PT2049906E

PT2049906E - Ensaio e estojo para o prognóstico de uma implantação com sucesso na fertilização assistida

Info

Publication number: PT2049906E
Application number: PT07787688T
Authority: PT
Inventors: Nathalie Ledee; Marie-Pierre Piccinni; Raoul Lombroso
Original assignee: Mithra Pharmaceuticals Nv Sa
Priority date: 2006-07-21
Filing date: 2007-07-18
Publication date: 2010-08-02
Also published as: JP5052609B2; HK1128760A1; EP2857840B1; EP3267198B1; WO2008009705A1; CA2658665A1; EP2857840A1; ATE468538T1; ES2634527T3; HRP20100382T8; KR20140040289A; MX2009000569A; US20090312596A1; AU2007275112A1; BRPI0714494B1; PL2214021T3; EA016348B1; EP3627156A1; ES2531853T3; KR101482568B1

Description

DESCRIÇÃO

ENSAIO E ESTOJO PARA O PROGNÓSTICO DE UMA IMPLANTAÇÃO COM SUCESSO NA FERTILIZAÇÃO ASSISTIDA A fertilização assistida, tal como a fertilização in vitro (FIV) ou a injecção intracitoplásmica de esperma (IICE) têm sido utilizadas, há já três décadas, com sucesso, em pacientes humanos com problemas de infertilidade. Apesar da extensa investigação, é ainda um processo dificil e caro e observa-se geralmente uma baixa taxa de implantação por embrião transferido (15 - 20 %) .

Os hospitais e centros privados que prestam um serviço de fertilização assistida baseiam a sua selecção, depois da fertilização do oócito, nas caracteristicas dos embriões produzidos deste modo. Por exemplo, a selecção pode ter por base a morfologia do embrião (Guerif F et al., 2007, Hum

Reprod 22 (7): 1973) ou a produção de HLA-G (antigénio do leucócito humano G) solúvel por parte dos embriões (Fuzzi B, et al. , 2002, Eur J Immunol. Fev; 32 (2): 311-5). Ambas as técnicas requerem interferência com o embrião.

Para aumentar o sucesso da gravidez, transfere-se normalmente mais do que um embrião. Na Europa, a prática normal consiste em transferir dois embriões para a cavidade uterina. Nos EUA, é mais comum transferirem-se três ou quatro embriões. O efeito adverso desta política é o aumento do número de gravidezes múltiplas e as subsequentes patologias obstétricas relacionadas, tal como prematuridade e principalmente uma baixa taxa de nascimentos.

Além disso, a fertilização assistida é um processo caro e pode também ser psicologicamente traumático para a 1 paciente. São necessários processos cirúrgicos para a recolha dos óvulos para a fertilização assistida e para o seguimento da fertilização, sendo necessária mais cirurgia para implantar os óvulos fertilizados no útero. A receptora deve então esperar durante um certo período de tempo antes de se determinar se se estabeleceu ou não a gravidez. Nalguns casos, a gravidez pode nunca ser estabelecida apesar das tentativas repetidas e estes casos representam uma despesa considerável para a sociedade, tanto em termos financeiros como humanos.

Por isso, seria desejável providenciar um ensaio que pudesse indicar o potencial para a implantação de um oócito antes da fertilização, permitindo maximizar as possibilidades de sucesso do implante do embrião e dando indicações sobre as baixas taxas de sucesso a serem utilizadas para evitar os traumas e os custos mencionados antes para a fertilização assistida.

LEGENDAS DAS FIGURAS FIG. 1. Curva das COR (características operacionais da receptora) a partir de uma experiência de Luminex para detectar FEC-G (factor de estimulação de colónias de granulócitos) de FF (fluido folicular) utilizando um estojo Luminex da Biorad. A taxa positiva verdadeira (sensibilidade) é desenhada no gráfico em função da taxa positiva falsa (100-especificidade) para diferentes pontos de corte da concentração de FEC-G do FF. Cada ponto no gráfico da COR representa um par de sensibilidade/ especificidade correspondendo a um limite particular de decisão. A área sob a curva das COR é uma medida da forma como se pode distinguir bem FEC-G de FF entre dois grupos principais de diagnóstico 2 (implantação certa / sem implantação) . Linha 1: A área sob a curva é de 0,82, indicando que um indivíduo seleccionado aleatoriamente do grupo positivo tem um valor do ensaio maior do que o de um indivíduo escolhido aleatoriamente no grupo negativo em 82 % das vezes. Linha 2: A área sob a curva de COR é de 0,5 representando a hipótese nula. FIG. 2. Curva das COR a partir de uma experiência de Luminex para detectar FEC-G de FF utilizando um estojo de Luminex da R and D. Linha 3: A área sob a curva é de 0,72, indicando que um indivíduo seleccionado aleatoriamente do grupo positivo tem um valor de ensaio maior do que o de um indivíduo escolhido aleatoriamente no grupo negativo, em 72 % das vezes. Linha 4: A área sob a curva das COR é de 0,5 representando a hipótese nula. FIG. 3. Gráfico que mostra a variação ln na concentração do fluido folicular individual de um mesmo grupo de embriões obtidos de vários indivíduos. Cada caixa mostra a variação dos fluidos foliculares individuais, em relação à média, no mesmo grupo de embriões gerados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se na verificação inesperada, pelos requerentes, de que um indivíduo do género feminino que providencie uma pluralidade de oócitos, por meio da hiperestimulação dos ovários, irá exibir uma variação nos níveis de várias citocinas e de factores de crescimento presentes no fluido folicular do folículo a partir do qual derivou cada um dos oócitos Além disso, os requerentes verificaram que há uma forte correlação entre um elevado nível de factor de estimulação de colónias de 3 granulócitos (FEC-G) presente no fluido folicular do folículo do indivíduo de que deriva um oócito e um elevado potencial de implantação de um embrião obtido por fertilização do referido oócito. Nunca foi demonstrado antes que, para o mesmo indivíduo, o fluido folicular que rodeia cada oócito individual pode variar na sua composição e que a referida composição é indicativa do sucesso da implantação do oócito subsequentemente fertilizado. Esta verificação permite que uma pluralidade de embriões, obtidos de uma única paciente, seja classificada por ordem do seu potencial de implantação. Pela primeira vez, verificou-se que pacientes que exibem um potencial de fertilidade incerto, utilizando indicadores que são a média dos marcadores de fertilidade dos oócitos (por exemplo, 11-beta HSD) têm oócitos que mostram um elevado potencial de implantação contra uma baixa média global; isto oferece novas possibilidades para mulheres que antes indicavam infertilidade. Além disso, o processo oferece a possibilidade de classificar cada oócito individualmente e assim cada embrião individualmente, sem interferência com o embrião ou o oócito. A presente invenção tem por objecto um ensaio para a determinação do potencial de implantação de uma pluralidade de embriões, cada um deles obtido ou que se possa obter por fertilização assistida de um oócito de um indivíduo do género feminino, compreendendo a medição dos níveis de FEC-G no fluido folicular presente no folículo a partir do qual deriva cada um dos oócitos e determinando o potencial de implantação de cada embrião a partir do nível de FEC-G do fluido folicular presente. 0 oócito do folículo com o mais alto nível de FEC-G no fluido folicular dá origem a um embrião com o maior potencial de implantação. 4

Um enquadramento da presente invenção consiste num ensaio para a determinação, para um individuo do género feminino, do potencial de implantação dos embriões obtidos ou que se possam vir a obter por fertilização assistida compreendendo: (i) a medição, para uma variedade de oócitos recolhidos do referido indivíduo, do nível de factor de estimulação de colónias de granulócitos (FEC-G) do fluido folicular presente no fluido folicular (FF) de um folículo de cada um dos oócitos recolhido; e (ii) a determinação, a partir dos níveis medidos de FEC-G do FF, dos potenciais de implantação dos embriões obtidos ou que se possam vir a obter por fertilização assistida dos oócitos.

Outro enquadramento da presente invenção consiste num ensaio, tal como se descreveu antes, em que os oócitos com os mais elevados níveis de FEC-G de FF têm o mais elevado potencial de implantação.

Outro enquadramento da presente invenção consiste num ensaio, tal como se descreveu antes, em que se obtém cada amostra de FF a partir de um aspirado folicular.

Outro enquadramento da presente invenção consiste num ensaio, tal como se descreveu antes, em que os respectivos níveis de FEC-G de FF se medem no prazo de 20 horas a partir da recolha do aspirado folicular.

Outro enquadramento da presente invenção consiste num ensaio, tal como se descreveu antes, em que um nível de FEC de FF igual ou inferior a 20,6 pg/ml determina nenhum ou um baixo potencial de implantação. 5

Outro enquadramento da presente invenção consiste num ensaio, tal como se descreveu antes, em que um nivel de FEC de FF iqual ou maior do que 24,0 pg/ml determina um elevado potencial de implantação.

Outro enquadramento da presente invenção consiste num ensaio, tal como se descreveu antes, em que os respectivos níveis de FEC-G de FF se medem utilizando um imunoensaio.

Outro enquadramento da presente invenção consiste num ensaio, tal como se descreveu antes, em que os respectivos níveis de FEC-G de FF se medem utilizando um ensaio comparativo ou um ensaio imunométrico, tal como um ensaio por RIA, IRMA, ELISA ou ELISPOT.

Outro enquadramento da presente invenção consiste num ensaio, tal como se descreveu antes, em que os respectivos níveis de FEC-G de FF se medem utilizando um ensaio de Luminex.

Outro enquadramento da presente invenção consiste num ensaio, tal como se descreveu antes, em que o ensaio de Luminex utiliza um estojo Luminex d Biorad ou da R and D.

Outro enquadramento da presente invenção consiste num ensaio, tal como se descreveu antes, em que os respectivos níveis de FEC-G de FF se medem determinando os níveis de ARNm de FEC-G de FF.

Outro enquadramento da presente invenção consiste num ensaio, tal como se descreveu antes, em que os respectivos níveis de FEC-G de FF se medem por qualquer um dos métodos de ressonância plasmónica da superfície, transferência de 6 energia de ressonância de fluorescência, transferência de energia de ressonância de bioluminescência, fluorescência para parar a fluorescência, polarização de fluorescência, EM, CLAR, CLAR/SM, CLAR/EM/EM, electroforese de capilaridade, electroforese de gel de vara ou placa.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A menos que seja definido de outra forma, todos os termos científicos e técnicos utilizados aqui têm o mesmo significado que lhes é normalmente atribuído por um especialista na matéria.

Os artigos "um" e "uma" são utilizados aqui para referir um ou mais do que um, isto é, pelo menos um dos objectos gramaticais do artigo. A título de exemplo, "uma amostra" significa uma amostra ou mais do que uma amostra. A citação de intervalos numéricos por meio de extremos inclui todos os números inteiros e, quando apropriado, fracções incluídas dentro do intervalo (por exemplo, 1 a 5 pode incluir 1, 2, 3, 4 quando se refere, por exemplo, a um número de amostras e podem também incluir 1,5, 2, 2,75 e 3,80, quando se refere, por exemplo, a concentrações). A citação dos pontos terminais também inclui os próprios valores dos pontos das extremidades (por exemplo de 1,0 a 5,0 inclui tanto 1,0 como 5,0)

Tal como se mencionou noutra parte, a presente invenção está relacionada com a verificação inesperada, pelos requerentes, de que um indivíduo do género feminino que providencia uma pluralidade de oócitos, por meio da hiperestimulação dos ovários, irá exibir uma variação nos níveis de várias citocinas e factores de crescimento 7 presentes no fluido folicular do folículo a partir do qual derivou cada um dos oócitos. Além disso, os requerentes verificaram que há uma forte correlação entre um elevado nivel de factor de estimulação de colónias de granulócitos (FEC-G) presente no fluido folicular do folículo individual de que deriva um oócito e um elevado potencial de implantação de um embrião obtido por fertilização do referido oócito. Nunca foi demonstrado antes que, para o mesmo indivíduo, o fluido folicular que rodeia cada oócito individual pode variar na sua composição e que a referida composição é indicativa do sucesso da implantação do oócito subsequentemente fertilizado. Esta verificação permite que uma pluralidade de embriões, obtidos de um único paciente, seja classificada por ordem do seu potencial de implantação. Pela primeira vez, verificou-se que pacientes que exibem um potencial de fertilidade incerto, utilizando indicadores que são a média dos marcadores de fertilidade dos oócitos (por exemplo, 11-beta HSD) têm oócitos que mostram um elevado potencial de implantação contra uma baixa média global; isto oferece novas possibilidades para mulheres que antes indicavam infertilidade. Além disso, o processo oferece a possibilidade de classificar cada oócito individualmente e assim cada embrião é considerado individualmente, sem interferência com outro embrião ou oócito. A presente invenção tem assim por objecto um método de ensaio que pode ser utilizado para prever o resultado da fertilização assistida numa paciente do género feminino. 0 ensaio pode ser utilizado num processo de tratamento de fertilização, para melhorar a implantação. Embora a presente invenção, descrita a seguir, tenha sido desenvolvida a partir da investigação sobre implantação em paciente humanos fêmeas, será aplicável a qualquer mamífero 8 fêmea e pode ser utilizada para aumentar o sucesso, por exemplo, de programas de procriação cativa de espécies ameaçadas ou a procriação comercial por fertilização assistida de animais de quinta tal como gado bovino ou cavalos. Preferencialmente, o indivíduo que se submeteu a um pré-tratamento de infertilidade (por exemplo hiperestimulação dos ovários) para aumentar o número de óvulos produzidos por cada ciclo mensal. Fertilização assistida, tal como se utiliza aqui, refere-se a processos de fertilização ex vivo em que o oócito é fertilizado fora do corpo feminino, tal como fertilização in vitro (FIV) ou injecção intracitoplásmica de esperma (IICE).

Um dos enquadramentos da presente invenção consiste num ensaio para a determinação do potencial de implantação de uma pluralidade de embriões, cada um deles obtido ou que se possa obter por fertilização assistida de um oócito de um indivíduo fêmea, compreendendo a medição dos níveis FEC-G no fluido folicular presente no folículo a partir do qual deriva cada um dos oócitos e determinando o potencial de implantação de cada embrião a partir do nível de FEC-G do fluido folicular.

Um outro enquadramento da presente invenção consiste num ensaio para a determinação, para um indivíduo fêmea, do potencial de implantação dos embriões obtidos ou que se possam vir a obter por fertilização assistida compreendendo: (i) a medição, para uma variedade de oócitos recolhidos do referido indivíduo, do nível de factor de estimulação de colónias de granulócitos (FEC-G) do fluido folicular (FF) presente no fluido folicular de um folículo de cada um dos oócitos recolhido; e 9 (ii) a determinação, a partir dos níveis medidos de FEC-G do FF, os potenciais de implantação dos embriões obtidos ou que se possam vir a obter por fertilização assistida dos oócitos. 0 oócito do folículo com o mais alto nível de FEC-G no fluido folicular dá origem a um embrião com o maior potencial de implantação. 0 factor de estimulação da colónia de granulócitos (FEC-G) é uma citocina gerada naturalmente e que pertence à família do factor de crescimento hemopoiético (Clark, et al., 1987, Science 236 (4806): 1229). O seu principal papel descrito consiste em actuar na proliferação, na diferenciação e na activação das células hematopoiéticas da linha neutrofílica (Mielcarek et al., 1996 ., Blood 87 (2): 574, Visani et al., 1995, 18 (5—6): 423). Produzido principalmente pelas células hematopoiéticas, o FEC-G é também produzido por células não hematopoiéticas, tal como no tracto de reprodução: células humanas granulosas, foliculares, luteinizadas (Salmassi A, et al, 2004. Fértil Steril, 81 Supl 1: 786), células do endométrio (Giacomini G, et al., 1995, Hum Reprod 10 (12): 3259), decídua e placenta (Duan J.S., 1990, Osaka City Med J 36 (2) : 81; Miyama M et al., 1998, Osaka City Med J., 44 (1): 85) e vários tecidos fetais (Calhoun et al., 1999. Pediatr Res 46 (3): 333). No ovário, localizaram-se proteínas de FEC-G e os seus receptores (por "western blot" e imuno-histoquímica) principalmente em células granulosas do folículo e em células do corpo lúteo (Salmassi, et al., 2004). O nível de FEC-G do fluido folicular (FEC-G FF) mede-se preferencialmente no dia da colheita dos oócitos. Como é 10 na matéria, conhecido dos especialistas na matéria, a aspiração folicular é guiada utilizando sonografia transvaginal após anestesia local ou geral. Cada fluido folicular, correspondente a um foliculo do ovário visualizado através da sonografia transvaginal é aspirado individualmente. A captura de cada oócito não exige qualquer outra manipulação porque o fluido folicular, que rodeia o oócito, é aspirado em conjunto com o oócito. A inspecção do fluido folicular, ao microscópio, permite uma identificação imediata da presença do oócito. Em vez de se juntar os fluidos foliculares e os respectivos oócitos, o oócito é separado no momento da recolha de modo que se possam medir os níveis individuais de FEC-G FF. De acordo com um aspecto da presente invenção, mede-se o nível de FEC-G FF após 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 horas da colheita de oócitos, em qualquer momento entre dois dos valores mencionados antes. Preferencialmente, mede-se o nível de FEC-G FF entre 1 a 20 horas após a colheita do oócito. O nível de FEC-G FF associado a um oócito pode ser medido utilizando qualquer ensaio quantitativo apropriado. A medição pode ser realizada, por exemplo, utilizando um processo seleccionado entre ensaios bioquímicos (por exemplo, imuno-ensaio em fase sólida ou líquida), ressonância de plasmónio de superfície, transferência de energia de ressonância de fluorescência, percepção de fluorescência e polarização de fluorescência. Essas técnicas são bem conhecidas da técnica e estão resumidamente descritas aqui a seguir.

Os ensaios bioquímicos geralmente baseiam-se na imobilização de um componente analisado, por exemplo, numa membrana ou noutro suporte sólido e na exposição a um 11 ligando. Depois de se lavar o excesso de ligando, detecta-se o ligando ligado por imuno-ensaio ou utilizando o ligando marcado (por exemplo, ligando marcado com rádio, ligando marcado por fluorescência, ligando marcado com partículas etc.). Os métodos para determinar e obter os ligandos que se ligam com uma elevada afinidade a um analisado específico estão também disponíveis na técnica; ver por exemplo a patente W089/09088 intitulada "Cromatografia de afinidade por homologia". Num exemplo de um imuno-ensaio, podem imobilizar-se anticorpos contra FEC-G em pérolas magnéticas e expô-los a uma amostra de fluido folicular. 0 FEC-G ligado pode ser detectado utilizando imuno-ensaios de anticorpos primários e secundários para se chegar a uma concentração. Normalmente, um imuno-ensaio é avaliado utilizando um conjunto de normas. Os imuno-ensaios em fase sólida estão descritos, por exemplo na patente US 4.376.110. As variações dos imuno-ensaios, dentro do âmbito da presente invenção, incluem qualquer ensaio com um formato comparativo ou imunométrico utilizando anticorpos anti-FEC-G, por exemplo RIA (imuno-ensaio), ELISA (ensaio imuno-absorvente ligado a enzimas), ELISPOT (pontos imuno-absorventes ligados a enzimas) ou Luminex (imuno-ensaio em sanduíche multiplicadora à base de pérolas).

Os níveis de FEC-G FF medem-se, preferencialmente, utilizando a tecnologia Luminex. Luminex é um método altamente sensível para a medição simultânea dos níveis de componentes específicos num sistema. Faz uso de uma fase sólida, microesferas codificadas por corantes (pigmentos) que são suficientemente pequenas para se comportarem como uma solução num líquido. Cada microesfera é revestida com um anticorpo ou com outro reagente de ligação do ligando específico para os componentes detectados (por exemplo, FEC-G FF). Os componentes da amostra são capturados e 12 detectados nas microesferas. Dentro do analisador, os lasers excitam os corantes internos que identificam cada partícula da microesfera e também qualquer corante repórter capturado durante o ensaio. São feitas muitas leituras em cada conjunto de pérolas, para validar os resultados. Desta maneira, faz-se um ensaio de sensibilidade multiplicador que é ao mesmo tempo rápido e preciso. Preferencialmente, medem-se os niveis de FEC-G FF utilizando um estojo fabricado pela Biorad® ou pela R and D®. Num enquadramento preferido, o estojo da Biorad® é o estojo de ensaio do imuno-ensaio de pérolas fluorescentes de citocina humana, Bio-Plex™ (Hercules, CA, USA, 17A11127). Noutro enquadramento preferido, o estojo da R and D é o LUH000, LUH279, LUH270, LUH271, LUH278, LUH208, LUH214, LUH215B, LUH285, LUH200, LUH280, LUH201, LUH202, LUH204, LUH205, LUH206, LUH217, LUH317, LUH210, LUH293, LUB000, LUB320, LUB294, LUB219 e/ou o estojo LUB213.

Para os fins da presente invenção, o termo "anticorpo", a menos que seja especificado de outra forma, inclui anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e fragmentos de anticorpos completos que retêm a sua actividade de ligação a um antigénio-alvo. Esses fragmentos incluem os fragmentos Fv, F(ac') [fragmento de anticorpo'] e F(ab')2, assim como anticorpos de cadeia simples. Além disso, os anticorpos e os seus fragmentos podem ser anticorpos humanizados, como por exemplo, os que estão descritos na patente EP-A-239400 (Winter).

Os anticorpos contra FEC-G FF podem ser anticorpos monoclonais ou policlonais. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados pela tecnologia convencional dos hibridomas utilizando as suas proteínas ou os seus fragmentos de péptidos, sob a forma de um imunogénio. Os anticorpos 13 policlonais podem ser preparados por meios convencionais que compreendem a inoculação de um animal hospedeiro, por exemplo um rato ou um coelho, com um péptido da presente invenção e recuperando o soro imune.

Alternativamente, os níveis de FEC-G de FF podem ser estimados por meio da análise dos níveis do ARNm de FEC-G do FF nas células granulosas. As células granulosas à volta da coroa radiada podem ser armazenadas no estádio de descoroação de cada um dos oócitos e podem ser armazenadas no estabilizador de ARN (por exemplo, a 80 °C) até ao ensaio. As sondas para o gene de FEC-G de FF podem ser concebidas para serem utilizadas como sondas, por exemplo, num ensaio de amplificação (RCP) de ácido nucleico e/ou na hibridação. Os métodos e as condições para realizar uma RCP e as reacções de hibridação são conhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual (terceira edição) (Joseph Sambrook, Peter MacCallum, David Russell, Cold Spring Habor Laboratory Press) ou podem ser realizados por meio de um ensaio por "Quantigene Plex", que é concebido para multiplicar quantitativamente as moléculas do ARN específicas do alvo (Panomics).

Alternativamente, pode-se utilizar um ensaio de ressonância do plasmónio da superfície como um método quantitativo para medir o nível de FEC-G numa amostra de fluido folicular. Confronta-se um anticorpo anti-FEC-G ligado a um fragmento com um fluido folicular e mede-se a ressonância do plasmónio da superfície. As reacções de ligação são realizadas utilizando concentrações normalizadas para se chegar aos níveis de FEC-G do FEC-G no fluido folicular. 14

Também se pode utilizar a TERF (transferência de energia de ressonância por fluorescência) para se medir o nivel de FEC-G numa amostra de fluido folicular. 0 FEC-G e o anticorpo anti-FEC-G são marcados com um par complementar de fluoróforos dadores e receptores. Embora fortemente ligados pela interacção de FEC-G : anticorpo anti-FEC-G, a fluorescência emitida, após a excitação do fluoróforo do dador, terá um comprimento de onda diferente da emitida em resposta a esse comprimento de onda de excitação quando o FEC-G e o anticorpo anti-FEC-G não estão ligados, permitindo a quantificação das moléculas ligadas versus as não ligadas, por meio da medição da intensidade de emissão em cada um dos comprimentos de onda. As reacções de ligação podem ser comparadas com um conjunto de normas para se chegar ao nivel de FEC-G no fluido folicular.

Também se pode utilizar a TERB (transferência de energia de ressonância por bioluminescência) para se medir o nivel de FEC-G numa amostra de fluido folicular. A luz é emitida por um receptor quando estiver muito próximo do dador, isto é, quando se forma um complexo da interacção de FEC-G : anticorpo anti-FEC-G. Comparando a interacção com um conjunto de normas, determina-se o nivel de FEC-G no fluido folicular.

Do mesmo modo, a fluorescência que extingue a fluorescência providencia uma medição dos níveis de FEC-G. Geralmente, uma diminuição da fluorescência do anticorpo anti-FEC-G marcado é indicativa de que o FEC-G que comporta o extintor está ligado. Obviamente, aparecerá um efeito similar quando um FEC-G é marcado por fluorescência e o anticorpo anti-FEC-G comporta o agente extintor. Comparando a interacção com um conjunto de normas, pode-se medir o nível de FEC-G numa amostra do fluido folicular. 15 A medição da polarização da fluorescência pode também determinar o nivel de FEC-G numa amostra do fluido folicular. Os complexos, tal como os formados pela associação de FEC-G com um anticorpo anti-FEC-G, sob o ponto de vista da fluorescência, terão valores de polarização mais elevados do que o anticorpo anti-FEC-G que não esteja complexado. Isto é a base para a determinação dos niveis de FEC-G numa amostra de um fluido folicular, cujas medições se fazem normalmente por comparação com um conjunto de concentrações normalizadas de FEC-G.

Outros métodos que se podem utilizar para ensaios quantitativos de FEC-G no FF incluem espectrometria de massa (EM), cromatografia liquida de alta resolução (CLAR), CLAR/EM, CLAR/EM/EM, electroforese capilar e electroforese em gel com varas ou placas, associados à análise de imagens. Essas técnicas são bem conhecidas conforme descrito, por exemplo, em Modem HPLC for Practicing Scientists (Dong, M, Wiley-Interscience, Junho 2006), Tandem Mass Spectrometry (McLafferty F.W. John Wiley & Sons Inc, Novembro, 1983), Mass Spectrometry for Biotechnology (Siuzdak, G., Academic Press, Fevereiro 1996), Clinicai Applications of Capillary Electrophoresis (Methods in Molecular Medicine) (Palfrey S. M., Humana Press, Junho 1999), Handbook of Capillary Electrophoresis, segunda edição, (Landers J.P. CRC; Dezembro 1996), High-Resolution Electrophoresis and Immunofixation: Techniques and Interpretation (Keren, D. F. Hodder Arnold, Janeiro, 1994).

Uma vez medidos os niveis de FEC-G do FF num grande número de oócitos de um único paciente, os resultados podem ser usados para estabelecer o potencial relativo de implantação de embriões obtidos por meio da fertilização dos referidos oócitos, isto é, numa ordem de classificação. 16 0 nível de FEC-G do FF pode ser usado para determinar se todos, alguns ou nenhum dos oócitos, depois da fertilização, irão determinar a implantação, num indivíduo do género feminino, que siga um tratamento de fertilização assistida. Além disso, o nível de FEC-G do FF pode ser usado para determinar se todos, alguns ou nenhum dos embriões serão implantados num indivíduo do género feminino, que siga um tratamento de fertilização assistida.

Nos estudos dos requerentes, mediram-se os níveis de FEC-G do FF utilizando imunoensaios, em particular utilizando a tecnologia Luminex da Biorad e da R&D. Os requerentes verificaram que esses embriões derivados dos oócitos, com uma concentração de FEC do FF igual ou inferior a 20,0 pg/ml, não tiveram sucesso na implantação ou tiveram um sucesso reduzido. Pelo contrário, os embriões que derivaram de oócitos com uma concentração de FEC no FF superior a 24 pg/ml implicaram uma implantação certa.

Os especialistas nesta técnica verificarão que embora a investigação dos requerentes tenha determinado um nível "limite" de FEC-G de FF abaixo do qual os embriões não serão implantados (e acima do qual os pacientes têm uma probabilidade de implantação significativamente aumentada), o valor é uma medida estatística e podem usar-se outras medidas e limites. Na prática da presente invenção, é da máxima importância conseguir consistência do ensaio e por isso cada médico individualmente (ou cada equipa de fertilização) será capaz de estabelecer o seu próprio método de ensaio particular e determinar o seu próprio limite do nível. Pode-se estabelecê-lo realizando primeiro um estudo histórico em amostras de pacientes anteriores. 17

Assim, o nível de FEC-G do FF mencionado antes representa a medida utilizada pelo requerente nos seus estudos como um limite apropriado. Contudo, se os níveis de FEC-G do FF forem medidos por qualquer uma das outras maneiras mencionadas antes, será desejável realizar as medições utilizando processos de rotina, um controlo usando o método de ensaio dos requerentes de modo a determinar a relação entre os resultados dos requerentes e os resultados de outros métodos, de modo a fazer comparações directas.

De acordo com um dos aspectos da presente invenção, um embrião derivado de um oócito em que o nível de FEC-G no FF do seu folículo é igual ou inferior a 21,6 pg/ml, 21,4 pg/ml, 21,2 pg/ml, 21,0 pg/ml, 20,8 pg/ml, 20,6 pg/ml, 20,4 pg/ml, 20,2 pg/ml, 20,0 pg/ml, 19,8 pg/ml, 19,6 pg/ml, 19,4 pg/ml, 19,2 pg/ml, 19,0 pg/ml, 18,8 pg/ml, 18,6 pg/ml, 18,4 pg/ml, 18,2 pg/ml, 18,0 pg/ml 17,8 pg/ml, 17,6 pg/ml, 17,4 pg/ml, 17,2 pg/ml, 17,0 pg/ml, 16,8 pg/ml, 16,6 pg/ml, 16,4 pg/ml, 16,2 pg/ml, 16,0 pg/ml, 15,8 pg/ml, 15,6 pg/ml, 15,4 pg/ml, 15,2 pg/ml, 15,0 pg/ml ou um nível entre quaisquer dois valores mencionados antes, previsivelmente terá um baixo potencial de implantação. Preferencialmente, um nível de FEC no FF igual ou inferior a 15,0 pg/ml até 20,0 pg/ml, mais preferencialmente igual ou inferior a 19,8 até 20,6 pg/ml, o mais preferencialmente inferior a 20,6 pg/ml é previsível que não tenha nenhum ou que tenha um baixo potencial de implantação. Os níveis deste enquadramento são considerados como níveis limites para um processo de fertilização assistida (a seguir). Um baixo nível de implantação é uma probabilidade de implantação de 10 %, 9 %, 8 % ou menos.

De acordo com um dos aspectos da presente invenção, um embrião derivado de um oócito em que o nível de FEC-G no FF 18 do seu folículo é igual ou inferior a 34,0 pg/ml, 33,5 pg/ml, 33,0 pg/ml, 32,5 pg/ml, 32,0 pg/ml, 31,5 pg/ml, 31,0 pg/ml, 30,5 pg/ml, 30,0 pg/ml, 29,5 pg/ml, 29,0 pg/ml, 28,5 pg/ml, 28,0 pg/ml, 27,5 pg/ml, 27,0 pg/ml, 26,5 pg/ml, 26,0 pg/ml, 25,5 pg/ml, 25,0 pg/ml, 24,5 pg/ml, 24,0 pg/ml, 23,5 pg/ml, 23,0 pg/ml, 22,5 pg/ml, 22,0 pg/ml, 21,5 pg/ml, 21,0 pg/ml, 20,5 pg/ml, 20,0 pg/ml, 19,5 pg/ml, 19,0 pg/ml, 18,5 pg/ml, 18,0 pg/ml, 17,5 pg/ml, 17,0 pg/ml, 16,5 pg/ml, 16,0 pg/ml, 15,5 pg/ml, 15,0 pg/ml ou um nivel entre quaisquer dois valores mencionados antes, é previsível que tenha uma implantação com sucesso. Preferencialmente, um nível de FEC-FF no intervalo de 15,0 pg/ml até 34,0 pg/ml, mais preferencialmente no intervalo de 20,0 até 24,0 pg/ml previsivelmente é provável que seja implantado. Provável que seja implantado significa uma possibilidade maior de sucesso do que a não certeza da implantação; um potencial de implantação provável significa uma probabilidade de implantação de 15 % a 25 %. Os níveis deste enquadramento são considerados como níveis limites para um processo de fertilização assistida (a seguir).

De acordo com um dos aspectos da presente invenção, um embrião derivado de um oócito em que o nível de FEC-G no FF do seu folículo é igual ou superior a 22,0 pg/ml, 22,1 pg/ml, 22,2 pg/ml, 22,3 pg/ml, 22,4 pg/ml, 22,5 pg/ml, 22,6 pg/ml, 22,7 pg/ml, 22,8 pg/ml, 22,9 pg/ml, 23,0 pg/ml, 23,1 pg/ml, 23,2 pg/ml, 23,3 pg/ml, 23,4 pg/ml, 23,5 pg/ml, 23,6 pg/ml, 23,7 pg/ml, 23,8 pg/ml, 23,9 pg/ml, 24,0 pg/ml, 24,1 pg/ml, 24,2 pg/ml, 24,3 pg/ml, 24,4 pg/ml, 24,5 pg/ml, 24,6 pg/ml, 24,7 pg/ml, 24,8 pg/ml, 24,9 pg/ml, 25,0 pg/ml, 25,1 pg/ml, 25,2 pg/ml, 25,3 pg/ml, 25,4 pg/ml, 25,5 pg/ml, 25,6 pg/ml, 25,7 pg/ml, 25,8 pg/ml, 25,9 pg/ml, 26,0 pg/ml, 26,1 pg/ml, 26,2 pg/ml, 26,3 pg/ml ou um nível entre quaisquer dois valores mencionados antes, é previsível que tenha um 19 elevado potencial de implantação. Preferencialmente, o nível de FEC no FF igual ou superior a 24,0 pg/ml, mais preferencialmente superior a 35 pg/ml é previsível que tenha um potencial de implantação elevado. Os níveis deste enquadramento são considerados como níveis limites para um processo de fertilização assistida (a seguir). Um elevado nível de implantação é uma probabilidade de implantação de 30 %, 35 %, 40 % ou mais.

Se os níveis de FEC-G do FF nesses pacientes estiverem significativamente abaixo do nível associado com uma probabilidade ou uma certeza de implantação em todos os oócitos recolhidos, então haverá uma economia de tempo, dinheiro e stress para o paciente se não se submeter à implantação. Nesses casos, será possível para o médico (ou para a clínica de fertilização assistida) decidir se se deve ou não tentar uma primeira implantação. Por outro lado, se um ou mais dos oócitos indicar uma certeza alta ou completa de implantação, apenas esses oócitos podem ser fertilizados e os embriões assim obtidos podem ser implantados, poupando assim dinheiro e recursos fertilizando apenas os oócitos com probabilidade de se tornarem embriões estabelecidos. Alternativamente, todos os oócitos podem ser fertilizados e apenas são implantados os embriões derivados de oócitos que indicam uma certeza elevada ou completa de implantação; isto permite uma melhor possibilidade de sucesso dado que a indicação de implantação não está necessariamente correlacionada com as possibilidades de fertilização. A presente invenção aumenta significativamente a taxa de implantação ao mesmo tempo que diminui o número de embriões substituídos. Permite também a um especialista ser mais eficiente na prevenção de gravidezes múltiplas e toda 20 a morbidez do feto e da mãe que lhes estão associadas. 0 oócito e consequentemente o embrião com o potencial mais elevado pode assim ser implantado e por isso permite uma política de transferência de um único embrião embora não diminuindo a taxa global de gravidez. 0 ensaio aqui descrito pode também ser utilizado num método de fertilização assistida de um indivíduo do género feminino, compreendendo: (i) a recolha de um grande número de oócitos do referido indivíduo, (ii) a determinação do nível de FEC-G do FF no folículo de cada oócito recolhido, (iii) a fertilização dos oócitos que tenham os níveis mais elevados de FEC-G no FF e (iv) a implantação do embrião assim obtido no indivíduo do género feminino. 0 número de oócitos submetidos à fertilização pode ser de 1, 2, 3, 4 ou 5 ou mais. Alternativamente, 50 %, 40 %, 30 %, 20 % ou 10 % dos oócitos são fertilizados, referindo-se as percentagens aqueles que têm os níveis mais elevados de FEC-G do FF.

Um outro método de fertilização assistida de um indivíduo do género feminino compreende: (i) a recolha de um grande número de oócitos do referido indivíduo, (ii) a determinação do nível de FEC-G do FF no folículo de cada oócito recolhido, (iii) a fertilização dos oócitos para se obter os embriões, 21 (iv) a implantação dos embriões derivados dos oócitos que tiverem os níveis mais elevados de FEC-G do FF. 0 número de embriões implantados pode ser de 1, 2, 3, 4 ou 5 ou mais. Alternativamente, implanta-se 50 %, 40 %, 30 %, 20 % ou 10 % dos embriões, cujas percentagens têm os níveis mais elevados de FEC-G do FF.

Um outro método de fertilização assistida de um indivíduo do género feminino compreende: (i) a recolha de um grande número de oócitos do referido indivíduo, (ii) a determinação do nível de FEC-G do FF no folículo de cada oócito recolhido, (iii) a fertilização dos oócitos para se obter os embriões, (iv) a implantação dos embriões derivados dos oócitos com um nível de FEC-G do FF acima de um limite pré- determinado. 0 número de embriões implantados pode ser de 1, 2, 3, 4 ou 5 ou mais. Alternativamente, 50 %, 40 o o r 30 %, 20 % ou 10 % dos embriões sao implantados, cujas percentagens têm os níveis mais elevados de FEC-G do FF.

Um outro método de fertilização assistida de um indivíduo do género feminino compreende: (i) a recolha de um grande número de oócitos do referido indivíduo, (ii) a determinação do potencial de implantação para um embrião derivado de cada oócito de acordo com o ensaio, conforme foi definido antes, 22 (iii) a fertilização dos oócitos correspondendo aos embriões que têm um elevado potencial para implantação e (iv) a implantação do embrião assim obtido no indivíduo do género feminino.

Um outro método de fertilização assistida de um indivíduo do género feminino compreende: (i) a recolha de um grande número de oócitos do referido indivíduo, (ii) a determinação do potencial de implantação para um embrião derivado de cada oócito de acordo com o ensaio, conforme foi definido antes, (iii) a fertilização dos oócitos para se obter os embriões e (iv) a implantação dos embriões com o mais elevado potencial para implantação.

Os enquadramentos descritos antes, relativamente ao ensaio, aplicam-se ao método correspondente de fertilização assistida. Os valores limites estão indicados aqui noutro sítio. Os especialistas na matéria compreendem que podem estar presentes etapas de intervenção tal como o congelamento depois da recolha dos oócitos. Utilizando a presente invenção será possível, para clínicas de fertilização assistida, alocar recursos de uma forma mais eficiente, de modo a que as pacientes com níveis baixos de FEC-G no FF do folículo de um oócito recuperado que não tenham probabilidade de ficar grávidas por tratamento de fertilização assistida, não sejam tratadas.

Podem-se fornecer estojos para serem utilizados na realização do ensaio da presente invenção. Esses estojos incluem pelo menos um reagente útil para a detecção de FEC- 23 G no FF. Os reagentes apropriados incluem anticorpos ou outros reagentes apropriados de ligação a ligandos, contra o FEC-G do FF ligado a um marcador. Os marcadores típicos são os que se utilizam normalmente em processos de imunoensaios, por exemplo peroxidase de rábano. 0 estojo pode também conter padrões, por exemplo, quantidades pré-determinadas de FEC-G do FF (por exemplo, proteína ou ANR) que podem estar marcadas com um marcador detectável. 0 estojo pode também conter ponteiras de aspirador descartáveis para serem utilizadas na extracção dos oócitos e do fluido folicular. 0 estojo pode ser usado para a medição do FEC-G FF num processo de diagnóstico, prognóstico e/ou num tratamento de fertilização assistida de um indivíduo do género feminino. A presente invenção ainda tem por objecto a utilização de um reagente para a detecção de FEC-G do FF para o prognóstico da probabilidade de estabelecer uma gravidez por fertilização assistida num indivíduo do género feminino.

Os anticorpos, os seus fragmentos e as suas variantes mencionados antes e outros reagentes apropriados de ligação do ligando, que eventualmente podem ser marcados com um marcador detectável, podem ser usados para o fabrico de um estojo de diagnóstico para ser usado no tratamento ou no diagnóstico da adequação para a fertilização assistida.

Os níveis de FEC-G do FF podem também ser analisados por via da análise dos níveis de do ARNm do FEC-G do FF presente nas amostras obtidas. Para se conseguir isto, o FEC-G do FF ou os seus fragmentos podem ser usados como uma sonda para determinar os níveis de FEC-G no fluido folicular. Alternativamente, os níveis de FEC-G de FF podem 24 ser estimados por meio da análise dos niveis do ARNm de FEC-G do FF expresso no fluido folicular ou nas células granulosas. As células granulosas à volta da coroa radiada podem ser armazenadas no estádio de descoroação de cada um dos oócitos e podem ser armazenadas no estabilizador de ARN (por exemplo, a 80 °C) até ao ensaio. Essas sondas podem também ser formuladas em estojos de uma maneira análoga à descrita para os anticorpos e podem conter ácidos nucleicos de controlo. As sondas para o gene do FEC-G de FF podem ser concebidas para serem utilizadas como sondas, por exemplo, para serem utilizadas num ensaio de amplificação do ácido nucleico.

EXEMPLOS

Os exemplos não limitativos gue se seguem ilustram alguns enquadramentos da presente invenção.

Exemplo 1: Concepção experimental

Pacientes

Recrutaram-se 280 pacientes do género feminino que apresentavam infertilidade e incluiram-se num programa do ICSI entre Janeiro e Março de 2007. A razão para a inclusão no ICSI foi, predominantemente, a infertilidade masculina mas também prevê a falha da FIV ou uma baixa taxa de fertilização prévia na FIV convencional. Os requerentes procederam a uma escolha aleatória no momento da inclusão para não introduzir influências na selecção clinica dos pacientes. Cada paciente foi incluído, uma só vez, no período do estudo. Todos os pacientes foram completamente informados e o Institutional Review Board (Comissão de Revisão Institucional) aprovou esta investigação (Comité 25 [Comissão Poissy- St Germain en des personnes

Consultatif de Protection Consultiva da Protecção das Pessoas Laye,) .

Pré -Tratamento

As pacientes sofreram o processo clássico de hiperestimulação dos ovários. Os requerentes aplicaram o protocolo referido pelo seu médico. A resposta à estimulação foi controlada por uma série de análises de sangue e avaliação ultra-sónica para controlar os foliculos e o crescimento do endométrio. Os critérios para despertar a ovulação foram conseguidos quando pelo menos 5 foliculos atingiram 16 mm. A recuperação dos oócitos teve lugar 35 a 36 horas após o inicio da ovulação. Realizou-se a aspiração dos oócitos sob anestesia geral ou local com ultra-sonografia vaginal utilizando seringas individuais de 10 ml para cada folículo no grupo estudado. Os requerentes adaptaram o método clássico de aspiração dos oócitos de modo a individualizar o fluido folicular de cada oócito recolhido.

Amostras de fluido folicular A presença ou a ausência de um oócito em cada folículo foi imediatamente avaliada e os foliculos que não tinham oócito foram rejeitados. No grupo estudado, recolheu-se cada uma das amostras individuais de fluido folicular, correspondendo a um oócito maduro. Registou-se o volume e o aspecto (citrino, laranja ou hemático) de cada amostra de fluido folicular. As amostras individuais de fluido folicular foram centrifugadas e o sobrenadante foi dividido em alíquotas depois de se tornar cada amostra anónima, de acordo com uma base de dados, de modo a tornar cega a 26 análise subsequente. As amostras foram inicialmente armazenadas a -20 °C, depois a -80 °C até ao ensaio. Toda a informação clinica e biológica foi registada em tempo real na base de dados (Medifirst).

Fertilização do oócito e cultura do embrião até ao 2o dia

Colheram-se os oócitos e os cúmulos e as células da coroa foram removidos com hiluronidase 80 IU (Fertipro). Injectou-se o oócito numa gota de 5 μΐ de meio de lavagem (JCD) , com uma amostra de esperma bloqueada pelo meio de PVP (Fertipro). Os oócitos injectados foram postos em cultura separadamente em 40 μΐ de microgoticulas de ISM1 (Medicult, França) em óleo a 37 °C. O número de pró-núcleos e o aspecto foram avaliados 20 horas depois, de acordo com os critérios de Gianaroli. No 2o dia, registou-se o número, a fragmentação e a regularidade de cada um dos blastómeros. A transferência de embriões foi programada para o 2° dia.

Os requerentes dividiram os embriões transferidos em duas categorias para a análise: 1. Os embriões de melhor qualidade definidos por 4-5 células no dia 2, 8-9 no dia 3 e menos do que 10 % de células de fragmentação e células regulares (embriões de alta qualidade) ou 2. Quaisquer outros modelos (embriões de baixa qualidade) Só se analisaram os fluidos foliculares correspondendo aos embriões transferidos utilizando o método Luminex. 27

Avaliação do potencial de implantação

Cada amostra foi relacionada com uma probabilidade de implantação, descrita aqui como a taxa de implantação. A taxa de implantação clinica de um embrião define-se, para cada amostra ensaiada, como o número de sacos embrionários / número de embriões transferidos. A implantação clinica foi definida às 8 semanas de amenorreia por meio da visualização ultra-sónica do saco embrionário. Há por isso três categorias principais em função do resultado: - Sem implantação: Taxa de implantação = 0 - Alguma implantação: 0 número de embriões substituídos foi igual ao número de sacos embrionários observados por ultra-sons às 8 semanas de amenorreia (1 embrião substituído e uma gravidez simples, dois embriões substituídos e gravidez de gémeos): Taxa de implantação =1 - Implantação provável que representa uma probabilidade de implantação desde que o número de sacos embrionários seja inferior ao número de embriões substituídos (por exemplo, 1 em cada 2, 1 em cada 3, 2 em cada 3, então a taxa de implantação = 0,5, 0,33, 0, 66).

Para construir a curva das COR (Características operacionais do receptor), os requerentes tiveram em conta apenas duas categorias

Sem implantação:

Alguma implantação: O número de embriões substituídos foi igual ao número de sacos embrionários observados por ultra-sons às 8 semanas de amenorreia (1 embrião 28 substituído e uma gravidez simples, dois embriões substituídos e gravidez de gémeos) A discriminação atingida entre sem implantação e alguma implantação, em função da concentração do FEC-G em cada amostra foi avaliada com a análise da curva das COR (programa MedCalc, Mariakerke, Bélgica). Obteve-se a sensibilidade, a especificidade e a área sob a curva (ASC) da COR para os três métodos de detecção. Numa curva das COR, a taxa positiva verdadeira (sensibilidade) é desenhada no gráfico em função da taxa positiva falsa (especificidade 100) para diferentes pontos de corte. Cada ponto no gráfico de ROC representa um par de sensibilidade/especificidade correspondendo a um limite particular de decisão. Um ensaio com uma discriminação perfeita (sem sobreposição nas duas distribuições) tem um gráfico das COR que passa através do canto superior esquerdo (100 % de sensibilidade, 100 % de especificidade). Por isso, quanto mais próxima estiver a COR do canto superior esquerdo, maior será a precisão do ensaio (Zweig & Campbell, 1993). cálculo da ASC-COR dá o valor da precisão, i.e. a capacidade de FEC-G para discriminar entra a implantação e a não implantação.

Contudo, a maior parte dos embriões que foram implantados foram definidos por uma probabilidade de implantação. Por exemplo, se dois embriões forem transferidos e apenas um for implantado, cada amostra é caracterizada por uma probabilidade de implantação de 50 %.

Os requerentes definiram assim para cada método 29 — 0 limite inferior de implantação definido por um valor previsto negativo de 100 % a partir da curva de ASC-COR. - O limite mais elevado de implantação definido pelo valor positivo previsto mais elevado para a implantação.

Ensaios do FEC-G realizados em amostras de FF

Aplicou-se, sucessivamente, dois métodos Luminex de detecção para amostras individuais de fluido folicular das quais saíram os embriões transferidos.

De Janeiro de 2005 a Junho de 2005

Aplicou-se a tecnologia Luminex com o estojo da Biorad (Hercules, Ca, USA, 17A11127, citocinas humanas, estojo com 27 partes).

De Setembro de 2005 a Março de 2007 80 das amostras eram comuns ao anterior Luminex da Biorad e 120 eram novas amostras colhidas.

Aplicou-se a tecnologia Luminex com o estojo da R and D (Minneapolis, MN, EUA, LUH000, LUH279, LUH270, LUH271, LUH278, LUH208, LUH214, LUH215B, LUH285, LUH200, LUH280, LUH201, LUH202, LUH204, LUH205, LUH206, LUH217, LUH317, LUH210, LUH293, LUB000, LUB320, LUB294, LUB219 LUB213).

Realizou-se uma análise só com uma variável ou com várias variáveis . Um valor de P abaixo de 0, 05 foi considerado como significativo. 0 quadro 1 resume a populaçao e o número de amostras analisadas sucessivamente utilizando os dois métodos de investigação aplicada. 30

Quadro 1: População e número de amostras analisadas sucessivamente utilizando os dois métodos de investigação aplicada

Parâmetro medido Luminex da BIORAD Luminex da R&D Número de pacientes incluídos Número de fluidos foliculares individuais 71 121 analisados correspondendo a transferido um embrião 132 200 Taxa média de gravidez clínica 31,5% 27,3% Taxa média de implantação 20% 18%

As avaliações que utilizaram os estojos Luminex da Biorad® e da R and D® estão elaboradas nos exemplos 2 e 3.

Exemplo 2: Avaliação utilizando o estojo Luminex fabricado pela Biorad®

Analisaram-se 132 amostras do fluido folicular correspondendo aos 132 embriões transferidos subsequentemente, quanto aos níveis de algumas citocinas e quimiocinas. Em particular, avaliaram-se as concentrações de IL-lbeta, IL-lRa, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, alfa-IFN, alfa-FNT, FEC-G, FEC-GM, FCEV (factor de crescimento endotelial vascular), FCDP (factor de crescimento derivado de plaquetas), FCF (factor de crescimento do fibroblasto), IP-10, MCP-1, RANTES, EOTAXIN, MIP-1 alfa, MIP-1 beta utilizando a tecnologia Luminex, usando um estojo Luminex® da Biorad®.

Obtiveram-se os seguintes resultados: 31 1) Detectou-se LIF, IL-lra, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, FEC-G, FCEV, IP-10, MCP-1, eotaxina e ΜΙΡ-beta em todas as amostras de fluido folicular,

2) Não se detectou IL-1 beta, IL-5, IL-7, IL-17, FNT alfa, ΜΙΡ-alfa em nenhuma amostra de fluido folicular, 3) Detectou-se IL-15, FEC-GM, Rantes, FCDP, IFN-gama, IL- 9, IL-2, IL- -15, FCF , respectivamente, em 95 %, 94 o o r 88 %, 81 % , 76 %, 65 %, 60 %, 48 % e 22 % das amostras de fluido folicular. 0 FEC-G não estava relacionado com a morfologia do embrião, se compararmos no que se refere à qualidade dos embriões das duas melhores categorias versus outros. Por isso, não houve nenhuma correlação entre o FEC-G e a qualidade morfológica do embrião (alta qualidade versus outras qualidades de embriões transferidos)

Citocinas, factores de crescimento e taxas de implantação

Apenas uma citocina estava associada com o potencial do embrião correspondente para ser implantado, quer numa análise com uma única variável ou numa análise com várias variáveis, sendo essa citocina o factor de estimulação de colónias de granulócitos (FEC-G).

Os embriões foram classificados de acordo com as suas taxas de implantação.

Para construir as curvas ASC-COR para FEC-G, os requerentes tiveram em conta embriões que não se implantaram (n=89) e os que exibiram implantação (n=13). A implantação certa é definida quando todos os embriões substituídos levam a um saco embrionário. 32 A área sob a curva de COR foi de 0,82 [0, 73-0, 89] e foi altamente significativa (p=0,0001) (fig 1). Assim, o FEC-G está correlacionado com a taxa de implantação (r = 0,40 p < 0, 0001) .

Os requerentes também encontraram uma diferença significativa entre embriões com uma implantação certa e sem implantação (p=0,0002) e entre embriões com uma implantação certa e uma implantação provável (p=0,001) (quadro 2). QUADRO 2 Correlação entre o sucesso da implantação e os níveis de FEC-G do FF e IL-lra do FF medida utilizando o estojo Luminex fabricado pela Biorad Implantação Numero de embriões envolvidos De FEC-G do FF +/-desvio padrão (pg/ml) IL-lra. do FF +/-desvio padrão (pg/ml) Implantação certa 13 25,3 +/-1 764 +/-373 Implantação provável 30 21,6 + /- 1 225+/- 106 Sem implantação 89 20,2 +/-0,4 148+/-17 De acordo com a curva de ASC-COR, os requerentes definiram um limite inferior e um limite superior para o FEC-G para avaliar se a concentração de FEC-G pode ser utilizada para avaliar, para cada embrião, um "potencial de implantação" de modo a decidir o número de embriões que devem ser substituídos. O limite inferior foi definido pelo mais forte valor negativo preditivo de implantação. Se FEC-G é inferior a 20 pg/ml, o valor negativo preditivo é de 100 % a partir da ASC-COR. Se FEC-G é superior a 24, o valor positivo preditivo atinge o seu máximo: 40 %

Se todos os embriões substituídos são avaliados de acordo com o nível de FEC-G, podem observar-se as subsequentes diferenças das taxas de implantação (quadro 3) . 33 QUADRO 3 Correlação entre o sucesso da implantação e os níveis de FEC-G do FF medidos utilizando um estojo Luminex fabricado pela Biorad; *p=0,003 entre o valor médio e baixo de FEC-G; FEC-G (Luminex/Biorad) Número de envolvidos embriões Taxa média de implantação FEC-G baixo (abaixo de 20 pg/ml) 45 9 % FEC-G médio (entre 2 0 e 24 62 18 %* pg/ml) FEC-H alto (acima de 24 pg/ml) 25 44 %** ** p<0,001 entre FEC-G alto e baixo

Exemplo 3: Avaliação dos fluidos foliculares utilizando o estojo Luminex fabricado pela R and D

Analisaram-se 200 amostras de fluido folicular correspondendo aos subsequentes 200 embriões transferidos. As concentrações das citocinas e quimiocinas que se seguem IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-lRa, IL-2. IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IFN alfa, FNT-alfa, FEC-G, FEC-GM, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, RANTES, MCP-1, FCEV, foram avaliadas utilizando a tecnologia Luminex utilizando o estojo feito pela R&D.

Detecção de citocinas e quimiocinas

Detectou-se FEC-G, IL-1 Ra; IL-6, IL-8, MIP-beta, RANTES, MCP-1, FCEV em 95 a 100 % das amostras de fluido folicular analisadas: 34

Detectou-se IL-4, FNT-alfa, FEC-GM, IL-5 em 75 % a 94 % das amostras de fluido folicular analisadas,

Detectou-se IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-10, ΜΙΡ-alfa em 50 a 74 % das amostras de fluido folicular analisadas,

Detectou-se IL-2, IFN-gama e IL-17 em menos do que 50 % das amostras de fluido folicular analisadas.

Citocinas, quimiocinas e taxas de implantação

Para construir ASC-COR para FEC-G, os requerentes tiveram em conta embriões que não se implantaram (n=146) e os que se implantaram com certeza (n=16) A área sob a curva da COR foi a 0,72 [0,65-0, 79] e altamente significativa (p=0,0025) (FIG. 2)

Observou-se uma diferença significativa para o FEC-G entre os embriões com um certo sucesso de implantação e sem sucesso de implantação (p=0,01) e entre os embriões com um provável sucesso de implantação e um certo sucesso de implantação certa (p=0,03) (quadro 4) QUADRO 4: Correlação entre o sucesso de implantação e os níveis de FEC-G no FF medidos utilizando um estojo Luminex fabricado pela R and D.

Implantação Número de embriões envolvidos FEC-G (pg/ml) +/-desvio padrão Implantação certa 16 28 +/-2,3 Implantação provável 37 20,5 + /- 1,7 Sem implantação 146 20,7 +/-0,9

Detectou-se FEC-G em todos os fluidos e com desvios padrão baixos de uma amostra para a outra o que é um requisito forte para identificar um biomarcador. De acordo com a curva ASC-COR, os requerentes definiram um limite inferior e um limite superior para o GEC-G para avaliar se 35 a concentração de FEC-G pode ser utilizada para prever, para cada embrião, um "potencial de implantação" que ajudará na decisão sobre o número de embriões que se deve substituir. 0 limite inferior foi definido pelo mais forte valor negativo preditivo da implantação. Se FEC-G é inferior a 15 pg/ml, o valor negativo preditivo foi de 100 % a partir da ASC-COR. Se FEC-G for superior a 34, o valor positivo preditivo atinge o seu máximo de 27,8 %. Se todos os embriões substituídos forem avaliados de acordo com da categoria de nível definido pela ASC-COR de FEC-G, podem observar-se as subsequentes diferenças da potencialidade de implantação (QUADRO 5). QUADRO 5 Correlação entre o sucesso da implantação e os níveis de FEC-G do FF medidos utilizando um estojo Luminex fabricado pela R and D; ** p <0,001 entre o valor baixo, médio e alto de FEC-G;

FEC-G FEC-G baixo (abaixo de 15 pg/ml) FEC-G médio (entre 15 e 34 pg/ml) FEC-G alto (acima de 35 pg/ml) Número de embriões envolvidos 61 117 22

Taxa média deimplantação g % * * 22 %** 43,5 % **

Exemplo 4: A média do FEC-G nos fluidos foliculares aglomerados não reflecte as variações observadas nos fluidos foliculares individuais.

Entre 15 pacientes, todos os fluidos foliculares que levam a um embrião, independentemente do seu resultado, foram avaliados no mesmo grupo. Avaliaram-se 76 amostras utilizando o estojo Luminex fabricado pela Biorad.

Para cada amostra, os requerentes avaliaram a seguinte relação. A média de FEC-G nos fluidos foliculares 36 aglomerados que foi inferior à concentração de FEC-G nos FF individuais (n=76). A FIG. 3 representa um gráfico que mostra a variação na concentração de fluido folicular individual de um mesmo grupo de embriões obtidos de 10 indivíduos múltiplos. Cada caixa mostra a variação dos fluidos foliculares individuais, em relação à média, no mesmo grupo de embriões gerados. Estas observações sugerem que nem todos os embriões gerados são iguais no que respeita ao FEC-G do FF e por isso o mesmo se passa com o seu potencial de implantação.

Lisboa, 26 de Julho de 2010. 37

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Ensaio para a determinação, para um indivíduo do género feminino, do potencial de implantação de embriões obtidos ou que se possam vir a obter por fertilização assistida, caracterizado pelo facto de compreender: (i) a medição, para vários oócitos colhidos do referido indivíduo, do nível de factor de estimulação de colónias de granulócitos (FEC-G) no fluido folicular, presente no fluido folicular (FF) de um folículo de cada oócito colhido; e (ii) a determinação dos níveis de FEC-G no FF medidos, os potenciais de implantação dos embriões obtidos ou que se possam vir a obter por fertilização assistida dos oócitos.
2. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de os oócitos que têm os níveis mais elevados de FEC-G no FF, terem o mais elevado potencial de implantação.
3. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de cada amostra de FF se obter a partir do aspirado folicular.
4. Ensaio, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de os níveis respectivos de FEC-G no FF serem medidos no prazo de 20 horas após a recolha do produto folicular aspirado.
5. Ensaio, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de o nível de FEC do FF 1 igual ou a inferior a 20,6 pg/ml determinar nenhum potencial ou um baixo potencial de implantação.
6. Ensaio, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de um nivel de FEC do FF igual ou maior do que 2 4,0 pg/ml determinar um elevado potencial de implantação.
7. Ensaio, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de os niveis respectivos de FEC-G no FF serem medidos utilizando um imunoensaio.
8. Ensaio, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 7, caracterizado pelo facto de os niveis respectivos de FEC-G no FF serem medidos utilizando um ensaio comparativo ou um ensaio imunométrico, tal como um ensaio por RIA, IRMA, ELISA ou ELISPOT.
9. Ensaio, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 7, caracterizado pelo facto de os niveis respectivos de FEC-G no FF serem medidos utilizando um ensaio Luminex.
10. Ensaio, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o ensaio Luminex utilizar um estojo Luminex da Biorad ou da R and D.
11. Ensaio, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de os niveis respectivos de FEC-G no FF serem medidos por determinação dos niveis de ARNm do FEC-G do FF.
12. Ensaio, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de os niveis respectivos 2 de FEC-G no FF serem medidos por qualquer um dos métodos de ressonância plasmónica da superfície, transferência de energia de ressonância de fluorescência, transferência de energia de ressonância de bio-luminescência, fluorescência para extinguir a fluorescência, polarização da fluorescência, EM, CLAR, CLAR/SM, CLAR/EM/EM, electroforese de capilaridade, electroforese em gel com vara ou placa. Lisboa, 26 de Julho de 2010. 3