CN113614251A - Hcv检测 - Google Patents
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Abstract
描述了用于检测丙型肝炎病毒(HCV)核酸的方法。该方法可用于即时(POC)测试，并且提供了能够检测数种不同HCV基因型的快速测试。还描述了试剂盒、引物、探针、引物组、5寡核苷酸组和寡核苷酸，以及它们在所述方法中的用途。
Description
本发明涉及用于检测丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)核酸，特别是用于即时(point-of-care，POC)测试的方法，以及涉及试剂盒、引物、探针、引物组、寡核苷酸组和寡核苷酸，以及它们在所述方法中的用途。
丙型肝炎是主要影响肝的由丙型肝炎病毒(HCV)引起的感染性疾病。在最初感染期间，通常仅有轻微的症状或无症状。最初感染的那些中的约75％至85％中的肝中存在病毒。在慢性感染的早期通常无症状。然而，多年来，其经常导致肝病并且有时导致肝硬化。在一些情况下，患有肝硬化的那些将发生并发症，例如肝衰竭、肝癌、或食道和胃中的血管扩张。
HCV主要通过与静脉内药物使用、消毒不良的医学设备、健康护理中的针刺损伤和输血相关的血液与血液的接触进行传播。截至2015年，估计在全世界有1.43亿人(2％)感染了丙型肝炎(GBD 2015 Disease and Injury Incidence and Prevalence,Collaborators.(2016年10月8日).Lancet,388(10053):1545–1602)。其最常发生于非洲以及中亚和东亚。在2015年由于丙型肝炎导致发生了由于肝癌引起的约167,000例死亡和由于肝硬化引起的326,000例死亡(GBD 2015 Mortality and Causes of Death,Collaborators.(2016年10月8日).Lancet,388(10053):1459–1544)。没有针对丙型肝炎的疫苗。然而，随着强效且良好耐受的直接作用抗病毒药物组合的开发和批准，已彻底改变了HCV感染的治疗。在大多数患者群体中，这些治疗在施用8至24周之后产生超过95％的治愈率(Belperio,et al.,2017,Ann Intern Med 167,499–5045；Falade-Nwulia,et al,2017,Ann Intern Med 166,637–648)。
HCV是黄病毒科(family Flaviviridae)的包膜RNA病毒。HCV颗粒包含脂质膜包膜，其中嵌入了两种病毒包膜糖蛋白E1和E2。它们参与病毒附着并进入到细胞中。包膜内是包含病毒的RNA物质的二十面体核心。HCV具有由9,600个核苷酸碱基长的单一开放阅读框组成的正义单链RNA基因组。该单一开放阅读框被翻译以产生约3,000个氨基酸的单一蛋白质产物，然后该产物被细胞和病毒蛋白酶进一步加工成10个较小的蛋白质，其允许病毒在宿主细胞内复制或组装成成熟的病毒颗粒。在RNA的5’和3’端是非翻译区(non-translatedregion，NTR)，其不会翻译成蛋白质但对病毒RNA的翻译和复制却是重要的。
由丙型肝炎病毒制备的结构蛋白包含核心蛋白E1和E2。非结构(nonstructural，NS)蛋白包含NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。所述蛋白质沿基因组按以下顺序布置：
N端-核心-包膜
(E1)-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NSSA-NSSB-C端
。核心蛋白具有191个氨基酸。
已将HCV分类为7种主要基因型(1至7)和67种亚型(Smith et al.,2014(Hepatology 2014；59；318-327)。在完整基因组中基因型的核苷酸位点相差30至35％(Ohno et al.(2007),J Clin Microbiol.35(1):201–7)。基因型亚型的基因组组成中的差异通常为20至25％。亚型1a和1b在全世界均有发现，并且引起所有病例中的60％。
HCV的诊断是通过血液测试来寻找针对病毒或其RNA的抗体。美国FDA已批准了HCV检测的数种方法：
·丙型肝炎病毒编码抗原(抗HCV测定)：ABBOTT HCV EIA 2.0(AbbottLaboratories)；Chiron RIBA HCV 3.0条带免疫印迹测定(Chiron Corp)；ABBOTT PRISMHCV(Abbott Laboratories)；
·核酸测试：UltraQual HCV RT-PCR测定(国家遗传学研究所(NationalGenetics Institute))；COBAS AmpliScreen HCV测试(Roche Molecular Systems,Inc)；Procleix HIV-1/HCV测定(Gen-Probe,Inc)；Procleix Ultrio测定(Gen-Probe,Inc)；Procleix Ultrio Plus测定(Gen-Probe,Inc)；丙型肝炎病毒(HCV)逆转录(RT)聚合酶链反应(PCR)测定(BioLife Plasma Services,L.P.)；
·ELISA测试：Ortho HCV 3.0版本ELISA测试系统(Ortho-ClinicalDiagnostics,Inc)。
这些方法不适合用于难以接触(hard-to-reach)的群体和其中HCV感染普遍的低资源环境，因为它们是基于实验室的、耗时且成本高昂的。此外，基于抗体的测试可仅在感染之后通常6至12周检测HCV感染。因此，需要适合于用于难以接触的群体和低资源环境并且可在感染之后尽快检测HCV的快速测试。
本申请人已经认识到，可通过使用与HCV核心核酸序列(或其互补序列)的保守区域特异性杂交的核酸扩增引物来提供能够检测数种不同HCV基因型的快速POC核酸测试。
根据本发明，提供了用于确定样品是否包含HCV核酸的方法，其包括通过使用正向核酸扩增引物和反向核酸扩增引物进行等温扩增反应来扩增样品的核酸或扩增核酸来源于样品的核酸的核酸，其中每个核酸扩增引物与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列特异性地杂交。
HCV核心核酸序列示于图2中。
保守序列可通过使用工具例如BLAST、HMMER和Infernal进行同源性检索来鉴定。同源性检索工具可将单独核酸序列作为输入，或使用由已知相关序列的多序列比对生成的统计模型。统计模型(例如profile-HMM)和还并入了结构信息的RNA协方差模型在检索更远的相关序列时可以是有用的。然后将输入序列针对来自相关个体或其他物种的序列数据库进行比对。然后基于匹配碱基的数目和由比对生成的空位或缺失的数目对所得比对进行评分。可接受的保守性替换可使用替换矩阵例如PAM和BLOSUM来鉴定。假设高度评分的比对来自同源序列。然后可通过在广泛的系统发育范围内检测高度相似的同源物来推断序列的保守性。
任选地，不同HCV基因型之间保守的HCV核心核酸序列是对于每种HCV基因型1至6，包含至多2个错配/20个核苷酸的核酸序列。
任选地，不同HCV基因型之间保守的HCV核心核酸序列是对于每种HCV基因型1至6，具有同一性的核酸序列。
多序列比对可用于显现保守序列。CLUSTAL格式包含纯文本键以对所述比对的保守列进行注释，表示保守序列(*)、保守突变(:)、半保守突变(.)和非保守突变()。软件(例如MacVector)可用于进行多序列比对。
任选地，如果核酸扩增引物在严格条件下与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列杂交，则其与HCV核心核酸序列特异性地杂交。
杂交的严格性受条件例如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲剂组成的影响。通常，选择比特定序列在限定的离子强度和pH下的热解链点(Tm)低约30℃的低严格性条件。中等严格性条件是当温度低于Tm 20℃时，以及高严格性条件是当温度低于Tm 10℃时。Tm是在限定的离子强度和pH下的温度，此时50％的靶序列与完全匹配的引物或探针杂交。Tm取决于溶液条件以及探针的碱基组成和长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性地杂交。最大杂交率从Tm以下的约16℃至32℃获得。杂交溶液中存在单价阳离子降低了两条核酸链之间的静电排斥，从而促进了杂交体形成；该作用对于高至0.4M的钠浓度是可见的(对于更高的浓度，该作用可以忽略)。甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，其中每百分比甲酰胺降低了0.6℃至0.7℃，并且添加50％甲酰胺使得杂交在30℃至45℃下进行，尽管杂交率将降低。碱基对错配降低了双链体的杂交率和热稳定性。平均而言，并且对于大探针，Tm降低约1℃/％碱基错配。Tm可使用以下方程来计算，这取决于杂交体的类型：
1)DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl,Anal.Biochem.,138:267-284,1984)：
Tm＝81.5℃.+16.6xlog10[Na+]a+0.41x％[G/Cb]-500x[Lc]-1-0.61x％甲酰胺；
2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交体：
Tm＝79.8℃.+18.5log10[Na+]a+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc；
3)寡DNA或寡RNA杂交体：
对于<20个核苷酸：Tm＝2(ln)；
对于20至35个核苷酸：Tm＝22+1.46(In)；
a或针对其他单价阳离子，但仅在0.01至0.4M范围内准确。
b仅对30％至75％范围内的％GC准确。
cL＝碱基对中双链体的长度。
d寡，寡核苷酸；1n，＝引物的有效长度＝2×(G/C数目)+(NT数目)。
除杂交条件之外，杂交的特异性通常还取决于杂交之后洗涤的功能。为了去除由非特异性地杂交产生的背景，将样品用稀释盐溶液进行洗涤。这样的洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低以及洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件通常在杂交严格性或低于杂交严格性下进行。阳性杂交产生了为背景信号的至少两倍的信号。通常，用于核酸杂交测定或基因扩增检测程序的合适的严格条件如上所述。也可选择更严格或较不严格的条件。技术人员知晓在洗涤期间可以改变并且将维持或改变严格性条件的多种参数。
例如，针对长于50个核苷酸的DNA杂交体的典型严格条件(也称为高严格性杂交条件)涵盖在65℃下在1×SSC中或在42℃下在1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃下在0.3×SSC中洗涤。杂交体的长度是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸杂交时，杂交长度可通过将序列进行比对并鉴定本文中所述的保守区来确定。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可另外地包含5×Denhardt试剂、0.5至1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑鱼精子DNA、0.5％焦磷酸钠。
出于限定严格性水平的目的，可参考Sambrook et al.(2001)MolecularCloning:a laboratory manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,CSH,NewYork或者参考Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Ν.Υ.(1989年和年度更新)。
任选地，正向核酸引物包含AGACTGCTAGCCGAGTAG(SEQ ID NO：1)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
任选地，反向核酸引物包含GCTCATGATGCACGGTCTACGAGA(SEQ ID NO：2)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
与SEQ ID NO:1(引物F2，正向引物)序列相对应的序列以及与SEQ ID NO:2(引物R1.2，反向引物)序列的反向互补序列相对应的序列在HCV核心区域中的位置示于图2中。针对HCV基因型1至6的HCV核心核酸序列的序列比对示于图3中，以及与SEQ ID NO:1(引物F2)相对应的序列和与SEQ ID NO:2(引物R1.2)的反向互补序列相对应的序列的定位。
核酸可来源于样品的核酸，例如通过对样品的HCV核心核酸进行逆转录，以及通过使用正向和反向核酸扩增引物进行等温核酸扩增反应来扩增逆转录的产物。
任选地，本发明的方法还包括对样品的HCV RNA进行逆转录，以及通过使用正向和反向核酸扩增引物进行等温扩增反应来扩增逆转录的产物。
在本发明的方法中可使用等温核酸扩增的任何合适的方法。等温核酸扩增的数种合适的方法是技术人员已知的。任选地，等温核酸扩增是基于转录的扩增。这样的方法涉及使用逆转录酶(reverse transcriptase，RT)、RNase H和RNA聚合酶活性来扩增RNA模板，并且包括基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、转录介导的扩增(transcription-mediated amplification，TMA)和自持续序列复制(3SR)(Chan和Fox，Rev.Med.Microbiol.10：185-196(1999)；Guatelli et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.87：1874-1878(1990)；Compton，Nature 350：91-92(1991))。NASBA和3SR使用来自禽成髓细胞瘤病毒(Avian Myeloblastosis Virus，AMV)的RT(其也具有RNaseH活性)、来自大肠杆菌(E.coli)的RNase H、和T7 RNA聚合酶。TMA使用莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus，MMLV)RT(其也具有RNaseH活性)和T7 RNA聚合酶。
等温扩增方法(例如基于转录的扩增方法)具有优于使用聚合酶链反应(PCR)进行扩增的数个优点。反应在单管中同时发生，并且在等温条件下进行，因此不需要热循环仪。扩增反应比PCR更快(与PCR的20个循环之后的1×106倍扩增相比，其在5个循环之后可看到1×109倍扩增)。DNA背景不干扰基于转录的扩增，并因此这些方法不受双链DNA污染的影响。扩增产物是单链的并且在无对链分离的任何需要的情况下即可检测。
任选地，反向核酸引物还包含在其5’端的用于DNA依赖性RNA聚合酶的启动子序列。这样的引物可用于逆转录以及用于基于转录的等温扩增反应，从而使进行逆转录和等温核酸扩增所需的引物数目最小化。
例如，启动子序列可以是T7启动子序列：
5’
TAATACGACTCACTATAG3′(SEQ ID NO：6)
。T7 RNA聚合酶在启动子序列中加下划线的G处开始转录。然后，聚合酶使用相反链作为模板从5’-＞3’进行转录。转录物中的第一碱基将是G。
例如，在其5’端具有T7启动子序列的反向核酸引物可包含
GCTCATGATGCACGGTCTACGAGATAATACGACTCACTATAG(SEQ ID NO：7)
的核酸序列。
适合于用于本发明方法中的基于转录的等温扩增反应在以下描述，参考图4。
反义引物1包含与靶RNA的一部分互补的核酸序列，使得该引物可与靶RNA(例如，SEQ ID NO:2，引物R1.2，反向引物)和在其5’端的用于DNA依赖性RNA聚合酶的单链形式的启动子序列(例如，SEQ ID NO:7，T7启动子序列)特异性地杂交。引物1与RNA靶标退火。RNA依赖性DNA聚合酶延伸引物1以合成RNA靶标的互补DNA(complementary DNA，cDNA)拷贝。DNA/RNA双链体特异性核糖核酸酶消化RNA-cDNA杂交体的RNA。有义引物2包含与cDNA的一部分互补的核酸序列。引物2与引物1形成的cDNA的一部分的下游cDNA退火。引物2被DNA依赖性DNA聚合酶延伸以产生在一端延伸经过DNA依赖性RNA聚合酶启动子序列的第二DNA链(从而形成双链启动子)。该启动子被DNA依赖性RNA聚合酶使用以合成与原始靶序列互补的大量RNA。然后，这些RNA产物用作反应循环阶段的模板，但其中引物退火步骤相反，即引物2随后是引物1。
在该方法的变化形式中，引物2还可包含用于DNA依赖性RNA聚合酶的单链形式的启动子序列。这导致产生与原始靶序列具有相同意义的RNA(以及与原始靶序列互补的RNA)。
在一些常规的基于等温转录的扩增反应中，已知在靶RNA用作用于cDNA合成的模板之前在5’端将靶RNA切割。使用具有RNaseH活性的酶来切割通过添加具有与靶RNA的5’端重叠并与其邻近的区域互补的序列的寡核苷酸(切割寡核苷酸)而形成的RNA-DNA杂交体的RNA部分。切割寡核苷酸可具有其适当修饰的3’-端-OH以防止延伸反应。虽然在本发明一些实施方案中可使用切割寡核苷酸，但优选地，在不存在切割寡核苷酸的情况下进行本发明的方法，从而简化扩增反应和所需组分。
等温核酸扩增是有利的，因为其可容易地用于资源有限的环境中。这样的方法不需要使用在资源有限的环境中可能不可用的热循环仪。合适方法的一些实例描述于WO2008/090340和Lee et al.,Journal of Infectious Diseases 2010；201(S1):S65-S71中。
用于进行RNA逆转录和用于逆转录产物的等温扩增的合适试剂的一些实例提供于WO 2008/090340中，并且包含例如以下酶活性：RNA依赖性DNA聚合酶、DNA依赖性DNA聚合酶、DNA/RNA双链体特异性核糖核酸酶和DNA依赖性RNA聚合酶。
应理解，除所需酶活性之外，还将必要的是提供合适的核苷酸三磷酸(对于基于转录的扩增，需要核糖核苷酸三磷酸(rNTP，即rATP、rGTP、rCTP和rUTP)和脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP，即dATP、dGTP、dCTP和dTTP))、用于靶核酸特异性扩增的合适的引物、用于进行扩增反应的合适的缓冲剂、以及酶活性所需的任何必要的辅因子(例如镁离子)。合适的缓冲剂的一些实例包括Tris-HCl、HEPES或乙酸盐缓冲剂。可提供合适的盐，例如氯化钾或氯化钠。技术人员可容易地确定这些组分的合适浓度。合适的rNTP浓度通常为0.25至5mM或0.5至2.5mM。合适的dNTP浓度通常为0.25至5mM或0.5至2.5mM dNTP。合适的镁离子浓度通常为5至15mM。
一些常规的基于转录的扩增方法使用极高的T7 RNA聚合酶量(例如142或更多单位，其中一个单位在例如以下的标准测定条件下在37℃下在1小时内将1纳摩尔经标记的核苷酸并入到酸不溶性物质中：40mM Tris-HCl(pH 8.0)、50mM NaCl、8mM MgCl2、5mM DTT、400μM rNTP、400μM[3H]-UTP(30cpm/皮摩尔)、20μg/ml T7 DNA、50μg/ml BSA、100μl反应体积，37℃，10分钟)。本发明的方法可使用比这样的常规方法显著更少的T7 RNA聚合酶来进行，从而降低成本。例如，本发明的方法可使用少于142单位的DNA依赖性RNA聚合酶(例如T7RNA聚合酶)，适当地少于100单位或少于50单位(例如30至40单位)来进行。
任选地，分离样品的核酸，之后对存在于所分离的核酸中的样品的HCV RNA进行逆转录。
用于分离核酸的许多合适方法是技术人员已知的。一些方法使用离液剂(chaotropic agent)(例如硫氰酸胍)和有机溶剂来裂解细胞并使蛋白质变性。例如，Boomet al.(Journal of Clinical Microbiology,1990,Vol.28(3):495-503)描述了其中在存在包含硫氰酸胍的裂解/结合缓冲剂的情况下使样品与二氧化硅颗粒接触的方法。释放的核酸与二氧化硅颗粒结合，然后将其用包含硫氰酸胍的洗涤缓冲剂，然后用乙醇并随后用丙酮洗涤。随后将结合的核酸在水性低盐缓冲剂(Tris-HCl，EDTA，pH 8.0)中洗脱。
一些方法避免了对离液盐和有机溶剂的需要。例如，Hourfar et al.(ClinicalChemistry,2005,51(7):1217-1222)描述了其中在添加蛋白酶K之前在存在包含亲液盐(kosmotropic salt)(硫酸铵)的裂解/结合缓冲剂的情况下将样品与磁性二氧化硅颗粒混合的方法。在分离之后，将磁性颗粒用包含蛋白酶K的洗涤缓冲剂洗涤，并在80℃下将其在洗脱缓冲剂(Tris-HCl，pH 8.5)中洗脱。另一些合适的方法描述于WO 2010/015835中。
核酸的分离可使用用于与固相一起使用的常规结合缓冲剂和/或洗脱缓冲剂来进行，所述固相在第一pH下在存在结合缓冲剂的情况下能够结合核酸，并且在第二pH下核酸可从中洗脱。
任选地，所述固相包含根据环境条件改变电荷的可电离基团。可电离基团的pKa适合于期望将核酸与固相结合并从固相释放核酸的条件。通常，核酸将在低于或约等于pKa的pH下与固相结合，并且将在较高的pH(通常高于pKa)下释放。用于在第一pH下结合核酸并且在高于第一pH的第二pH下洗脱结合的核酸的合适固相是本领域普通技术人员公知的。例如，在第一pH下固相可包含正电荷，并且在第二pH下固相可具有较少的正电荷、中性电荷或负电荷。或者或另外地，在第一pH下固相可包含中性电荷或较少负电荷，并且在第二pH下固相可具有负电荷或更多负电荷。这样的电荷变化使得核酸在第一pH下吸附至固相，并且在第二pH下释放。
例如，固相可包含其中pKa在第一与第二pH之间的可负电离基团。核酸在固相为中性或带较少负电荷时将与固相结合，并且在固相带负电荷或带更多负电荷时将释放。或者或另外地，固相可包含其中pKa在第一与第二pH之间的可正电离基团。核酸在固相带正电荷时将与固相结合，并且在固相为中性或带较少正电荷时将释放。
可用于提取核酸的固相的一些实例包括这样的固相，其包含无机氧化物，例如二氧化硅或玻璃(例如，如在Boom et al或Hourfar et al中所述)、或氧化铝、糖聚合物、或电荷开关物质(charge-switch material)(例如，如在WO 02/48164中所述)。
所述固相可以为任何合适的形式，例如包含膜、凝胶或颗粒，例如磁性颗粒。二氧化硅膜或凝胶和磁性二氧化硅颗粒是一些优选实例。二氧化硅膜是特别优选的。与磁性二氧化硅颗粒不同，这比磁性二氧化硅颗粒(例如由Hourfar et al使用)便宜并且不需要冷藏储存。
固相可以是通过存在亲液剂(kosmotropic agent)增强核酸与其结合的固相。任选地，核酸与固相的结合在存在亲液剂的情况下进行。已知这样的试剂增强核酸与固相(例如基于二氧化硅的固相)的结合。
术语“离液”和“亲液”剂源自Hofmeister系列(Cacace et al.,Q Rev Biophys1997；30:241-77)，根据这些试剂对大分子和水的结构的影响来将其划分。离液剂(chaotrope)可被限定为破坏溶剂结构的物质，以及亲液剂(kosmotrope)被限定为增强溶剂结构的物质。Cacace et al的图1示出了Hofmeister系列以及对蛋白质结构/功能具有作用的通常存在的有机溶质。离液剂的一些实例是本领域技术人员已知的，并且包括碘化钠、高氯酸钠、硫氰酸胍和盐酸胍。亲液剂的一些实例是本领域技术人员已知的，并且包括硫酸铵和氯化锂。
任选地，使用结合缓冲剂进行裂解。可用于细胞裂解的结合缓冲剂是本领域普通技术人员已知的。Boom et al.使用的裂解缓冲剂包含硫氰酸胍、Tris盐酸盐，pH 6.4、EDTA(调节至pH 8)和Triton X-100。任选地，裂解缓冲剂不包含离液剂。例如，可使用包含亲液剂的裂解/结合缓冲剂。任选地，缓冲剂是酸性缓冲剂，适当的是pKa(25℃)为3至5的强酸性缓冲剂。
任选地，本发明的方法还包括通过将产物的核酸与核酸捕获探针杂交来捕获等温扩增反应的产物，其中捕获探针与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列特异性地杂交。
任选地，如果捕获探针在严格条件下与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列杂交，则所述捕获探针与HCV核心核酸序列特异性地杂交。
任选地，捕获探针包含GCGAAAGGCCTTGTGGTACT(SEQ ID NO：3)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列。
任选地，本发明的方法还包括通过将产物与核酸检测探针杂交来检测等温扩增反应的产物，其中检测探针与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列特异性地杂交。
任选地，如果检测探针在严格条件下与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列杂交，则所述检测探针与HCV核心核酸序列特异性地杂交。
任选地，检测探针包含TGATAGGGTGCTTGCGAGTG(SEQ ID NO：4)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO:4的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列。
与SEQ ID NO:3(探针CP2，捕获探针)和SEQ ID NO:4(探针DP2，检测探针)的序列相对应的序列在HCV核心区域中的位置示于图2中。针对HCV基因型1至6的HCV核心核酸序列的序列比对示于图3中，以及与SEQ ID NO:3(捕获探针2)和SEQ ID NO:4(检测探针)相对应的序列的定位。
例如，如果捕获探针和检测探针在严格杂交条件下不与存在于等温扩增反应中的其他核酸(即非HCV核心核酸，包括核心区域之外的HCV核酸)杂交，则所述捕获探针和检测探针与HCV核心核酸序列特异性地杂交。
核酸序列之间的序列同一性可通过比较序列的比对来确定。当所比较序列中的等同位置被相同的核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。将比对评分为同一性百分比是所比较序列共享位置处相同核苷酸数目的函数。当对序列进行比较时，最佳比对可能需要待引入到一个或更多个序列中的空位，以顾及序列中可能的插入和缺失。序列比较方法可采用空位罚分，以便对于所比较序列中相同数目的相同分子，具有尽可能少的空位的序列比对(反映两个所比较序列之间的更高相关性)将比具有许多空位的序列比对获得更高的评分。最大百分比同一性的计算涉及在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。
用于进行序列比较的合适的计算机程序在商业和公共部门中广泛可得。一些实例包括MatGat(Campanella et al.,2003,BMC Bioinformatics 4:29；程序可从http://bitincka.com/ledion/matgat获得)、Gap(Needleman&Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)、FASTA(Altschul et al.,1990,J.Mol.Biol.215:403-410；程序可从http://www.ebi.ac.uk/fasta获得)、Clustal W 2.0和X 2.0(Larkin et al.,2007,Bioinformatics 23:2947-2948；程序可从http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2获得)和EMBOSS成对比对算法(Needleman&Wunsch,1970,同上；Kruskal,1983,In:Time warps,string edits and macromolecules:the theory and practice of sequencecomparison,Sankoff&Kruskal(编辑),第1至44页,Addison Wesley；程序可从http://www.ebi.ac.uk/tools/emboss/align获得)。所有程序均可使用默认参数运行。
例如，序列比较可使用EMBOSS成对比对算法的“needle”法进行，其在考虑两个序列的全长时确定其最佳比对(包括空位)并提供百分比同一性评分。
任选地，将检测探针用视觉可检测标记(即无需使用仪器的视觉可检测的标记)进行标记。合适的视觉可检测标记的一些实例包括胶体金属溶胶颗粒、乳胶颗粒或纺织染料颗粒。胶体金属溶胶颗粒的一个实例是胶体金颗粒。
可将等温核酸扩增的产物用视觉可检测标记进行标记，以及使用色谱测试条(chromatographic test strip)进行捕获和检测，例如如WO 2008/090340和Lee et al.,Journal of Infectious Diseases 2010；201(S1):S65-S71中所述。
任选地，样品是液体样品。任选地，样品是从怀疑被HCV感染的对象获得的生物样品，例如液体生物样品。任选地，样品是从怀疑被HCV感染的对象获得的血液或血浆样品。
任选地，本发明的方法是体外方法。
本发明的方法特别地可用作用于筛选HCV感染的POC测试。特别地，本发明的方法可在不使用实验室设施或热循环仪的情况下快速地进行。HCV感染可在感染1至2周内检测。一旦将对象鉴定为被HCV感染，就可向其施用合适的治疗，并且可监测感染。如果合适的话，可对对象进行再次测试以确定哪种HCV基因型导致感染，并随后施用适合于该基因型的治疗。
根据本发明，还提供了用于确定样品是否包含HCV核酸的试剂盒，其包含：
正向核酸扩增引物和反向核酸扩增引物，其用于通过等温扩增反应来扩增模板核酸，其中每个核酸扩增引物与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列特异性地杂交；
核酸捕获探针，其中所述捕获探针与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列特异性地杂交；和/或
核酸检测探针，其中所述检测探针与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列特异性地杂交，任选地，其中所述检测探针包含用于标记等温核酸扩增的产物的视觉可检测标记。
任选地，正向核酸引物包含含有以下或由以下组成的核酸序列：核酸序列AGACTGCTAGCCGAGTAG(SEQ ID NO：1)，或沿其全长与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
任选地，反向核酸引物包含含有以下或由以下组成的核酸序列：核酸序列GCTCATGATGCACGGTCTACGAGA(SEQ ID NO：2)，或沿其全长与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
任选地，捕获探针包含含有以下或由以下组成的核酸序列：核酸序列GCGAAAGGCCTTGTGGTACT(SEQ ID NO：3)，或沿其全长与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列。
任选地，检测探针包含含有以下或由以下组成的核酸序列：核酸序列TGATAGGGTGCTTGCGAGTG(SEQ ID NO：4)，或沿其全长与SEQ ID NO:4的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列。
任选地，本发明的试剂盒还包含RNA依赖性DNA聚合酶、DNA依赖性DNA聚合酶、DNA/RNA双链体特异性核糖核酸酶和DNA依赖性RNA聚合酶。
任选地，本发明的试剂盒还包含合适的核苷酸三磷酸(对于基于转录的扩增，需要核糖核苷酸三磷酸(rNTP，即rATP、rGTP、rCTP和rUTP)和脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP，即dATP、dGTP、dCTP和dTTP))、用于进行扩增反应的合适的缓冲剂以及酶活性所需的任何必要的辅因子(例如镁离子)。合适的缓冲剂的一些实例包括Tris-HCl、HEPES或乙酸盐缓冲剂。可提供合适的盐，例如氯化钾或氯化钠。技术人员可容易地确定这些组分的合适浓度。合适的rNTP浓度通常为0.25至5mM或0.5至2.5mM。合适的dNTP浓度通常为0.25至5mM dNTP或0.5至2.5mM。合适的镁离子浓度通常为5至15mM。
本发明的试剂盒还可包含用于标记等温核酸扩增的产物的视觉可检测标记和/或用于捕获和检测等温核酸扩增的产物的色谱测试条和试剂。合适的标记、测试条和试剂以及用于通过基于简单扩增的测定(simple amplification-based assay，SAMBA)来捕获和检测等温核酸扩增的产物的方法描述于WO 2008/090340和Lee et al.,Journal ofInfectious Diseases 2010；201(S1):S65-S71中。
本发明的试剂盒还可包含用于例如使用如上所述的核酸提取方法从样品中分离核酸的试剂。用于提取核酸的合适的试剂可包括：用于裂解存在于样品中的细胞的裂解缓冲剂、用于结合核酸的固相、用于将核酸与固相结合的结合缓冲剂(任选地，裂解缓冲剂与结合缓冲剂相同)、任选地用于洗涤结合至固相的核酸的洗涤缓冲剂和用于从固相洗脱核酸的洗脱缓冲剂。以上描述了合适的裂解缓冲剂、洗涤缓冲剂和洗脱缓冲剂，以及用于与所述缓冲剂一起使用的合适的固相。
本发明的试剂盒还可包含以下另外的组分中的任一种：用于通过指穿刺或足跟穿刺从对象获得全血样品的刺血针(lancet)；用于从对象收集血液样品的血液收集器；阳性和/或阴性对照；用于使用所述试剂盒进行本发明测试的方法的说明。
根据本发明还提供了用于通过等温核酸扩增反应来扩增HCV核酸的引物组，其包含正向核酸扩增引物和反向核酸扩增引物，其中每个核酸扩增引物与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列特异性地杂交。
任选地，引物组包含这样的正向核酸引物，其包含含有以下或由以下组成的核酸序列：核酸序列AGACTGCTAGCCGAGTAG(SEQ ID NO：1)，或沿其全长与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
任选地，引物组包含这样的反向核酸引物，其包含含有以下或由以下组成的核酸序列：核酸序列GCTCATGATGCACGGTCTACGAGA(SEQ ID NO：2)，或沿其全长与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
任选地，正向和/或反向核酸引物为至多50个核苷酸长。
根据本发明还提供了用于通过等温扩增反应来扩增HCV核酸以及用于捕获和/或检测扩增反应的产物的寡核苷酸组，其包含：
本发明的引物组；
核酸捕获探针，其中所述捕获探针与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列特异性地杂交；和/或
核酸检测探针，其中所述检测探针与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列特异性地杂交。
任选地，寡核苷酸组包含这样的正向核酸引物，其包含含有以下或由以下组成的核酸序列：核酸序列AGACTGCTAGCCGAGTAG(SEQ ID NO：1)，或沿其全长与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
任选地，寡核苷酸组包含这样的反向核酸引物，其包含含有以下或由以下组成的核酸序列：核酸序列GCTCATGATGCACGGTCTACGAGA(SEQ ID NO：2)，或沿其全长与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
任选地，寡核苷酸组包含这样的捕获探针，其包含含有以下或由以下组成的核酸序列：核酸序列GCGAAAGGCCTTGTGGTACT(SEQ ID NO：3)，或沿其全长与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列。
任选地，寡核苷酸组包含这样的检测探针，其包含含有以下或由以下组成的核酸序列：核酸序列TGATAGGGTGCTTGCGAGTG(SEQ ID NO：4)，或沿其全长与SEQ ID NO:4的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列。
任选地，捕获和/或检测探针为至多50个核苷酸长。
根据本发明还提供了寡核苷酸，其包含：
含有以下或由以下组成的核酸序列：核酸序列AGACTGCTAGCCGAGTAG(SEQ ID NO：1)，或沿其全长与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列；
含有以下或由以下组成的核酸序列：核酸序列GCTCATGATGCACGGTCTACGAGA(SEQID NO：2)，或沿其全长与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列；
含有以下或由以下组成的核酸序列：核酸序列GCGAAAGGCCTTGTGGTACT(SEQ IDNO：3)，或沿其全长与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列；或
含有以下或由以下组成的核酸序列：核酸序列TGATAGGGTGCTTGCGAGTG(SEQ IDNO：4)，或沿其全长与SEQ ID NO:4的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列。
本发明的引物组、寡核苷酸组或寡核苷酸可用于本发明的试剂盒或本发明的方法中。
本发明的引物、探针或寡核苷酸、或者本发明的引物或寡核苷酸的组的引物、探针或寡核苷酸、或者本发明试剂盒的引物、探针或寡核苷酸、或者用于本发明方法中的引物、探针或寡核苷酸的长度可以为至少15、20、25、30、35、40、45、50或超过50个核苷酸。
本发明的引物、探针或寡核苷酸、或者本发明的引物或寡核苷酸的组的引物、探针或寡核苷酸、或者本发明试剂盒的引物、探针或寡核苷酸、或者用于本发明方法中的引物、探针或寡核苷酸的长度可以为至多20、25、30、35、40、45、50或100个核苷酸。
本发明的引物或寡核苷酸、或者本发明的引物或寡核苷酸的组的引物或寡核苷酸、或者本发明试剂盒的引物或寡核苷酸、或者用于本发明方法中的引物或寡核苷酸，其包含长度可以为以下的核酸序列AGACTGCTAGCCGAGTAG(SEQ ID NO：1)：至多19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100个核苷酸。
本发明的寡核苷酸、或者本发明的引物或寡核苷酸的组的寡核苷酸、或者本发明试剂盒的寡核苷酸、或者用于本发明方法中的寡核苷酸，其包含长度可以为以下的核酸序列
AGACTG；TAGCCGAGTAG(SEQ ID NO：1)
的互补序列：至多19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100个核苷酸。
本发明的引物或寡核苷酸、或者本发明的引物或寡核苷酸的组的引物或寡核苷酸、或者本发明试剂盒的引物或寡核苷酸、或者用于本发明方法中的引物或寡核苷酸，其包含长度可以为以下的核酸序列GCTCATGATGCACGGTCTACGAGA(SEQ ID NO：2)：至多25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100个核苷酸。
本发明的寡核苷酸、或者本发明的引物或寡核苷酸的组的寡核苷酸、或者本发明试剂盒的寡核苷酸、或者用于本发明方法中的寡核苷酸，其包含长度可以为以下的核酸序列GCTCATGATGCACGGTCTACGAGA(SEQ ID NO：2)的互补序列：至多25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100个核苷酸。
本发明的探针或寡核苷酸、或者本发明的引物或寡核苷酸的组的探针或寡核苷酸、或者本发明试剂盒的探针或寡核苷酸、或者用于本发明方法中的探针或寡核苷酸，其包含长度可以为以下的核酸序列GCGAAAGGCCTTGTGGTACT(SEQ ID NO：3)：至多21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100个核苷酸。
本发明的探针或寡核苷酸、或者本发明的引物或寡核苷酸的组的探针或寡核苷酸、或者本发明试剂盒的探针或寡核苷酸、或者用于本发明方法中的探针或寡核苷酸，其包含长度可以为以下的核酸序列
GCGAAAGGCCTTGTGGTACT(SEQ ID NO：3)
的互补序列：至多21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100个核苷酸。
本发明的探针或寡核苷酸、或者本发明的引物或寡核苷酸的组的探针或寡核苷酸、或者本发明试剂盒的探针或寡核苷酸、或者用于本发明方法中的探针或寡核苷酸，其包含长度可以为以下的核酸序列TGATAGGGTGCTTGCGAGTG(SEQ ID NO：4)：至多21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100个核苷酸。
本发明的探针或寡核苷酸、或者本发明的引物或寡核苷酸的组的探针或寡核苷酸、或者本发明试剂盒的探针或寡核苷酸、或者用于本发明方法中的探针或寡核苷酸，其包含长度可以为以下的核酸序列
TGATAGGGTGCTTGCGAGTG
(SEQ ID NO：4)
的互补序列：至多21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100个核苷酸。
本发明的寡核苷酸可包含含有以下或由以下组成的核苷酸序列：在其全长上与SEQ ID NO:1至4或7中任一个的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性的序列，或其互补序列。
本发明的寡核苷酸可包含含有以下或由以下组成的核苷酸序列：在其全长上与SEQ ID NO:7的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性的序列，或其互补序列。
可将寡核苷酸例如用视觉可检测标记进行标记。特别地，可将包含以下或由以下组成的寡核苷酸用视觉可检测标记进行标记：TGATAGGGTGCTTGCGAGTG(SEQ ID NO：4)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO:4的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列。视觉可检测标记的一些实例包括胶体金属溶胶颗粒、乳胶颗粒或纺织染料颗粒。胶体金属溶胶颗粒的一个实例是胶体金颗粒。
本发明的引物或寡核苷酸的组可包含本发明的寡核苷酸。
本发明的试剂盒可包含本发明的引物组、寡核苷酸组或寡核苷酸。
根据本发明还提供了本发明的引物组、寡核苷酸组或寡核苷酸在本发明方法中的用途。
以下仅通过实例的方式参考附图描述了本发明的一些实施方案，其中：
图1示出了HCV RNA基因组的结构；
图2示出了根据本发明一个实施方案的HCV核心区域的核酸序列，以及HCV引物和探针的核酸序列。HCV核心序列中引物和探针的相对应序列以粗体加下划线示出；
图3示出了根据本发明一些实施方案的HCV基因型1至6的HCV核心区域的核酸序列比对，以及引物和探针序列在核心序列中的位置。比对中示出的序列(及其各自的SEQ IDNO)如下：
HCV_1_西班牙_AJ8(SEQ ID NO：8)；
HCV_1a_美国_EF40(SEQ ID NO：9)；
HCV_1b_日本_AB(SEQ ID NO：10)；
HCV_1b/2b_日本(SEQ ID NO：11)；
HCV_1b/2k_俄罗斯(SEQ ID NO：12)；
HCV_1c_印度尼西亚(SEQ ID NO：13)；
HCV_1e_英国_KC248(SEQ ID NO：14)；
HCV_1f_法国_L(SEQ ID NO：15)；
HCV_1g_西班牙_AM(SEQ ID NO：16)；
HCV_1h_喀麦隆(SEQ ID NO：17)；
HCV_1I_英国_KC248(SEQ ID NO：18)；
HCV_2a_日本_B0(SEQ ID NO：19)；
HCV_2b_AB030907(SEQ ID NO：20)；
HCV_2b/1b_菲律宾(SEQ ID NO：21)；
HCV_2k摩尔多瓦(SEQ ID NO：22)；
HCV_2/5_法国(SEQ ID NO：23)；
HCV_3a_AB691595(SEQ ID NO：24)；
HCV_3a_AB691596(SEQ ID NO：25)；
HCV_3a_AF046866(SEQ ID NO：26)；
HCV_3h_索马里(SEQ ID NO：27)；
HCV_4_美国_DQ418(SEQ ID NO：28)；
HCV_4a_埃及_DQ(SEQ ID NO：29)；
HCV_4a_日本_AB(SEQ ID NO：30)；
HCV_4b_葡萄牙(SEQ ID NO：31)；
HCV_4c_加拿大_F(SEQ ID NO：32)；
HCV_4d_美国_DQ41(SEQ ID NO：33)；
HCV_4d_西班牙_DQ(SEQ ID NO：34)；
HCV_4f_法国_E(SEQ ID NO：35)；
HCV_4g_加拿大_F(SEQ ID NO：36)；
HCV_4l_加拿大_F(SEQ ID NO：37)；
HCV_4k_EU392171(SEQ ID NO：38)；
HCV_4m_加拿大_F(SEQ ID NO：39)；
HCV_4n_加拿大_F(SEQ ID NO：40)；
HCV_4o_加拿大_F(SEQ ID NO：41)；
HCV_4p_加拿大_F(SEQ ID NO：42)；
HCV_4q_加拿大_F(SEQ ID NO：43)；
HCV_4r_加拿大_F(SEQ ID NO：44)；
HCV_4t_加拿大_F(SEQ ID NO：45)；
HCV_4v_塞浦路斯_H(SEQ ID NO：46)；
HCV_5_印度_KF3(SEQ ID NO：47)；
HCV_5a_中国_KC(SEQ ID NO：48)；
HCV_5a_法国_A(SEQ ID NO：49)；
HCV_5a_英国_NC_00(SEQ ID NO：50)；
HCV_6_中国_DQ2(SEQ ID NO：51)；
HCV_6a_中国香港(SEQ ID NO：52)；
HCV_6b_泰国(SEQ ID NO：53)；
HCV_6c_泰国(SEQ ID NO：54)；
HCV_6d_越南(SEQ ID NO：55)；
HCV_6e_中国_DQ(SEQ ID NO：56)；
HCV_6f_泰国(SEQ ID NO：57)；
HCV_6g_中国香港(SEQ ID NO：58)；
HCV_6h_越南(SEQ ID NO：59)；
HCV_6i_泰国(SEQ ID NO：60)；
HCV_6k_中国_DQ(SEQ ID NO：61)；
HCV_6I_越南(SEQ ID NO：62)；
图4示意性地示出了针对靶RNA的基于转录的扩增的步骤；以及
图5示出了使用根据本发明一个实施方案的方法检测HCV基因型1至6。在全血中以3,000IU/ml测试HCV亚型。以3,000IU/ml检测全血中稀释的每种亚型的至少3个血浆样品。
实施例
用于检测HCV基因型1至6的即时(POC)核酸测试
提取HCV病毒RNA、进行逆转录，并通过等温核酸扩增进行扩增，并且通过使用与Lee et al.，Journal of Infectious Diseases 2010；201(S1)：S65-S71中描述的方法类似的基于简单扩增的测定(SAMBA)方法，用试纸快速视觉检测来检测扩增产物。
简言之，反向核酸扩增引物包含与HCV靶RNA的一部分互补的核酸序列，使得该引物可与靶RNA和在其5’端的用于DNA依赖性RNA聚合酶的单链形式的启动子序列特异性地杂交。反向引物与靶RNA杂交。RNA依赖性DNA聚合酶将反向引物延伸，合成RNA靶标的互补DNA(cDNA)拷贝。DNA/RNA双链体特异性核糖核酸酶消化RNA-cDNA杂交体的RNA。正向核酸扩增引物包含与cDNA的一部分互补的核酸序列。正向引物与反向引物形成的cDNA的一部分的下游cDNA杂交。正向引物被DNA依赖性DNA聚合酶延伸以产生在一端延伸经过DNA依赖性RNA聚合酶启动子序列的第二DNA链(从而形成双链启动子)。该启动子被DNA依赖性RNA聚合酶使用以合成与原始靶序列互补的大量RNA。然后，这些RNA产物用作用于反应循环阶段的模板，但其中引物杂交步骤相反，即正向引物随后是反向引物。
以下引物序列用于基因型1至6的HCV核酸的等温扩增：
HCV引物F2(正向引物)：
AGACTGCTAGCCGAGTAG(SEQ ID NO：1)；
HCV引物REV1.2(反向引物)/T7启动子：
GCTCATGATGCACGGTCTACGAGATAATACGACTCACTATAG(SEQ ID NO：7)。
使用以下捕获和检测探针来捕获和检测扩增产物：
HCV探针CP2(捕获探针)：
GCGAAAGGCCTTGTGGTACT(SEQ ID NO：3)；
HCV探针DP2(检测探针)：
TGATAGGGTGCTTGCGAGTG(SEQ ID NO：4)。
对于六种HCV基因型中的每一种，针对至少三个不同样品测试HCV引物/探针。结果记录在图5中。有效地检出了HCV基因型1至6。
序列表
<110> Diagnostics for the Real World, Ltd
<120> HCV检测
<130> P/79789.WO01
<150> GB 1819726.9
<151> 2018-12-03
<160> 62
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 1
agactgctag ccgagtag 18
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 2
gctcatgatg cacggtctac gaga 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 捕获探针
<400> 3
gcgaaaggcc ttgtggtact 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 检测探针
<400> 4
tgatagggtg cttgcgagtg 20
<210> 5
<211> 1140
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 5
gtgaggaact actgtcttca cgcagaaagc gtctagccat ggcgttagta tgagtgtcgt 60
acagcctcca ggcccccccc tcccgggaga gccatagtgg tctgcggaac cggtgagtac 120
accggaattg ccaggatgac cgggtccttt ccattggatc aaacccgctc aatgcctgga 180
gatttgggcg tgcccccgca agactgctag ccgagtagcg ttgggttgcg aaaggccttg 240
tggactgcct gatagggtgc ttgcgagtgc cccgggaggt ctcgtagacc gtgcatcatg 300
agcacacttc caaaacctca aagaaaaacc aaaagaaaca ccaaccgccg cccaatggac 360
gtcaagttcc cgggtggcgg tcagatcgtt ggtgaggaac tactgtcttc acgcagaaag 420
cgtctagcca tggcgttagt atgagtgtcg tacagcctcc aggccccccc ctcccgggag 480
agccatagtg gtctgcggaa ccggtgagta caccggaatt gccaggatga ccgggtcctt 540
tccattggat caaacccgct caatgcctgg agatttgggc gtgcccccgc aagactgcta 600
gccgagtagc gttgggttgc gaaaggcctt gtggtactgc ctgatagggt gcttgcgagt 660
gccccgggag gtctcgtaga ccgtgcatca tgagcacact tccaaaacct caaagaaaaa 720
ccaaaagaaa caccaaccgc cgcccaatgg acgtcaagtt cccgggtggc ggtcagatcg 780
ttggtgagga actactgtct tcacgcagaa agcgtctagc catggcgtta gtatgagtgt 840
cgtacagcct ccaggccccc ccctcccggg agagccatag tggtctgcgg aaccggtgag 900
tacaccggaa ttgccaggat gaccgggtcc tttccattgg atcaaacccg ctcaatgcct 960
ggagatttgg gcgtgccccc gcaagactgc tagccgagta gcgttgggtt gcgaaaggcc 1020
ttgtggactg cctgataggg tgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcatc 1080
atgagcacac ttccaaaacc tcaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg ccgcccaatg 1140
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7启动子序列
<400> 6
taatacgact cactatag 18
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有T7启动子序列的反向引物
<400> 7
gctcatgatg cacggtctac gagataatac gactcactat ag 42
<210> 8
<211> 198
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 8
ttggatcaaa cccgctctat gcctggagat ttgggcgtgc ccccgcgaga ctgctagccg 60
agtagtgttg ggtcgcgaaa ggccttgtgg tactgcctga tagggtgctt gcgagtgccc 120
cgggaggtct cgtagaccgt gcaccatgag cacgaatcct aaacctcaaa gaaaaaccaa 180
acgtaacacc aaccgccg 198
<210> 9
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 9
ttggataaac ccgctcaatg cctggagatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg caccatgagc acgaatccta aacctcaaag aaaaaccaaa 180
cgtaacacca accgtcg 197
<210> 10
<211> 198
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 10
ttggatcaat cccgctcaat gcctggagat ttgggcgtgc ccccgcgaga ctgctagccg 60
agtagtgttg ggtcgcgaaa ggccttgtgg tactgcctga tagggtgctt gcgagtgccc 120
cgggaggtct cgtagaccgt gcaccatgag cacaaatcct aaacctcaaa gaaaaaccaa 180
acgtaacacc aaccgccg 198
<210> 11
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 11
ttggataaac ccactctatg tccggtcatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
gtagcgttgg gttgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg catcatgagc acaaatccta aacctcaaag aaaaacccaa 180
agaaacacaa accgccg 197
<210> 12
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 12
ttggataaac ccactctatg cccggccatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
gtagcgttgg gttgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg catcatgagc acaaatccta aacctcaaag aaaaaccaaa 180
agaaacacaa accgccg 197
<210> 13
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 13
ttggattaac ccgctcaatg cctggagatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg caccatgagc acgaatccta aacctcaaag aaaaaccaaa 180
cgtaacacca accgccg 197
<210> 14
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 14
ttggatcaac ccgctcaatg cctggagatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg caccatgagc acgaatccta aacctcaaag aaaaaccaaa 180
agaaacacca accgccg 197
<210> 15
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 15
ttggatctaa ccgctcaatg cctggagatt tgggcgtgcc cccgcgagac tgctagccga 60
gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg catcatgagc acgaatccta aacctcaaag aaaaaccaaa 180
cgcaacacca accgccg 197
<210> 16
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 16
ttggataaac ccgctcaatg cctggaaatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg caccatgagc acgaatccta aacctcaaag aaaaaccaaa 180
agaaacacca accgccg 197
<210> 17
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 17
ttggatcaac ccgctcaatg cctggagatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg caccatgagc acaaatccta aacctcaaag aaaaaccaaa 180
cgtaacacca accgccg 197
<210> 18
<211> 198
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 18
ttggatcaaa cccgctcaat gcctggagat ttgggcgtgc ccccgcaaga ctgctagccg 60
agtagtgttg ggtcgcgaaa ggccttgtgg tactgcctga tagggtgctt gcgagtgccc 120
cgggaggtct cgtagaccgt gcaccatgag cacgaatcct aaacctcaaa gaaaaaccaa 180
acgtaacacc aaccgtcg 198
<210> 19
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 19
ttggataaac ccactctatg cccggccatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
gtagcgttgg gttgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggcgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg caccatgagc acaaatccta aacctcaaag aaaaaccaaa 180
agaaacacca accgtcg 197
<210> 20
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 20
ttggataaac ccactctatg tccggtcatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
gtagcgttgg gttgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggcctc gtagaccgtg caccatgagc acaaatccta aacctcaaag aaaaaccaaa 180
agaaacacaa accgccg 197
<210> 21
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 21
ttggataaac ccactctatg tccggtcatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
gtagcgttgg gttgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg catcatgagc acagatccta aaccccaaag aaaaaccaaa 180
agaaacacaa accgccg 197
<210> 22
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 22
ttggataaac ccactctatg cccggccatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
gtagcgttgg gttgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg caccatgagc acaaatccta aacctcaaag aaaaaccaaa 180
agaaacacaa accgccg 197
<210> 23
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 23
ttggataaac ccactctatg cccggtcatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
gtagcgttgg gttgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg catcatgagc acaaatccta aacctcaaag aaaaaccaac 180
agaaacacta accgccg 197
<210> 24
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 24
ttggaacaac ccgctcaata cccagaaatt tgggcgtgcc cccgcgagat cactagccga 60
gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg caacatgagc acacttccta aaccccaaag aaaaaccaaa 180
agaaacacca tccgtcg 197
<210> 25
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 25
ttggaacaac ccgctcaata cccagaaatt tgggcgtgcc cccgcgagat cactagccga 60
gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg caacatgagc acacttccta aaccccaaag aaaaaccaaa 180
agaaacacca tccgtcg 197
<210> 26
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 26
ttggaacaac ccgctcaata cccagaaatt tgggcgtgcc cccgcgagat cactagccga 60
gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg caacatgagc acacttccta aaccacaaag aaaaaccaaa 180
agaaacacca tccgtcg 197
<210> 27
<211> 53
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 27
atgagcacac ttcctaaacc tcaaagaaaa accaaaagaa acaccatccg ccg 53
<210> 28
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 28
ttggattaac ccgctcactg cccggaaatt tgggcgtgcc cccgcaagac tactagccga 60
gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg caccatgagc acgaatccta aacctcaaag aaaaaccaac 180
cgtaacacca accgccg 197
<210> 29
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 29
ttggattaac ccgctcaatg cccggaaatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg caccatgagc acgaatccta aacctcaaag aaaaaccaaa 180
cgtaacacca accgccg 197
<210> 30
<211> 198
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 30
ttggattaaa cccgctcaat gcccggaaat ttgggcgtgc ccccgcgaga ctgctagccg 60
agtagtgttg ggtcgcgaaa ggccttgtgg tactgcctga tagggtgctt gcgagtgccc 120
cgggaggtct cgtagaccgt gcaccatgag cacgaatcct aaacctcaaa gaaaaaccaa 180
acgtaacacc aaccgccg 198
<210> 31
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 31
ttggatcaac ccgctcaata cccggaaatt tgggcgtgcc cccgcaagac ygctagccga 60
gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg catcatgagc acaaatccta aaccccaaag aaaaaccaaa 180
cgtaacacca accgtcg 197
<210> 32
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 32
ttggataaac ccgctcaatg cccggaaatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg caccatgagc acgaatccta aacctcaaag aaaaaccaaa 180
cgtaacacca accgccg 197
<210> 33
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 33
ttggataaac ccgctcaatg cccggaaatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
gtagygttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg caccatgagc acgaatccta aacctcaaag aaaaaccaaa 180
cgtaacacca accgccg 197
<210> 34
<211> 197
<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 34
ttggataaac ccgctcaatg cccggaaatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg caccatgagc acgaatccta aaccgcaaag aaaaacccaa 180
cgtaacacca accgccg 197
<210> 35
<211> 197
<212> DNA
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<400> 35
ttggattaac ccgctcaatg cccggagatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
gtagcgttgg gttgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg caccatgagc acgaatccta aacctcaaag aaaaaccaaa 180
cgtaacacca accgccg 197
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<212> DNA
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<400> 36
ttggaacaaa cccgctcaat gcccggcaat ttgggcgtgc ccccgcaaga ctgctagccg 60
agtagtgttg ggtcgcgaaa ggccttgtgg tactgcctga tagggtgctt gcgagtgccc 120
cgggaggtct cgtagaccgt gcaccatgag cacgaatcct aaacctcaaa gaaaaaccaa 180
acgtaacacc aaccgccg 198
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<212> DNA
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gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg caccatgagc acgaatccta aacctcaaag aaaaacccac 180
cgtaacacca accgccg 197
<210> 38
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<212> DNA
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<400> 38
ttggaactaa cccgctcaat gcccggaaat ttgggcgtgc ccccgcgaga ctgctagccg 60
agtagtgttg ggtcgcgaaa ggccttgtgg tactgcctga tagggtgctt gcgagtgccc 120
cgggaggtct cgtagaccgt gcaccatgag cacgaatcct aaacctcaaa gacaaaccaa 180
acgtaacacc aaccgccg 198
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agtagcgttg ggttgcgaaa ggccttgtgg tactgcctga tagggtgctt gcgagtgccc 120
cgggaggtct cgtagaccgt gcaccatgag cacgaatcct aaacctcaaa gaaaaaccaa 180
acgtaacacc aaccgccg 198
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gggaggtctc gtagaccgtg caccatgagc acgaatccca aacctcaaag aaaaaccaaa 180
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ttggaataaa cccgctcaat gcccggcaat ttgggcgtgc ccccgcaaga ctgctagccg 60
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cgggaggtct cgtagaccgt gcaccatgag cacgaatcct aaacctcaaa gaaaaaccaa 180
acgtaacacc aaccgccg 198
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gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
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cgtaacacca accgccg 197
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ttggaacaaa cccgctcaat gcccggaaat ttgggcgtgc ccccgcaaga ctgctagccg 60
agtagcgttg ggttgcgaaa ggccttgtgg tactgcctga tagggtgctt gcgagtgccc 120
cgggaggttt cgtagaccgt gcaccatgag cacgaatcct aaacctcaaa gaaaaaccaa 180
acgtaacacc aaccgccg 198
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<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
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ttggattaac ccgctcaatg cctggaaatt tgggcgtgcc cccgcgagac tgctagccga 60
gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
gggaggtctc gtagaccgtg caccatgagc acaaatccca aacctcaaag aaaaaccaaa 180
cgtaacacca accgccg 197
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ttggattaac ccgctcaatg cccggaaatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
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agaaacacca accgtcg 197
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ttggataaac ccgctcaatg cccggagatt tgggcgtgcc cccgcgagac tgctagccga 60
gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
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gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
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ttggaacaac cccgctcaat gcctggagat ttgggcgtgc ccccgcgaga ctgctagccg 60
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cgggaggtct cgtagaccgt gcatcatgag cacacttcct aaacctcaaa gaataaccaa 180
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cattggatca aacccgctca atgcctggag atttgggcgt gcccccgcaa gactgctagc 60
cgagtagcgt tgggttgcga aaggccttgt ggtactgcct gatagggtgc ttgcgagtgc 120
cccgggaggt ctcgtagacc gtgcatcatg agcacacttc caaaacccca aagaaaaacc 180
aaaagaaaca ccaaccgtcg 200
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cattggatca aacccgctca atgcctggag atttgggcgt gcccccgcaa gactgctagc 60
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aaaagaaaca ccaaccgtcg 200
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<400> 54
ttggatcaaa cccgctcaat gcctggagat ttgggcgtgc ccccgcgaga ctgctagccg 60
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<213> 丙型肝炎病毒
<400> 55
ttggatcaac ccgctcaatg cctggagatt tgggcgtgcc cccgcgagac tgctagccga 60
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agaaacacaa accgtcg 197
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<400> 56
ttggatyaac ccgctcaatg cctggagatt tgggcgtgcc cccgcgagac tgctagccga 60
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<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 57
ttggattaac ccgctcagtg cctggagatt tgggcgtgcc cccgcgagac cgctagccga 60
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<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 58
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<212> DNA
<213> 丙型肝炎病毒
<400> 59
ttggatcaac ccgctcaatg cctggagatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60
gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc 120
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gggaggtctc gtagaccgtg catcatgagc acacttccaa aacccctaag aaaaaccaaa 180
agaaacacca accgtct 197
Claims (39)
1.用于确定样品是否包含HCV核酸的方法，其包括通过使用正向核酸扩增引物和反向核酸扩增引物进行等温扩增反应，来扩增所述样品的核酸或扩增来源于所述样品之核酸的核酸，其中每个核酸扩增引物与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列特异性地杂交。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述正向核酸引物包含AGACTGCTAGCCGAGTAG(SEQID NO：1)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO：1的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述反向核酸引物包含GCTCATGATGCACGGTCTACGAGA(SEQ ID NO：2)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括对所述样品的HCV RNA进行逆转录，以及通过使用所述正向核酸扩增引物和反向核酸扩增引物进行等温扩增反应来扩增所述逆转录的产物。
5.根据权利要求5所述的方法，其中所述反向核酸引物还包含在其5’端的用于DNA依赖性RNA聚合酶的启动子序列，并且逆转录使用所述反向核酸引物来进行。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其还包括分离所述样品的核酸，之后对存在于所分离的核酸中的样品的HCV RNA进行逆转录。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括通过将产物的核酸与核酸捕获探针进行杂交来捕获所述等温扩增反应的产物，其中所述捕获探针与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列特异性地杂交。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述捕获探针包含GCGAAAGGCCTTGTGGTACT(SEQ IDNO：3)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO：3的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括通过将产物与核酸检测探针进行杂交来检测所述等温扩增反应的产物，其中所述检测探针与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列特异性地杂交。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述检测探针包含TGATAGGGTGCTTGCGAGTG(SEQID NO：4)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO：4的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中将所述检测探针用视觉可检测标记进行标记。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的方法，其中所述等温扩增反应的产物的捕获和/或检测通过色谱试纸测定进行。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是从怀疑被HCV感染的对象获得的生物样品。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是从怀疑被HCV感染的对象获得的血液或血浆样品。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其是体外方法。
16.用于确定样品是否包含HCV核酸的试剂盒，其包含：
正向核酸扩增引物和反向核酸扩增引物，其用于通过等温扩增反应来扩增模板核酸，其中每个核酸扩增引物与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列特异性地杂交；
核酸捕获探针，其中所述捕获探针与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列特异性地杂交；和/或
核酸检测探针，其中所述检测探针与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列特异性地杂交，任选地，其中所述检测探针包含用于标记等温核酸扩增产物的视觉可检测标记。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述正向核酸引物包含AGACTGCTAGCCGAGTAG(SEQ ID NO：1)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO：1的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
18.根据权利要求16或17所述的试剂盒，其中所述反向核酸引物包含GCTCATGATGCACGGTCTACGAGA(SEQ ID NO：2)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获探针包含GCGAAAGGCCTTGTGGTACT(SEQ ID NO：3)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO：3的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的试剂盒，其中所述检测探针包含TGATAGGGTGCTTGCGAGTG(SEQ ID NO：4)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO：4的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的试剂盒，其还包含RNA依赖性DNA聚合酶、DNA依赖性DNA聚合酶、DNA/RNA双链体特异性核糖核酸酶和DNA依赖性RNA聚合酶。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的试剂盒，其还包含用于通过指穿刺或足跟穿刺从对象获得全血样品的刺血针。
23.根据权利要求16至22中任一项所述的试剂盒，其还包含用于从对象收集血液样品的血液收集器。
24.根据权利要求16至23中任一项所述的试剂盒，其还包含用于捕获和检测所述等温核酸扩增的产物的色谱测试条。
25.根据权利要求16至24中任一项所述的试剂盒，其还包含用于从血液或血浆样品中提取核酸的裂解/结合缓冲剂、洗脱缓冲剂和任选地洗涤缓冲剂。
26.用于通过等温核酸扩增反应来扩增HCV核酸的引物组，其包含正向核酸扩增引物和反向核酸扩增引物，其中每个核酸扩增引物与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列特异性地杂交。
27.根据权利要求26所述的引物组，其中所述正向核酸引物包含AGACTGCTAGCCGAGTAG(SEQ ID NO：1)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO：1的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
28.根据权利要求26或27所述的引物组，其中所述反向核酸引物包含GCTCATGATGCACGGTCTACGAGA(SEQ ID NO：2)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的引物组，其中所述正向核酸引物和/或反向核酸引物为至多50个核苷酸长。
30.用于通过等温核酸扩增反应来扩增HCV核酸以及用于捕获和/或检测所述扩增反应的产物的寡核苷酸组，其包含：
根据权利要求26至29中任一项所述的引物组；
核酸捕获探针，其中所述捕获探针与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列特异性地杂交；和/或
核酸检测探针，其中所述检测探针与在至少HCV基因型1至6之间保守的HCV核心核酸序列或其互补序列特异性地杂交。
31.根据权利要求30所述的寡核苷酸组，其中所述正向核酸引物包含AGACTGCTAGCCGAGTAG(SEQ ID NO：1)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO：1的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
32.根据权利要求30或31所述的寡核苷酸组，其中所述反向核酸引物包含GCTCATGATGCACGGTCTACGAGA(SEQ ID NO：2)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的寡核苷酸组，其中所述捕获探针包含GCGAAAGGCCTTGTGGTACT(SEQ ID NO：3)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO：3的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列。
34.根据权利要求30至33中任一项所述的寡核苷酸组，其中所述检测探针包含TGATAGGGTGCTTGCGAGTG(SEQ ID NO：4)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO：4的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列。
35.根据权利要求30至34中任一项所述的寡核苷酸组，其中所述捕获探针和/或检测探针为至多50个核苷酸长。
36.寡核苷酸，其包含：
AGACTGCTAGCCGAGTAG(SEQ ID NO：1)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO：1的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列；
GCTCATGATGCACGGTCTACGAGA(SEQ ID NO：2)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列；
GCGAAAGGCCTTGTGGTACT(SEO ID NO：3)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO：3的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列；或
TGATAGGGTGCTTGCGAGTG(SEQ ID NO：4)的核酸序列，或沿其全长与SEQ ID NO：4的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或其互补序列。
37.根据权利要求36所述的寡核苷酸，其为至多25、30、35、40、45或50个核苷酸长。
38.根据权利要求16至25中任一项所述的试剂盒，其包含根据权利要求26至29中任一项所述的引物组、根据权利要求30至35中任一项所述的寡核苷酸组、或根据权利要求36或37所述的寡核苷酸。
39.根据权利要求26至29中任一项所述的引物组、根据权利要求30至35中任一项所述的寡核苷酸组、或根据权利要求36或37所述的寡核苷酸在根据权利要求1至15中任一项所述的方法中的用途。
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