确定。
WST-8细胞生长测定
根据制造商的说明使用CellCountingKit-8（Dojindo,Gaithersburg,MD）通过WST-8测定评价细胞生长抑制。将500微升细胞以1×104个细胞/孔接种到24孔板，同时加入指定浓度的HN3-hFc。将所述细胞在37℃下孵育4天，然后如先前报道所述（Hoetal.,IntJCancer128:2020-2030,2011）进行细胞活力测定。
B.结果
抗GPC3的单结构域人mAb的分离
本研究使用的单结构域文库是基于高度可溶抗体m0（Chenetal.,JMolBiol382:779-789,2008）的框架区构建，其具有类似于种系对应物DP47的序列。DP47是高度可溶和可再折叠的（Jespersetal.,JMolBio337:893-903,2004）。
为了筛选对GPC3的核心蛋白或HS链特异的抗体，构建并产生了两个人Fc融合蛋白：蛋白GPC3-hFc和GPC3(AA)-hFc。所述Fc片段含有具有CH2和CH3结构域的铰链区。GPC3(AA)-hFc含有两个点突变（S495A和S502A），所述两个点突变破坏（abolish）了GPC3上的HS链。所述蛋白的分子量和纯度用SDS-PAGE和蛋白质印迹确认（图1）。其纯度大于90%。然后，将所述单结构域噬菌体展示文库在包被在平的96孔ELISA板上的5μgGPC3上进行第一轮筛选，然后相对于0.5μg的GPC3进行之后的3轮淘选。在第一轮噬菌体淘选之后，获得了约9000个单个噬菌体克隆。在第四轮淘选结束时，多于95%的克隆为GPC3结合物；HN3是高度富集的优势克隆。序列分析显示HN3在框架区中具有与m0和DP47的框架区序列相同的序列（图2）。
HN3与细胞表面相关GPC3的高亲和力结合
为了检查HN3对癌细胞的结合特性，构建了HN3-人Fc融合蛋白（HN3-hFc）并使用蛋白A柱纯化。SDS-PAGE分析显示它形成了分子量约80kDa的二聚体。在还原条件下，分子量为约40kDa（图3A）。
然后，使用HN3-hFc测试了六种HCC细胞系、一种阴性细胞系A431和A431衍生的细胞系G1。所述G1细胞系稳定地在细胞表面高表达GPC3。HN3显示出对HCC细胞和G1细胞的特异性结合，而不结合GPC3阴性的A431癌细胞（图3B）。HN3对GPC3蛋白和GPC3阳性细胞的亲和力分别通过ELISA和流式细胞术测量。对GPC3蛋白和细胞的亲和力都非常强，对于GPC3蛋白，计算出的KD值为0.64nM，对于细胞表面相关GPC3，为0.15nM（图4）。HN3结合细胞表面相关GPC3比可溶性GPC3蛋白更强，这可能是由于细胞表面上GPC3的天然构象。HN3不能通过蛋白质印迹识别变性的GPC3，这表明HN3的结合可能是构象依赖的。
表位作图结果显示HN3结合野生型GPC3蛋白与结合没有HS链的突变型GPC3一样强。因此，HN3可结合GPC3的核心蛋白。所述结合不依赖于所述HS链。此外，HN3不结合所述N端片段或C端片段，这再次表明HN3可识别GPC3的核心蛋白的天然构象。
HN3处理通过引起细胞周期停滞和凋亡而抑制HCC细胞增殖
为了确定具体GPC3缺失对人HCC肿瘤细胞系的增殖和存活的效应，使用了三种不同的GPC3特异性shRNA来敲低GPC3mRNA/蛋白质。用于研究灵敏度的细胞系包括Hep3B和Huh-7，两者均为HCC细胞系。具体shRNA对GPC3蛋白的有效敲低通过免疫印迹验证（图6A）。所述shRNAsh-1和sh-2减少了HCC细胞中>90%的GPC3表达，而shRNAsh-3仅适度地减少HCC细胞中约10%的GPC3表达（图6A）。Hep3B和Huh-7细胞系暴露于培养物中的GPC3特异性shRNA（sh-1和sh-2）导致了对增殖的很深的抑制（图6B和6C）。相比之下，相同的细胞暴露于对照（乱序的）shRNA不影响增殖。
为了确定HN3是否可以通过中和GPC3增殖效应而直接抑制HCC增殖，对五种GPC3阳性HCC细胞系和一种GPC3阴性上皮癌细胞系（A431）进行了细胞生长抑制测定。已发现，HN3强烈地抑制Hep3B和Huh-7细胞系的生长（IC50为约50μg/ml），部分地抑制HepG2、Huh-4和Huh1细胞生长（图6D）。HN3不抑制A431细胞和其他GPC3阴性的细胞。测试了发明人实验室中的其他抗GPC3的人和小鼠mAb，它们中没有一个能抑制HCC细胞增殖，这表明被所述HN3人mAb识别的表位是特异性参与HCC细胞增殖的新功能性结构域。
为了研究所述HN3人抗体抑制HCC细胞增殖的机制，分析了细胞周期和凋亡。在Huh4和Huh7中，HN3处理显著地增加了G1的群体并减少了S期（图7A）。还检查了经HN3处理的HCC细胞的凋亡。在经HN3处理的Huh-4、Huh-7和Hep3B细胞中观察到了凋亡被诱导（图7B）。在所述HN3人mAb处理48小时之后，观察到了凋亡标记物PARP被切割（图7C）。
还研究了Hippo/Yap、TGFβ和Wnt信号转导途径，因为这三条途径已被提出在HCC发病机制，尤其是细胞增殖和存活中起重要作用。已发现，Wnt和TGF信号转导的靶基因没有改变，这表明这两条途径可能不参与HN3诱导的细胞周期停滞和凋亡。然而，Yap可能参与由所述HN3人mAb抑制细胞增殖的机制。
最近认识到，hippo途径活跃地控制肝大小以免过度生长。由于持续活性的yap——hippo途径主要的下游效应物，在HCC中经常见到hippo途径的脱调节。为了检测HN3通过使yap失活而抑制细胞增殖的可能性，在HN3处理之后在一组的三个HCC细胞系（Huh-4、Huh-7和Hep3B）中通过蛋白质印迹测量了分子改变（图7D）。已发现，yap由于磷酸化的yap和降解的增加而失活。在经处理的Hep3B中总yap也降低。与yap失活一致的是，yap靶基因——细胞周期蛋白D1（参与G1期停滞的的基因），也降低。这些观察结果表明yap可能介导HN3功能。
C.讨论
本文公开了通过噬菌体展示分离HN3——一种靶向GPC3的人单结构域mAb。HN3以亚纳摩尔亲和力与癌细胞上GPC3的构象敏感的新表位强烈并特异性地反应。所述结合不依赖于GPC3上的HS链。此外，HN3可在体外直接抑制HCC细胞增殖。本公开首次报道了针对GPC3的人mAb，并首次表明了靶向GPC3的药物可抑制HCC生长。
最近，已经开发了靶向GPC3的基于抗体的疗法。已经制备了识别C端肽的小鼠mAbGC33，目前正在临床试验中就肝癌治疗对人化GC33进行评估。与GC33相比，HN3具有至少3个优点。第一，HN3是全人蛋白。在没有对癌细胞上的GPC3有高亲和力的人mAb的情况下，不可能全面地开发靶向表达GPC3的癌症的免疫疗法。第二，HN3为单结构域抗体。与常规IgG抗体相比，单结构域mAb具有若干优点：(a)由于其尺寸小（约15kDa），在实体瘤中渗透更好，(b)在大肠杆菌、酵母或甚至植物中进行生产相对容易并且成本降低，和(c)在双特异性抗体、免疫毒素、免疫缀合物、工程化细胞毒性T细胞和纳米颗粒中更加可行的潜力。第三，HN3以亚纳摩尔亲和力结合细胞表面相关GPC3并直接抑制HCC细胞增殖。本文公开的结果证明了HN3可用作治疗剂用于治疗肝癌。
HN3不结合变性的全长GPC3，但它以高亲和力结合细胞表面相关GPC3分子。这些结果强烈地暗示，HN3识别细胞上存在于天然形式GPC3中的构象敏感的特定表位结构。
HN3还可用于通过ELISA、免疫组织化学和肿瘤成像来诊断HCC。Filmus和同事开发了对GPC3的C端特异的1G12mAb，并建立了测量HCC患者的血清GPC3的ELISA方法（Capurroetal.,Gastroenterology125:89-97,2003）。他们发现，在53%的HCC患者的血清中GPC3显著增加，而在健康供体和肝炎患者中检测不到GPC3。Hippo等开发了对GPC3的N端（残基：25-358）特异的mAb并发现GPC3在51%的HCC患者的血清中显著增加（Hippoetal.,CancerRes64:2418-2423,2004）。
本公开描述了针对肿瘤相关GPC3的高亲和力单结构域mAb的产生和表征。因为HN3完全来源于人并且具有高亲和力，预期其免疫原性比鼠mAb低很多并且可有效靶向表达GPC3的肿瘤。HN3是显示出对HCC生长的直接抑制的第一个GPC3结合物。因此，HN3是用于治疗肝癌的可行的治疗剂。
实施例2：HS20——结合GPC3上硫酸类肝素链并抑制肝细胞癌细胞迁移的人单克隆抗体
本实施例描述了可结合GPC3上硫酸肝素的人mAb的产生和表征。
A.材料和方法
细胞系
一组六个人HCC细胞系（SK-Hep1、HepG2、Hep3B、Huh-1、Huh-4和Huh-7）获自马里兰州贝塞斯达的美国国立癌症研究所（NCI）人类致癌作用实验室（NationalCancerInstitute(NCI)LaboratoryofHumanCarcinogenesis,Bethesda,Maryland）。A431（人上皮癌细胞系）获自美国典型培养物保藏中心（ATCC；Manassas,VA）。所述细胞系培养在补充有10%胎牛血清、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素和2mmol/LL-谷氨酰胺的RPMI或DMEM中。收获细胞并每周两次更换所述培养基。确认了细胞是支原体阴性的。
稳定表达GPC3的人细胞的产生
使用LipofectAMINETM2000（Invitrogen,Carlsbad,CA）用含有全长GPC3cDNA的pReceiver载体（Genecopia,Rockville,MD）转染A431细胞。通过用FACSVantageSE（BDBiosciences,SanJose,CA）进行单细胞分选获得了高表达GPC3的细胞系G1。简言之，GPC3cDNA被转染至A431细胞内。3天后，用新霉素选择携带GPC3的细胞持续10天。在流式细胞计数分析的标准方法中，将新霉素选择的细胞与DMEM中1μg/ml的小鼠抗GPC3的抗体（IG12）（SantaCruzBiotechnology,Inc.SantaCruz,CA）一起孵育。4℃下孵育1小时后，将细胞用DMEM洗涤一次并与PE标记的山羊抗小鼠IgG（Invitrogen,Carlsbad,CA）的1:200稀释液孵育1小时。洗涤两次后，将细胞悬浮于0.5ml的DMEM，分选出排名前0.1%的GPC3阳性细胞，并使单个的细胞在单独的孔中生长。所述G1克隆在细胞表面上具有最高的GPC3蛋白表达。
重组人GPC3蛋白的产生
在多种哺乳细胞——包括HEK-293T、HEK-293F和CHO细胞——中制备了四种不同类型的重组GPC3。设计了兔Fc(rFc)-GPC3-his的引物以纳入侧翼的EcoRI和NotI限制性内切酶位点，以利于框内克隆至修饰的pSecTag2载体（Invitrogen,Carlsbad,CA）。构建体含有Ig-κ前导序列，其后为兔IgGFc和人GPC3胞外结构域的全长序列以及His6标签。在N端含有IL-2信号序列的pVRC载体中构建了带有His标签的人GPC3（称为GPC3-his）和两个人Fc融合克隆（GPC3-hFc和GPC3(AA)-hFc）。GPC3-hFc(AA)是通过用丙氨酸替换Ser495和Ser509产生的没有HS链的突变体。rFc-GPC3和GPC3-his的质粒分别在CHO和HEK-293T细胞中产生。GPC3-hFc和GPC3-hFc(AA)在HEK-293F细胞中制备。从培养物上清液收获蛋白质并将蛋白质用镍柱（GEHealthcare,Piscataway,NJ）纯化。GPC3-hFc和GPC3(AA)-hFc用蛋白A柱纯化。将纯化的重组GPC3蛋白使用1G12小鼠抗GPC3的抗体通过ELISA进行分析。
噬菌体抗体的选择
本研究使用的TomlinsonI和J噬菌体展示文库（GenserviceLtd.,Cambridge,UK）具有1×108多样性的大小（deWildtetal.,NatBiotechnol18(9):989-994,2000）。根据确立的方法，在Nunc免疫板（Maxisorp,ThermoFisherScientific,Rochester,NY）上对噬菌体进行三轮淘选。所述噬菌体展示文库基于VH（V3-23/DP-47和JH4b）和Vκ（O12/O2/DPK9和Jκ1）的单个人框架，有侧链多样性（NNK编码）纳入在抗原结合位点中的位置处的互补决定区（CDR）2和3中，这使得接触已知结构的抗原并且成熟形式（repertoire）高度多样化（18个不同的氨基酸）。对于三轮淘选，使用100μl的磷酸盐缓冲盐水（PBS，10mM磷酸盐/150mMNaCl，pH7.4）中100μg/ml的蛋白在4℃下用所述GPC3-his蛋白过夜包被免疫板（Maxisorb,Nunc/ThermoFisherScientific,Rochester,NY）。将所述板在室温下用PBS中3%的脱脂乳（MPBS）封闭1小时，将1012cfu的噬菌体在室温下用PBS中3%的脱脂乳预封闭1小时，然后加入到所述免疫板。在室温下孵育2小时后，用PBS/0.1%吐温-20洗涤10次并用PBS洗涤10次来除去未结合的结合噬菌体。将特异性结合的噬菌体在室温下使用120μl洗脱缓冲液（100mMHCl，用固体甘氨酸调至pH2.2并含有0.1%BSA）洗脱5分钟，进行两次。将洗脱的噬菌体合并，用200μl的1MTris（pH8.0）中和，并用于感染新鲜制备的5ml大肠杆菌TG1细胞。扩大并拯救所述噬菌体用于下一轮淘选。将从每轮淘选获得的洗脱噬菌体用于滴度测定（tittering），用于富集考虑。
噬菌体ELISA
在每轮淘选结束时将噬菌体结合表征为群体（“多克隆噬菌体ELISA”）和单个克隆（“单克隆噬菌体ELISA”）。分析了在每轮淘选结束时随机挑选的96个噬菌体克隆的GPC3结合。在4℃下用50μl/孔的1μg/ml重组GPC3过夜包被MaxiSorp96孔板。将孔用PBS洗涤3次，并在37℃下用MPBS封闭1小时。将样品（50μl/孔）用6%MPBS（等体积的MPBS）预孵育，并将所述板在室温下孵育1小时。在用PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μl的抗-M13-HRP（1:5000稀释；GEHealthcare,Piscataway,NJ），并将所述板在室温下孵育1小时。用PBS-T洗涤3次后，以50μl/孔加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺检测试剂（KPL,Gaithersburg,MD），将所述板在室温下孵育10分钟，用SpectraMaxTMPlus酶标仪（MolecularDevices,Sunnyvale,CA）在450nm下读取吸光度。
序列分析
为了分析Ig可变区，使用用于重链的引物VH-R
（CGACCCGCCACCGCCGCTG；SEQIDNO:21）和用于轻链的引物Vk-R
(CTATGCGGCCCCATTCA；SEQIDNO:22）对噬菌粒克隆进行了测序。CDR3通过在InternationalImmunogeneticsDatabase中使用IMGT/V-QUEST与人Ig基因进行比较来确定。
HS人IgG的构建
这样使用用于重链（VH）的PCR引物：将含有EcoRI的IL-8信号序列和NheI限制性内切酶位点置于两侧。将PCR产物插入表达载体pFUSE-CHIg-HG1（Invivogen,SanDiego,CA）的EcoRI和NheI位点并命名为pMH144。使用含有IL-8信号序列和AgeI限制性内切酶位点的正向引物和含有NcoI限制性内切酶位点的反向引物PCR扩增了VL区。将PCR产物插入表达载体pFUSE2-CLIg-hk（Invivogen,SanDiego,CA）中的AgeI和NcoI位点并命名为pMH145。使用LIPOFECTAMINETM2000，将所述质粒瞬时地共转染至DMEM中的HEK-293T细胞（Invitrogen,Carlsbad,CA）中并将上清液更换为FreeStyle无血清培养基（Invitrogen,Carlsbad,CA）以在纯化步骤中除去牛IgG。三天后，在离心后收集培养基，替换培养基再维持另外的3-4天并再次收集培养基。然后，处理合并的上清液并使用1mL重组蛋白AHi-Trap柱（GEHealthcare,Piscataway,NJ）纯化抗体。纯化的IgG1的质和量通过SDS-PAGE和NANODROPTM分光光度计（ThermoScientific/Nanodrop,Wilmington,DE）上的A280吸光度来确定。HS20IgG通过GPC3-his的ELISA进行分析。
蛋白质印迹测定
HS20对GPC3的反应性通过免疫印迹评估。将G1、A431和HepG2细胞的细胞裂解物加载至4-20%SDS-PAGE凝胶中进行电泳。将蛋白质转移到Hybond-PPDVF膜（GEHealthcare,Piscataway,NJ）。将所述膜用PBS-T中5%的脱脂乳在室温下封闭1小时并用PBS-T洗涤4次。封闭所述PVDF膜后，将所述膜与HS20（1μg/ml）一起在室温下孵育2小时。将所述膜用PBS-T洗涤4次，与1:5000稀释的缀合HRP的抗人IgG一起孵育2小时。使用EnhancedChemiluminescenceKit（GEHealthcare,Piscataway,NJ）使信号可视。
流式细胞术
为了确定HS20与细胞表面相关GPC3蛋白的结合，将癌细胞（G1、A431和HepG2细胞）与荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液（5%BSA，0.01%NaN3）中的HS20一起在冰上孵育1小时。结合的抗体通过在冰上与FACS缓冲液中1:200稀释的山羊抗人IgG-PE（Invitrogen,Carlsbad,CA）第二抗体孵育0.5小时来检测。使用FACSCalibur（BDBiosciences）分析细胞。
免疫组织化学
来自10名肝癌患者的福尔马林固定和石蜡包埋的组织块从武装部队病理研究所（ArmedForcesInstituteofPathology）的档案中获得。制备5-7μm厚度的连续切片并将其置于带正电的载玻片上。将切片更换三次二甲苯进行脱蜡，用浓度递减的醇和水洗涤并依照先前公开的方法（Man和Tavassoli,ApplImmunohistochem4:139-141,1996）进行抗原提取。依先前所述（Hsiaoetal.,JCancer1:93-97,2010）用HN3、HS20和同种型对照人IgG（SouthernBiotech,Birmingham,AL）进行免疫染色。缀合过氧化物酶的第二抗体、二氨基联苯胺和3-氨基-9-乙基咔唑色原体试剂盒获自VectorLaboratories（Burlingame,CA）。为了评估免疫染色的特异性，使用了不同的阴性对照，包括将所述第一抗体替换为相同同种型或所述抗体的预免疫血清，并省略所述第二抗体。另外，使用相同的方法在相同的条件下重复所述免疫染色步骤至少两次。免疫染色的切片由两位研究者独立地评估。如果在给定细胞的细胞质、膜或细胞核中一致地看到明显的免疫反应性，而所有的阴性对照没有明显的免疫染色，那么所述给定的细胞被认为是免疫反应性的。
细胞形态和迁移
细胞迁移通过伤口愈合划痕测定和培养物插件评估。将Hep3B细胞接种到24-孔板的孔中，培养至100%汇合。使用无菌P200微量加样器吸头在每个孔的细胞单层中制造伤口。然后，将所述孔用1ml的生长培养基洗涤，除去所述生长培养基并替换为0.5ml含有不同浓度IgG-20的生长培养基。在37℃下在5%CO2培养箱中孵育24小时后，检查每条划痕并拍照。在迁移测定的时间过程中，在24孔板中使用了ibidi培养物插件（AppliedBioPhysics,Troy,NY）。细胞生长到100%汇合后，除去所述培养插件并向所述板加入0.5ml的含有HS20（50μg/ml）的生长培养基。每条刮痕的第一张图像在0时通过相差显微镜在10×放大率下获得。然后，将所述24孔板在37℃、5%CO2下孵育48小时，在每个时间点检查划痕并在同一位置拍照。图像使用Tscratch程序进行分析。
统计
使用GraphPadPrism程序（Graphpadsoftware,SanDiego,CA）对结果进行统计分析。细胞迁移使用Dunnett’s和Newman-Keuls多重比较事后检验通过单因素方差分析进行分析。P值<0.05被认为是统计学显著的。
B.结果
HS20Fv的分离
为了产生针对GPC3的mAb，在哺乳动物细胞中制备了若干重组蛋白。第一，在CHO细胞中制备了兔IgGFc-GPC3融合蛋白（rFc-GPC3）。第二，在人HEK293细胞中表达了带有六个组氨酸标签的GPC3（GPC3）。第三，在HEK293细胞中产生了GPC3-huFc和GPC3(AA)-huFc两个人Fc融合蛋白。GPC3(AA)-huFc不含HS链，因为两个丝氨酸残基（Ser495和Ser509）被替换为两个丙氨酸残基。所有重组蛋白通过SDS-PAGE，以及之后使用可商购的小鼠抗GPC3mAb（克隆1G12）的蛋白质印迹和ELISA来验证（图8）。人scFv噬菌体展示文库用包被在MaxiSorp96孔板上的100μg/mL的重组GPC3进行3轮淘选来筛选。在第一轮噬菌体淘选之后，获得了约4000个单个的噬菌体克隆。使用结合的噬菌体的多克隆ELISA来监测每轮淘选步骤后高结合物的富集（图9A）。噬菌体的逐渐富集说明，在初始文库I和J中存在少量的高亲和力结合物并且其在淘选过程中逐渐富集。在第三轮结束时，随机挑选的克隆中多于50%为GPC3结合物（图9B）。选择克隆20（称为HS20）用于进一步表征，因为它以强信号结合所有的重组GPC3蛋白。
HS20的序列分析示出了重（H）链和轻（L）链CDR尤其是HCDR2、HCDR3以及LCDR3和LCDR3中的体细胞突变。这可能表明，用于抗原结合的关键残基大部分位于重链和轻链的CDR2和CDR3中。因为所述Fv分离自合成文库（deWildtetal.,NatBiotechnol18(9):989-994,2000），所以在所述CDR外的框架区没有发现体细胞突变。
在搜索了所有已知的公开数据库之后，确认了HS20具有独特的Fv序列。所述VH序列最接近于具有已知的特异性的两个已知VH序列：ABQ50854.1（B组链球菌III型多糖的肽模拟表位）和ADP21081.1（犬树突状细胞）。所述VL序列最接近于ABD59019.1（TREM样转录物1）和ABQ50855.1（B组链球菌III型多糖的肽模拟表位）。HS20的Fv与已知可结合链球菌上的多糖的Fv同源性最高，这表明HS20表位与碳水化合物位点相关。
HS20对癌细胞的结合特性
为了表征HS20的结合特性，HS20Fv被转变成人IgG。人IgG分子通过将所述VH与重链γ1的恒定区融合并将所述VL与人κ链的恒定区融合来构建。最终的人IgG分子为IgGγ1κ。使用所述HS20IgG通过蛋白质印迹探测了A431（GPC3-）、G1（GPC3+）和一组人HCC细胞系（HepG2、Huh-1、Huh-4和Huh-7）的细胞裂解物（图11A）。G1是细胞表面上高表达GPC3的A431稳定细胞系。HS20以比结合A431更强的信号结合G1。被HS20识别的G1中的带形成了大的弥散，这表明糖基化模式可能有不均一性。还在HepG2、Hep3B和Huh-4上检测到HS20的结合，而在Huh-1和Huh-7上检测不到。为了确定HS20是否结合细胞表面相关的GPC3，进行了流式细胞计数分析（图10B）。HS20以强信号结合G1和HepG2细胞系。HS20在A431细胞上具有相对弱的信号，这表明所述结合信号与细胞表面上GPC3蛋白表达相关。
为了进一步分析HCC组织上结合的HS20，对肿瘤样本进行了免疫组织化学（图12）。HS20在HCC细胞的质膜上具有强且高特异性的免疫染色，而在GPC3阴性细胞例如基质细胞上没有染色。
HS20以亚纳摩尔亲和力结合GPC3上HS位点
为了揭示GPC3上HS20的结合位点，使用重组GPC3-hFc和突变型GPC3(AA)-hFc进行了ELISA（图13A）。对照GPC3mAb（1G12）结合所有重组GPC3蛋白，这与1G12结合GPC3的C端核心蛋白这一事实一致（Capurroetal.,Gastroenterology125:89-97,2003）。HS20结合GPC3-hFc而不结合突变型GPC3(AA)-hFc，这表明HS20结合GPC3上的HS位点。还将重组GPC3蛋白上的HS20结合与HS分子上的结合进行了比较。HS20结合连接到GPC3的HS的强度是结合单独HS的至少1000倍。该结果表明，HS20结合HS并且GPC3的核心蛋白可增强这种结合。基于ELISA结果（图13B），估计HS20对GPC3的结合亲和力（平衡KD）为0.75nM。所述数据集显示出强的相关性(R2=0.997）。
还确定了HS的结合是构象依赖性的。在使用细胞裂解物的蛋白质印迹中，HS20人抗体不结合变性的GPC3；然而，可用HS20将来自G1细胞的内源GPC3蛋白沉淀（图13C）。在Hep3B细胞、天然HCC细胞系中也观察到了类似的结果。已发现，从GPC3敲低的Hep3B细胞中没有明显的GPC3蛋白可被沉淀（图13C，右图）。
硫酸类肝素属于糖胺聚糖家族，并且具有与肝素高度密切相关的结构。它们都具有硫酸化的重复二糖单元。然而，最近的研究显示硫酸类肝素的结构与肝素大不相同。为了评估HS20的结合特性，进行了竞争ELISA实验。将HS20与硫酸类肝素（HS）或肝素预孵育，发现仅HS能够阻断HS20-GPC3结合（图13D）。总之，认为HS20人抗体(i)主要结合GPC3上的HS链;(ii)过量的肝素分子或肝素酶的酶消化不能消除所述HS20mAb对GPC3的结合，和(iii)GPC3的核心蛋白可能在支持或稳定被所述HS20mAb识别的不同构象中起作用。
HS20通过妨碍GPC3与Wnt3a相互作用来抑制HCC细胞迁移
为了确定HS20是否可中和GPC3的功能，将HCC细胞用所述HS20mAb处理并在细胞增殖和细胞迁移测定中测试所述HS20mAb。所述HS20人mAb在体外不抑制HCC细胞增殖。然而，在HS20处理后，HCC细胞的细胞迁移能力显著降低。伤口愈合测定表明了Hep3B细胞和Huh-4细胞都显示出更慢的迁移，尤其是在HS20处理后48小时（图14A）。然而，GPC3阴性细胞系SK-hep1的迁移能力没有改变。所述抑制表现出剂量依赖的方式（图14B左图）并且用50μg/ml的HS20在6小时后出现显著的抑制。与对照组相比，HS20处理的细胞的伤口愈合效率降低达多于30%（图4B右图）。
Wnt信号转导已经被提出在HCC进展中起重要作用。先前的研究显示Wnt3a可能参与HCC发病机制。GPC3可能充当Wnt配体的储存位置（storagesite）并使所述Wnt配体可接触其受体Frizzle。用所述HS20人mAb处理Hep3B细胞，然后检查GPC3与Wnt3a的相互作用。HS20阻断了Wnt3a与GPC3的相互作用（图4C），这表明HS20可能通过妨碍GPC3与Wnt3a的相互作用而阻断Wnt信号转导。为了进一步评估Wnt信号转导的下游效应，通过RT-PCR评估了Wnt靶向基因。许多与细胞转移或迁移相关的基因表达下降，而与细胞生长相关的那些没有显著改变。注意到，在HS20处理后，在mRNA水平和蛋白质水平β-连环蛋白表达都下降（图4D和4E）。总之，这些数据表明HS20与GPC3的结合可抑制Wnt信号转导，导致β-连环蛋白降解并最终抑制HCC细胞迁移。
C.讨论
对治疗有抗性的转移是癌症的主要死因。尽管有近200年的研究，但是肿瘤转移的过程仍然不清楚。StephenPaget最初提出了“种子和土壤”假说，其已被大量的实验报道支持（Paget,Lancet133:571-573,1889；Talmadge和Fidler,CancerRes70(14):5649-5669,2010）。最近的研究提供的证据显示，硫酸类肝素在调节黑色素瘤（Balijinnyametal.,AmJPhysiolCellPhysiol297(4):C802-C813,2009）和乳癌（Khuranaetal.,CancerRes71(6):2152-2161,2011）中的细胞迁移中起重要作用。在本研究中，开发了对GPC3上HS位点特异的人mAb并发现该抗体可抑制HCC细胞迁移。
在伤口愈合和癌症转移中，细胞运动在病理上是重要的。为了使这些过程发生，必须降解细胞外基质（ECM）以允许细胞自由运动（Kimetal.,JEndocrinol209(2):139-151,2011）。这些过程伴随有蛋白酶和降解HS的类肝素酶。本公开证明了靶向GPC3上HS链的药物——一种癌症特异性的HSPG——可抑制癌细胞迁移。
实施例3：为除去N-糖基化位点对HS20进行的突变不改变亲和力和特异性
本实施例描述了为除去所述VL结构域中鉴定的N-糖基化位点对所述H220mAb进行的修饰。
在基于HEK-293的哺乳动物表达系统中表达的HS20IgG中观察到两条轻链带，这表明存在N-糖基化位点。通过分析所述轻链的序列，在HS20的VL结构域的CDR2中鉴定了可能的N-糖基化位点（SEQIDNO:16中的氨基酸残基50）。当通过SDS-PAGE进行分析时，N-糖基化位点的存在产生了约30kDa的额外的带；然而，当用内切糖苷酶PNG酶处理纯化的HS20IgG以除去所有的N-糖基化时，观察到了单条带（图15A）。用PNG酶处理的H2S0mAb的蛋白质印迹也证明了单条VL带，而未处理的抗体产生了VL结构域的两条带（图15B）。
为了除去所述N-糖基化位点，将所述VL结构域的CDR2中的天冬氨酸（N）残基改变为丙氨酸（A）残基（图15C）。HS20的修饰形式被称为“HS20Mt”。突变形式的HS20展现出的对GPC3上硫酸类肝素链的结合特异性或亲和力没有改变（图16A-16C）。
修饰的HS20VL结构域的核苷酸和氨基酸序列分别以SEQIDNO:28和29列于序列表中。
实施例4：HS20在体内抑制HCC肿瘤生长
为了作为治疗抗体候选物评估所述HS20人抗体，在裸鼠中建立HCC异种移植模型并测试所述HS20人抗体的抗肿瘤活性。在本实施例中描述的研究使用了没有N-糖基化位点的突变形式的HS20（SEQIDNO:28-31）。将HepG2细胞在皮下接种到裸鼠中。如图17A所示，所述HS20抗体显著地抑制肿瘤生长。使用异种移植肿瘤组织时，显示HS20处理后GPC3与Wnt3a的相互作用显著降低。处理小鼠持续三周后，所述相互作用被阻断70%，持续四周的处理甚至阻断更多（图17B）。还通过RT-PCR检测了Wnt信号转导的下游基因。与细胞迁移和转移相关的若干基因，如Nr-CAM、Connexin30、MMP2和MPP26显著减少。然而，参与细胞增殖的那些基因没有改变（图17C）。这些数据与使用体外细胞模型的发现一致，表明了所述HS20人抗体能够通过阻断GPC3与Wnt3a的相互作用经由Wnt信号转导抑制HCC肿瘤生长。
实施例5：HN3人抗体可在体内抑制HCC肿瘤生长
为了研究所述HN3人抗体是否可用作癌症治疗候选物，在小鼠中研究了HN3的体内效力。将Huh7细胞在皮下接种至裸鼠中。在肿瘤大小达到约100mm3后，通过一周两次以60mg/kg的剂量静脉内注射HN3来处理所述小鼠。测量肿瘤大小并与对照组比较。HN3处理显著抑制小鼠中的HCC肿瘤生长（图18A）。
为了确认yap信号转导是否也在体内在HN3处理的HCC肿瘤中起作用，比较了小鼠的经HN3处理和未处理的HCC肿瘤中的yap信号转导改变（图18B）。由于HN3处理的肿瘤中磷酸化的yap增加，yap失活。与体外数据一致，yap靶基因，细胞周期蛋白D1的蛋白表达也降低。这些结果进一步支持了如下观点：yap信号转导可介导所述HN3人mAb对HCC细胞增殖的抑制。
实施例6：靶向肝细胞癌中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的重组免疫毒素
本实施例描述了靶向HCC细胞上GPC3的抗体毒素融合蛋白的产生。HN3的重链可变区（VH）与PE38相连，PE38为修改形式的假单胞菌外毒素。
HN3(VH)-PE38免疫毒素的产生
为了研究HN3作为新的抗体治疗剂用于癌症治疗的潜力，HN3VH结构域被转换为抗-GPC3的免疫毒素。如图19所示，将HN3VH与截短形式的假单胞菌外毒素——PE38（SEQIDNO:27）融合。
所述HN3免疫毒素通过将单结构域（VH）HN3抗体的核苷酸序列和假单胞菌外毒素38（PE38）的核苷酸序列克隆至pRB98载体中来制备。包括HN3的所述免疫毒素部分、载体序列（下划线）和PE38的N端部分的核苷酸和氨基酸序列示于下文。
HN3-PE38DNA序列（SEQIDNO:28）
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTTATTTCGATTTCGATTCTTATGAAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGCCTAGAGTGGATTGGGAGTATCTATCATAGTGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACACCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAGAGTAAATATGGACCGATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAAGTGCGGCCAAAGCTTCCGGAGGTCCCGAGGGCGGCAGCCTGGCCGCGCTGACCGCGCACCAGGCTTGCCACCTGCCGCTGGAGACTTTCACCCGTCATCGCCAGCCGCGCGGCTGGGAACAACTGGAGCAGTGCGGCTATCCGGTGCAGCGGCTGGTCGCCCTCTACCTGGCGGCGCGGCTGTCGTGGAACCAGGTCGACCAGGTGATCCGCAACGCCCTGGCCAGCCCCGGCAGCGGCGGCGACCTGGGCGAAGCGATCCGCGAGCAGCCGGAGCAAGCCCGTCTGGCCCTGACCCTGGCCGCCGCCGAGAGCGAGCGCTTCGTCCGCCAGGGCACCGGCAACGACGAGGCCGGCGCGGCCAACGGCCCGGCGGACAGCGGCGACGCC
核苷酸1-351=HN3DNA序列
核苷酸352-378（下划线）=载体序列
核苷酸379-738=部分PE38序列
HN3-PE38蛋白质序列（SEQIDNO:29）
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASYTDTDSYEMSWVRQAPGKGLEWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTATYYCARVNMDRFDYWGQGTLVTVSSSAAKASGGPEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPKGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSCGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADSGDAP
残基1-117=HN3序列
残基118-126（下划线）=源自所述载体序列
残基127-246=部分PE38序列
所述免疫毒素的纯度大于90%，并且通过SDS-PAGE确认了正确的分子量（53kDa）。所述免疫毒素在大肠杆菌（Escherichiacoli）中表达，在体外重折叠，并被纯化至约95%的纯度，有＞15%的高产率。为了评估所述免疫毒素的可能的聚集，在TSK体积排阻柱上将所纯化的蛋白过柱（图19B）。发现了清晰的峰，这表明所纯化的HN3(VH)-PE38分子作为单体被正确折叠。
HN3(VH)-PE38免疫毒素对HCC细胞系的细胞毒性
为了评估HN3(VH)-PE38免疫毒素对表达GPC3的癌细胞的细胞杀伤，通过WST测定在一组六个HCC细胞系（Hep3B、Huh-1、HepG2、Huh-4、Huh-7和SK-Hep-1）上检查对细胞增殖的抑制（图20和表4）。所述HN3(VH)-PE38免疫毒素具有针对被迫表达GPC3的G1细胞系的非常高且特异性的细胞毒活性（IC50=0.01ng/ml或0.2pM），但是对于不表达GPC3的人A431上皮癌细胞系没有活性。在Hep3B和Huh-1中，这三个HCC细胞系细胞表面上GPC3表达最高（>104个位点/细胞），HN3(VH)-PE38对于Hep3B（3.5×104个位点/细胞，IC50为0.02ng/mL或0.4pM）、Huh-1（1×104个位点/细胞，IC50为0.06ng/ml或1.2pM）和Huh-7（1.2×104个位点/细胞，IC50为64ng/mL或1.3nM）都是高活性的。在具有低GPC3表达（2.5×103个位点/细胞）的HepG2细胞系中，观察到了更低却显著的细胞毒活性（IC50=549ng/mL或10nM）。所述HN3(VH)-PE38不能杀死Huh-4和SK-Hep-1细胞系，因为数据（流式细胞术、RT-PCR和蛋白质印迹）显示这两个细胞系不表达GPC3。最近的研究表明，SK-HEP-1不是HCC细胞系，因为其不具有肝细胞的特性并且是内皮来源的。HN3(VH)-PE38的细胞毒活性类似于或好于就治疗其他人癌症例如间皮瘤、胰癌和B细胞白血病而正在临床试验中被评估的免疫毒素SS1P和BL22。BL22——靶向表达CD22的白血病的对照免疫毒素——对所测试的所有HCC细胞系都没有细胞毒性。
表4.HCC细胞系中HN3(VH)-PE38免疫毒素的细胞毒性和GPC3表达
*阴性还通过RT-PCR和蛋白质印迹确认
细胞毒性通过细胞增殖测定（WST-8）测量。简言之，在所述测定前12小时，在96孔板中以5×104/孔接种细胞。向所述板加入免疫毒素，将所述细胞在37℃下孵育48-72小时，用WST-8测量所述细胞活力。每个测定以三次重复完成。IC50（以ng/ml表示的平均值）是与未用所述毒素处理的细胞相比使细胞活力减少达50%的毒素浓度。结果表示为三次重复测量的平均数±SD（标准差），并且测定重复两或三次。使用抗GPC3的小鼠单克隆抗体和BDQuantibritePE珠通过流式细胞术测量每个细胞GPC3位点的数目。
静脉内HN3(VH)-PE38免疫毒素可抑制肿瘤生长
为了探究HN3(VH)-PE38作为可能的癌症治疗剂，检查了所述抗GPC3的免疫毒素是否在小鼠的肿瘤异种移植物中导致肿瘤生长抑制。将G1细胞系用作细胞模型以在裸鼠中建立肿瘤异种移植模型（图21）。G1细胞系中GPC3位点的数目与内源性表达GPC3的HCC细胞相当，在小鼠中它们的植入一致地导致了侵袭性的肿瘤生长。当在第7天肿瘤达到100mm3的平均体积时，每隔一日给予小鼠0.4mg/kg的HN3(VH)-PE38，持续一周。从第12天起（在三次注射免疫毒素后），给予HN3(VH)-PE38明显地抑制了小鼠中肿瘤的生长。因此，HN3(VH)-PE38作为单个试剂在体内展现出了对表达GPC3的肿瘤异种移植物的强的抗肿瘤活性。
总之，这些结果显示，已经成功地产生了靶向HCC中细胞表面相关GPC3蛋白的免疫毒素。HN3(VH)-PE38免疫毒素对于表达GPC3的HCC细胞系是细胞毒性的，而对于靶位阴性的细胞则不是细胞毒性的。此外，所述免疫毒素在裸鼠中展现出对皮下植入的表达GPC3的肿瘤异种移植物的显著的肿瘤生长抑制，这表明所述新免疫毒素有潜力作为治疗候选物用于肝癌治疗。
实施例7：GPC3特异性单克隆抗体用于检测受试者中的癌症或确认受试者的癌症的诊断
本实施例描述了可结合GPC3或GPC3上HS链的人单克隆抗体用于检测受试者中的癌症的用途。本实施例还描述了这些抗体用于确认受试者的癌症的诊断的用途。
样品（例如活组织检查）获自被诊断患有或怀疑患有GPC3阳性癌症（即，表达或过表达GPC3的癌症，例如HCC、黑色素瘤、肺癌或卵巢癌）的患者。取自未患癌症患者的样品可用作对照。进行免疫组织化学（IHC）以检测所述样品中表达GPC3的细胞的存在。IHC在本领域是熟知的。例如，可使用缀合荧光标记物的GPC3特异性抗体直接检测GPC3。相对于对照样品，所述患者样品的荧光强度增加，则检出所述样品中表达GPC3的细胞的存在。在所述样品中检测到GPC3阳性细胞表明所述患者患有GPC3阳性癌症或确认所述受试者的癌症的诊断。
实施例8：GPC3特异性单克隆抗体用于治疗癌症
本实施例描述了GPC3特异性人单克隆抗体用于治疗表达或过表达GPC3的癌症例如HCC、黑色素瘤、肺癌或卵巢癌的用途。可根据本领域的标准方法治疗被诊断患有GPC3阳性癌症的患者。
在本实施例中，给予被诊断患有GPC3阳性癌症的患者包含被连接至假单胞菌外毒素（PE）的GPC3特异性人单克隆抗体的免疫缀合物。PE免疫缀合物的制备描述于实施例6，并且先前在本领域已被描述过（参见，例如，美国专利No.7,081,518和美国专利申请公开No.2005/0214304）。在一些患者中，通过静脉快速注射每隔一日给予所述免疫缀合物，共三至六个剂量。在其他患者中，通过在十天的时间内连续静脉输注给予所述免疫缀合物。给予患者的免疫缀合物的剂量根据所述患者的体重和性别以及给药的方式和时间而有所不同。治疗后，评估患者的癌进展（包括肿瘤生长和转移）和疾病的其他临床征象。
鉴于所公开的发明的原理可以应用于许多可能的实施方案，应当认识到，所示出的实施方案只是本发明的优选实例，其不应当被认为是对本发明范围的限制。而是，本发明的范围由以下的权利要求书确定。所以，申请人要求落入这些权利要求的范围和主旨内的所有发明。

Claims (49)

1.一种结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含CDR1，SEQIDNO:2的氨基酸残基26-33；CDR2，SEQIDNO:2的氨基酸残基51-57；和CDR3，SEQIDNO:2的氨基酸残基96-105。
2.权利要求1的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。
3.一种结合GPC3上硫酸类肝素(HS)的分离的人单克隆抗体，其中：
(i)所述抗体的重链包含CDR1，SEQIDNO:14的氨基酸残基26-33；CDR2，SEQIDNO:14的氨基酸残基51-58；和CDR3，SEQIDNO:14的氨基酸残基97-105；和
(ii)所述抗体的轻链包含CDR1，SEQIDNO:16或SEQIDNO:31的氨基酸残基27-32；CDR2，SEQIDNO:16或SEQIDNO:31的氨基酸残基50-52；和CDR3，SEQIDNO:16或SEQIDNO:31的氨基酸残基89-97。
4.权利要求3的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQIDNO:14的氨基酸残基26-33、51-58和97-105，所述抗体的轻链包含SEQIDNO:16的氨基酸残基27-32、50-52和89-97。
5.权利要求3的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQIDNO:14的氨基酸残基26-33、51-58和97-105，所述抗体的轻链包含SEQIDNO:31的氨基酸残基27-32、50-52和89-97。
6.权利要求3-5任一项的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQIDNO:14的氨基酸序列。
7.权利要求3-5任一项的人单克隆抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQIDNO:16或SEQIDNO:31的氨基酸序列。
8.权利要求3-5任一项的人单克隆抗体，其中所述抗体为VH单结构域抗体、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、单链可变区片段(scFv)或二硫化物稳定的可变区片段(dsFv)。
9.权利要求8的人单克隆抗体，其中所述抗体为VH单结构域抗体。
10.权利要求8的人单克隆抗体，其中所述抗体为scFv。
11.权利要求1-5任一项的人单克隆抗体，其中所述抗体为IgG。
12.权利要求1-5任一项的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体被标记。
13.权利要求12的分离的人单克隆抗体，其中所述标记为荧光标记、酶标记或放射性标记。
14.一种组合物，其包含可药用载体中的治疗有效量的权利要求1-13任一项的抗体。
15.一种分离的免疫缀合物，其包含权利要求1-13任一项的人单克隆抗体和效应分子。
16.权利要求15的分离的免疫缀合物，其中所述效应分子为毒素。
17.权利要求16的分离的免疫缀合物，其中所述毒素为假单胞菌(Pseudomonas)外毒素或其变体。
18.权利要求17的分离的免疫缀合物，其中所述毒素为包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的PE38。
19.权利要求16-18任一项的分离的免疫缀合物，其中所述人单克隆抗体为包含SEQIDNO:2的氨基酸残基26-33、51-57和96-105的VH单结构域抗体。
20.权利要求19的分离的免疫缀合物，包含SEQIDNO:29的氨基酸序列。
21.权利要求15的分离的免疫缀合物，其中所述效应分子为可检测标记。
22.一种组合物，其包含可药用载体中的治疗有效量的权利要求15-21任一项的分离的免疫缀合物。
23.权利要求14或权利要求22的组合物用于制备用于治疗患有表达GPC3的癌症的受试者的药物的用途。
24.权利要求14或权利要求22的组合物用于制备用于抑制患有表达GPC3的癌症的受试者的肿瘤生长或转移的药物的用途。
25.权利要求1-13任一项的人单克隆抗体用于制备用于确定受试者是否患有癌症的试剂的用途。
26.权利要求1-13任一项的人单克隆抗体用于制备用于确认受试者的癌症的诊断的试剂的用途。
27.权利要求25或权利要求26的用途，其中所述人单克隆抗体被直接标记。
28.权利要求25或26的用途，其中所述癌症为肝细胞癌(HCC)、黑色素瘤、肺癌或卵巢癌。
29.权利要求28的用途，其中所述癌症为HCC。
30.一种编码权利要求1-13任一项的人单克隆抗体的分离的核酸分子。
31.权利要求30的分离的核酸分子，其中编码所述人单克隆抗体的重链的核苷酸序列包含SEQIDNO:1。
32.权利要求30的分离的核酸分子，其中：
(i)编码所述人单克隆抗体的重链的核苷酸序列包含SEQIDNO:13；
(ii)编码所述人单克隆抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQIDNO:15或SEQIDNO:30；或
(iii)(i)和(ii)。
33.权利要求32的分离的核酸分子，其中所述人单克隆抗体的重链包含SEQIDNO:13，所述人单克隆抗体的轻链包含SEQIDNO:30。
34.权利要求30-33任一项的分离的核酸分子，与启动子可操作地连接。
35.一种表达载体，其包含权利要求30-34任一项的分离的核酸分子。
36.一种分离的宿主细胞，其转化有权利要求30-35任一项的核酸分子或表达载体。
37.权利要求1-13任一项的抗体用于制备用于治疗患有表达GPC3的癌症的受试者的药物的用途。
38.权利要求1-13任一项的抗体用于制备用于抑制表达GPC3的癌症的生长或转移的药物的用途。
39.权利要求37或权利要求38的用途，其中所述癌症为HCC。
40.一种结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含CDR1，SEQIDNO:2的氨基酸残基31-35；CDR2，SEQIDNO:2的氨基酸残基50-65；和CDR3，SEQIDNO:2的氨基酸残基96-105。
41.一种结合GPC3上硫酸类肝素(HS)的分离的人单克隆抗体，其中：
(i)所述抗体的重链包含CDR1，SEQIDNO:14的氨基酸残基31-35；CDR2，SEQIDNO:14的氨基酸残基50-66；和CDR3，SEQIDNO:14的氨基酸残基97-105；和
(ii)所述抗体的轻链包含CDR1，SEQIDNO:16或SEQIDNO:30的氨基酸残基24-34；CDR2，SEQIDNO:16或SEQIDNO:30的氨基酸残基50-56；和CDR3，SEQIDNO:16或SEQIDNO:30的氨基酸残基89-97。
42.一种分离的免疫缀合物，其包含权利要求40或权利要求41的人单克隆抗体和效应分子。
43.权利要求42的分离的免疫缀合物，其中所述效应分子为毒素。
44.权利要求43的分离的免疫缀合物，其中所述毒素为假单胞菌外毒素或其变体。
45.权利要求44的分离的免疫缀合物，其中所述毒素为包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的PE38。
46.权利要求43-45任一项的分离的免疫缀合物，其中所述人单克隆抗体为包含SEQIDNO:2的氨基酸残基31-35、50-65和96-105的VH单结构域抗体。
47.权利要求46的分离的免疫缀合物，其包含SEQIDNO:29的氨基酸序列。
48.权利要求42的分离的免疫缀合物，其中所述效应分子为可检测标记。
49.一种组合物，其包含可药用载体中的治疗有效量的权利要求42-48任一项的分离的免疫缀合物。
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