CN105861649A - 一种新型核酸扩增反应中的探针及应用 - Google Patents

Abstract

本发明是一种新型核酸扩增反应中的探针及应用，涉及一种用于检测靶基因序列的探针，其包括与所述靶基因序列上连续碱基互补结合的配对序列、位于所述配对序列3’端的部分互补序列和位于所述部分互补序列3’端的自由序列。另外，本发明还涉及基于上述探针的试剂盒和应用等。

Description

一种新型核酸扩增反应中的探针及应用

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体而言，本发明涉及用于检测靶基因序列的探针以及基于其的试剂盒和应用等。

背景技术

核酸分子体外扩增技术是开展分子生物学研究的基础。随着生物技术的发展，建立一套灵敏度高，快速简便的核酸扩增技术一直是研究工作者探讨的问题。现有的核酸技术根据其特点可以分为两类：第一类是靶核酸的直接扩增；包括聚合酶链式反应(PCR)、核酸依赖的扩增(NASBA)和转录介导的扩增(TMA)等。第二类是信号放大扩增；包括支链DNA(bDNA)、侵染探针(Invader)和滚环扩增(RCA)等。近年来，荧光PCR技术得到了长足的发展，因其灵敏度高、快速简便、无污染、配套齐全等特点，荧光PCR技术在临床上应用越来越广泛。

荧光PCR技术一般使用荧光染料、TAQMAN探针、分子信标等，荧光染料虽然简单便宜，但是它无法识别非特异扩增，在实际应用中受限制较大。TAQMAN探针在实际应用中较为广泛，避免了非特异扩增，结果可靠，却存在荧光本底高的缺点。分子信标由于荧光本底低，能较好的区分低拷贝基因，也得到一定应用，不过其扩增效率较低。

本发明人在现有技术没有启示的情况下，经过长期实践，开拓性地开发出了一种新型探针及应用。该探针一方面吸取了上述探针的优点，另一方面避开了上述探针的缺点。该探针设计方便、扩增效率高、荧光本底低。本发明的新型探针是基于对靶核酸的直接互补，而且经过精心设计，荧光本底低，开环去结合效率高，从而基本不影响同时对靶序列的扩增，使得整个检测的效率得以提高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供新的用于检测靶基因序列的探针以及基于其的试剂盒和应用等。该探针可以提高荧光PCR(尤其是实时荧光PCR)检测的效率。

具体而言，在第一方面，本发明提供了用于检测靶基因序列的探针，其包括与所述靶基因序列上n个连续碱基互补结合的配对序列、位于所述配对序列3’端的部分互补序列和位于所述部分互补序列3’端的自由序列，在所述配对序列中自5’端起，第一位碱基是C，第n位是C，并且第2位至第[n/2]-1位包含至少一个C，而且，所述部分互补序列与所述配对序列中自5’端起第2位至第[n/2]-1位中C起始的p个连续碱基互补结合。优选地，本发明第一方面的探针由所述配对序列、所述部分互补序列和位于所述自由序列组成。

在本文中，互补结合是本领域技术人员所熟知的，指的是一个序列或序列部分从5’端起的第m位的碱基与另一个序列或序列部分从3’端起的第m位呈现A-T或C-G的配对，则这两个序列或序列部分的这两个碱基互补结合；如果这两个序列或序列部分上任意一个对应位置的两个碱基都互补结合，则这两个序列或序列部分才互补结合。另外，在本文中，中括号(“[]”)是本领域技术人员熟知的运算符，表示对所述数字取整，例如，[6.5]＝6，[7.5]＝7。

优选地，在本发明第一方面的探针中，自由序列不与所述靶序列上所述n个连续碱基5’端前p个碱基起始并向前延伸的序列互补结合，而且也不与所述配对序列中自5’端起第2位至第[n/2]-1位中C的5’端前的序列互补结合。而所述部分互补序列可以与所述靶序列上所述n个连续碱基5’端前第1位至第p为碱基的的互补结合，也可以不互补结合，优选是后者。

优选地，本发明第一方面的探针5’端标记有荧光基团，而且其3’端标记有淬灭基团。优选荧光基团及其淬灭基团是市售的，如可以采用FAM^TM/Green I、/JOE/HEX、NED^TM/TAMRA^TM/、ROX^TM/Texas和等常规产品，也可以委托公司合成标记有荧光标记的探针。优选在本发明的第一方面的探针中，荧光基团可以是FAM，TAMRA，ROX或Cy5，优选是FAM。

优选地，在本发明第一方面的探针中，n为10～20，优选为12～18，更优选为13～15。

优选地，在本发明第一方面的探针中，p为2～5，优选为2～4，更优选为 2～3。

优选地，在本发明第一方面的探针中，所述自由序列的碱基数为2～5，优选为2～4，更优选为2～3。

在本文中，如无相反指示，靶基因和靶核酸可以是互换使用。靶基因可以存在于离体样品中，如食品、空气、血液、血液制品、唾液、医疗用品或药品等。本发明仅限于对离体样品的检测，检测的直接结果是靶核酸的存在性与否。即使对于利用本发明的检测方法检测人或动物的血液样品中病原体(如，病毒)上的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在与否，还需要有经验的医生或取样人员判断检测出的靶核酸是来自于血液中的病原体还是取样时不慎污染的病原体，而不能直接得到疾病的诊断结果或健康状况；即使靶核酸来自于血液中的病原体，也只能说明相应人或动物是相应病原体的携带者，还需要有经验的医生根据相应人或动物的体质、病史、临床症状等综合情况才能判断出是否会造成疾病或对健康状况有影响。当然，由于这些病毒可以经口、鼻传播，因此本发明的实时PCR方法可以针对食品和/或空气样品进行检测，用于环境安全领域，不涉及疾病的诊断和治疗。

优选地，在本发明第一方面的探针中，靶是HBV或HCV。在本发明的具体实施方式中，探针为CCCTTCTCGTGTTACAGGCG或CTTGCGAGTGCCCCGGGA。

在第二方面，本发明提供了用于检测靶基因序列的试剂盒，其包括本发明第一方面的探针。试剂盒中不同的试剂可以分装在不同容器中，也可以选择几种长期保存而不发生化学反应并且在检测靶基因序列中将混合使用的试剂合并保存在相同的容器中。容器可以是瓶、盒、注射器等能容纳上述试剂的容器，例如常规用于装PCR、酶或核酸试剂的容器。试剂盒中还可以有标签或说明书，用以指示检测(如，实时荧光PCR检测)靶基因序列。标签可以贴在上述容器上，或者直接打印到上述容器上，也可以提供独立的说明书。根据需要，如方便运输、存放的需要，试剂盒还可以进一步包装进更大的包装中，这样的产品也在本发明的范围内。

优选地，本发明第二方面的试剂盒还包括能扩增所述靶基因序列或其部分的引物对，其中所述部分包括所述n个连续碱基。在本发明的具体实施方式中，引物对为GGACCCTGCGCTGAACATG和 GCGGTATTGTGAGGATTCTTG，或为TTGCGAACGGCCTTGTGGTA和HCV-R:GTAAACTCCGCCAACGATCTG。

本发明第二方面的试剂盒还包括用于荧光PCR的试剂和/或仪器。优选地，本发明第二方面的试剂盒还可以包括DNA聚合酶、dNTP、反转录酶和/或缓冲液。

在第三方面，本发明提供了本发明第一方面的探针在制备本发明第二方面的试剂盒中的应用。

在第四方面，本发明提供了本发明第一方面的探针在检测靶基因序列中的应用。

在第五方面，本发明提供了本发明第二方面的试剂盒在检测靶基因序列中的应用。

优选地，第四方面或第五方面的应用是非诊断应用。

在第六方面，本发明提供了一种制备探针的方法，其包括：

(1)搜索靶序列，挑出n个连续碱基的部分，所述部分中自5’端起，第一位碱基是G，第n位是G，并且第n-[n/2]+1位至第n-1位包含至少一个G，以与所述部分互补结合的序列作为配对序列；

(2)以与所述配对序列中自5’端起第2位至第[n/2]-1位中C起始的p个连续碱基互补结合的序列作为部分互补序列；

(3)构建自由序列，所述自由序列不与所述靶序列上所述n个连续碱基5’端前p个碱基起始并向前延伸的序列互补结合，而且也不与所述配对序列中自5’端起第2位至第[n/2]-1位中C的5’端前的序列互补结合；和

(4)将所述部分互补序列连接在所述配对序列的3’端，并将所述自由序列连接在所述部分互补序列的3’端。

优选本发明第六方面的方法，还可以进一步包括，将步骤(4)连接得到的探针的5’端标记荧光基团，并且将其3’端标记淬灭基团。

优选地，在本发明第六方面的方法中，n为10～20，优选为12～18，更优选为13～15。

优选地，在本发明第六方面的方法中，p为2～5，优选为2～4，更优选为2～3。

优选地，在本发明第六方面的方法中，所述自由序列的碱基数为2～5，优 选为2～4，更优选为2～3。

本发明的有益效果在于：本发明的探针设计方便，扩增效率高，荧光本底低，尤其适用于在实时荧光PCR检测中推广应用。

为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

附图说明

图1显示了本发明实施例的新型探针用于乙型肝炎病毒核酸定量检测的结果，其中，各曲线分别为样本连续10倍稀释的各结果；

图2显示了本发明实施例的新型探针用于丙型肝炎病毒核酸定量检测的结果，其中，各曲线分别为样本连续10倍稀释的各结果。

具体实施方式

以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratoryPress)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社,北京,中国,2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社,北京,中国,1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的探针、引物可以委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

实施例1乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)

乙型肝炎病毒核酸定量标准品可购自中国食品药品检定研究院，供核酸提取。核酸的提取按照常规磁珠提取法进行提取，为了同时适应大量乙型肝炎病毒的核酸提取，改进如下：向1uL标准品加入90uL核酸萃取液(配方及终浓 度为：异硫氰酸胍1.2M、乙二胺四乙酸钠(pH8.0)10mM、吐温-20 2％(W/W)、高氯酸钠1M、乙醇40％(V/V)、Tris-HCl(pH8.0)10mM)，于42℃保温10min，然后加入10uLD-Beads DNA磁珠悬浮液(50mg/mL，可购自北京艾比根生物技术有限公司)，振荡混合均匀后，套在磁架上施加磁场，弃去其中液体，然后加入200uL洗涤液A(配方及终浓度为：高氯酸钠1M、乙醇30％(V/V))，洗涤后弃去洗涤液A，再加入200uL洗涤液B(配方及终浓度为：乙醇70％(V/V))，洗涤后弃去洗涤液B，最后加入洗脱液(配方及终浓度为：Tris-HCl(pH8.0)10mM)，于42℃保温10min，吸出并保留液体，即为核酸提取液。

1，引物及探针序列

委托合成如下引物对和探针：

检测HBV的引物对：

HBV-F:GGACCCTGCGCTGAACATG，

HBV-R:GCGGTATTGTGAGGATTCTTG，

检测HBV的探针：

HBV-P:CCCTTCTCGTGTTACAGGCG，

对照探针：

在HBV-P的基础上分别去除了第1位C、第15位C、部分互补序列或自由序列。

2，荧光标记

在上述探针HBV-P和对照探针的5’端委托合成标记荧光标记FAM，并在3’端标记相应的淬灭基团。

3，PCR反应条件

PCR反应体系总体积为20μl，其中各组分的终浓度分别为：核酸提取液(100倍稀释)1uL，每一种引物含量为15pmol/ml，每一种探针含量为8pmol/ml，Mg²⁺(MgCl₂)浓度为3.75mmol/ml，dNTP浓度各为0.2mmol/ml，UNG酶含量为0.05U，2×PCR buffer(可购自TaKaRa公司，pH8.3，无Mg²⁺) 为10ul，Taq DNA聚合酶为2U，甘油15％(V/V)，余量为去离子水。

反应热循环条件如下：

使用ABI 7500实时荧光PCR仪，荧光采集FAM检测波长。

4，结果判断

基线和阈值设定为ABI 7500荧光仪默认自动设定。如果各荧光FAM、VIC、NED、Texas Red或CY5)层Ct值大于45，则判定为相应的核酸检测阴性，如果小于等于45，则判定相应的核酸检测阳性。本发明的方法能够检测极底浓度的上述病毒的靶核酸，如图1所示，达到了超敏级的检测灵敏度，检测下限达到4IU/ml。而使用对照探针则灵敏度下降显著，检测下限分别只35～300IU/ml，有数量级的差异。

以上测试重复120次(包括样品中只添加乙型肝炎病毒标准品的核酸提取液，或者未添加任何提取液的情况，但是其他检测条件不变)，结果阳性、阴性均正确，表明本发明准确性和可靠性好。

实施例2丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)

丙型肝炎病毒核酸定量标准品可购自中国食品药品检定研究院，供核酸提取。核酸的提取按照常规磁珠提取法进行提取，为了同时适应大量丙型肝炎病毒的核酸提取，改进如下：向1uL标准品加入90uL核酸萃取液(配方及终浓度为：异硫氰酸胍1.2M、乙二胺四乙酸钠(pH8.0)10mM、吐温-20 2％(W/W)、高氯酸钠1M、乙醇40％(V/V)、Tris-HCl(pH8.0)10mM)，于42℃保温10min，然后加入10uLD-Beads DNA磁珠悬浮液(50mg/mL，可购自北京艾比根生物技术有限公司)，振荡混合均匀后，套在磁架上施加磁场，弃去其中液体，然后加入200uL洗涤液A(配方及终浓度为：高氯酸钠1M、乙醇30％(V/V))，洗涤后弃去洗涤液A，再加入200uL洗涤液B(配方及终浓度为：乙醇70％(V/V))，洗涤后弃去洗涤液B，最后加入洗脱液(配方及终浓度为：Tris-HCl(pH8.0)10mM)，于42℃保温10min，吸出并保留液体，即为核酸提取液。

1，引物及探针序列

委托合成如下引物对和探针：

检测HCV的引物对：

HCV-F:TTGCGAACGGCCTTGTGGTA，

HCV-R:GTAAACTCCGCCAACGATCTG，

检测HCV的探针：

HCV-P:CTTGCGAGTGCCCCGGGA，

对照探针：

在HCV-P的基础上分别去除了第1位C、第13位C、部分互补序列或自由序列。

2，荧光标记

在上述探针HCV-P和对照探针的5’端委托合成标记荧光标记FAM，并在3’端标记相应的淬灭基团。

3，PCR反应条件

PCR反应体系总体积为20μl，其中各组分的终浓度分别为：核酸提取液(100倍稀释)1uL，每一种引物含量为15pmol/ml，每一种探针含量为8pmol/ml，Mg²⁺(MgCl₂)浓度为3.75mmol/ml，dNTP浓度各为0.2mmol/ml，UNG酶含量为0.05U，2×PCR buffer(可购自TaKaRa公司，pH8.3，无Mg²⁺)为10ul，Taq DNA聚合酶为2U，MMLV反转录酶5U，甘油15％(V/V)，余量为去离子水。

反应热循环条件如下：

使用ABI 7500实时荧光PCR仪，荧光采集FAM检测波长。

4，结果判断

基线和阈值设定为ABI 7500荧光仪默认自动设定。如果各荧光FAM、 VIC、NED、Texas Red或CY5)层Ct值大于45，则判定为相应的核酸检测阴性，如果小于等于45，则判定相应的核酸检测阳性。本发明的方法能够检测极底浓度的上述病毒的靶核酸，达到了超敏的检测灵敏度，检测下限达到10IU/ml。而使用对照探针则灵敏度下降显著，检测下限分别只65～500IU/ml，有接近数量级的差异。

以上测试重复120次(包括样品中只添加丙型肝炎病毒标准品的核酸提取液，或者未添加任何提取液的情况，但是其他检测条件不变)，结果阳性、阴性均正确，表明本发明准确性和可靠性好。

Claims (10)

1.用于检测靶基因序列的探针，其包括与所述靶基因序列上n个连续碱基互补结合的配对序列、位于所述配对序列3’端的部分互补序列和位于所述部分互补序列3’端的自由序列，在所述配对序列中自5’端起，第一位碱基是C，第n位是C，并且第2位至第[n/2]-1位包含至少一个C，而且，所述部分互补序列与所述配对序列中自5’端起第2位至第[n/2]-1位中C起始的p个连续碱基互补结合。

2.权利要求1所述的探针，其5’端标记有荧光基团，而且其3’端标记有淬灭基团。

3.权利要求1所述的探针，其中，n为10～20，优选为12～18，更优选为13～15；p为2～5，优选为2～4，更优选为2～3；和/或，所述自由序列的碱基数为2～5，优选为2～4，更优选为2～3。

4.权利要求1所述的探针，其中，靶是HBV或HCV。

5.权利要求1所述的探针，其为CCCTTCTCGTGTTACAGGCG或P:CTTGCGAGTGCCCCGGGA。

6.用于检测靶基因序列的试剂盒，其包括权利要求1～5之任一所述的探针。

7.权利要求6所述的试剂盒，其还包括能扩增所述靶基因序列或其部分的引物对，如GGACCCTGCGCTGAACATG和GCGGTATTGTGAGGATTCTTG，或TTGCGAACGGCCTTGTGGTA和GTAAACTCCGCCAACGATCTG。

8.权利要求1～5之任一所述的探针在制备权利要求6或7所述的试剂盒中的应用。

9.权利要求1～5之任一以所述的探针或权利要求6或7所述的试剂盒在检测靶基因序列中的应用(优选是非诊断应用)。

10.一种制备探针的方法，其包括：

(1)搜索靶序列，挑出n个连续碱基的部分，所述部分中自5’端起，第一位碱基是G，第n位是G，并且第n-[n/2]+1位至第n-1位包含至少一个G，以与所述部分互补结合的序列作为配对序列；

(2)以与所述配对序列中自5’端起第2位至第[n/2]-1位中C起始的p个连续碱基互补结合的序列作为部分互补序列；

(3)构建自由序列，所述自由序列不与所述靶序列上所述n个连续碱基5’端前p个碱基起始并向前延伸的序列互补结合，而且也不与所述配对序列中自5’端起第2位至第[n/2]-1位中C的5’端前的序列互补结合；

(4)将所述部分互补序列连接在所述配对序列的3’端，并将所述自由序列连接在所述部分互补序列的3’端。