JP6301310B2 - 精細胞中の細胞内感染因子の検出方法 - Google Patents

精細胞中の細胞内感染因子の検出方法 Download PDF

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Description

本発明は、低妊孕性および不妊症の病因を調査および決定すること、ならびに先天性感染症を予防することを企図して、精子中の細胞内ウイルス、クラミジア、寄生虫および他の微生物を検出するために、精液、つまり精細胞集団を分析する方法について記載する。手法全ては、ＤＮＡ構造を弛緩させる特殊方法、抗体を用いる微生物の標的化、フローサイトメトリーを用いた結果の評価を使用して実施する。
低妊孕性は、現在、発生頻度がますます上昇しつつある問題であり、多数の家族に影響を及ぼしている。そこでこの問題に対処するため、体外受精（ＩＶＦ）を含む数多くのアプローチが開発されてきた。
卵管閉塞、無精子症および閉経が低妊孕性の原因であることは議論の余地がない。無精子症と閉経の初期段階である精子過少症と閉経前期もまた、低妊孕性を引き起こす、ますます重要性の高まっている因子であるので、同様に関心が高い。特に精子過少症は、受胎するためには精子がたった１個あれば十分なので、ＩＶＦを介して容易に解決されるはずの問題である。しかし、実際にはそうではない。
精子については、これまで集中的に研究されてきた、精子の品質に関する形態および運動性という２種の評価パラメータに特に影響を及ぼす様々な質的欠陥が存在する。運動性は、ＩＶＦを試みるエンブリオロジスト（胚培養士）に、精子の顕微受精への適合性に関して近似情報しか提供しない。他方、精子形態は、精子が受精に適するか否かに関して評価するためのはるかに正確な基準である。しかし精子形態は、精子サンプルの形態学的特性解析に使用される精子が解析過程において破壊されるので、ＩＶＦに使用できる良好な精子を選択するための尺度として直接的に使用することはできない。上記によれば、低妊孕性カップルを観察する際に考慮に入れられる、精液サンプルを評価する多数の方法（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖａｌｕｅｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｓｅｍｅｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｕｐｄａｔｅ ２００９）があり、それらのカップルの多くはＩＶＦ法の使用へ進むことになる。
精液サンプルの最終特性解析は、検査対象の各精子上で検出された特異的な形態学的異常全ての評価を結合した結果となる。これらの異常が存在しないことを特徴とする精子は、「適合」または「正常」と分類される。さらに、生理学的数値も異常な精子１個当たりの形態学的異常の平均値を計測する奇形精子指数（ＴＺＩ）を通して与えられてきた。精子の品質を、プログラム細胞死の過程に入ってしまった精子であるサンプル中のアポトーシス性精子のパーセンテージを計測することによって評価することもまた可能である。
しかし、あらゆる精子異常は特定の原因に帰せることができる。そのような原因は、例えば慢性前立腺炎の症例では、微生物、または例えば喫煙、肥満、過剰な身体運動、高温などの他の因子であろう。
これに反して、男性低妊孕性の原因としてのウイルス因子は、医学界では現在まで重要であるとは見なされていなかった。２００４年および２００５年に、米国の２誌の生殖免疫学雑誌において、Ｌｏｃｕｓ Ｍｅｄｉｃｕｓ Ｓ．Ａ．の研究者ら（本発明の発明者であるＶ．Ｔｓｉｌｉｖａｋｏｓを含む）は、低妊孕性および／または流産（ｍｉｓｃａｒｒｉｇｅｓ）の病歴を持つ女性の血液中のナチュラルキラー（以下ではＮＫと呼ぶ）リンパ球の高い数値と無症候性ヘルペスウイルス血症（ＨＳＶ１〜２型、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７）の存在との相関について報告している。
その後、本発明者らは、流産胎児中ではＮＫリンパ球の大多数が着床部位に集合していたが、他方これらの女性の血中ＮＫレベルは正常であることを観察した。本発明者らの理論によれば、これは、これらの症例における胚が精子を含む精細胞を通して男性に遡ることができる（少なくともヘルペス性の）ウイルス抗原の存在に起因して胚自体が抗原性であるかどうかで説明できる。これらの抗原は、ＮＫ応答を引き起こす胎児細胞によって女性の免疫系に発現および提示されることになる。
しかし、本発明者らは、精子形態または精液分析の他のパラメータなどの伝統的診断法を通してウイルス要素の存在を確定しようと試みたが、それが実現不可能であることを見いだした。
カップルが不妊症クリニックを受診した場合の適正なアプローチは、この問題の原因を調査することである。多数の症状や徴候が不妊症に関係する因子であると見なされてきたが、それらの多くは主要原因ではなく、それら自体が、通常は実際上感染性である他の因子の結果であり、これらの根絶または抑制が治療に役立つ可能性がある。例えば、本発明者らは、卵管内のクラミジアもしくは他の微生物の存在が卵管閉塞をもたらすことがあり、この卵管閉塞は、最初は一時的だが、治療的介入を行わないと永続性になる可能性があることを知っている。同様に、細胞アポトーシスを原因とする精子を含む精細胞のＤＮＡ断片化は、男性生殖器官の様々な部分の細菌性もしくは場合によりウイルス性感染症ならびに例えば酸化的ストレスなどの他の因子の結果であることが多い。
カップルが抱える不妊症問題への対応が成功するか否かは、この問題の主要原因に関する解明の絶対精度、カップルが自然妊娠を達成するか、または何らかの種類の介助生殖を使用するかに左右される。残念なことに、実際に精液中にウイルスが存在することの臨床的重要性が個々の研究者らに認識されたのは近年に過ぎない（しかし、医学界全体では未だ認識されていない）が、最終的に未受精卵を受精させる精子内にウイルスが含まれていれば、臨床的により一層重要になる事実である。この場合、ウイルス感染症は、精子から受精卵へ垂直伝播を通して感染することができ、結果として胎児およびウイルス細胞の同時増殖を生じさせ、ウイルス細胞は次に、例えば神経系におけるヘルペスウイルスまたは心血管系における他のウイルスの場合のように、先天性欠損を誘発することが公知である器官や組織内に生息することになろう。本発明者らの見解では、感染性（ウイルス）因子の存在が有害作用を引き起こすために、免疫系はその感染との闘いに失敗する。これとは対照的に、女性の防御機構がウイルス抗原を認識することによって感染（ウイルス）因子に対向できれば、ウイルス感染胎児細胞の破壊がもたらされることになる。
胚細胞拒絶の機序は、ＮＫ細胞を介して発生する機序を含むことができ、この機序に対しては、免疫学的病因が第一三半期流産の経過において果たす役割に関して過去２５年以上にわたり極めて大きな議論が起こってきた。これは、少なくともそれに対するＮＫ細胞の活性化が後続反応であるヘルペスウイルスの場合には真実であろう。さらに、近年の刊行物において、本発明者らは、ギリシャ人教師の間での不妊症の高い発生率について報告した。この原因は、小児期のウイルス感染症への彼らの曝露率が高かったこと、つまりウイルス濃度が高かったことに求めることができよう。さらに本発明者らは、長期にわたり関係があるカップルでは流産の発生率が高いことを観察したが、これは女性の側に強度の免疫記憶が存在することを指していると思われる。この免疫記憶は、女性の免疫系から男性パートナーの「周知」ウイルスに対する強度の免疫学的応答を導き、結果として感染胚細胞の急速な破壊を生じさせることになる。残念なことに、胚抗原性に関して国際的に実施された試験は未だ存在していない。しかし本発明者らは、発達中の胚は、男性によって生み出される抗原である、およびそれらを自分自身と認識できるように女性器官がその抗原を作り出すことはない男性限定抗原を、少なくとも第一三半期終了時までは、ほとんどもしくは全く発現しないと考える。
配偶者間で異なるＨＬＡ分子に関して、本発明者らは、それらの発現が女性の免疫系と直接接触するようになる胎児細胞中ではダウンレギュレートされると認識している。そこで第一三半期流産中または極めて早期に発生する、このため月経の遅延を通して感知できない流産中には、どの異種抗原が女性器官を攻撃するのかという疑問が生じる。今後は、国際的科学コミュニティが、胎児へのウイルス抗原の直接伝播を生じさせるであろう、男性の無症候性ウイルス感染症の臨床的有意性度ならびに各症例の適切な治療に取り組むことが必要である。
本発明者らがこの因子を考察に含めたことから、精子を含む精細胞中の非ウイルスおよび他の汚染因子を考察することの失敗は、不妊症に関する不適切で不十分な研究と一致するという本発明者らの見解が生じた。
このため、高度の感受性および特異性で精子を含む精細胞中の感染因子を検出する方法に対する大きな必要があるが、残念なことに、現在まで、これは技術的に不可能であった。
その他のアプローチ
現在まで、精液中の例えばクラミジアなどの微生物を検出する方法は免疫蛍光法（スライド載荷細胞懸濁液）を使用してきたが、この方法の感受性は極めて低い。血液中の循環抗体を検出する血清学的ＥＬＩＳＡ法もまた頻回に使用されてきたが、感染の位置確認に関する情報は全く得られていない。
現在は、マイコプラズマ属を含む微生物が精液培養によって検出されている。しかし細胞内感染因子を培養するためには、特殊細胞系および細胞培養装置の使用ならびに厳密な実験に関する安全性基準が必要とされる。これらの要件の増加は、この技術を日常的に適用することをほぼ不可能にしている。
近年は、分子技術（主としてポリメラーゼ連鎖反応もしくはＰＣＲ）を使用すると、精子または精液の洗浄済み細胞成分からＤＮＡ抽出後にクラミジアおよび感染因子を検出することができる。しかし走査型電子顕微鏡による精子を含む精細胞内部での細胞内病原体の検出については、これまで報告されていない。
最後に、電子顕微鏡は、細胞膜の外面に付着した微生物またはウイルスの存在しか検出できない。
精液中のウイルスを検出するために高度の感度および特異性を特徴とする現在利用可能な最も有効なアプローチは、精液の洗浄細胞成分のＰＣＲである。しかしこの技術の主要な欠点は、細胞外または細胞内の寄生虫を、つまり検出された微生物が精子の外側または内側のどちらに位置するのか識別できないことであり、さらにこの技術は、感染した特定細胞型が、精子であるのか、または精液中に含有される他の細胞型、例えば白血球もしくは精細胞前駆細胞であるのかを指定することができない。
さらに、ウイルスおよび／またはトキソプラズマに対する抗体の血清学的検出は、精細胞の内側もしくは外側上または精液の任意の他の細胞成分上での感染因子の位置確認に関する情報を全く提供しない。
最後に、細胞内の微生物の検出は、蛍光性または発色性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを通して可能である。しかしこの方法は、本発明において記載する方法より感受性が低く、所要時間が長く、要する費用も高額である。
本発明において開示および記載する方法は、初めて、感染因子の、つまり精子を含む精細胞内（内側上）に位置する感染因子の細胞内検出を可能にする。
“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ”と題するＳｔｕａｒｔらの米国特許出願公開第２００６／００９９６６１Ａ１号明細書の特許出願は、大多数は末梢血液中であるが、さらに精液を含む他の生体液の細胞上でも、細胞の表面ならびに細胞内の両方でのクラミジアの検出に焦点を当てている。この特許では、発明者らは、下記の３つの基本的な
ａ）生体液を入手するステップと、
ｂ）細胞表面上もしくは細胞内でクラミジア抗原を特異的に認識するために一次抗体を使用するステップと、
ｃ）フローサイトメトリーを使用してサンプルを分析するステップと
について記載しており、
さらに彼らは、この特許に記載した提案方法を使用することによって、末梢血中でクラミジアを検出することに成功できると報告している。
さらに、化学物質ＴＲＩＴＯＮ−Ｘを使用するリンパ球内でのクラミジア検出法によると、“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ”と題する米国特許出願公開第２００６／００９９６６１Ａ１号明細書の著者らは、この方法が胚細胞を含む他の細胞内でのクラミジアの検出にも拡大できると主張している。
前記先行技術文献において記載された前提条件を試験するために、本発明者らは、発明者Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｓ．ＳｔｕａｒｔおよびＬｌｏｙｄ Ｈ．Ｓｅｍｐｒｅｖｉｖｏによって提案された実験方法にしたがって、米国特許出願公開第２００６／００９９６６１Ａ１号明細書に記載された実験を実施した。しかし精細胞内のクラミジア検出への本方法の拡大に関して米国特許出願公開第２００６／００９９６６１Ａ１号明細書に表示された主張にもかかわらず、本発明者らが下記の図１におけるヒストグラムに示したように、本発明者らは、胚細胞内での細胞内クラミジア検出がＳｔｕａｒｔおよびＳｅｍｐｒｅｖｉｖｏによって記載された試験技術にしたがうと不可能であることを見いだしたが、これは本発明において本発明者らが開示した方法によりクラミジアの存在に対して「強陽性」と特徴付けられた公知のサンプル上でのことであった。
本発明者らの結果によると、ＳｔｕａｒｔおよびＳｅｍｐｒｅｖｉｖｏによって報告された手法によるクラミジア検出に使用された精液サンプルを表示する曲線は、コントロールに比較して右方へのシフトを示さなかった（図１Ｂ）−２つの曲線は識別不能である。これは、この方法がサンプル中のクラミジアの存在を検出しなかったことを意味する。本発明の発明者らは、ＳｔｕａｒｔおよびＳｅｍｐｒｅｖｉｖｏによる方法が精細胞内でのクラミジア検出に失敗した原因が細胞の（ＤＮＡａｓｅを用いる）酵素処理が行われなかったことにあると考えており、この処理こそ本発明者らが提案する処理であり、精細胞内部の（細菌性もしくはウイルス性）感染因子を検出する手法にとって必須のステップであることが明らかになり、この手法は本発明の方法の中心で必須要素である。
さらに、本発明者らの結果は、ＳｔｕａｒｔおよびＳｅｍｐｒｅｖｉｖｏの方法が、特に直接蛍光法を使用した場合は、精液の試験に関する限り、感受性が低く特異性も低いことを証明した。これは、ＳｔｕａｒｔおよびＳｅｍｐｒｅｖｉｖｏの特許出願において提案されたプロトコールを使用することによって、陰性コントロール精液サンプル内でマウス抗原に対する特異性を備える抗ＣＤ３抗体が検出されるが、他方この抗体は理論的には精細胞内の抗原に結合するはずがない（低特異性）ことを示している図２に示されている。つまり、ＳｔｕａｒｔおよびＳｅｍｐｒｅｖｉｖｏの提案方法は、誤った誤解を招く結果を作り出す。
上記の結果は、Ｓｔｕａｒｔらの米国特許出願公開第２００６／００９９６６１Ａ１号明細書によって提案された、精細胞内で細胞内クラミジアを検出する方法が本発明によって記載された課題の解決を提供しないことを実証している。
本発明者らの見解によると、精液中の推定感染因子に関する付随的試験は、以下の：早期妊娠不成功、生化学的妊娠、精子過少症、精子無力症もしくは奇形精子症、ＩＶＦ試行の不成功、低妊孕性の内の１つ以上の病歴がある場合は必ず、または一般に低妊孕を予防するために絶対必要である。
特に低妊孕を予防するための第一の焦点は精子中のクラミジア検出であり、本発明者らは、他の微生物の存在もまた検出する目的で、スペルミオグラム（ｓｐｅｒｍｉｏｇｒａｍ（精子発育系図））と精液培養とを組み合わせて精子中のクラミジア検出を実施することを選択した。
本発明は、精子内部のウイルス、クラミジア、寄生虫および他の微生物の存在を検出および試験する方法において、直接的もしくは間接的免疫蛍光法を使用するステップと、その後にフローサイトメトリーを用いて視認および評価するステップとによる方法について記載する。
本発明は、この検出が、精子の内部に存在する微生物を検出するために細胞内で実施されることについて記載する。本発明で提案する方法は、例えばＤＮＡを弛緩させる特殊処理、例えばＤＮＡ消化を用いて、フローサイトメトリーの結果の評価と組み合わせた免疫蛍光法である。
本発明の特徴は、精子の細胞内のウイルス、クラミジア、寄生虫および他の感染性病原体の存在を調査するために記載した方法が以下の：
− 精子を含む精細胞のＤＮＡの高密度構造を弛緩させるステップと、
− 直接的もしくは間接的精細胞内免疫蛍光法と、
− フローサイトメトリーを用いた結果の視認および評価と
を含む点にある。
本発明者らは、標的抗原を特異的抗体によって検出可能にするためには、免疫蛍光法の前にＤＮＡの高密度構造のＤＮＡ弛緩を行うことが極めて重要であることを強調しておきたい。
フローサイトメトリーによって結果を視認および評価するステップは、１Ｎおよび２Ｎ細胞間を識別可能にするためにＷＢ内での細胞ペレットと７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）とのインキュベーションを含むことが有益である。
好ましくは、本発明で記載した方法は、低妊孕性、早期の妊娠不成功もしくは流産または胎児消失の原因を決定するために実施される。さらに、本方法は、先天性感染症を予防および研究するため、または垂直伝播を予防するため、ならびに男性生殖器系の炎症や感染症、例えば精巣上体炎（ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｔｉｓ）を検出するために使用できる。
本発明の方法は、さらに以下の病原体：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ＨＨＶ（ヒトヘルペスウイルス）−６、ＨＨＶ−７、ＨＨＶ−８、パルボウイルス１９、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、コクサッキーウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、風疹ウイルス、ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）、クラミジア、トキソプラズマおよびノロウイルスのうちの１つの特異的存在を検出することもできる。
特に、精子中のクラミジアの検出に関して、本方法は、他の病原体を検出するためにスペルミオグラムおよび精液培養と組み合わせることができ、これらの方法が同一サンプル上または異なるサンプル上で実施できることは有意な利点である。
好ましくは、極めて高密度である精子ＤＮＡのＤＮＡ構造の弛緩は、ＤＮＡ消化を用いて実施され、ＤＮＡ断片化を生じさせる。
ＤＮＡ消化は、ＤＮＡを切断する酵素を用いて実施することが有益である。
例えば、この酵素は、ＤＮａｓｅ Ｉであろう。
免疫蛍光法のためには、任意の適切な蛍光抗体または抗抗体を使用できる。このために、現在知られている以下の：フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、アミノメチルクマリンアセテート（ＡＭＣＡ ３５０）、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシクマリン誘導体（Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４０５、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシクマリン誘導体（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、フィコエリトリン（ＰＥ）、フィコエリトリンＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（ＰＥ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、フィコエリトリン−シアニン５（ＰＥ−Ｃｙ５）、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質−シアニン５．５（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）、フィコエリトリン−シアニン７（ＰＥ−Ｃｙ７）、ローダミンＴＲ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＬｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、アロフィコシアニンシアニン７（ＡＰＣ−Ｃｙ７）、ＢＤ ＡＰＣ−Ｈ７またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００のうちのいずれか１つを含む任意の蛍光色素を使用できる。
本発明の方法は、表面抗原を検出するための追加のステップを含むことができる。
本発明は、本発明の方法を使用して精子の内部のクラミジア、ウイルス、寄生虫および他の病原体を精子内検出するためのキットの開発および使用をさらに含んでいる。本キットは、精子細胞のＤＮＡを弛緩させることができる物質を必ず含んでいなければならない。この物質は、例えばＤＮＡを消化する酵素であろう；例えば、この酵素はＤＮａｓｅ Ｉであろう。さらに、本発明に開示したキットは、その存在を同定することが要求される特異的病原体に対する１つ以上の抗体を含まなければならない。上記の抗体は、例えば上述したような蛍光色素を用いて直接標識できる。病原体に対する特異的抗体が標識されない場合は、第一蛍光色素を認識する第二蛍光色素標識もしくはビオチン化抗体を含めなければならない。
以下の図面を使用すると本発明を例示することができる。
図１は、Ｓｔｕａｒｔらによる（他の細胞型に対する）米国特許出願公開第２００６／００９９６６１Ａ１号明細書に記載されたプロトコールによる精子内のクラミジア検出の不成功を示す図である。同一サンプルは、本発明によるＤＮＡ消化後には強陽性と特徴付けられる（データは示していない）。 図２は、Ｓｔｕａｒｔらによる（他の細胞型に対する）米国特許出願公開第２００６／００９９６６１Ａ１号明細書に記載されたプロトコールによる抗体特異性の消失を示す図である。マウスＣＤ３に対する抗体が結合し、精子に非特異的に結合し、右方への蛍光シフトを引き起こす。 図３は、フローサイトメトリーを用いたＣ．トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）およびＨＳＶ抗原の精子内検出を示す図である。図３Ａは、特異的抗原の検出がＤＮａｓｅ Ｉ消化後に観察されることを示し、図３Ｂは、特異的抗原の検出がＤＮａｓｅ Ｉ消化後に観察されることを示し、図３Ｃは、特異的抗原の検出がＤＮａｓｅ Ｉ消化後に観察されることを示している。これとは対照的に、図３Ｄは、ＤＮａｓｅ Ｉ消化が先行しないとそのような検出が行われないことを示し、図３Ｆは、ＤＮａｓｅ Ｉ消化が先行しないとそのような検出が行われないことを示し、図３Ｇは、ＤＮａｓｅ Ｉ消化が先行しないとそのような検出が行われないことを示している。
下記に本発明の実施形態の実施例を示す。
１． 精子を含む精細胞の固定
精液の収集および流動化後に、精子を沈降させ、４℃で３０分間にわたり４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて固定した。ＰＦＡは、タンパク質を架橋し、これにより病原体を不活性化して、精子に既に結合している推定自己抗体を固定化することによって機能し、所望であれば検出可能にさせる。一部のまれな場合には、一部の抗原性エピトープが変化もしくは破壊され、所定の抗体によって検出不能にさせられることがある。このような場合には、固定に先行して表面染色が実施されてよい。さらに、ＰＦＡ固定は、細胞の物理的特性を保存する。つまり、固定後には、細胞はフローサイトメトリーを用いて実施される解析中に、証明された同一散乱特性を示す。さらにＰＦＡ固定は、細胞外または細胞内いずれかのその後の染色手法の適用を可能にする。
２． 重要な注意
特定抗体をこの特定抗体が認識して結合する病原体とともにインキュベートする前に、精子の高密度ＤＮＡ構造を弛緩させる、または緩めるステップを最初に実施することは、この手法にとって極めて重要であって不可欠である。この方法は、ＤＮＡ構造を緩めることができる任意の方法、特に精子ＤＮＡの高密度構造を緩める能力を有するＤＮＡ消化法によって達成できる。ＤＮＡを緩めるこの方法は、同一結果を達成できる、機械的、熱的、電解的方法いずれか、または例えばβメルカプトエタノール、ジチオスレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンなどの還元剤を使用するなどの任意の他の手段を用いて実施できる。このような手段は、ＤＮＡ消化のための酵素の使用であってよい。本明細書に提示した特定の実施例では、このような物質の例は、ＤＮＡ消化酵素である。本明細書で使用する特定の実施例では、本発明者らは、このようなＤＮＡ消化物質として酵素ＤＮＡｓｅ Ｉを使用した。図３は、ＤＮａｓｅ Ｉ消化のステップを使用しなかった場合の病原体検出の不成功を例示している。
３． 精子内染色（間接的）
本発明者らの実施例において間接染色を使用するのは、コストが直接染色より安価なためである。しかし本発明は、以下に記載するように、代わりに直接共役抗体を利用しても機能できる。
Ａ． 細胞分画を沈降させ、再懸濁させ、３０分間にわたって４％のＰＦＡおよび０．１％のサポニン（培地Ａ）を含有する１００〜５００μＬのリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）とともにインキュベートする。これらの細胞は、次に０．１％のサポニンおよび２％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（洗浄バッファー（ＷＢ））を含有する２ｍＬのＰＢＳで洗浄する。上清を廃棄し、ペレットは、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および０．１％のサポニンを含有する１００〜５００μＬのＰＢＳとともに１０分間インキュベートする。ＷＢを用いた洗浄後、ペレットは４℃で１００〜５００μＬの培地Ａを用いて固定する。１０分間のインキュベーション後、細胞をＷＢで洗浄し、上清を廃棄し、ペレットは再懸濁させ、３７℃でＤＮａｓｅ Ｉ（５００μｇ／ｍＬ）とともに３０分間インキュベートする。最後に、細胞をＷＢで洗浄し、上清を廃棄し、ペレットは、以下の病原体：
ａ． サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
ｂ． 単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）および／または単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）
ｃ． エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）
ｄ． ＨＨＶ−６
ｅ． ＨＨＶ−７
ｆ． ＨＨＶ−８
ｇ． パルボウイルス１９
ｈ． Ｂ型肝炎ウイルス
ｉ． Ｃ型肝炎ウイルス
ｊ． コクサッキーウイルス
ｋ． ＨＩＶ（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）
ｌ． アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
ｍ． 風疹ウイルス
ｎ． ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）
ｏ． ノロウイルス
ｐ． クラミジア
ｑ． トキソプラズマのうちの１つに対して特異的な滴定量の特定抗体とともにインキュベートする。
細胞の抗体とのインキュベーションは、各１種の病原体につき別個の試験管内、または相互に対照的に発色する別個の蛍光体と直接共役した抗体が存在することを前提に、病原体の同時検出を可能にする同一試験管内のいずれかで行われる。
４℃での３０分間のインキュベーション後、細胞をＷＢで洗浄し、上清を廃棄する。
Ｂ． 細胞ペレットを再懸濁させ、その後に、それから一次抗体が開発された動物由来の免疫グロブリンに対する５０μＬのポリクローナル蛍光体共役抗体との新規インキュベーションを実施する。任意の蛍光体を使用できる。以下は、指示的に言及した現時点で最も知られている蛍光体であるが、これらが本発明者らの蛍光体の選択を制限すると見なすべきではない：
フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、アミノメチルクマリンアセテート（ＡＭＣＡ ３５０）、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシクマリン誘導体（Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４０５、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシクマリン誘導体（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、フィコエリトリン（ＰＥ）、フィコエリトリンＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（ＰＥ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、フィコエリトリン−シアニン５（ＰＥ−Ｃｙ５）、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質−シアニン５．５（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）、フィコエリトリン−シアニン７（ＰＥ−Ｃｙ７）、ローダミンＴＲ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＬｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、アロフィコシアニンシアニン７（ＡＰＣ−Ｃｙ７）、ＢＤ ＡＰＣ−Ｈ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００。
次に細胞の４℃での３０分間のわたるインキュベーションを行い、その後に細胞を２ｍＬのＷＢで洗浄する。白血球試験が必要であれば、その手法を次のステップで実施する。または、この手法は、細胞を採取するステップに進む。
任意選択の白血球染色のステップ
本発明者らが精液の白血球中に微生物が存在するか否かという疑問に直面した場合は、サンプルは、白血球内に病原体が存在する可能性を評価するために白血球抗原に対する直接共役抗体とともにインキュベートされることになる。この抗体に付着させる蛍光体は、病原体検出のために使用される他の蛍光体とは相違しなければならない。次に４℃で３０分間のインキュベーションを行い、さらに別の２ｍＬのＷＢで洗浄する。上清を廃棄し、次に細胞を再懸濁させる。さらに、１Ｎおよび２Ｎ細胞間の識別は、ＷＢ中での細胞ペレットと７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）とのインキュベーション後に実現できる。５分間のインキュベーション後、細胞はフローサイトメーターで捕捉する準備が整う。
病原体の直接免疫表現型検査
または、推定病原体に対する特異的抗体が蛍光体と直接共役した場合は、上述したステージＢを省略することができる。さらに、各特異的抗体はビオチンと共役させることができ、それらの検出は、その後のストレプトアビジン−蛍光体複合体とのインキュベーションによって達成できる。ビオチンの代りとして、任意の他の様式の蛍光体共役を使用できる。以下の公知の蛍光体：フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、アミノメチルクマリンアセテート（ＡＭＣＡ ３５０）、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシクマリン誘導体（Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４０５、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシクマリン誘導体（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、フィコエリトリン（ＰＥ）、フィコエリトリンＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（ＰＥ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、フィコエリトリン−シアニン５（ＰＥ−Ｃｙ５）、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質−シアニン５．５（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）、フィコエリトリン−シアニン７（ＰＥ−Ｃｙ７）、ローダミンＴＲ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＬｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、アロフィコシアニンシアニン７（ＡＰＣ−Ｃｙ７）、ＢＤ ＡＰＣ−Ｈ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００を含むがそれらに限定されない任意の蛍光体を使用できる。
４． 捕捉および結果の評価
フローサイトメトリー装置でサンプルを捕捉し、適切なソフトウエアを使用してデータ分析を実施する。細胞は、細胞のサイズおよび複雑性および／または抗原（例えば白血球抗原）の発現に基づく領域組み合わせを用いてゲーティングされる。この分析は、精子内または精液の他の細胞成分内の病原体の推定存在に焦点を当てる。さらに、白血球中のそのような病原体の検出は、白血球抗原の発現に基づく適切な領域を使用すると実現可能である。
Ｂ． 表面免疫染色
精子内染色に加えて、推定細胞外病原体の検出もまた実現可能である。細胞の第二分画を遠心にかけ、上清を廃棄し、細胞を各病原体に対して特異的な滴定量の特定抗体を含有する試験管に同等に分配する。４℃での３０分間のインキュベーション後に、試験管は２％のＦＣＳを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−２％のＦＣＳ）で洗浄し、上清を廃棄する。次に、細胞は、再懸濁させ、それから一次抗体が開発された動物由来の免疫グロブリンに対する５０μＬのポリクローナル蛍光体共役抗体中で再度インキュベートする。４℃での３０分間のインキュベーション後に、試験管は２％のＦＣＳを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−２％のＦＣＳ）で洗浄し、上清を廃棄する。細胞は再懸濁させ、捕捉および分析のためにフローサイトメトリー装置に配置する。
図面の詳細な説明
詳細には、
図３の二次元散布図では、精子のサイズ（ＦＳＣ−Ｈ）は、それらの複雑性（ＳＳＣ−Ｈ）に関して示されているが、このとき精子富裕細胞集団を調査できるように囲み領域Ｒが規定されている。
ＤＮＡｓｅを使用しない上記の手法によって、１つのクラミジア抗原および１つのヘルペス抗原各々を検出する抗体の特異的蛍光を図１のヒストグラム３Ｅおよび３Ｆに提示した。さらに、同一ヒストグラムにおいて、標識抗抗体によるコントロールの蛍光もまた示した。これら２本の曲線を比較すると、抗原が検出されない、つまり感染因子が検出されないことが明らかである。
同一囲み領域Ｒ内での精子の試験からの同一パラメータを図３のヒストグラム３Ａ、３Ｂおよび３Ｃに示したが、この場合には上記で詳述したようにＤＮＡａｓｅインキュベーションを含んでいた。データ解析は、ＤＮＡｓｅの存在下では、コントロール（感染因子特異的抗体の使用を排除した同一手法によって処理されている）と比較して右方への蛍光シフトによって明らかなように、精子中の感染因子の検出が実現可能であることを証明している。
図１および２については、本明細書の先行技術の章において上記で詳細に説明した。
本発明の方法の利点
・ 本発明に記載したように精子を含む精細胞の内部で感染因子を検出する方法の主要な利点は、細胞固定、膜透過化、および最も重要にはＤＮＡ消化酵素を用いたＤＮＡの高密度構造の酵素的弛緩のための技術および条件が満たされることを前提に、高度の感受性である。本発明者らが実施した並行調査では、同一サンプル上の分子（ＰＣＲ）検出試験結果が陰性である場合でさえ、本方法が感染因子の存在を検出することが見いだされた。さらに、特殊ビーズを使用し、抗原の数に蛍光レベルを適合させられる技術を使用することによって、精子を含む感染精細胞当たりの微生物もしくはウイルス数と蛍光強度を相関させる曲線を作成することが可能になる。本発明が提案する方法は、１サンプル当たり極めて多数（例、２０，０００個）の細胞の試験およびサンプルのレトロスペクティブ再試験を可能にする。提案方法によって提供されるこの量的優位性は、偽陰性（感染因子の検出の不成功）結果の可能性を最小限に抑える。
・ 本方法の高度の特異性は確立されており、陰性コントロールの使用、および当然ながらモノクローナル抗体（各微生物もしくはウイルスに対する特定分子の単一特異的部位を特異的に検出して反応する物質）の使用を通して保証される。さらに、散乱特性の評価を通して、および／または補助抗体（つまり、抗ＣＤ４５）を用いると、精子を含む精細胞中の微生物の存在を確証できる。さらに、感染因子は細胞膜の外面に付着しているが、精子を含む精細胞の内部には付着していないこともまた明白に証明されている；このような情報は臨床的有意性が極めて大きい。
・ 本方法は、抗生物質もしくは抗ウイルスによる治療の有効性の評価を可能にする。サンプル中で検出される微生物（例、テトラサイクリンによる治療後のクラミジア）数の減少によって指示される、感染の退行を決定することによって病原体を監視することは有用である。
・ 固定サンプルは、試験時まで長期間にわたって安全に貯蔵できる。固定サンプルの輸送もまた実現可能である。本発明において精液を試験するために記載した方法はフローサイトメトリーの使用を必要とするので、この技術を持たない研究室がフローサイトメトリーを利用することは不可能である。この問題に対処するために、本発明において記載した方法は、感受性もしくは特異性を消失させずに固定サンプルの（様々な場所や研究室間の）安全な移動もしくは輸送を可能にする。さらに、安全なサンプル輸送能力は、フローサイトメトリーの技術的失敗が生じた場合に、別の研究室でのサンプルの再試験を可能にする。最後に、結果として生じたデータは、装置によって電子的に保存されるので、再評価のためにいつでも利用できる。
・ 本明細書に記載した方法は、同等のＰＣＲ試験のコストより確実に安価な極めて低いコストを特徴とする。
・ 本明細書に記載した方法は、試験結果を試験当日に入手できるので、極めて迅速な研究室ターンアラウンドタイムを特徴とする。
さらに、本発明は、精子を含む精細胞内の細胞内感染因子を検出する方法において、特異的免疫蛍光法を使用するステップとフローサイトメトリーによって試験結果を評価するステップとを含む方法について初めて記載する。
− 精子の細胞内分析は、細胞内部のＤＮＡ構造を「緩める」ＤＮＡ消化酵素を使用することで可能になる。本発明者らは、現在までの試薬（抗体）が精子頭部内の微生物（標的抗原）を検出できなかったことの原因は、細胞のその領域内に存在するＤＮＡの特定の極めて高い濃度にあると考えた。その結果、本発明者らは、抗体が標的抗原（微生物）に接触して結合する経路を明確にするためには消化を通してＤＮＡを「緩める」ことが必要と考える。
− 細胞内または細胞膜の外面上の微生物の検出に関する限り、本発明者らは、これらは臨床的解釈が異なる、２種の異なる種類のアプローチであると考える。例えば、本発明者らは、非顕性ウイルス血症およびクラミジア血症の原因は血液精巣関門の透過を通した前駆胚細胞感染にあると考える。他方、微生物の膜局在は、主として精液放出経路（精巣上体、前立腺、尿道）の感染に関連している。
自然妊娠に関しては、接合子細胞は細胞内感染因子の垂直伝播、つまり、精子による胎児への感染因子の直接伝播に対して保護されるとは思われないが、他方膜結合感染因子の伝播はより容易に阻止できる。例えば、Ａｙｎａｕｄ ｅｔ ａｌ．（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ，ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｉｎ ｓｅｍｅｎ．Ａｙｎａｕｄ Ｏ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ ＳＴＤ ＡＩＤＳ．２００２ Ａｕｇ；１３（８）：５４７−５０）によると、精漿は細胞膜へのウイルス付着を予防する。
本発明者らは、細胞表面上の感染因子は、精漿、抗体、前立腺などの要素の作用に起因して、垂直伝播については相当に小さなリスク因子であると考える。これとは対照的に、本発明者らは、胎児への無傷の細胞内感染因子の垂直伝播は、例えば先天性疾患、不妊症もしくは早期流産などの問題の発生にとって大きなリスクであると考える。
特に自然妊娠中（卵細胞質内精子注入法なし）には、精子頭部のみが卵子内に進入し、残りの細胞（精細胞表面の大部分を占める）は排除される。その結果、細胞内感染因子は不可避的に卵子内に進入するが、他方、細胞膜結合微生物に関しては、精細胞膜は受精中は受精卵の外側に留まるので、これは当てはまらない。
その結果、本発明者らは、精子から胎児への垂直伝播の試験において、細胞内感染因子の調査は最重要であると考える。
以下の表１では、ＬＯＣＵＳ ＭＥＤＩＣＵＳ Ｓ．Ａ．の研究室において試験したサンプルならびにＬＯＣＵＳ ＭＥＤＩＣＵＳ Ｓ．Ａ．の細胞生物学・免疫学研究室からの５カ月間の予備試験結果のデータを提示した。
Figure 0006301310
本発明者らは、サンプルの５％超で陽性精子が検出されたサンプルを「強陽性」と見なす。
上記の結果は、試験した有意な割合（％）のサンプルが細胞内クラミジアおよび／またはウイルスに感染しているのが見いだされたことを示している。検出された細胞内感染は、他の方法では見つけることができなかった。陽性結果（つまり、感染の検出）は、以下の表２に示したように、適切な抗生物質を用いて感染を即時に治療することを可能にする。
Figure 0006301310
より詳細には、表２は、「強陽性」（膜結合Ｃ．トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）が検出された）サンプル計３７例中２０例（５４．０５％）において、抗生物質による治療後にクラミジア量が減少したことを示している。さらに表２は、Ｃ．トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）が細胞内検出された場合、抗生物質による治療後に３７例中２７例（７２．９７％）が改善を示したので、クラミジア量の減少を示したサンプルの割合（％）がいっそう高かったことを示している。

Claims (12)

  1. 精子の細胞内のウイルス、クラミジア、寄生虫および他の感染性病原体の存在を調査する方法において、
    − 精子を含む精細胞のＤＮＡの高密度構造をＤＮＡ消化を用いて弛緩させるステップと、
    − 直接的もしくは間接的精子内細胞免疫蛍光法と、
    − フローサイトメトリーによる結果の視認および評価とのための手法を含み、
    および前記ＤＮＡの高密度構造を弛緩させるステップが免疫蛍光法の前に必ず実施されなければならない事実を特徴とする方法。
  2. 請求項１に記載の方法において、フローサイトメトリーにより結果を視認および評価する前記ステップは、１Ｎおよび２Ｎ細胞間の識別を可能にするために洗浄バッファー（ＷＢ）内での細胞ペレットと７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）とのインキュベーションを含むことを特徴とする方法。
  3. 請求項１または２のいずれか一項に記載の方法において、不妊症、早期妊娠不成功の流産または胎児消失の原因を決定するため、および先天性感染症の予防もしくは垂直伝播の予防のため、さらに男性生殖器系の炎症および感染症を調査するために使用されることを特徴とする方法。
  4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法において、以下の感染因子：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、ＨＨＶ−８、パルボウイルス１９、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、コクサッキーウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、風疹ウイルス、ＨＰＶ、クラミジア、トキソプラズマおよびノロウイルスのうちの１つを調査するために使用されることを特徴とする方法。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法において、スペルミオグラムおよび精子中のクラミジアの存在について同一サンプル上もしくは相違するサンプル上の培養と組み合わせて調査するために使用されることを特徴とする方法。
  6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法において、ＤＮＡ消化がＤＮＡを切断する酵素を用いて実施されることを特徴とする方法。
  7. 請求項６に記載の方法において、ＤＮＡを切断する前記酵素はＤＮａｓｅ Ｉであることを特徴とする方法。
  8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法において、適切な標識抗体を蛍光法のために使用できることを特徴とする方法。
  9. 請求項８に記載の方法において、蛍光法のために以下の蛍光体：フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、アミノメチルクマリンアセテート（ＡＭＣＡ ３５０）、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシクマリン誘導体（Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４０５、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシクマリン誘導体（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、フィコエリトリン（ＰＥ）、フィコエリトリンＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（ＰＥ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、フィコエリトリン−シアニン５（ＰＥ−Ｃｙ５）、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質−シアニン５．５（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）、フィコエリトリン−シアニン７（ＰＥ−Ｃｙ７）、ローダミンＴＲ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＬｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、アロフィコシアニンシアニン７（ＡＰＣ−Ｃｙ７）、ＢＤ ＡＰＣ−Ｈ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００のうちのいずれか１つを使用できることを特徴とする方法。
  10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法において、表面免疫蛍光法の１つの追加ステップが含まれることを特徴とする方法。
  11. 精子の内部に存在するウイルス、クラミジア、寄生虫および他の病原体を調査するためのキットにおいて、少なくとも以下の：
    − 精子細胞のＤＮＡを弛緩させることができるＤＮＡ消化物質と、
    − 対象の感染因子に対して使用するのに適切な１つ以上の抗体と
    を含むことを特徴とするキット。
  12. 請求項１１に記載のキットにおいて、前記ＤＮＡ消化物質がＤＮＡ消化酵素であることを特徴とするキット。
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