CN1620611A - 用于感染性物质检测的样品制备 - Google Patents

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黄玲
E·C·小纳达拉
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Abstract

本文描述了改善用于检测感染性物质的亚最适患者样品质量的方法。特别是用脱氧核糖核酸酶处理子宫颈内液体样品或阴道液体样品以提高感染性物质检测的可靠性。本文还描述了用于实施该方法的试剂盒。

Description

用于感染性物质检测的样品制备
本发明涉及改进疾病检测的方法、用于检验待测样品中疾病指示部分存在的改进方法以及用于实施该方法的试剂盒。
发明背景
对患者样品进行疾病检测的理想状况是，该检测能提供可靠的疾病特异性结果，并且该检测不给出高水平的假阳性或假阴性的结果。疾病检测可以通过检测样品中的特异的分析物，例如通过检测特异性抗原或抗原的片段、抗体或抗体的片段，或核酸序列。优选患者的样品在检测前需要以最小量制备和处理。还优选患者的样品可以通过完全或相对无损伤的方式获得。
一种传统的用于检测待测溶液中分析物的存在的方法包括捕获所述分析物于浸渍片(dipstick)上，并检查该分析物在浸渍片上的存在。所述浸渍片具有与待测溶液接触的接触端和远离接触端的捕获带。所述待测溶液被记录下从接触端向捕获带移动，在所述捕获带中该待测溶液中存在的所有分析物将被捕获，并给出适当的显示作为读出数据。已知的浸渍片种类应用抗体-抗原反应检测分析物。所述分析物可以直接指示由感染性物质导致的感染，或间接指示疾病的状态。
在受控试验条件下(特别是在实验室试验条件下)，对最优化的样品进行检测试验是可能的。所述样品可以从被检测的分析物的“载量”方面(即生物载量)和其中存在被检测的分析物的待测样品的质量和数量方面予以优化。
相反地，在许多临床情况中，患者的样品采集于亚最适(suboptimal)条件。此外患者的样品还可能本身即为亚最适的：例如患者样品间的载量存在广泛的差异和/或可能与许多可能会干扰检测过程的其他物质混合和污染。另外，这些物质可能会在个体样品间的数量和/或组成方面存在相差很大的差异。所述个体间的差异可能依赖于生理学条件、健康状况和/或饮食习惯。
因而一些在缓冲液中才有效的检测可能给出不可靠的结果或可能在应用于实际的患者样品时完全失败。与上述有关的一个例子是沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)的检测，所述沙眼衣原体是导致妇女不孕症和盆腔炎的原因。图1显示了当CT的原生小体(EB)在缓冲液中被穿刺与其在阴道液体中被穿刺相比较的检测水平。可以看到由于阴道样品中抑制性物质的存在而导致其检测信号降低了约100倍。
手工或自动检测如酶免疫测定(EIA)依赖于连续的试剂孵育和洗涤步骤以提高检测的灵敏度和降低样品对检测结果的抑制作用。然而就浸渍片分析来说，生物样品本身即作为液体来溶解干试剂以渗透于浸渍片。因为这里不存在孵育或洗涤的步骤并且因为其反应是快速的，所以由所述样品的质量所产生的影响是特别重要的。
Arko等人(Journal of Clinical Microbiology(1979)，9，517-519)公开了在用于检测淋病奈瑟球菌的玻片凝集试验(SAT)中核酸酶对特异细胞凝集的增强作用。然而该试验是在实验室培养物上进行的(生长在琼脂上的细菌细胞悬浮于含有每毫升1mg脱氧核糖核酸酶的磷酸盐缓冲液中)。该文献没有公开如何改善患者样品的检测(特别是子宫颈内液体样品或阴道液体样品)，也没有公开除SAT之外核酸酶处理还可以提高哪些检测。事实上，核酸酶处理并不改善在荧光抗体试验中淋球菌的荧光染色。
Tarkowski等人(Molecular Diagnosis(2001)，6(2)，125-130)描述了改良的用于分离自液态细胞学样品的病毒RNA的检测。总核酸(TNA)提取自在实验室培养的细胞系(来自新鲜细胞或来自固定于液态细胞学介质的细胞)。然后用脱氧核糖核酸酶I处理上述提取的TNA以允许通过逆转录酶-多聚酶链式反应分析样品中的核糖核酸。然而这里没有公开临床样品的检测，也没有公开如何经过处理来改善检测的灵敏度、特异性或可靠性。
因此，需要提出改良的疾病检测试验，其灵敏度、特异性和可靠性能够达到令人满意的水平，并且易于应用于患者的样品，不论该样品“质量”如何。
发明概述
本发明提供了一种改善用以检测感染性物质的亚最适患者样品“质量”的方法。本发明提供了若干步骤，所述步骤可以单独或联合应用以实现对亚最适患者样品进行的改良试验。
在一个优选的方面，本发明提供了一种用于处理人类患者样品的方法，用以实现对样品进行感染性物质检测的诊断方法，其中所述样品是子宫颈内液体样品或阴道液体样品，该方法包括在脱氧核糖核酸酶存在下完成诊断方法的步骤。优选地用脱氧核糖核酸酶处理子宫颈内液体样品或阴道液体样品。
值得重视的是本发明不需要预先了解患者样品的质量：具有不佳质量的样品会得到改善，已具有高质量的样品会不作变动或作微小的改善。总的结果是不论样品最初的质量如何，均可以获得对患者样品的高度可靠的检测结果，而不需对样品进行质量检测。
本发明将详细描述关于由沙眼衣原体引发的性传播性疾病的检测，所述检测是通过分析以自身采集的阴道拭子作为样品类型来完成。但是本发明将不限于所描述的优选的实施例，而是权利要求中所定义的范畴。
衣原体作为疾病的重要性
CT是在西方国家中最常见的性传播的病原体。CT的血清型D-K具有世界范围的分布并且是导致生殖器感染以及与眼和呼吸道相关的感染的原因。衣原体感染可导致严重的并发症和后遗症：例如盆腔炎(PID)，异位妊娠，女性不孕症，和婴儿出生时从感染的母亲获得的围产期的和先天性感染。
由于许多被感染的女性具有轻微的、非特异的症状或是无症状，所以CT感染经常是未确诊的。CT感染的筛检是疾病控制努力的重要组成部分。目前应用EIA或快速检测对女性的CT感染的诊断需要对盆腔进行检查。只有扩增的核酸检测如连接酶链反应(LCR)或聚合酶链反应(PCR)能够检测尿液样品。应用LCR或PCR的检测是复杂的，其需要昂贵的仪器并且检测结果通常在样品送检一周后才能得到。使用无损伤的样品(即尿液或自身采集的阴道拭子)进行快速检测将允许更多的女性得到检测，这包括那些或者被盆腔检查所阻碍或者无法获得检查(即因为缺少专业的内外科医师)的女性。
对来自女性泌尿生殖门诊的配对的尿液和阴道拭子的样品进行的LCR试验表明尿液中的CT微生物计数少于阴道拭子中。因此，应用自身采集的阴道拭子样品具有作为易于采集的无损伤性样品类型的优点。由于其较高的微生物载量使得该样品的应用与尿液相比还可提高检测的灵敏度。
目前的尿液检测方案需要在离心前用水稀释的步骤以降低尿液对检测的抑制作用。另外，应用尿液作为样品需要浓缩的步骤，这不但会增加成本也会延长处理时间。与上述有关的一个例子是Clearview衣原体MF(Unipath LTD，Bedford，England)检测，其中10ml的尿液样品用等量的蒸馏水或去离子水稀释，然后在3000g条件下离心15分钟。
虽然目前的实验没有关于阴道拭子样品的产品权利要求，但我们已发现阴道拭子样品对于目前的基于抗体的或扩增的DNA衣原体检测具有抑制作用。这些基于抗体的检测包括Clearview衣原体MF，QuickVue衣原体(Quidel Corp，CA，USA)，和衣原体OLA(Biostar，CO，USA)。
所述Clearview衣原体MF试验是一种用于检测女性子宫颈拭子样品或男性尿液样品中沙眼衣原体抗原的侧流免疫测定法。如上所述男性尿液样品需要稀释和离心的步骤，而拭子样品不需要。提取包括加入提取剂，在80℃下加热10分钟，并让样品冷却至少5分钟。检测过程包括将5滴样品提取物加到检测装置的样品窗中(免疫色谱检测条)，然后在15分钟后读取结果。
所述QuickVue衣原体试验是一种用于检测子宫颈拭子样品和细胞刷样品中衣原体抗原的侧流免疫测定法。作为试验操作，从子宫颈取得临床样品并置于含有提取溶液的试管中；2分钟后加入中和溶液至试管中。在提取和中和之后，将3滴经提取的样品加入到检测盒的样品池中并在10分钟后读取结果。
所述衣原体OLA是一种用于检测女性子宫颈拭子样品和新生儿的结膜样品中衣原体抗原的光学免疫测定法。该试验包括用两种样品提取剂和一种中和剂从样品中提取衣原体脂多糖(LPS)，随后应用光学免疫测定技术对该抗原进行定性检测。所述检测或试验过程包括5个步骤：将样品提取物加到检测仪器中(孵育5分钟)，加入偶联物(孵育5分钟)，洗涤，加入底物(孵育5分钟)，最后洗涤。检测结果依据明亮的光源下被试物表面反射的光计算。
本发明开发了一种快速的免疫色谱条试验，用于检测自身采集的阴道拭子的衣原体LPS抗原。为进行此试验，将所述拭子样品置于含有提取溶液的试管中。中和样品的提取物，并将等分试样加到免疫色谱检测条中(即“浸渍片”)。检测结果于15-25分钟后读取。
样品制备
当已知量的原生小体被穿刺到阴道拭子中(图1)可观察到阴道液体对所述分析灵敏度的抑制作用。在阴道液体存在下所产生的信号与缓冲液相比降低了约100倍。在阴道拭子样品中观察到至少两个方面的抑制现象：直接抑制抗体-抗原相互作用，和通过阻碍试剂的正常混合和减弱或阻止液体流动来间接抑制试验。
所述阴道样品含有能直接抑制抗体和其靶抗原(即脂多糖和抗-脂多糖抗体)之间相互作用的成分。这种抑制可能是经由物理地阻断抗体和抗原的结合，隔绝脂多糖目标，或通过对抗体分子所带电荷进行修饰而反向影响其亲和力。所述抑制作用在个体间和同一个体月经周期的不同时期之间存在较大的变异。
对正常的混合和液体流动的抑制与阴道液体固有的粘度有关。导致上述粘度的两个主要因素是样品中粘蛋白的水平和DNA的数量。一些样品中的高的粘蛋白水平导致了上述粘度以及大量的DNA趋向于形成凝胶样基质，因而物理地阻塞了膜并阻止或减弱液体的流动。
阴道液体在个体之间以及在女性每月的月经周期的不同时期之间存在很大的变异。其他一些情况的存在如精液，过度的细菌生长，酵母菌感染，阴道灌洗，和润滑剂也可能与所述变异有关。
一般实施例：阴道拭子样品
样品采集
1.使用聚氨基甲酸酯或聚酯(例如涤纶)拭子(在聚苯乙烯或聚丙烯的塑料柄上)采集阴道样品。棉塞和妇女卫生纸也可用于样品的采集。
2.所述拭子从阴道口插入优选6cm(3cm至9cm)深并在取出前旋转几次至少停留10秒钟。
3.在检测前，所述拭子可在2-8℃下干燥保存也可在样品采集缓冲液中保存2-4天。
样品制备
1.脱氧核糖核酸酶用于降解核酸的应用
一些阴道拭子样品含有大量的脱氧核糖核酸以至形成凝胶样基质，该凝胶样基质趋向于保留液体、阻塞所述硝化纤维膜并抑制试剂移动，因而导致试验完全失败。用脱氧核糖核酸酶消化上述脱氧核糖核酸以阻止上述情形发生。脱氧核糖核酸酶在加到多于0.5μg/ml或每毫升1.5活性单位是有效的，例如0.5-100μg/ml或每毫升1.5-300活性单位。所述脱氧核糖核酸酶所需的量最终取决于样品中脱氧核糖核酸的量以及酶作用的时间长短。
图4显示脱氧核糖核酸酶处理对浸渍片分析的有益效果。在一个感染了衣原体的个体的阴道液体中，用脱氧核糖核酸酶处理防止了在所述条的底部的阻塞并使得在检测线形成了更强的阳性信号。在衣原体阴性的阴道拭子样品B中，脱氧核糖核酸酶处理防止了在所述条的底部的阻塞，使得程序的对照信号能够形成。
同时，还检测了神经氨酸酶和溶菌酶对阴道液体的抑制特性。然而与脱氧核糖核酸酶不同，它们都始终不具有对阴道液体的抑制现象。神经氨酸酶的测试从每毫升阴道样品提取物3至200活性单位，溶菌酶的测试从每毫升阴道样品提取物830至100,000活性单位。
2.正十二烷基麦芽糖苷作为表面活性物质的应用
非离子型烷基糖苷特别是正十二烷基麦芽糖苷是最有效的用于从阴道样品中提取沙眼衣原体脂多糖的表面活性物质，从而使其可用于抗体检测。正十二烷基麦芽糖苷的浓度在重量体积比为0.01％至0.04％时作用最佳，优选地为重量体积比在0.015％至0.03％。
表1显示当阴道拭子来自不同的个体(A-G)时，所述每个拭子用20,000衣原体原生小体穿刺，上述添加正十二烷基麦芽糖苷到提取缓冲液中给出了最好的信号结果。
3.聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮的应用
当使用阴道拭子样品时聚乙烯醇(PVA)是一种有效的阻断剂。PVA被认为包被于上述硝化纤维膜的纤维上，从而有效地阻断其与其他试剂的结合。这使得在捕获线有更多的试剂用于反应。这还导致试验背景更干净。另外，它可通过作为脂多糖的载体或通过增加脂多糖胶束的形成来增强浸渍片试验的灵敏度。PVA的浓度在重量体积比为0.01％至0.5％时作用最佳。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)也可通过与PVA相似的机理增强上述试验的灵敏度，并且其浓度在重量体积比为0.2％至2％时作用最佳。
表2显示当阴道拭子来自不同个体(A-G)，所述每个拭子用20,000衣原体原生小体穿刺，对提取溶液中应用或不应用PVA进行试验，那些在PVA存在下提取的试验的信号更强。
4.H2O2用于氧化抑制性物质的应用
H2O2的添加可以中和一些阴道样品的抑制作用。这种作用可能与H2O2作为氧化剂因而通过氧化作用氧化某些抑制性物质有关。H2O2最适宜的浓度是重量体积比介于0.5％至3％之间。低于该浓度范围时效果降低而高于该浓度范围时会对试验产生不良的作用。
图2显示H2O2对不同个体中的沙眼衣原体浸渍片试验的信号的影响。阴道拭子采集自四个不同的个体(A-D)并用90,000衣原体原生小体穿刺每个拭子。提取步骤在添加或不添加1％H2O2的条件下进行。可以看到在没有经过H2O2处理的样品中没有观测到阳性信号，相反在那些经过H2O2处理的样品中都产生了强阳性的信号。
由图3可以说明上述抑制性物质主要存在于被处理样品的溶液部分。来自个体A-D的阴道拭子用每个拭子80,000原生小体穿刺。在提取脂多糖后，一半样品通过离心纯化以除去特殊物质得到进一步澄清。检测离心的和未离心的样品经过或不经过H2O2处理脂多糖的存在。可以看到在所有经过H2O2处理的样品中可以观测到显著增强的信号强度。
样品制备过程的一般实施例
首先获得自身采集的阴道拭子样品，然后按下述方式处理。(注意如果棉塞或妇女卫生纸被用于采集上述样品，所用试剂量需要作相应的调整。)
1.加入400μl试剂A到上述拭子中以破坏原生小体并提取脂多糖。试剂A包含100-300mM NaOH。所述拭子应在试剂A中孵育不超过5分钟。
2.加入300μl试剂B以降低pH、提供蛋白质和聚合物阻断剂，并形成脂多糖胶束。试剂B是0.5M三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH8.5包含100mM NaCl，130-400mM HCl和1％-4％蛋白质例如牛血清白蛋白，0.03％-1.3％聚乙烯醇和0.03％-0.1％正十二烷基麦芽糖苷。该拭子应孵育不超过5分钟。
3.加入100μl试剂C以氧化抑制性物质。试剂C是6％H2O2。所述样品应孵育不超过2分钟。
4.在多于0.5μg/ml或每毫升1.5活性单位，例如0.5-100μg/ml或每毫升1.5-300活性单位的脱氧核糖核酸酶存在条件下，将上述样品加样到试验条中。
参考文献
Smith K，Harrington K，Wingood G，Oh MK，Hook EW，DiClementeRJ.2001.自身采集的阴道拭子用于诊断治疗中的青春期少女性传播性疾病(Self-obtained vaginal swabs for diagnosis of treatablesexually transmitted diseases in adolescent girls).ArchPediatr Adolesc Med 155：676-679.
                                             表1
表面活性物质                                  个体
  A   B   C     D     E     F     G
  正十二烷基麦芽糖苷   1.5   2   2     1.5     2     2     2
  正辛基吡喃葡糖苷   1   1.5   0.5     1     1.5     2     2
  吐温20   2   0.5   1     0.5     1     1.5     2
  Chapso   0.5   0.5   0.5     0.5     1     1     1
  胆酸盐   0.5   0.5   1     0.5     0.5     1     1
上述信号用1～5来标度，5代表最强的信号
                                         表2
处理                              个体
  A   B   C   D   F   F   G
  不用聚乙烯醇   1   1.5   1   1.5   1   0.5   0.5
  用聚乙烯醇   2   2.5   2   2.5   2   2.5   1.5
上述信号用1～5来标度，5代表最强的信号

Claims (22)

1.一种用于处理人类患者样品以对所述样品实施诊断方法来检测感染性物质的方法，其中所述样品是子宫颈内液体样品或阴道液体样品，所述方法包括在脱氧核糖核酸酶存在下实施所述诊断方法的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述脱氧核糖核酸酶以多于0.5μg/ml，优选地是0.5-100μg/ml的量存在。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述脱氧核糖核酸酶以多于每毫升1.5活性单位，优选地是每毫升1.5-300活性单位的量存在。
4.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其另外包括在对所述样品实施诊断方法来检测感染性物质之前制备人类患者样品的方法，所述制备方法包括用氧化剂处理样品的步骤。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述氧化剂是过氧化氢(H2O2)。
6.如权利要求5所述的方法，其应用过氧化氢的工作浓度是重量体积比0.5％-3％。
7.如权利要求1至3或4至6中任何一项所述的方法，其另外包括用非离子型烷基糖苷表面活性物质处理样品的步骤。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述表面活性物质是正十二烷基麦芽糖苷。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述正十二烷基麦芽糖苷以重量体积比0.01％至0.04％，优选地是0.015％至0.03％的工作浓度存在。
10.如权利要求1至3或4至6或7至9中任何一项所述的方法，其另外包括单独或同时应用聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮处理样品的步骤。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述样品用聚乙烯醇处理，所述聚乙烯醇优选地具有介于20-25kDa的平均分子量和重量体积比介于0.01％-0.5％的工作浓度。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述样品用重量体积比介于0.2％-2％的工作浓度的聚乙烯吡咯烷酮处理。
13.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其另外包括如权利要求10至12中任何一项所述的方法步骤和如权利要求7至9中任何一项所述的方法步骤和如权利要求4至6中任何一项所述的方法步骤。
14.如权利要求1至13中任何一项所述的方法，其中所述人类患者样品是从自身采集的阴道拭子样品获得的。
15.如权利要求1至13中任何一项所述的方法，其中所述方法是用于沙眼衣原体的检测。
16.如权利要求1至13中任何一项所述的方法，其中所述患者样品是自身采集的阴道拭子样品并且所述方法是用于沙眼衣原体的检测。
17.如上述权利要求中任何一项所述的方法，其中所述方法是浸渍片试验法。
18.一种试剂盒，其包括：
-用于完成特定的感染性物质检测试验的浸渍片试验设备；
-为了完成上述特定的检测试验的上述设备所需的试剂；
-用于完成如权利要求1至3中任一项所述方法的脱氧核糖核酸酶试剂。
19.如权利要求18所述的试剂盒，其另外包括：
-用于完成如权利要求4至6中任一项所述方法的氧化剂试剂。
20.如权利要求18所述的试剂盒，其另外包括：
-用于完成如权利要求7至9中任一项所述方法的非离子型烷基糖苷试剂。
21.如权利要求18所述的试剂盒，其另外包括：
-用于完成如权利要求10至12中任一项所述方法的试剂，所述试剂是聚乙烯醇和/或聚乙烯吡咯烷酮。
22.如权利要求18所述的试剂盒，其另外包括：
-用于完成如权利要求1至15中任一项所述方法的如权利要求4至6中任一项所定义的非离子型烷基糖苷表面活性物质试剂和如权利要求7至9中任一项所定义的聚乙烯醇和/或聚乙烯吡咯烷酮试剂。
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