KR20150042146A - 정자 세포에서 세포내 감염제의 검출 방법 - Google Patents

정자 세포에서 세포내 감염제의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유세포 분석과 함께 면역형광을 이용하여 정자에서 클라미디아, 바이러스 및 다른 감염제의 존재를 조사하기 위한 방법을 기재한다. 이 방법은 DNA 완화 절차의 이용을 통한 정자 세포 내 미생물의 세포내 검출뿐만 아니라 정자 표면에 부착한 미생물의 검출을 위해 이용된다.

Description

정자 세포에서 세포내 감염제의 검출 방법{METHOD OF INTRACELLULAR INFECTIOUS AGENT DETECTION IN SPERM CELLS}
본 발명은 생식능력 저하 및 불임의 병인을 연구 및 결정하기 위해서 뿐만 아니라 선천성 감염을 예방하기 위한 노력으로, 정자 내부의 세포내 바이러스, 클라미디아(Chlamydia), 기생충 및 다른 미생물을 검출하기 위해 정액, 즉 정자-세포 집단을 분석하기 위한 방법을 기재한다. 전체 절차는 DNA 구조의 완화를 위한 특수 공정의 이용, 항체를 이용한 미생물 표적화 및 유세포 분석을 이용한 결과 평가로 달성된다.
생식능력 저하는 현재 여러 가정에 영향을 미치는 점점 빈번한 문제가 되어 가고 있다. 이 문제를 해결하기 위해, 체외 수정(IVF)을 포함하는 여러 접근법이 개발되었다.
나팔관 폐색, 무정자증 및 폐경은 생식능력 저하의 명백한 원인이다. 무정자증 및 폐경의 초기 단계인 정자부족증 및 폐경 전기도 생식능력 저하로 이어지는 요인으로서 점점 더 중요해지고 있으므로 관심의 대상이 된다. 1개 정자만으로도 임신을 위해 충분해야 하므로, 특히 정자부족증은 IVF를 통해 쉽게 해결되는 문제여야 한다. 그러나 실제로는 그렇지 못하다.
정자에 있어서는, 집중적으로 연구되었으며 특히 정자 질의 두 평가 파라미터, 즉 형태 및 운동성에 영향을 미치는 다양한 질적 결함이 존재한다. 운동성은 IVF 시도에서 발생학자들에게 마이크로-수정을 위한 정자의 적합성에 대한 대략적 정보만을 제공한다. 반면, 정자 형태는 정자가 수정에 적합한지 또는 적합하지 않은지의 평가에 대해 훨씬 더 정확한 기준이다. 그러나 정자 샘플의 형태학적 분석을 위해 이용되는 정자는 공정 중에 파괴되므로, 정자 형태는 IVF에서 이용될 우수한 정자의 선택을 위한 척도로서 직접 이용될 수 없다. 이에 따라, 생식능력 저하 커플(이들 중 다수가 IVF 방법을 이용하게 됨)의 관찰 시 고려되는 정자 샘플을 평가하기 위한 여러 방식이 확실히 존재한다(인간 정액 특징에 대한 국제보건기구 참조값, Human Reproduction Update 2009).
정자 샘플의 최종 분석은 각각의 검사된 정자에서 검출되는 모든 특수한 형태학적 장애의 조합된 평가 결과일 것이다. 이들 장애의 부재를 특징으로 하는 정자는 "적합한" 또는 "정상"인 것으로 분류된다. 또한, 생리학적 값은 비정상 정자 별로 형태학적 장애의 평균값을 측정하는 기형정자 지수(TZI)를 통해서도 얻어졌다. 샘플에서 아폽토시스성 정자, 즉 프로그래밍된 세포사 절차에 들어간 정자의 백분율 측정에 의해 정자 질을 평가할 수도 있다.
그러나 모든 정자 장애는 특수한 원인에 기인할 수 있다. 이러한 원인은, 예를 들어 만성 전립선염의 경우 미생물 또는 흡연, 비만, 과도한 신체 운동, 고온 등과 같은 다른 요인일 수 있다.
반면, 남성 생식능력 저하의 원인으로서의 바이러스성 요인은 지금까지 의료계에서 크게 고려되지 않았다. 2004년 및 2005년에 공개된 미국 생식 면역학 저널(American Journal of Reproductive Immunology)의 논문 2편에서, Locus Medicus S.A.의 연구자들(본 발명의 발명자인 V.Tsilivakos 포함)은 생식능력 저하 및/또는 유산 이력이 있는 여성 혈액 중 다수의 자연 살해(본원에서 NK로 불림) 림프구와 무증상성 헤르페스 바이러스혈증(HSV1-2, EBV, CMV, HHV6 및 HHV7)의 존재 간 연관성을 기재하였다.
그 후, 발명자들은 유산된 물질에서 NK 림프구가 대부분 착상 부위에 모여 있는 반면, 이들 여성에서의 혈중 NK 수준은 정상이었음을 관찰하였다. 발명자들의 이론에 따르면, 이는 이들 경우의 배아가 정자를 포함하는 정자 세포를 통해 남성에서 유래하는 바이러스성(적어도 헤르페스성) 항원의 존재로 인해 자체가 항원성인 경우에 설명될 수 있다. 이들 항원은 태아 세포에 의해 여성의 면역계에 발현되고 제시되어 NK 반응을 유도할 것이다.
그러나 정자 형태 또는 다른 정액 분석 파라미터와 같은 전통적 진단 방법을 통해 바이러스 요소의 존재를 확립하고자 시도했을 때, 이것이 실현가능하지 않음을 확인하였다.
커플이 불임 클리닉에 오면, 올바른 접근법은 문제의 원인을 조사하는 것이다. 불임에 관여되는 요인으로 여러 증상 및 징후가 시사되었지만, 이들 다수는 일차적 원인이 아니며, 이들 자체는 보통 그 박멸 또는 봉쇄가 치료에 기여할 수 있는 감염성 성질의 다른 요인의 결과이다. 예를 들어, 나팔관에서 클라미디아 또는 다른 미생물의 존재는 관 폐색으로 이어질 수 있으며, 처음에는 일시적이지만 치료적 개입이 일어나지 않는 경우 영구적이 될 수 있음을 안다. 유사하게, 세포 아폽토시스로 인한 정자를 포함하는 정자 세포의 DNA 단편화는 종종 남성 생식관의 다양한 부분의 박테리아 또는 가능하게는 바이러스 감염뿐만 아니라 산화적 스트레스와 같은 다른 요인의 결과이다.
커플 불임 문제 해결에서의 성공은 커플이 자연 임신을 달성하든 어느 종류의 보조 생식기술을 이용하든 간에, 문제의 일차적 원인 설명의 절대적 정확성에 의존한다. 불행하게도 최근에 와서야, 개별 연구자들(전체 의료계가 아님)에 의해 정액에서 바이러스 존재의 임상적 중요성이 인지되었으며, 그 사실은 바이러스가 궁극적으로 소란을 수정시킬 정자 내에 실제로 함유된 경우 임상적으로 더욱 더 관련성이 있다. 이러한 경우, 바이러스 감염은 정자로부터 접합체로 통과되어 태아 및 바이러스 세포의 동시 증식을 일으키는 수직 감염을 일으킬 수 있고, 이어서 헤르페스 바이러스의 경우 신경계에서 또는 다른 바이러스의 경우 심혈관계에서와 같이, 바이러스가 선천성 결함을 유도하는 것으로 알려져 있는 기관 및 조직에서 증식할 수 있다. 본 발명자들의 의견으로는, 감염성(바이러스성) 요인의 존재의 해로운 효과가 일어나기 위해서는, 감염에 대항하는 면역계가 실패해야 한다. 대조적으로 여성의 방어 기전이 바이러스 항원의 인식을 통해 감염성(바이러스성) 요인에 대면할 수 있는 경우, 이는 바이러스 감염된 태아 세포의 파괴로 이어질 것이다.
배아 세포 거부 기전에는 NK 세포를 통해 일어나는 것들이 관여될 수 있으며, 이에 대해 지난 25년 간 면역학적 병인을 갖는 첫 3개월의 유산 과정에서 이들의 역할에 대해 수많은 논쟁이 있어 왔다. 이는 그에 대한 NK 세포의 활성화가 후속 반응인 헤르페스 바이러스의 경우에는 적어도 사실일 수 있다. 또한 최근 문헌에서, 발명자들은 그리스인 교사에서 높은 불임 발생률을 기재하였다. 이는 이들의 아동기 바이러스 감염에 대한 높은 노출, 즉 더 높은 바이러스 농도에 기인할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 장기 관계를 맺은 커플에서 더 높은 유산 발생률을 관찰하였으며, 이는 여성쪽에서의 더 강한 면역 기억을 시사할 수 있다. 이는 남성 파트너의 "잘 아는" 바이러스에 대한 여성 면역계의 더 강한 면역학적 반응으로 이어져서, 감염된 배아 세포의 신속한 파괴를 유도할 것이다. 불행히도, 배아 항원성에 대한 국제적 연구는 아직 전혀 없었다. 그러나 본 연구자들은 발생 배아가 남성 전용 항원을 전혀 발현하지 않거나 또는 소수만 발현하며, 이는 남성에 의해 개발되는 항원이고, 이 항원은(적어도 첫 3개월이 끝날 때까지는) 여성 개체가 자신으로 인식하도록 생성되지 않을 것으로 믿는다.
배우자 간에 상이한 HLA 분자에 있어서, 이들의 발현은 여성의 면역계와 직접 접촉하게 되는 태아 세포에서 하향조절된다는 것을 알고 있다. 따라서 문제는, 첫 3개월의 유산 동안 또는 훨씬 더 일찍 일어나서 생리 지연을 통해 감지될 수 없는 유산 동안 어느 외래 항원을 여성 개체가 공격하느냐는 것이다. 향후에는 국제적 과학계가 태아에 대한 바이러스 항원의 수직 감염을 일으킬 수 있는 남성의 무증상성 바이러스 감염(산발성이거나 만성)의 각 경우에 대한 임상적 중요도뿐만 아니라 적절한 치료에 대해 다루는 것이 필요하다.
본 발명의 발명자들에 의한 상기 요인의 도입은 정자를 포함하는 정자 세포에서 비바이러스 및 다른 오염물을 고려하지 못하는 것이 불임의 부적절하고 부적합한 연구에 해당한다는 발명자들의 의견을 만들어냈다.
따라서 높은 감수성 및 특이도를 갖는 정자를 포함하는 정자 세포에서 감염제의 검출 방법에 대한 필요성이 크지만, 불행하게도 지금까지는 기술적으로 이것이 가능하지 않았다.
지금까지 정액에서 미생물, 예컨대 클라미디아를 검출하는 방법은 면역형광(슬라이드에 고정한 세포 현탁액)을 이용하였으나, 이는 매우 감수성이 낮은 방법이다. 혈액 중 순환 항체를 검출하는 혈청학적 ELISA 방법도 빈번하게 이용되지만, 감염 위치에 대한 정보가 전혀 없다.
마이코플라즈마를 포함하는 미생물이 최근 정액 배양에 의해 검출된다. 그러나 세포내 감염제를 배양하기 위해서는 특수한 세포주 및 세포 배양 장비의 이용뿐만 아니라 엄격한 안전 실험실 규제가 요구된다. 이러한 증가된 요건은 이 기법을 일일 단위로 적용하는 것을 거의 불가능하게 만든다.
최근 몇 년간, 분자적 기법(주로 중합효소 연쇄 반응 또는 PCR)이 정자 또는 정액의 세척 세포 성분으로부터의 DNA 추출 후 클라미디아 및 감염제의 검출을 위해 이용될 수 있다. 그러나 스캐닝 전자 현미경을 통한 정자를 포함하는 정자 세포 내부의 세포내 병원체 검출은 기재되지 않았다.
마지막으로 전자 현미경은 세포막의 외표면에 부착된 바이러스 또는 미생물의 존재만 검출할 수 있고, 세포내의 것은 불가능하다.
정액에서 바이러스의 검출을 위해 높은 감수성 및 특이도를 특징으로 하는 오늘날 이용가능한 가장 효과적인 접근은 정액의 세척 세포 성분의 PCR이다. 그러나 이 기법의 주요 단점은 세포외 또는 세포내 기생충을, 즉 검출된 미생물이 정자 외부에 있는지 또는 내부에 있는지를 구별할 수 없다는 것이며, 또한 감염된 특정 세포 유형이 정자인지 또는 정액에 함유된 다른 세포 유형, 예를 들어 백혈구 또는 정자 세포 전구체인지를 나타낼 수 없다.
또한, 바이러스 및/또는 톡소플라즈마에 대한 항체의 혈청학적 검출은 정자 세포의 내부 상이나 외부 상에서 또는 정액의 임의의 다른 세포 성분 상에서 감염제의 위치에 대한 어떠한 정보도 제공하지 않는다.
마지막으로 세포 내 미생물의 검출은 형광 또는 발색 인 시츄(in situ) 혼성화를 통해 가능하다. 그러나 상기 방법은 본 발명에 기재된 것에 비해 감수성이 더 낮고, 시간이 더 걸리고, 더 고가이다.
본 발명에서 최초로 개시되고 기재된 방법은 감염제의 세포내 검출, 즉 정자를 포함하는 정자 세포의 내부에(내부 상에) 위치하는 것들의 검출을 가능하게 한다.
"세포내 병원체의 검출 및 정량화"를 표제로 하는 Stuart 등의 US 특허 출원 공개 번호 US2006/0099661 A1은 세포 표면뿐만 아니라 세포내 모두에서, 주로 말초 혈액 세포에서 그러나 또한 정자를 포함하는 다른 생물학적 유체의 세포 상에서 클라미디아의 검출에 초점을 맞춘다. 상기 특허에서, 발명자들은
a) 생물학적 유체의 수득
b) 세포 표면 상이나 세포내에서 클라미디아 항원의 특이적 인식을 위한 일차 항체의 이용 및
c) 유세포 분석을 이용한 샘플 분석의 세 기본 단계를 기재한다.
이에 따라, 이들은 특허에 기재된 제시 방법을 이용하여 말초 혈액 세포에서 클라미디아의 검출에 성공했다고 기재한다.
또한 화학제 TRITON-X를 이용한 림프구 내에서의 기재된 클라미디아 검출 방법에 따라, "세포내 병원체의 검출 및 정량화"를 표제로 하는 US 특허 출원 공개 번호 US2006/0099661 A1의 저자들은 이 방법이 정자 세포를 포함하는 다른 세포 내에서의 클라미디아의 검출에도 확장될 수 있다고 주장한다.
상기 선행 기술 문헌에서 시도된 가정을 시험하기 위해, 본 발명의 발명자들은 US2006/0099661 A1에 기재된 실험을 발명자들인 Elizabeth S. Stuart 및 Lloyd H. Semprevivo가 제안한 실험 방법에 따라 수행하였다. 그러나 정자 세포 내에서 클라미디아의 검출에 대한 방법 확장에 관한 US2006/0099661 A1에 표현된 주장에도 불구하고, 도 1에 뒤따르는 히스토그램에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 Stuart 및 Semprevivo가 기재한 실험 기법에 따라 본 발명에서 발명자들이 개시한 방법에 의해 클라미디아의 존재에 대해 "매우 양성"으로 분석된 공지된 샘플에 대해, 정자 세포의 세포내에서 클라미디아 검출이 불가능함을 확인하였다.
본 발명자들의 결과에 따르면, Stuart 및 Semprevivo가 기재한 절차에 따른 클라미디아의 검출에 이용된 정자 샘플을 나타내는 곡선은 대조군에 비해 오른쪽으로 이동을 나타내지 않았으며(도 1의 1B) 두 곡선은 구별이 불가능하다. 이는 상기 방법이 샘플에서 클라미디아의 존재를 검출하지 못했음을 의미한다. 본 발명의 발명자들은 정자 세포 내에서 클라미디아를 검출하기 위한 Stuart 및 Semprevivo의 방법의 실패가 세포의 효소적 처리(DNAase 이용)의 부재에 기인하는 것으로 보며, 이 처리는 본 발명의 발명자들이 정자 세포 내부의 임의의 감염성 요인(박테리아성 또는 바이러스성)의 검출을 위한 절차의 필수 단계인 것으로 제시하고 증명했으며, 이 절차는 본 발명의 방법에 중요하고 본질적인 요소이다.
또한, 본 발명의 발명자들의 결과는 Stuart 및 Semprevivo의 방법이, 특히 직접 형광 방법을 이용하는 경우 정자 연구가 고려되는 범위에서 낮은 감수성 및 낮은 특이도를 특징으로 한다는 것을 나타내었다. 이는 Stuart 및 Semprevivo의 특허 출원에 제시된 프로토콜을 이용하여, 마우스 항원에 대해 특이도를 갖는 항-CD3 항체는 음성 대조군 정자 샘플 내부에서 검출되는 반면, 이론적으로 상기 항체는 정자 세포에서 임의 항체에 결합하지 않아야 함을(낮은 특이도임을) 나타내는 도 2에 예시된다. 다시 말하면, Stuart 및 Semprevivo에서 제시된 방법은 오류가 있고 오도하는 결과를 생성한다.
상기 결과는 정자 세포의 세포내에서 클라미디아를 검출하기 위한 Stuart 등의 특허 출원 US 2006/0099661 A1에서 제시된 방법이 본 발명에서 주지하는 문제에 대한 해결책을 제공하지 않음을 증명한다.
본 발명자들의 관점에 따르면, 정자에서 추정 감염 요인의 자세한 연구는 조기 임신 실패, 생화학적 임신, 정자부족증, 정자무력증 또는 기형정자증, 성공하지 못한 IVF 시도, 생식능력 저하 중 하나 이상의 임상 이력이 있는 경우 또는 일반적인 생식능력 저하의 예방을 위해 필수적이다.
특히 생식능력 저하의 예방을 위해 일차적인 초점은 정자에서의 클라미디아 검출이며, 본 발명자들은 다른 미생물의 존재도 검출하기 위한 관점에서 정자발육계도 및 정자 배양과 조합하여 이를 수행하기로 선택하였다.
본 발명은 직접적 또는 간접적 면역형광의 이용에 이어 유세포 분석을 이용한 가시화 및 평가에 의해 정자 내부의 바이러스, 클라미디아, 기생충 및 다른 미생물의 존재를 검출하고 연구하는 방법을 기재한다.
본 발명은 정자 내부에 있는 미생물을 검출하기 위해 상기 검출이 세포 내에서 수행됨을 기재한다. 특수한 DNA 완화 처리, 예를 들어 DNA 효소분해를 이용하여 유세포 분석 결과의 평가와 조합된 면역형광 방법이 본 발명에서 제안된다.
정자에서 세포내 바이러스, 클라미디아, 기생충 및 다른 감염성 병원체의 존재를 조사하기 위한 기재된 방법이
- 정자를 포함하는 정자 세포의 DNA의 조밀 구조를 완화시키는 단계,
- 직접적 또는 간접적 정자 세포내 면역형광 단계,
- 유세포 분석을 이용한 결과의 가시화 및 평가 단계를 포함하는 것이 본 발명의 특징이다.
본 발명자들은 표적 항원을 특정 항체에 의해 검출가능하게 만들기 위해, 면역형광 이전에 DNA 조밀 구조의 DNA 완화가 일어나는 것이 결정적임을 강조하고자 한다.
유세포 분석에 의한 결과의 가시화 및 평가 단계는 1N 및 2N 세포 간 구별을 구현하기 위해 세포 펠렛을 WB 중 7-아미노액티노마이신 D(7AAD)와 인큐베이션하는 것을 포함하는 것이 유리하다.
바람직하게는 본 발명에 기재된 방법은 생식능력 저하, 조기 임신 실패 또는 유산 또는 태아 상실의 원인 결정을 위해 수행된다. 또한, 이는 선천성 감염의 예방 및 연구를 위해 또는 수직 감염의 예방을 위해 그리고 남성 생식계의 염증 및 감염, 예를 들어 부고환염의 검출을 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 하기 병원체 중 하나의 특이적 존재를 검출할 수 있다: 사이토메갈로바이러스(CMV), 헤르페스 심플렉스 바이러스 I(HSV I), 헤르페스 심플렉스 바이러스 II(HSV II), 엡스테인 바르 바이러스(EBV), HHV6, HHV7, HHV8, 파르보바이러스 19, B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 콕사키 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1, HIV-2), 아데노-연관 바이러스(AAV), 루벨라 바이러스, HPV, 클라미디아, 톡소플라즈마 및 노로바이러스.
특히 정자에서 클라미디아의 검출에 관해, 본 발명의 방법은 이들이 동일한 샘플 또는 상이한 샘플 상에서 수행될 수 있다는 상당한 장점과 함께, 다른 병원체의 검출을 위한 정자발육계도 및 정액 배양과 조합될 수 있다.
바람직하게는 매우 조밀한 정자 DNA의 DNA 구조 완화는 DNA 효소분해로 수행되며 DNA 단편화를 일으킨다.
DNA 효소분해는 DNA를 자르는 효소로 수행되는 것이 유리하다.
예를 들어, 상기 효소는 DNase I일 수 있다.
면역형광에 있어서, 임의의 적합한 형광 항체 또는 항 항체가 이용될 수 있다. 상기 목적을 위해, 오늘날 알려져 있는 플루오레신-5-이소티오시아네이트(FITC), 아미노메틸쿠마린 아세테이트(AMCA 350), 6,8-디플루오로-7-히드록시쿠마린 유도체(마리나 블루), 캐스케이드 블루, 알렉사 플루오르 405, 6,8-디플루오로-7-히드록시쿠마린 유도체(퍼시픽 블루), 알렉사 플루오르 430, 캐스케이드 옐로우, 알렉사 플루오르 488, 피코에리트린(PE), 피코에리트린 텍사스 레드(PE-텍사스 레드), 피코에리트린-시아닌 5(PE-Cy5), 페리디닌 엽록소 단백질(PerCP), 페리디닌 엽록소 단백질-시아닌 5.5(PerCP-Cy5.5), 피코에리트린-시아닌 7(PE-Cy7), 로다민 TR, 알로피코시아닌(APC), 알렉사 플루오르 647, 알로피코시아닌 시아닌 7(APC-Cy7), BD APC-H7 또는 알렉사 플루오르 700 중 어느 하나를 포함하는 임의의 형광단이 이용될 수 있다.
본 발명의 방법에는 표면 항원을 검출하기 위한 추가 단계가 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 이용해서 정자 내부의 클라미디아, 바이러스, 기생충 및 다른 병원체를 정자내 검출하기 위한 키트의 개발 및 용도를 기재한다. 키트는 정자 세포의 DNA를 완화시킬 수 있는 물질을 반드시 포함해야 한다. 상기 물질은, 예를 들어 DNA를 효소분해하는 효소일 수 있고; 예를 들어 효소는 DNase I일 수 있다. 또한 본 발명에 개시된 키트는 그 존재 확인이 요구되는 특정 병원체에 대한 하나 이상의 항체를 포함해야 한다. 상기 항체는 상술된 것과 같은 형광단으로 직접 표지될 수 있다. 병원체에 대한 특이적 항체가 표지되지 않은 경우, 첫 번째 항체를 인식하는 두 번째 형광단 표지된 또는 바이오틴화된 항체가 포함되어야 한다.
본 발명은 하기 도면들을 이용하여 예시될 수 있다.
도 1에서, Stuart 등의 특허 출원 번호 US 2006/0099661 A1에 기재된 프로토콜에 따른(다른 세포 유형을 위한) 정자 내부의 클라미디아 검출 실패를 나타낸다. 동일한 샘플은 본 발명에 따른 DNA 효소분해 후 강한 양성으로 분석된다(데이터는 나타내지 않음).
도 2는 Stuart 등의 특허 출원 번호 US 2006/0099661 A1에 기재된 프로토콜에 따른(다른 세포 유형을 위한) 항체 특이도의 손실을 나타낸다. 마우스 CD3에 대한 항체는 정자에 비특이적으로 결합하여 형광을 오른쪽으로 이동시킨다.
도 3에서, C. 트라코마티스 및 HSV 항원의 유세포 분석을 이용한 정자내 검출이 예시된다. 도 3의 3A, 3B, 3C에서, DNase I 분해 후 특이적 항원의 검출이 관찰된다. 대조적으로 DNase I 분해가 선행되지 않은 도 3의 3D, 3F, 3G에서는 이러한 검출이 되지 않는다.
본 발명의 구현예의 실시예는 다음과 같다:
1. 정자를 포함하는 정자 세포의 고정
정액 수집 및 액화 후, 정자를 회전 침강시키고 4℃에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정한다. PFA는 단백질 가교에 의해 작용하여 병원체를 비활성화시키고 이미 정자에 연결된 추정 자가항체를 고정하여 필요한 경우 이들이 검출가능하게 만든다. 일부 드문 경우, 일부 항원 에피토프는 특정 항체에 의해 검출불가능하게 변경되거나 파괴될 수 있다. 이러한 경우, 고정 전에 표면 염색이 수행될 수 있다. 또한, PFA 고정은 세포의 물리적 특징을 보존한다: 즉, 고정 후 세포는 유세포 분석으로 수행되는 분석 동안 나타낸 동일한 산란 특징을 나타낸다. 또한 PFA 고정은 세포외 또는 세포내 염색 절차의 후속 적용을 가능하게 한다.
2. 중요 공지 : 특정 항체를 이것이 인식하고 결합하는 병원체와 인큐베이션하기 전에, 정자의 조밀 DNA 구조를 완화시키거나 느슨하게 만드는 단계를 먼저 수행하는 것이 절차에서 핵심적으로 중요하며 필요하다. 상기 절차는 DNA 구조를 느슨하게 만들 수 있는 임의의 방법에 특히 정자 DNA의 조밀 구조를 완화시키는 능력이 있는 DNA 효소분해로 수행될 수 있다. 이러한 DNA를 느슨하게 만드는 절차는 기계적, 열적, 전기분해 방법이나 환원제, 예컨대 β메르캅토에탄올, 디티오트레이톨, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀의 이용 등 동일한 결과를 달성할 수 있는 임의의 다른 수단으로 수행될 수 있다. 이는 DNA 효소분해를 위한 효소의 이용이 될 수도 있다. 본 명세서에 제시되는 특정 실시예에서, 이러한 물질의 예는 DNA 분해 효소이다. 본 명세서에서 이용된 특정 실시예에서, 이러한 DNA 분해 물질로 효소 DNAse I을 이용하였다. 도 3은 DNase I 분해 단계 부재 시 병원체 검출의 실패를 예시한다.
3. 정자내 염색(간접적)
간접적 염색은 직접적 염색에 비해 비용이 적게 소요되므로 본 실시예에서 이용된다. 그러나 본 발명은 또한 후술되는 직접 컨쥬게이션된 항체를 대안적으로 이용하는 경우에도 작용할 수 있다.
A. 세포 분획을 회전 침강시키고, 재현탁하고, 4% PFA 및 0.1% 사포닌을 함유한 인산염 완충 식염수(PBS)(배지 A) 100 내지 500㎕와 함께 30분 동안 인큐베이션한다. 이어서 세포를 0.1% 사포닌 및 2% 소 태아 혈청(FCS)을 함유하는 PBS(세척 완충액-WB) 2ml로 세척한다. 상층액을 버리고 펠렛을 10분 동안 10% 디메틸 설폭시드(DMSO) 및 0.1% 사포닌을 함유한 PBS 100 내지 500㎕와 함께 인큐베이션한다. WB로 세척 후, 펠렛을 4℃에서 배지 A 100 내지 500㎕를 사용하여 고정한다. 10분 인큐베이션 후, 세포를 WB로 세척하고, 상층액을 버리고 펠렛을 재현탁하고, 37℃에서 DNase I(500㎍/ml)과 함께 30분 동안 인큐베이션한다. 마지막으로 세포를 WB로 세척하고, 상층액을 버리고 펠렛을
a. 사이토메갈로바이러스(CMV)
b. 헤르페스 심플렉스 바이러스 I(HSV I) 및/또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 II(HSV II)
c. 엡스테인 바르 바이러스(EBV)
d. HHV6
e. HHV7
f. HHV8
g. 파르보바이러스 19
h. B형 간염 바이러스
i. C형 간염 바이러스
j. 콕사키 바이러스
k. HIV(HIV I, HIV II)
l. 아데노 연관 바이러스(AAV)
m. 루벨라 바이러스
n. HPV
o. 노로바이러스
p. 클라미디아
q. 톡소플라즈마의 병원체 중 하나에 특이적인 특정 항체의 적정량과 함께 인큐베이션한다.
세포와 항체의 인큐베이션은 각각의 한 병원체에 대한 별도 튜브에서 또는 동일 튜브에서 일어나며, 별도의 형광단과 직접 컨쥬게이션된 항체가 있는 경우, 서로를 대비하는 색상을 방출하는 병원체의 동시적 검출을 허용한다. 4℃에서 30분 인큐베이션 후, 세포를 WB로 세척하고 상층액을 버린다.
B. 세포 펠렛을 재현탁하고, 첫 번째 항체가 개발된 동물의 면역글로불린에 대한 폴리클로날 형광단 컨쥬게이션된 항체 50㎕과 함께 새로 인큐베이션한다. 임의의 형광단이 이용될 수 있다. 다음은 현재 가장 많이 알려져 있는 형광단으로, 예시적으로 언급되며 본 발명의 형관단 선택을 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다:
플루오레신-5-이소티오시아네이트(FITC), 아미노메틸쿠마린 아세테이트(AMCA 350), 6,8-디플루오로-7-히드록시쿠마린 유도체(마리나 블루), 캐스케이드 블루, 알렉사 플루오르 405, 6,8-디플루오로-7-히드록시쿠마린 유도체(퍼시픽 블루), 알렉사 플루오르 430, 캐스케이드 옐로우, 알렉사 플루오르 488, 피코에리트린(PE), 피코에리트린 텍사스 레드(PE-텍사스 레드), 피코에리트린-시아닌 5(PE-Cy5), 페리디닌 엽록소 단백질(PerCP), 페리디닌 엽록소 단백질-시아닌 5.5(PerCP-Cy5.5), 피코에리트린-시아닌 7(PE-Cy7), 로다민 TR, 알로피코시아닌(APC), 알렉사 플루오르 647, 알로피코시아닌 시아닌 7(APC-Cy7), BD APC-H7, 알렉사 플루오르 700.
4℃에서 30분 동안 세포를 인큐베이션한 후 세포를 WB 2ml로 세척한다. 백혈구 연구를 수행해야 하는 경우, 절차를 다음 단계로 진행한다. 대안적으로, 절차를 세포가 수확되는 단계로 진행한다.
선택적인 백혈구 염색 단계
미생물이 정액의 백혈구에 존재하는지에 대한 의문에 직면하는 경우, 샘플을 백혈구 내에서 가능한 병원체의 존재를 평가하기 위해 백혈구 항원에 대한 직접 컨쥬게이션된 항체와 인큐베이션할 것이다. 상기 항체에 부착된 형광단은 병원체 검출에 이용된 다른 형광단과 달라야 한다. 4℃에서의 30분 인큐베이션 후 또 다른 2ml의 WB로 세척한다. 상층액을 버리고 세포를 재현탁한다. 또한 WB 중 7-아미노액티노마이신 D(7AAD)와 세포 펠렛의 인큐베이션 후 1N 및 2N 세포 간 구별이 가능하다. 5분 인큐베이션 후, 세포는 유세포 분석에서 확보될 준비가 된다.
병원체의 직접적 면역표현형 분석
대안적으로 추정 병원체에 대한 특이적 항체에 형광단이 직접 컨쥬게이션되는 경우, 전술된 단계 B가 생략될 수 있다. 또한 각각의 특이적 항체는 바이오틴으로 컨쥬게이션될 수 있고, 스트렙타비딘-형광단 복합체와의 후속 인큐베이션으로 이들의 검출이 달성될 수 있다. 바이오틴에 대한 대안으로, 임의의 다른 방식의 형광단 컨쥬게이션이 이용될 수 있다. 하기 알려져 있는 형광단을 비제한적으로 포함하는 임의의 형광단이 이용될 수 있다: 플루오레신-5-이소티오시아네이트(FITC), 아미노메틸쿠마린 아세테이트(AMCA 350), 6,8-디플루오로-7-히드록시쿠마린 유도체(마리나 블루), 캐스케이드 블루, 알렉사 플루오르 405, 6,8-디플루오로-7-히드록시쿠마린 유도체(퍼시픽 블루), 알렉사 플루오르 430, 캐스케이드 옐로우, 알렉사 플루오르 488, 피코에리트린(PE), 피코에리트린 텍사스 레드(PE-텍사스 레드), 피코에리트린-시아닌 5(PE-Cy5), 페리디닌 엽록소 단백질(PerCP), 페리디닌 엽록소 단백질-시아닌 5.5(PerCP-Cy5.5), 피코에리트린-시아닌 7(PE-Cy7), 로다민 TR, 알로피코시아닌(APC), 알렉사 플루오르 647, 알로피코시아닌 시아닌 7(APC-Cy7), BD APC-H7, 알렉사 플루오르 700.
4. 결과 확보 및 평가
유세포 분석 장치에서 샘플이 확보되고 적합한 소프트웨어를 이용하여 데이터 분석이 수행된다. 세포를 이들의 크기 및 복잡성 및/또는 항원(예컨대 백혈구 항원)의 발현에 근거한 영역 조합을 이용하여 관문화한다. 분석은 정자내 또는 정자의 다른 세포 성분내 병원체의 추정 존재에 초점을 맞춘다. 또한, 백혈구에서 이러한 병원체의 검출은 백혈구 항원의 발현에 근거해 적합한 영역을 이용하여 실현가능하다.
B. 표면 면역염색
정자내 염색에 부가하여, 추정 세포외 병원체의 검출도 실현가능하다. 두 번째 세포 분획을 원심분리하고, 상층액을 버리고, 세포를 각각의 병원체에 특이적인 특정 항체의 적정량을 함유하는 튜브로 동일하게 분배한다. 4℃에서 30분 인큐베이션 후, 튜브를 2% FCS를 함유하는 PBS(PBS-2% FCS)로 세척하고 상층액을 버린다. 다음으로 세포를 재현탁하고, 첫 번째 항체가 개발된 동물의 면역글로불린에 대한 폴리클로날 형광단 컨쥬게이션된 항체 50㎕에서 한 번 더 인큐베이션한다. 4℃에서 30분 인큐베이션 후, 튜브를 2% FCS를 함유하는 PBS(PBS-2% FCS)로 세척하고 상층액을 버린다. 다음으로 세포를 재현탁하고, 확보 및 분석을 위해 유세포 분석 장치에 둔다.
도면의 상세한 설명
특히, 도 3의 2D 산란 플롯에서, 정자(FSC-H)의 크기를 이들의 복잡성(SSC-H)에 대해 나타내며, 여기서 정자 풍부 세포 집단이 연구될 수 있도록 폐쇄 영역 R이 정의된다.
DNAse의 이용 없이 상기 절차에 따라 각각 하나의 클라미디아 항원 및 하나의 헤르페스 항원을 검출하는 항체를 위한 특정 형광단을 도 1의 히스토그램 3E 및 3F에 나타낸다. 또한 동일한 히스토그램에서, 표지된 항-항체에 의한 대조군의 형광도 나타낸다. 이들 두 곡선의 비교는 항원이 검출되지 않음을, 즉 감염제가 검출되지 않음을 나타낸다.
동일한 폐쇄 영역 R에서 정자 연구로부터의 동일한 파라미터를 도 3의 히스토그램 3A, 3B 및 3C에 예시하지만, 이 경우 DNAase 인큐베이션이 위에 상세히 설명된 바와 같이 포함되었다. 데이터 분석은 대조군(감염제 특이적 항체의 이용을 생략하고 동일 절차에 의해 처리됨)에 비해, DNAse의 존재 하에 오른쪽으로의 형광 이동으로 발현되는 바와 같이 정자에서 감염제 검출이 실현가능함을 나타낸다.
도 1 및 도 2는 본 명세서의 선행 기술 챕터에서 상세히 전술된다.
본 발명의 방법의 장점
·세포 고정, 막 투과화 그리고 가장 중요하게는 DNA 분해 효소를 이용하여 DNA 조밀 구조를 효소적으로 느슨하게 하기 위한 기법 및 조건이 충족되는 경우, 본 발명에 기재된 정자를 포함하는 정자 세포 내부의 감염제 검출 방법의 주된 장점은 그 높은 감수성이다. 본 발명의 발명자들이 수행한 병렬 연구에서, 본 발명의 방법은 동일한 샘플 상의 분자적(PCR) 검출 시험이 음성인 경우에도 감염제의 존재를 검출하는 것으로 나타났다. 또한, 특정 비드를 이용하여 항원의 수에 형광 수준을 매치할 수 있는 기법을 이용하여, 형광 강도를 감염된 정자를 포함하는 정자 세포 당 미생물 또는 바이러스의 수와 연관시키는 곡선을 구축할 수 있다. 본 발명에서 제시되는 방법은 샘플 당 많은 수의 세포(예로 20,000개)의 연구 및 샘플의 후향 재평가를 가능하게 한다. 제시된 방법에 의해 제공되는 이러한 정량적 우수성은 위음성 결과(감염제의 검출 실패)의 가능성을 최소화한다.
·음성 대조군의 이용을 통해, 그리고 물론 모노클로날 항체(각각의 미생물 또는 바이러스의 특정 분자의 하나의 특정 부위를 특이적으로 검출하고 반응하는 시약)의 이용을 통해 방법의 고특이도가 구축되었고 보장된다. 또한, 산란 특징 평가를 통해 및/또는 보조 항체(즉 항-CD45)의 도움을 받아, 정자를 포함하는 정자 세포에서 미생물의 존재가 확인될 수 있다. 또한 감염제가 정자를 포함하는 정자 세포의 내부가 아니라 세포막의 외표면에 부착되어 있음이 확실히 나타난다; 이러한 정보는 임상적으로 큰 중요성을 가질 수 있다.
·기재된 방법은 항균 또는 항바이러스 치료의 유효성을 평가할 수 있게 한다. 샘플에서 검출된 미생물(예로 테트라사이클린 치료 후 클라미디아)의 숫자의 감소로 나타낸 바와 같이 감염 회귀를 측정함으로써 병원체 상태를 모니터링하기에 유용하다.
·고정된 샘플은 시험될 때까지 장기간 동안 안전하게 보관될 수 있다. 고정된 샘플의 운송도 가능하다. 정액 연구를 위해 본 발명에 기재된 방법은 유세포 분석의 이용을 필요로 하므로, 이 기술이 없는 실험실에서는 이것을 이용할 수 없다. 이 문제를 다루기 위해, 본 발명에 기재된 방법은 감수성 또는 특이도의 손실 없이 고정된 샘플의 안전한 전달 또는 운송(상이한 위치 및 실험실 간)을 가능하게 한다. 또한 안전한 샘플 수송 능력은 유세포 분석의 기술적 실패 시 상이한 실험실에서 샘플의 재평가를 가능하게 한다. 마지막으로, 생성 데이터는 장치에 의해 전자적으로 저장되므로, 언제든지 재평가를 위해 이용가능하다.
·기재된 방법은 동등한 PCR 시험에 비해 확실히 더 낮은 매우 낮은 비용을 특징으로 한다.
·기재된 방법은 또한 시험 결과를 동일한 날에 이용가능하여 매우 빠른 실험실 총처리 시간을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 최초로 특정 면역형광 기법을 이용하여 정자를 포함하는 정자 세포에서 세포내 감염제를 검출하고 유세포 분석에 의해 시험 결과를 평가하는 방법을 기재한다.
- 정자의 세포내 분석은 세포 내부의 DNA 구조를 "느슨하게 하는" DNA 분해 효소의 이용에 의해 가능해진다. 본 발명의 발명자들은 현재까지 정자 머리 내에서 미생물(표적 항원)을 검출하기 위한 시약(항체)의 무능이 그 세포 영역에 존재하는 특정한 매우 높은 농도의 DNA에 기인하는 것으로 보았다. 그 결과, 본 발명의 발명자들은 표적 항원(미생물)에 접촉하고 결합하기 위한 항체를 위한 경로를 제거하기 위해 효소분해를 통한 DNA의 "느슨하게 하기"가 필요하다고 간주한다.
- 세포내 또는 세포막의 외표면 상의 미생물 검출이 고려되는 경우, 본 발명의 발명자들은 이들을 상이한 임상 해석을 갖는 2개의 상이한 종류의 접근이라고 여긴다. 예를 들어 본 발명의 발명자들은 무증상 바이러스혈증 및 클라미디아혈증을 혈액-정소 장벽의 투과를 통한 전구체 정자 세포 감염에 기인한다고 본다. 반면, 미생물의 막 편재는 주로 정자 배출 경로(부고환, 전립선, 요도)의 감염에 연관된다.
자연 수정에 있어서, 접합체 세포는 세포내 감염제의 수직 감염, 즉 정자에 의한 태아로의 직접적 감염제 전염에 대해 보호되는 것으로 보이지 않는 반면, 막 결합 감염제의 전염은 보다 쉽게 억제될 수 있다. 예를 들어 Aynaud 등의 문헌[Frequency of herpes simplex virus, cytomegalovirus and human papillomavirus DNA in semen. Aynaud O et al., Int J STD AIDS. 2002 Aug; 13(8):547-50]에 따르면, 정액 혈장은 세포막에 대한 바이러스 부착을 방지한다.
본 발명의 발명자들은 정액 혈장, 항체, 프로테아제 등과 같은 요인의 효과로 인해, 세포 표면 상의 감염제가 수직 감염에 있어서 상대적으로 중요하지 않은 위험 요인인 것으로 간주한다. 대조적으로, 이들은 온전한 세포내 감염제의 태아로의 수직 감염을 선천성 질환, 불임 또는 조기 유산과 같은 문제 발생에 있어서 큰 위험인 것으로 간주한다.
특히 (세포질내 정자 주입이 아닌) 자연 수정 동안, 정자의 머리만이 난자에 들어가는 반면, 세포의 나머지(정자 세포 표면의 대부분을 차지함)는 배제된다. 그 결과, 세포내 감염제는 불가피하게 난자에 들어가는 반면, 정자 세포막은 수정 동안 접합체 외부에 남아 있으므로, 막 결합 미생물은 난자에 들어가지 않는다.
그 결과, 본 발명의 발명자들은 정자로부터 태아로의 수직 감염 연구에서 세포내 감염제의 조사가 가장 중요하다고 간주한다.
아래 표 1에서, LOCUS MEDICUS S.A.의 실험실에서 시험된 샘플로부터의 데이터뿐만 아니라 5개월 기간 동안 LOCUS MEDICUS S.A.의 세포 생물학 및 면역학 실험실로부터의 예비 결과를 나타낸다.
유세포 분석을 이용한 정자 샘플에서의 감염제 검출
샘플의 전체 수 양성 매우 양성
(N) (%) (N) (%)
sCT 310 204 65.81 14 6.86
cCT 329 219 66.57 49 22.37
CMV 273 125 45.79 19 15.20
EBV 243 59 24.28 1 1.69
HSV I/II 242 103 42.56 7 6.80
sCT: 막-결합된 C. 트라코마티스, cCT: 세포내 C. 트라코마티스, CMV: 사이토메갈로바이러스, EBV: 엡스테인 바르 바이러스, HSV I/II: 헤르페스 심플렉스 바이러스.
본 발명자들은 샘플의 5% 초과에서 양성 정자가 검출되는 샘플을 "매우 양성"으로 간주한다.
상기 결과는 시험된 샘플의 상당 비율이 세포내 클라미디아 및/또는 바이러스에 감염된 것으로 나타났음을 보여준다. 검출된 세포내 감염은 다른 방식으로는 확인할 수 없었다. 양성 결과(즉 감염 검출)는 감염이 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 적절한 항생제로 즉시 치료될 수 있도록 한다.
유세포 분석을 이용해서 "매우 양성" 샘플의 C. 트라코마티스 감염에 대한 항생제 치료 이전 및 이후 클라미디아 부하의 유의미한 감소를 나타내는 사례의 수
전체 사례 수 클라미디아 부하의 유의미한 감소
(사례 수) %
sCT 37 20 54.05
cCT 37 27 72.97
sCT: 막-결합된 C. 트라코마티스, cCT: 세포내 C. 트라코마티스
보다 구체적으로, 표 2는 막-결합된 C. 트라코마티스가 검출된 총 37개의 "매우 양성" 샘플 중 20개(54.05%)에서 항생제 치료 후 클라미디아 부하가 감소되었음을 나타낸다. 또한, 표 2는 C. 트라코마티스의 세포내 검출 사례에서 항생제 치료 후 37개 중 27개(72.97%) 사례가 개선을 나타내어 클라미디아 부하 감소를 나타낸 샘플의 백분율이 훨씬 더 높았음을 보여준다.

Claims (13)

  1. - 정자를 포함하는 정자 세포의 DNA의 조밀 구조를 완화시키는 단계,
    - 직접적 또는 간접적 정자 세포내 면역형광 단계,
    - 유세포 분석을 이용한 결과의 가시화 및 평가 단계
    를 포함하는, 정자에서 세포내 바이러스, 클라미디아, 기생충 및 다른 감염성 병원체의 존재를 조사하기 위한 방법에 있어서,
    DNA의 조밀 구조의 완화 단계가 면역형광 이전에 반드시 일어나야 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 유세포 분석을 이용한 결과의 가시화 및 평가 단계가 1N 및 2N 세포 간 구별을 구현하기 위해 세포 펠렛을 WB 중의 7-아미노액티노마이신 D(7AAD)와 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 불임, 조기 임신 실패 유산 또는 태아 상실의 원인 결정을 위해 그리고 선천성 감염의 예방을 위해 또는 수직 감염의 예방을 위해 그리고 또한 남성 생식계의 염증 및 감염의 조사를 위해 이용되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토메갈로바이러스(CMV), 헤르페스 심플렉스 바이러스 I(HSV I), 헤르페스 심플렉스 바이러스 II(HSV II), 엡스테인 바르 바이러스(EBV), HHV6, HHV7, HHV8, 파르보바이러스 19, B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 콕사키 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1, HIV-2), 아데노 연관 바이러스(AAV), 루벨라 바이러스, HPV, 클라미디아, 톡소플라즈마 및 노로바이러스 감염제 중 하나의 조사를 위해 특이적으로 이용되는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 정자에서 클라미디아의 존재 조사를 위해 동일한 샘플 또는 상이한 샘플을 이용하여 정자발육계도 및 배양물과 조합되어 이용되는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 정자 DNA의 매우 조밀한 DNA 구조 완화는 DNA 효소분해로 수행되는 방법.
  7. 제6항에 있어서, DNA 효소분해는 DNA를 자르는 효소로 수행되는 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, DNA를 자르는 효소는 DNase I인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 적절히 표지된 항-항체가 형광을 위해 이용될 수 있는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 형광을 위해 플루오레신-5-이소티오시아네이트(FITC), 아미노메틸쿠마린 아세테이트(AMCA 350), 6,8-디플루오로-7-히드록시쿠마린 유도체(마리나 블루), 캐스케이드 블루, 알렉사 플루오르 405, 6,8-디플루오로-7-히드록시쿠마린 유도체(퍼시픽 블루), 알렉사 플루오르 430, 캐스케이드 옐로우, 알렉사 플루오르 488, 피코에리트린(PE), 피코에리트린 텍사스 레드(PE-텍사스 레드), 피코에리트린-시아닌 5(PE-Cy5), 페리디닌 엽록소 단백질(PerCP), 페리디닌 엽록소 단백질-시아닌 5.5(PerCP-Cy5.5), 피코에리트린-시아닌 7(PE-Cy7), 로다민 TR, 알로피코시아닌(APC), 알렉사 플루오르 647, 알로피코시아닌 시아닌 7(APC-Cy7), BD APC-H7, 알렉사 플루오르 700 중 어느 하나를 포함하는 임의의 형광단이 이용될 수 있는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 외부 면역형광의 추가 단계가 포함되는 방법.
  12. 적어도
    - 정자 세포의 DNA를 완화시킬 수 있는 물질
    - 관심 감염제에 대해 이용하기 적절한 하나 이상의 항체
    를 포함하는, 정자 내부의 바이러스, 클라미디아, 기생충 및 다른 병원체의 존재를 조사하기 위한 키트.
  13. 제12항에 있어서, DNA 분해 물질이 임의의 DNA 분해 효소인 키트.
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