RU2735542C2

RU2735542C2 - Применение растворимого cd146 в качестве биомаркера для селекции оплодотворенного in vitro эмбриона для имплантации млекопитающему

Info

Publication number: RU2735542C2
Application number: RU2017140204A
Authority: RU
Inventors: Натали БАРДЕН; Марсель БЛО-ШАБО; Сильви БУВЬЕ; Одиль ЛАКРУА; Франсуаз ДИНЬА-ЖОРЖ; Жан-Кристоф Раймон ГРИ
Original assignee: Юниверсите Д'Экс-Марсель; Энсэрм (Энститю Насьональ Де Ля Санте Э Де Ля Решерш Медикаль); Юниверсите Де Монпелье; Сантр Оспиталье Юниверситер Де Ним; Ассистанс Пюблик Опито Де Марсель
Priority date: 2015-04-21
Filing date: 2016-04-21
Publication date: 2020-11-03
Also published as: JP6751104B2; CN107636467A; EP3286566B1; CA2983365A1; BR112017022710A2; JP2018513979A; US20180164323A1; ES2741854T3; RU2017140204A3; EP3286566A1; US10809269B2; CN107636467B; RU2017140204A; WO2016170021A1; DK3286566T3

Abstract

Группа изобретений относится к медицине, а именно к эмбриологии и иммунологии, и может быть использована для определения фертильности млекопитающего. Для этого применяют растворимый белок CD146 (sCD146), присутствующий в среде для культивирования эмбрионов в качестве биомаркера имплантации указанного эмбриона в матке млекопитающего. Группа изобретений относится к способу отбора эмбриона, полученного посредством оплодотворения in vitro (IVF), для имплантации в матку млекопитающего, а также к способу повышения вероятности беременности при оплодотворении in vitro у млекопитающего и способу стимуляции беременности у млекопитающего. Использование данной группы изобретений позволяет повысить вероятность беременности при оплодотворении in vitro у млекопитающего при определении порогового значения концентрации sСD146, составляющей 1164 пг на мл супернатанта среды для культивирования эмбрионов. 6 н. и 7 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области лечения фертильности человека. Фактически, авторы настоящего изобретения в настоящем описании идентифицируют новый биомаркер, растворимый CD146 (sCD146), который при измерении в среде для культивирования эмбрионов можно использовать для определения того, можно ли выбирать эмбрион для имплантации в матку млекопитающего, или нет. Таким образом, настоящее изобретение относится к новому инструменту и связанным с ним наборам для (предварительной) селекции эмбриона, подходящего для имплантации. Изобретение также относится к способам стимуляции беременности у человека, подвергаемого переносу эмбриона.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Несмотря на улучшение условий культивирования эмбрионов и способов переноса при оплодотворении in vitro (IVF) в течение последнего десятилетия, не достигнуто значительного улучшения коэффициентов беременности и коэффициентов родов (Kupka MS et al., Hum Reprod. 2014). Более 70% эмбрионов не могут имплантироваться. В связи с этим, для повышения вероятности беременности переносят несколько эмбрионов. Однако, перенос множества эмбрионов вызывает значительный риск многоплодной беременности, которая, как известно, вызывает повышенную заболеваемость и смертность плода и матери. Чтобы избежать этого риска, в качестве стратегии для снижения частоты многоплодных родов предлагают перенос отдельных эмбрионов (McLernon et al., BMJ. 2010; Pandian Z et al., Cochrane Database Syst Rev. 2013). К настоящему времени качество эмбрионов оценивают морфологически с использованием нескольких критериев, включая размер и симметрию клеток, количество клеток, стадию дробления, безъядерные фрагменты клеток. Однако качество эмбрионов не коррелирует строго с жизнеспособностью эмбрионов и имплантационным потенциалом. Таким образом, для лучшей оценки прогноза имплантации необходим поиск биологических маркеров имплантации, чтобы сделать возможным перенос единственного эмбриона, имеющего высокий имплантационный потенциал.

Показано, что мембранный CD146 экспрессируется эмбрионом на ранних стадиях (Wang et al., Journal of Reproduction and Contraception, 2008), и недавно авторы настоящего изобретения идентифицировали растворимый CD146 как новый фактор, регулирующий имплантацию эмбриона у беременной крысы (Kaspi et al., Angiogenesis, 2013).

CD146 (или Ag S-Endo 1/MUC 18/M-CAM) является молекулой адгезии, принадлежащей к суперсемейству иммуноглобулинов, по существу, локализующимся в эндотелиальном контакте (Bardin et al. Blood 2001). Физиологически CD146 повсеместно и конститутивно экспрессируется на эндотелии человека, где он участвует в сцеплении эндотелиального монослоя. CD146 также существует в растворимой форме, образующейся при протеолизе мембраны. Показано, что растворимый CD146 (sCD146) присутствует в супернатанте эндотелиальных клеток в культуре и в нормальной и патологической сыворотке человека (Bardin et al. FEBS Lett 1998) (Bardin et al. Thromb Haemost 2003).

Что касается акушерства, мембранный CD146 экспрессируется комплексом кумулюс-ооцит, эмбрионом до имплантации, вневорсинчатым трофобластом и эндометрием (Wang et al. J Reprod Contracept 2008). Кроме того, использование блокирующего антитела против CD146 предотвращает имплантацию эмбриона in vitro и in vivo у мышей. Антитело AA 98, блокирующее мембранный CD146, присутствующий на клетках эндометрия, предотвращает имплантацию бластоцисты (Liu et al. J Cell Physiol, 2008). При преэклампсии экспрессия CD146 значительно снижена или отсутствует в соответствии со снижением инвазивной способности этих трофобластов (Liu et al. Lab Investig J Tech Methods Pathol 2004). Что касается растворимой формы, описано снижение сывороточного sCD146 с внутриутробным возрастом в течение нормальной беременности (Kaspi et al. Angiogenesis 2013). Кроме того, авторы настоящего изобретения сообщали о повышенном sCD146 у женщин по меньшей мере с двумя необъяснимыми потерями плода по сравнению с женщинами по меньшей мере с одним живым ребенком (Pasquier et al. Thromb Haemost 2005). Они также сообщали о различных эффектах sCD146 в отношении вневорсинчатых трофобластов: i) in vitro, когда он ингибирует миграцию, пролиферацию и образование псевдокапилляров в линии клеток вневорсинчатого трофобласта, клеток HTR/Svneo, ii) в плацентарных эксплантатах ex vivo, когда он снижает инвазивный потенциал, и iii) в конечном итоге, в модели беременной крысы, когда повторные инъекции sCD146 снижают коэффициент беременности и количество эмбрионов на выводок. Плацентарные гистологические исследования плаценты этих крыс показали, что эти эффекты сопровождаются снижением миграции гликогеновых клеток, схожих с вневорсинчатыми трофобластами у женщин (Kaspi et al. Angiogenesis 2013).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения в настоящем описании демонстрируют наличие растворимого белка CD146 (sCD146) в средах для культивирования эмбрионов с помощью экспериментов с использованием ELISA и вестерн-блоттинга. Они демонстрируют, что sCD146 при измерении в среде для культивирования эмбрионов можно успешно использовать в качестве биомаркера для недопущения имплантации in utero эмбриона, ассоциированного с высоким риском неудачи имплантации, для идентификации имплантируемого эмбриона или для селекции, помимо прочего, эмбриона, ассоциированного с лучшим имплантационным потенциалом.

Таким образом, первый объект, представленный в настоящем описании, относится к применению растворимого белка CD146 (sCD146), присутствующего в среде для культивирования эмбрионов, в качестве биомаркера имплантации указанного эмбриона в матке млекопитающего.

В настоящем описании также представлен ранний и неинвазивный способ получения полезной информации об эмбрионе, полученном посредством оплодотворения in vitro (IVF), в частности, для оценки/определения имплантационного потенциала оплодотворенного in vitro эмбриона, как правило, для идентификации эмбриона с имплантационным потенциалом ("имплантируемого эмбриона") при переносе в матку млекопитающего. Такой способ, как правило, осуществляют для недопущения или, наоборот, селекции, например, предварительной селекции, эмбриона для имплантации в матку млекопитающего.

Способ по изобретению предпочтительно включает стадию in vitro введения sCD146 в среду для культивирования эмбрионов, предпочтительно, в супернатант среды для культивирования эмбрионов, и стадию сравнения дозы с пороговым значением.

В настоящем описании также представлен набор, содержащий детектируемое моноклональное антитело, связывающееся с sCD146, а также применение такого набора для идентификации среди эмбрионов, полученных посредством оплодотворения in vitro (IVF), подходящих для имплантации в матку млекопитающего, предпочтительно, для селекции эмбриона, ассоциированного с лучшим имплантационным потенциалом, или для проверки имплантационного статуса ("имплантируемости") одного эмбриона.

Также описывают способ стимуляции беременности у человека, подвергаемого переносу эмбриона, включающий стадию in vitro введения sCD146 в среду для культивирования эмбрионов и стадию сравнения дозы с пороговым значением.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к применению растворимого белка CD146 (sCD146), присутствующего в среде для культивирования эмбрионов, в качестве биомаркера имплантации указанного эмбриона в матке млекопитающего, как правило, человека.

sCD146 является инновационным инструментом, представляющим собой ранний и неинвазивный биомаркер. Благодаря настоящему изобретению селекция эмбрионов, подходящих для переноса в матку млекопитающего, больше не зависит лишь от морфологических критериев эмбриона. sCD146 можно тестировать в любой среде для культивирования эмбрионов, независимо от качества эмбриона, определяемого по Стамбульской классификации ("лучшее", "среднее" или "плохое" качество). Кроме того, селекцию можно осуществлять на очень ранних стадиях развития эмбриона и раньше, чем с использованием существующих способов. Фактически, sCD146 можно определять в среде для культивирования эмбрионов на ранней стадии развития эмбриона, как правило, уже через два для после оплодотворения яйцеклетки in vitro.

В настоящем описании представлен новый биомаркер, позволяющий успешно осуществлять перенос одного эмбриона, как правило, эмбриона, имеющего, помимо прочего, лучший потенциал имплантации в матку млекопитающего. Этот вариант можно использовать во избежание риска многоплодных беременностей и связанных с ними осложнений при IVF [классическом IVF или IVF с интрацитоплазматической инъекцией сперматозоида (ICSI-IVF)] и одновременно для значительного повышения вероятности беременности при снижении затрат, связанных с IVF.

Настоящее изобретение также относится к способу получения полезной информации об эмбрионе, полученном посредством оплодотворения in vitro (IVF), в частности, для оценки/определения имплантационного потенциала оплодотворенного in vitro эмбриона, предпочтительно, для идентификации/селекции эмбриона с имплантационным потенциалом ("имплантируемого эмбриона") при переносе в матку млекопитающего. Как правило, такой способ используют для недопущения или, наоборот, селекции, например, предварительной селекции, оплодотворенного in vitro эмбриона для имплантации в матку млекопитающего.

Способ по изобретению, предпочтительно, является неинвазивным и включает стадию in vitro введения sCD146 в среду для культивирования эмбрионов, как правило, в супернатант среды для культивирования эмбрионов, и стадию сравнения дозы с пороговым значением. Если эмбрионы подвергают предварительной селекции способом по изобретению, этот способ дополнительно может включать последующую стадию морфологической селекции, состоящей в исследовании эмбриона с использованием критериев, известных специалисту в этой области, таких как размер и симметрия клеток, количество клеток, стадия дробления, наличие безъядерных фрагментов клеток.

Среда для использования может являться любой из общепринятых сред, используемых в культивировании и переносе эмбрионов. Среда для культивирования, как правило, является искусственной средой для культивирования, как правило, содержащей глюкозу, пируват и обеспечивающие энергией компоненты, а также факторы, высвобождаемые эмбрионом, развивающимся в ней, до имплантации. Среды могут дополнительно содержать, например, аминокислоты, нуклеотиды, витамины и холестерин.

Бессывороточная среда является предпочтительной с учетом того, что необходимо устранить риск контаминации прионами или другими возбудителями инфекций.

Среду для культивирования регулярно обновляют. Среда может являться одной и той же в течение периода культивирования, или ее можно заменять в течение периода культивирования в зависимости от стадии развития.

Примером подходящей среды является GLOBAL® (Life Global), дополненная 10% сывороточным альбумином человека. Такие среды можно использовать соответствующим образом в культуре, поддерживаемой до образования бластоцист в день 5.

Среда для культивирования или супернатант среды для культивирования, подлежащий сбору, предпочтительно является таким, в котором перед сбором осуществляют, по меньшей мере, 1-дневное культивирование эмбриона.

Учитывая необходимость обеспечения эмбрионов достаточным количеством среды и удобство сбора эмбрионов из среды, указанное выше культивирование эмбрионов человека осуществляют, предпочтительно, в количестве среды, соответствующем 50 мкл-1 мл среды на эмбрион человека, и более предпочтительно - 500-800 мкл, как правило, 600 мкл среды на эмбрион человека.

Собранную среду для культивирования или супернатант культуры можно тестировать сразу или хранить в замороженном виде и размораживать перед тестированием. Также можно добавлять один или несколько фармацевтически инертных дилюентов (например, стерильную очищенную воду или водный раствор, содержащий альбумин плазмы человека, глюкозу, хлорид натрия и т.п., являющиеся соединениями, содержащимися в GLOBAL®) для повышения объема посредством разведения в объеме, с которым легче обращаться, например, 0,2 мл или 0,5 мл.

Конкретный способ, представленный в настоящем описании, является способом получения полезной информации об эмбрионе, полученном посредством оплодотворения in vitro (IVF), и, предпочтительно, определения с использованием указанной информации того, можно ли выбирать эмбрион для имплантации в матку млекопитающего. Этот способ включает стадию in vitro введения sCD146 в среду для культивирования эмбрионов и стадию сравнения дозы с пороговым значением. Наличие в среде для культивирования эмбрионов sCD146 в количестве выше порогового значения свидетельствует о высоком риске неудачи имплантации эмбриона в матку млекопитающего (ассоциировано с ним), и наличие sCD146 в количестве, равном или ниже указанного порогового значения, свидетельствует о вероятности успеха имплантации эмбриона в матку млекопитающего (ассоциировано с ней). Чем ниже концентрация sCD146, тем выше вероятность успеха имплантации эмбриона. "Пороговое значение" может варьироваться в зависимости от природы сред, используемых для культивирования, и от конкретно тестируемой части сред (супернатант или вся среда). Например, когда осуществляют введение в супернатант среды для культивирования при использовании среды Global® (Life Global), как в экспериментальном разделе, пороговое значение составляет 1164 пг на мл супернатанта.

Стадию введения, предпочтительно, осуществляют через 2-5 дней после оплодотворения яйцеклетки, предпочтительно - два дня после оплодотворения яйцеклетки, как правило, в день переноса эмбриона в матку млекопитающего.

В настоящем описании также представлен набор, как правило, набор для селекции оплодотворенного in vitro эмбриона, содержащий детектируемое антитело, связывающееся с sCD146, предпочтительно - детектируемое моноклональное антитело, связывающееся с sCD146, а также его применение для определения того, можно ли выбирать эмбрион, полученный посредством оплодотворения in vitro (IVF), для имплантации в матку млекопитающего.

Конкретный набор содержит детектируемое антитело, связывающееся с sCD146, предпочтительно - детектируемое моноклональное антитело, связывающееся с sCD146, необязательно, вместе с подходящим субстратом, позволяющим определять указанное детектируемое антитело при связывании с sCD146 в среде для культивирования эмбрионов, предпочтительно, детектируемое (моноклональное) антитело, селективно связывающееся с растворимой формой CD146 и не связывающееся с мембраносвязанной формой CD146. Набор, необязательно, дополнительно содержит фармацевтически инертный дилюент, в котором отсутствует sCD146, для использования для получения контроля или по меньшей мере один раствор, содержащий известную концентрацию sCD146, предпочтительно, несколько растворов (например, 2, 3, 4, 5 или 6 растворов), имеющих различную известную концентрацию sCD146, вместе с калибровочной кривой (как правило, от 0 пг/мл до 10000 пг/мл). Как правило, набор также содержит один или несколько контейнеров, наполненных одним или несколькими веществами (антителом, дилюентом и растворами), представленными в настоящем описании. К таким контейнерам можно добавлять маркировку с инструкциями по использованию веществ в соответствии с описанными способами.

Антитело, связывающееся с sCD146, может являться синтетическим, моноклональным или поликлональным, и его можно получать хорошо известными в этой области способами.

Моноклональное антитело, связывающееся с sCD146, предпочтительно, выбрано из клона COM 3D9, клона COM 2F6, клона COM 5G6, клона COM 7A4 и клона F4-35H7 (S-endo 1) от BioCytex, и, предпочтительно, является клоном COM 7A4.

Способы получения таких антител известны в этой области (см., например, Despoix N, Walzer T, Jouve N, Blot-Chabaud M, Bardin N, Paul P, Lyonnet L, Vivier E, Dignat-George F, Vély F. Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation. Eur J Immunol. 2008;38: 2855-64).

Детектируемое моноклональное антитело, связывающееся с sCD146, из набора, предпочтительно, находится в концентрированной лекарственной форме для детекции низкой концентрации sCD146 в среде для культивирования эмбрионов или супернатанте. Таким образом, предпочтительно, используют концентрированное антитело. В предпочтительном варианте осуществления концентрированное антитело позволяет определять sCD146 в супернатанте среды для культивирования эмбрионов, содержащей не более 100 нг/мл, предпочтительно - не более 50 нг/мл, даже более предпочтительно - не более 10 нг/мл sCD146.

Определение наличия, а также измерение количества sCD146, предпочтительно, осуществляют посредством иммунологического анализа с помощью одностадийного способа, где среду для культивирования или супернатант культуры приводят в непосредственный контакт с подходящим антигеном, или способа с предварительной обработкой биологического образца. Иммунологический анализ можно осуществлять способами, хорошо известными в этой области: в твердой фазе или гомогенной фазе, за одну или две стадии, конкурентным способом и т.д.

Более предпочтительно, указанный иммунологический анализ выбран из группы, состоящей из ELISA, FEIA, вестерн-блоттинга, дот-блота, анализа с использованием частиц, анализа антигенов и радиоиммунологического анализа.

При ELISA антиген необходимо иммобилизовать на твердой поверхности, а затем комплексировать с антителом, связанным с ферментом. Определение осуществляют посредством анализа активности конъюгированного фермента посредством инкубации с субстратом для получения окрашенного продукта.

При FEIA окрашенный продукт является флуоресцентным.

При радиоиммунологическом анализе конечный продукт является радиоактивным.

Определение белка с использованием дот-блота схоже с вестерн-блоттингом в том, что оба способа позволяют идентифицировать и анализировать интересующие белки. Методология дот-блота отличается от общепринятых способов вестерн-блоттинга отсутствием разделения образцов белков с использованием электрофореза. Вместо этого белки в образце наносят пятнами на мембрану и гибридизуют с антителом-зондом.

Можно осуществлять полуколичественные измерения с помощью каждого из описанных ранее способов с использованием, например, нормальных контролей для нормализации значения, а затем устанавливать соотношение, или с использованием положительного контроля в качестве калибратора (выраженного в условных единицах).

Определение можно осуществлять на твердой подложке, например, микропланшете, на который нанесен антиген, соответствующий sCD146, подлежащий детекции и количественному анализу, или твердых частицах, пробирках и т.д.

Антитела, распознающие sCD146, применимые по настоящему изобретению, предпочтительно, метят одной или несколькими метками (маркерами детекции), делающими возможной их идентификацию, последующее наблюдение, детекцию и/или измерение. Маркеры детекции можно выбирать, например, из флуорофора, магнитной частицы, антигенного эпитопа, субстрата конкретного фермента, связывающего домена конкретного лиганда и любой другой молекулы или вещества, которое можно определять или количественно анализировать. Антитела, применимые по настоящему изобретению, также могут являться анти-антителами, используемыми для идентификации, последующего наблюдения, детекции и/или измерения антител, распознающих sCD146.

Фармацевтически инертный дилюент, в котором отсутствует sCD146, можно выбирать, например, из стерильной очищенной воды или водного раствора, содержащего альбумин плазмы человека, глюкозу, хлорид натрия и т.п., такого как среда GLOBAL®.

Также описывают способ стимуляции беременности (т.е. повышения долю успешных попыток достижения беременности) у млекопитающего, как правило, человека, подвергаемого переносу эмбрионов, включающий стадию in vitro i) введения sCD146 в среду для культивирования эмбрионов, стадию ii) сравнения дозы с пороговым значением по изобретению и принятия решения о том, что эмбрион подходит для имплантации в матку млекопитающего, если доза равна или ниже порогового значения, и что эмбрион не подходит для имплантации в матку млекопитающего, если доза выше порогового значения, необязательно, стадию iii) исследования эмбриона с использованием морфологических критериев, и стадию iv) переноса эмбриона в матку млекопитающего, если доза равна или ниже порогового значения, и если указанный эмбрион удовлетворяет морфологическим критериям имплантации.

В описанном выше способе необязательную стадию iii) можно осуществлять первой, т.е. до стадий i) и ii). В другом варианте осуществления стадию iii) можно осуществлять между стадиями i) и ii).

Дополнительные аспекты и преимущества настоящего изобретения будут описаны в следующих примерах, представленных в иллюстративных целях, а не для ограничения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1: Распределение пар и эмбрионов.

Фигура 2: Анализ вестерн-блоттинга положительных или отрицательных супернатантов эмбрионов при ELISA.

Отрицательный контроль соответствует среде для культивирования без какого-либо эмбриона. MW, молекулярная масса.

Фигура 3: Концентрации sCD146 в день 2 (D2) и день 3 (D3).

Фигура 4: Концентрации sCD146 в соответствии с качеством эмбрионов по Стамбульской классификации (тип 1 "лучшее качество" n=90, тип 2 "среднее качество" n=190, или тип 3 "плохое качество" n=43).

Фигура 5: Сравнение концентраций sCD146 в случае имплантированных (да, n=63) и неимплантированных эмбрионов (нет, n=172)

Фигура 6: Процентная доля беременностей в соответствии со значением sCD146.

ПРИМЕРЫ

Материал и способы

Пациенты

С марта 2013 года по декабрь 2014 года авторы настоящего изобретения осуществляли исходное пилотное исследование на 162 парах, подвергаемых оплодотворению in vitro (IVF) в репродуктивном отделении медицинского центра в La Conception University Hospital (AP-HM, Marseille, France). Все пары информировали о том, что среды для культивирования эмбрионов от перенесенных эмбрионов будут хранить после переноса эмбрионов в исследовательских целях, и выбирали или не выбирали пары для участия в этом исследовании. Каждую пару включали только один раз. Авторы настоящего изобретения исключали из этого исследования доноров яйцеклеток и спермы и пациентов, не давших согласие. Экспертный совет организации одобрил это исследование.

Протокол лечения

Пациентов подвергали контролируемой гиперстимуляции яичников с использованием трех типов протоколов: длинный протокол с использованием агонистов (введение агонистов GnRH в фазу лютеинизации предыдущего цикла); короткий протокол с использованием агонистов (ежедневное введение агонистов GnRH с первого дня цикла IVF) и протокол с использованием антагонистов (ежедневное введение антагонистов GnRH со дня 5). Рекомбинантный FSH и/или hMG использовали в дозах в диапазоне от 150 МЕ/день до 450 МЕ/день в соответствии с индексом массы тела, возрастом женщины, исходное значение FSH в день 3 и количество антральных фолликулов. Пациентов обычным образом подвергали серийным трансвагинальным ультразвуковым исследованиям, начиная со дня 8 после гиперстимуляции яичников и измерений эстрадиола (E2) сыворотки. Затем дозу гонадотропина корректировали в зависимости от ответа яичников. Стимуляцию овуляции осуществляли посредством подкожной инъекции рекомбинантного хорионического гонадотропина человека (hCG, Ovitrelle®, Merck-Serono, 250 мкг), когда по меньшей мере три фолликула достигали среднего диаметра 16 мм. Извлечение яйцеклеток осуществляли под местной или общей анестезией с использованием пункции фолликулов под контролем трансвагинального ультразвукового исследования через 35 часов после введения hCG. Затем осуществляли общепринятую IVF или интраплазматическую инъекцию сперматозоида (ICSI-IVF) в соответствии с параметрами спермы с использованием общепринятых протоколов. После оценки нормального оплодотворения (т.е. оплодотворенных яйцеклеток с двумя пронуклеусами, так называемых диплоидных зигот) через 18 часов после осеменения зиготы культивировали по отдельности при 37°C, 5% CO₂ в 500 мкл среды Global® (Life Global) до дня переноса эмбриона (день 2 или 3).

Их наблюдали в течение 26 часов после осеменения для детекции раннего дробления клеток. Полученные диплоидные эмбрионы классифицировали перед переносом в соответствии с системой оценки на основе размера и симметрии клеток, фрагментации и количества клеток в соответствии со Стамбульским соглашением (Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology. Hum Reprod. 2011).

Затем эмбрионы классифицировали на 3 подгруппы:

1/ Эмбрионы лучшего качества с клетками равного размера, без фрагментации или с фрагментацией менее 10%, 4 клетки в день 2 или 8 клеток в день 3; предпочтительно, выбирают для переноса, если возможно;

2/ Эмбрионы среднего качества со стадие-специфичным размером клеток для большинства клеток и/или фрагментацией 10-25%, и/или 3 или 5 клеток в день 2 или 6, 7 или 9 клеток в день3;

3/ Эмбрион плохого качества без стадие-специфичного размера клеток и/или с тяжелой фрагментацией (>25%) и/или 2 клетки или >5 клеток в день 2 или <6 или >9 клеток в день 3.

Затем после переноса эмбрионов фазу лютеинизации поддерживали ежедневным введением таблеток прогестерона (дюфастона R 30 мг/день; Abbot Products SAS, France). Беременности диагностировали по положительным уровням hCG в сыворотке (>100 МЕ/л) через 14 дней после переноса эмбрионов. Клинические беременности подтверждали по наличию плодного яйца с сердечной активностью при вагинальном ультразвуковом исследовании в течение 5-ой недели после переноса эмбрионов.

Супернатанты эмбрионов

Среды для культивирования (500 мкл Global®) каждого перенесенного эмбриона собирали по отдельности после переноса эмбриона, замораживали и хранили при -20°C до количественного анализа sCD146. Сбор супернатантов эмбрионов является неинвазивным способом; не было изменений в лечении пациентов. Исходы IVF сравнивали ретроспективно у всех пациентов.

Подтверждение наличия sCD146 в супернатантах эмбрионов

CD146 уже идентифицирован на ранних стадиях развития эмбриона человека (Wang H et al. J of Reprod and contracept 2008), и известно, что растворимая форма может образовываться посредством отщепления мембранного CD146 в трофобластных клетках (Kaspi et al., Angiogenesis, 2013). Однако в литературе нет данных о секреции sCD146 эмбрионами. Авторы настоящего изобретения осуществляли анализ вестерн-блоттинга на супернатанте эмбриона для подтверждения высвобождения sCD146 эмбрионами. 50 мкл супернатантов эмбрионов или отрицательного контроля (среды для культивирования) подвергали электрофорезу в 4-12% полиакриламидном геле NuPage в присутствие SDS (In Vitrogen/Life Technologies, USA) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Использовали маркеры молекулярной массы Bio-Rad. Перенос осуществляли при постоянном напряжении (60 В) в течение 2 часов. После блокирования с использованием 4% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в TBS-Tween 20 (TBST) растворимый CD146 определяли с помощью антитела против CD146 человека (7A4 1 мг/л, Biocytex, Marseille, France), разведенного в TBST (1:3000), в течение ночи при 4°C при постоянном встряхивании. Растворимый CD146 выявляли с помощью HRP-конъюгированного антитела козы против мыши (Thermo Scientific, USA). Мембраны сканировали и анализировали с помощью G:Box-Chemi-XT4 (Syngene, Cambridge, United Kingdom).

Анализ растворимого CD146

sCD146 анализировали с использованием модификации коммерческого анализа ELISA (CY-QUANT sCD146, Biocytex, Marseille). Планшеты покрывали специфическими моноклональными F(ab')₂-фрагментами мыши против CD146 человека. 200 мкл супернатанта эмбрионов, разведенного 1:2, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации планшеты промывали пять раз с последующей инкубацией со специфическим HRP-конъюгированным моноклональным антителом против CD146 (7A4-HRP, 1 мг/мл, Biocytex, Marseille, France) с разведением 1:1000 в конкретном дилюенте в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем промывали пять раз. 200 мкл субстрата тетраметилбензидина (TMB) инкубировали в течение приблизительно 20 минут при комнатной температуре. Затем колориметрическую реакцию останавливали посредством добавления 100 мкл раствора кислоты. Интенсивность сигнала напрямую связана с концентрацией sCD146, исходно содержащегося в образце. Модификация способа основана на замене дилюента из набора средой для культивирования эмбрионов, хранящейся в тех же условиях, что и супернатанты эмбрионов (37°C, 5% CO₂ в течение 48 часов), но без эмбриона, для улучшения повторяемости и воспроизводимости теста. Также использовали концентрированное антитело против CD146 из-за более низкой концентрации sCD146 в супернатантах, чем в сыворотке или плазме человека (7A4-HRP, 1 мг/мл, Biocytex, Marseille, France). Концентрации sCD146 в супернатантах эмбриона определяли с использованием калибровочной кривой растворов с известными концентрациями sCD146 (от 0 пг/мл до 10 000 пг/мл). По причине низкого объема супернатантов и рекомендаций производителя (200 мкл/лунку) каждый образец разводили (1:2) и анализировали in simplicate. Измеряли оптическую плотность (OD) при 450 нм.

Осуществляли анализ повторяемости и воспроизводимости, и данные свидетельствуют о 4% повторяемости и 11% воспроизводимости (n=3 тестов).

Собранные данные

Авторы настоящего изобретения собирали клинические и биологические данные пациентов (возраст, индекс массы тела, курение, показания и длительность бесплодия, оценка резерва яичников, оцениваемого по количеству антральных фолликулов и исходным уровням FSH и AMH в плазме в день 3), характеристики цикла IVF и лабораторные данные (количество предшествующих попыток IVF-ICSI, общепринятое IVF или ICSI-IVF, протокол стимуляции яичников, уровни эстрадиола и толщина эндометрия в день стимуляции, количество извлеченных яйцеклеток, зрелых яйцеклеток, диплоидных полученных эмбрионов и перенесенных эмбрионов, морфологическая оценка перенесенных эмбрионов, день переноса) и частота клинических беременностей.

Статистический анализ

Данные выражали как среднее значение ± SEM. Статистический анализ осуществляли с использованием программного обеспечения Prism (GraphPad Software Inc., San Diego). Значимые различия определяли с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни и критерия хи-квадрат. Т.к. авторы настоящего изобретения осуществляли несколько наблюдений для каждой пары, используют обобщенное оценочное уравнение (GEE) с многомерной моделью. Значимым считали значение p<0,05.

Результаты

Исходные характеристики пациентов

Исследуемая группа включала 162 пар, подвергаемых IVF или IVF-ICSI по меньшей мере с одним перенесенным эмбрионом. Из 1505 извлеченных яйцеклеток 1199 были зрелыми (81,2%), 907 эмбрионов было получено, и 738 были диплоидными. В день 2/3 переносили всего 261 эмбрион, при этом использовали один или два эмбриона на перенос. Из 162 исследуемых пар полные данные (результат теста sCD146 и тестирования беременности) были доступны для 138, при этом перенесено 225 эмбрионов (фигура 1). Эти 225 перенесенных эмбрионов привели к 36 клиническим беременностям и включали 33 одноплодных беременности и 3 пары близнецов. 146 эмбрионов переносили в день 2 (D2, 64,8%), 79 в день 3 (D3, 35,2%). Среднее количество перенесенных эмбрионов составляло 1,63 (SD+/-0,53), и коэффициент имплантации составлял 17,3% (39 плодных яиц/225 эмбрионов). Общий коэффициент беременности составлял 26,1% (36 беременностей/138 пациентов).

Среди этих 225 эмбрионов в соответствии со Стамбульской классификацией 64 являлись "эмбрионами лучшего качества", 125 - "среднего качества" и 36 - "плохого качества". Их коэффициент имплантации составлял 26,2%, 12% и 5,7% соответственно.

Средний возраст женщин составлял 33,1 лет (SD+/-4,51). Контролируемую гиперстимуляцию яичников осуществляли с использованием короткого протокола с использованием агонистов в 21,5% попыток, длинного протокола с использованием агонистов в 58,3% и протокола с использованием антагонистов в 20,2%. 54% пар подвергали классическому оплодотворению in vitro, 46% - интраплазматической инъекции сперматозоида. Средняя последовательность циклов IVF составляла 1,77 (SD+/-0,97). Показания к IVF относились к мужскому бесплодию в случае 58% пар или женскому бесплодию в случае 42%. Характеристики исследуемой выборки (статус резерва яичников, клинические факторы прогноза имплантации, ответ яичников и состояние эндометрия в день стимуляции) приведены в таблице 1.

Таблица 1: Характеристики исследуемой выборки. Данные выражены как среднее значение +/- SD и медиана [IQR]

AMH (нг/мл)	3,68+/-3,38 2,50 [1,36-5,20]
FSH (МЕ/л)	7,452+/-2,601 7 [5,6-8,78]
Количество антральных фолликулов	14,32+/-8,74 12 [9-18]
Индекс массы тела (BMI, Кг/м^-²)	23,81+/-4,98 22,5 [20,7-26,0]
Курильщики (%)	28
Анамнез предыдущей беременности (%)	35
Эстрадиол (пг/мл) в день стимуляции	2394+/-1392 2216 [1495-2946]
Толщина эндометрия в день стимуляции Хорошее качество: 8-13 мм (%) Плохое качество: <8 мм или >13 мм (%)	74 24

Наличие sCD146 в супернатантах эмбрионов со дня 2

Для подтверждения наличия sCD146 в супернатантах эмбрионов авторы настоящего изобретения осуществляли анализ вестерн-блоттинга на 4 образцах с различными концентрациями sCD146: первый анализировали с помощью ELISA при 220 пг/мл (перенос в день 2), второй - при 1178 пг/мл (перенос в день 2), третий - при 3850 пг/мл (перенос в день 3), и последний являлся отрицательным контролем и соответствовал дилюенту, используемому для анализа (среда для культивирования эмбрионов, хранящаяся в тех же условиях, что и супернатанты эмбрионов, но без эмбрионов) (фигура 2).

Т.к. эмбрионы переносили в день 2 (D2) или 3 (D3), авторы настоящего изобретения сравнивали концентрации sCD146 в супернатантах эмбрионов в D2 и D3. Не наблюдали значимых различий в концентрациях sCD146 между переносами в D2 или D3 (p=0,36) (фигура 3).

Концентрации sCD146 и качество эмбрионов

На практике, селекция эмбрионов основана на их морфологии. Это является единственным критерием, оцениваемым перед переносом. Таким образом, авторы настоящего изобретения исследовали взаимосвязь между концентрациями sCD146 и качеством эмбриона по Стамбульской классификации. Они обнаруживали, что концентрации sCD146 не коррелируют с типом эмбриона (фигура 4).

Концентрации sCD146 и исход IVF

Авторы настоящего изобретения обнаруживали значимые различия в концентрациях sCD146 между эмбрионами с имплантацией и без нее (фигура 5) с низкой концентрацией, ассоциированной с высоким имплантационным потенциалом. После поэтапного многофакторного анализа с поправкой на ковариаты по Стамбульской классификации и коэффициенту FSH они подтверждали значимую ассоциацию между низкой концентрацией sCD146 и имплантацией с использованием теста Вальда при 5,39 (p=0,02).

Эффективность sCD146 в качестве биомаркера имплантации

Вычисленная кривая ROC свидетельствовала о том, что оптимальной чувствительности (71%) и специфичности (60%) для имплантации достигали при 1164 пг/мл sCD146. При этом пороговом значении процентная доля беременностей повышалась приблизительно на 40%. Это повышение сохранялось в трех группах по Стамбульской классификации с повышением 20, 30 и 77% в случае лучшего, среднего и плохого качества эмбрионов, соответственно (фигура 6).

Выводы

Во избежание риска многоплодных беременностей и связанных с ними осложнений необходимо выбирать только один эмбрион для переноса. Таким образом, прогнозирование имплантационного потенциала эмбрионов представляет собой первостепенную задачу при IVF. В этом эксперименте авторы настоящего изобретения показали, что sCD146 представляет собой ранний, неинвазивный и инновационный биомаркер для селекции эмбриона с наиболее высоким имплантационным потенциалом. Примечательно, что этот биомаркер не зависит от морфологических критериев по Стамбульской классификации, которые до сих пор были единственными критериями селекции. Таким образом, селекция эмбрионов с использованием sCD146 может быть полезной независимо от группы эмбрионов. Таким образом, sCD146 представляет собой первый биомаркер для селекции эмбрионов, улучшающий точность селекции эмбрионов и эффективность IVF.

Ранний, точный и правильный выбор эмбриона с лучшим потенциалом для имплантации, фактически, является лучшей стратегией повышения вероятности беременности при IVF.

Авторы настоящего изобретения в своих экспериментах доказали наличие sCD146 в супернатантах эмбрионов посредством ELISA и вестерн-блоттинга. Это определение можно осуществлять в супернатанте эмбриона уже в день 2. Эти результаты свидетельствуют о том, что sCD146 является предпочтительным биомаркером при IVF, т.к. до этих пор ни один биомаркер не определяли в бластоцистах на ранней стадии. Кроме того, применение sCD146 имеет другое преимущество, в большинстве центров эмбрионы переносят в день 2 или 3, период, совместимый с детекцией sCD146. В конечном итоге, ранняя детекция sCD146 также связана со снижением затрат.

Концентрация sCD146 в супернатантах эмбрионов представляет собой ранний, неинвазивный и инновационный биомаркер для селекции эмбриона с наиболее высоким имплантационным потенциалом. Этот биомаркер успешно улучшает эффективность IVF, снижая время и затраты для достижения беременности.

ССЫЛКИ

- Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Hum Reprod. 2011; 26:1270-1283.

- Bardin et al. FEBS Lett 1998

- Bardin et al. Blood 2001

- Bardin et al. Thromb Haemost 2003

- Kaspi et al., Angiogenesis, 2013

- Kupka MS, Ferraretti AP, de Mouzon J, Erb K, D'Hooghe T, Castilla JA, Calhaz-Jorge C, Assisted reproductive technology in Europe, 2010: results generated from European registers by ESHRE. Reproduction and Embryology. Hum Reprod. 2014 ;29:2099-113.

- Liu et al. J Cell Physiol, 2008

- Liu et al. Lab Investig J Tech Methods Pathol 2004

- McLernon DJ, Harrild K, Bergh C, Davies MJ, de Neubourg D, Dumoulin JC, Gerris J, Kremer JA, Martikainen H, Mol BW, Norman RJ, Thurin-Kjellberg A, Tiitinen A, van Montfoort AP, van Peperstraten AM, Van Royen E, Bhattacharya S. Clinical effectiveness of elective single versus double embryo transfer: meta-analysis of individual patient data from randomised trials. BMJ. 2010; 21:341:c6945.

- Pandian Z, Marjoribanks J, Ozturk O, Serour G, Bhattacharya S. Number of embryos for transfer following in vitro fertilisation or intra-cytoplasmic sperm injection. Cochrane Database Syst Rev. 2013; 29;7:CD003416.

- Pasquier et al. Thromb Haemost 2005

- Wang et al., Journal of Reproduction and Contraception, 2008

Claims

1. Применение растворимого белка CD146 (sCD146), присутствующего в среде для культивирования эмбрионов в качестве биомаркера имплантации указанного эмбриона в матке млекопитающего.

2. Способ отбора эмбриона, полученного посредством оплодотворения in vitro (IVF), для имплантации в матку млекопитающего, включающий стадию in vitro определения концентрации sCD146 в супернатанте среды для культивирования эмбрионов Global®, при этом среда для культивирования является средой, в которой осуществляют по меньшей мере 1-дневное культивирование эмбриона перед определением концентрации sCD146, и сравнения концентрации sCD146 с пороговым значением концентрации, где пороговое значение концентрации составляет 1164 пг на мл супернатанта, где присутствие sCD146 в концентрации выше порогового значения свидетельствует о высоком риске неудачи имплантации эмбриона в матку млекопитающего и наличие sCD146 в количестве, равном или ниже порогового значения, свидетельствует о вероятности успеха имплантации эмбриона в матку млекопитающего.

3. Способ по п. 2, где стадию определения концентрации sCD146 осуществляют через 2-5 дней после оплодотворения яйцеклетки in vitro, предпочтительно два дня после оплодотворения яйцеклетки in vitro.

4. Способ по п. 2 или 3, где млекопитающее является человеком.

5. Применение детектируемого моноклонального антитела, связывающегося с sCD146, для определения того, можно ли выбирать эмбрион, полученный посредством оплодотворения in vitro (IVF), для имплантации в матку млекопитающего.

6. Набор для определения, может ли эмбрион, полученный посредством оплодотворения in vitro (IVF), быть отобран для имплантации в матку млекопитающего, содержащий детектируемое моноклональное антитело, связывающееся с sCD146, вместе с фармацевтически инертным дилюентом, не содержащим sCD146, подлежащим использованию для получения контроля, или по меньшей мере с одним раствором, содержащим известную концентрацию sCD146, при этом моноклональное антитело позволяет определять sCD146 в супернатанте среды для культивирования эмбрионов, содержащей не более чем 100 нг/мл sCD146.

7. Набор по п. 6, где детектируемое антитело метят маркером детекции, выбранным из флуорофора, магнитной частицы, антигенного эпитопа, субстрата конкретного фермента, связывающего домена конкретного лиганда.

8. Набор по п. 6 или 7, где набор содержит подходящий субстрат, позволяющий выявлять указанное детектируемое моноклональное антитело при связывании с sCD146 в среде для культивирования эмбрионов.

9. Набор по любому из пп. 6-8, где набор содержит несколько растворов, содержащих различные известные концентрации sCD146, вместе с калибровочной кривой.

10. Способ стимуляции беременности у млекопитающего, подвергаемого переносу эмбриона, включающий стадию in vitro i) определения концентрации sСD146 в супернатанте среды для культивирования эмбрионов Global®, при этом среда для культивирования является средой, в которой осуществляют по меньшей мере 1-дневное культивирование эмбриона перед определением концентрации sCD146, стадию ii) сравнения концентрации sCD146 в указанной среде для культивирования с пороговым значением концентрации, где пороговое значение концентрации составляет 1164 пг на мл супернатанта, и стадию iv) переноса эмбриона в матку млекопитающего, если концентрация sCD146 равна или ниже порогового значения.

11. Способ по п. 10, где способ включает стадию iii) исследования эмбриона с использованием морфологических критериев (морфологическое исследование), и стадию iv) переноса эмбриона в матку млекопитающего, если концентрация sCD146 равна или ниже порогового значения и если указанный эмбрион удовлетворяет морфологическим критериям имплантации.

12. Способ повышения вероятности беременности при оплодотворении in vitro у млекопитающего, включающий: i) оплодотворение ооцита указанного млекопитающего спермой; культивирование указанного оплодотворенного ооцита в среде для культивирования эмбрионов Global® с образованием эмбриона; определение концентрации sСD146 в супернатанте среды для культивирования эмбрионов, в которой эмбрион культивировался по меньшей мере 1 день, стадию ii) сравнения концентрации sCD146 в указанном супернатанте среды для культивирования с пороговым значением концентрации 1164 пг на мл супернатанта, и стадию iv) переноса эмбриона в матку млекопитающего, если концентрация sCD146 равна или ниже порогового значения.

13. Способ по п. 12, где способ включает стадию iii) исследования эмбриона с использованием морфологических критериев (морфологическое исследование), и стадию iv) переноса эмбриона в матку млекопитающего, если концентрация sCD146 равна или ниже порогового значения и если указанный эмбрион удовлетворяет морфологическим критериям имплантации.