KR20110117224A - 간염 ｂ 바이러스의 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브 및 프라이머 - Google Patents

간염 ｂ 바이러스의 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브 및 프라이머 Download PDF

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찬드라섹하르 바스카란 네어
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Abstract

본 발명의 설명은 간염 B 바이러스(Hepatitis B Virus)의 검출 및 수량화의 방법을 제공한다. 간염 B 바이러스의 검출을 위한 SEQ ID Nos. 1 및 2로 시작하는 올리고뉴클레오티드 프로브(oligonucleotide probes)와 SEQ ID Nos. 3, 4, 5 및 6으로 시작하는 각각의 프라이머[센스 및 안티센스(sense and antisense)]가 기재되어 있다. 또한, 간염 B 바이러스의 검출을 위한 PCR 반응 혼합물(PCR reaction mixture) 및 지시 패키지(instruction package)와 함께 상기 혼합물을 포함하는 HBV의 검출용 키트(kit)를 제공한다.

Description

간염 Ｂ 바이러스의 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브 및 프라이머{OLIGONUCLEOTIDE PROBES AND PRIMERS FOR DETECTION OF HEPATITIS B VIRUS}
본 발명은 시료에서 HBV(간염 B 바이러스) 핵산(nucleic acids)의 존재 및 수량화(quantification)를 측정하는 방법에 관한 것이다.
HBV는 급성 및 만성 간염(B형 간염), 일부 경우에 간경변증(cirrhosis) 및 암종(carcinoma)을 야기한다. 최근 연구에서 전세계에서 간염 B 바이러스(HBV)에 감염된 사람의 수가 약 3억명에 달하는 것이 밝혀졌다.
감염된 피험자(infected subject)의 혈액/혈청(blood/serum)에서 HBV 핵산의 직접적인 검출을 위한 PCR계 분석은 감염의 정확한 단계를 알기 위해 의사에게 유용한, 감염된 환자의 정확한 바이러스의 양(viral load)를 측정하는데 이점을 제공할 수 있다. 이것은 환자에게 적합한 요법을 제공하기 위해 의사에게 도움을 줄 수 있다. 또한, 정확한 바이러스 양의 수량화는 항바이러스성 요법(anti-viral therapy)의 진행을 모니터링하는 것에 도움을 줄 수 있다. HBV의 진단을 위해 현재 사용되고 있는 방법은 HbeAg, HbsAg, 또는 항-HBc IgM, 항-HBe, 항-HBs, 또는 항-HBc IgGs와 같은 혈청 마커(serum markers)의 존재에 근거하는, ELISA(Enzyme Linked immune sorbent assay)에 근거한다. ELISA계 방법(ELISA based methods)이 정확한 바이러스의 양을 간파하지 못하기 때문에, 바이러스의 양의 수량적 측정을 제공할 수 있는 방법을 찾을 필요가 있다. 검출의 공지 방법과 연관된 상기 문제를 고려한 효과적인 방법이 필요하여, 이는 바이러스의 양을 질적 및 양적 측정을 제공할 수 있는, HBV의 검출에 사용될 수 있다.
본 발명의 제1 목적은 시료에서 HBV 핵산(nucleic acids)의 존재를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제2 목적은 HBV의 검출을 위한 프로브 및 프라이머(probes and primers)를 제공하는 것이다.
본 발명의 제3 목적은 HBV의 검출을 위한 PCR 반응 혼합물(PCR reaction mixture)을 제공하는 것이다.
본 발명의 제4 목적은 HBV의 검출을 위한 프로브 및 프라이머를 포함하는 키트(kit)를 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명의 설명은 SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 2의 올리고뉴클레오티드 프로브(oligonucleotide probes); SEQ ID Nos. 3, 4, 5 및 6의 프라이머; 간염 B 바이러스의 검출을 위한 PCR 반응 혼합물(PCR reaction mixture)에 관한 것이고, 상기 혼합물은 핵산 증폭 시약(nucleic acid amplification reagents), SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No.2로 시작하는 듀얼 라벨 프로브(dual labeled probes), SEQ ID Nos. 3, 4, 5, 6의 프라이머 및 테스트 시료를 포함하고; 간염 B 바이러스를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 핵산 증폭 시약, SEQ ID No. 1 또는 SEQ ID No.2의 올리고뉴클레오티드 프로브와 SEQ ID Nos. 3 및 4 또는 SEQ ID Nos. 5 및 6에 각각 대응하는 프라이머, 테스트 시료를 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계(said method comprising steps of: forming a reaction mixture comprising nucleic acid amplification reagents, oligonucleotide probe of SEQ ID No. 1 or SEQ ID No.2 with corresponding primers of SEQ ID Nos. 3 and 4 or SEQ ID Nos. 5 and 6 respectively, a test sample); 및 상기 반응 혼합물에 PCR을 행하여, 표적 시퀀스(target sequence)의 복제물(copies)을 얻은 후, 간염 B 바이러스의 검출을 위한 형광 신호(fluorescence signal)의 증가를 측정하는 단계를 포함하는 간염 B 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이고; 간염 B 바이러스의 검출용 키트로서, 상기 키트는 SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 2의 듀얼 라벨 프로브를 각각 또는 조합하여 포함하고; SEQ ID Nos.3, 4, 및 5, 6의 프라이머의 대응하는 짝(corresponding pair of primers of SEQ ID Nos.3, 4, and 5, 6)을 각각 또는 조합하여 포함하고, 증폭 시약을 포함하는 간염 B 바이러스의 검출용 키트에 관한 것이다.
도 1은 시판 키트를 사용하는 HBV 포지티브 시료(HBV positive samples)의 실시간 플롯(Real time plot)이다.
도 2는 SEQ ID No. 1을 사용하는 HBV 포지티브 시료의 실시간 플롯이다.
도 3은 SEQ ID No. 2를 사용하는 HBV 포지티브 시료의 실시간 플롯이다.
도 4는 SEQ ID No. 1을 사용하는 HBV 네거티브 시료의 실시간 플롯이다.
도 5는 SEQ ID No. 2를 사용하는 HBV 네거티브 시료의 실시간 플롯이다.
도 6은 HBV-표준 곡선이다.
본 발명의 설명은 SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 2의 올리고뉴클레오티드 프로브(oligonucleotide probes)에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 프로브는 듀얼 라벨 프로브(dual labeled probes)이다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 프로브는 간염 B 바이러스(Hepatitis B Virus)를 검출한다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 프로브는 5' 말단에 형광단(fluorophore), 내부 영역 또는 3' 말단에 퀀처(quencher)를 갖는 검출가능한 라벨과 콘쥬게이트(conjugated)된다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 SEQ ID No. 1은 간염 B 바이러스의 표면 유전자(surface gene)에 지정되어 있고, SEQ ID No. 2는 간염 B 바이러스의 X-유전자 영역(X-gene region)에 지정되어 있다.
본 발명은 SEQ ID Nos. 3, 4, 5 및 6의 프라이머에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, SEQ ID No.3 및 SEQ ID No.5의 프라이머는 센스(sense)이고, SEQ ID No.4 및 SEQ ID No.6은 각각 안티센스 프라이머(anti sense primer)이다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 SEQ ID No.3 및 SEQ ID No.4의 프라이머는 SEQ ID No. 1의 듀얼 라벨 프로브(dual labeled probe) 및 SEQ ID No.5의 프라이머(primer)이고, SEQ ID No.6은 SEQ ID No. 2의 듀얼 라벨 프로브이다.
본 발명은 간염 B 바이러스의 검출을 위한 PCR 반응 혼합물(PCR reaction mixture)에 관한 것으로, 상기 혼합물은 핵산 증폭 시약(nucleic acid amplification reagents), SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No.2로 시작하는 듀얼 라벨 프로브(dual labeled probes), SEQ ID Nos. 3, 4, 5, 6의 프라이머 및 테스트 시료를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈청 및 플라즈마(blood, serum and plasma)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 PCR은 실시간 PCR이다.
본 발명은 간염 B 바이러스의 검출방법으로서, 상기 방법은
(a) 핵산 증폭 시약, SEQ ID No. 1 또는 SEQ ID No.2의 올리고뉴클레오티드 프로브와 SEQ ID Nos. 3 및 4 또는 SEQ ID Nos. 5 및 6에 각각 대응하는 프라이머, 테스트 시료를 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계(forming a reaction mixture comprising nucleic acid amplification reagents, oligonucleotide probe of SEQ ID No. 1 or SEQ ID No.2 with corresponding primers of SEQ ID Nos. 3 and 4 or SEQ ID Nos. 5 and 6 respectively, a test sample); 및
(b) 상기 반응 혼합물에 PCR을 행하여, 표적 시퀀스(target sequence)의 복제물(copies)을 얻은 후, 간염 B 바이러스의 검출을 위한 형광 신호의 증가를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 프로브는 5' 말단에 형광단(fluorophore), 내부 영역 또는 3' 말단에 퀀처(quencher)를 갖는 검출가능한 라벨과 콘쥬게이트(conjugated)된다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 SEQ ID No.3 및 SEQ ID No.5의 프라이머는 센스이고, SEQ ID No.4 및 SEQ ID No.6은 각각 안티센스 프라이머(anti sense primer)이다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 테스트 시료는 혈액, 혈청 및 플라즈마를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 증폭 시약은 마그네슘 클로라이드(magnesium chloride), Taq 중합효소(Taq polymerase) 및 증폭용 완충제(buffer)를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 검출은 사실상 질적(qualitative) 또는 양적(quantitative)이다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 형광단은 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 유도체(fluorescein derivatives) FAM, VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산, 쿠마린(coumarin) 및 쿠마린 유도체, 루시퍼 옐로우(lucifer yellow), 텍사스 레드(texas red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 6-카르복시 플루오레세인(6-Carboxy Fluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluoroscein), 5-카르복시로다민(5-carboxyrhodamine) 및 시아닌 염료(cyanine dyes)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 퀀처는 테트라메틸로다민(Tetra Methyl Rhodamine)[TAMRA], 4'-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조산(4'-(4-dimethylaminophenylazo)benzoic acid), 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-말레이미드(4-dimethylaminophenylazophenyl-4'-maleimide), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 카르복시테트라메틸로다민(carboxytetramethylrhodamine) 및 BHQ 염료(BHQ dyes)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 형광단은 5' 말단에 6-카르복시 플루오레세인(6-Carboxy Fluorescein)이 바람직하고, 상기 퀀처(quencher)는 3' 말단에 테트라 메틸 로다민(tetra methyl rhodamine), 또는 내부 영역 또는 3' 말단에 블랙홀 퀀처 1(Black hole quencher 1)[BHQ1]이 바람직하다.
본 발명은 간염 B 바이러스의 검출용 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 2의 듀얼 라벨 프로브(dual labeled probes)를 각각 또는 조합하여 포함하고; SEQ ID Nos.3, 4, 및 5, 6의 프라이머의 대응하는 짝 및 증폭 시약을 각각 또는 조합하여 포함한다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 증폭 시약은 마그네슘 클로라이드(magnesium chloride), Taq 중합효소(Taq polymerase) 및 증폭용 완충제(buffer)를 포함한다.
본 발명의 생물학적 시퀀스 리스트
SEQ ID No. 1 및 대응하는 프라이머 3 및 4는 이하 표 1에 나타낸 바와 같이 시퀀스 식별 번호(sequence identification numbers)를 갖는다.
Figure pct00001
SEQ ID No. 2 및 대응하는 프라이머 5 및 6은 이하 표 2에 나타낸 바와 같이 시퀀스 식별 번호를 갖는다.
Figure pct00002
지정된(designed) "올리고뉴클레오티드(Oligonucleotide)" 프로브는 실시간 PCR(Real time PCR)을 채용함으로써 감염된 시료에서 HBV 핵산의 검출을 위해 사용될 수 있다. 검출 형태는 PCR 동안 형광(fluorescence)의 증가를 측정함에 의한다.
HBV 데이터 베이스는 HBV 유전자에 특이적인 대부분의 보존 부위를 식별하기 위해 전체적으로 서치된다(HBV data base was thoroughly searched for identifying most conserved regions specific to HBV genome.). 보존 부위를 갖는 가장 유망한 부위(promising regions)는 프라이머 및 프로브 세트(probe sets)를 고안하기 위해 선택된다. 표면에서의 보존 부위 및 X 유전자는 프로브 및 프라이머를 고안하기 위해 얻어지고, 분석된다.
본 발명에 따라서, SEQ ID No. 1과 각각의 센스 및 SEQ ID No. 3 및 SEQ ID No. 4의 안티센스 프라이머는 HBV 게놈(genome)의 표면 유전자(Surface gene)로 고안되었다. 마찬가지로, SEQ ID No. 2와 그것에 대응하는 센스 및 SEQ ID No. 5 및 SEQ ID No. 6의 안티센스 프라이머(antisense primers)는 HBV 게놈의 X 유전자로 고안되었다.
본 발명에 따라서, 상기 SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 2의 "올리고뉴클레오티드"는 5' 말단에서 형광단 및 내부 영역 또는 3' 말단에서 퀀처(quencher)를 갖는 검출가능한 라벨을 갖는다. 형광단은 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 유도체 FAM, VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산, 쿠마린(coumarin) 및 쿠마린 유도체, 루시퍼 옐로우(lucifer yellow), 텍사스 레드(texas red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 6-카르복시 플루오레세인(6-Carboxy Fluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluoroscein), 5-카르복시로다민(5-carboxyrhodamine) 및 시아닌 염료(cyanine dyes)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 상기 퀀처는 테트라메틸로다민(Tetra Methyl Rhodamine)[TAMRA], 4'-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조산(4'-(4-dimethylaminophenylazo)benzoic acid), 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-말레이미드(4-dimethylaminophenylazophenyl-4'-maleimide), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 카르복시테트라메틸로다민(carboxytetramethylrhodamine) 및 BHQ 염료(BHQ dyes)를 포함하는 군으로부터 선택된다. 상기 형광단은 6-카르복시 플루오레세인(6-Carboxy Fluorescein)[FAM]이 바람직하고, 상기 퀀처(quencher)는 내부에 존재하는 경우에 블랙홀 퀀처 1(Black hole quencher 1)[BHQ1], 3' 말단에 존재하는 경우에 테트라 메틸 로다민(tetra methyl rhodamine)[TAMRA] 또는 블랙홀 퀀처 1(Black hole quencher 1)[BHQ1]이 바람직하다.
본 발명의 간염 B 바이러스의 검출 방법에 관한 것이고, 핵산 증폭 시약, SEQ ID No. 1 또는 SEQ ID No.2로 고안된 "올리고뉴클레오티드"와 대응하는 SEQ ID Nos. 3, 4, 5 및 6의 프라이머 및 테스트 시료를 포함하는 상기 PCR 혼합물은 실시간 PCR을 사용하여 증폭이 행해져 표적 시퀀스의 복제물을 얻었다. 상기 증폭은 형광 신호의 증가의 면에서 측정된다.
"올리고뉴클레오티드" 프로브는 19-27 뉴클레오티드 범위의 크기를 갖는다. 고안된 프로브는 5' 말단에서 형광단, 내부 영역 또는 3' 말단에서 퀀처를 갖는다.
상기 형광단은 6-카르복시 플루오레세인(6-Carboxy Fluorescein)[FAM]이 바람직하고, 상기 퀀처(quencher)는 내부에 존재하는 경우에 블랙홀 퀀처 1(Black hole quencher 1)[BHQ1], 3' 말단에 존재하는 경우에 테트라 메틸 로다민(tetra methyl rhodamine)[TAMRA] 또는 블랙홀 퀀처 1(Black hole quencher 1)[BHQ1]이 바람직하다. 본 발명은 혈액/혈청/플라즈마 시료에 존재하는 간염 B 바이러스의 검출에 사용된다. 검출에 사용되는 방법은 PCR 동안 형광단의 증가를 모니터링함에 의한다.
본 발명에 따라서, "올리고뉴클레오티드" 프로브는 리보핵산(ribonucleic acid)(RNA) 또는 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid)(DNA)의 짧은 시퀀스를 말한다. "올리고뉴클레오티드" 프로브는 모든 간염 B 바이러스(HBV) 유전자형(genotypes)으로부터 핵산에 특이적으로 하이브리드(hybridise)할 수 있다. 본 발명에 따른 "올리고뉴클레오티드" 프로브는 일반적으로 약 19-27 뉴클레오티드의 길이이다. 여기서 말하는 "올리고뉴클레오티드" 프로브는 비-HBV 핵산(non-HBV nucleic acids)에 비특이적 하이브리드(hybridisation)를 나타내지 않고 HBV 핵산 시퀀스에 특이적으로 하이브리드한다. 여기에 채용되는 "올리고뉴클레오티드"는 Taqman 화학의 원리를 따른다. 이중-염료 올리고뉴클레오티드(Double-Dye oligonucleotide) 또는 듀얼 라벨 프로브(dual labeled probes)라고도 하는 TaqMan 프로브는 프로브의 가장 널리 사용되는 형태이다. 이들은 라디오라벨 프로브(radiolabeled probe)로 본래 사용되고, 앰플리콘(amplicon)의 가닥 중 하나에 상보적인 단일-가닥 프로브 시퀀스(single-stranded probe sequence)로 이루어진 분석으로부터 Roche [Basel, Switzerland] 및 ABI [Foster City, USA]에 의해 발전되었다. 여기되는 경우에 형광단은 FRET (Fluorescence resonance energy transfer)를 통해 퀀처로 그 에너지를 통과시킨다. 실시간 PCR을 행하는 동안, 상기 프로브는 PCR의 각각의 어닐링(annealing) 단계 동안 앰플리콘(amplicon)과 결합한다. Taq 중합효소가 프라이머에서 앰플리콘(amplicon)으로 확대되는 경우에, Taq 중합효소의 5'-3' 엑소뉴클리아제(exonuclease) 활성에 의해 열화되는 프로브의 5' 말단은 교체된다. 분열(Cleavage)은 남아있는 프로브가 앰플리콘을 용융시켜버릴(melts off) 때까지 계속된다. 이러한 공정은 용액에 형광단 및 퀀처를 해리하고, 그들이 프로브에 의해 함께 있는 경우와 비교하여 그들을 특별히 분리시킨다(This process releases the fluorophore and quencher into solution, specially separating them compared to when they were held together by the probe.). 이는 형광단으로부터 형광의 비가역적인 증가를 야기한다.
따라서, 본 발명에 따른 SEQ ID Nos. 1 및 2의 "올리고뉴클레오티드" 프로브는 그에 대응하는 센스 및 각각 SEQ ID Nos. 3, 4, 5 및 6의 안티센스 프라이머와의 조합으로 더 제공되고, 이는 특이적으로 증폭하는데 사용되고, 실시간 PCR에 의한 테스트 시료의 HBV 핵산 시퀀스를 검출할 수 있다.
본 발명의 기술은 이하 실시예에 의해 더 설명될 것이다. 그러나, 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해되어서는 안된다.
SEQ ID No. 1 & SEQ ID No. 2의 올리고뉴클레오티드 프로브의 효능 및 감도는 시판되는 표준 키트로 분석되고 비교되었다. 동일한 농도의 실시간 PCR 시약, 템플릿(template) 및 올리고(oligos)가 각 경우에 사용되었고, 모든 반응에 사이클 조건(cycling conditions)이 일정하게 유지되었다. 시판되는 표준 키트로부터 얻어진 결과에 근거하여, SEQ ID Nos. 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프로브의 감도 및 특이성이 분석되었다.
실시예 : 1
시판되는 키트를 사용하여 10개의 HBV 포지티브 및 10개의 HBV 네커티브 혈청 시료(negative serum samples)로부터 DNA를 분리했다. SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 2와 함께 SEQ ID Nos. 3, 4, 5 및 6의 각각 대응하는 프라이머로 지정된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 모든 시료에 실시간 PCR 반응을 행했다. 감염된 시료에서 채취한(picking up) 이들 올리고뉴클레오티드 프로브의 감도(sensitivity)는 시판되는 표준 키트(standard kit)로 비교되었다. 동일한 농도의 실시간-PCR 시약(Real time-PCR reagents), 템플릿 및 프라이머가 각 경우에 사용되고, 모든 반응에 사이클 조건이 일정하게 유지되었다. 실시간 PCR 믹스(PCR mix) 및 PCR 조건(PCR conditions)의 조성물을 표 3 & 4에 나타냈다.
Figure pct00003
Figure pct00004
얻어진 결과는 SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 2로 지정된 올리고뉴클레오티드 프로브는 HBV 포지티브 시료(HBV positive samples)에서만 채취되었고, 네거티브 시료(negative samples)에서 어떠한 오류 증폭(false amplification)도 나타나지 않은 것을 나타낸다.
올리고뉴클레오티드 SEQ ID No. 1은 100% 특이성을 나타내는 40사이클(포지티브 시료 컷오프(positive sample cutoff)) 내에서 10개의 포지티브 시료 모두에서 채취했다. 10개의 검출된 포지티브 중에서, 9개의 시료가 시판되는 표준 키트와 비교되는 경우에 더 먼저 검출되었다(Out of 10 detected positives, 9 samples were detected earlier when compared to commercial standard kit.).
마찬가지로, SEQ ID No. 2의 올리고뉴클레오티드는 100% 특이성을 나타내는 40사이클(포지티브 시료 컷오프(positive sample cutoff)) 내에서 10개의 포지티브 시료 모두에서 채취했다. 10개의 검출된 포지티브 중에서, 2개의 시료가 시판되는 표준 키트와 비교되는 경우에 더 먼저 검출되었다.
SEQ ID No.1은 시판되는 표준 키트보다 더 빨리 많은 시료에서 채취한다(Since SEQ ID No.1 picked many samples earlier than the commercial standard kit.). 따라서, SEQ ID No. 1은 특이성 및 감도에 있어서 HBV 감염을 스크리닝하는 더 우수한 프로브이다. 그러나, 올리고뉴클레오티드 프로브, SEQ ID No. 1 & SEQ ID No. 2는 HBV 감염의 검출에 사용될 수 있다.
표: 5는 SEQ ID No.1의 성능과 Ct 시판되는 키트의 비교를 제공한다. 마찬가지로, 표: 6은 SEQ ID No.2의 성능과 Ct 시판되는 키트의 비교를 제공한다. 시판되는 키트, SEQ ID No.1 및 SEQ ID No.2의 실시간 PCR 그래프는 도 1, 2, 3, 4 & 5에 나타냈다.
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예 : 2
또한, 표준 곡선을 생성함으로써 바이러스의 양을 수량화할 수 있다. HBV가 25㎕인 표준 곡선에 있어서, DNA는 dNTPS, Taq DNA 중합효소, 효소 완충제(enzyme buffer), Mgcl2 및 표면 및 X 유전자 부위에 특이적인 프라이머를 포함하는 PCR 믹스를 사용하여 종래의 PCR을 행했다. PCR의 조건은 이하와 같다.
단계 1: 120초 동안 95℃
단계 2: 20초 동안 95℃
단계 3: 40초 동안 60℃
단계 2 & 3은 40 사이클 동안 반복되었다.
PCR 후, 증폭된 시료를 3% 아가로오스겔(agarose gel)에 전기영동(electrophoresis)을 행하고, 브롬화 에티듐(ethidium bromide)으로 염색했다. 길이가 약 1.2kbp이고, HBV 게놈의 표면 및 X 유전자에 대응하는 앰플리콘 밴드(amplicon band)는 겔로부터 제거된 후 퀴아퀵 젤 추출 키트(Qiaquick gel extraction kit)를 사용하여 정제했다. 정제된 앰플리콘 DNA(2㎕)의 흡광도는 나노드롭(nanodrop)사용하여 260nm에서 측정되었다. DNA의 흡광 계수(Extinction coefficient)를 총합계에 의해 개별적 염기 계수로부터 산출했다.
앰플리콘의 나노몰(Nanomoles)을 이하 방정식을 사용하여 산출했다:
Nmoles/ml= 1000 × OD260(1cm) ×1 ml (vol)
---------------------------------
앰플리콘의 흡광 계수
복제수를 이하 식을 사용하여 산출했다.
복제수(Copy number)/ml = (Moles/ml) × 아보가드로수(Avogadro number).
산출:
OD 260 = 0.522
흡광 계수(Ext coefficient) = 33675.1
nmoles/ml = 0.015501068
Copies/ml = 9.34 x 1012
순수한 앰플리콘의 복제수로부터, 실시간 PCR을 사용하여 앰플리콘의 108 내지 103 희석물을 러닝함으로써 표준 곡선을 생성했다. 실시간 PCR 프리믹스(PCR premix ) 및 PCR 프로그램의 조성물을 표 3 & 4에 제공했다.
표준 곡선, 도: 6으로부터 얻어진 Ct로부터, 복제수를 도 6 & 표 7의 미상의 시료로 산출했다(From the Ct obtained from the standard curve, Fig: 6, copy number can be calculated for unknown samples Fig. 6 & Table 7.).
Figure pct00007
결론
a) 네거티브 시료 중 어느 것도 SEQ ID No. 1 & SEQ ID No. 2로 지정된 올리고뉴클레오티드 프로브로 긍정 오류(false positive)를 나타내지 않는다(None of the negative samples showed false positive with the designed oligonucleotide probes designated as SEQ ID No. 1 & SEQ ID No. 2.).
b) HBV의 표면 유전자로 고안된, SEQ ID No.1의 올리고뉴클레오티드는 우수한 특이성 및 감도(100%)를 나타낸다. 10개의 포지티브 시료 중, 9개는 표 5의 시판되는 표준 키트보다 먼저 채취되었다(Out of 10 positive samples 9 were picked earlier than the commercial standard kit, Table 5).
c) HBV의 표면 유전자로 고안된, 올리고뉴클레오티드 SEQ ID No.2는 100% x특이성을 나타내는 10개의 포지티브 모두를 채취한다. 10개의 포지티브 시료 중, 2개는 표 6의 시판되는 표준 키트보다 먼저 채취되었다(Out of 10 positive samples 2 were picked earlier than the commercial standard kit, Table 6).
d) 전체 평가 연구에 근거하여, SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 2는 시판되는 키트와 비교하여 HBV 검출에 최고가 되는 것으로 간주된다.
e) 최종적으로, SEQ ID No. 1 & SEQ ID No. 2로 지정된 올리고뉴클레오티드 프로브는 감염된 샘플에서 바이러스의 양을 수량화하는데 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Bigtec Private Limited <120> Oligonucleotide Probes and Primers for Detection of Hepatitis B Virus <130> PCT0940 <150> 314/CHE/2009 <151> 2009-02-13 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 1 cctcagtccg tttctcctgg ctcagtt 27 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 2 ccccttcttc gtctgccgt 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <400> 3 tgcacctgta ttcccatccc 20 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(26) <400> 4 ccacatcatc catataactg aaagcc 26 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(16) <400> 5 cgtcggcgct gaatcc 16 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(18) <400> 6 gaagcgaagt gcacacgg 18

Claims (22)

  1. SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 2의 올리고뉴클레오티드 프로브(Oligonucleotide probes).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프로브는 듀얼 라벨 프로브(dual labeled probes)인, 프로브.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 프로브는 간염 B 바이러스(Hepatitis B Virus)를 검출하는, 프로브.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 프로브는 5' 말단에 형광단(fluorophore), 내부 영역 또는 3' 말단에 퀀처(quencher)를 갖는 검출가능한 라벨과 콘쥬게이트(conjugated)된, 프로브.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 SEQ ID No. 1은 간염 B 바이러스의 표면 유전자(surface gene)로 지정되어 있고, SEQ ID No. 2는 간염 B 바이러스의 X-유전자 영역(X-gene region)으로 지정되어 있는, 프로브.
  6. SEQ ID Nos. 3, 4, 5 및 6의 프라이머(Primer).
  7. 제6항에 있어서,
    상기 SEQ ID No.3 및 SEQ ID No.5의 프라이머는 센스(sense)이고, SEQ ID No.4 및 SEQ ID No.6은 각각 안티센스 프라이머(anti sense primer)인, 프라이머.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 SEQ ID No.3 및 SEQ ID No.4의 프라이머는 SEQ ID No. 1의 듀얼 라벨 프로브(dual labeled probe), SEQ ID No.5 및 SEQ ID No.6의 프라이머(primer)는 SEQ ID No. 2의 듀얼 라벨 프로브인, 프라이머.
  9. 간염 B 바이러스의 검출을 위한 PCR 반응 혼합물(PCR reaction mixture)로서:
    상기 혼합물은 핵산 증폭 시약(nucleic acid amplification reagents), SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No.2로 시작하는 듀얼 라벨 프로브(dual labeled probes), SEQ ID Nos. 3, 4, 5, 6의 프라이머 및 테스트 시료를 포함하는, PCR 반응 혼합물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 시료는 혈액, 혈청 및 플라즈마를 포함하는 군으로부터 선택된, PCR 반응 혼합물.
  11. 제11항에 있어서,
    상기 PCR은 실시간 PCR인, 방법.
  12. 이하 단계를 포함하는 간염 B 바이러스의 검출방법으로서:
    (a) 핵산 증폭 시약, SEQ ID No. 1 또는 SEQ ID No.2의 올리고뉴클레오티드 프로브와 SEQ ID Nos. 3 및 4 또는 SEQ ID Nos. 5 및 6에 각각 대응하는 프라이머, 테스트 시료를 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및
    (b) 상기 반응 혼합물에 PCR을 행하여, 표적 시퀀스(target sequence)의 복제물(copies)을 얻은 후, 간염 B 바이러스의 검출을 위한 형광 신호의 증가를 측정하는 단계.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 프로브는 5' 말단에 형광단(fluorophore), 내부 영역 또는 3' 말단에 퀀처(quencher)를 갖는 검출가능한 라벨과 콘쥬게이트(conjugated)된, 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 SEQ ID No.3 및 SEQ ID No.5의 프라이머는 센스이고, SEQ ID No.4 및 SEQ ID No.6은 각각 안티센스 프라이머(anti sense primer)인, 방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 테스트 시료는 혈액, 혈청 및 플라즈마를 포함하는 군으로부터 선택된, 방법.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 증폭 시약은 마그네슘 클로라이드(magnesium chloride), Taq 중합효소(Taq polymerase) 및 증폭용 완충제(buffer)를 포함하는, 방법.
  17. 제12항에 있어서,
    상기 검출은 사실상 질적(qualitative) 또는 양적(quantitative)인, 방법.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 형광단(fluorophore)은 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 유도체 FAM, VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산, 쿠마린(coumarin) 및 쿠마린 유도체, 루시퍼 옐로우(lucifer yellow), 텍사스 레드(texas red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 6-카르복시 플루오레세인(6-Carboxy Fluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluoroscein), 5-카르복시로다민(5-carboxyrhodamine) 및 시아닌 염료(cyanine dyes)를 포함하는 군으로부터 선택된, 방법.
  19. 제13항에 있어서,
    상기 퀀처는 테트라메틸로다민(Tetra Methyl Rhodamine)[TAMRA], 4'-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조산(4'-(4-dimethylaminophenylazo)benzoic acid), 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-말레이미드(4-dimethylaminophenylazophenyl-4'-maleimide), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 카르복시테트라메틸로다민(carboxytetramethylrhodamine) 및 BHQ 염료(BHQ dyes)를 포함하는 군으로부터 선택된, 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    상기 형광단은 5' 말단에 6-카르복시 플루오레세인(6-Carboxy Fluorescein)이 바람직하고, 상기 퀀처(quencher)는 3' 말단에 테트라 메틸 로다민(tetra methyl rhodamine), 또는 내부 영역 또는 3' 말단에 블랙홀 퀀처 1(Black hole quencher 1)[BHQ1]이 바람직한, 방법.
  21. 간염 B 바이러스의 검출용 키트로서:
    상기 키트는 SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 2의 듀얼 라벨 프로브를 각각 또는 조합하여 포함하고; SEQ ID Nos.3, 4, 및 5, 6의 프라이머의 대응하는 짝을 각각 또는 조합하여 포함하고, 증폭 시약을 포함하는, 간염 B 바이러스의 검출용 키트.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 증폭 시약은 마그네슘 클로라이드(magnesium chloride), Taq 중합효소(Taq polymerase) 및 증폭용 완충제(buffer)를 포함하는, 방법.
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