CN106282404A

CN106282404A - 丙型肝炎病毒的快速及灵敏检测及基因型鉴定

Info

Publication number: CN106282404A
Application number: CN201510282548.4A
Authority: CN
Inventors: 周国辉; 潘思颖; 李瑞萍
Original assignee: Diagcor Bioscience Inc Ltd
Current assignee: Dayak High Life Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2015-05-28
Filing date: 2015-05-28
Publication date: 2017-01-04

Abstract

本发明提供了用于快速及灵敏地检测、辨认或区分丙型肝炎病毒(HCV)各种基因型和亚型的寡核苷酸和测试剂。在一个实施例中，本发明提供对应全部HCV的通用引物和探针，并能够捕获来自HCV族群的通用或共有核酸。在一个实施例中，本发明能够捕获来自罕见、未分类或未知的HCV基因型、亚型或株系的核酸。在另一个实施例中，本发明提供可以明确地检测或辨认HCV基因型1‑6或者区分这些基因型的探针。在一个实施例中，本发明提供可以明确地检测或辨认HCV亚型1a和1b以及具有NS3‑K80或NS3‑Q80多态性的亚型1a的引物和探针。

Description

丙型肝炎病毒的快速及灵敏检测及基因型鉴定

技术领域

本发明涉及丙型肝炎病毒(HCV)的检测。在一个实施例中，本发明提供用于快速及灵敏地检测丙型肝炎病毒(HCV)和鉴定丙型肝炎病毒(HCV)基因型的方法和试剂盒。

背景技术

丙型肝炎是一个重大的全球性公共健康问题，并且是引发慢性肝病如肝硬化和肝细胞癌(HCC)的其中一个主要原因。丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引致的一种肝脏疾病。丙型肝炎病毒一般透过接触感染者的血液而传播。据估计，有1.85亿人受慢性HCV感染，每年有超过35万人死于丙型肝炎相关的肝脏疾病。丙型肝炎流行于全球，其中慢性HCV感染在国家包括埃及、巴基斯坦和中国的感染率尤其高。病毒在肝脏中复制，攻击并杀死肝细胞，并引起肝脏炎症。一旦感染HCV，有高达75％的人可能成为慢性感染者；慢性感染是指感染者在六个月内未能清除病毒。大多数的慢性HCV感染者并没有症状，并过着正常的生活。然而，10-25％的慢性HCV感染者的病情可能在感染后10到40年之内逐渐恶化，最后可能导致严重的肝损伤、肝硬化(形成疤痕组织)和肝癌。目前，丙型肝炎是美国肝脏移植的主要原因。由于HCV有高度的变异性，所以目前尚未有有效的疫苗。然而，随着医学界对诊断、管理和治疗HCV感染的认识渐增，以及相关技术的进步，治疗丙型肝炎的成功率可高达90％，并能減少副作用，及缩短治疗时间。绝大多数HCV感染者，經适当的治疗后痊愈或減緩其病情的惡化。

目前已知有7个HCV基因型(基因型1-7)，每个基因型中再細分为不同亚型或病毒株。相近的HCV亚型之间大约有20-25％核苷酸序列上的差异，各个基因型之间的差异则有30％以上。基因型1、2和3分布在世界各地，其中大约60％的感染是由亚型1a和1b引起的。基因型4主要在中东和非洲出现。基因型5占南非地区的50％，并很少在南非以外地区出现。基因型6一般在中国南方和东南亚地区出现。基因型7并不常见，主要盛行于泰国。

实验室一般以病毒抗体检测和病毒负荷量来检测受试者样品中是否存在HCV感染。在感染者体内，可能需要长达50天才能产生HCV抗原，并且可能需要100天以上才能达到血清转化(seroconversion),即产生足够的抗体数量以获得的病毒抗体检测阳性结果。病毒负荷量检测通过定性方法，如聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction-PCR)、分支链DNA技术(Branched-chain DNA-bDNA)或转录介导扩增法(Transcription Mediated Amplification-TMA)，以估计感染者体内HCV病毒RNA的数量。病毒负荷量检测可以在感染HCV几天后检测HCV,病毒抗体检测在那时一般仍呈陰性。病毒负荷量检测的结果通常指出受试者的病毒载量是低或高(即低于或高于8000000IU/mL)。HCV抗体检测只能证实受试者是否曾经被HCV感染，而病毒负荷量检测则结果可以供医生诊断受试者是否正受HCV感染。一般而言，阳的性抗体检测结果及高病毒载量顯示受试者正受HCV感染。

一旦证实感染HCV，通常会在给予治疗前测定病毒载量和基因型两个指标以评估HCV感染的类型和程度，从而为受试者安排适当的治疗。病毒载量测量对预测和监测治疗的有效性十分有用。研究发现，治疗前患者的病毒载量愈低，现有的HCV治法对患者的成效愈大。临床观察得知，治疗开始前病毒载量低于400,000IU/mL的患者通常有更好的治疗结果。此外，在疗程期间测量病毒载量可以反映消除或抑制HCV的进展，因此病毒载量是一个评估治疗成效的有用指标。

另一方面，HCV基因型在决定疗程时间和类型发挥了关键的作用。已知不同基因型的HCV其毒力大致相等，但对药物疗法的反应则有所不同。例如，一种施用聚乙烯二醇化干扰素α和抗病毒药利巴韦林(ribavirin)的複合治疗可以治愈70％-80％由基因型2和3引致的疾病，及治愈45-70％由其他基因型引致的疾病。由于相同药物对于不同的HCV基因型的疗效和副作用有显著差异，所以治疗方案(例如所用药物、治疗时间)通常会对应特定的HCV基因型而设计。

此外，HCV亚型1a在其非结构基因NS3中展现Q80K多态性，即在NS3基因中，天然氨基酸残基谷氨酰胺-80(Glutamine-80)突变为赖氨酸-80(Lysine-80)。NS3基因负责编码一个对病毒复制过程必需的蛋白酶。该蛋白酶是前线抗HCV药物的目标,例如Simeprevir专门抑制NS3/4A蛋白酶。研究发现，在感染了HCV亚型1a的患者中，发现NS3 Q80K多态性与他們对Simeprevir,聚乙烯二醇化干扰素和利巴韦林的结合治疗反应较差有关。临床研究发现，具有NS3 Q80K多态性的HCV感染患者如接受Simeprevir治疗，他們较少获得持续性病毒反应(Sustained Virologic response-SVR)。因此，强烈建议在治疗之前测定HCV感染患者是否展现NS3 Q80K多态性(WHO,2014)。

因此，鉴定HCV基因分型对疾病的流行病学和临床管理都是有用的。来自欧洲(EASL，2014年)、美国(AASLD，2014年)和世界卫生组织(WHO，2014年)的三个最新HCV指南中，均建议进行HCV基因型鉴定。

基因分型一般通过分子基因分型技术来鉴定，例如直接测序、实时逆转录聚合酶链反应和特异性等位基因杂交测定(或线性探针测定)。直接测序直接获得有关物种的准确序列。直接测序方法准确并可靠，是鉴定HCV基因型的黃金标准。然而，此方法的灵敏度有限，也相对昂贵和费时。相比之下，实时逆转录聚合酶链反应更灵敏，但是此方法涉及若干反应样本来确定基因型，所以需要阐释复杂的结果。

鉴定基因型亦可以使用特异性等位基因杂交测定，当中僅需检测目标HCV的短核酸段而无需检查大范围的核酸序列。这种方法通常涉及使用聚合酶链反应(PCR)扩增目标核酸，并用特异性寡核苷酸探针与扩增子杂交以探测目标核酸。此方法的结果容易阐释，配合适当的引物、探针和测定条件可以明确且灵敏的地检测目标核酸。然而，传统的固定技术和杂交技术一般受膜面积的限制，并且涉及较长的温育时间(至少4小时)。

基于上述应用技术的考虑，有必要发展出更先进的方法以便快速、简单而准确及灵敏地检测和鉴定HCV，从而为HCV感染者提供及时和优化的治疗。如能及早检测HCV和鉴定HCV基因型，有望更迅速地排除潜在感染，预防感染者在感染期间传播HCV，并在病毒载量变得过高之前给予治疗以增加治疗的成功率。

另外，由于HCV的RNA基因组突变率高，HCV展现非常高的异质性。传统的基因分型方法大多用于检测特定基因型的已知序列，未必能检测罕见或新出现的HCV品种。因此,一种涵盖各种不同基因型并包括HCV族群的亚型的崭新型基因分型系统是非常有用的。

本发明提供了用于多项检测、辨认或区分HCV的方法和试剂盒。本发明符合成本效益，易于操作，且允许简易至仅需要肉眼观察的结果阐释。本发明提供更快速及有效的HCV检测。

发明内容

本发明提供了可快速及灵敏地检测、辨认或区分各种不同HCV基因型的方法和试剂盒。

在一个实施例中，本发明结合一步法RT-PCR扩增法和导流杂交技术，以快速地检测人类样本如血清和血浆中的HCV或HCV的核酸并鉴定其基因型。

在一个实施例中，本发明提供一种检测、鉴定或区分不同HCV基因型的方法和试剂盒。在一个实施例中，本发明提供对应HCV基因型1-6的引物和探针。

在一个实施例中，本发明提供一种检测、鉴定或区分HCV亚型1a和1b的方法和试剂盒。在一个实施例中，本发明提供对应编码HCV亚型1a和1b的非结构蛋白质NS5B的核酸的引物和探针。

在一个实施例中，本发明提供一种检测、鉴定或区分出HCV亚型1a中的NS3基因多态性的方法和试剂盒。在一个实施例中，本发明提供对应HCV亚型1aNS3蛋白中的氨基酸赖氨酸-80或谷氨酰胺-80的序列的引物和探针。

在一个实施例中，本发明提供一种用來检测HCV或其核酸的方法和试剂盒。在一个实施例中，本发明提供适用于所有HCV品种且能捕获HCV族群中的通用或共有核酸的引物和探针。在另一个实施例中，本发明所述的引物和探针能够捕获来自罕见、未分类或未知的HCV基因型的核酸。

在一个实施例中，本发明结合其他等温设备和/或导流杂交设备一起使用。

本发明提供用于快速及灵敏地检测、辨认或区分各种HCV类型和来自各种HCV基因型的核酸的方法和试剂盒，所述方法和试剂盒包含对应HCV核酸的引物和探针。在一个实施例中，本发明提供一种快速及灵敏地检测HCV和鉴定HCV基因型的方法和试剂盒。

本发明并不需要昂贵的仪器和复杂的程序，并且与逆转录、PCR扩增法和导流杂交技术相容。

在一个实施例中，本发明结合逆转录、PCR扩增法和导流杂交技术，以快速并灵敏地检测不同样品和人类样本中的HCV及鉴定其HCV基因型。

本发明可以快速、灵敏且高流量地进行HCV检测和基因型鉴定，从而允许医生为患者尽早安排适当的治疗，以提高治疗的成功率。

本发明提供了一组经特殊设计、修饰的新颖核酸引物和探针，用于扩增和检测来自HCV的核酸。

在一个实施例中，本发明的引物和探针经测试并确定能检测和鉴定HCV基因型1-6的品种，且具有高的特异性和灵敏度。本发明亦提供用于通用检测HCV族群的探针。本发明的引物和探针经实验及临床测试,証实能够检测血清和血浆样品中90％以上的流行性HCV感染。本发明的引物和探针亦已被证实不会与人类基因组產生交叉反应，从而保证HCV的检测既特定又准确。

在一个实施例中，本发明的引物是涵盖所有HCV基因型、亚型和株系的核酸的通用引物。在一个实施例中，本发明的探针对应特定HCV基因型、亚型或株系的核酸。在一个实施例中，本发明的探针对应HCV基因型1、2、3、4、5或6，且能够检测属于HCV基因型1、2、3、4、5或6的任何已知或未知的亚型或株系。

在一个实施例中，本发明检测HCV亚型1a的NS3基因的多态性，其中NS3基因的Q80K多态性被发现与抗病毒药物simeprvir的抗药性相关。

在一个实施例中，本发明的探针对应编码HCV亚型1a的NS3中赖氨酸-80的自然序列。在另一个实施例中，本发明的探针对应编码HCV亚型1a的NS3中谷氨酰胺-80(Q80K多态性)的序列。

在一个实施例中，本发明的引物和探针能够检测和区分HCV亚型1a和1b。在一个实施例中，本发明的引物和探针对应HCV亚型1a和1b的NS5B基因。

在另一个实施例中，本发明的探针对应所有HCV基因型、亚型和株系，并且能够捕获来自HCV族群中的通用或共有核酸。结合使用通用探针以及对应特定品种的品种探针，可以确定样品或患者是否感染任何一种HCV，以及有关病原体属于HCV基因型1-6、亚型1a或1b、或者任何其他或未知的HCV。

在一个实施例中，本发明的引物和探针是经修饰的、非天然的寡核苷酸并带有一个或多个化学标记，所述化学标记包括但不限于生物素、荧光标记物和氨基。在一个实施例中，本发明的引物和探针包含一个或多个非天然的核苷酸类似物，包括但不限于肌苷(inosine/I)和荧光碱基类似物。在另一个实施例中，本发明的引物和探针与逆转录、PCR扩增法和导流杂交技术结合地使用。

一步法逆转录和PCR扩增法(RT-PCR)

在一个实施例中，本发明的引物可同时用于逆转录和PCR扩增法，因而可以在单个试管中对病毒RNA进行逆转录和扩增由此产生的互补DNA(complementary DNA/cDNA)。相比于两步法RT-PCR(即需要在完成逆转录之后再额外设置PCR反应),一步法RT-PCR的程序更简单，对试剂、引物和机件设备的需求亦较低，因此更有优势。因此，本发明与传统方法和试剂盒相比更具成本效益及更易于操作。

任何设备或系统，包括但不限于热循环仪、恒温箱以及能保持一定高温或执行RT-PCR扩增的加热板/加热组，均可以与本发明结合使用。

一般可使用能被侦测的标记物标记扩增子，以便于随后检测和量化目标核酸。在一个实施例中，可使用带有适当标记物的引物扩增目标序列，以在随后的杂交过程中生成信号。在一个实施例中，可通过引物5’端的共价键在引物对中的一个或两个引物上加上标记物。

在一个实施例中，本发明的引物包含一个或多个标记物如生物素。生物素可以结合抗生素及蛋白酶的结合物,產生颜色以供检测。在另一个实施例中，可以标记四种核苷酸dNTP的其中一个并在扩增过程中使用，以标记新生成的扩增子。

本发明可使用任何可被监测并產生信号的标记物。例如，本发明可以与其他标记系统结合使用，包括但不限于胶状金结合物和荧光标记、磁颗粒结合物、量子点、化学发光标记分子，或其他合适的系统。

导流杂交

导流杂交方法和设备可以准确地控制杂交条件,不会有传统杂交技术需时较长的问題。导流DNA杂交技术可将杂交时间从数小时或数天减至数分钟(整个杂交测定可以在5-30分钟内完成，具体时间取决于用于产生检测信号的方法)。导流杂交设备的制造成本低廉，并且使用比传统杂交设备少10倍的试剂量，因此使DNA检测技术比前更经济实惠。导流杂交技术提供更灵敏、准确的检测和鉴定结果，并普遍适用于各种不同技术例如传统DNA印迹法(Southernblotting)、RNA印迹法(Northern blotting)、斑点印迹法、狭槽印迹法和反向斑点印迹法的杂交。

PCT申请WO/2011/139750描述了一个连接到中央控制单元的多个横向快速导流检测设备。杂交设备包含一个连接到一个或多个横流设备的中央控制单元。横流设备进行杂交过程和显影程序，并由中央控制单元控制和供电。单个横流设备或几个设备可以同时测试若干反应(或者若干样品和/或分析物),并在独立的控制下以不同条件进行程序。横流设备可以是“nxm”点阵(矩阵)的形式，也可以是线阵的形式。更多有关于执行导流杂交的方法和设备的描述可參见美国专利5,741,647、美国专利6,020,187和PCT申请WO/2011/139750。本技术领域的普通技术人员可以使用美国专利5,741,647或美国专利6,020,187中所述的类近导流杂交技术，或者能够执行导流杂交技术的任何新方法或设备来实践本发明。杂交设备附有的成像系统，例如FT-Pro，可以将信号检测数码化。本发明所述的杂交设备可以是自动化的设备，可以使用其内置的数码化功能以进行所有分析。导流杂交法比传统杂交技术有更高的效率、准确度和灵敏度。

目标核酸的检测可以在几秒钟内完成，其结果易于阐释并可以直接用肉眼观察，因此无需专门的仪器。有需要时可以使用如CapturePRO的设备捕获和记录信号。根据所得的图像，可对目标核酸进行半定量的分析。

HCV的类型特异性检测和鉴定

第1组：HCV基因型1-6

在一个实施例中，本发明提供对应特定HCV基因型1-6核酸的探针。

或可通过适当的设计和优化,务求使各个目标核酸在相近的效率下扩增及杂交。因此，对于引物和扩增方案，必须仔细设计并优化，以确保用于检测的扩增技術其结果可靠。

对于基因型分析，首选HCV中共有但有一定差异的核酸区域作为目标区域，以区分不同的HCV品种。在一个实施例中，本发明选择了HCV基因组内的5’端的非翻译区(5’-UTR)来设计引物和探针。通过精心设计和严紧的实验，证实本发明的全部引物和探针均能够特异地、灵敏地扩增和检测来自HCV基因型1-6的目标核酸。

在一个实施例中，本发明提供可以识别全部HCV基因型、亚型和株系的5’-UTR的通用引物，所述HCV包括但不限于HCV基因型1、2、3、4、5和6，以及其他已知或未分类的HCV品种。在一个实施例中，本发明的通用引物包含序列号1-7的序列，它们能够结合到HCV的5’-UTR，继而扩增目标序列。工具BasicLocal Alignment Search Tool(BLAST)的检索结果表明，本发明的通用引物可以检测多种HCV基因型、亚型和株系。

通用引物

目标5’-UTR	引物ID	引物序列(5'到3')	5'修饰	长度	序列号
						正链	HCV-C-1F	GAGAGCCATAGTGGTCTGC	蛋白生物素	19	1
正链	HCV-C-6F	CTTGCGAGTGCCCCGGGA	-	18	2
						反链	HCV-C-6R	CCACCCGGGAACTTAACGT	蛋白生物素	19	3
反链	HCV-C-7R	CCGCCCGGGAACTTGACGT	蛋白生物素	19	4
						反链	HCV-C-8R	CCGCCCGGGAACTTAACGT	蛋白生物素	19	5
反链	HCV-C-9R	CCACCCGGGAACTTGACGT	蛋白生物素	19	6
						反链	HCV-C-10R	AGGCCTTTCGCRACCCAAC	蛋白生物素	19	7

Y＝嘧啶(C/T)；R＝嘌呤(A/G)；W＝(A/T)

HCV品种特异性探针

目标基因型	探针ID	探针序列(5'到3')	5'修饰	长度	序列号
						HCV 1	P43	CTTGGATAACCCCGC	胺基	15	8
HCV 1,6	P118	GAATTGCCAGGACGACC	胺基	17	9
						HCV 1,6	P137	GAGTTGCCAGGATGACCG	胺基	18	10
HCV 1,4	P29	AACCAAACGTAACACCAAC	胺基	19	11
						HCV 2	P55	CCGGGAAGACTGGGT	胺基	15	12
HCV 2	P102	TGGATAAACCCACTCTATG	胺基	19	13
						HCV 3,6	P28	TGAGCACACTTCCAAAAC	胺基	18	14
HCV 3,6	P110	TGAGCACACTTCCTAAA	胺基	17	15
						HCV 3	P13	CGCGAGATCACTAGCC	胺基	16	16
HCV 4	P14	CCGCCGCCCCATGGA	胺基	15	17
						HCV 4	P71	AACCGCCACCCCATGGA	胺基	17	18
HCV 5	P23	GTCATCCCGGCAATTC	胺基	16	19
						HCV 5	P50	GCCCGGAGACTTGG	胺基	14	20
HCV 5	P60	TGCCCGGAGATTTGG	胺基	15	21
						HCV 6	P125	AAAACCCCAAAGACAAAC	胺基	18	22

在一个实施例中，在RT-PCR反应中共同使用包含序列号1-7序列的引物，以产生特定HCV的扩增子。

在另一个实施例中，在RT-PCR反应中共同使用两个或多个包含序列号1-7序列的引物，以产生特定HCV的扩增子。在一个实施例中，包含序列号1的引物与一个或多个包含序列号3-7的引物配对使用。在另一个实施例中，包含序列号2的引物，与一个或多个包含序列号3-6的引物配对使用。

在一个实施例中，本发明提供用以检测HCV基因型1-6的品种特异性探针，从而鉴定样品中的HCV基因型。在一个实施例中，本发明的品种特异性探针包含序列号8-22，能够与HCV基因型1-6的5’‐UTR结合。

在一个实施例中，可以共同使用本发明不同的探针并将之分成一个或多个组别以检测HCV。在另一个实施例中，可单独地使用本发明的探针以检测个别的HCV基因型。

一般而言，基因型分析方法通常利用一个对应特定核酸序列的探针就足够。尽管如此，本发明设计的探针涵盖每个HCV基因型其5’-UTR区内的多个序列，以进一步增加检测的准确度及灵敏度。

在一个实施例中，可共同使用了两个或多个对应相同HCV基因型的探针以验证基因型分析的结果。如果任何一个目标序列出现缺陷或降解，则其他序列可以弥补缺陷，从而减少假阴性结果并提高检测准确度。例如，共同使用包含序列号8-11的探针，可证实某个测试样品或受试者是否被HCV基因型1感染。在另一个实施例中，共同使用包含序列号12-13的探针，可证实某个测试样品或受试者是否被HCV基因型2感染。类似的方法也适用于HCV基因型3、4、5和6。本技术领域的技术人员可考虑测试的实际需要对杂交方案作出调整。

观察所得，如果对应某个基因型的探针序列与其它基因型有基本同源性，很可能出现探针与非目标的序列之间的非特异性结合(即交叉反应)。另一方面，每个基因型内的亚型或株系之间的序列或有不同，因而专为为检测某几种亚型或株系而设计的探针可能不能检测出已出现突变的亚型或株系。因此，有必要权衡检测的灵敏度和特异性，以达到一个准确、肯定的HCV检测。

基于上述情况，本发明既提供与已知HCV亚型完全同源的“天然”探针，亦提供与已知HCV亚型不完全同源的“人工”探针。所述人工探针的序列包括错配的序列，从而只能检测出那些与目标序列充分同源的真正目标序列。在一个实施例中，本发明共同使用涵盖同一区域的天然探针和人工探针，从而保证即使所测基因型内不同亚型或株系之间的核酸有所变异，亦能检测某个特定基因型，以提高检测的灵敏度和特异性。

例如，包含序列号9-10的探针用于检测HCV基因型1和6。序列号9属于天然序列，序列号10则是人工序列，后者与序列号9的天然序列相比有两个错配。在一个实施例中，如图1所示,可以在阵列位置C1上共同使用包含序列号9-10序列的探针，以检测HCV基因型1和6。

在另一个实施例中，如图1所示,可以在阵列位置B3上共同使用包含序列号17-18的探针以检测HCV基因型4。序列号18是人工序列，与序列号17的天然序列相比有三个错配。

在一个实施例中，如图1所示,可以在阵列位置E3上共同使用包含序列号19-20序列的探针以检测HCV基因型5。在另一个实施例中，如图1所示,可以在阵列位置E4上共同使用包含序列号20-21的探针以检测HCV基因型5。序列号20是人工序列，与序列号19或21的天然序列相比有两个错配。

第2组：HCV亚型1a和1b

在一个实施例中，本发明提供的引物和探针对应编码HCV亚型1a和1b的非结构蛋白NS5B的核酸，并已经证实這些引物和探针均能明确地并灵敏地扩增和检测来自HCV亚型1a和1b的目标核酸。

HCV亚型1a和1b(NS5B)的引物

目标NS5B	引物ID	引物序列(5'到3')	5'修饰	长度	序列号
						正链	HCV-NS5B-3F	CAATTCCTGGCTAGGCAAYAT	-	21	23
反链	HCV-NS5B-3R	GCGCTAAGRCCRTGGAGTC	生物素	19	24

Y＝嘧啶(C/T)；R＝嘌呤(A/G)；W＝(A/T)

HCV亚型1a和1b(NS5B)的探针

Y＝嘧啶(C/T)；R＝嘌呤(A/G)；W＝(A/T)

在一个实施例中，可分开使用包含序列号25-28的探针，以检测个别的HCV亚型1a或1b。在另一个实施例中，在一个或多个组中共同使用两个或多个包含序列号25-28的探针，以检测HCV亚型1a和1b。

在一个实施例中，包含序列号23-24的引物可以与两个或多个包含序列号1-7的引物可以结合地使用，以产生特定于HCV基因型1的扩增子。在另一个实施例中，可以在一个或多个组別中使用一个或共同使用多个包含序列号8-11和25-28的探针，以检测HCV基因型1，或者区分亚型1a和1b。

本技术領域的技术人员可根据测试的实际需要，按照图1中所示或类似的形式调整杂交方案并增加其他阵列位置。

第3组：HCV亚型1a的NS3 Q80K多态性

在一个实施例中，本发明提供的引物和探针对应可编码HCV亚型1a非结构蛋白NS3的特异性核酸。这些引物和探针能够检测与NS3蛋白质的赖氨酸-80(NS3-K80)和谷氨酰胺-80(NS3-Q80)相关的多态性，并已经证实這些引物和探针均能够明确地并灵敏地检测HCV亚型1a中NS3-K80或NS3-Q80的多态性。

NS3-K80和NS3-Q80多态性的引物

目标NS3	引物ID	引物序列(5'到3')	5'修饰	长度	序列号
						正链	HCV-NS3-3F	AAGGGTCCTGTCATYCARATGTA	生物素	23	29
反链	HCV-NS3-2R	CTCGTGACCAGGTARAGRTC	生物素	20	30

Y＝嘧啶(C/T)；R＝嘌呤(A/G)；W＝(A/T)

NS3-K80和NS3-Q80多态性的探针

目标基因型	探针ID	探针序列(5'to3')	5'修饰	长度	序列号
						K80(反链)	NS3-P65	AYRAGGTCTTTGTCCAC	胺基	17	31
K80	NS3-P32	AATGTRGACAAAGATCTYG	胺基	19	32
						K80(反链)	NS3-P55	CRAGGTCTTTGTCTACITT	胺基	19	33
K80(反链)	NS3-P69	CAAGGTCCTTGTCYACR	胺基	17	34
						Q80(反链)	NS3-P57	CRAGGTCTTGGTCYAC	胺基	16	35
Q80	NS3-P20	AAYGTRGACCAAGACCT	胺基	17	36
						Q80	NS3-P30	CCAAYGTRGATCAAGACCT	胺基	19	37
Q80	NS3-P21	AAYGTRGATCAAGACCT	胺基	17	38
						Q80	NS3-P31	CCAAYGTRGACCAGGACCT	胺基	19	39
Q80	NS3-P22	AAYGTRGACCAGGACCT	胺基	17	40

Y＝嘧啶(C/T)；R＝嘌呤(A/G)；W＝(A/T)；I＝肌苷

在一个实施例中，可分开使用包含序列号31-40的探针以检测HCV亚型1a中存在的个別NS3-K80或NS3-Q80多态性。

在一个实施例中，可以在一个或多个组別中共同使用两个或多个包含序列号31-40的探针，以检测NS3-K80和NS3-Q80的多态性。在另一个实施例中，可以在一个或多个组別中使用一个或共同使用多个包含序列号31-34的探针，以检测NS3-K80的多态性。在另一个实施例中，可以在一个或多个组別中使用一个或共同使用多个包含序列号35-40的探针，以检测NS3基因中的NS3-Q80的多态性。

在一个实施例中，包含序列号29-30的引物可以与两个或多个包含序列号1-7和23-24序列的引物共同使用，以产生特定于HCV基因型1的扩增子。在另一个实施例中，可以在一个或多个组別中使用一个或共同使用多个包含序列号8-22、25-28和31-40的探针,以检测或区分HCV基因型1的各种亚型或株系。

HCV的通用检测和鉴定

第4组：HCV的通用检测

在一个实施例中，本发明提供对应所有HCV的通用探针，可以捕获HCV族群的通用或共有核酸。通过使用通用探针，本发明可以检测样品中是否存在HCV，可作为HCV感染的快速及初步筛选。

如上所述，每个紧密相关的HCV亚型在其核苷酸序列上有大约20-25％的差异，而不同基因型之间则有30％以上的差异。本发明比较并分析了HCV族群品种间的共有和可变性核酸序列，并设计了足以检测大部分HCV品种的引物和探针。经过精心设计并严紧控制的实验，本发明的通用引物和探针能够检测并识别众多不同的HCV物种，并且不会与人类基因组產生交叉反应，从而保证一个检测的特异性及准确度。

在一个实施例中，本发明结合品种特异性探针和通用探针，以确定所测样品是否包含HCV核酸，以及相关病原体属于HCV基因型1、2、3、4、5或6,或是其他已知、未知或未分类的基因型、亚型或株系。

在一个实施例中，本发明的通用探针包含序列号41-43，并能够与大部分HCV的5’-UTR结合,从而允许检测和确认由任何一种HCV基因型、亚型或株系引起的HCV感染。检索工具BLAST的检索结果表明本发明的通用探针可以检测众多HCV亚型和株系。

通用探针

在一个实施例中，使用一个或多个包含序列号41-43的探针，可检测是否存在HCV的核酸。在另一个实施例中，可在同一阵列位置上共同使用包含序列号41-43的探针，以通用检测HCV核酸。共同使用序列号41-43的三个探针可以涵盖来自绝大多数已知HCV物种的核酸，从而大大提高检测的灵敏度。此外，使用品种特异性探针的方法或现有的基因型分析方法(例如实时PCR)一般依赖目标序列与用來检测目标序列的寡核苷酸之间的高度互补性。如果HCV品种是新出现的或者是高度突变的，這些方法或未能检测出來,导致假阴性的情況。本发明的通用检测系统则能有效地降低假阴性的发生率。

如上所述，可以选择并结合使用本发明特定的引物和探针，以进行特定的基因型分析。例如，如图1中所示，可同时使用序列号8-22的品种特异性探针和序列号41-43的通用探针，以检测HCV基因型1-6及HCV基因型1-6以外的HCV基因型。

在另一个实施例中，如图6中所示，可在阵列中共同使用序列号8-22,25-28和31-40的品种特异性探针以及序列号41-43的通用探针，以检测HCV基因型1-6及HCV基因型1-6以外的HCV基因型，并进一步识别HCV亚型1a中NS3-K80和NS3-Q80的多态性。

本发明中所示阵列格式仅用于说明性目的。本领域技术人员可根据测试的实际需要，调整杂交方案并增加其他阵列位置。

以下为用于设计本发明的引物和探针的某些基因组序列。

5’-非翻译区(5’-UTR)

下划线：引物序列；粗体：品种特异性探针序列；灰色和下划线：通用探针序列

a.HCV基因型1a[基因库：EU155310.2]

(序列号44)

[引物：HCV-C-1F,HCV-C-10R,HCV-C-6F,HCV-C-6R；探针:P118,P43,P29；通用探针:P113]

b.HCV基因型1b[基因库：AB049090.1]

(序列号45)

[引物:HCV-C-1F,HCV-C-10R,HCV-C-6F,HCV-C-7R；探针：P118,P29；通用探针:P113]

c.HCV基因型2a[基因库：AB047639.1]

(序列号46)

[引物:HCV-C-1F,HCV-C-10R,HCV-C-6F,HCV-C-8R；探针:P55,P102；通用探针:P113]

d.HCV基因型3a[基因库：D28917.1]

(序列号47)

[引物:HCV-C-1F,HCV-C-10R,HCV-C-6F,HCV-C-9R；探针:P13,P110；通用探针:P114]

e.HCV基因型4a[基因库：D1418782.1]

(序列号48)

[引物:HCV-C-1F,HCV-C-10R,HCV-C-6F,HCV-C-9R；探针:P29,P14；通用探针:P113]

f.HCV基因型5a[基因库：AF064490.1]

(序列号49)

[引物:HCV-C-1F,HCV-C-10R,HCV-C-6F,HCV-C-7R；探针:P23(负链),P60；通用探针:P113]

g.HCV基因型6a[基因库：AY859526.1]

(序列号50)

[引物:HCV-C-1F,HCV-C-10R,HCV-C-6F,HCV-C-9R；探针:P118,P28；通用探针:P113]

h.HCV基因型6a[基因库：HQ639936.1]

(序列号51)

[引物:HCV-C-1F,HCV-C-6F,HCV-C-9R；探针:P28；通用探针:P117]

i.HCV基因型6g[基因库：D63822.1]

(序列号52)

[引物:HCV-C-1F,HCV-C-10R,HCV-C-6F,HCV-C-7R；探针:P118,P125；通用探针:P113]

NS5B区

下划线：引物序列；粗线：品种特异性探针序列

(i)HCV亚型1a[基因库：KP668776.1]

(序列号53)

[引物:HCV-NS5B-3F,HCV-NS5B-3R；探针:NS5B-P25]

(i)HCV亚型1b[基因库:AB989387.1]

(序列号54)

[引物:HCV-NS5B-3F,HCV-NS5B-3R；探针:NS5B-P15]

NS3区

下划线：引物序列；粗线：类型特异性探针序列；灰色和粗线：多态性区域

(a)HCV亚型1a,K80[基因库:KP668008.1]

ACCATCGCATCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCAATGGGCTGGCCCGCTCCTCAAGGTTCCCGCTCATTGACACCCTGCACCTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACG AGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGAGGTGATAGCAGGGGT

(序列号55)

[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探针:NS3-P65]

(b)HCV亚型1a,K80[基因库:KJ682984.1]

ACCATCGCATCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCTGGGCTGGCCCGCTCCTCAAGGTTCCCGCTCATTGACACCCTGCACCTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACG AGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGAGGTGATAGCAGGGGT

(序列号56)

[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探针:NS3-P32]

(c)HCV亚型1a,K80[基因库:KM591981.1]

(序列号57)

[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探针:NS3-P55]

(d)HCV亚型1a,K80[基因库:KM591978.1]

(序列号58)

[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探针:NS3-P69]

(e)HCV亚型1a,Q80[基因库:KP667530.1]

ACCATCGCATCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCAATTGGGCTGGCCCGCTCCTCAAGGTTCCCGCTCATTGACACCCTGCACCTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACG AGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGAGGTGATAGCAGGGGT

(序列号59)

[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探针:NS3-P57]

(f)HCV亚型1a,Q80[基因库:KP668635.1]

ACCATCGCATCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCTGTGGGCTGGCCCGCTCCTCAAGGTTCCCGCTCATTGACACCCTGCACCTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACG AGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGAGGTGATAGCAGGGGTAGGTCCTGGTCNACNTT

(序列号60)

[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探针:NS3-P20]

(g)HCV亚型1a,Q80[基因库:KM591971.1]

ACCATCGCATCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATATGTGGGCTGGCCCGCTCCTCAAGGTTCCCGCTCATTGACACCCTGCACCTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACG AGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGAGGTGATAGCAGGGGT

(序列号61)

[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探针:NS3-P30]

(h)HCV亚型1a,Q80[基因库:KP667508.1]

(序列号62)

[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探针:NS3-P21]

(i)HCV亚型1a,Q80[基因库:KP668211.1]

(序列号63)

[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探针:NS3-P31]

(j)HCV亚型1a,Q80[基因库:KP667454.1]

(序列号64)

[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探针:NS3-P22]

质量控制和阵列设计

阳性对照(Positive Control-PC)和阴性对照(Negative Control-NTC)在每次检测中是很重要的。对于扩增，需要阳性对照(PC)来证明扩增反应的效率和特异性，亦需要阴性对照(NTC)来确定扩增试剂是否被污染。对于杂交，需要阳性对照(PC)和阴性对照(NTC)来确定成功的信号显影。

在一个实施例中，本发明包含一种内部扩增对照(InternalAmplification Control-IAC)和杂交对照(Hybridization Control-HC)，以监测扩增和杂交反应。这对于正确地解释结果是很重要的，同时亦可以确保结果的可靠性和准确性。

本领域技术人员可改编阵列格式以增加更多的孔，从而快速且廉价地分析更大数量的核苷酸序列。可以实践本发明的阵列可以采取任何格式，例如线性格式或“nxm”格式。

根据测定的实际需要，可以将同一类型的探针固定在两个或多个阵列位置上以同时进行两个或以上同样的检测。另一方面，不同类型的探针可以被固定在相同的阵列位置上以同时检测不同的特定目标。

图1的上部份显示了本发明阵列格式的一个实施例，其中品种特异性探针和通用探针被固定同一个阵列上，以同时检测个别HCV品种及HCV族群。

在一个实施例中，一个或多个探针被固定在相同的阵列位置上，以共同地检测一个或多个HCV基因型。例如，如图1的下图中所示，探针P118(序列号9)和P137(序列号10)被放在相同的阵列位置C1上，以共同HCV基因型1和6。本技术领域的技术人员可以将本发明的探针划分成不同组合，以进行不同的检测。

本发明的方法可以同时检测特定的HCV品种和HCV族群.因此,除了检测样品是否感染HCV以及鉴定HCV基因型1-6之外，本发明还可以确定患者是否被未知或未发现的HCV基因型、亚型或株系感染。在一个实施例中，本发明的通用探针已被证实能够在血清和血浆样品中检测超过90％的流行性HCV感染。

与目前相大部分旨在检测已知HCV品种的方法相比，本发明的优势在于能够检测HCV的共同核酸(即HCV族群)，进而提供了一种具有更高覆盖率的检测方法。

图1-2显示了本发明所述的阵列格式的一个实施例以及其预期结果。如阵列位置U、IAC和HC出现阳性信号，但不存在于其他品种特异性阵列位置中，则表示样品包含来自未知的HCV基因型或未被品种特异性探针涵盖的HCV基因型的核酸。

内部扩增对照(Internal Amplification Control-IAC)

内部扩增对照(IAC)可以用来监测扩增过程或作为一个内部对照以测试扩增反应是否存在抑制扩增反应的物质。用来设置内部扩增对照(IAC)的核酸模板包括并不涵盖人类或HCV基因组的人工序列，或者在测试样品中并不存在的人工序列，从而确保测试样品的质量或数量不会影响IAC的测定结果。例如，可以将IAC核酸模板和引物添加到样品中，从而在扩增反应中同时制造目标核酸的扩增子和内部对照的扩增子。然后，将对应IAC序列的检测试剂放在阵列或膜上的IAC区中，以检测内部对照扩增子的存在。

IAC信号出现表示扩增反应成功。IAC信号和测试样品信号不存在时则表示抑制扩增反应的物质或存在并阻碍扩增反应的正常运作。IAC亦可以用于监测扩增反应的效率。

另外，IAC信号的强度可以用来显示是随后的杂交和信号显影步骤是否成功或充分。IAC信号太弱可能表示杂交和/或信号显影的程序不佳，继而需要调整杂交条件或更换信号显影试剂。

在一个实施例中，IAC引物包含序列号65-66以扩增IAC序列，以及包含序列号67的探针以检测IAC序列，所述IAC引物及探针对应包含序列号68的IAC序列。

在另一个实施例中，其他不与人类和HCV基因组出现交叉反应的其他核酸序列亦可被设计并与本发明的引物和探针结合使用。

内部扩增对照(IAC)引物和探针

目标	引物ID	引物序列(5'到3')	5'修饰	长度	序列号
						IAC	IAC-R-F2	CGAGTTCCCGCCCATAACC	-	19	65
IAC	IAC-R-R2	GGAAGTTGCAACGCCGTCC	生物素	19	66

目标	探针ID	探针序列(5'到3')	5'修饰	长度	序列号
						IAC	IAC-R-P2	CTCGAATGCCTCGTATCAT	胺基	19	67

IAC克隆序列(在载体pUC57中克隆)(下划线＝引物序列；粗体＝探针序列)(序列号68)：

杂交对照(Hybridization Control-HC)

本发明亦可在测试阵列加入杂交对照(HC)，以验证信号显影的过程。在一个实施例中，杂交对照(HC)包含与信号显影系统兼容的分子或试剂(例如酶结合物)，用来产生阳性信号。HC信号不存在时可能表示信号显影试剂有问题，或者信号显影程序不适当。

本发明可通过设置一个或多个阳性对照(Positive control,PC)和阴性对照(Negative control,NTC)以验证测试结果。阳性对照(PC)由可以与任何非IAC引物和探针发生反应并产生阳性信号的核酸模板设置,用来确保测定程序适当。阴性对照(NTC)则不含有任何核酸,以确定扩增和杂交试剂有否被污染。

阳性对照(PC)

在一个实施例中，一个来自HCV品种的核酸，例如HCV亚型1a可被用作阳性克隆以设置阳性对照(PC)。在阳性对照中,所测试的为阳性克隆而非测试样品。

在一个实施例中，阳性克隆对应HCV亚型1a 5’-UTR的DNA,并包含序列号69的DNA，所述序列号69的DNA被克隆到载体pUC57中。在一个实施例中，阳性克隆能够被包含序列号1-2和6-7的引物扩增，并可以被包含序列号9和11的品种特异性探针以及包含序列号41的通用探针检测。

阳性对照克隆序列(在载体pUC57中)(下划线：引物序列；粗体：品种特异性探针序列；灰体和下划线：通用探针序列)(序列号69)：

[引物:HCV-C-1F,HCV-C-10R,HCV-C-6F,HCV-C-6R；探针:P118,P29；通用探针:P113]

如果测试程序正常，阳性信号应出现在相应的阵列位置上。例如，如图2中所示，样品“阳性对照”应在阵列位置B1(HCV 1)、C1(HCV 1/6)、U、IAC和HC显示阳性信号，这表示测试程序正常。

在另一个实施例中，阳性对照是一个对应于其他已知HCV物种其5’-UTR的DNA。本技术领域的技术人员可以设计其他兼容的阳性对照系统与本发明结合使用。

阴性对照(NTC)

在一个实施例中，可以将来自患者的核酸换成合适的缓冲液，以设置阴性对照(NTC)。由于不存有任何测试样品/核酸或阳性克隆，阴性对照(NTC)预期只产生IAC和HC信号。例如，如图2中所示，样品“阴性对照”只显示IAC和HC信号。如阴性对照(NTC)中存在IAC和HC信号以外的信号，则可能显示试剂已被污染。

本发明的应用

本发明提供一系列专门设计的核酸引物和探针，可以与逆转录、PCR扩增法和导流杂交技术相兼容,并可以快速及灵敏地检测、辨认或区分各种HCV基因型、亚型和株系。

在一个实施例中，本发明提供一种用来检测、辨认或区分HCV或来自HCV的核酸的方法和试剂盒。

在一个实施例中，本发明提供一种检测、辨认或区分各种HCV基因型、亚型和株系的方法和试剂盒。在一个实施例中，本发明的方法和测试剂可以检测或鉴定HCV基因型1、2、3、4、5和6，或者区分这些HCV物种。在一个实施例中，本发明可以检测其他已知或未知的HCV基因型、亚型或株系。

在一个实施例中，本发明可以检测或鉴定HCV基因型1、2、3、4、5和6的5’端的非翻译区(5’-untranslated region,5’-UTR)，或者其他已知或未知HCV基因型、亚型或株系的5’-UTR.

在一个实施例中，本发明所述的探针以表1及图1的下图所示的阵列格式排列，或以其他阵列格式排列。

表1-本发明的一种阵列格式

阵列位置	序列号	探针ID
			B1	8	P43
C1	9,10	P118,P137
			D1	11	P29
E1	12	P55
			F1	13	P102
B3	17,18	P14,P71
			C3	14,15	P28,P110
D3	16	P13
			E3	18,20	P23,P50
F3	22	P125
			E4	20,21	P50,P60
U(B5)	41,42,43	P113,P114,P117
			IAC(E5)	67	IAC‐R‐P2
HC(F5)	/	/

在一个实施例中，本发明的引物和探针用于检测和区分HCV亚型1a和1b。在另一个实施例中，本发明的引物和探针用于检测和区分HCV亚型1a的NS3基因中K80和Q80多态性。

图6-7显示了本发明的阵列格式的另一种实施例，以及其预期结果。如阳性信号出现在阵列位置U、IAC和HC但不存在于任何对应HCV品种的阵列位置上，则可能表示样品包含来自未知HCV基因型或未被品种特异性探针涵盖的HCV基因型的核酸。

在一个实施例中，本发明的探针以表2及图6的上图所示的阵列格式排列。图7显示数个HCV基因型所得的预期阵列结果。

表2-本发明的一种阵列格式

在一个实施例中，本发明可与逆转录、PCR扩增法和导流杂交技术结合使用，以检测、辨认或区分各种HCV。本发明不需要分开逆转录及PCR扩增法(即不需使用两步法RT-PCR),亦不需使用需时较长和繁琐程序的杂交设备。本发明能够更快速检测来自样品和人类标本的HCV及提高检测的灵敏度和准确性，有利于管理和治疗HCV感染者。

在一个实施例中，本发明提供一种方法以检测样品是否存在丙型肝炎病毒(HCV)的一个或多个核酸序列。此方法包含以下步骤：

a)获得一个包含模板核酸的样品；

b)用引物从模板核酸扩增一个或多个选定的核酸，从而得到目标扩增产物；以及

c)目标扩增产物与固定的寡核苷酸探针杂交，其中获得的杂交结果显示样品是否存在所述核酸序列。

在一个实施例中，本发明提供一种方法以检测一名受试者或一个样品中是否存在丙型肝炎病毒(HCV)。此方法包含以下步骤：

a)获得一个包含模板核酸的样品；

c)目标扩增产物与固定的寡核苷酸探针杂交，其中获得的杂交结果显示受试者或样品中是否存在丙型肝炎病毒(HCV)。

在一个实施例中，本发明提供一种方法以区分受试者或样品中的丙型肝炎病毒(HCV)，其中所述HCV具有的基因型选自基因型1、2、3、4、5或6。此方法包含以下步骤：

a)获得一个包含模板核酸的样品；

c)目标扩增产物与固定的寡核苷酸探针杂交，其中获得的杂交结果显示受试者或样品中的丙型肝炎病毒(HCV)的基因型。

在一个实施例中，本发明提供一种方法以区分受试者或样品中的丙型肝炎病毒(HCV)的亚型1a和1b。此方法包含以下步骤：

a)获得一个包含模板核酸的样品；

c)目标扩增产物与固定的寡核苷酸探针杂交，其中获得的杂交结果显示受试者或样品中丙型肝炎病毒(HCV)的基因型。

在一个实施例中，本发明提供一种方法以检测受试者或样品中丙型肝炎病毒(HCV)的非结构基因NS3的多态性。此方法包含以下步骤：

a)获得一个包含模板核酸的样品；

c)目标扩增产物与固定的寡核苷酸探针杂交，其中获得的杂交结果显示受试者或样品中丙型肝炎病毒(HCV)NS3基因的多态性。

在一个实施例中，本发明提供一种方法以确定受试者是否被HCV感染。在另一个实施例中，本发明提供一种方法，确定受试者是否被一种或多种HCV类型感染。

在一个实施例中，本发明提供一种方法以评估HCV感染者对治疗的反应。

在一个实施例中，本发明提供一种方法以确定受试者的HCV感染是否复发。

在一个实施例中，本发明提供一种方法以检测样品中是否存在丙型肝炎病毒(HCV)的核酸。所述方法包含以下步骤：

a)获得一个包含模板核酸的样品；

b)使用兩个或多个包含选自序列号为1-7的引物扩增模板核酸，从而得到目标扩增产物；以及

c)将扩增产物与一个或多个包含选自序列号8-22和41-43的寡核苷酸探针杂交，从而獲得杂交结果。其中，包含序列号8-22的寡核苷酸探针能够捕获来自一个或多个HCV基因型的核酸，包含序列号41-43的寡核苷酸探针能够捕获来自HCV的共有核酸。所得的杂交结果显示样品中是否存在丙型肝炎病毒(HCV)的核酸。

在一个实施例中，本发明所述的丙型肝炎病毒(HCV)基因型可以是HCV基因型1、2、3、4、5或6。

在一个实施例中，本发明所述的检测HCV方法可以额外使用包含序列号23-24的引物及序列号25-28的探针来检测HCV亚型1a和HCV亚型1b的核酸。

在一个实施例中，本发明所述的检测HCV方法可以额外使用包含序列号29-30的引物及序列号31-40的探针来检测丙型肝炎病毒非结构基因NS3的多态性。

在一个实施例中，本发明所述的检测HCV方法进一步包含一个在样品中加入一内部对照的步骤,以及使用内部对照引物和内部对照探针以扩增和杂交所述内部对照的步骤,其中所述内部对照不包含HCV的核酸序列。

在一个实施例中，本发明所述的内部对照包含序列号68，内部对照引物包含序列号65-66，内部对照探针包含序列号67。

在一个实施例中，本发明所述的引物和探针可以与一种或多种作用剂结合,所述作用剂选自生物素、胺基或信号生成标记。

在一个实施例中，本发明所述的检测HCV方法的扩增步骤包括逆转录和扩增过程。

在一个实施例中，本发明所述的检测HCV方法使用导流杂交技术进行杂交步骤。

在一个实施例中，本发明提供一种方法以检测样品中丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3的多态性。所述方法包含以下步骤：

a)获得一个包含模板核酸的样品；

b)使用包含序列号29-30的引物扩增模板核酸，从而得到目标扩增产物；以及

c)将扩增产物与包含序列号31-40的寡核苷酸探针杂交，从而獲得杂交结果。其中，包含序列号31-40的寡核苷酸探针能够检测编码NS3蛋白中赖氨酸-80的核苷酸序列,包含序列号35-40的寡核苷酸探针能够检测编码NS3蛋白中谷氨酰胺-80的核苷酸序列。所得的杂交结果显示样品中丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3的多态性。

在一个实施例中，本发明所述的检测HCV NS3多态性的方法可以额外使用包含序列号23-24的引物和序列号25-28的探针，以检测HCV亚型1a和HCV亚型1b的核酸。

在一个实施例中，本发明所述的检测HCV NS3多态性的方法进一步包含一个在样品中加入一内部对照的步骤,以及使用内部对照引物和内部对照探针以扩增和杂交所述内部对照的步骤,其中所述内部对照不包含HCV的核酸序列。

在一个实施例中，本发明提供一种使用寡核苷酸以检测样品中来自丙型肝炎病毒(HCV)的核酸的应用，所述寡核苷酸包含一个或多个选自序列号为1-7的序列，以及一个或多个选自序列号为8-22和41-43的序列。在一个实施例中，包含序列号8-22的寡核苷酸能够捕获来自一个或多个HCV基因型的核酸，以及包含序列号41-43的寡核苷酸能够捕获HCV的共有核酸。

在一个实施例中，本发明所述的应用可以额外使用包含序列号23-28的寡核苷酸来检测HCV亚型1a和HCV亚型1b的核酸。

在一个实施例中，本发明所述的应用可以额外使用包含序列号29-40的寡核苷酸来检测丙型肝炎病毒非结构基因NS3的多态性。

在一个实施例中，本发明所述的应用中的寡核苷酸进一步包含一内部对照序列，和用于扩增和杂交所述内部对照序列的内部对照引物和内部对照探针,所述内部对照序列不包含HCV的核酸序列。

在一个实施例中，本发明所述的内部对照序列包含序列号为68的序列，所述内部对照引物包含序列号为65-66的序列，以及所述内部对照探针包含序列号为67的序列。

在一个实施例中，本发明提供一种检测样品中丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3的多态性的应用,所述的寡核苷酸包含序列号为29-30和31-40的序列。在一个实施例中，包含序列号31-34检测编码NS3蛋白中赖氨酸-80的核苷酸序列，以及包含序列号35-40的寡核苷酸能够检测编码NS3蛋白中谷氨酰胺-80的核苷酸序列。

在一个实施例中，本发明提供一个用来检测样品是否存在丙型肝炎病毒(HCV)的测试剂,测试剂包含序列号为1-7，8-22和41-43的寡核苷酸。

在一个实施例中，本发明的测试剂进一步包含序列号为23-24的寡核苷酸，和一个或多个包含选自序列号25-28的寡核苷酸。

在一个实施例中，本发明的测试剂进一步包含序列号为29-30的寡核苷酸，和一个或多个包含选自序列号31-40的寡核苷酸。

在一个实施例中，本发明的测试剂进一步包含对应于内部对照序列的内部对照引物和内部对照探针，所述内部对照序列不包含HCV核酸序列的核酸。

在一个实施例中，本发明的测试剂的内部对照引物包含序列号为65-66的序列，所述内部对照探针包含序列号为67的序列，所述内部对照序列包含序列号为68的序列。

在一个实施例中，本发明的测试剂的一个或多个寡核苷酸被修饰或与一个或多个作用剂结合,所述作用剂选自生物素、胺基或信号生成标记。

在一个实施例中，本发明提供一个用来检测(HCV)非结构基因NS3的多态性的测试剂,测试剂包含序列号为29-30的寡核苷酸，和一个或多个包含选自序列号31-40的寡核苷酸。

通过引用以下的实验细节，可以更好地理解本发明。然而，本领域技术人员应理解所提供的实施例仅作为说明作用，而非限制本发明的范围。本发明的范围将由随后的权利要求所界定。

在本申请中的，引用了不同的参考文献或出版物。这些参考或出版物的全文和公开都结合到本申请中,从而更全面地描述本发明的情况。应当指出的是，过渡语“包含”与‘包括’﹑‘含有’或‘以…为特征’是同义的，是包括性或开放式的，当中并不排除有另外未列举的元素或方法步骤。

附图说明

图1显示了一个用于检测、辨认或区分HCV基因型1-6的检测阵列,其中固定有本发明的通用探针和对应特定HCV的品种探针。图的上部分为阵列中每个测定位置的名称。图的下部分为每个测定位置中所用的寡核苷酸探针。

图2显示了本发明的阵列的一个实施例，以及测试各种HCV基因型和对照组的预期测试结果。

图3显示了测试8个载有HCV基因型1-6的核苷酸的合成克隆的实际测试结果。其中提供了预期结果以作参考。

图4显示了测试本发明其中一个实施例其检测极限的实际结果,并提供预期结果以作参考。该实验测试了4个载有HCV基因型1-4的核苷酸的合成克隆其连续稀释样本，其中浓度范围为2.5x10²IU/mL到2.3x10⁴IU/mL。

图5显示了测试35个临床样品的实际测试结果。其中的实验结果经实时PCR和直接测序法验证。

图6显示了一个用于鉴定HCV基因型1-6和HCV亚型1a的NS3 Q80K多态性的检测阵列,其中固定有本发明的品种探针和通用探针。图的上部分为每个测定位置中所用的寡核苷酸探针。图的下部分为阵列中每个测定位置的名称。

图7显示了本发明的一个阵列，以及测试展现NS3 Q80K多态性的HCV亚型1a和1b的预期测试结果。

图8显示了测试载有相应于HCV亚型1a的NS3和NS5B基因的核酸的合成克隆所得的实际测试结果。克隆1-6载有NS3基因(K80)的自然序列，克隆7-10则载有包含NS3 Q80K多态性的序列。

图9显示了测试本发明的引物和探针其交叉反应的实验结果。该实验测试了一个阴性对照以及9个载有HCV基因型1-6、HCV亚型1a和1b或人类DNA核酸的合成克隆。

具体实施方式

实施例1

核算扩增

本实施例描述本发明的一个实施方案，其中本发明与逆转录和PCR扩增技术结合使用。

RNA制备

本发明使用的RNA可以使用任何市售或适当的方法或试剂盒，从样品中提取或制备。

本发明的样品可以是任何类型的样品，包括来自任何受试者或来源的核酸。在一个实施例中，样品是生物样品，如血液、血清、血浆、唾液、痰、精液、淋巴液或其他体液。在另一个实施例中，样品包括已从生物样品中粗略纯化的核酸。

一步法RT-PCR扩增(RT-PCR)

在一个实施例中，可使用以下方案设置RT-PCR：

反应混合液

成分	容量(μL)
		HCV PCR预混合	13.4
IAC	0.1
		酶混合液	1.5
RNA模板	多达10.0*
		无核酸酶水	可变
总计	25.0

温度设置

阶段	步骤	温度(℃)	时间
				放置	逆转录	50	30分钟
放置	初始变性	95	15分钟
					变性	94	30秒
42个循环	退火	61	30秒
					延伸	72	30秒
放置	最终延伸	72	10分钟
				放置	最终放置	4	∞

在一个实施例中，使用RNA模板的阳性克隆作为阳性对照。在另一个实施例中，使用水或ddH2O而非RNA模板，来设置阴性对照(NTC)。

任何内部或市售系统，包括但不限于适用于提取RNA、对目标核酸进行的处理、逆转录和/或PCR扩增的酶、试剂、材料和设备，均可以与本发明结合使用。本技术领域的普通技术人员可以调整任何相关参数来实践本发明。

实施例2

快速导流杂交

本实施例描述本发明的一个实施方案，其中本发明与导流杂交技术结合使用。

在一个实施例中，检测、辨認或区分HCV的方法包含以下步骤：

a)将含有目标核酸的溶液变性并与膜接触；

b)用洗涤溶液洗涤膜；以及

c)显色，并以目视检测或光谱测量。

一般而言，与本发明一起使用的检测试剂可以是任何已知可用于检测核酸的试剂。检测试剂包括但不限于酶、抗体、蛋白质、荧光化学试剂、发色团和视觉染料。在一个实施例中，目标核酸在RT-PCR扩增期间被生物素标记(例如使用生物素标记的目标特异性引物)，并被链霉亲和素辣根过氧化物酶組成的交联酶捕获，从而在阵列上产生信号，指示目标核酸的存在。对于定量测量，可以使用扫描仪/光谱成像仪和成像软件来执行分析。

在一个实施例中，本发明使用一步法RT-PCR的杂交过程，其中目标核酸被荧光标签、量子点、胶体金颗粒或其他适用标记物标记，因此不需要使用与酶交联的底物进行显色步骤。这些设计可以使技术人员在较短时间内并使用较少量的试剂完成整个杂交过程。对于定量测量，可以在洗涤步骤之后，立即使用扫描仪/光谱成像仪分析经荧光染料标记的目标核酸。

本发明可使用任何能固定核酸的膜。上述的膜包括但不限于硝化纤维素、尼龙和Nytran^TM。本技术领域的技术人员可以改编阵列格式以增加更多的孔，以快速且廉价地分析更大量的核苷酸序列。

材料和方法

在一个实施例中，可使用以下方案设置杂交：

杂交前准备

(1)使用前，将杂交溶液(如2×SSC或任何市售的溶液/产品+0.05％tween 20)在水浴中预热至49℃。如果封闭溶液中有沉淀物，将封闭溶液在49℃下温育直至沉淀溶解。在整个杂交过程中保持温度在49℃，以保持设定的严格性。

(2)配置显色溶液,例如將一片NBT/BCIP片剂溶解在10毫升的显色溶液或PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)中。稀释好的显色溶液避光保存，未使用的溶液储存在4℃。

(3)将杂交溶液(2×SSC+0.05％ tween 20)平衡至室温。

(4)将所有含核酸的样品在95℃下加热5分钟以变性，然后立即放在冰上冷却至少两分钟。

杂交设置

对于导流杂交，技术人员可以使用美国专利号6,020,187中描述的直接导流设备或者横向流动设备。接通杂交装置电源，加入蒸馏水以洗涤杂交室。

将已固定有探针的膜放入杂交室內并用盖子或其他方法固定膜。

已扩增核酸产物的杂交

加入500μL预热的杂交溶液覆盖全膜，以进行预杂交。孵育至少2分钟，盖上盖子，防止在预杂交过程中热量散失。确保温度在设定值达到平衡。

加入500μL预热的杂交溶液至每个变性的核酸的样品中,然后将核酸样品加到指定的孔中。将每个核酸样品输送到膜表面，直到膜被完全覆盖，在49℃下温育5分钟，然后让核酸样品在整个膜上流动。杂交通常在5-30秒内完成。5分钟的温育时间是为了保证DNA样品的温度达到设定的温度。用500μL的杂交溶液洗膜3次。

显色

温度设定为25℃，将500μL封闭溶液分散在膜上，并温育5分钟，然后抽空溶液。

关闭泵，并加入500μL酶交联物。让膜静置8分钟。启动泵。

温度设定为36℃。用500μL溶液A或洗涤缓冲液如pH7.4的PBS缓冲液，彻底洗涤膜三次。

关闭泵，向每个孔中注入500μL封闭溶液，盖上盖子，温育1分钟，然后抽空溶液。

当温度达到36℃时，关闭泵，向每个孔中注入500μL检测溶液(例如NBT/BCIP溶液)。盖上盖子，温育5分钟，但是少于10分钟，或者直到显色。打开泵，移走检测溶液。

关闭泵，注入500μL停止溶液，并温育约1分钟。打开泵，移走停止溶液。用500μL dH2O漂洗膜一到两次

最好在一个小时以内，尽快检查结果。可以直接用肉眼观察，或者扫描图像以进行半定量检测(即通过样品之间的相对信号强度来定量)。

在一个实施例中，本发明一次处理众多样品，并需要大约4个小时完成整個基因型分析(从RNA制备到结果解释)，与传统基因分型技术相比，本发明是非常高产量且高效的。

结果解释和验证

在一个实施例中，本发明的探针被配置成如图1所示阵列格式，技术人员可以如下表3中的概述，辨认或区分各种不同的HCV基因型。只有当测试阵列上存在IAC和HC信号时，并且阴性对照(NTC)仅显示IAC和HC信号的情况下，测试结果才是有效的。

表3—本发明一个实施例的结果及解释

应指出的是，表3中所列结果解释只是说明性的，而非排他性的，也并不意味着限制本发明的其他可能出现的其他结果及解释。

在一个实施例中，本发明可以区分HCV亚型1a和1b，其中HCV亚型1a是通过品种特异性探针ID P43,P118和P29(序列号8,9和11)检测，而HCV亚型1b是通过品种特异性探针ID P118和P29(序列号9和11)检测。在另一个实施例中，还可以使用序列号25-26探针来检测HCV亚型1a，及使用序列号27-28引物来检测HCV亚型1b，从而提高检测的准确性和灵敏度。

在特殊的情况下，如果病毒核酸的拷贝数量非常高，极弱的信号可能会出现在不相关阵列位置上。例如，在高拷贝量的HCV基因型1、4或6中，可能会出现来自探针ID P50和P60(序列号20-21，阵列位置E4)的微弱信号；在高拷贝量的HCV基因型2中，可能会出现来自探针ID P23和P50(序列号19-20，阵列位置E3)的微弱信号；在高拷贝量的HCV基因型5中，可能会出现来自探针ID P118和P137(序列号9-10，阵列位置C1)的微弱信号；在高拷贝量的HCV基因型6中，可能会出现来自探针ID P14和P71(序列号17-18，阵列位置B3)的微弱信号。然而，与真正的阳性信号相比，这些非不相关的信号的强度通常是非常低的。因此，如果在上述情况下观察到一个极弱的不相关性信号，测试结果仍然是有效的。在这情况下，可以尝试稀释样品(例如稀释10倍)并重复测试，以证实结果。

实施例3

使用合成克隆的验证

本实施例说明使用本发明检测和辨认来自各种HCV基因型的核酸的一个实施方案。

本实施例使用戴有来自各种HCV基因型的5’-UTR相应序列的克隆以评估本发明所述引物和探针的特异性和灵敏度。

图3显示载有来自HCV基因型1、2、3、4、5或6的核酸序列的8个合成克隆的测试结果。使用本发明以扩增来自八个克隆的目标核酸。然后，按照上文所述的程序，将所生成的扩增产物与探针杂交。

测试结果显示，本发明能够扩增且检测来自全部8个克隆的目标核酸，并且与预期结果和验证对照组的结果一致。

图4显示载有来自HCV基因型1、2、3或4的核酸序列的4个合成克隆的测试结果。用缓冲液稀释克隆，并用本发明测试稀释物。在一个实施例中，制备克隆连续稀释液，浓度范围从最低2.5x10²IU/mL到最高2.3x10⁴IU/mL，以评估本发明的灵敏度。

图4的结果显示，本发明能够检测和鉴定目标核酸，核酸的检测极限低至2.5x10²IU/mL。

实施例4

临床样品的基因分型

本实施例说明使用本发明并采取图1阵列格式鉴定临床样品的HCV基因型的一个实施方案。

图5显示从被HCV基因型1、3或6感染的35份临床样品获得的测试结果。由于没有合适的临床样品，本实施例没有测试其他基因型。

使用直接测序方法可确认每个样品中HCV的基因型，直接测序方法的结果与本发明的测试结果相一致。本实施例亦使用实时PCR以评估每个样品中目标病毒RNA的数量，并以IU/ml表示。表4总结了测试所得的结果。

表4-来自35份临床样品的测试结果

*样品中病毒RNA量降至检测下限(LOD)以下。

本发明的品种特异性探针可以检测目标HCV的基因型，上述全部35个临床样品的检测结果均合符预期，并经直接测序结果证实。另一方面，阵列位置U(B5)上的通用探针可以在全部35个样品中检测HCV。另外，除了IAC和HC信号，也可以根据阳性对照(PC)(即使用来自HCV基因型1的克隆)的结果，以及的阴性对照(NTC)(即使用使用缓冲液)的结果(数据未在此提供)，以验证本测试的结果。

值得注意的是，被基因型6感染的样品10号在检测基因型4的阵列位置B3上观察到一个微弱信号。如上所述，在高拷贝数量的HCV基因型6中，可能会额外出现来自探针ID P14和P71(序列号17-18，阵列位置B3)的微弱不相关信号。如图5中所示，B3上的不相关信号非常弱，并不会影响测试结果的有效性。

实施例5

基因分型和基因亚型分型

本实施例说明了使用本发明的引物和探针鉴定HCV基因型1-6并区分HCV亚型1a和1b的一个实施方案。

在一个实施例中，本发明所述探针被设置成如图6所示阵列格式，技术人员可以如下表5中所述，辨认或区分各种HCV基因型。只有当测试阵列上存在IAC和HC信号时，并且阴性对照(NTC)仅显示IAC和HC信号的情况下，测试结果才是有效的。图7显示了阴性对照以及NS3-K80或NS3-Q80多态性的HCV亚型1a或1b的预期结果。

表5-本发明一个实施例的结果及解释(如图7所示)

图8显示载有对应于HCV亚型1a NS3和NS5B基因的核酸的10个合成克隆的结果。本发明用于扩增来自10个克隆的靶核酸。按照上文所述的程序，将所生成的扩增产物与探针杂交。测试结果显示，本发明能够检测在全部10个克隆中的目标NS5B基因、NS3-K80或NS3-Q80多态性，并且与预期结果和验证对照组的结果一致。表6总结了测试所得的结果。

表6-载有NS3基因K80或Q80的10个合成克隆的测试结果(如图8所示)(下划线为多态密码子)

克隆	基因型	克隆中的多态序列	序列号
				#1	K80	TGTGGACAAAGACCTTGT	70
#2	K80	CGTGGACAAAGACCTTGT	71
				#3	K80	AATGTAGACAAAGATCTTG	72
#4	K80	AATGTGGACAAAGATCTTG	73
				#5	K80	AATGTAGACAAAGACCTTG	74
#6	K80	AACGTAGACAAAGACCTCG	75
				#7	Q80	AATGTGGACCAAGACCT	76
#8	Q80	AATGTGGACCAGGACCT	77
				#9	Q80	CCAATGTAGATCAAGACCT	78
#10	Q80	CCAATGTGGATCAAGACCT	79

图9显示一个测试本发明的引物和探针其交叉反应性的实际实验结果。该实验测试了包含缓冲液的阴性对照，以及载有对应于HCV基因型1-6、HCV亚型1a和1b或者人类DNA的核酸的9个合成克隆。表7总结了测试所得结果。

表7-本发明的引物和探针的特异性

样品	基因型
		#1	HCV 1b,NS3-K80
#2	HCV 1b,NS3-Q80
		#3	HCV 2
#4	HCV 3
		#5	HCV 4
#6	HCV 5
		#7	HCV 6
#8	HCV 6
		#9	人类DNA
#10	阴性(NTC)

图9的结果显示，本发明的引物和探针并不会与人类核酸或非目标的核酸产生交叉反应，并且能够明确地及准确地鉴定HCV基因型，并与预期结果一致。

综上所述，本发明所测试的结果明确阐明，本发明的引物和探针可以在一个或多个组别中共同使用，以扩增和检测来自各种不同HCV基因型的核酸，并能快速、灵敏、及准确地区分HCV基因型。

Claims

1.一种使用寡核苷酸以检测样品中来自丙型肝炎病毒(HCV)的核酸的应用，所述寡核苷酸包含兩个或多个选自序列号为1-7的序列，和一个或多个选自序列号为8-22和41-43的序列，其中包含序列号8-22的寡核苷酸能够捕获来自一个或多个HCV基因型的核酸，以及包含序列号41-43的寡核苷酸能够捕获HCV的共有核酸。

2.权利要求1所述的应用，其中所述丙型肝炎病毒(HCV)的基因型选自基因型1、2、3、4、5或6。

3.权利要求1所述的应用，其中所述寡核苷酸进一步包含序列号为29-40的序列，所述包含序列号29-40的寡核苷酸用于检测丙型肝炎病毒(HCV)的非结构基因NS3的多态性。

4.一种使用寡核苷酸以检测样品中丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3的多态性的应用，所述的寡核苷酸包含序列号为29-30和31-40的序列，其中包含序列号31-34的寡核苷酸能够检测编码NS3蛋白中赖氨酸-80的核苷酸序列，包含序列号35-40的寡核苷酸能够检测编码NS3蛋白中谷氨酰胺-80的核苷酸序列。

5.权利要求1或4所述的应用，其中所述寡核苷酸进一步包含序列号为23-28的序列，所述包含序列号23-28的寡核苷酸用于检测HCV亚型1a和HCV亚型1b的核酸。

6.权利要求1或4所述的应用，其中所述寡核苷酸进一步包含一内部对照序列，以及用于扩增和杂交所述内部对照序列的内部控制引物和内部对照探针,所述内部对照序列不包含HCV的核酸序列。

7.权利要求6所述的应用，其中所述内部对照序列包含序列号为的序列，所述内部对照引物包含序列号65-66的序列，以及所述内部对照探针包含序列号为67的序列。

8.权利要求1或4所述的应用，其中所述寡核苷酸与一种或多种作用剂结合,所述作用剂选自生物素、胺基或信号生成标记。

9.一种检测样品是否存在丙型肝炎病毒(HCV)的测试剂,包含序列号为1-7，8-22和41-43的寡核苷酸。

10.权利要求9所述的测试剂,进一步包含序列号为29-30的寡核苷酸，和一个或多个包含选自序列号31-40的寡核苷酸。

11.一种检测样品中丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3的多态性的测试剂,包含序列号为29-30的寡核苷酸，和一个或多个包含选自序列号31-40的寡核苷酸。

12.权利要求9或11所述的测试剂,进一步包含序列号为23-24的寡核苷酸，和一个或多个包含选自序列号25-28的寡核苷酸。

13.权利要求9或11所述的测试剂,进一步包含一内部对照序列,以及对应于内部对照序列的内部对照引物和内部对照探针，所述内部对照序列不包含HCV核酸序列的核酸。

14.权利要求13所述的测试剂,其中所述内部对照引物包含序列号为65-66的序列，所述内部对照探针包含序列号为67的序列，以及所述内部对照序列包含序列号为68的序列。

15.权利要求9或11所述的测试剂,其中一个或多个所述寡核苷酸被修饰或与一个或多个作用剂结合,所述作用剂选自生物素、胺基或信号生成标记。