JP6301310B2 - 精細胞中の細胞内感染因子の検出方法 - Google Patents
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Description
現在まで、精液中の例えばクラミジアなどの微生物を検出する方法は免疫蛍光法(スライド載荷細胞懸濁液)を使用してきたが、この方法の感受性は極めて低い。血液中の循環抗体を検出する血清学的ELISA法もまた頻回に使用されてきたが、感染の位置確認に関する情報は全く得られていない。
a)生体液を入手するステップと、
b)細胞表面上もしくは細胞内でクラミジア抗原を特異的に認識するために一次抗体を使用するステップと、
c)フローサイトメトリーを使用してサンプルを分析するステップと
について記載しており、
さらに彼らは、この特許に記載した提案方法を使用することによって、末梢血中でクラミジアを検出することに成功できると報告している。
− 精子を含む精細胞のDNAの高密度構造を弛緩させるステップと、
− 直接的もしくは間接的精細胞内免疫蛍光法と、
− フローサイトメトリーを用いた結果の視認および評価と
を含む点にある。
精液の収集および流動化後に、精子を沈降させ、4℃で30分間にわたり4%パラホルムアルデヒド(PFA)を用いて固定した。PFAは、タンパク質を架橋し、これにより病原体を不活性化して、精子に既に結合している推定自己抗体を固定化することによって機能し、所望であれば検出可能にさせる。一部のまれな場合には、一部の抗原性エピトープが変化もしくは破壊され、所定の抗体によって検出不能にさせられることがある。このような場合には、固定に先行して表面染色が実施されてよい。さらに、PFA固定は、細胞の物理的特性を保存する。つまり、固定後には、細胞はフローサイトメトリーを用いて実施される解析中に、証明された同一散乱特性を示す。さらにPFA固定は、細胞外または細胞内いずれかのその後の染色手法の適用を可能にする。
特定抗体をこの特定抗体が認識して結合する病原体とともにインキュベートする前に、精子の高密度DNA構造を弛緩させる、または緩めるステップを最初に実施することは、この手法にとって極めて重要であって不可欠である。この方法は、DNA構造を緩めることができる任意の方法、特に精子DNAの高密度構造を緩める能力を有するDNA消化法によって達成できる。DNAを緩めるこの方法は、同一結果を達成できる、機械的、熱的、電解的方法いずれか、または例えばβメルカプトエタノール、ジチオスレイトール、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンなどの還元剤を使用するなどの任意の他の手段を用いて実施できる。このような手段は、DNA消化のための酵素の使用であってよい。本明細書に提示した特定の実施例では、このような物質の例は、DNA消化酵素である。本明細書で使用する特定の実施例では、本発明者らは、このようなDNA消化物質として酵素DNAse Iを使用した。図3は、DNase I消化のステップを使用しなかった場合の病原体検出の不成功を例示している。
本発明者らの実施例において間接染色を使用するのは、コストが直接染色より安価なためである。しかし本発明は、以下に記載するように、代わりに直接共役抗体を利用しても機能できる。
a. サイトメガロウイルス(CMV)
b. 単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)および/または単純ヘルペスウイルス2型(HSV−2)
c. エプスタイン・バーウイルス(EBV)
d. HHV−6
e. HHV−7
f. HHV−8
g. パルボウイルス19
h. B型肝炎ウイルス
i. C型肝炎ウイルス
j. コクサッキーウイルス
k. HIV(HIV−1、HIV−2)
l. アデノ随伴ウイルス(AAV)
m. 風疹ウイルス
n. HPV(ヒト乳頭腫ウイルス)
o. ノロウイルス
p. クラミジア
q. トキソプラズマのうちの1つに対して特異的な滴定量の特定抗体とともにインキュベートする。
フルオレセイン−5−イソチオシアネート(FITC)、アミノメチルクマリンアセテート(AMCA 350)、6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン誘導体(Marina Blue)、Cascade Blue、Alexa fluor 405、6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン誘導体(Pacific Blue)、Alexa Fluor 430、Cascade Yellow、Alexa Fluor 488、フィコエリトリン(PE)、フィコエリトリンTexas Red(PE−Texas Red)、フィコエリトリン−シアニン5(PE−Cy5)、ペリジニンクロロフィルタンパク質(PerCP)、ペリジニンクロロフィルタンパク質−シアニン5.5(PerCP−Cy5.5)、フィコエリトリン−シアニン7(PE−Cy7)、ローダミンTR、アロフィコシアニン(APC)、ALexa Fluor 647、アロフィコシアニンシアニン7(APC−Cy7)、BD APC−H7、Alexa Fluor 700。
本発明者らが精液の白血球中に微生物が存在するか否かという疑問に直面した場合は、サンプルは、白血球内に病原体が存在する可能性を評価するために白血球抗原に対する直接共役抗体とともにインキュベートされることになる。この抗体に付着させる蛍光体は、病原体検出のために使用される他の蛍光体とは相違しなければならない。次に4℃で30分間のインキュベーションを行い、さらに別の2mLのWBで洗浄する。上清を廃棄し、次に細胞を再懸濁させる。さらに、1Nおよび2N細胞間の識別は、WB中での細胞ペレットと7−アミノアクチノマイシンD(7AAD)とのインキュベーション後に実現できる。5分間のインキュベーション後、細胞はフローサイトメーターで捕捉する準備が整う。
または、推定病原体に対する特異的抗体が蛍光体と直接共役した場合は、上述したステージBを省略することができる。さらに、各特異的抗体はビオチンと共役させることができ、それらの検出は、その後のストレプトアビジン−蛍光体複合体とのインキュベーションによって達成できる。ビオチンの代りとして、任意の他の様式の蛍光体共役を使用できる。以下の公知の蛍光体:フルオレセイン−5−イソチオシアネート(FITC)、アミノメチルクマリンアセテート(AMCA 350)、6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン誘導体(Marina Blue)、Cascade Blue、Alexa fluor 405、6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン誘導体(Pacific Blue)、Alexa Fluor 430、Cascade Yellow、Alexa Fluor 488、フィコエリトリン(PE)、フィコエリトリンTexas Red(PE−Texas Red)、フィコエリトリン−シアニン5(PE−Cy5)、ペリジニンクロロフィルタンパク質(PerCP)、ペリジニンクロロフィルタンパク質−シアニン5.5(PerCP−Cy5.5)、フィコエリトリン−シアニン7(PE−Cy7)、ローダミンTR、アロフィコシアニン(APC)、ALexa Fluor 647、アロフィコシアニンシアニン7(APC−Cy7)、BD APC−H7、Alexa Fluor 700を含むがそれらに限定されない任意の蛍光体を使用できる。
フローサイトメトリー装置でサンプルを捕捉し、適切なソフトウエアを使用してデータ分析を実施する。細胞は、細胞のサイズおよび複雑性および/または抗原(例えば白血球抗原)の発現に基づく領域組み合わせを用いてゲーティングされる。この分析は、精子内または精液の他の細胞成分内の病原体の推定存在に焦点を当てる。さらに、白血球中のそのような病原体の検出は、白血球抗原の発現に基づく適切な領域を使用すると実現可能である。
精子内染色に加えて、推定細胞外病原体の検出もまた実現可能である。細胞の第二分画を遠心にかけ、上清を廃棄し、細胞を各病原体に対して特異的な滴定量の特定抗体を含有する試験管に同等に分配する。4℃での30分間のインキュベーション後に、試験管は2%のFCSを含有するPBS(PBS−2%のFCS)で洗浄し、上清を廃棄する。次に、細胞は、再懸濁させ、それから一次抗体が開発された動物由来の免疫グロブリンに対する50μLのポリクローナル蛍光体共役抗体中で再度インキュベートする。4℃での30分間のインキュベーション後に、試験管は2%のFCSを含有するPBS(PBS−2%のFCS)で洗浄し、上清を廃棄する。細胞は再懸濁させ、捕捉および分析のためにフローサイトメトリー装置に配置する。
詳細には、
図3の二次元散布図では、精子のサイズ(FSC−H)は、それらの複雑性(SSC−H)に関して示されているが、このとき精子富裕細胞集団を調査できるように囲み領域Rが規定されている。
・ 本発明に記載したように精子を含む精細胞の内部で感染因子を検出する方法の主要な利点は、細胞固定、膜透過化、および最も重要にはDNA消化酵素を用いたDNAの高密度構造の酵素的弛緩のための技術および条件が満たされることを前提に、高度の感受性である。本発明者らが実施した並行調査では、同一サンプル上の分子(PCR)検出試験結果が陰性である場合でさえ、本方法が感染因子の存在を検出することが見いだされた。さらに、特殊ビーズを使用し、抗原の数に蛍光レベルを適合させられる技術を使用することによって、精子を含む感染精細胞当たりの微生物もしくはウイルス数と蛍光強度を相関させる曲線を作成することが可能になる。本発明が提案する方法は、1サンプル当たり極めて多数(例、20,000個)の細胞の試験およびサンプルのレトロスペクティブ再試験を可能にする。提案方法によって提供されるこの量的優位性は、偽陰性(感染因子の検出の不成功)結果の可能性を最小限に抑える。
− 精子の細胞内分析は、細胞内部のDNA構造を「緩める」DNA消化酵素を使用することで可能になる。本発明者らは、現在までの試薬(抗体)が精子頭部内の微生物(標的抗原)を検出できなかったことの原因は、細胞のその領域内に存在するDNAの特定の極めて高い濃度にあると考えた。その結果、本発明者らは、抗体が標的抗原(微生物)に接触して結合する経路を明確にするためには消化を通してDNAを「緩める」ことが必要と考える。
− 細胞内または細胞膜の外面上の微生物の検出に関する限り、本発明者らは、これらは臨床的解釈が異なる、2種の異なる種類のアプローチであると考える。例えば、本発明者らは、非顕性ウイルス血症およびクラミジア血症の原因は血液精巣関門の透過を通した前駆胚細胞感染にあると考える。他方、微生物の膜局在は、主として精液放出経路(精巣上体、前立腺、尿道)の感染に関連している。
Claims (12)
- 精子の細胞内のウイルス、クラミジア、寄生虫および他の感染性病原体の存在を調査する方法において、
− 精子を含む精細胞のDNAの高密度構造をDNA消化を用いて弛緩させるステップと、
− 直接的もしくは間接的精子内細胞免疫蛍光法と、
− フローサイトメトリーによる結果の視認および評価とのための手法を含み、
および前記DNAの高密度構造を弛緩させるステップが免疫蛍光法の前に必ず実施されなければならない事実を特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法において、フローサイトメトリーにより結果を視認および評価する前記ステップは、1Nおよび2N細胞間の識別を可能にするために洗浄バッファー(WB)内での細胞ペレットと7−アミノアクチノマイシンD(7AAD)とのインキュベーションを含むことを特徴とする方法。
- 請求項1または2のいずれか一項に記載の方法において、不妊症、早期妊娠不成功の流産または胎児消失の原因を決定するため、および先天性感染症の予防もしくは垂直伝播の予防のため、さらに男性生殖器系の炎症および感染症を調査するために使用されることを特徴とする方法。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法において、以下の感染因子:サイトメガロウイルス(CMV)、単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)、単純ヘルペスウイルス2型(HSV−2)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、HHV−6、HHV−7、HHV−8、パルボウイルス19、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、コクサッキーウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV−1、HIV−2)、アデノ随伴ウイルス(AAV)、風疹ウイルス、HPV、クラミジア、トキソプラズマおよびノロウイルスのうちの1つを調査するために使用されることを特徴とする方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法において、スペルミオグラムおよび精子中のクラミジアの存在について同一サンプル上もしくは相違するサンプル上の培養と組み合わせて調査するために使用されることを特徴とする方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法において、DNA消化がDNAを切断する酵素を用いて実施されることを特徴とする方法。
- 請求項6に記載の方法において、DNAを切断する前記酵素はDNase Iであることを特徴とする方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法において、適切な標識抗体を蛍光法のために使用できることを特徴とする方法。
- 請求項8に記載の方法において、蛍光法のために以下の蛍光体:フルオレセイン−5−イソチオシアネート(FITC)、アミノメチルクマリンアセテート(AMCA 350)、6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン誘導体(Marina Blue)、Cascade Blue、Alexa fluor 405、6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン誘導体(Pacific Blue)、Alexa Fluor 430、Cascade Yellow、Alexa Fluor 488、フィコエリトリン(PE)、フィコエリトリンTexas Red(PE−Texas Red)、フィコエリトリン−シアニン5(PE−Cy5)、ペリジニンクロロフィルタンパク質(PerCP)、ペリジニンクロロフィルタンパク質−シアニン5.5(PerCP−Cy5.5)、フィコエリトリン−シアニン7(PE−Cy7)、ローダミンTR、アロフィコシアニン(APC)、ALexa Fluor 647、アロフィコシアニンシアニン7(APC−Cy7)、BD APC−H7、Alexa Fluor 700のうちのいずれか1つを使用できることを特徴とする方法。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法において、表面免疫蛍光法の1つの追加ステップが含まれることを特徴とする方法。
- 精子の内部に存在するウイルス、クラミジア、寄生虫および他の病原体を調査するためのキットにおいて、少なくとも以下の:
− 精子細胞のDNAを弛緩させることができるDNA消化物質と、
− 対象の感染因子に対して使用するのに適切な1つ以上の抗体と
を含むことを特徴とするキット。 - 請求項11に記載のキットにおいて、前記DNA消化物質がDNA消化酵素であることを特徴とするキット。
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