FI80344C - Foerfarande foer detektering av cellmembranproteiner fraon mikroorganismen chlamydia trachomatis. - Google Patents

Description

1 80344

Menetelmä Chlamydia trachomatis -mikro-organismin solukal-voproteiinien havaitsemiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää Chlamydia trachomatis -mikro-organismin solukalvoproteiinien havaitsemisek-5 si. Erityisen mielenkiinnon kohteena on menetelmä Chlamydia trachomatiksen ulkokalvon pääproteiinin havaitsemiseksi. Mainitulla proteiinilla on kaikille Chlamydia trachomatis-serotyypeille yhteiset antigeeniset ominaisuudet, sen toteaminen on hyödyllinen diagnostinen indikaattori.

10 Immunomääritys on useissa tapauksissa menetelmä, joka valitaan mikro-organismien aiheuttamien infektioiden toteamiseen. Jotta koe toimisi apuna spesifisessä diagnoosissa, tulee sillä pystyä identifioimaan tietty mikro-organismilaji hyvin luotettavasti. Tämä vaatii useimmissa ta-15 pauksissa lajispesifisten antigeenien eristämistä asiaankuuluvien vasta-aineiden kanssa tapahtuvaa reaktiota varten. Tyypillinen tällaiseen analyysiin soveltuva organismi on Chlamydia trachomatis, joka on luokan Chlamydiales heimon Chlamydiaceae kahdesta lajista toinen. Toinen laji on 20 Chlamydia psittaci. Chlamydia trachomatiksen noin 50 erilaista kantaa ovat ihmisen useiden silmä- ja genitaalisai-rauksien, trakooma, sulkeumasidekalvotulehdus, lokeronivu-sajos, "epäspesifinen" eli nongonokokkaalinen virtsaputkentulehdus ja peräsuolentulehdus mukaan luettuina, etiologi-25 siä agensseja. C. trachomatis -infektio on levinnyt koko ihmisyhteistöön. On arvioita, että C. trachomatis on esimerkiksi syynä useisiin miljooniin nongonokokkaalisiin virtsaputkentulehdustapauksiin vuosittain.

Koska C. trachomatiksen aiheuttamat sairaudet ovat 30 laajalle levinneitä, on luotettava, yksinkertainen ja halpa testi tämän organismin läsnäolon toteamiseksi hyvin toivottava, jotta voitaisiin ryhtyä asianmukaiseen hoitoon. Ainoa nykyään käytössä oleva serologinen testi on mikroim-munofluoresenssitesti. Tämä testi vaatii kuitenkin C. trac- 2 80344 homatis -kantojen käyttöä serologisen testin antigeeninä. Valmiuksia tämän testin tekemiseksi on lisäksi vain rajoitetussa määrässä laboratorioita koko maailmassa. Testi on hyvin työläs, aikaavievä ja vaikea suorittaa.

5 US-patenttijulkaisussa 4 118 469 on vähän aikaa sitten kuvattu C. trachomatis -antigeenin, joka on käyttökelpoinen lokeronivusajoksen ja nongonokokkaalisen virtsaputkentulehduksen serologiseen testaukseen, valmistusta. Tämä antigeeni puhdistettiin C. trachomatis -organismeista 10 immunoadsorptiokromatografialla käyttämällä monospesifistä antiseerumia agaroosigeelipylvääseen kovalenttisesti sidottuna spesifisenä ligandina. Tämän antigeenin molekyylipa!-no oli vain noin 160.000 daltonia, ja sillä pystyttiin vastavirtaimmunoelektroforeesissa havitsemaan vasta-ainetta 15 lokeronivusajospotilaiden seerumeista. Kun tätä antigeeniä käytettiin samanlaisessa kokeessa nongonokokkaalista virtsaputkentulehdusta sairastavien potilaiden seerumeille, ei tällä antigeenillä kuitenkaan pystytty havaitsemaan vasta-aineita. Sillä onnistuttiin kuitenkin havaitsemaan 20 vasta-aineet kokeessa, jossa käytettiin kaksisuuntaista immunoelektroforeesia.

Joka tapauksessa vallitsee kuitenkin suuri lääketieteellinen kiinnostus C. trachomatis- mikro-organismin lajispesifisten antigeenien, joilla pystytään ha vaitsemaan 25 infektio, edullisesti yleisesti käytetyillä antigeeni-vasta-aine -menetelmillä, eristämistä kohtaan. Tämä keksinnön päämääränä on siksi saada aikaan parannettu menetelmä tällaisten lajispesifisten antigeenien eristämiseksi.

30 Tämä keksintö koskee diagnostista tutkimusmenetel mää soluproteiinien havaitsemiseksi.

Monissa mikro-organismeissa solukalvoproteiinit ovat lajispesifisiä antigeenejä. Toisin sanoen, testattaessa proteiini kaikista mikro-organismin serotyypeistä 35 peräisin olevia vasta-aineita vastaan se reagoi lajispesi-

II

3 80344 fisesti. Proteiini on siten kaikille tietyn mikro-organismin serotyypeille yhteinen ainutlaatuinen proteiini, ja tarjoaa antigeeninä perustan kaikkien tällaisten serotyyp-pien identifioinnille.

5 Tämän keksinnön mukaiselle menetelmälle solukalvo- proteiinien vapauttamiseksi on tunnusomaista, että otetaan tutkittava näyte, jonka epäillään sisältävän Chlamydia trachomatis -bakteereja; sekoitetaan näyte ensimmäiseen puskuriliuokseen, jonka pH on noin 6,0 -8,0, jolloin muo-10 dostuu näyteliuos; säädetään näytteen pH arvoon noin 8,0- 12,5 käyttämällä emäsliuosta; inkuboidaan näytettä noin 5-30 minuuttia, lisätään neutraloivaa toista puskuria, jonka pH on noin 1,0 - 7,0 näytteen pH;n säätämiseksi lopulliseen arvoon noin 7,0 - 8,0; ja tutkitaan näyte Chlamy-15 dia trachomatis -antigeenien läsnäolon toteamiseksi.

Tämän keksinnön mukaiselle tutkimusmenetelmälle ulkokalvon pääproteiinin vapauttamiseksi on tunnusomaista, että otetaan näyte, kuten sivelynäyte kohdunkaulasta tai virtsaputkesta; laitetaan näyte sakkaroosifosfaattia si-20 sältävään puskuriliuokseen, jonka pH on noin 7,0; sekoitetaan näyte puskuriliuokseen, jolloin muodostuu näyteliuos; lisätään näytelluokseen noin 0,4 M natriumhydroksi-liuosta määrä, jolla näyteliuoksen pH kohoaa arvoon noin 11,0 - 11,8; nostetaan näyteliuoksen lämpötila noin 100° 25 C:seen; inkuboidaan näyteliuosta mainitussa lämpötilassa noin 15 minuuttia; jäähdytetään näyteliuos lämpötilaan noin 20 - 30 °C, alennetaan jäähdytetyn näyteliuoksen pH arvoon noin 7,2 - 7,8 käyttämällä neutraloivaa fosfaattipuskuria, jonka pH on noin 6,1; ja tutkitaan näyte antigeenien läsnä-30 olon havaitsemiseksi.

Monet solukalvoproteiinit ovat mikro-organismien kaikille serotyypeille yhteisiä lajispesifisiä antigeenejä. Eräs tällainen proteiini on Chlamydia trachomatiksen ulkokalvon pääproteiini. Tämä proteiini muodostaa noin 60 % C. 35 trachomatiksen ulkokalvon kokonaisproteiinimäärästä, ja 4 80344 sen koko eli alayksikön molekyylipaino on noin 30.000- 44.000 daltöniä keskimääräisen molekyylipainon ollessa noin 39.500 daltonia. Tästä ulkokalvon pääproteiinistä käytetään tästedes lyhennettä MP 39,5.

5 Solukalvoproteiinin havaitseminen osoittaa, että yksilöillä on mainitun mikro-organismin aiheuttama infektio. Tehokas havaitseminen vaatii proteiinin vapauttamisen ja/tai paljastamisen mikro-organismisolun infektoivasta partikkelista. Kun tämä on tehty, voidaan detektointi tehdä 10 erilaisin kokein, esimerkiksi radioimmunomäärityksellä (RIA), entsyymiin kytketty immunosorbenttimäärityksellä (ELISA), jne.

Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä mikro-or-ganismisolujen infektoivat partikkelit käsitellään menet-15 telyllä, jossa otetaan näyte, jonka epäillään sisältävän mikro-organismia ja käsitellään näyte alkaliliuoksella ja mahdollisesti lämmöllä.

Hakija on havainnut, että solujen käsittely alkaliliuoksella vapauttaa ja/tai paljastaa solukalvoproteiinit 20 solun infektoivasta partikkelista. Hakija on lisäksi havainnut, että käytettäessä käsittelyprosessissa lisäksi lämpöä proteiinin vapauttamisen ja/tai paljastamisen teho paranee. Erilaisia tutkimuksia voidaan sitten käyttää proteiinin läsnäolon havaitsemiseksi käsiteltyjä soluja 25 sisältävästä näytteestä.

Tämän keksinnön mukainen menettely on yleisesti ilmaistuna seuraava: Tutkittava näyte sekoitetaan ensin pus-kurisuolaliuokseen, jonka pH on noin 6,0 - 8,0. Soveltuviin puskureihin kuuluvat sokerifosfaattipuskurit, kuten sakka-30 roosifosfaatti ja muut alalla tunnetut sokeria sisältävät puskurit. Puskuriliuoksen pH on mielellään noin 6,8 - 7,2.

Kun näyte ja puskuriliuos on sekoitettu perinpohjin keskenään, lisätään näytteeseen sopiva määrä alkaliliuosta pH:n nostamiseksi arvoon noin 8,0 - 12,5. pH on mielellään 35 noin 10,0 - 12,0, edullisesti noin 11,0 - 11,8. Soveltuviin

II

5 80344 alkaliuoksiin kuuluvat natriumhydroksidin, kaliumhydroksi-din, trinatriumfosfaatin ja tri(hydroksimetyyli)aminometaa-nin liuokset, joista natriumhydroksidiliuos on edullisin.

Kun pH on säädetty halutuksi, näytettä inkuboidaan 5 noin 5-30 min. Inkubointi voidaan tehdä huoneen lämpötilassa (20 °C) tai korotetussa lämpötilassa 105 °C:seen asti. Näytteen lämpötila korotetaan mielellään noin 90-100 °C:ksi, edullisesti noin 100 eC:ksi. Korotetun lämpötilan käytön inkuboinnin aikana on havaittu parantavan 10 tehoa, jolla solukalvoproteiini vapautuu ja/tai paljastuu. Inkuboinnin jälkeen näyte jäähdytetään tarvittaessa lämpötilaan noin 0-40 °C, edullisesti noin 25 °C. Jäähdytys tehdään edulli sesti upottamalla jäähauteeseen.

Näytteen jäähdytyksen jälkeen lisätään neutraloi-15 vaa toista puskuria, jonka pH on noin 1,0 - 7,0, näytteen pH:n säätämiseksi loppuarvoon noin 7,0 - 8,0. Parhaat mahdolliset olosuhteet tutkimusta varten saavutetaan yleensä näillä pH-arvoilla, ts neutraalista hieman emäksiseen. Liuoksen lopullinen pH on edullisesti noin 7,2 - 7,8. So-20 veltuviin neutralointipuskureihin kuuluvat erilaiset fos-faattipuskuriliuokset (PBS), edullinen on sakkaroosifos-faatti. Muihin soveltuviin puskuriliuoksiin kuuluvat sitruunahappo, suolahappo ja tri(hydroksimetyyli)aminometaani HC1. Tämän pH-säädön jälkeen näyte on valmis tutkimusta 25 varten ilman lisämuutoksia.

Kuten edeltävästä kuvauksesta käy ilmi, voidaan tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käyttää erilaisia puskurisuoloja, pH-arvoakohottavia alkalililiuoksia ja neutralointipuskureita yhdessä laajoissa rajoissa vaihte-30 levien inkubointiaikojen ja -lämpötilojen kanssa. Kulloinkin käytettävät reaktiokomponentit ja -olosuhteet voidaan valita MP 39,5:n tai muun proteiinin vapauttamismenetelmän yhdistämiseksi kulloinkin mielenkiinnon kohteena olevaan detektointitutkimukseen, esimerkiksi entsyymi-immunomääri-35 tykseen (EIA), radioimmunomääritykseen (RIA), lateksi-immu- 6 80344 nomääritykseen, jne. Yleensä voidaan käyttää minkä tahansa tyyppisiä tunnettuja immunomääritysmenetelmiä.

Monospesifisiä, esimerkiksi MP 39,5 -antigeenin vastaisia, vasta-aineita voidaan muodostaa soveltuvin inoku-5 lointimenettelyin laboratorioeläimissä, esimerkiksi hiirissä tai kaniineissa. Eläimissä muodostettuja vasta-aineita voidaan käyttää muiden nisäkkäisen klamydiainfektioiden tutkimiseen. Nämä tutkimukset voidaan tehdä tunnetuin menetelmin, joita käytetään bakteeriantigeenin läsnäolon tutki-10 miseen infektoituneessa kohteessa. Kun monospesifisten vasta-aineiden muodostaja on varmistettu MP 39,5 -antigeenillä inokuloitujen laboratorioeläinten joukosta, voidaan ryhtyä joko suoriin tai epäsuoriin tutkimusmenettelyihin käyttämällä näytteitä, joiden epäillään olevan klamydiainfektoi-15 tuneita.

Suorassa määritysmenettelyssä kalvoproteiinin vastainen monospesifinen vasta-aine voidaan sitoa kovalentti-sesti tai ei-kovalenttisesti kiinteäfaasikantajasysteemiin. Kantaja voi olla lasia, muovia tai vastaavaa, kuten näiden 20 menetelmien yhteydessä on tavanomaista.

Kiinteäfaasikantajaa, johon on kiinnitetty kyseessä olevan kalvoproteiinin vastainen monospesifinen vasta-aine, voidaan inkuboida edellä kuvatulla tavalla käsitellyn näytteen kanssa. Kalvoproteiiniantigeenin vastainen mono-25 spesifinen vasta-aine, joka on ennalta leimattu radionuk-lidilla tai liitetty entsyymiin, tasapainotetaan sitten kantajasysteemiin nähden. Näytteeesä mahdollisesti oleva ja kantajasysteemillä olevaan vasta-aineeseen sitoutunut antigeeni sitoutuu puolestaan radionuklidileimattuun tai 30 entsyymiin liitettyyn vasta-aineeseen.

Jos käytetään radionukleidileimattua vasta-ainetta, voidaan määrittää näytteen jäännösradioaktiivisuus. Tätä arvoa verrataan sitten näytteiden, joiden on määritetty olevan vapaita kalvoproteiiniantigeenista, antamiin arvoi-35 hin. Kun käytetään entsyymiin liitettyä vasta-ainetta, li-

II

7 80344 sätään kiinteän kantajan sisältävään reaktioseokseen tälle entsyymille spesifistä substraattia ja rekisteröidään tuloksena oleva värinmuutos spektrofotometrisesti. Tätä vä-rinmuutosta verrataan kalvoproteiiniantigeenia sisältämät-5 tömiksi tiedettyjen näytteiden värinmuutokseen. Tällä tavalla voidaan antigeenin läsnäolo näytteissä todeta suoraan.

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää epäsuoraa menettelyä. Tarkemmin ilmaistuna antigeenit voidaan sitoa kova-10 lenttisesti tai ei-kovalenttisesti soveltuvaan kiinteäfaa-sikantajasysteemiin. Edellä kuvatulla tavalla käsitelty näyte sekoitetaan tunnettuun määrään kalvoproteiinianti-geenin vastaista, radionukleidileimattua tai entsyymiin liitettyä vasta-ainetta, joka on ennalta saatu laboratorio-15 eläimestä. Näyteuute - vasta-aineseosta voidaan sitten in-kuboida kiinteäfaasikanta-systeemin ja siihen kiinnitetyn antigeenin kanssa.

Kiinteäfaasikantajasysteemin radioktiivisuus tai liittämissysteemin värin kehittyminen mitataan ja sitä 20 verrataan standardeina käytettyjen, samalla tavalla käsiteltyjen näytteiden, jotka eivät sisällä tutkimuskohteena olevaa antigeeniä, antamiin arvoihin.

Kliinisen näytteen, jonka epäillään sisältävän mikro-organismia, kyky estää radionuklidileimattujen tai ent-25 syymiin liitettyjen vasta-aineiden sitoutuminen kiinteään kantajaan osoittaa kalvoproteiiniantigeenin läsnä- tai poissaolon kliinisessä näytteessä. Mahdollisesti ilmenevä esto on osoitus infektiosta. Tällaisiin määritysmenetelmiin perehtynyt tuntee muitakin soveltuvia määritysmenetelmiä 30 ja niiden muunnoksia.

Seuraava esimerkki valaisee keksintöä sovellettuna Chlamydia trachomatisin MP 39,5:n havaitsemiseen. Kuvattua menettelyä voidaan hieman muutettuna tai muuttumattomana käyttää muun tyyppisten soluproteiinien toteamiseen.

β 80344

Esimerkki

Hankittiin sata kliinistä sivelynäytettä ja niistä tutkittiin Chlamydian läsnäolo. Reagenssiformulat valmistettiin seuraavasti: 5 A. Natriumhydroksidiliuos (0,42 M) 34 ml 50 %:ista (12,5 M) NaOH:a, täytetään 1,0 l:ksi.

B. Neutralointipuskuri

Lisätään 900 ml:aan tislattua vettä: 10 NaH2P04· H20 13,8 g, säädetään pH arvoon 6,10 ± 0,05 NaOH:lla, lisätään BSA 2,0 g

NaN3 1,0 g C. Standardilaimennusaine 15 800 ml:aan tislattua vettä lisätään:

6,90 g NaH2 P04 · H2 O

1.000 g BSA

0,50 g NaN3 34,25 g sakkaroosia 20 1,044 g K2HP04 0,544 g KH2P04 25.0 ml lämpökäsiteltyä naudan sikiöseerumia 25 mg streptomysiiniä 50 mg vankomysiiniä 25 12500 yksikköä nystatiinia säädetään pH arvoon 7,45 ± 0,05 käyttämällä 0,42 M NaOH:, täytetään 1,0 l:ksi, suodatetaan 0,22 pm:n suodattimen läpi.

D. Konjugaattipuskuri 30 600 ml:aan tislattua vettä lisätään: 0,532 g KH2P04 2,80 g K2HP04 0,20 g timerosalia 250 ml lämpökäsiteltyä naudan sikiöseerumia, 35 säädetään pH arvoon 7,4 ± 0,1, täytetään 1,0 l:ksi, suodatetaan 0,22 pm:n suodattimen läpi.

Il 9 80344 E. Syvennysten pesupuskuri 900 ml:aan tislattua vettä lisätään: 0,532 g KH2P04 2,800 g K2HP04

5 1,000 g BSA

säädetään pH arvoon 7,4 ± 0,1, täytetään 1,0 l:ksi tislatulla vedellä.

F. Substraattipuskuri 900 ml:ksi tislattua vettä lisätään: 10 8,203 g vedetöntä natriumasetaattia, säädetään pH arvoon 6,0 ± 1 IM sitruunahapolla, täytetään 1,0 l:ksi tislatulla vedellä.

G. Tetrametyylibentsidiinisubstraatti (TMB) 900 ml:aan dimetyylisulfoksidia (DMSO), 15 spektroskopialaatu, jäätymispiste 18 °C, lisätään: 10,0 g 3,3', 5,5'-tetrametyylibentsidiiniä, täytetään 1,0 l:ksi DMSO:11a, säilytetään huoneen lämpötilassa.

H. 0,5 M vetyperoksidiliuos 20 500 ml:aan stabiloitua 3 %:ista H202 lisätään 500 ml tislattua vettä ja sekoitetaan.

I. Pysäytysliuos - 2M rikkihappo 800 ml:aan tislattua vettä lisätään: varovasti 111 ml väkevää rikkihappoa, 25 jäähdytetään huoneen lämpötilaan, täytetään 1,0 l:ksi tislatulla vedellä.

J. 2 SP -kuljetusväliaine 900 ml:aan tislattua vettä lisätään: 68,5 g sakkaroosia 30 2,088 g K2HP04 1,088 g KH2P04 50 ml naudan sikiöseerumia (lämpökäsiteltyä) 50 mg streptomysiiniä 100 mg vankomysiiniä 35 25000 yksikköä nystatiinia, säädetään pH arvoon 7,0, täytetään 1,0 l:ksi ja suodatetaan 0,22 pm:n suodattimen läpi.

10 80344 Näytteen sisältävät dacron-tupot leikattiin juuriva-nun yläpuolelta suoraan 10 x 75 mm:n lasisiin koeputkiin. Kahteen putkeen laitettiin käyttämättömät tupot nollanäyt-teiksi. Kuhunkin putkeen lisättiin 500 μΐ 25P-kuljetusväli-5 ainetta ja putkia pyöritettiin voimakkaasti 10-20 s, minkä jälkeen lisättiin 50 μΐ 0,42 M NaOH kuhunkin putkeen. Sitten putkia pyöritettiin voimakkaasti 10 - 20 s ja inku-boitiin 100 (± 2) °C:ssa 15 min. Sitten putket laitettiin jäähautee seen ja jäähdytettiin noin 25 °C:seen, minkä 10 jälkeen lisät tiin 500 μΐ neutralointipuskuria. Putkia pyöritettiin voi makkaasti 10 - 20 s. Näytteet olivat tämän jälkeen valmiit määritettäviksi.

Määritysohjelma - Entsyymiin liitetty immunosorbent-timääritys (ELISA).

15 Vasta-aineella päällystetyt levyt pestiin kolmesti pesupuskurilla ja valutettiin kuiviksi. Lisättiin 100 μΐ standardeja, vertailunäytteitä, nollanäytteitä tai käsiteltyjä näytteitä vastaaviin rinnakkaissyvennyksiin ja sekoitettiin. Vertailunäytteet olivat sivelynäytteitä, joi-20 den tiedettiin sisältävän Chlamydia-partikkeleja ja jotka oli käsitelty edellä kuvatulla tavalla. Toinen ryhmä vertai lunäytteitä, joiden tiedettiin sisältävän bakteeripar-tikkeleja, käsiteltiin 500 pl:lla neutralointipuskuria ja 50 plrlla NaOH. Tätä vertailusarjaa ei ollut käsitelty. 25 Levyt peitettiin sitten kansilla (tinafoliota) ja niitä inkuboitiin yön yli huoneen lämpötilassa. Syvennysten sisällöt heitettiin sitten pois ja levyt pestiin uudelleen edellä kuvatulla tavalla. Kuhunkin syvennykseen lisättiin 100 μΐ konjugaattipuskuria, sekoitettiin ja peitettiin 30 kansilla. Levyjä inkuboitiin sitten 37 °C:ssa 2 - 3 h. Syvennysten sisällöt heitettiin jälleen pois, levy pestiin edellä kuvatulla tavalla ja lisättiin 200 μΐ TMB-substraat-tikäyttöliuosta. Käyttöliuoksen koostumus oli seuraava.

10,0 ml substraattipuskuria 35 100 μΐ TMB-varastosubstraattia 30 μΐ 0,5 M H20j sekoitetaan hyvin.

Il n 80344

Seosta inkuboitiin 30 min. huoneen lämpötilassa välillä sekoittaen. Sitten reaktio pysäytettiin lisäämällä 50 μΐ 2M H2 S04 . Levyjen absorbanssit mitattiin nollanäytteenä substraatti, joka oli valmistettu lisäämällä 200 μΐ sub-5 straattia ja 50 μΐ 2M H2S04 yhteen syvennysriviin, käyttämällä 450 nm:n suodatinta.

Nollanäytetuppojen antaman absorbanssin pitäisi olla verrattavissa standardiin 0,0 ng/ml. Laskettiin stan-darsisyvennysten, vertailysyvennysten ja näytesyvennysten 10 absorbanssien keskiarvo. Standardin 0,0 ng/ml keskiarvo vähennettiin kaikkien standardien keskiarvoabsorbansseista. Nollatuppojen keskiarvoabsorbanssi vähennettiin kaikki en näytteiden ja vertailunäytteiden keskiarvoabsorbansseista. Sitten piirrettiin käyrä, joka esittää standardien korjat-15 tuja keskiarvoabsorbansseja konsentraation (ng/ml) funktiona, ja käyriltä saatiin näytteen konsentraatio. Arvoa > 0,5 ng/ml pidettiin positiivisena. Määritykset uusittiin kaikille positiivisille näytteille sekä edellä kuvatun ohjelman mukaisesti että seuraavassa esitettävällä tarkis-20 tusmäärityksellä.

Käyttämällä samaa klamydia-vasta-ainetta, jolla peitettiin ELISA-syvennykset valmistettiin liuokset, jotka sisälsivät sitä 1 mg/ml standardipuskurilaimennusaineessa. 10 x 75 mm:n koeputket leimattiin lisäämällä 250 μΐ kuta-25 kin pilkottua positiivista näytettä tai käsiteltävää ver-tailunäytettä. Kaikkiin putkiin lisättiin 5 μΐ vasta-aine-liuosta, sekoitettiin hyvin pyörittämällä ja annettiin seistä 5 min. Vastaaviin rinnakkaissyvennyksiin lisättiin 100 μΐ vasta aineella käsiteltyjä näytteitä. Tehtiin myös 30 rinnakkaissyvennykset, jotka sisälsivät annokset pilkottuja näytteitä (ei vasta-ainekäsittelyä). Määritykset tehtiin sitten edellä kuvatulla tavalla.

Tulos merkittiin positiiviseksi näytteille, jotka antoivat MP 39,5 -tuloksen ±0,5 ng/ml syvennyksissä, jotka 35 sisälsivät näytettä, jota ei ollut käsitelty vasta-aineel- 12 80344 la, ja tuloksen merkittävälle pienenemiselle (yli 70 %:inen esto) vasta-aineella käsitellyllä näytteellä. Näytettä, joka antoi positiivisen tai kyseenalaisen positiivisen tuloksen ensimmäisessä kokeessa, mutta negatiivisen tulok-5 sen tarkistuskokeessa, pidettiin negatiivisena. Tämä voi johtua joko pienemmästä tuloksesta kuin 0,5 ng/ml uusin-takokeessa (annokset, joita ei käsitelty vasta-aineella) tai siitä, etteivät vasta-aineella käsitellyt annokset osoittaneet merkittävää tuloksen pienenemistä.

10 100 tutkitusta näytteestä 62 oli negatiivisia ja 38 positiivisia. Positiivisten tulosten tarkistus tehtiin inhibiitiokokeella. Vertailunäytteiden partikkelit jaettiin käsiteltyjen ja käsittelemättömien ryhmiin MP 39,5:n vapau-tumistehon määrittämiseksi. Käsiteltyjen partikkelien kes-15 kimääräinen absorbanssi aallonpituudella 450 nm oli 0,611, kun taas käsittelemättömille partikkeleille saatiin absor-bassi 0,018 aallonpituudella 450 nm.

Il

Claims (15)

1. Menetelmä Chlamydia trachomatis -mikro-organismin solukalvoproteiinien havaitsemiseksi, tunnet-5 t u siitä, että otetaan tutkittava näyte, jonka epäillään sisältävän Chlamydia trachomatis -bakteereja; sekoitetaan näyte ensimmäiseen puskuriliuokseen, jonka pH on noin 6,0- 8,0, jolloin muodostuu näyteliuos; säädetään näytteen pH arvoon noin 8,0 - 12,5 käyttämällä emäsliuosta; inkuboi- 10 daan näytettä noin 5-30 minuuttia, lisätään neutraloivaa toista puskuria, jonka pH on noin 1,0 - 7,0 näytteen pH:n säätämiseksi lopulliseen arvoon noin 7,0 - 8,0; ja tutkitaan näyte Chlamydia trachomatis -antigeenien läsnäolon toteamiseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen puskuri on sokeria sisältävän puskurin liuos.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että emäs on natriumhydroksidi, KOH, 20 trinatriumfosfaatti tai tri(hydroksimetyyli)aminometaani.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näyteliuos lisäksi kuumennetaan lämpötilaan noin 20 - 105 °C näytteen pH:n säätämisen jälkeen, inkuboidaan näytettä tässä lämpötilassa ja jäähdy- 25 tetään näyteliuos inkuboinnin jälkeen lämpötilaan noin 0-40 °C.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen puskuri on sakka-roosifosfaatti.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näyte kuumennetaan lämpötilaan noin 90 - 100 eC.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että neutraloiva toinen puskuri on 35 fosfaatin, sitruunahapon, suolahapon tai tri(hydroksime-tyyli)aminometaanihydrokloridin liuos, jonka pH on noin 1,0 - 7,0. 14 80344

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näytteen lopullinen pH on noin 7,2 - 7,8.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että kun näyte on sekoitettu ensimmäiseen puskuriliuokseen, sen pH säädetään arvoon noin 11,0 - 11,8.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että emäs on natriumhydroksidi.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näyte jäähdytetään kuumennuksen jälkeen lämpötilaan noin 25 °C.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että neutraloiva toinen puskuri on 15 sakkaroosifosfaatti.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys on radiolmmunomääri-tys.

13 80 34 4

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että määritys on entsyymiin liittyvä immunoabsorbenttimääritys.

15. Menetelmä Chlamydia trachomatis -bakteerin ulko-kalvon pääproteiinin havaitsemiseksi, tunnettu siitä, että otetaan näyte, kuten sivelynäyte kohdunkaulasta 25 tai virtsaputkesta; laitetaan näyte sakkaroosifosfaattia sisältävään puskuriliuokseen, jonka pH on noin 7,0; sekoitetaan näyte puskuriliuokseen, jolloin muodostuu näyteliu-os; lisätään näyteliuokseen noin 0,4 M natriumhydroksi-liuosta määrä, jolla näyteliuoksen pH kohoaa arvoon noin 30 11,0 - 11,8; nostetaan näyteliuoksen lämpötila noin 100° Crseen; inkuboidaan näyteliuosta mainitussa lämpötilassa noin 15 minuuttia; jäähdytetään näyteliuos lämpötilaan noin 20 - 30 °C, alennetaan jäähdytetyn näyteliuoksen pH arvoon noin 7,2 - 7,8 käyttämällä neutraloivaa fosfaattipuskuria, 35 jonka pH on noin 6,1; ja tutkitaan näyte antigeenien läsnäolon havaitsemiseksi. is 80344