JPS61129572A - 細胞膜蛋白質の検出法 - Google Patents

細胞膜蛋白質の検出法

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JPS61129572A
JPS61129572A JP60174948A JP17494885A JPS61129572A JP S61129572 A JPS61129572 A JP S61129572A JP 60174948 A JP60174948 A JP 60174948A JP 17494885 A JP17494885 A JP 17494885A JP S61129572 A JPS61129572 A JP S61129572A
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般に微生物の細胞蛋白質の検出に関する。特
に関心のあるものは、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈ
ｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の主要外膜
蛋白質である。この蛋白質はクラミジア・トラコマチス
のあらゆる血清型に共通の抗原性を示すので、その検出
は診断指標として有用である。
イムノアッセイは微生物による感染を検出するために多
（の場合選ばれる方法である。特異的診断の補助として
、アッセイは特定の種の微生物を高度の信頼性をもって
同定できなければならない。
このためには大部分の場合、種特異性抗原を適宜な抗体
との反応のために単離する必要がある。この種の分析に
従う種類の微生物の代表例はクラミジア・トラコマチス
である。これはクラミジア属（Ｃｈ　ｌ　ａｍｙｄ　ｉ
　ａｃ　ｅ　ａｅ　）またはクラミジアレス属（Ｃｈｌ
ａｍｙｄｉａｌｅｓ）の２種の微生物のうちの１つであ
る。他方の種はクラミジア・プンタツシ（Ｃｈｌａｍｙ
ｄｉａ　ｐｓｉｔｔａｓｉ）である。クラミジアトラコ
マチス（約５０株）はヒトの多種の眼病および生殖器疾
患の病因であり、これにはトラコーマ、封入体結膜炎、
性病性リンパ肉芽腫、”非特異性″または非淋菌性の尿
道炎および直腸炎が含まれる。
クラミジア・トラコマチス感染は全集団に及ぶ。
たとえばクラミジア・トラコマチスは年間数百万症例の
非淋菌性尿道炎に関与していると推定される。
クラミジア・トラコマチスにより媒介される疾病は広範
にわたるので、適切な処置をとることができるために存
在する微生物に対する簡単なかつ費用のかからなり試験
法が強（望まれており、かつきわめて重要である。現在
用いられている唯一の血清学的試験はミクロ免疫螢光試
験である。しかしこの試験はクラミジア・トラコマチス
の菌株を血清学的試験用抗原として用いることを必要と
する。さらにこの試験を行う設備は世界中で限られた数
の研究室にあるにすぎない。この試験はきわめて労力を
要し、時間がかかり、かつ実施するのが困難である。
最近、米国特許第４，１１８，４６９号明細書に性病性
リンパ肉芽腫および非淋菌性尿道炎の血清学的試験に有
用なりラミシア・トラコマチスの抗原の調製法が記述さ
れた。この抗原はクラミジア・トラコマチス生体から、
アガロースゲルカラムに共有結合した特異的リガンドと
して単一特異性抗血清を用いる免疫吸着クロマトグラフ
ィーにより精製された。この抗原はわずか約１３０，０
００ダルトンの分子量をもち、向流免疫電気泳動試験に
おいて性病性リンパ肉芽腫患者の血清から抗体を検出す
ることができた。しかし非淋菌性尿道炎患者の血清を用
いる同様な試験に使用した場合、この抗原は抗体を検出
することができなかった。しかし抗体を二次元免疫電気
泳動試験により検出する際にはこれは有効であった。
しかしいずれにしろ、感染を好ましくは一般的に行われ
ている抗原−抗体アッセイ法により感染を検出できる、
微生物たとえばクラミジア・トラコマチスの種特異性抗
原の単離に社なお医学上大きな関心がもたれている。従
って本発明の目的は、これらの種特異性抗原を単離する
ための改良法を提供することである。
本発明は細胞蛋白質を検出するための診断試験法に関す
る。本発明をクラミジア・トラコマチスに関して詳述す
るが、本発明は微生物一般の細胞膜蛋白質に同等に適用
されると解すべきである。
多くの微生物において細胞膜蛋白質は種特異性抗原であ
る。すなわちすべての血清型の微生物に由来する抗体に
対して試験した場合、この蛋白質は種特異性をもって反
応する。このようにこの蛋白質はあらゆる血清型の微生
物に共通の特殊な蛋白質であり、抗原としてこれらの血
清型をすべて同定するための基礎を与える。
細胞膜蛋白質を微生物から放出させるための本発明方法
には下記の工程が含まれる。特定の微生物を含有する疑
いのある被験試料を採取し、試料をｐＨ約６．０〜約８
．０の第１緩衝液と混合し、これにより試料溶液を調製
し、試料のｐＨを塩基溶液により約８，０〜約１２．５
の値に調整し、試料を約５〜約３０分間インキュベート
し、ｐＨ約１．０〜７．０の中和用第２緩衝液を添加し
て試料のｐＨを約７．０〜約８．０の最終値となし、そ
して試料をアッセイして抗原の存在を検出する。
本発明の特定の実施態様においては、クラミジア・トラ
コマチスから主要外膜蛋白質を放出させる試験に下記の
工程が含まれる。頚管または尿道の試験スワプなどの試
料を採取し、試料をｐＨ約７、０　（７）シュクロース
ホスフェートからなる第１緩衝液に入れ、スワプを緩衝
液と混合して試料溶液を調製し、試料溶液に約０．４Ｍ
の水酸化ナトリウム溶液を一定量添加し、これにより試
料溶液のｐＨを約１１．０〜約１１．８に高め、試料溶
液の温度を約１００℃に高め、試料溶液を約１５分間イ
ンキュベートし、試料溶液を約２０〜約３０℃の温度に
冷却し、冷却した試料溶液のｐＨをｐＨ約６．１の中和
用ホスフェート緩衝液により約７２〜約７８に低下させ
、そして試料をアッセイして抗原の存在を検出する。
目的とする多種の微生物の細胞膜蛋白質はこれらの微生
物のあらゆる血清型に対する種特異性抗原である。この
種の蛋白質の１つはクラミジア・トラコマチスの主要外
膜蛋白質である。この蛋白質はクラミジア・トラコマチ
スの随伴する外膜蛋白質全体の約３０Ｌ１）からなり、
サブユニット分子量約３０，０００〜約４４，０００ダ
ルトン、平均分子量約３９．５００ダルトンの大きさを
もつ。以下呼びやすくするためにこの主要外膜蛋白質群
をＭＰ３９．５と呼ぶ。これは“平均サブユニット分子
量３９．５００ダルトンの主要外膜蛋白質”を表わす。
細胞膜蛋白質が検出されたことは、ある個体がその微生
物に感染していることを示す。有効に検出するためには
、その蛋白質が微生物細胞の感染粒子内から放出され、
および／または露出する必要がある。これが行われると
、検出は各種のアッセイにより、たとえばラジオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベントアッセ
イ（ＥＬＩＳＡ）などにより達成できる。
本発明方法によれば、微生物の潜在が疑われる試料また
は検体を採取し、この試料をアルカリ溶液および場合に
より熱で処理することを伴う、微生物細胞内の感染粒子
の処理法が開示される。
本発明者は、細胞をアルカリ溶液で処理することにより
細胞膜蛋白質が放出され、および／または露出すること
を見出した。本発明者はさらに、この処理法に熱を加え
ることにより、蛋白質の放出および／または露出の効率
が高められることを見出した。次いで各種のアッセイを
行って、処理細胞を含有する試料中に蛋白質が存在する
ことを検出することができる。
本発明による一般的操作は下記のとおりである。
すなわち被験資料をまずｐＨ約６．０〜約８．０の緩衝
塩溶液と混合する。適切な緩衝剤には糖ホスフェート緩
衝剤たとえばシュクロースホスフェート、その他車技術
分野で既知の糖含有緩衝剤が含まれる。望ましくは緩衝
液のｐＨは約６．８〜約７２である。
試料および緩衝塩溶液を十分に混和したのち、一定量の
アルカリ溶液を試料に齢加してｐＨを約８．０〜約１２
．５に高める。望ましくはｐＨは約１０．０〜約１２．
０であり、約１１．０〜約１１．８が好ましい。適切な
アルカリ溶液には水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
リン酸三ナトリウムおよびトリ（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタンの溶液が含まれ、水酸化ナトリウムが好まし
い。
ｐＨが希望する水準に調整されると、試料を約５〜約３
０分間インキュベートする。インキュベーションは室温
（２０℃）で、または約１０５℃までの高められた温度
で行うことができる。望ましくは試料の温度を約９０〜
約１００℃に高める。
約１００℃が好ましい。インキュベーション処際して高
められた温度を採用すると細胞膜蛋白質が放出され、お
よび／または露出する効率が高まることが認められた。
インキュベーショ７期間後に、試ｉ説熱した場合にはこ
れを約０〜約４０℃の温度に冷却する。約２５℃が好ま
しい。冷却は好ましくは水浴中に浸漬することにより行
う。
試料を冷却したのち、ｐＨ約１．０〜約７．０の中和用
第２緩衝液を添加して試料のｐＨを約７．０〜約８．０
の最終値にする。アッセイするための最適条件は一般に
このｐＨ値、すなわち中性ないしわずかにアルカリ性で
得られる。好ましくは溶液は約Ｚ２〜約７８の最終ｐＨ
をもつ。適切な中和用緩衝液には各種のホスフェート緩
衝液（ＰＢＳ　）が含まれ、シュクロースホスフェート
が好ましい。
他の適切な緩衝液にはクエン酸、塩酸、および塩酸トリ
（ヒドロキシメチル）アミノメタンが含まれる。このｐ
Ｈ調整後に試料はそれ以上調整することな（アッセイす
ることができる。
先きの記述から明らかなように、各種の緩衝塩、ｐＨを
高めるためのアルカリ溶液、および中和用緩衝液、なら
びに広範なインキュベーション時間および温度を本発明
方法に用いることができる。
実際の反応成分および条件はＭ　Ｐ　３９．５その他の
蛋白質を放出させる方法を特徴とする特定の検出アッセ
イ、たとえば酵素イムノアッセイ（ＩＩＥＩＡ）、ラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックスイムノアッセ
イなどと結びつけるように選ぶことができる。一般に既
知のイムノアッセイ法のいずれの型をも用いることがで
きる。
たとえばＭ　Ｐ　３９．５抗原に対する単一特異性抗体
は実験動物、たとえばマウスまたはウサギを用いた適切
な接種操作により産生させることができる。動物により
産生された抗体は他の哺乳動物におけるクラミジア属菌
感染のアッセイに用いることができる。これらのアッセ
イは感染した被験者における細菌性抗原の存在をアッセ
イするだめの周知の方法により行うことができる。Ｍ　
Ｐ　３９．５抗原接種した実験動物からの単一特異性抗
体の供給が確立されると、クラミジア属菌感染の潜在が
疑われる検体を用いる直接または間接アッセイ操作を行
うことができる。
直接アッセイ操作においては、膜蛋白質に対する単一特
異性抗体を固相支持体系に共有結合または非共有結合に
より付着させることができる、これらの方法忙一般的な
ように、支持体系はガラス、プラスチックなどであって
よい。
特定の膜蛋白質に対する単一特異性抗体が付着した固相
支持体を先きに概説した方法で調製された検体と共にイ
ンキュベートする。次いで、あらかじめ既知の方法によ
り放射性標識されたまたは酵素と、結合した、膜蛋白質
抗原に対する単一特異性抗体を次いで支持体系に対して
平衡化する。検体中に存在しており、支持体系上の抗体
に結合していた抗原は今度は放射性標識された、または
酵素に結合した抗体と結合する□セあろう。
放射性標識された抗体を用いる場合、次いで試料中の残
存放射能の量を測定する。この値を膜蛋白質抗原不含で
あると判定されている検体と比較する。酵素と結合した
抗体を用いる場合、その酵素に対し特異的な置換体を固
体支持体反応混合物に添加し、生じた色の変化を吸光分
光分析により記録する。この色の変化を蛋白質抗原不含
であることがわかっている試料と比較する。この方法で
検体中の抗原の存在を直接にアッセイすることができる
。
あるいは間接アッセイ法を用いることもできる。
詳細には、抗原を適切な固相支持体系に共有結合または
非共有結合により結合させＩることができる。
先きに概説した方法で調製した検体を、既知量の放射性
標識されたまたは酵素と結合した、膜蛋白質に対する抗
体（あらかじめ実験動物源から確保したもの）と混合す
る。次いで検体抽出液−抗体混合物を固体支持体系およ
びその結合抗原と共にイノキュベートする。
固体支持体系の放射能を測定するか、または結合系にお
ける発色を測定し、標準として同様に処理され、目的と
する抗原を含有しない検体と比較するＯ 微生物を含有する疑いのある臨床試料が放射性標識され
たまたは酵素と結合した抗体の固体支持体への結合を抑
制する能力は、臨床検体中に膜蛋白質抗原が存在するこ
と、または存在しないことを明らかにする。何らかの抑
制が証明された場合、感染を示す。他の適切なアッセイ
法および変法はこの種のアッセイ技術の分野における専
門家には明らかであろう。
下記の実施例はクラミジア・トラコマチスＭＰ６９５の
検出に適用した本発明を示す。上記の方法をほとんどま
たは全く変更することなく、各種微生物中の他の種類の
細胞蛋白質の検出に用いることができる。
実施例 ＩＣｌ０例の臨床スワプを採取し、クラミジア属菌の存
在を調べた。試薬配合物は下記のとおシ調製された。
Ａ、水酸化ナトリウム（０，４２Ｍ）溶液５０％（１２
，５Ｍ）ＮａＯＨ３４ｍ１適量を加えて１．Ｏｌにする
、 Ｂ、中和用緩衝液 蒸留水９００ｉＪに下記のものを添加する。
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２ｏ　　　　１３．８＆ＮａＯＨで
ｐＨを６．１０±０８０５に調整。
ＢＳＡ　　　　　　　　　　２．Ｏ＆ ＮａＮ３　　　　　　　　　　１．０　ｇＣ０標準希釈
液 蒸留水８００１１１に下記のものを添加する。
ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ６，９０ｇ ＢＳＡ　　　　　　　　　　　１．０００．ＦＮａＮ　
３０．５０　＆ ショ糖　　　　　　　３４．２５ｇ Ｋ２ＨＰＯ４１，０４４ｇ ＫＨ２ＰＯ４０，５４４，！ｉ’ 熱処理したウシ胎仔血清　２５．０１ｒＬｌストレプト
マイシン　　　２５ｒｎ９ バンコマイシン　　　　　５０＃１１ｉ１ナイスタチン
　　　　　　１２．５００単位０．４２Ｍ−ＮａＯＨに
よりｐＨを７．４５±０ｏ０５に調整。
適量を加えて１．Ｏｌにする。
０．２２μｍのフィルターで濾過。
Ｄ、酵素結合体用緩衝液 蒸留水３０．０ｍｌに下記のものを添加する。
ＫＨ２ＰＯ４０，５３２，Ｆ Ｋ２ＨＰＯ４２，８０ｇ チメロサール　　　　　　０．２０．！ｉ＋熱処理した
ウシ胎仔血清　２５０．　ｍｅｐＨをＺ４±０．１に調
整。
適量を加えて１．Ｏｌにする。
０．２２μｍのフィルターで濾過。
Ｅ、水洗浄用緩衝液 蒸留水９００ｍ１に下記のものを添加する。
Ｋ）ｆ２ＰＯ４０，５３２ｇ Ｋ２ＨＰＯ４２，８００ｇ ＢＳＡ　　　　　　　　　　　１．０００．！ｉ’ｐＨ
をＺ４±０．１に調整。
蒸留水を適量加えて１．０１にする。
Ｆ、基質用緩衝液 蒸留水９００ｍ１に下記のものを添加する。
酢酸ナトリウム（無水）　　　８．２０１１Ｍクエン酸
でｐＨを６．０±０．１に調整。
蒸留水を適量加えて１１にする。
Ｇ、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質ジメチルス
ルホキシド（ＤＭＳＯ）（スペクトル用、凝固点１８℃
）９００ｄに下記のものを添加する。
３．６′、ｓ、ｓ′−テトラメチルベンジジン　　１０
．０．？ＤＭＳＯを適量添加して１．Ｏｊにする。
室温に保存。
Ｈ，０，５Ｍ過酸化水素溶液 安定化した６％Ｈ２Ｏ２・５００ｒｎｌＦＣ蒸留水ｓｏ
ｏｍｇを添加して混合する。
工、停止液−２Ｍ硫酸 蒸留水ｓｏｏｍｌに下記のものを添加する。
濃硫酸１１１ｍ１（慎重に） 室温に冷却。
蒸留水を適量添加して１．Ｏｌにする。
Ｊ、２ＳＰ輸送用媒質 蒸留水９０Ｍに下記のものを添加する。
ショ糖　　　　　　　　　６８．５．９に２ＨＰＯ４２
，０８８ｌ！ ＫＨ２ＰＯ４１，０８８，Ｆ 加熱処理したウシ胎仔血清５Ｍ ストレプトマイシン　　　　５０■ バンコマイシン　　　　　１００ｒｎ９ナイスタチン　
　　　　　２５，０００単位ｐＨをｚＯに調整し、適量
を加えて１．Ｏｌにする。
無菌０．２２μｍのフィルターで濾過。
試料の処理 試料（ダクロンスワプ）を綿のすぐ上で切断し、直接１
１Ｃ１０Ｘ　７５　Ｉ！ｉＩのガラス製試験管に入れた
。、７ブランクとして未使用スワプな用いた２本の試験
管も用意した。２ＳＰ輸送用媒地を各試験管に添加し、
混合物を１０〜２０秒間激しく磁気攪拌したのち、０．
４２　Ｍ　−ＮａＯＨ５０μｌを各試験管に添加した。
次いで混合物を１０〜２０秒間激しく磁気攪拌したのち
１００℃（±２℃）で１５分間インキュベートした。次
いで試験管を水浴に入れて約２５℃にまで冷却し、次い
で中和用緩衝液５００μｌを添加した。次いで混合物を
１０〜２０秒間激しく磁気攪拌した。こうして試料はア
ッセイできる状態になった。
アッセイのプロトコール−酵素結合イムノノルベントア
ッセイ（ＥＬＩＳＡ） 抗体を塗布したプレートを洗浄用緩衝液で６回洗浄し、
水切りした。標準、対照、ブランク、または処理済試料
１００μｌを対応する２個ずつの穴に入れたのち混合し
た。対照はクラミジア基本小体を含有することがわかっ
ており、前記に従って処理された試料スワプであった。
基本小体を含有することがわかっている第２組の対照を
中和用緩衝液５００μぎおよびＮａＯＨ５０μ！で処理
した。この組の対照は処理しなかった。これらのプレー
トを次いでグレートシーラー（スズ箔）で覆い、周囲温
度で一夜インキユベートした。次いで穴の内容物を捨て
、プレートを再度上記に従って洗浄した。酵素結合体１
００μｌを各穴に添加したのち混合し、グレートシーラ
ーで覆った。次いでプレートを３７℃で２〜６時間イン
キュベートした。再び穴の内容物を捨て、プレートを前
記に従って洗浄したのち、作業用ＴＭＢ基質溶液２００
μｌを添加した。作業溶液は下記の組成を有していた。
。 基質緩衝液　　　　　１０．０ｍ／ ＴＭＢ基質原液　　１００μ１ ０．５Ｍ−Ｈ２Ｏ３０μｌ 溶液を十分に混合する。
混合物を時々混和しながら周囲温度で３０分間インキュ
ベートした。次いで２Ｍ−Ｈ２Ｓ０４５０μｌの添加に
より反応を停止した。基質２００μｌおよび２Ｍ−Ｈ２
ＳＯ４５０μｌを一連の穴に４５０１ｍのフィルターを
用いて添加することにより調製した基質ブランクに対し
てプレートを読み取った。
計算および結果の解釈 ブランクスワプの吸光度は０．０ｎ９／ｒｎｌ　の標準
液に相当するはずである。標準液の穴、対照および試料
の吸光度をそれぞれ平均した。Ｏ，Ｏ口ｇ／ｍＪの平均
吸光度をすべての標準液の平均吸光度から差し引いた。
ブランクの平均吸光度をすべての試料および対照の平均
吸光度から差し引いた。次いで各標準液の補正済平均吸
光度を浸度Ｃｎｇ／ｒｎｌ）に対してプロットし、プロ
ットした曲線から回収率を判定した。回収率の値〉０．
５０　ｇ／ｍｌを陽性とみなした。陽性の試料すべてに
つき、上記のプロトコールおよび下記の確認アッセイの
双方により反復試験した。
陽性の試料に関する確認アッセイのプロトコールＥＬｉ
ｉＳＡの各人に塗布したものと同一のクラミジア抗体を
用いて、標準緩衝液希釈液中に１ｍ９／ｍｌを含有する
溶液を調製した。１０Ｘ７５ｉ＋ｍの試験管を、処理す
べき消化した陽性の試料および対照各２５０μ！の添加
により標識した。抗体溶液５μｌをすべての試験管に添
加し、次いでこれＳ磁気攪拌により十分に混合し、５分
間放置した。対応する２個ずつの穴に抗体処理した試料
１００μｌを添加した。消化した試料の一定部分からな
る各２個の穴も設けた（抗体で処理していないもの）。
次いで上記に従ってアッセイを行った。
確認試験により得た結果の解釈 陽性の結果は、抗体で処理しなかった試料を含む穴にお
けるＭ　Ｐ　３９．５回収率〉０．５　ｎｙ／ｍｃおよ
び抗体処理した試料における回収率の有意の低下（抑制
率〉７０％）を伴う試料に対し与えられた。最初にアッ
セイされた時点では陽性または擬陽性とアッセイされ、
確認試験で陰性となった試料は陰性とみなした。これは
反復試験においてく０．５　ｎ　＆　／ｍｌが回収され
たことにより（抗体で処理しなかった一定部分）または
抗体で処理した一定部分が有意の回収率低下を示さなか
った場合に生じた。
結果 処理した１００個の試料のうち６２個は陰性、６８個は
陽性であった。陽性の結果の確認は抑制アッセイにより
行った。対照における基本小体（ＥＢ）を処理群と未処
理群に分けて、ＭＰ３９．５放出の効率を判定した。処
理したＥＢについては４５０１ｍにおける平均吸光度は
０．６１１であり、一方未処理ＥＢは４５０ｎｍ　でｏ
、ｏｉｓの吸光度を与えた。

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）特定の微生物を含有する疑いのある被験試料を採
    取し； 試料をｐＨ約６．０〜約８．０の第１緩衝液と混合し、
    これにより試料溶液を調製し； 試料のｐＨを塩基溶液により約８．０〜約１２．５の値
    に調整し； 試料を約５〜約３０分間インキュベートし；ｐＨ約１．
    ０〜約７．０の中和用第２緩衝液を添加して試料のｐＨ
    を約７．０〜約８．０の最終値となし；そして 試料をアツセイして抗原の存在を検出することよりなる
    、微生物の細胞膜蛋白質の検出法。
  2. （２）第１緩衝液が糖含有緩衝剤の溶液よりなる群から
    選ばれる、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. （３）塩基が水酸化ナトリウム、ＫＯＨ、リン酸三ナト
    リウム、およびトリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン
    よりなる群から選ばれる、特許請求の範囲第２項に記載
    の方法。
  4. （４）試料のＰＨを調整したのち試料溶液を約２０〜約
    １０５℃の温度に加熱し、試料をこの温度でインキュベ
    ートし、そして試料溶液をインキュベーション後に約０
    〜約４０℃に冷却することをさらに含む、特許請求の範
    囲第３項に記載の方法。
  5. （５）第１緩衝液がシユクロースホスフエートである、
    特許請求の範囲第４項に記載の方法。
  6. （６）試料が約９０〜約１００℃の温度に加熱される、
    特許請求の範囲第５項に記載の方法。
  7. （７）中和用第２緩衝液がＰＨ約１．０〜約７．０のホ
    スフェート、クエン酸、塩酸、および塩酸トリ（ヒドロ
    キシメチル）アミノメタンの溶液よりなる群から選ばれ
    る、特許請求の範囲第６項に記載の方法。
  8. （８）試料の最終ＰＨが約７．２〜約７．８である、特
    許請求の範囲第７項に記載の方法。
  9. （９）試料を第１緩衝液と混合したのち試料のＰＨを約
    １１．０〜約１１．８に調整する、特許請求の範囲第８
    項に記載の方法。
  10. （１０）塩基が水酸化ナトリウムである、特許請求の範
    囲第９項に記載の方法。
  11. （１１）試料溶液が約９０〜約１００℃の温度に加熱さ
    れる、特許請求の範囲第１０項に記載の方法。
  12. （１２）クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉ
    ａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の主要外膜蛋白質を検出
    するために用いられる、特許請求の範囲第１１項に記載
    の方法。
  13. （１３）試料が加熱されたのち約２５℃に冷却される、
    特許請求の範囲第１２項に記載の方法。
  14. （１４）中和用第２緩衝液がシユクロースホスフエート
    である、特許請求の範囲第１３項に記載の方法。
  15. （１５）アツセイがラジオイムノアツセイである、特許
    請求の範囲第１４項に記載の方法。
  16. （１６）アツセイが酵素結合免疫吸着アツセイである、
    特許請求の範囲第１４項に記載の方法。
  17. （１７）頸管または尿道の試験スワプなどの試料を採取
    し；試料をｐＨ約７．０のシユクロースホスフエートか
    らなる緩衝液に入れ； 試料を該緩衝液と混合して試料溶液を調製し；試料溶液
    に約０．４Ｍの水酸化ナトリウム溶液を一定量添加し、
    これにより試料溶液のｐＨを約１１．０〜１１．８に高
    め； 試料溶液の温度を約１００℃に高め； 試料溶液を上記の温度で約１５分間インキュベートし； 試料溶液を約２０〜約３０℃の温度に冷却し；冷却した
    試料溶液のｐＨをｐＨ約６．１の中和用ホスフェート緩
    衝液により約７．２〜７．８に低下させ；そして 試料をアツセイして抗原の存在を検出することよりなる
    、クラミジア・トラコマチスの主要外膜蛋白質の検出法
    。
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