DK161860B - Fremgangsmaade til paavisning af det vigtigste ydre membranprotein af chlamydia trachomatis - Google Patents

Description

i

DK 161860B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til påvisning af det vigtigste ydre membranprotein af Chlamydia trachomatis. Fordi dette protein udviser antigene egenskaber, der er fælles for alle Chlamydia trachomatis serotyper, er dets på-5 visning nyttig som diagnostisk indikator.

Immunobestemmelse er i mange tilfælde den valgte metode til at bestemme infektion med mikroorganismer. Som en hjælp til specifik diagnose må prøven være i stand til at identificere en 10 særlig art mikroorganisme med en høj grad af pålidelighed. I de fleste tilfælde kræver dette isolation af artspecifikke antigener til reaktion med passende antistoffer. Typisk for den type organisme, der egner sig til en sådan analyse er Chlamydia trachomatis, som er en af de to mikroorganismearter af 15 slægten Chlamydiaceae, ordenen Chlamydiales. Den anden art er Chlamydia psittaci. Chlamydia trachomatis er i sine nogle og halvtreds stammer de ætiologiske midler for et antal humane okulare og genitale sygdomme, herunder trachoma, inclusion conjunctivitis, lymphogranuloma venereum, "uspecifik" og ikke-20 gonokokkal urethritis og proctitis. C. trachomati s-i nfektion har tendens til at brede sig i hele den almene befolkning. Det er f.eks. blevet anslået, at C. trachomatis er ansvarlig for flere millioner tilfælde per år af ikke-gonokokkal urethritis.

25 Da C. trachomatis-formidlet sygdom er vidt udbredt, er en pålidelig og enkel og billig prøve for organismens tilstedeværelse meget ønskelig og af stor betydning for, at der kan foretages passende behandling. Den eneste serologiske prøve, der for tiden anvendes, er mikroimmunof1uorescensprøven. Denne 30 prøve kræver imidlertid, at stammerne af C. trachomatis anvendes som serologisk prøveantigen. Desuden findes faciliteterne til udførelse af denne prøve kun i et begrænset antal laboratorier over hele verden. Prøven er meget arbejdskrævende, tidsrøvende og vanskelig at udføre.

For nylig beskrev US patent nr. 4.118.469 fremstilling af et antigen af C. trachomatis, der er nyttig til serologisk afprøvning for lymphogranuloma venereum og ikke-gonokokkal 35 2

DK 161860 B

urethritis. Dette antigen blev renset af C. trachomatis organismer ved immunoadsorptionskromatografi under anvendelse af det monospecifikke antiserum som en specifik ligand kovalent bundet i en agarosegelsøjle. Dette antigen havde en molekyl-5 vægt på kun ca. 150.000 dalton, og ved afprøvning i modstrøms-immunoelektroforese, var det i stand til at påvise antistoffer fra sera fra lymphogranuloma venereum-patienter. Når det blev anvendt i en lignende prøve med sera fra ikke-gonokokkale urethritispatienter, kunne dette antigen imidlertid ikke på-10 vise antistoffer. Det var imidlertid vellykket til påvisning af antistoffer ved todimensional immunoelektroforeseprøve.

Det er kendt fra GB 1.036.621 at isolere antigen fra cellerne af Salmonella thyphi ved at behandle dem med NaOH ved en pH-15 værdi på ca. 11 og derefter sænke pH-værdien til 7,2 ved hjælp af Ν·Η·4·ε 1.

Fra EP offentliggørelsesskrift nr. 0059624 kendes en fremgangsmåde til at isolere det vigtigste ydre cellemembranpro-20 tein af Chlamydia trachomatis ved at adskille det ydre celle-membranmateriale af mikroorganismerne fra resten af celleind-holdet og derpå bringe dette materiale i kontakt med et stærkt anionisk tensid for at opløseliggøre proteinantigenet og derpå udvinde proteinantigenet fra tensidopløsningen og rense pro-25 teinantigenet. Denne fremgangsmåde er langsom og besværlig.

Under alle omstændigheder er der imidlertid stadig stor medicinsk interesse for isolering af artsspecifikke antigener af mikroorganismer, såsom C. trachomatis, som er i stand til at 30 påvise infektion, fortrinsvis ved almindeligt praktiserede antigen-antistofprøvemetoder. Det er derfor et formål med den foreliggende opfindelse at angive en forbedret metode til isolering af sådanne artspecifikke antigener.

35 i mange mikroorganismer er cellemembranproteiner artspecifikke antigener. Dvs. at når de afprøves overfor antistoffer afledt fra alle mikroorganismens seratyper, reagerer proteinet med artspecificitet. Proteinet er således et enestående protein, der

DK 161860B

3 er fælles for alle serotyper af mikroorganismen/ og som antigen giver det grundlag for identifikation af alle sådanne serotyper.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at der 5 tages en prøve; dannes en prøveopløsning ved at blande prøven med en første stødpudeopløsning med en pH-værdi fra 6 til 8; prøveopløsningens pH-værdi indstilles til en værdi fra 8 til 12,5 ved anvendelse af base; prøven inkuberes i en periode fra 5 minutter til 30 minutter; der tilsættes en neutraliserende 10 anden stødpude med en pH-værdi fra 1 til 7 for at bringe pH-værdien af prøveopløsningen til en endelig værdi fra 7 til 8; og prøveopløsningen måles for at påvise tilstedeværelse af antigener.

15 I en særlig udførelsesform ifølge opfindelsen indbefatter en prøvemetode til frigørelse af det vigtigste ydre membranprotein fra C. trachomatis følgende: Der tages en prøve, såsom en udpensling med en vatpind fra halsen eller urinvejsområdet, og prøven anbringes i en første stødpudeopløsning omfattende sac-20 charosephosphat med en pH-værdi på ca. 7,0, udpenslingen blandes med stødpudeopløsningen til dannelse af en prøveopløsning, der sættes til prøveopløsningen en mængde natriumhydroxidopløsning, der har en molaritet på ca. 0,4, således at pH-værdi-en af prøveopløsningen hæves til mellem 11,0 og 11,8, tempera-25 turen af prøveopløsningen hæves til ca. 100°C, prøveopløsningen inkuberes i en periode på ca. 15 minutter, prøveopløsningen afkøles til en temperatur fra 20°C til 30°C, pH-værdien af den afkølede prøveopløsning reduceres til mellem 7,2 og 7,8 under anvendelse af en neutraliserende stødpude af phosphat 30 med en pH-værdi på ca. 6,1, og prøven måles for at bestemme tilstedeværelsen af antigener.

Cellemembranproteiner af mange interessante mikroorganismer er artspecifikke antigener for alle serotyper af disse mikro-35 organismer. Et sådant protein er det vigtigste ydre membranprotein i Chlamydia trachomatis. Dette protein omfatter ca.

60% af det samlede forbundne ydre membranprotein i C. trachomatis og har en størrelse eller molekylvægt af underenheden

O

4

DK 161860 B

mellem ca. 30.000 og ca. 44.000 dalton med en middel molekylvægt på ca. 39.500 dalton. Af forenklingsgrunde vil denne gruppe af vigtigste ydre membranproteiner i det følgende blive omtalt som MP 39,5, hvilket betyder "større ydre membranprotein med-' 5 en middelmolekylvægt af underenheden pa 39.500 dalton.

Påvisning af et cellemembranprotein er tegn på infektion med mikroorganismen i et individ. Effektiv påvisning kræver, at proteinet frigøres og/eller eksponeres fra den inficerende partikel af en mikroorganismecelle. Når først dette er gjort, kan påvisning ske ved forskellige målinger, f.eks. radioimmun-bestemmelse (RIA), enzymbundet immunosorbentbestemmelse (ELISA) osv.

15

Ifølge den foreliggende opfindelse beskrives en fremgangsmåde til behandling af de inficerende partikler i celler af mikroorganismer, som indebærer udtagelse af en prøve eller et eksemplar, dér mistænkes for at huse organismen, hvorefter prøven 2Q underkastes en alkaliopløsning og eventuelt varme.

Det er ifølge opfindelsen blevet opdaget, at behandling af celler med en alkaliopløsning vil frigøre og/eller eksponere cellemembranproteiner fra cellens inficerende partikel. Det 2g er endvidere blevet opdaget at tilføjelse af varme til behandlingsprocessen forøger den effektivitet, hvormed proteinet frigøres og/eller eksponeres. Forskellige målinger kan så udføres, for at påvise tilstedeværelsen af proteinet i en prøve indeholdende de behandlede celler.

30

En almen fremgangsmåde ifølge opfindelsen er følgende: En prøve blandes først med en stødpudesaltopløsning med en pH-værdi fra 6,0 til 8,0.. Egnede stødpuder indbefatter sukker- phosphatstødpuder, såsom saccharosephosphat og andre velkendte 35 sukkerholdige stødpuder. Hensigtsmæssigt er pH-værdien af stødpudeopløsningen fra 6,8 til 7,2.

Efter at prøven og stødpudesaltopløsningen er blevet grundigt

O

5

DK 161860 B

blandet, sættes en mængde alkaliopløsning til prøven for at hæve pH-værdien til mellem 8,0 og 12,5. Hensigtsmæssigt er pH-værdien fra 10,0 til 12,0, idet fra 11,0 til 11,8 foretrækkes. Egnede alkaliopløsninger indbefatter 5 opløsninger af natriumhydroxid, kaliumhydroxid, trinatrium-phosphat og tri(hydroxymethyl)aminomethan, idet natriumhydroxid foretrækkes.

Når først pH-værdien er blevet indstillet til det ønskede niveau, indkuberes prøven i en periode fra 5 til 30 minutter. Inkubationen kan finde sted ved stuetemperatur (20°C) eller ved forhøjede temperaturer op til ca. 105°C. Hensigtsmæssigt hæves temperaturen af prøven til mellem 90°C og 100°, idet ca. 100°C foretrækkes. Brugen af forhøjede 15 .

temperaturer under inkubationen har vist sig at forøge den effektivitet, hvormed cellemembranproteinet frigøres og/eller eksponeres. Efter inkubationsperioden bliver prøven, hvis opløsningen har været opvarmet, afkølet til en temperatur fra 0°c til 40°C, idet ca. 25°C foretrækkes. Kølingen 20 sker fortrinsvis ved neddykning i et isbad.

Efter afkøling af prøven tilsættes en neutraliserende anden stødpude med en pH-værdi fra 1,0 til 7,0 for at bibringe prøven en endelig pH-værdi fra 7,0 til 8,0.

25

Optimale betingelser for måling opnås i almindelighed ved disse pH-værdier, dvs. neutral til svagt alkalisk. Fortrinsvis har opløsningen en endelig pH-værdi fra 7,2 til 7,8. Egnede neutraliserende stødpuder indbefatter de forskellige phosphatstødpudeopløsninger (PBS), idet saccharosephosphat

OU

foretrækkes. Andre egnede stødpudeopløsninger indbefatter citronsyre, saltsyre og tri(hydroxymethyl)aminomethan, HC1. Efter denne pH-indstilling er prøven parat til måling uden yderligere modifikation.

Som det fremgår af den foregående beskrivelse, kan mange forskellige stødpudesalte, alkaliopløsninger til at hæve pH-værdien og neutraliserende stødpuder anvendes ved fremgangsmåden 35

O

6

DK 161860 B

ifølge opfindelsen sammen med mange forskellige inkubationstider og temperaturer. De faktiske reaktionskomponenter og betingelser kan vælges således, at de integrerer fremgangsmåden til frigørelse af MP 39,5 eller andet protein i den 5 særlige påvisningsmetode, der har interesse, f.eks. enzymimmuno-bestemmelse (EIA), radioimmunobestemmelse (RIA), lateximmuno-bestemmelse, osv. Generelt kan anvendes enhver type kendt immunobestemmelsesteknik.

10

Monospecifikke antistoffer mod f.eks. MP 39,5 antigen kan udvikles ved passende podningsmetoder med laboratoriedyr såsom mus eller kaniner. De af dyr udviklede antistoffer kan anvendes til bestemmelser for chlamydial infektion i andre pattedyr.

Disse bestemmelser kan udføres under anvendelse af velkendte 15 metoder til bestemmelse af tilstedeværelsen af bakterielt antigen i det inficerede individ. Når først en forsyning af monospecifikke antistoffer er sikret fra MP 39,5 antigen-podede laboratoriedyr, kan der foretages enten direkte eller indirekte bestemmelsesmetoder under anvendelse af eksemplarer, der mistæn- 20 kes for at huse chlamydiale infektioner.

Ved en direkte bestemmelsesmetode kan monospecifikt antistof mod membranproteinet blive kovalent eller ikke-kovalent bundet „ til et bæresystem i fast fase. Som almindeligt ved disse tek-nikker kan bæresystemet være glas, plast eller lignende.

Fastfasebæreren med vedhængende monospecifikt antistof mod det særlige membranprotein kan inkuberes med et eksemplar 30 fremstillet som ovenfor skitseret. Monqspecifikt antistof mod membranproteinantigenet, der tidligere er blevet radiomærket eller konjugeret med enzym ved kendt teknik, bringes så i ligevægt med bæresystemet. Eventuelt antigen, der findes i prøven, og som er blevet bundet til antistoffet på bære-35 systemet, vil på sin side bindes til det radiomærkede eller enzymkonjugerede antistof.

O

7

DK 161860 B

Hvis der anvendes radiomærket antistof, kan mængden af resterende radioaktivitet derefter bestemmes. Denne værdi sammenlignes med prøver, der er blevet bestemt at være fri for membran- proteinantigenet. Hvis der anvendes enzymkonjugeret antistof,-5 sættes en erstatning, der er specifik for enzymet til reaktionsblandingen med den faste bærer, og den fremkomne farveændring noteres spektrofotometrisk. Denne farveændring sammenlignes med prøver, der vides at være fri for membranproteinantigenet.

På denne måde kan tilstedeværelsen af antigenet i prøverne bestemmes direkte.

Alternativt kan anvendes indirekte bestemmelsesmetoder. Specielt kan antigenerne bindes kovalent eller ikke-kovalent til et egnet bæresystem i fast fase. En prøve fremstillet som ovenfor skitseret blandes med en kendt mængde radiomærket eller enzymkonjugeret antistof mod membranproteinantigenet, der tidligere er fremskaffet af et laboratoriedyr. Blandingen af prøveekstrakt og antistof kan så inkuberes med det faste 20 bæresystem og dets bundne antigen.

Radioaktiviteten af det faste bæresystem måles eller farveud-viklingen i det konjugerede system måles og sammenlignes med prøver, der er behandlet på lignende måde som standarder, 25 og som ikke indeholder det antigen, der har interesse.

Evnen hos den kliniske prøve, der mistænkes for at indehoxde mikroorganismen,til at hæmme bindingen af radiomærkede eller enzymkonjugerede antistoffer til den faste bærer afslører 30 tilstedeværelsen eller fraværet af membranproteinantigenet i den kliniske prøve. En eventuel påvist hæmning viser infektion. Andre egnede bestemmelsesmetoder og variationer vil være indlysende for fagfolk med kendskab til sådan bestemmelsesteknik.

De følgende eksempler illustrerer opfindelsen anvendt på påvisning af Chlamydia trachomatis MP 39,5. Ved ingen eller ringe modifikation kan den beskrevne fremgangsmåde anvendes 35

O

8

DK 161860 B

til påvisning af andre typer celleproteiner i forskellige mikroorganismer.

EKSEMPEL 5 —

Et hundrede kliniske vatpindudpenslinger blev taget og afprøvet for tilstedeværelse af Chlamydia. Keagenssammensætningerne blev fremstillet som følger: 10 A. Natriumhydroxid (0,42 M) opløsning

34 ml 50% (12,5 M NaOH q.s. til 1,0 L

B. Neutraliserende stødpude 15 til 900 mL dH?0 sæt:

NaH2P04 , H20 13,8 g indstil pH til 6,10+0,05 med NaOH BSA 2,0 g 20 NaH3 1,0 g C. Standard fortyndingsmiddel til 800 ml dH20 sæt: 6,90 g NaH2P04 . H20

25 1,000 g BSA

0,50 g NaN^ 34,25 g saccharose · · 1,044 g K2HP04 0,544 g KH2P04 30 25,0 ml varmebehandlet kalvefosterserum 25 mg streptomycin 5 0 mg vancomyc in

12,500 enheder nystatin indstil pH til 7,45 + 0.05 med 0,42 M NaOH 35 q.s. til 1,0 L

filtrer gennem et 0,22 jam filter

O

9

DK 161860 B

D. Konjugeret stødpude til 600 ral di^O sæt: 0,532 g KH2P04 2,80 g KoHP0.

5 ^ 4 0,20 g thimerosal 250 ml varmebehandlet kalvefosterserum indstil pH til 7,4 + 0,1

q.s til 1,0 L

10 filtrer gennem 0,22 pm filter E. Vaskestødpude til 900 ml dH20 sæt: 15 0,532 g KH2P04 2,800 g K2HP04

1.000 g BSA

indstil pH til 7,4 + 0,1 q.s. til 1,0 L med dH20 F. Substratstødpude til 900 ml dH20 sæt: 25 8,203 g vandfrit natriumacetat indstil pH med 1M citronsyre til 6,0 + 0,1 q.s. til 1,0 L med dH20 G. Tetramethylbenzidin (TMB) substrat 30 til 900 ml dimethylsulfoxid (DMSO) - Spectragrade, frysepunkt, 18°C sæt: 10.0 g 3,3',5,5', tetramethylbenzidin q.s.til 1,0 L med DMSO.

35 Opbevares ved stuetemperatur

DK 161860B

10 o Η. M hydrogenperoxidopløsning til 500 ml stabiliseret 3% H2C>2 sæt 500 ml dH20 og bland.

5 I. Standseopløsning - 2 m svovlsyre til 800 ml dH20 sæt: forsigtigt 111 ml svovlsyre (koncentreret), afkøl til stuetemperatur q.s. til 1.0L med dH20 J. '2 SP 'transportmedier til 900 ml dHo0 sæt: 15 2 saccharose 68,5 g K2HP04 2,088 g KH2P04 1,088 g

Kalvefosterserum (varmebehandlet) 50 ml 20

Streptomycin 50 mg Vancomycin 100 mg

Nystatin 25.000 enheder

Indstil pH til 7,0 og q.s. til 1,0L filter gennem steril 0,22 pm filter.

Prøvebehandling.

Prøvedacronvatpinde blev afskåret lige over vattet direkte 30 ned i 10x75 mm reagensglas. To glas blev opstillet med ubrugte vatpinde som blindforsøg. 500 ul 2SP transportmedium blev sat til hvert glas, og blandingerne blev omhvirvlet kraftigt i 10 til 20 sekunder efterfulgt af tilsætning af 50pl 0,42 M NaOH til hvert glas. Blandingerne blev så omhvirvlet i 10 35 til 20 sekunder kraftigt efterfulgt af inkubation ved 100°C (+ 2°C) i 15 minutter. Glassene blev så anbragt i et isbad og afkølet til ca. 25°C, hvorefter der blev tilsat 500 pi neutraliserende stødpude. Blandingerne blev så omhvirvlet 11

DK 161860 B

o kraftigt i 10 til 20 sekunder. Prøverne var så parat til bestemmelse.

Bestemmelsesprotokol-enzymbundet immunosorbentbestemmelse (ELISA).

Plader belagt med antistof blev vasket tre gange med vaskestødpude og banket tørre. 100 mikroliter af standarder, kontroller, blindprøver eller behandlede prøver blev sat til tilsvarende duplikerede fordybninger efterfulgt af blanding. Kontrollerne var prøveudpenslinger, der vides at indeholde elementære stoffer fra Chlamydia og behandlet som ovenfor beskrevet. Et andet sæt kontroller, der vides at indeholde elementære stoffer blev behandlet med 500 μΐ af den neutraliserende stødpude og 5 μΐ NaOH. Dette sæt kontroller var ubehandlet. Pladerne blev så dækket med pladeforseglingsmidler (tinfolie) og inkuberet natten over ved omgivelsernes temperatur. Fordybningernes indhold blev så kasseret, og pladerne vasket igen som ovenfor.

2Q 100 mikroliter konjugat blev sat til hver fordybning efter fulgt af blanding og overdækning med pladeforseglingsmidler. Pladerne blev så inkuberet ved 37°C i 2 til 3 timer. Fordybningens indhold blev igen kasseret, og pladen vasket som ovenfor, efterfulgt af en tilsætning af 200 mikroliter TMB-substrat- 25. opløsning. Denne arbejdsopløsning havde følgende sammensætning: 10,0 ml substratstødpude 100 μΐ stam TMB-substrat 30 pi 0,5M H20 30 Bland opløsningen grundigt.

Blandingen blev inkuberet i 30 minutter ved omgivelsernes temperatur og lejlighedsvis blanding. Reaktionen blev så standset ved tilsætning af 50 mikroliter 2M Pladerne blev 35 så aflæst i sammenligning med en substratblindprøve fremstillet ved at sætte 200 mikroliter substrat og 50 mikroliter 2M H2SO^ til en stribe fordybninger under anvendelse af et 450 nanometer filter.

DK 161860 8

O

12

Beregning og fortolkning af resultater.

Absorbansen af blindprøveudpenslingerne skulle være sammenlignelige med 0,0 ng/ml standarden. Arsorbanserne af standard-5 fordybninger, kontroller og prøver blev hver især taget som gennemsnit. Den gennemsnitlige 0,0ng/ml absorbans blev trukket fra alle standarders gennemsnitlige absorbanser. Gennemsnits-absorbansen af blindprøveudpenslingerne blev trukket fra gennem-snitsabsorbanserne af alle prøver og kontroller. Den korrigerede gennemsnitsabsorbans af hver standard blev så aftegnet som funktion af koncentrationen i ng/ml og genvindingerne bestemt af de tegnede kurver. En genvindingsværdi > 0,5 ng/ml blev anset for positiv. Alle positive prøver blev gentaget under anvendelse af både ovennævnte protokol og den nedenfor anførte bekræftelsesbestemmelse.

Protokol for bekræftelsesbestemmelse for positive prøver.

2Q Under anvendelse af samme chlamydia-antistof belagt på ELISA-fordybningerne, blev der fremstillet opløsninger indeholdende 1 mg/ml i standard stødpudefortynding. 10x75 ml reagensglas blev mærket ved at,tilsætte250 p.1 af hver fordøjet positiv prøve eller kontrol, der skulle behandles. 5 μΐ af antistofopløsningen 25 blev sat til alle glas, der så blev blandet grundigt ved om- hvirvling og henstillet i 5 minutter. Til tilsvarende duplikerede fordybninger blev sat 100 pi af de med antistof behandlede prøver. Duplikerede fordybninger fra lige store portioner af de fordøjede prøver blev også opstillet (ikke-behandlet 30 med Ab). Bestemmelserne blev udført som ovenfor beskrevet.

Fortolkning af resultater fra bekræftelsesafprøvning.

Et positivt resultat blev tillagt prøver med MP 39,5 genvindin-35 ger > 0,5 ng/ml i fordybningerne indeholdende prøverne, der ikke var behandlet med antistof og et betydeligt fald (>70% hæmning) i genvinding i prøven behandlet med antistof. En prøve, der bestemmes som positiv eller tvivlsom positiv ved

Claims (11)

10 Af de 100 undersøgte prøver var 62 negative og 38 positive. Bekræftelse af positive resultater skete ved hæmningsbestemmelse Elementærstoffer (EB) i kontroller blev delt i behandlede og ubehandlede grupper for at bestemme effektiviteten af MP 39,5 frigørelse. Af de behandlede EB var gennemsnitsabsor-15 bansen ved 450 nanometer 0,611, medens de ubehandlede EB gav en absorbans på 0,018 ved 450 nanometer. Patentkrav. 20

1. Fremgangsmåde til påvisning af det vigtigste ydre membranprotein af Chlamydia trachomatis, kendetegnet ved, at der tages en prøve; 25 dannes en prøveopløsning ved at blande prøven med en første stødpudeopløsning med en pH-værdi fra 6 til 8; prøveopløsningens pH-værdi indstilles til en værdi fra 8 til 12,5 ved anvendelse af base; 30 prøven inkuberes i en periode fra 5 minutter til 30 minutter; der tilsættes en neutraliserende anden stødpude med en pH-vær-di fra 1 til 7 for at bringe pH-værdien af prøveopløsningen 35 til en endelig værdi fra 7 til 8; og prøveopløsningen måles for at påvise tilstedeværelse af antigener. DK 161860 B

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den første stødpude er en sukkerholdig stødpudeopløsning, især saccharosephosphat,

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendeteg net ved, at basen omfatter natriumhydroxid, kaliumhydroxid, trinatriumphosphat eller tri(hydroxymethyl)aminomethan.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 3, kendeteg-10 net ved, at inkuberingstrinnet indbefatter opvarmning af prøveopløsningen til en temperatur fra 20eC til 105eC efter indstilling af prøvens pH-værdi, inkubering af prøven ved den temperatur og afkøling af prøveopløsningen efter inkubation til fra 0eC til 40eC, fortrinsvis fra ca. 25°C. 15

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at prøveopløsningen opvarmes til en temperatur fra 90°C til 100°C. 20 6, Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, ken detegnet ved, at den neutraliserende anden stødpude omfatter et phosphat, citronsyre, saltsyre eller tri(hydroxy-methyl)aminomethan, HCl-opløsning, især saccharosephosphat.

7. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, ken detegnet ved, at den endelige pH-værdi af prøveopløsningen er fra 7,2 til 7,8.

8. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, k e n -30 detegnet ved, at pH-værdien af prøven efter blanding af prøven med en første stødpudeopløsning indstilles til mellem 11,0 og 11,8.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, 35 at pH-værdien indstilles med natriumhydroxid.

10. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, kendetegnet ved, at målingen er ved radioimmunbestemmel- DK 161860 B 16 se.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1-9, kendetegnet ved, at målingen er ved enzymbundet immunoabsorbentbestemme1-5 se. 10 20 2 5 30 35