JP2018513979A - 哺乳動物における着床用の体外受精胚を選択するためのバイオマーカーとしての可溶性ｃｄ１４６の使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒト不妊治療の分野に関する。より具体的には、本発明は胚培養培地で測定されると、胚が哺乳動物の子宮内着床につき選択可能か否かを判定するために使用することができるバイオマーカーとしての、可溶性ＣＤ１４６（ｓＣＤ１４６）の同定に関する。本発明はしたがって、着床に適格な胚を（予備）選択するための新しいツール及び関連キットを提供する。本発明はまた、胚移植を受けるヒトにおいて妊娠を促進するための方法にも関する。
Description
本発明は、ヒト不妊治療の分野に関する。発明者らは本願明細書において実際に、新しいバイオマーカーである可溶性ＣＤ１４６（ｓＣＤ１４６）を同定したが、前記バイオマーカーは胚培養培地で測定されると、胚が哺乳動物の子宮内着床につき選択可能か否かを判定するために使用することができる。したがって本発明は、着床に適格な胚を（予備）選択するための新しいツール及び関連キットを提供する。本発明はまた、胚移植を受けるヒトにおいて妊娠を促進するための方法にも関する。
過去数十年にわたる、体外受精（インビトロ受精、ＩＶＦ）における胚培養条件及び移植技術の双方の向上にかかわらず、妊娠及び出産率の有意な向上は成し遂げられていない（Kupka MS et al., Hum Reprod. 2014）。着床に失敗する胚は７０％を超える。これに関連して、妊娠の確率を増大させるために２個以上の胚が移植される。しかしながら、複数胚移植は、胎児及び母親の罹患率及び死亡率の増加をもたらすことが知られている、多胎妊娠の有意なリスクを誘導する。このリスクを回避するために、多胎出産の頻度を低減する手法として単一胚移植が推奨されている（McLernon et al., BMJ. 2010; Pandian Z et al., Cochrane Database Syst Rev. 2013）。胚の品質の評価は今日まで、細胞サイズ及び対称性、細胞数、卵割段階、無核細胞断片を含むいくつかの基準で、形態学的に評価される。しかしながら、胚の品質は胚の生存率及び着床可能性（implantation potential）に厳密に相関しているわけではない。したがって、高い着床可能性を呈する単一胚の移植を可能にするために、着床の予後のより良好な査定には着床の生物学的マーカーの検索が必要とされる。
膜ＣＤ１４６は、早期段階で胚によって発現されることが証明されており（Wang et al., Journal of Reproduction and Contraception, 2008）、そして発明者らは最近、妊娠ラットにおける胚着床を調節する新しい因子として可溶性ＣＤ１４６を同定した（Kaspi et al., Angiogenesis, 2013）。
ＣＤ１４６（又は、Ag S-Endo 1 / MUC 18 / M-CAM）は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する接着分子であり、これは基本的に、内皮接合部に局在する（Bardin et al. Blood 2001）。生理的には、ＣＤ１４６はヒト内皮に遍在的且つ構成的に発現され、そこで内皮の単層の接着（cohesion）に関与する。ＣＤ１４６はまた、膜タンパク質分解によって生成される可溶性フォームとしても存在する。可溶性ＣＤ１４６（ｓＣＤ１４６）は、培養内皮細胞の上清中、並びに正常及び病的ヒト血清中の両者に存在することが立証された（Bardin et al. FEBS Lett 1998）（Bardin et al. Thromb Haemost 2003）。
産科学では、膜ＣＤ１４６は卵丘−卵母細胞複合体、着床前胚、絨毛外栄養膜及び子宮内膜によって発現される（Wang et al. J Reprod Contracept 2008）。また、抗ＣＤ１４６遮断抗体の使用により、マウスにおいてインビトロ及びインビボでの胚の着床が妨げられる。ＡＡ９８抗体は、子宮内膜細胞上に存在する膜ＣＤ１４６を遮断するが、これは胚盤胞の着床を妨げる（Liu et al. J Cell Physiol, 2008）。子癇前症では、これらの栄養膜の浸潤能の減弱に関連して、ＣＤ１４６の発現が大幅に低減するか又は発現しなくなる（Liu et al. Lab Investig J Tech Methods Pathol 2004）。可溶性フォームに関し、正常な妊娠中の妊娠持続期間に伴う血清ｓＣＤ１４６の減少が発表された（Kaspi et al. Angiogenesis 2013）。加えて発明者らは、少なくとも１人の生存児がいる女性と比べて、原因不明の少なくとも２の胎児喪失があった女性における、ｓＣＤ１４６の上昇を報告した（Pasquier et al. Thromb Haemost 2005）。発明者らは、絨毛外栄養膜に対するｓＣＤ１４６の異なる効果：ｉ）インビトロで、絨毛外栄養膜細胞株ＨＴＲ／Ｓｖｎｅｏ細胞の遊走、増殖及び擬似毛細管形成を阻害することと、ｉｉ）エクスビボ（胎盤の外植）で、侵襲可能性を低減することと、並びにｉｉｉ）最後に、妊娠ラットのモデルで、ｓＣＤ１４６の反復注射により妊娠率及び同腹子あたりの胚の数が低減することも報告した。これらのラット（rates）の胎盤の胎盤組織学的研究により、女性における絨毛外栄養膜に類似するグリコーゲン細胞の遊走の低下を、これらの効果が伴うことが示されている（Kaspi et al. Angiogenesis 2013）。
発明者らは本明細書において、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット実験の結果により、胚培養培地中の可溶性ＣＤ１４６タンパク質（ｓＣＤ１４６）の存在を明らかにする。発明者らは、ｓＣＤ１４６が胚培養培地において測定されると、着床不全（failure）の高いリスクを随伴する胚の子宮内着床につき不適格と判定するため、移植可能な胚を同定するため、又はいくつかのうち、最高の着床可能性を随伴する胚を選択するためのバイオマーカーとして有利に使用可能であることを立証する。
本願明細書に記載される第一の目的はしたがって、哺乳動物の子宮における胚の着床のバイオマーカーとしての、胚培養培地中に存在する可溶性ＣＤ１４６タンパク質（ｓＣＤ１４６）の使用に関する。
本願明細書に記載されるのはまた、体外受精によって得られる胚に関する有用な情報を得るための、特に体外受精胚の着床可能性を評価／判定するための、典型的には、哺乳動物の子宮に移植された場合に着床可能性を備える胚（「移植可能な胚」）を同定するための、早期的且つ非侵襲的な方法でもある。このような方法は典型的には、哺乳動物の子宮内着床につき、胚を不適格と判定するため、又は逆に選択するため、例えば予備選択するために実行される。
本発明の方法は有利には、胚培養培地中に、好ましくは胚培養培地上清中にｓＣＤ１４６を投与するインビトロ工程、及びその投与量を閾値と比較する工程を含む。
本願明細書に記載されるのはまた、検出可能なｓＣＤ１４６結合モノクローナル抗体を含むキット、さらには体外受精（ＩＶＦ）によって得られる胚のうち哺乳動物の子宮内着床に適格であるものを同定するための、好ましくは最高の着床可能性を随伴する胚を選択するための、又は単一胚の着床状態（「着床能」）を確認するための、このようなキットの使用でもある。
さらにまた記載されるのは、胚培養培地中にｓＣＤ１４６を投与するインビトロ工程、及びその投与量を閾値と比較する工程を含む、胚移植を受けるヒトにおいて妊娠を促進するための方法である。
本願明細書に記載の発明は、哺乳動物の、典型的にはヒトの、子宮における胚の着床のバイオマーカーとしての、胚培養培地中に存在する可溶性ＣＤ１４６タンパク質（ｓＣＤ１４６）の使用に関する。
ｓＣＤ１４６は、早期且つ非侵襲的バイオマーカーに相当する革新的手段である。本発明の結果、哺乳動物の子宮内への移植に適格な胚の選択はもはや、胚の形態学的な基準頼みとならない。ｓＣＤ１４６は、イスタンブール分類（「最良（top）」、「良好（fair）」又は「不良（poor）」な品質）によって定義される胚の品質が何れであっても、任意の胚培養培地中で試験可能である。前記選択は加えて、胚発生において非常に早期に、且つ既存の技術での場合よりも早期に実施可能である。ｓＣＤ１４６は、胚発生の早期段階で、典型的にはインビトロ卵母細胞受精後早くも２日で、胚培養培地中で実際に検出可能である。
本願明細書に記載される新しいバイオマーカーは、有利には、単一胚の、典型的には、いくつかのうち哺乳動物の子宮内着床の最高の可能性を呈する胚の移植を可能とする。この選択肢は、多胎妊娠のリスク及び体外受精［古典的な体外受精又は細胞質内精子注入体外受精（ＩＣＳＩ−体外受精）］に関わる関連合併症を回避するために、そして同時に体外受精手順に随伴するコストを低下させながらも妊娠の確率を有意に増大するために採用され得る。
本明細書に記載の発明はまた、体外受精によって得られる胚に関する有用な情報を得るための、特に体外受精胚の着床可能性を評価／判定するための、好ましくは、哺乳動物の子宮に移植された場合に着床可能性を備える胚（「移植可能な胚」）を同定／選択するための方法も提供する。このような方法は典型的には、哺乳動物の子宮内着床につき、体外受精胚を不適格と判定するため、又は逆に選択するため、例えば予備選択するために使用される。
本発明の方法は有利には、非侵襲的であり、そして胚培養培地中に、典型的には胚培養培地上清中にｓＣＤ１４６を投与するインビトロ工程、及びその投与量を閾値と比較する工程を含む。本発明の方法の結果として胚が予備選択されると、本方法はさらに、胚を調べる際に、細胞サイズ及び対称性、細胞数、卵割段階、無核細胞フラグメントの存在などの、当業者により認められた数値の基準を使用することからなる形態学的選択の次の工程を含むことができる。
用いられるべき培地は、胚培養又は移植に以前から使用される従来の培地のいずれであってもよい。培養培地は典型的には、グルコース、ピルビン酸、及びエネルギー供給成分、さらにはその中で発生する着床前胚により遊離される因子を基本的に含有する人工培養培地である。培地はさらに、例えばアミノ酸、ヌクレオチド、ビタミン、及びコレステロールを含むことができる。
プリオン又は他の感染病原体での汚染のリスクを排除すべきとの観点から、無血清培地が好ましい。
培養培地は定期的に交換される。培地は、培養期間中ずっと同じであるか、又は培養期間にわたり発生段階に応じて変更される場合がある。
適切な培地の例として、１０％ヒト血清アルブミンが添加されたGLOBAL（登録商標、Life Global）が挙げられる。このような培地は、第５日に胚盤胞が形成されるまで継続されることになる培養に、好適に使用可能である。
収集されるべき培養培地、又は培養培地の上清は、好ましくは収集の前にその中で少なくとも１日胚培養が実施されたものである。
胚への十分量の培地を供給することの必要性と、培地から胚を収集するための利便性との両方を考慮し、ヒト胚の前記培養は、ヒト胚あたり、好ましくは５０μL〜１mL、より好ましくは５００〜８００μLの培地に相当する量の培地で、典型的にはヒト胚あたり６００μLの培地で行われる。
収集された培養培地又は培養上清は、直接、又は凍結保存され試験前に解凍されて試験される場合がある。一種類以上の薬学的に不活性な希釈剤（例えば、滅菌精製水、又はヒト血漿アルブミン、グルコース、塩化ナトリウムなど、GLOBAL（登録商標）に含まれる化合物を含有する水溶液）を添加して、例えば、０．２mL又は０．５mLといった、取扱いがより容易な容量に希釈することによって容量を増やすことも許容される。
本願明細書に記載される特定の方法は、体外受精によって得られる胚に関する有用な情報を得るための方法、そして好ましくは、前記情報を用いて、胚が哺乳動物の子宮内着床につき選択可能かどうかを判定する方法である。本方法は、胚培養培地中にｓＣＤ１４６を投与するインビトロ工程、及びその投与量を閾値と比較する工程を含む。閾値を超える量でｓＣＤ１４６が胚培養培地中に存在することは、哺乳動物の子宮における胚着床不全の高リスクの指標であり（関連し）、前記閾値以下の量でｓＣＤ１４６が存在することは、哺乳動物の子宮における胚着床成功の確率の指標である（関連する）。ｓＣＤ１４６濃度が低いほど、胚着床成功の確率が高くなる。「閾値」は、培養に用いられる培地の性質に応じて、また具体的に試験される培地の部分（上清又は全培地）に応じて変動し得る。例えば、実験の項にて実施されたものなど、Global（登録商標）培地（Life Global）を用いて培養培地上清に投与が実施される場合、閾値は１mLの上清あたり１１６４pgである。
投与する工程は有利には、卵母細胞受精後２日と５日の間、好ましくは卵母細胞受精後２日、典型的には哺乳動物の子宮内への胚移植の日に実施される。
検出可能なｓＣＤ１４６結合抗体、好ましくは検出可能なｓＣＤ１４６結合モノクローナル抗体を含むキット、典型的には体外受精胚選択キット、さらには体外受精（ＩＶＦ）によって得られる胚が哺乳動物の子宮内着床につき選択可能かどうかを判定するためのその使用も、また本願明細書に記載される。
特定のキットは、任意に、胚培養培地中のｓＣＤ１４６に結合されると前記検出可能な抗体を明らかにする適切な基質と一緒に、検出可能なｓＣＤ１４６結合抗体、好ましくは検出可能なｓＣＤ１４６結合モノクローナル抗体、好ましくは選択的にＣＤ１４６の可溶性フォームを結合し、且つＣＤ１４６膜結合フォームを結合しない検出可能な（モノクローナル）抗体を含む。キットは、コントロールを調製するために使用されるべき、ｓＣＤ１４６不含の薬学的に不活性な希釈剤、又は既知濃度のｓＣＤ１４６を含む少なくとも１つの溶液、好ましくは検量線（典型的には０pg/ml〜１００００pg/ml）と一緒に、異なる既知濃度のｓＣＤ１４６を有するいくつかの溶液（２、３、４、５又は６つなどの溶液）をさらに任意に含む。一般的に、キットはまた、本願明細書に開示される物質（抗体、希釈剤、及び溶液）の一以上で満たされた一以上の容器も含む。このような容器（一以上）に関連付けて、開示された方法に従い前記物質を用いるための取扱説明を提供する注意書きラベルを添付してもよい。
ｓＣＤ１４６結合抗体は、合成品、モノクローナル、又はポリクローナルであり得、また当技術分野において周知の技術によって製造可能である。
ｓＣＤ１４６結合モノクローナル抗体は有利には、BioCytexからのクローンCOM 3D9、クローンCOM 2F6、クローンCOM 5G6、クローンCOM 7A4及びクローンF4-35H7（S-endo 1）より選択され、好ましくはクローンCOM 7A4である。
このような抗体を生成する方法は、当技術分野において公知である（例えば、Despoix N, Walzer T, Jouve N, Blot-Chabaud M, Bardin N, Paul P, Lyonnet L, Vivier E, Dignat-George F, Vely F. Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation.（マウスＣＤ１４６／ＭＣＡＭはナチュラルキラー細胞成熟のマーカーである。）Eur J Immunol. 2008;38: 2855-64を参照のこと）。
前記キットの検出可能なｓＣＤ１４６結合モノクローナル抗体は、胚培養培地又は上清中の低濃度のｓＣＤ１４６を検出するために、濃縮された剤形であることが好ましい。それゆえ濃縮された抗体が好ましく使用される。好ましい実施形態では、濃縮された抗体で、１００ng/ml以下、好ましくは５０ng/ml以下、さらにより好ましくは１０ng/ml以下のｓＣＤ１４６を含有する胚培地の上清中のｓＣＤ１４６の検出が可能となる。
ｓＣＤ１４６の存在や、さらにはその量の尺度の判定は、培養培地、若しくは培養上清が適切な抗原と直接接触される１工程法によって、又は生物試料の予備的処置が含意される方法によって、イムノアッセイ法にて判定されるのが好ましい。イムノアッセイ法は、固相又は均一相において、１又は２工程、競合的方法り、等の当該技術分野で周知の方法で実施可能である。
より好ましくは、前記イムノアッセイ法は、ＥＬＩＳＡ、ＦＥＩＡ、ウエスタンブロット、ドットブロット、ビーズベースのアッセイ法、抗原アレイ及びラジオイムノアッセイ法からなる群より選択される。
ＥＬＩＳＡにおいて抗原は、固体表面に固定化されなければならず、次いで酵素に結合される抗体と複合されなければならない。検出は、着色産物を精製する基質とのインキュベーションを介して、接合された酵素活性を査定することによって達成される。
ＦＥＩＡにおいて、前記着色産物は蛍光性である。
ラジオイムノアッセイ法では、前記最終産物は放射活性を有する。
ドットブロットプロトコールを用いるタンパク質検出は、両方法が対象となるタンパク質の同定及び分析を可能にするという点でウエスタンブロット法に類似している。ドットブロット方法論は、電気泳動を用いてタンパク質試料を分離しないことが従来のウエスタンブロット技術と異なっている。代わりに試料タンパク質は膜上にスポットされ、抗体プローブとハイブリダイズされる。
半定量的な測定値は、例えば正常なコントロールを用い値を標準化した後に比を確立するか、又は標準物質として陽性コントロールを用いる（任意の単位で表される）、これまでに記載された方法の各々で得られる場合がある。
検出は、例えば、検出及び定量されるべき、ｓＣＤ１４６に対応する抗原がその上に配置されるミクロプラーク（microplaque）、又は固体粒子、試験管、等の固体支持体上で実施され得る。
本発明に関連して使用可能なｓＣＤ１４６を認識する抗体は、それらの同定、フォローアップ、検出及び／又は測定を可能とする、一以上のタグ（検出マーカー）でラベルされることが好ましい。検出マーカーは、例えばフルオロフォア、磁気ビーズ、抗原エピトープ、特異的酵素の基質、特異的リガンドの結合ドメイン、及び検出又は定量され得る任意の他の分子又は部分から選択され得る。本発明に関連して使用可能な抗体は、ｓＣＤ１４６を認識する抗体の同定、フォローアップ、検出及び／又は測定をするために使用される抗−抗体であってもよい。
ｓＣＤ１４６不含の薬学的に不活性な希釈剤は、例えば滅菌精製水、又はGLOBAL（登録商標）培地など、ヒト血漿アルブミン、グルコース、塩化ナトリウム等を含有する水溶液から選択され得る。
また記載されるのは、胚移植を受ける哺乳動物において、典型的にはヒトにおいて妊娠を促進する（すなわち、妊娠を成し遂げる成功率を高める）ための方法であって、ｉ）胚培養培地中にｓＣＤ１４６を投与するインビトロ工程、ｉｉ）その投与量を本発明に係る閾値と比較して、投与量が閾値以下であれば、胚が哺乳動物の子宮内着床に適格であること、また投与量が閾値を超えれば、胚が哺乳動物の子宮内着床に適格でないことを決定する工程を含み、任意に、ｉｉｉ）形態学的な基準を用いて胚を検査する工程、及びｉｖ）投与量が閾値以下であれば、且つ前記胚が着床の形態学的な基準を満たしていれば、哺乳動物の子宮内に胚を移植する工程を含む、方法である。
これまでに記載された方法において、任意の工程ｉｉｉ）は最初に、すなわち工程ｉ）及びｉｉ）の前に実施される場合がある。別の実施形態では、工程ｉｉｉ）は工程ｉ）とｉｉ）との間に実施される場合がある。
本発明のさらなる態様及び利点が、以下の実施例において説明されるが、これらは限定としてではなく例示を目的として示される。
実施例
材料及び方法
患者
２０１３年３月から２０１４年１２月まで、発明者らはLa Conception University Hospital（AP-HM, Marseille, France）の医療センターの生殖部門において、体外受精（ＩＶＦ）の試行を受けた１６２のカップルの初発のパイロット試験を実施した。全てのカップルが、移植された胚からの胚培養培地が胚移植後に研究目的で保存されることになる旨を知らされ、この試験に加わるか否かを選択した。各々のカップルが参加したのは１回のみであった。発明者らは、同意がなければ卵母細胞及び精子ドナー及び患者はこの試験から除外した。施設内倫理委員会（Institutional Review Board）は、この研究を認可した。
材料及び方法
患者
２０１３年３月から２０１４年１２月まで、発明者らはLa Conception University Hospital（AP-HM, Marseille, France）の医療センターの生殖部門において、体外受精（ＩＶＦ）の試行を受けた１６２のカップルの初発のパイロット試験を実施した。全てのカップルが、移植された胚からの胚培養培地が胚移植後に研究目的で保存されることになる旨を知らされ、この試験に加わるか否かを選択した。各々のカップルが参加したのは１回のみであった。発明者らは、同意がなければ卵母細胞及び精子ドナー及び患者はこの試験から除外した。施設内倫理委員会（Institutional Review Board）は、この研究を認可した。
処置プロトコール
患者は、３つのタイプのプロトコール、すなわち、長期アゴニストプロトコール（前のサイクルの黄体期にＧｎＲＨアゴニスト投与）；短期アゴニストプロトコール（体外受精サイクルの第１日以降、毎日ＧｎＲＨアゴニスト投与）；及びアンタゴニストプロトコール（第５日から毎日ＧｎＲＨアンタゴニスト投与）を用いて、コントロールされた卵巣過刺激を受けた。肥満度指数、女性の年齢、基準の第３日ＦＳＨ値及び胞状卵胞（antral follicle）の数に従い、１５０IU/日と４５０IU/日との間の範囲の用量でリコンビナントＦＳＨ及び／又はｈＭＧを用いた。患者は、卵巣過刺激の第８日に開始の連続的経膣超音波と、血清エストラジオール（Ｅ２）測定とをルーチンに受けた。ゴナドトロピンの用量はその後、卵巣応答に従って調整された。少なくとも３つの卵胞が１６mmの平均直径に達したら、リコンビナントヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ、Ovitrelle（登録商標）、Merck-Serono、２５０μg）の皮下注射で排卵誘発を実施した。卵母細胞の回収は、局所又は全身麻酔下に卵胞の経膣超音波ガイド下穿刺を用いてｈＣＧ投与後３５時間に実施された。従来の体外受精又は細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ体外受精）がその後、精子パラメータに基づき、日常的なプロトコールを用いて実施された。受精後１８時間に正常な受精（すなわち、２つの前核を持つ受精された卵母細胞、いわゆる２倍体接合子）の査定をした後、接合子は次いで、５００μlのGlobal（登録商標）培地（Life Global）中５％ＣＯ２で３７℃にて胚移植の日（第２日又は第３日）まで個々に培養された。
患者は、３つのタイプのプロトコール、すなわち、長期アゴニストプロトコール（前のサイクルの黄体期にＧｎＲＨアゴニスト投与）；短期アゴニストプロトコール（体外受精サイクルの第１日以降、毎日ＧｎＲＨアゴニスト投与）；及びアンタゴニストプロトコール（第５日から毎日ＧｎＲＨアンタゴニスト投与）を用いて、コントロールされた卵巣過刺激を受けた。肥満度指数、女性の年齢、基準の第３日ＦＳＨ値及び胞状卵胞（antral follicle）の数に従い、１５０IU/日と４５０IU/日との間の範囲の用量でリコンビナントＦＳＨ及び／又はｈＭＧを用いた。患者は、卵巣過刺激の第８日に開始の連続的経膣超音波と、血清エストラジオール（Ｅ２）測定とをルーチンに受けた。ゴナドトロピンの用量はその後、卵巣応答に従って調整された。少なくとも３つの卵胞が１６mmの平均直径に達したら、リコンビナントヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ、Ovitrelle（登録商標）、Merck-Serono、２５０μg）の皮下注射で排卵誘発を実施した。卵母細胞の回収は、局所又は全身麻酔下に卵胞の経膣超音波ガイド下穿刺を用いてｈＣＧ投与後３５時間に実施された。従来の体外受精又は細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ体外受精）がその後、精子パラメータに基づき、日常的なプロトコールを用いて実施された。受精後１８時間に正常な受精（すなわち、２つの前核を持つ受精された卵母細胞、いわゆる２倍体接合子）の査定をした後、接合子は次いで、５００μlのGlobal（登録商標）培地（Life Global）中５％ＣＯ２で３７℃にて胚移植の日（第２日又は第３日）まで個々に培養された。
それらは、早期の細胞分割を検出するために、受精後２６時間観察された。得られた２倍体胚は、イスタンブールの合意（Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology. Hum Reprod. 2011）に従い、細胞サイズ及び対称性、断片化及び細胞数に基づく採点によって移植の前にランク付けされた。
胚は次いで、３つのサブグループに分類された。
１／ 同じサイズの細胞で、断片化はなしか又は１０％未満であり、且つ第２日に４細胞か又は第３日に８細胞の、最良な品質の胚；取得可能なら移植用に優先的に選択される；
２／ 細胞の大多数につき、段階特異的な細胞サイズ、及び／又は１０〜２５％断片化、及び／又は第２日に３若しくは５細胞か又は第３日に６、７又は９細胞の、良好な品質の胚；
３／ 段階特異的細胞サイズでなく、及び／又は深刻な断片化（＞２５％）、及び／又は第２日に２細胞若しくは＞５細胞か又は第３日に＜６細胞若しくは＞９細胞の、不良な品質の胚。
１／ 同じサイズの細胞で、断片化はなしか又は１０％未満であり、且つ第２日に４細胞か又は第３日に８細胞の、最良な品質の胚；取得可能なら移植用に優先的に選択される；
２／ 細胞の大多数につき、段階特異的な細胞サイズ、及び／又は１０〜２５％断片化、及び／又は第２日に３若しくは５細胞か又は第３日に６、７又は９細胞の、良好な品質の胚；
３／ 段階特異的細胞サイズでなく、及び／又は深刻な断片化（＞２５％）、及び／又は第２日に２細胞若しくは＞５細胞か又は第３日に＜６細胞若しくは＞９細胞の、不良な品質の胚。
胚移植後、黄体期は次いで、毎日のプロゲステロン錠剤（DuphastonR、３０mg/日；Abbot Products SAS,France）によって補助された。妊娠は、血清陽性ｈＣＧレベル（＞１００IU/l）によって胚移植後１４日に診断された。臨床的妊娠は、胚移植後第５週の間の膣内超音波検査での心臓活性を伴う胎嚢の存在により確認された。
胚上清
移植された各胚の培養培地（５００μl Global（登録商標））は胚移植後、個々に収集され、ｓＣＤ１４６定量化まで−２０℃で凍結保存された。胚上清を収集するのは非侵襲的技術であり、患者のケアに変更はなかった。体外受精の結果は、全患者で遡及的に比較された。
移植された各胚の培養培地（５００μl Global（登録商標））は胚移植後、個々に収集され、ｓＣＤ１４６定量化まで−２０℃で凍結保存された。胚上清を収集するのは非侵襲的技術であり、患者のケアに変更はなかった。体外受精の結果は、全患者で遡及的に比較された。
胚上清中のｓＣＤ１４６の存在の確認
ＣＤ１４６は既に、ヒト胚の早期段階で同定されており（Wang H et al. J of Reprod and contracept 2008）、栄養膜細胞における膜ＣＤ１４６を脱落させることによって可溶性フォームを産生可能であることが公知である（Kaspi et al., Angiogenesis, 2013）。しかしながら、胚によるｓＣＤ１４６の分泌については、文献からデータが得られない。発明者らは、胚上清につきウエスタンブロット解析を行い、胚によるｓＣＤ１４６の放出を確認した。５０μLの胚上清又は陰性コントロール（培養培地）を４〜１２％ NuPage ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（In Vitrogen/Life Technologies, USA）に付し、ニトロセルロース膜へと転写した。Bio-Rad分子量マーカーを使用した。転写は、定電圧（６０Ｖ）で２時間実施した。ＴＢＳ−Tween 20（ＴＢＳＴ）中４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした後、４℃で一晩連続的に振盪しながらＴＢＳＴ（１：３０００）で希釈した抗ヒトＣＤ１４６抗体（７Ａ４ １mg/l、Biocytex, Marseille, France）を用いて可溶性ＣＤ１４６が証明された。可溶性ＣＤ１４６は、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス抗体（Thermo Scientific, USA）によって検出された。G:Box-Chemi-XT4（Syngene, Cambridge, United Kingdom）によって膜をスキャン及び分析した。
ＣＤ１４６は既に、ヒト胚の早期段階で同定されており（Wang H et al. J of Reprod and contracept 2008）、栄養膜細胞における膜ＣＤ１４６を脱落させることによって可溶性フォームを産生可能であることが公知である（Kaspi et al., Angiogenesis, 2013）。しかしながら、胚によるｓＣＤ１４６の分泌については、文献からデータが得られない。発明者らは、胚上清につきウエスタンブロット解析を行い、胚によるｓＣＤ１４６の放出を確認した。５０μLの胚上清又は陰性コントロール（培養培地）を４〜１２％ NuPage ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（In Vitrogen/Life Technologies, USA）に付し、ニトロセルロース膜へと転写した。Bio-Rad分子量マーカーを使用した。転写は、定電圧（６０Ｖ）で２時間実施した。ＴＢＳ−Tween 20（ＴＢＳＴ）中４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした後、４℃で一晩連続的に振盪しながらＴＢＳＴ（１：３０００）で希釈した抗ヒトＣＤ１４６抗体（７Ａ４ １mg/l、Biocytex, Marseille, France）を用いて可溶性ＣＤ１４６が証明された。可溶性ＣＤ１４６は、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス抗体（Thermo Scientific, USA）によって検出された。G:Box-Chemi-XT4（Syngene, Cambridge, United Kingdom）によって膜をスキャン及び分析した。
可溶性ＣＤ１４６アッセイ法
ｓＣＤ１４６は、市販のＥＬＩＳＡアッセイ法の適応を用いてアッセイされた（CY-QUANT ｓＣＤ１４６、Biocytex、Marseille）。プレートは、特異的マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ１４６ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントでコーティングされた。２００μLの胚上清１／２希釈液を各ウェルに加えて室温で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後に、プレートを５回洗浄し、その後特異的ＨＲＰ結合抗ＣＤ１４６モノクローナル抗体（７Ａ４−ＨＲＰ、１mg/ml、Biocytex, Marseille, France）と特異的希釈剤中１：１０００希釈にて室温で３０分間インキュベーションし、次いで５回洗浄した。２００μLのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を室温でおよそ２０分間インキュベーションした。比色反応をその後、１００μLの酸溶液の添加によって停止させた。シグナルの強度は、試料中に最初に含有されていたｓＣＤ１４６の濃度に直接連関していた。技術の適応は、胚培養培地によるキットの希釈剤の置換に基づき、胚上清と同じ条件（３７℃、５％ＣＯ２、４８時間）で保存されたが、試験の反復性及び再現性を向上させるためにこれには胚を含めなかった。濃縮された抗ＣＤ１４６抗体も使用したが、これはヒト血清又は血漿中よりも上清中でｓＣＤ１４６が低濃度なためである（７Ａ４−ＨＲＰ、１mg/ml、Biocytex, Marseille, France）。既知濃度（０pg/mlから１００００pg/mlまで）のｓＣＤ１４６を含む溶液の検量線を使用して、胚上清中のｓＣＤ１４６の濃度を求めた。上清の容量が小さいことと、提供者の推奨（２００μl/ウェル）とにより、各試料を希釈し（１：２）、一重で（in simplicate）分析した。光学密度（ＯＤ）を４５０nmで測定した。
ｓＣＤ１４６は、市販のＥＬＩＳＡアッセイ法の適応を用いてアッセイされた（CY-QUANT ｓＣＤ１４６、Biocytex、Marseille）。プレートは、特異的マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ１４６ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントでコーティングされた。２００μLの胚上清１／２希釈液を各ウェルに加えて室温で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後に、プレートを５回洗浄し、その後特異的ＨＲＰ結合抗ＣＤ１４６モノクローナル抗体（７Ａ４−ＨＲＰ、１mg/ml、Biocytex, Marseille, France）と特異的希釈剤中１：１０００希釈にて室温で３０分間インキュベーションし、次いで５回洗浄した。２００μLのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を室温でおよそ２０分間インキュベーションした。比色反応をその後、１００μLの酸溶液の添加によって停止させた。シグナルの強度は、試料中に最初に含有されていたｓＣＤ１４６の濃度に直接連関していた。技術の適応は、胚培養培地によるキットの希釈剤の置換に基づき、胚上清と同じ条件（３７℃、５％ＣＯ２、４８時間）で保存されたが、試験の反復性及び再現性を向上させるためにこれには胚を含めなかった。濃縮された抗ＣＤ１４６抗体も使用したが、これはヒト血清又は血漿中よりも上清中でｓＣＤ１４６が低濃度なためである（７Ａ４−ＨＲＰ、１mg/ml、Biocytex, Marseille, France）。既知濃度（０pg/mlから１００００pg/mlまで）のｓＣＤ１４６を含む溶液の検量線を使用して、胚上清中のｓＣＤ１４６の濃度を求めた。上清の容量が小さいことと、提供者の推奨（２００μl/ウェル）とにより、各試料を希釈し（１：２）、一重で（in simplicate）分析した。光学密度（ＯＤ）を４５０nmで測定した。
反復性及び再現性解析を実施し、データは４％の反復性及び１１％の再現性（ｎ＝３試験）を示した。
収集されたデータ
発明者らは、患者の臨床的及び生物学的データ（年齢、肥満度指数、喫煙習慣、不妊症の指示及び継続期間、胞状卵胞カウント数及び基準の第３日ＦＳＨ及びＡＭＨ血漿レベルによって評価された卵巣予備能力の査定）、体外受精サイクルの特性及び実験用データ（以前の体外受精−ＩＣＳＩ試行、従来の体外受精又はＩＣＳＩ−体外受精の数、卵巣刺激プロトコール、誘発日のエストラジオールレベル及び子宮内膜の厚さ、回収された卵母細胞の数、成熟卵母細胞の数、得られた２倍体胚の数及び移植された胚の数、移植された胚の形態的スコア、移植の日）、並びに臨床的妊娠の発生率を収集した。
発明者らは、患者の臨床的及び生物学的データ（年齢、肥満度指数、喫煙習慣、不妊症の指示及び継続期間、胞状卵胞カウント数及び基準の第３日ＦＳＨ及びＡＭＨ血漿レベルによって評価された卵巣予備能力の査定）、体外受精サイクルの特性及び実験用データ（以前の体外受精−ＩＣＳＩ試行、従来の体外受精又はＩＣＳＩ−体外受精の数、卵巣刺激プロトコール、誘発日のエストラジオールレベル及び子宮内膜の厚さ、回収された卵母細胞の数、成熟卵母細胞の数、得られた２倍体胚の数及び移植された胚の数、移植された胚の形態的スコア、移植の日）、並びに臨床的妊娠の発生率を収集した。
統計解析
データは、平均±ＳＥＭとして表された。統計解析は、Prismソフトウェア（GraphPad Software Inc., San Diego）を用いて実施された。有意差は、ノンパラメトリックMann Whitney and Chi2検定を用いて判定された。本発明者らには、各カップルにつきいくつかの観察内容があるので、多変量のモデルを用いる一般化推定方程式（ＧＥＥ）が使用される。ｐ値＜０．０５が有意と考えられた。
データは、平均±ＳＥＭとして表された。統計解析は、Prismソフトウェア（GraphPad Software Inc., San Diego）を用いて実施された。有意差は、ノンパラメトリックMann Whitney and Chi2検定を用いて判定された。本発明者らには、各カップルにつきいくつかの観察内容があるので、多変量のモデルを用いる一般化推定方程式（ＧＥＥ）が使用される。ｐ値＜０．０５が有意と考えられた。
結果
ベースライン患者特性
試験グループは、少なくとも１個の移植された胚を用いた体外受精又は体外受精−ＩＣＳＩを受けた１６２組のカップルを含んでいた。１５０５個の回収された卵母細胞のうち、１１９９個（８１．２％）は成熟であり、９０７個の胚が得られて７３８個が２倍体であった。第２日／３日に、１回の移植あたり１または２個の胚を用いて合計２６１個の胚が移植された。試験された１６２組のカップルのうち、完全なデータ（ｓＣＤ１４６試験結果及び妊娠検査）が、それらのうち１３８組につき入手でき、移植された胚は２２５個であった（図１）。これらの２２５個の移植された胚は結果的に、３６例の臨床的妊娠をもたらし、これには３３人の単身と３組の双子が含まれていた。第２日に、１４６個の胚が移植された（Ｄ２、６４．８％）、第３日には７９個であった（Ｄ３、３５．２％）。移植された胚の平均数は１．６３個（ＳＤ±０．５３）で、着床率は１７．３％（３９個の（卵黄）嚢／２２５個の胚）であった。全体の妊娠率は２６．１％（３６例の妊娠／１３８人の患者）であった。
ベースライン患者特性
試験グループは、少なくとも１個の移植された胚を用いた体外受精又は体外受精−ＩＣＳＩを受けた１６２組のカップルを含んでいた。１５０５個の回収された卵母細胞のうち、１１９９個（８１．２％）は成熟であり、９０７個の胚が得られて７３８個が２倍体であった。第２日／３日に、１回の移植あたり１または２個の胚を用いて合計２６１個の胚が移植された。試験された１６２組のカップルのうち、完全なデータ（ｓＣＤ１４６試験結果及び妊娠検査）が、それらのうち１３８組につき入手でき、移植された胚は２２５個であった（図１）。これらの２２５個の移植された胚は結果的に、３６例の臨床的妊娠をもたらし、これには３３人の単身と３組の双子が含まれていた。第２日に、１４６個の胚が移植された（Ｄ２、６４．８％）、第３日には７９個であった（Ｄ３、３５．２％）。移植された胚の平均数は１．６３個（ＳＤ±０．５３）で、着床率は１７．３％（３９個の（卵黄）嚢／２２５個の胚）であった。全体の妊娠率は２６．１％（３６例の妊娠／１３８人の患者）であった。
これらの２２５個の胚のうち、イスタンブール分類によると、６４個は「最良な品質の胚」、１２５個は「良好な品質」、そして３６個は「不良な品質」であった。それらの着床率はそれぞれ、２６．２％、１２％及び５．７％であった。
女性の平均年齢は３３．１歳であった（ＳＤ±４．５１）。コントロールされた卵巣過刺激は、試行のうち２１．５％で短期アゴニストプロトコール、５８．３％で長期アゴニストプロトコール、及び２０．２％でアンタゴニストプロトコールを用いて実施された。カップルのうち５４％が古典的なインビトロ受精を受け、４６％は細胞質内精子注入を受けた。体外受精サイクルの平均列（mean row）は１．７７（ＳＤ±０．９７）であった。体外受精についての指示は、カップルの５８％が男性不妊症に、４２％が女性不妊症に関連するものであった。試験された集団の特性（卵巣予備状態、着床の臨床的予後因子、誘発日の卵巣応答及び子宮内膜の状態）を表１に要約している。
第２日からの胚上清中のｓＣＤ１４６の存在
胚上清中のｓＣＤ１４６の存在を確認するため、発明者らは種々のｓＣＤ１４６濃度を用い４つの試料についてウエスタンブロット解析を実施した。ＥＬＩＳＡにより、第１の試料は２２０pg/mlで（第２日に移植）、第２の試料は１１７８pg/mlで（第２日に移植）、第３の試料は３８５０pg/mlで（第３日に移植）評価され、最後の試料は陰性コントロールでありアッセイ法に使用された希釈剤に対応していた（胚上清と同じ条件に保存されたが胚を含まない胚培養培地）（図２）。
胚上清中のｓＣＤ１４６の存在を確認するため、発明者らは種々のｓＣＤ１４６濃度を用い４つの試料についてウエスタンブロット解析を実施した。ＥＬＩＳＡにより、第１の試料は２２０pg/mlで（第２日に移植）、第２の試料は１１７８pg/mlで（第２日に移植）、第３の試料は３８５０pg/mlで（第３日に移植）評価され、最後の試料は陰性コントロールでありアッセイ法に使用された希釈剤に対応していた（胚上清と同じ条件に保存されたが胚を含まない胚培養培地）（図２）。
胚は第２日（Ｄ２）又は第３日（Ｄ３）に移植されたので、発明者らは胚上清中のｓＣＤ１４６濃度をＤ２及びＤ３に比較した。Ｄ２又はＤ３移植間でｓＣＤ１４６濃度に有意差は示されなかった（ｐ＝０．３６）（図３）。
ｓＣＤ１４６濃度及び胚の品質
実際には、胚の選択は形態学に基づく。これは移植前に査定される唯一の判断基準である。よって、発明者らはｓＣＤ１４６の濃度と、イスタンブール分類により定義される胚の品質との関係を研究した。発明者らは、ｓＣＤ１４６の濃度が胚のタイプと相関しないことを見出した（図4）。
実際には、胚の選択は形態学に基づく。これは移植前に査定される唯一の判断基準である。よって、発明者らはｓＣＤ１４６の濃度と、イスタンブール分類により定義される胚の品質との関係を研究した。発明者らは、ｓＣＤ１４６の濃度が胚のタイプと相関しないことを見出した（図4）。
ｓＣＤ１４６濃度と体外受精の結果
発明者らは、着床胚と非着床胚との間のｓＣＤ１４６濃度の有意差を見出し（図５）、低濃度は高い着床可能性に連関していた。共変数のイスタンブール分類及びＦＳＨ率に調整して逐次多変量解析をした後、発明者らは低ｓＣＤ１４６濃度と着床との間の有意な相関を確認し、Wald chi-square５．３９（ｐ＝０．０２）であった。
発明者らは、着床胚と非着床胚との間のｓＣＤ１４６濃度の有意差を見出し（図５）、低濃度は高い着床可能性に連関していた。共変数のイスタンブール分類及びＦＳＨ率に調整して逐次多変量解析をした後、発明者らは低ｓＣＤ１４６濃度と着床との間の有意な相関を確認し、Wald chi-square５．３９（ｐ＝０．０２）であった。
着床のバイオマーカーとしてのｓＣＤ１４６の有用性
算定されたＲＯＣ曲線で、着床に対する至適感度（７１％）及び特異性（６０％）は１１６４pg/mLのｓＣＤ１４６で見出されることが示された。この閾値では、妊娠の百分率は約４０％増加した。この増大は、最良、良好及び不良の胚の品質の３つのイスタンブール群において、それぞれ２０、３０及び７７％の増大で維持される（図６）。
算定されたＲＯＣ曲線で、着床に対する至適感度（７１％）及び特異性（６０％）は１１６４pg/mLのｓＣＤ１４６で見出されることが示された。この閾値では、妊娠の百分率は約４０％増加した。この増大は、最良、良好及び不良の胚の品質の３つのイスタンブール群において、それぞれ２０、３０及び７７％の増大で維持される（図６）。
結論
多胎妊娠のリスク及び関連合併症を回避するため、胚１個だけを選択して移植することが必要である。胚の着床可能性の予測はしたがって、体外受精における必要事項を構成する。本実験で発明者らは、ｓＣＤ１４６は着床可能性が最も高い胚を選択するのに早期、非侵襲的且つ革新的なバイオマーカーに相当することを示した。興味深いことに、このバイオマーカーは、これまでに唯一の選択基準であったイスタンブール分類により定義される形態学的基準からは独立である。したがって、ｓＣＤ１４６を用いた胚選択は、何れの胚の群であっても有用であり得る。それゆえｓＣＤ１４６は、胚選択の精度及び体外受精有効性を向上させる、胚選択の第一のバイオマーカーを表す。
多胎妊娠のリスク及び関連合併症を回避するため、胚１個だけを選択して移植することが必要である。胚の着床可能性の予測はしたがって、体外受精における必要事項を構成する。本実験で発明者らは、ｓＣＤ１４６は着床可能性が最も高い胚を選択するのに早期、非侵襲的且つ革新的なバイオマーカーに相当することを示した。興味深いことに、このバイオマーカーは、これまでに唯一の選択基準であったイスタンブール分類により定義される形態学的基準からは独立である。したがって、ｓＣＤ１４６を用いた胚選択は、何れの胚の群であっても有用であり得る。それゆえｓＣＤ１４６は、胚選択の精度及び体外受精有効性を向上させる、胚選択の第一のバイオマーカーを表す。
最高の着床可能性を備えた胚の早期、正確且つ厳密な選択は事実上、体外受精における妊娠の確率を増大するのに最良の手法を構成する。
発明者は、その実験において、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットの双方により胚上清中のｓＣＤ１４６の存在を証明した。この検出は、最短第２日の胚上清中で達成できた。胚盤胞の早期段階において検出されることができるバイオマーカーはこれまでにないので、これらの結果は、体外受精において有利なバイオマーカーとしてのｓＣＤ１４６を明示するものである。さらに、センターの大多数は第２日又は第３日に胚を移植し、これはｓＣＤ１４６検出に適合する期間であるので、ｓＣＤ１４６の使用の別の利点が示される。最後に、ｓＣＤ１４６の早期検出はコスト低減にも関わる。
胚上清中のｓＣＤ１４６濃度は、着床可能性が最も高い胚を選択するのに、早期、非侵襲的且つ革新的なバイオマーカーに相当する。このバイオマーカーは有利なことに、妊娠するための時間とコストを低減することによって、体外受精の有効性を向上させる。
参考文献
Claims (10)
- 哺乳動物の子宮における胚の着床のバイオマーカーとしての、胚培養培地中に存在する可溶性ＣＤ１４６タンパク質（ｓＣＤ１４６）の使用。
- 体外受精によって得られる胚に関する有用な情報を得るため、及び好ましくは胚が哺乳動物の子宮内着床につき選択可能かどうかを判定するための方法であって、胚培養培地中にｓＣＤ１４６を投与するインビトロ工程、及び閾値との比較を含む、方法。
- 前記閾値を超える量でｓＣＤ１４６が存在することが、哺乳動物の子宮における胚着床不全の高リスクの指標であり、前記閾値以下の量でｓＣＤ１４６が存在することが、哺乳動物の子宮における胚着床成功の確率の指標である、請求項２記載の方法。
- 前記投与する工程が、インビトロ卵母細胞受精後２〜５日の間に、好ましくはインビトロ卵母細胞受精後第２日に実施される、請求項２から請求項３のいずれか一項記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項２から請求項４のいずれか一項記載の方法。
- 哺乳動物の子宮における体外受精胚の着床可能性を評価するため、及び任意に、着床不全のリスクが高い着床胚につき不適格と判定するための、請求項２から請求項５のいずれか一項記載の方法の使用。
- 哺乳動物の子宮内着床につき、体外受精胚を選択するため、及び好ましくは予備選択するための、請求項２から請求項５のいずれか一項記載の方法の使用。
- 体外受精（ＩＶＦ）によって得られる胚が、哺乳動物の子宮内着床につき選択可能かどうかを判定するための、検出可能なｓＣＤ１４６結合モノクローナル抗体を含むキットの使用。
- 任意に、胚培養培地中のｓＣＤ１４６に結合されると前記検出可能なモノクローナル抗体を明らかにする適切な基質と一緒に、及び任意に、コントロールを調製するために使用されるべき、ｓＣＤ１４６不含の薬学的に不活性な希釈剤と、又は既知濃度のｓＣＤ１４６を含む少なくとも１つの溶液、好ましくは検量線と一緒に、濃縮された剤形の検出可能なｓＣＤ１４６結合モノクローナル抗体と、、異なる既知濃度のｓＣＤ１４６を含むいくつかの溶液とを含む、キット。
- 前記検出可能な抗体が、フルオロフォア、磁気ビーズ、抗原エピトープ、特異的酵素の基質、特異的リガンドの結合ドメインから選択される検出マーカーでラベルされる、請求項９記載のキット。
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