BRPI0714494B1

BRPI0714494B1 - ensaio e kit para a previsão de sucesso para implantação em fertilização assistida

Info

Publication number: BRPI0714494B1
Application number: BRPI0714494A
Authority: BR
Inventors: Piccinni Marie-Pierre; Lédée Nathalie; Lombroso Raoul
Original assignee: Femalon S A; Femalon S P R L; Mithra Pharmaceuticals Nv/As
Priority date: 2006-07-21
Filing date: 2007-07-18
Publication date: 2018-05-08
Also published as: HK1128760A1; DE602007006672D1; PL2214021T3; MX2009000569A; DK2049906T3; JP5052609B2; WO2008009705A1; PL2049906T3; EA200900210A1; PT2049906E; HRP20150251T1; AU2007275112B2; MY150687A; EP2857840B8; NZ574135A; ES2754707T3; CA2658665C; EP2049906A1; HRP20100382T8; EP3627156A1

Abstract

ensino e kit para a previsão de sucesso para implantação em fertilização assistida. a presente invenção diz respeito a um ensaio para determinar o potencial de implantação de uma pluarlidade de embriões cada um obtido ou a ser obtido por fertilização assistida de um oócitos de um indivíduo do sexo feminino, compreendendo medir ao níveis do fator estimulador de colônia de granulócitos (g- csf) no fluido folicular (ff) presentes no folículo do qual cada oócito é derivado, e determinar o potencial de impalntação de cada embrião do nível de ff g-csf medido. a invenção também se refere a um kit para realizar o ensaio. esta invenção também se refere a método de fertilização assistida.

Description

(54) Título: ENSAIO E KIT PARA A PREVISÃO DE SUCESSO PARA IMPLANTAÇÃO EM FERTILIZAÇÃO ASSISTIDA (51) Int.CI.: G01N 33/68 (30) Prioridade Unionista: 21/07/2006 US 60/832,094 (73) Titular(es): FEMALON S.P.R.L.

(72) Inventor(es): NATHALIE LÉDÉE; MARIE-PIERRE PICCINNI; RAOUL LOMBROSO

ENSAIO E KIT PARA A PREVISÃO DE SUCESSO PARA IMPLANTAÇÃO EM FERTILIZAÇÃO ASSISTIDA

A fertilização assistida, tal como fertilização in vitro (IVF) ou injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) tem sido utilizada em pacientes humanos com problemas de infertilidade com sucesso durante três décadas. Apesar de intensas pesquisas, isto ainda é um processo difícil e caro e é geralmente observado que tem uma baixa taxa de implantação por embrião transferido (15-20%).

Hospitais e centros privados que prestam um serviço de fertilização assistida, baseiam a sua seleção após a fertilização do oócito sobre as características do embrião assim produzido. Por exemplo, a seleção pode ser baseada na morfologia do embrião (GUERIF F et al., 2007, Hum Reprod 22 (7) : 1973) , ou sobre a produção de HLA-G solúvel pelos embriões (Fuzzi B, et al. of 2002, Eur J Immunol. fev; 32 (2) :311-5.) . Ambas estas técnicas exigem interferência no embrião.

Para aumentar o sucesso da gravidez, o número de embriões transferidos normalmente é mais de um. Na Europa, é uma prática normal transferir dois embriões para a cavidade uterina. Nos Estados Unidos, normalmente se transfere mais, geralmente três ou quatro embriões. O efeito negativo de tal política é aumentar o número de gravidezes múltiplas e as patologias subseqüentes relacionadas à obstetrícia, tais como prematuridade e principalmente baixa taxa de natalidade.

Além disso, a fertilização assistida é um procedimento caro e também pode ser psicologicamente traumática para um paciente. Os procedimentos cirúrgicos exigem coletar óvulos para fertilização assistida e em seguida fertiliza-los, adicionalmente a cirurgia requer que os óvulos fertilizados sejam implantados no útero. O destinatário deve então aguardar por um período de tempo antes que este possa ser determinado antes que possa se determinado se a gravidez ocorreu ou não. Em alguns casos, a gravidez nunca pode ser obtida apesar das repetidas tentativas, e estes casos representam um gasto considerável para a sociedade, tanto em termos financeiros como humanos.

Portanto, seria desejável fornecer um teste e kit que posa indicar o potencial da implantação de um oócito antes da fertilização, permitindo que as chances de sucesso de implantação do embrião sejam aumentadas, e que permita a indicação de baixas taxas de sucesso a ser usada para evitar o referido trauma e os custos de fertilização assistida citados acima.

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1. A curva ROC de um experimento Luminex para detectar FF G-CSF usando um Kit Luminex Biorad. A taxa positiva verdadeira (sensibilidade) é plotada em função da taxa positiva falsa (100-especificidade) para diferentes pontos de corte da concentração de FF-GCSF. Cada ponto da curva ROC representa um par de sensibilidade/ especificidade correspondente a um limiar de determinada decisão. A área sob a curva ROC é uma medida de como FF-GCSF pode se distinguir entre os dois principais grupos de diagnósticos (certeza da implantação/sem implantação).

Linha 1: A área sob a curva é 0,82, indicando que um indivíduo selecionado aleatoriamente do grupo positivo tem um teste de valor maior do que para uma escolha individual aleatória do grupo negativo em 82% do tempo. Linha 2: A área sob a curva ROC é de 0,5 representando a hipótese nula.

A figura 2. A curva ROC de um experimento Luminex para detectar FF G-CSF usando um Kit Luminex R e D. Linha 3: A área sob a curva é 0,72, indicando que um indivíduo selecionado aleatoriamente do grupo do grupo positivo tem um valor de teste maior do que para uma escolha aleatória individual do grupo negativo em 72% do tempo. Linha 4: Área sob a curva ROC é de 0,5 representando a hipótese nula.

A figura 3. 0 gráfico mostrando a variação da concentração de cada fluido folicular de uma mesma coorte de embriões obtidos a partir de vários indivíduos. Cada caixa mostra a variação dos fluidos foliculares individuais do meio em uma mesma coorte de embriões gerados.

RESUMO DA INVENÇÃO

A invenção é baseada em uma descoberta inesperada pelos inventores em que um indivíduo do sexo feminino fornece uma pluralidade de oócitos sob hiperestimulação ovariana apresentando uma variação nos níveis de diversas citocinas e fatores de crescimento presentes no fluido folicular do folículo do qual cada oócito é derivado. Além disso, os inventores descobriram que há uma forte correlação entre um alto nível de granulócitos e fator estimulador de colônias (G-CSF) presentes no fluido folicular de cada folículo do qual é derivado um oócito e um alto potencial de implantação de um embrião obtido por fertilização do dito oócito. Nunca foi demonstrado anteriormente que, para o mesmo sujeito, o fluido folicular rodeia cada oócito pode variar em composição, e que a dita composição é indicativa do sucesso de implantação do oócito fertilizados posteriormente. Esta constatação permite que uma pluralidade de embriões obtidos de um único paciente seja classificada por ordem de implantação potencial. Pela primeira vez, os pacientes apresentaram um potencial de fertilidade incerto usando indicadores em que a média marcadores de fertilidade de oócitos (por exemplo, 11-beta HSD) pode ser encontrada para ter oócitos apresentando um alto potencial de implantação contra uma média global pobre, o que oferece novas possibilidades para previamente indicar as fêmeas inférteis. Além disso, o método oferece a possibilidade de classificar cada oócito individualmente e, portanto o embrião individualmente, sem a interferência para o embrião ou oócitos.

A presente invenção diz respeito um ensaio para determinar a implantação potencial de uma pluralidade de cada embrião obtido ou a ser obtido por fertilização assistida de um oócito de um sujeito do sexo feminino, compreendendo medir os níveis de G-CSF no fluido folicular presentes no folículo do qual cada oócito é derivado, e determinar o potencial de implantação de cada embrião o nível do fluido folicular G-CSF. O oócito do folículo com altíssimo nível de G-CSF no fluido folicular dá origem a um embrião com maior potencial de implantação.

A presente invenção é um kit de ensaio que pode ser usado para prever o resultado da fertilização assistida em uma paciente do sexo feminino. A invenção também se refere a este ensaio e kit para uso em um método de tratamento de fertilização para melhorar a implantação.

Uma modalidade da invenção é um ensaio para a determinação do potencial de implantação de embriões obtidos ou a serem obtidos por fertilização assistida para um indivíduo do sexo feminino, compreendendo:

(i) medir, por uma pluralidade de oócitos recolhidos do dito indivíduo, o nível do fator estimulador de colônia de granulócitos (G-CSF) presentes no fluido folicular (FF) de um folículo de cada oócito recolhidos; e (ii) determinar os níveis de FF G-CSF medido, o potencial de implantação dos embriões obtidos ou a serem obtidos por fertilização assistida dos oócitos.

Outra modalidade da invenção é um ensaio, como descrito acima,onde os oócitos possuem altíssimos níveis de FF G-CSF tendo altíssimo potencial de implantação.

Outra modalidade da invenção é um ensaio, como descrito acima, onde cada amostra de FF é obtida a partir de uma aspiração folicular.

Outra modalidade da invenção é um ensaio, como descrito acima, onde respectivos níveis de FF G-CSF são medidos dentro de 20 horas de coleta aspirada do folículo.

Outra modalidade da invenção é um ensaio, como descrito acima, onde o nível de FF-CSF é igual ou menor do que 20,6 pg/ml ou não determina um baixo potencial de implantação.

Outra modalidade da invenção é um ensaio, como descrito acima, onde nível de FF-CSF igual ou maior do que 24,0 pg/ml determinam um elevado potencial de implantação.

Outra modalidade da invenção é um ensaio, como descrito acima, onde os respectivos níveis de FF G-CSF são medidos usando um imunoensaio.

Outra modalidade da invenção é um ensaio, como descrito acima, onde os respectivos níveis de FF G-CSF são medidos usando um ensaio competitivo ou imunométrico, tais como ensaios RIA, IRMA, ELISA, ou ELISPOT.

Outra modalidade da invenção ê um ensaio, como descrito acima, onde respectivos níveis de FF G-CSF são medidos usando um ensaio Luminex.

Outra modalidade da invenção é um ensaio, como descrito acima, onde o ensaio Luminex emprega um kit

Luminex R e D ou BioRad.

Outra modalidade da invenção ê um ensaio, como descrito acima, onde os respectivos níveis de FF G-CSF são medidos pela determinação dos níveis de FF G-CSF mRNA.

Outra modalidade da invenção é um ensaio, como descrito acima, onde os respectivos níveis de FF G-CSF são medidos por qualquer ressonância de plásmons de superfície, transferência de energia de ressonância fluorescente, transferência da energia da ressonância da bioluminescência, fluorescência quenching, fluorescência polarizada, MS, HPLC, HPLC/SM, por HPLC/MS/MS, eletroforese capilar, vareta ou eletroforese em gel de acrilamida.

Outra modalidade da invenção é um kit para uso na realização de um ensaio, como descrito acima, onde um reagente adequado para a detecção dos níveis de FF G-CSF ou

FF G-CSF mRNA.

Outra modalidade da invenção é um kit, como descrito acima, que adicionalmente compreende um conjunto de concentrações padrões de FF G-CSF.

Outra modalidade da invenção é um kit, como descrito acima, que adicionalmente compreende uma pluralidade de pontas aspiradoras para remover um oócitos e fluido folicular de um indivíduo.

Outra modalidade da invenção é um método de fertilização assistida em um indivíduo do sexo feminino compreendendo:

(i) coletar uma pluralidade de oócitos de um dito indivíduo, (ii) determinar a implantação potencial de um embrião derivados de cada oócito, de acordo com o ensaio acima descrito, (iii) fertilizar os oócitos correspondentes aos embriões com um elevado potencial de implantação, e (iv) implantar o embrião assim obtido de um indivíduo do sexo feminino.

Outra modalidade da invenção é um método de fertilização assistida de um indivíduo do sexo feminino compreendendo:

(i) coletar uma pluralidade de oócitos de um dito indivíduo, (ii) determinar a implantação potencial de um embrião derivados de cada oócito, de acordo com o ensaio acima descrito, (iii) fertilizar os oócitos para obter os embriões, e (iv) implantar os embriões com um elevado potencial de implantação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A menos que definidos de outra forma, todas as técnicas e termos científicos usados aqui têm o mesmo significado que é comumente entendido por uma pessoa versada na arte. Todas as publicações aqui mencionadas são incorporadas por referência. Todas as patentes e pedidos de patentes americanos aqui mencionados são incorporadas por referência neste documento, em sua totalidade, incluindo os desenhos.

O artigo um e uma são aqui usados para se referir a um (a) ou a mais de um (a) , ou seja, a pelo menos um dos objetos gramaticais do artigo. A título de exemplo, uma amostra significa uma amostra ou mais de uma amostra.

A recitação numérica de parâmetros inclui todas as gamas de números inteiros e, quando apropriado, frações dentro desse intervalo (por exemplo, 1 a 5 pode incluir 1, 2, 3, 4, quando se referir, por exemplo, a um número de amostras, e também pode incluir 1,5, 2, 2,75 e 3,80, quando se referir, por exemplo, as concentrações) . A recitação de pontos finais inclui também o ponto final de valores próprios (por exemplo, 1,0 a 5,0 incluem ambos 1,0 e 5,0).

Como mencionado a presente invenção se refere respeito a uma descoberta inesperada pelos inventores na qual um indivíduo do sexo feminino fornece uma pluralidade de oócitos sob hiperestimulação ovariana apresentando uma variação nos níveis de diversas citocinas e fatores de crescimento presentes no fluido folicular do folículo do qual cada oócito é derivado. Além disso, os inventores descobriram que há uma forte correlação entre um alto nível de granulócitos e fator estimulador de colônias (G-CSF) presentes no fluido folicular de cada folículo do qual um oócito é derivado e um elevado potencial de implantação de um embrião obtido por fertilização do dito oócito. Nunca foi demonstrado anteriormente que, para o mesmo sujeito, o fluido folicular rodeia cada oócito pode variar em composição, e que a dita composição é indicativa do sucesso de implantação do oócito fertilizados posteriormente. Esta constatação permite que uma pluralidade de embriões obtidos de um único paciente seja classificada por ordem de implantação potencial. Pela primeira vez, os pacientes apresentaram um potencial de fertilidade incerto usando indicadores em que a média dos marcadores de fertilidade de oócitos (por exemplo, 11-beta HSD) pode ser encontrada para ter oócitos apresentando um alto potencial de implantação contra uma média global pobre; isto oferece novas possibilidades para previamente indicar as fêmeas inférteis. Além disso, o método oferece a possibilidade de classificar cada oócito individualmente e, portanto o embrião individualmente, sem a interferência para o embrião ou oócitos.

A presente invenção, portanto, se refere a um método de ensaio e kit de ensaio que pode ser usado para prever o resultado da fertilização assistida em um paciente do sexo feminino. A invenção também se refere a tal ensaio e kit para uso em um método de tratamento de fertilização, para melhorar a implantação. Embora, nossa invenção descrita abaixo foi desenvolvida a partir de pesquisas em seres humanos do sexo feminino, será aplicável a qualquer mamífero do sexo feminino e pode ser usado para aumentar o sucesso de, por exemplo, reprodução em cativeiro de espécies ameaçadas de extinção ou programas comerciais de reprodução assistida por fecundação de gado, tal como bovinos e equinos. Preferencialmente, o indivíduo foi submetido a tratamento prévio de fertilidade (por exemplo, hiperestimulação ovariana) para aumentar o número de óvulos produzidos por ciclo mensal. A fertilização assistida, tal como usada aqui, se refere a métodos de fertilização ex vivo quando o oócito é fertilizado fora do corpo feminino, como a fertilização in vitro (IVF) ou injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI).

Uma modalidade da invenção é um ensaio para determinar o potencial de implantação de uma pluralidade de cada embriões obtidos ou a ser obter por fertilização assistida de um oócitos de um indivíduo do sexo feminino, compreendendo medir os níveis de G-CSF presente no fluído folicular no folículo do qual cada oócito é derivado, e determinar o potencial de implantação de cada embrião do nível de fluido folicular G-CSF.

Outra modalidade da presente invenção é um ensaio para determinar o potencial de implantação de embriões obtidos ou a serem obtidos por fertilização assistida em um indivíduo do sexo feminino, compreendendo:

O oócito do folículo com altíssimo nível de G-CSF em fluido folicular dá origem a um embrião com o maior potencial de implantação.

O fator estimulador de colônia granulocítica (G-CSF) é uma citocina produzida naturalmente pertencente à família do fator de crescimento hematopoiético (Clark, et al. ,

1987, Science 236 (4806): 1229). Sua principal função é descrita para agir na proliferação, diferenciação e ativação de células hematopoiéticas da linhagem neutrofílica (Mielcarek et al. , 1996., Blood 87 (2): 574,

Visani et al. , 1995, 18 (5-6) : 423) . Primariamente produzida por células hematopoiética , G-CSF é também, por não produzir células-hematopoiética , como na reprodução do trato: the human luteneized follicular granulosa cells (Salmassi A, et al, 2004, Fértil Steril, 81 Suppl 1: 786.), endometrial cells (Giacomini G, et al. , 1995, Hum Reprod 10 (12) : 3259.), decídua and placenta (Duan JS, 1990, Osaka

City Med J 36 (2): 81; Miyama M et al. 1998, Osaka City Med

J. , 44 (1) : 85) and varius fetal tissue (Calhoun et al. ,

1999. Pediatr Res 46 (3) : 333) . In the ovary, G-CSF proteins and its receptor were located (western blot e imunohistochemestry) , mainly in granulosa cells of the follicule and luteal cells (Salmassi, et al., 2004).

O nível de fluido folicular G-CSF (FF G-CSF) é preferivelmente medido dentro da coleta de óvulos do dia. Como é de conhecimento de uma pessoa versada na arte, a aspiração folicular é guiada utilizando sonografia transvaginal após anestesia local ou geral. Cada fluido folicular correspondente a um folículo ovariano visualizado através de sonografia vaginal é aspirada individualmente. A captura de cada oócito não requer qualquer outra manipulação, porque o fluido folicular, que circunda o oócito, é aspirado juntamente com o oócito. A inspeção do fluido folicular sob microscópio permite a imediata identificação da presença do oócito. Em vez de reunir os fluidos foliculares e seus respectivos oócitos, o oócito é separado no momento da coleta, assim os níveis de FF G-CSF podem ser individualmente medidos. De acordo com um aspecto da invenção, o nível de FF G-CSF é medido com 1, 2, 3, 4,

5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19, 20 horas de coleta ovocitária, dentro de um tempo qualquer entre dois dos valores acima referidos. De preferência o nível de FF G-CSF é medido dentro de 1 a 20 horas de coleta ovocitária.

O nível de FF G-CSF associado com um oócitos pode ser medido por meio qualquer análise quantitativa adequada. A medição pode ser realizada, por exemplo, utilizando um método selecionado ensaio bioquímico (por exemplo, imunoensaio na fase sólida ou líquida) , a ressonância de plásmons de superfície, transferência de energia de ressonância fluorescente, fluorescência quenching, fluorescência polarizada. Tais técnicas são bem conhecidas na arte e são descritas abaixo.

Ensaios bioquímicos geralmente se baseiam na imobilização de um componente a ser analisado, por exemplo, para uma membrana ou outro suporte sólido, e na exposição de um ligante. Após lavar o excesso de ligante, o ligante de ligação é detectado por imunoensaio, ou usando um ligante rotulado (por exemplo, ligantes rádios-rotulados, ligantes fluorescentemente, as partículas ligantes rotuladas etc.) Métodos para determinar e obter ligantes que ligam com alta afinidade para um analito em específico também estão disponíveis na arte; ver, por exemplo W089/09088 intitulado Paralog Affinity Chromatography. Um exemplo de um imunoensaio, anticorpos contra o G-CSF pode ser imobilizada em esferas magnéticas e expostas a uma amostra de fluido folicular. Ligação G-CSF pode ser detectada utilizando imunoensaios de anticorpo primário e secundário para chegar a uma concentração. Tipicamente, um imunoensaio é calibrado utilizado um conjunto de normas. Os imunoensaios de fase sólida são descritos, por exemplo, na US 4,376,110. As variações de imunoensaios no âmbito da aplicação da invenção competitiva incluem qualquer formato ou ensaio do imunométrico utilizando anticorpos anti-G-CSF, por exemplo rádio-imuno ensaio (RIA), ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), local imunossorvente ligado à enzima (ELISPOT) ou imunoensaio multiplex baseado em grânulos (Luminex) .

Os níveis FF G-CSF são medidos de preferência usando tecnologia Luminex. Luminex é um método altamente sensível para a medição simultânea dos níveis de componentes específicos em um sistema. Faz uso da fase sólida, cor (corante) microesferas codificadas que são pequenas o suficiente para comportar quase como uma solução em um líquido. Cada microesfera é revestida com um anticorpo, ou outros ligantes reagentes específicos para a detecção dos componentes (por exemplo, FF C-GSF). Os componentes da amostra são capturados e detectados nas microesferas.

Dentro de um analisador, os lasers excitam os corantes internos que identificam cada partículas da microesfera, bem como qualquer corante capturado durante o ensaio. Muitas leituras são feitas em cada conjunto de grânulos, de forma a validar os resultados. Desta forma, um ensaio multiplex sensível ê feito que tanto rápido quanto preciso. De preferência, os níveis de FF C-GSF são medidos através de kit(s) fabricado pela Biorad° ou R e D°. Em uma modalidade preferida o kit Biorad° é o kit de ensaio de imunensaio de granulado fluorescente da citocina humana, Bio-plex™ (Hercules, CA, USA,17A1 1127). Em outra modalidade preferida, os Kits R e D são LUH000, LUH279,

LUH270,	LUH271 ,	LUH278,	LUH208,	LUH214,	LUH215B,	LUH285,
LUH200,	LUH280,	LUH201 ,	LUH202,	LUH204,	LUH205,	LUH206,
LUH217,	LUH317,	LUH210,	LUH293,	LUBOOO,	LUB320,	LUB294,
LUB219,	e/ou Kit	LUB213.

Para efeitos da presente invenção, o termo anticorpos, salvo especificação contrária, inclui anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, e fragmentos de anticorpos, que conservam toda a sua atividade para um antígeno alvo. Tais fragmentos incluem Fv, F (ab') e F (ab')2 fragmentos, bem como única cadeia de anticorpos. Além disso, os anticorpos e fragmentos podem ser anticorpos humanizados, por exemplo, conforme descrito em EP-A-239400 (Winter).

Os anticorpos contra FF G-CSF podem ser anticorpos monoclonais ou policlonais. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados por tecnologia de hibridomas convencional utilizando fragmentos de proteínas ou peptídeo, como se um imunógeno. Os anticorpos policlonais também podem ser preparados por meios convencionais que incluem inocular um animal hospedeiro, por exemplo, um rato ou um coelho, com um peptídeo da invenção e recuperação soro imune.

Alternativamente, os níveis de FF G-CSF podem ser estimados através da análise dos níveis de FF G-CSF mRNA em células granulosas. As células granulosas em torno da corona radiata podem ser armazenadas na fase do decoronisação de cada oócito e são armazenadas no estabilizador RNA (por exemplo, em 80 °C) até o ensaio. As sondas para o gene FF G-CSF podem ser concebidas para uso como sondas, por exemplo, para uso em um ensaio de amplificação do ácido nucléico (PCR) e/ou hibridação. Métodos e condições para a realização uma reação de r

hibridização e PCR são conhecidos na arte, e podem ser encontrados, por exemplo, em Molecular Cloning: A

Laboratory Manual (Third Edition) (Joseph Sambrook, Peter

MacCallum, David Russell, Cold Spring Habor Laboratory

Press) ou pode ser realizado por um ensaio quantigene plex, que visa quantificar as várias moléculas de RNA alvo específicas (Panomics).

Um ensaio de ressonância de plásmons de superfície poderá, alternativamente, ser utilizado como um método quantitativo para medir o nível de G-CSF em uma amostra de fluido folicular. Um chip acoplado ao anticorpo anti-G-CSF é desafiado com um fluido folicular e a ressonância de plásmons de superfície medida. As reações de ligação são realizadas com concentrações normais para chegar aos níveis de G-CSF do G-CSF no fluido folicular.

A fluorescência por transferência de energia por ressonância (FRET) também podem ser usada para medir o nível de G-CSF em uma amostra de fluido folicular. Os anticorpos G-CSF e anti-G-CSF são rotulados com um par 20 complementar do doador e receptor de fluoróforos. Enquanto liga fortemente o G-CSF: a interação do anticorpo anti-GCSF, a fluorescência emitida após a excitação do doador de fluoróforo terá um comprimento de onda diferente daquele emitido em resposta a excitação do comprimento onda quando os anticorpos G-CSF e anti-G-CSF não estão ligados, f

fornecendo a quantificação das moléculas de ligadas versus a não ligadas pela medição da intensidade de emissões em cada comprimento de onda. As reações de ligação podem ser comparadas com um conjunto de normas para chegar ao nivel de G-CSF no fluido folicular.

A transferência da energia da ressonância da bioluminescência (BRET) também podem ser usada para medir o nivel de G-CSF em uma amostra de fluido folicular. A luz é emitida por um receptor quando está próximo do doador, ou seja, quando um G-CSF: interação complexa do anticorpo anti-G-CSF é formada. Ao comparar a interação com um conjunto de normas, o nível de G-CSF em fluido folicular é determinado.

A fluorescência quenching similarmente fornece uma medição de níveis de G-CSF. Geralmente, uma diminuição da fluorescência do anticorpo anti-G-CSF rotulado é indicativa de que o G-CSF constando o quencher tem ligação. Evidentemente, um efeito semelhante iria surgir quando um G-CSF é fluorescentemente rotulado e anticorpo anti-G-CSF que contém o quencher. Ao comparar a interação com um conjunto de normas, o nível de G-CSF em uma amostra de fluido folicular pode ser medido.

A medição da polarização de fluorescência também pode determinar o nível de G-CSF em uma amostra de fluido folicular. Os Complexos, tais como aqueles formados por G20

CSF associando com um anticorpo anti-G-CSF fluorescente, teria valores de polarização maiores do que os anticorpos anti-G-CSF rotulados não complexos. Isto forma a base para determinar os níveis de G-CSF em uma amostra de fluido folicular, cujas medições são normalmente realizadas concomitante com um conjunto de normas de G-CSF concentrações.

Outros métodos que podem ser utilizados para ensaios quantitativamente G-CSF no FF incluir espectrometria de massa (MS), cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), HPLC/MS, HPLC/MS/MS, eletroforese capilar e eletroforese em gel de acrilamida ou haste associadas com as imagens do ensaio. Tais técnicas são bem conhecidas na arte, como descrito, por exemplo, em Modern HPLC for Practicing Scientists (Dong, M, Wiley-lnterscience, June 2006), Tandem Mass Spectrometry (McLafferty F. W. John Wiley & Sons Inc, November, 1983), Mass Spectrometry for Biotechnology (Siuzdak, G., Academic Press, February 1996), Clinicai Applications of Capillary Electrophoresis (Methods in Molecular Medicine) (Palfrey S. M. , Humana Press, June 1999), Handbook of Capillary Electrophoresis, Second Edition, (Landers J. P. CRC; December 1996), HighResolution Electrophoresis and Immunofixation: Techniques and Interpretation (Keren, D. F. Hodder Arnold, January,

1994) .

Quando os níveis de FF G-CSF, foram medidos em uma pluralidade de oócitos de um único paciente, os resultados podem ser utilizados para estabelecer a relação potencial de implantação de embriões obtidos por fertilização do dito oócito isto é uma ordem de classificação. O nível de FF GCSF pode ser usado para determinar se todos, alguns ou nenhum dos oócitos após a fertilização irá se estabelecer a implantação em um indivíduo do sexo feminino submetido ao tratamento fertilização assistida. Além disso, o nível de FF G-CSF pode ser usado para determinar se todos, alguns ou nenhum dos embriões vão implantar em um indivíduo do sexo feminino submetidos ao tratamento fertilização assistida.

Em nossos estudos, medimos os níveis de FF G-CSF usando imunoensaios, particularmente, através da tecnologia Luminex da BioRad e R&D. Descobrimos que os embriões provenientes de oócitos com uma concentração de FF-CSF igual ou inferior a 20,0 pg/ml apresentam um reduzido ou nenhum sucesso no implante. Em contraste, os embriões derivados de oócitos com uma concentração de FF-CSF acima de 24 pg/ml apresentam certeza no implante.

Aqueles versados na arte irão apreciar que, embora em nossa pesquisa tenham determinado um nível baixo de limiar de FF G-CSF do qual os embriões não são implantados (e, sobretudo, que os pacientes têm melhorado significativamente a probabilidade de implantação), o valor é uma estatística medida e outras medições e limiares podem ser usados. Na pratica a invenção, é mais importante para assegurar a coerência do ensaio e, por isso, cada prático (ou equipe de fertilização assistida) será capaz de estabelecer seu próprio método de ensaio e determinar seu próprio limiar. Isto poderia ser estabelecido pela primeira a realizar um estudo histórico sobre as amostras de pacientes prévios.

Assim, o nível de FF G-CSF mencionados acima representa a medida que temos usado em nossos estudos, como um limiar adequado. No entanto, se os níveis de FF G-CSF foram a ser medido em qualquer das outras formas acima mencionadas, seria desejável conduzir, utilizando os procedimentos de rotina, um controle utilizando o nosso método de ensaio, a fim de determinar a relação entre nossos resultados e os resultados de outros métodos, para fazer comparações diretas.

De acordo com um aspecto da invenção, um embrião derivado de um oócitos onde um nível de FF G-CSF no seu folículo é igual ou inferior a 21,6 pg/ml, 21,4 pg/ml, 21,2 pg/ml, 21,0 pg/ml , 20,8 pg/ml, 20,6 pg/ml, 20,4 pg/ml,

20.2 pg/ml, 20,0 pg/ml, 19,8 pg/ml, 19,6 pg/ml, 19,4 pg/ml,

19.2 pg/ml, 19,0 pg/ml, 18,8 pg/ml, 18,6 pg/ml, 18,4 pg/ml,

18.2 pg/ml, 18,0 pg/ml 17,8 pg/ml, 17,6 pg/ml, 17,4 pg/ml,

17.2 pg/ml, 17,0 pg/ml, 16,8 pg/ml, 16,6 pg/ml, 16,4 pg/ml,

16.2 pg/ml, 16,0 pg/ml, 15,8 pg/ml, 15,6 pg/ml, 15,4 pg/ml,

15.2 pg/ml, 15,0 pg/ml ou um nível entre qualquer dos dois valores acima mencionados, é previsto por ter um baixo potencial implantação. De preferência, um nível de FF-CSF igual ou inferior a 15,0 pg/ml a 20,0 pg/ml, mais preferencialmente igual ou inferior a 19,8 a 20,6 pg/ml, e mais preferivelmente ainda inferior a 20,6 pg/ml é previsto por não ter baixo ou nenhum potencial de implantação. Os níveis dessa modalidade são considerados limiares para um método de fertilização assistida (abaixo). Um baixo nível de implantação é uma probabilidade de implantação de 10%, 9%, 8% ou menos.

De acordo com um aspecto da invenção, um embrião derivado de um oócitos onde um nível de FF G-CSF no seu folículo é igual ou inferior a 34,0 pg/ml, 33,5 pg/ml, 33,0 pg/ml, 32,5 pg/ml , 32,0 pg/ml, 31,5 pg/ml, 31,0 pg/ml,

30,5	pg/ml,	30,0	pg/ml,	29,5	pg/ml,	29,0	pg/ml,28,5 pg/ml,
28,0	pg/ml,	27,5	pg/ml,	27,0	pg/ml,	26,5	pg/ml, 26,0 pg/ml,
25,5	pg/ml,	25,0	pg/ml,	24,5	pg/ml,	24,0	pg/ml, 23,5 pg/ml,
23,0	pg/ml,	22,5	pg/ml,	22,0	pg/ml,	21,5	pg/ml, 21,0 pg/ml,
20,5	pg/ml,	20,0	pg/ml,	19,5	pg/ml,	19,0	pg/ml, 18,5 pg/ml,
18,0	pg/ml,	17,5	pg/ml,	17,0	pg/ml,	16,5	pg/ml, 16,0 pg/ml,
15,5	pg/ml,	15,0	pg/ml	ou um	qualquer nível entre dois dos

valores acima referidos, Prevê-se que têm um provável sucesso de implantação. De preferência, um nível de FF-CSF no intervalo 15,0 pg/ml a 34,0 pg/ml, mais de preferência no intervalo de 20,0 a 24,0 pg/ml é previsto para ser susceptível de ser implantado. Susceptível de ser implantado significa uma maior chance de sucesso do que sem certeza de implantação: um provável potencial de implantação significa uma probabilidade de 15% para 25%. Os níveis dessa modalidade são considerados limiares para um método de fertilização assistida (abaixo).

De acordo com um aspecto da invenção, um embrião derivado de um oócitos onde um nível de FF G-CSF no seu folículo é igual ou superior a 22,0 pg/ml, 22,1 pg/ml, 22,2 pg/ml, 22,3 pg/ml, 22,4 pg/ml, 22,5 pg/ml, 22,6 pg/ml, 22,7 pg/ml, 22,8 pg/ml, 22,9 pg/ml, 23,0 pg/ml, 23,1 pg/ml, 23,2 pg/ml, 23,3 pg/ml , 23,4 pg/ml, 23,5 pg/ml, 23,6 pg/ml,

23,7	pg/ml,	23,8	pg/ml,	23,9	pg/ml,	24,0	pg/ml,	24,1	pg/ml,
24,2	pg/ml,	24,3	pg/ml,	24,4	pg/ml,	24,5	pg/ml,	24,6	pg/ml,
24,7	pg/ml,	24,8	pg/ml,	24,9	pg/ml,	25,0	pg/ml,	25,1	pg/ml,
25,2	pg/ml,	25,3	pg/ml,	25,4	pg/ml,	25,5	pg/ml,	25,6	pg/ml,
25,7	pg/ml,	25,8	pg/ml,	25,9	pg/ml,	26,0	pg/ml,	26,1	pg/ml,
26,2	pg/ml,	26,3	pg/ml	ou um	nível	entre	qualquer dos dois

os referidos valores, está previsto para ter um elevado potencial de implantação. De preferência, um nível de FFCSF igual ou superior a 24,0 pg/ml, mais de preferência superior a 35 pg/ml é previsto para ter um elevado potencial de implantação. Os níveis dessa modalidade são considerados limiares para um método de fertilização assistida (abaixo). Um nível elevado de implante é uma probabilidade de implantação de 30%, 35%, 40%, 43%, 44% ou mais.

Se os níveis de FF G-CSF em tais pacientes são significativamente inferiores aos níveis associados com prováveis ou certas implantações em todos os oócitos coletados, em seguida, havería uma economia de tempo, dinheiro e estresse para o paciente para não comprometer a implantação. Nesses casos, será possível para o médico (ou para clinica de fertilização assistida) decidir se pretende ou não, mesmo em uma primeira tentativa de implantação. Por outro lado, se um ou mais oócitos indicam uma alta ou certeza total de implantação, estes oócitos só podem ser fertilizados e assim obter os embriões implantados, economizando dinheiro e recursos pela fertilização somente dos oócitos que provavelmente irão se estabelecer como embriões. Alternativamente, todos os oócitos podem ser fertilizados, e apenas os embriões provenientes de oócitos indicando uma alta ou completa certeza de implantação, são implantados, o que permite uma chance maior de sucesso enquanto que a indicação da implantação não está necessariamente correlacionada com as chances de fertilização.

A presente invenção aumenta significativamente a taxa de implantação, enquanto diminui o número de embriões substituídos. Permite também um especialista a se tornar mais eficiente na prevenção de gestações múltiplas e a tudo relacionado à mortalidade materna e fetal. O oócito e, portanto, o embrião com o maior potencial para pode ser implantado, permitindo assim uma única política de transferência de embriões, embora não reduza a taxa de gravidez global.

O ensaio aqui descrito também pode ser empregado em um método para assistir a fertilização de um indivíduo do sexo feminino. Uma modalidade da invenção é um método de fertilização assistida de um indivíduo do sexo feminino compreendendo:

(i) coletar uma pluralidade de oócitos de um dito indivíduo, (ii) determinar o nível de FF G-CSF no folículo de cada oócito coletado.

(iii) fertilizar os oócitos com alto nível de FF GCSF, e (iv) implantar o embrião assim obtido de um indivíduo do sexo feminino.

número de óocitos submetido a mais fertilização pode ser 1, 2, 3, 4 ou 5 ou mais. Alternativamente, 50%, 40%, 30%, 20%, ou 10% dos oócitos que têm maiores níveis percentuais de FF G-CSF são fertilizados.

(iii) fertilizar os oócitos para obter os embriões, e (iv) implantar os embriões provenientes dos oócitos tendo altos níveis de FF G-CSF.

O número de embriões implantados pode ser 1, 2, 3, 4 ou 5 ou mais. Alternativamente, 50%, 40%, 30%, 20%, ou 10% dos embriões que têm maiores níveis percentuais de FF G-CSF são implantados.

	(i)	coletar uma pluralidade de oócitos	de um dito
indivíduo,
	(ii)	determinar o nível de FF G-CSF no	folículo de
cada	oócito	coletado,
	(iii)	fertilizar os oócitos para obter os	embriões, e
	(iv)	implantar os embriões provenientes	dos oócitos
tendo	um	nível FF G-CSF nível acima de	um limiar

predeterminado.

O número de embriões implantados pode ser 1, 2, 3, 4 ou 5 ou mais. Alternativamente, 50%, 40%, 30%, 20%, ou 10% dos embriões que têm níveis percentuais de FF G-CSF mais altos são implantados.

(i) coletar uma pluralidade de oócitos de um dito indivíduo, (ii) determinar a implantação potencial de um embrião proveniente de cada oócito, de acordo com o ensaio, tal como definido anteriormente, (iii) fertilizar os oócitos correspondentes aos embriões com um elevado potencial de implantação, e (iv) implantação do embrião assim obtido de um indivíduo do sexo feminino.

(i) coletar uma pluralidade de oócitos de um dito indivíduo, (ii) determinar a implantação potencial de um embrião proveniente de cada oócito, de acordo com o ensaio, tal como definido acima, (iii) fertilizar os oócitos para obter embriões, e (iv) implantar os embriões com o maior potencial de implantação.

As modalidades descritas acima em relação ao ensaio se aplicam as modalidades correspondentes do método de fertilização assistida. Os limiares são indicados a seguir em outras regiões. Uma pessoa versada na arte compreenderá que etapas de intervenção podem estar presentes, como o congelamento após coleta dos oócitos. Ao utilizar a presente invenção será possível que clínicas de fertilização assistida aloquem recursos de forma mais eficiente, de modo que os pacientes com baixos níveis de FF G-CSF no folículo de um oócito recuperado que não são susceptíveis a engravidar pelo tratamento de fertilização assistida não são tratados.

Os kits para utilizar o ensaio da presente invenção podem ser fornecidos. Esses kits incluem pelo menos um reagente útil para a detecção de FF G-CSF. Reagentes adequados incluem anticorpos, ou outros reagentes de ligação, contra FF G-CSF opcionalmente ligados a um rótulo. Os rótulos típicos são normalmente usados em procedimento de imunoensaio, por exemplo, horse radish peroxidase. O kit pode também conter padrões, por exemplo quantias predeterminadas de FF G-CSF (por exemplo, proteínas ou RNA) podem ser marcadas com uma etiqueta detectável. O kit pode também conter pontas aspiradoras descartáveis para uso na extração dos oócitos e fluido folicular.

O kit pode ser utilizado para a medição de FF G-CSF para uso em um método de diagnóstico, prognóstico e/ou tratamento de fertilização assistida um indivíduo do sexo feminino. A invenção também fornece o uso de um reagente para a detecção de FF G-CSF para o prognóstico da probabilidade de estabelecer a gravidez por fertilização assistida em um indivíduo do sexo feminino.

Os ditos anticorpos, fragmentos e variantes, e outros reagentes de ligação adequados, que podem opcionalmente ser marcados com uma etiqueta detectável, podem ser utilizados na fabricação de um kit diagnóstico para uso no tratamento ou diagnóstico da aptidão para a fertilização assistida.

Os níveis de FF G-CSF também podem ser analisados através de análise dos níveis de FF G-CSF mRNA presentes nas amostras obtidas. Para alcançar este objetivo, FF G-CSF ou fragmentos do mesmo podem ser utilizados como uma sonda para determinar os níveis de G-CSF no fluido folicular. Alternativamente, os níveis de FF G-CSF podem ser estimados através da análise dos níveis de FF G-CSF mRNA expressos no fluido folicular ou nas células granulosas. As células granulosas em torno da corona readiate podem ser armazenadas na fase de descoronisação de cada oócito e armazenadas no estabilizador RNA (por exemplo, em 80°C) até o ensaio. Essas sondas podem também ser formuladas em kits de uma forma análoga à descrita para os anticorpos, e pode conter o controle dos ácidos nucléicos. As sondas para o

Gene FF G-CSF podem ser concebidas para utilização como sondas, por exemplo, para uso em uma amplificação de ensaio de ácidos nucléicos.

EXEMPLO

Os seguintes exemplos não limitativos ilustram determinadas modalidades da invenção

Exemplos 1 : Projeto Experimental

Pacientes

280 pacientes femininos com infertilidade incluídas no programa ICSI foram recrutadas entre janeiro de 2005 a março de 2007. A razão para a inclusão no ICSI foi predominantemente a infertilidade do sexo masculino, mas também prevê falhas de IVF previas ou baixa taxa de fertilização em IVF convencional. Nós procedemos a uma randomização, no momento de inclusão para não introduzir vieses na seleção clinica do paciente. Cada paciente foi incluído dentro de um tempo do período de estudo. Todos os pacientes foram devidamente informados, e a Institucional Review Board aprovou esta pesquisa (Comitê Consultatif de Protection des personnes Poissy-St Germain en Laye).

Pré-Treatamento

Os pacientes foram submetidos ao procedimento clássico de hiperestimulação ovariana. Foi aplicado o

protocolo	previsto pelo	seu médico. A	resposta	a
estimulação	foi controlada	por uma série	de testes	de
sangue e	avaliações ultra-sônicas para	controlar	o
crescimento	de folículos	endométrio. 0	critério para
desencadear	a ovulação foi	obtido quando	pelo menos	5

folículos atingiram 16 mm.

Os oócitos recuperados ocorreram 35 a 36 horas após o desencadeamento da ovulação. A aspiração oocitária foi realizada sob anestesia geral ou local com ultra-sonografia vaginal utilizando uma seringa individual de lOml para cada folículo no grupo estudado. Assim, adaptamos o método clássico de aspiração oocitária para individualizar o fluido folicular de cada oócito recolhidos.

Amostras de fluido folicular

A presença ou ausência de um oócitos, em cada folículo foi imediatamente avaliada e os folículos desprovidos de oócito foram descartados. No grupo estudado, amostra de fluido folicular individual, cada uma correspondendo a um oócito maduro foi coletada. O volume e o aspecto (amarelo limão, laranja ou hemático) de cada amostra de fluido folicular foram anotados. As amostras individuais do fluido folicular foram centrifugadas e a quantidade especificada de sobrenadante após proceder à anonimização de cada amostra, de acordo com um banco de dados, a fim de ocultar a análise posterior. As amostras foram inicialmente armazenadas a -20°C e, em seguida, a800C até serem analisadas. Todas as clínicas e biológicas informações foram registradas em tempo real sobre a base de dados (Medifirst).

Fertilização oócito e cultura de embriões até 2 dias

Os oócitos foram coletados e as células do cumuls e da corona retiradas com hiluronidase 80 UI (Fertipro) . Os oócitos foram injetados em uma gota de 5μ1 no meio de lavagem (JCD), com uma amostra de esperma abrandado pela meio PVP (fertopto) . A injeção de oócito foi cultivada individualmente em 40μ1 microdroplet de ISM1 (Medicult, França) , sob óleo a 37°C. O número de pró-núcleos e aspecto foi avaliado após 20 horas de acordo com os critérios Gianaroli. No dia 2, o número, a fragmentação e a regularidade de cada blastômero foram anotados. A transferência dos embriões foi agendada no dia 2.

Nós dividimos os embriões transferidos em duas categorias de análise:

1. a melhor qualidade de embriões definidos pelas células 4-5 nos dias 2, 8-9 no dia 3, e inferior a 10% da fragmentação e células regulares (embriões de alta qualidade), ou

2. quaisquer outros padrões (embriões de baixa qualidade)

Apenas, os fluidos foliculares correspondentes aos embriões transferidos foram analisados utilizando o método

Luminex.

Avaliação do potencial de implantação

Cada amostra foi relacionada a uma probabilidade de implantação, aqui descrita como a taxa de implantação. O quadro clínico de uma taxa de implantação embrionária é definido para cada amostra testada, o número de saco vitelino/número de embriões transferidos. A implantação clinica foi definida em 8 semanas de amenorréia pela visualização ultrassônica de um saco vitelino.

Existe, portanto, três categorias principais, em função do resultado:

- Sem implantação: Taxa de implantação = 0

- Certeza de implantação: O número de embriões foi substituído igual ao número de saco vitelino observado pelo ultra-som em 8 semanas de amenorréia (1 embrião substituído e única gestação, dois embriões substituído e gravidez gemelar): Taxa de Implantação = 1

- Provável implantação, que é uma probabilidade de implantação pois o número de saco vitelino é inferior ao número de embriões substituído (por exemplo: 1 fora de 2, 1 fora de 3, 2 fora de 3, sendo a taxa de implantação = 0,5,

0,33, 0,66).

Para construir a curva ROC (Curva Característica de

Recepção), só levamos em conta as duas categorias.

- Sem implantação

Certeza de implantação: O número de embriões substituído foi igual ao número de saco vitelino observado por ultra-som em 8 semanas de amenorréia (1 embrião substituído e única gestação, dois embriões substituído e gravidez gemelar)

A discriminação atingida entre sem implantação e certeza da implantação em função da concentração de G-CSF em cada amostra foi avaliada com a análise da curva ROC (MedCalc Software, Mariakerke, Bélgica). A sensibilidade, especificidade e área sob a curva (AUC) ROC foram obtidas para os três métodos de detecção. Em uma curva ROC a taxa positiva verdadeira (sensibilidade) é plotada em função da taxa positiva falsa (100-especificidade) para diferentes pontos de corte. Cada ponto da curva ROC plotado representa um par de sensibilidade/especificidade correspondente a um determinado limiar de decisão. Um teste com perfeita discriminação (sem sobreposição das duas distribuições) tem um ROC plotado que passa através do canto superior esquerdo (100% de sensibilidade, 100% de especificidade). Portanto, quanto mais perto o ROC é plotado para o canto superior esquerdo, maior a precisão total do teste (Zweig & Campbell, 1993).

Cálculo da AUC-ROC prevê o quantitativo de precisão, isto é, a capacidade de G-CSF para discriminar entre implantação e sem implantação.

No entanto, a maioria dos embriões implantados foi definida por uma probabilidade de implantação. Por exemplo, se dois embriões foram transferidos e apenas uma implantado, cada amostra é caracterizada por uma probabilidade de 50% de implantação.

Cada método foi assim definido

- Baixo limiar da implantação definida por um valor preditivo negativo de 100% da curva AUC-ROC.

Alto limiar da implantação definida pelo maior valor preditivo positivo para implantação.

Ensaios G-CSF realizados em amostras FF

Dois métodos de detecção Luminex foram sucessivamente aplicados para cada amostra de fluido folicular individualmente dos quais os embriões foram transferidos.

De janeiro de 2005 a junho de 2007

A tecnologia Luminex foi aplicada com o kit BioRad (Hércules, Ca USA, 17A11 127, Human cytokines, 27-plex kit) .

De setembro de 2005 a março de 2007 das amostras foram comuns ao Luminex BioRad prévio, e 120 novas amostras foram recolhidas.

A Luminex tecnologia foi aplicada com kit R e D (Minneapolis, MN, USA, LUHOOO, LUH279, LUH270, LUH271,

LUH278, LUH208, LUH214, LUH215B, LUH285, LUH200, LUH280,

LUH201, LUH202, LUH204, LUH205, LUH206, LUH217, LUH317,

LUH210, LUH293, LUBOOO, LUB320, LUB294, LUB219, LUB213).

Análises univariada e multivariada foram realizadas.

Um valor p abaixo de 0,05 foi considerado significativo. A 5 Tabela 1 resume a população e o número de amostras analisadas utilizando sucessivamente dois dos métodos de investigação aplicada.

Parâmetros medidos	Luminex BIORAD	Luminex R&D
Número de pacientes incluídos	71	121
Número de fluidos foliculares individuais analisados correspondentes a um embrião transferido	32	200
Taxa média de gravidez clinica	31,5%	27,3%
Taxa média de implantação	20%	18%

TABELA 1: População e do número de amostras analisadas sucessivamente utilizando dois dos métodos de investigação aplicada.

As avaliações usando os kits Luminex®' BioRad°, R e D são elaborados em exemplos 2 e 3.

Exemplo 2: Avaliação utilizando o Kit Luminex 15 fabricado pela BioRad°

132 amostras de fluidos foliculares correspondentes à subsequentemente a 132 embriões transferidos foram analisados para os níveis de algumas citocinas e quimiocinas. Em particular, as concentrações de IL-1 beta,

IL-1 Ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12,

IL-13, IL-15, IL-17, IFN alfa, TNF-alfa, G-CSF, GM-CSF,

VEGF, PDGF, FGF, IP-10, MCP-1, RANTES, Eotaxina, MIP-1 alfa, MIP-1 beta foram avaliados utilizando tecnologia Luminex, utilizando um Kit Luminex® BioRad®.

Os seguintes resultados foram obtidos:

1) LIF, IL-1 ra, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL13, G-CSF, VEGF, IP-10, MCP -1, Eotaxina e ΜΙΡ-beta foram detectados em todas as amostras de fluido folicular,

2) IL-1 beta, IL-5, IL-7, IL-17, TNF-alfa, MIP-alfa foram detectadas sem ser detectadas em nenhuma amostra do fluido folicular,

3) IL-15, GM-CSF, RANTES, PDGF, IFN-gama, IL-9, IL-2,

IL-15, FGF foram detectados, respectivamente, em 95%, 94%,

88%, 81%, 76%, 65%, 60%, 48% e 22% das amostras do fluido folicular.

G-CSF não foi relacionada à morfologia do embrião, se comparado em relação a duas categorias de embrião melhor qualidade versus as outras. Portanto, não houve correlação entre G-CSF e qualidade morfológicas do embrião (Alta qualidade versus outras qualidades de embriões transferidos)

Citocinas, fatores de crescimento e taxas de implantação

Apenas uma citocina foi associada em outras análises univariada e multivariada com o potencial do embrião correspondente ao implante, que foi o fator estimulador de granulócitos e colônia (G-CSF)

Os embriões foram classificados de acordo com as suas taxas de implantação.

Para construir AUC-ROC para G-CSF, foi levado em consideração embriões que não implantado (n= 89) e os que apresentaram implante (n=13). Certas implantações são definidas quando todos os embriões substituídos são conduzidos a um saco vitelino.

A área sob a curva ROC foi de 0,82 [0,73-0,89] e altamente significativa (p = 0,0001) (Figura 1) . Assim, GCSF está correlacionada com a taxa de implantação (r = 0,40 p <0,0001) .

Também encontramos uma diferença significativa entre os embriões com certeza de implantação e sem implantação (p = 0,0002) e entre os embriões com certeza de implantação e com provável implantação (p = 0,001) (Tabela 2)

Implantação	Número de embriões envolvidos	FF G- CSF +/erro padrão (pg/ml)	FF IL-1 ra +/- erro padrão (pg/ml)
Certeza de Implantação	13	25,3 +/- 1	764 +/- 373
Provável implantação	30	21,6 +/- 1	225 +/- 106
Sem implantação	89	20,2 +/- 0,4	148 +/- 17

TABELA 2 Correlação entre o sucesso de implantação e níveis de FF G-CSF e FF IL-1 ra medido utilizando um kit

Luminex fabricado pela BioRad.

De acordo com a curva AUC-ROC, é definido um limiar inferior e um limiar superior para G-CSF para avaliar se a concentração de G-CSF pode ser usada na avaliação de cada embrião um potencial de implantação, a fim de decidir o número de embriões que devem ser substituídos.

O limiar inferior foi definido pelo maior valor preditivo negativo de implantação. Se G-CSF é inferior a 20 pg/ml, o valor preditivo negativo é de 100% de AUC-ROC. Se G-CSF é superior a 24, o valor preditivo positivo atinge sua capacidade máxima: 40%

Se todos os embriões substituídos são avaliados de acordo com o nível de categoria definida pelo AUC-ROC de GCSF, podemos observar as diferenças posteriores da taxa de implantação (Tabela 3) .

G-CSF	Número de embriões envolvidos	Taxa média	Implantação
G-CSF Baixo	45	g%**
(abaixo de 20
pg/ml) G-CSF Médio	62	18%*
(Entre 20 a 24 pg/ml) G-CSF Alto (Acima de 24 pg/ml)	25	44 %* *
TABELA 3	: Correlação entre o sucesso	de implantação e
níveis de FF	G-CSF medido	utilizando	um kit Luminex

fabricado pela BioRad; * p = 0,003 entre a médio e baixo GCSF; ** p <0,001 entre altos e baixos G-CSF

Exemplo 3: Avaliação dos fluidos foliculares utilizando o Kit Luminex fabricados por R & D.

200 amostras de fluido folicular correspondentes a 200 embriões transferidos subsequentemente foram analisadas. As concentrações das seguintes citocinas e quimiocinas IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-1 Ra, IL-2, IL-4, IL5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IFN alfa, TNF-alfa, G-CSF, GMCSF, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, RANTES, MCP-1, VEGF, foram avaliadas utilizando tecnologia Luminex utilizando o kit feito pela R&D.

Detecção de citocinas e quimiocinas

G-CSF, IL-1 Ra, IL-6, IL-8, ΜΙΡ-beta, RANTES, MCP-1,

VEGF foram detectados em 95 a 100% das amostras do fluido folicular testadas:

- IL-4, TNF-alfa, a GM-CSF, IL-5 foram detectadas em

75% a 94% das amostras do fluido folicular testadas,

IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-10, ΜΙΡ-alfa foram detectadas em 50 a 74% das amostras do fluido folicular testadas,

IL-2, IFN-gama e IL-17 foram detectadas em menos de 50% das amostras do fluido folicular testadas.

Citocinas, fatores de crescimento e taxas de implantação

Para construir a AUC-ROC para G-CSF, foi levado em consideração que os embriões não implantados (n=146) e os certamente implantados (n=16) . A área sob a curva ROC foi de 0,72 em [0,65-0,79] e altamente significativa (p=0,0025) (figura 2).

Uma diferença significativa foi observada para o GCSF entre embriões com certeza de sucesso na implantação e sem sucesso de implantação (p = 0,01) e entre embriões com provável sucesso de implantação e com certeza de implantação (p = 0,03) (Tabela 4).

Implantação	Número de embriões envolvidos	G- CSF (pg/ml) + /erro padrão
Certeza de Implantação	16	28 +/- 2,3
Provável implantação	37	20,5 +/- 1,7
Sem implantação	146	20,7 +/- 0,9

TABELA 4: Correlação entre o sucesso de implantação e níveis de FF G-CSF medido utilizando um kit Luminex fabricado por R e D.

G-CSF foi detectada em todos os fluidos e com baixo padrão de variações de uma amostra para outra, que é uma forte exigência para identificar um biomarcador. De acordo com a curva AUC-ROC, é definido um limiar inferior e um limiar superior para G-CSF para avaliar se a concentração

G-CSF pode ser usada para prever para cada embrião um potencial de implantação, que iria ajudar na decisão do número de embriões que devem ser substituídos. O limiar inferior foi definido pelo maior valor preditivo negativo de implantação. Se G-CSF é inferior a 15 pg/ml, valor preditivo negativo foi de 100% de AUC-ROC. Se G-CSF foi superior a 34, o valor preditivo positivo atinge máximo de

27,8%.

Se todos os embriões substituídos são avaliados de acordo com o nível de categoria definida pelo AUC-ROC de G-

CSF, podemos potencialidade	observar as da implantação	diferenças (Tabela 5).	posteriores à
G-CSF	Número de embriões envolvidos	Taxa média	Implantação
G-CSF Baixo (abaixo de 15 pg/ml)	61	9%**
G-CSF Médio (Entre 15 a 34 pg/ml)	117	22%**
G-CSF Alto (Acima de 35 pg/ml)	22	43,5%**

Tabela 5: Correlação entre a implantação com sucesso e níveis de FF G-CSF medidos usando um kit Luminex fabricado pela R e D; ** p< 0,001 entre G-CSF baixo, médio e alto.

Exemplo 4: A média de G-CSF em fluidos foliculares agrupados não refletem as variações observadas nos fluidos foliculares individuais.

Entre os 15 pacientes, todos os fluidos foliculares que conduzam a um embrião, independentemente do seu resultado foram avaliados na mesma coorte. 76 amostras foram avaliadas utilizando o kit Luminex fabricado pela

BioRad.

Para cada amostra, foram avaliadas as seguintes taxas. A média G-CSF em fluido folicular agrupado, menos a concentração de G-CSF em FF (n = 76) individual.

A figura é um gráfico que mostra a variação da 10 concentração de um fluido folicular individual de uma mesma coorte de embriões obtidos de 10 indivíduos diferentes.

Cada caixa mostra a variação de dos fluidos foliculares individuais do meio em uma mesma coorte de embriões gerados. Estas observações sugerem que todos os embriões 15 gerados não são iguais em matéria de FF-GCSF e, consequentemente, no seu potencial de implantação.

1/3

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Ensaio para determinar o potencial de implantação de embriões obtidos ou a serem obtidos por fertilização assistida em um indivíduo do sexo feminino, CARACTERIZADO por compreender:

(i) medir, por uma pluralidade de oócitos recolhidos do dito indivíduo, o nível do fator estimulador de colônia de granulócitos (G-CSF) presentes no fluido folicular (FF) individualizado de um folículo de cada oócito recolhido; e (ii) determinar a partir dos níveis de FF G-CSF medido, o potencial de implantação dos embriões obtidos ou a serem obtidos por fertilização assistida dos oócitos, em que um nível de FF-CSF igual ou menor do que 20,6 pg/ml determina nenhum ou um baixo potencial de implantação e em que um nível de FF-CSF igual ou maior do que 24,0 pg/ml determina um elevado potencial de implantação.
2. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que os oócitos que possuem altíssimos níveis de FF G-CSF têm maior potencial de implantação.
3. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que cada amostra de FF é obtida a partir de uma aspiração folicular.
4. Ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3 CARACTERIZADO pelo fato de que os níveis de FF G-CSF são medidos dentro de 20 horas de coletas aspiradas do folículo.

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5 . Ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 CARACTERIZADO pelo fato de que os respectiveis níveis de FF G- CSF são medidos usando imunoensaio 6. Ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 CARACTERIZADO pelo fato de que os respectiveis níveis de FF G-CSF são medidos usando ensaio

competitivo ou imunométrico, tais como ensaios RIA, IRMA,

ELISA ou ELISPOT.
7. Ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 CARACTERIZADO pelo fato de que os respectivos níveis de FF G-CSF são medidos usando um ensaio Luminex.
8. Ensaio, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o ensaio Luminex emprega um Kit Luminex R e D ou BioRad.
9. Ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 CARACTERIZADO pelo fato de que os respectivos níveis de FF G-CSF são medidos pela determinação dos níveis de FF G-CSF mRNA.
10. Ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 CARACTERIZADO pelo fato de que os respectivos níveis de FF G-CSF são medidos por qualquer ressonância de plásmons de superfície, transferência de energia da ressonância da bioluminescência, fluorescência quenching, fluorescência polarizada, MS, HPLC, HPLC/SM por HPLC/MS/MS, eletroferese capilar, vareta ou eletroferese em gel de acrilamida.

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11. Kit para utilização na realização de ensaio de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, CARACTERIZADO por compreender pelo menos um reagente adequado para detecção dos níveis de FF G-CSF ou FF G-CSF mRNA.
12. Kit, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO por adicionalmente compreender um conjunto de conncentrações padrões de FF G-CSF.
13. Kit, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, CARACTERIZADO por adicionalmente compreender uma pluralidade de pontas aspiradoras para remover um oócito e fluido folicular de um indivíduo.

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