JP2002519640A - 未受精卵の存在を示すためのアッセイ - Google Patents

未受精卵の存在を示すためのアッセイ

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、体外成熟(IVM)し、その後に体外受精(IVF)しうる未受精卵が哺乳類に存在する際に少なくとも１つの予想マーカーに対する特異的反応を示す、哺乳類の試料における少なくとも１つの予想マーカーについてのアッセイに関する。これは、未受精卵、吸引した場合には、MF-IIに体外成熟した後の卵が受精しメスの哺乳類へ着床した後に妊娠し得る際の測定に特に有用である。このアッセイは、体分泌物、唾液、血液、尿、子宮分泌物及び細胞からなる群から選択した試料に基づく。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 正常に排卵している女性は、各月経周期に約300個の未成熟な卵母細胞(卵)を
補充している。通常は、アポトーシスの進行中に、ただ１つを除いて全ての卵母
細胞が排卵前に死滅する。深刻な男女の不妊症の特殊な症例に対する治療である
、従来の体外受精(IVF)は、成熟したヒト卵を取り出し、続いて成熟卵母細胞と
精子とを受精させることに基づいている。ヒト成熟卵母細胞の補充は、しばしば
関わっている女性に不快感や危険性を伴う幾つかの複雑な形態のホルモン治療法
によって成されている。これらのホルモン治療法は、夫の精子の質が良くないた
めにこれらのプログラムを受けている完全に正常な女性にIVFがますます提案さ
れているので、特に将来的に問題になるであろう。さらに、この種の治療は通常
、開始周期当たり20％の妊娠割合を生じるであろう。
【０００２】 ホルモン刺激の危険性、不快感及び費用のために、何年ものあいだ幾つかの他
の方法が試みられている。動物では、体外成熟(IVM)はIVF用の卵母細胞を調製す
る有効な方法となっているが、これまでのところ臨床的なヒトIVMについて記録
されている成功割合は低い(Cha, Trouson, Barnes, Russel)。 ホルモン刺激を回避するもっとも簡単な方法の１つは、全くホルモンで刺激し
ないことである。しかし、この治療法は限られた数の妊娠を提供しただけで、算
出される妊娠割合は開始周期当たり5％を越えない。
【０００３】 発明の要約 本発明は、女性を外因的にホルモン治療せずに、特に健康で活性化された前期
卵がさらに体外でMF-IIまで成長するようなタイミングと発達を予測し、それに
よって、女性がホルモンで治療されていない場合でも大多数の卵の退化を回避す
る試験系の可能性に関する。後期成長段階の卵、通常はMF-II段階の卵に常に焦
点を絞っている全ての他のこれまでのホルモンアッセイと対照的に、この手段は
、体外で成熟して受精できる未受精卵の吸引のタイミングをはかることを目的と
している。この方法により、15％より高い妊娠割合が達成される。
【０００４】 発明の詳細な開示科学的背景 卵核の成長は、複糸期に卵核胞として停止する。これは、ディシテート(dicyt
ate)段階と呼ばれる。この段階は、そのDNAがホイルゲン試薬のような核染色に
ほとんど親和性がない染色体が広く散在していることによって特徴づけられる。
ディシテート段階の卵の染色体は、リボ核酸(RNA)を活発に複製する枝とループ
の形態の側方突起を有する。突起は、下等な脊椎動物と幾つかの無脊椎動物の卵
にほとんど例外なく見られる「ランプブラシ」染色体に極めて似ている。RNAは
、卵自体の内部でタンパク質合成を目的とするメッセンジャーとして作用し得る
。カエルやヒキガエルの卵に関する研究の詳細な検証から、幾つかのRNAは哺乳
類の発達の初期形成体として作用しうることが示唆されている。これらの複雑な
問題を解明するのに要される付随的な研究結果が何であれ、ディシテート段階は
、明らかに静止期とみなすべきではない。なぜなら、卵母細胞は、小胞膜がごく
少数の平坦な上皮細胞からなる際に高度な代謝及び合成活性を同時に示すからで
ある。
【０００５】 ヒトの卵母細胞/小胞の発達は、時間と生物学的過程の双方において制御され
た機序である。全ての卵のうち99％は、発生(birth)以前でさえ減数分裂前期(つ
まりディシテート段階)で停止する。卵核胞崩壊(GVB)及び分裂中期I(MF-I)から
分裂中期II (MF-II)及び小胞の成長によって減数分裂を再開するさらなる発達の
ために、このプールから数百個の卵が選択され、毎月(月経周期)活性化される。 女性の生殖状態は、最終的には排卵処理をもたらす視床下部、前葉下垂体及び
卵巣との相互作用が複雑な周期性のものである。周期は、平均28〜30日(25〜35
日の幅がある)で繰り返される。第一期の月経は、4〜5日間続く。周期の最初の
日は第一期の最初の日、つまり月経の出血の最初の日である。第二の卵巣小胞期
は子宮内膜の増殖期に相当し、10〜16日続く(つまり、ばらつきがある)。次いで
排卵期(36時間)と続き、最後に子宮内膜の分泌期に相当し、通常14日間一定な黄
体期が続く。月経周期を理解するのに必須な３つの構成要素は以下のとおりであ
る： １. FSH/LH放出に関する視床下部のGnRH制御 ２. 排卵のための卵巣小胞の発達、及びその後の黄体形成、及び ３. 卵巣ホルモンによるFSH/LH分泌のフィードバック制御。
【０００６】 生殖周期の第２ハーフ中、黄体は発達し、エストロゲンとプロゲステロンの両
方を分泌する。エストロゲンは、子宮内膜で増殖活性を促進し続ける。他方、プ
ロゲステロンは、グリコーゲン(着床させるべき発達中の胚に重要)を含む分泌産
物で子宮内膜腺を拡張させる。子宮内膜血流が増し、らせん動脈がコイル化し、
ねじれる。周期の第２ハーフは、黄体期(卵巣)又は分泌期(子宮)と呼ばれる。次
いで、着床によって黄体の退行が生じない場合、エストロゲンとプロゲステロン
の分泌が急速に低下し、細胞外液体がなくなるために子宮内膜が縮小し、らせん
動脈が収縮し、細胞死と血管の崩壊を伴って子宮内膜血流が減少する。これらの
機会は、子宮内膜の基底層以外の全てが失われる月経出血期を最終的にもたらす
。月経出血の最初の日は、実際的な理由から月経周期の最初の日である。 卵の成熟は、受精し、胚発達する卵の発達の最終段階である。それは、２つの
一般的な過程：核の成熟と細胞質の成熟に分けられる。核の成熟は、減数分裂の
再開及びMF-IIへの進行として定義され、一方、細胞質の成熟は、活性化、前核
形成及び初期胚形成用に卵を調製するゲノム外の変更と定義される。
【０００７】 ディシテート段階の卵を取巻く小胞は、単層の平坦な顆粒層細胞からなる。卵
と小胞のさらなる発達の徴候は、顆粒層細胞数の一層の増加と顆粒層細胞間の空
間への液体の通過をも伴う。液体量が増加するにつれて、液体が占める空洞の大
きさは増し、融合して洞を形成する。小胞は、現在はグラーフ型と言われている
。洞の一層の拡張に伴って、卵は小胞の一方の側で位置を占め、顆粒層細胞の２
以上の層で囲まれる。これらの細胞の最も内部の層は形状が柱状で、排卵後の一
定期間、卵の周囲に残っている放線冠を最も内部の卵丘部分として構成している
。
【０００８】 核の成熟は、小胞の発達と同時に進行する。例えば、GVBとMF-Iの卵は、洞及
び前洞の小胞中にある洞の形成中に認められる。洞が十分に発達するまでに減数
分裂が終了し、最初の極体の突出が見られる。 各月経周期中に、数百個の卵がこの段階に達する。しかし、現在のところ説明
できない要因により、これらの大多数は閉鎖(atresia)に進行し、卵がアポトー
シス処理をうけて死滅する。卵が依然として小胞中にあるか又はその出現後に早
熟であるあいだの顆粒層細胞の最も内部の崩壊は、退化への変更を生じ、その結
果、卵の死滅に至る確かな徴候である。ごく少数、通常は１個のみが、発達に進
むであろう。
【０００９】IVFの技術背景 女性がFSHを受けると、１以上の小胞が閉鎖を避けてMF-IIに発達的に進む。 MF-IIとは、卵母細胞が１個の極体と拡張した丘複合体を有し、最終的に卵核
胞の崩壊を経過したものと理解される。これらの卵母細胞は、IVF用の卵母細胞
を通常扱っている当業者によって容易に認識される。MF-IIの卵は、精子細胞に
よって受精されるように調製され、受精が可能とされているタイプの卵である。
卵の発達におけるこれより早い段階では、これは現在のところ不可能である。
【００１０】 従来の体外受精(IVF)治療は、MF-IIの卵をできるだけ多く得ることを目的とし
ている。これは、小胞刺激ホルモン(FSH)を含む、女性の外的なホルモン治療に
よって得られている。rFSHつまり尿由来FSHは、100〜250IU/日の投与量で投与さ
れる。この治療は、しばしば8〜10日のあいだ続けられる。さらに、ブセレリン
のようなGNRHアゴニストを用いる毎日の処置が、治療に加えられる。この治療に
よって、これらの活性化した卵の大部分の退化が避けられる。このタイプのホル
モン治療には、常に高刺激症候群と他の副作用の危険性、例えば卵巣癌、吐き気
、不快感、浮腫、疼痛、薬物療法に対するアレルギー反応、鬱病及び体重増加の
危険性の増大が含まれる。これらの作用は全て、特に女性が健康でIVF治療の動
機が深刻な男性の不妊問題に起因している場合には判断しがたい。したがって、
現在、世界中で全IVF周期の30％以上が、問題は男性の要因であるにもかかわら
ず、女性に大量の薬物を与えて始められている。
【００１１】 健康なMF-IIの卵を得るために、女性のホルモン治療には、エストラジオール
、FSH、LH、プロゲステロン、PP14及び/又はPP12の血清ホルモンレベルのモニタ
ーが追加されている。さらに、健康なMF-IIの卵の吸引のタイミングは、小胞の
発達を超音波でスキャンして行われている。これらの臨床試験は全て、補充可能
なMF-IIの卵の健全さと数を強化するように考案されている。
【００１２】IVM IVMは、未成熟又は十分に成熟していない生殖体を用いて開始することが好ま
しい。女性では、卵は、丘塊が密集し、極体や卵核胞が見えない卵母細胞として
認識される。これらの卵は、通常のIVF治療に関与している者によって未成熟な
卵として容易に認識される。 ホルモンが投与されない場合は、正常に排卵している女性で見られるように、
卵母細胞は１個のみ成熟するであろう。卵が閉鎖に入るアポトーシス過程の開始
に先立って卵巣から未成熟な卵母細胞を放出し、その後さらに体外で卵を成熟さ
せることによって、女性はホルモン治療に伴う危険性と不快感を避けることがで
き、さらに十分な数の分裂中期II(MF-II)の成熟した卵を、その後の体外受精に
利用することができる。
【００１３】 核の成熟がMF-IIに進む卵母細胞は調製できるが、卵母細胞は着床前の発達を
終えるのには役立たない。発達能力以上に細胞質制御に関する重要性が、未成熟
なサルの卵母細胞で記載されている。顕微操作を用いることによって、卵質はMF
-II卵母細胞から除かれ、前期I卵母細胞に注入される。細胞質輸注で卵母細胞を
受けたサルは、卵質を注入していない卵母細胞と比較して妊娠割合を７倍に増し
た(Flood)。 これまでに発表されているIVMプロトコルは、先の排卵又は月経の開始から算
出される月経周期の所定の日を用いるか、又は洞小胞の最終的な発達前の単に都
合のよい日を用いるものである。これにより、0〜10％の妊娠割合が得られる。
【００１４】本発明 この発明は、特異的な前兆となるホルモンの測定はIVM法のための卵の吸引の
適当なタイミングを示すとの知見に関している。卵の吸引のタイミングを示すこ
の測定により、詳しくは体外で成熟し、受精し、さらには発達し得る卵の数が最
適化される。体外で成熟し、その後、受精、卵割、着床及び妊娠し得る未受精卵
が哺乳類に存在する場合のための予想マーカーとして特定の前兆となるホルモン
を同定することは、IVM周期における成功率を大きく増す。 未受精卵は、この特許出願において未成熟な卵(=卵母細胞)で、成熟した精子
細胞との接触によって減数分裂を終えず、精子細胞から遺伝物質を受容し、受精
細胞を形成する。卵の成熟に関する内分泌及び卵巣内部の調節は、MF-IIに体外
成熟した後の未受精卵が受精し、次に卵割し、次いでメスの哺乳類への着床後に
妊娠できるように、精密ではあるが複雑な物質組成の卵を特定の濃度又は濃度割
合にしておくものと現在は考えられている。
【００１５】 したがって、本発明の一つの観点は、体外で成熟し、その後受精し得る未受精
卵が哺乳類に存在する際に少なくとも１つの予想マーカーの存在又は量の詳細な
傾向が示される、哺乳類からの試料における少なくとも１つの予想マーカーの存
在又は量についてのアッセイに関する。 少なくとも１つの予想マーカーについてのアッセイは、メスの哺乳類由来の試
料に基づく。本発明の１つの具体例において、試料は、例えば体分泌物、体液、
細胞栄養素、小胞内容物、唾液、血液、尿、便、子宮又は膣の分泌物及び成分、
月経産物、上皮(epitelia)及び上皮由来成分、皮膚成分及び死んでいるか又は生
きている細胞からなる群から選択される試料である。当業者は、これらの各試料
の入手方法を容易に理解するであろう。
【００１６】 本発明の１つの具体例において、試料は、ペットのような哺乳類、例えばネコ
、イヌ又はモルモット；又は動物園の動物、例えば霊長類から生じる。本発明の
別の具体例では、哺乳類はラット又はマウスのような研究用動物である。さらに
好ましい具体例では、哺乳類は産業の一部であり、好ましくはウシ、ウマ、ブタ
、ミンク、ヤギ又はヒツジのような家畜動物である。現在もっとも好ましい具体
例では、哺乳類はヒトである。 本発明の１つの観点において、メスの哺乳類は卵の吸引前に試験される。１以
上の試験を行ってもよい。絶対的なカットオフレベル又は前記選択マーカーのプ
ラトー、増加もしくは減少のような相対的な測定のいずれかにより、IVM用の卵
の吸引のタイミングを予想することができる。
【００１７】 この明細書において、予想マーカーは、生物、物理又は化学の試験で濃度、色
、構造、追認及び/又は反応パターンを変えるいずれかの物質として理解される
べきである。多くの潜在的な予想マーカーが存在するものと考えられる。本発明
の１つの具体例において、アッセイは、少なくとも１つの予想マーカーがゴナド
トロピン(例えばFSH、LH、プロラクチン及びHCG)、チオイデア(thyoidea)ホルモ
ン(例えばTSH、T3及びT4)及びステロイドホルモン(例えば性ホルモン；エストラ
ジオール、エストロゲン、エストラトリオール、プロゲステロン及びテストステ
ロン；アンドロゲン：コルチゾン又はコルチソル)からなる群から選択されるホ
ルモンのアッセイである。本発明の別の具体例では、アッセイは、少なくとも１
つの予想マーカーが小さなペプチドホルモン(例えばGIP又はVIP)のアッセイであ
る。本発明の別の具体例では、アッセイは、少なくとも１つの予想マーカーがペ
プチドホルモン(例えばPP12、PP14、インヒビン：インヒビンA又はインヒビンB
；アクチビン(activin)又はα1もしくはα2グロブリン)のアッセイである。本発
明の別の具体例において、アッセイは、少なくとも１つの予想マーカーが減数分
裂活性化ステロール(MAS)脂質及びプロスタグランジンからなる群から選択され
る脂質であるアッセイである。本発明の別の具体例では、アッセイは、少なくと
も１つの予想マーカーがDNAフラグメント、mRNA及びtRNAからなる群から選択さ
れる核酸であるアッセイである。本発明の別の具体例では、アッセイは、少なく
とも１つの予想マーカーがLFN1、LFN2、LFN3、糖結合物、炭水化物、細胞栄養素
、インテグリン1のようなインテグリン及び炭水化物エピトープからなる群から
選択されるマーカーであるアッセイである。本発明の別の具体例では、アッセイ
は、少なくとも1つの予想マーカーがcAMPのような細胞内又は細胞間メッセンジ
ャーであるアッセイである。本発明のさらに別の具体例では、アッセイは、少な
くとも１つの予想マーカーがホスホジエステラーゼのような酵素又はホスホジエ
ステラーゼ阻害剤であるアッセイである。
【００１８】 タンパク質、ホルモン、脂質、核酸、細胞間メッセンジャー及び酵素の相互間
の相互作用がかなり複雑であるために、未受精卵の吸引のタイミングは、ある予
想マーカーのカットオフレベル及び/又は1以上の予想マーカーについての相対測
定値、つまり試料を異なるときに採取した際の同一マーカーの相対測定値、又は
同時に試料に存在する2以上のマーカーの相対測定値の組合わせに依存するもの
と現在は考えられている。 アッセイは、少なくとも１つの予想マーカーを含む。つまり、2つの予想マー
カー、例えば3、4、5又は6個の予想マーカーである。 アッセイの予測値は、2以上の予想マーカーの評価を組合わせた場合に著しく
増すものと考えられる。
【００１９】 2つの予想マーカー、インヒビンAとエストラジオール間の相関関係がIVM周期
の結果にいかに相関しているかについての実施例１及び２の記載に基づいて、当
業者は、他の予想マーカー間のかかる相関関係を決定し得るであろう。１つの具
体例において、周期における妊娠の可能性と、卵の吸引の1日、2日、3日、4日、5
日、6日、7日、8日又は9日前までもの試料中の調査対象である予想マーカー濃度
の相対的な増加又は相対的な減少とには重要な相関関係がある。別の具体例では
、周期における妊娠の可能性と、卵の吸引の1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日
、8日又は9日前までもの試料中の調査対象である予想マーカー濃度の絶対的な増
加、絶対的な減少又はプラトーとには重要な相関関係がある。さらに別の具体例
では、1日目、2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、7日目、8日目又は9日目まで
もの試料中の調査対象である予想マーカー濃度と周期における妊娠の可能性とに
は重要な相関関係がある。この具体例の１つの観点では、試料中の調査対象であ
る予想マーカー濃度とその周期の妊娠の可能性との重要な相関関係は、カットオ
フレベルが設定され、そのカットオフレベルより調査対象の予想マーカー濃度が
高いか又は低いかに周期の妊娠の可能性が相関するような二対の相関関係となる
。
【００２０】 本発明の１つの具体例では、本発明に記載されているように卵の吸引時をアッ
セイによって設定しているIVM周期の研究における妊娠割合は10％より高く、例
えば13％、15％、18％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28
％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％より高く又は40％より高くさえ
ある。 本発明の現在好ましい具体例では、2つの予想マーカーが選択される。つまり
、インヒビンAとエストラジオールである。実施例１及び２に示すように、エス
トラジオールとインヒビンAの増加はIVM周期の成功を予測している。 インヒビンAの増加前にエストラジオールの増加が認められる場合がある。そ
の場合には、インヒビンAの増加が認められるまでに、エストラジオールの濃度
が低下するか又はプラトーに達している可能性がある。さらにこの場合、エスト
ラジオールの増加は、インヒビンAの増加が主要な要因であるとの事実のために
、成功する可能性が高くなるように達成されるものと考えられる。これは、FSH
プライミング(priming)が行われる際のケースである(実施例３参照)。
【００２１】 本発明の現在もっとも好ましい具体例において、アッセイは、3つの特異的反
応と2つの選択マーカーについての結果からなる。最初の特異的反応は、月経周
期の3日目における血液試料中の10pg/mlより低いインヒビンA濃度の測定である
。第2の特異的反応と結果は、3日目から卵の吸引日までの80％より高いインヒビ
ンA濃度の増加である。第3の特異的反応と結果は、3日目から卵の吸引日までの8
7％より高いエストラジオール濃度の増加である。つまり、具体例の１つの観点
では、女性を月経周期の3日目に排出された血液の試験に付し、血液試料中のイ
ンヒビンAとエストラジオール濃度が測定される。インヒビンA濃度がこの血液試
料中で10pg/mlより低い場合には、この周期はIVM周期ではない。しかし、インヒ
ビンA濃度がその血液試料中で10pg/mlより高いかそれに等しい場合、第2の特異
的反応と第3の特異的反応が認められなければ、新しい血液試料を4、5、6、7、8
、9、10、11、12、13、14、15及び16日目に回収する。第2の特異的及び/又は第3
の特異的反応が認められる場合は、観察日が卵の吸引日であるべきである。実施
例２の結果に基づけば、卵の吸引時がこれらの3つの特異的な反応に合致してい
るIVM周期により、妊娠割合は12％より高く、例えば16％、22％、25％、26％又
は28％よりさえ高くなるものと考えられる。
【００２２】 当業者に認識されるように、哺乳類の試料における予想マーカーの測定は常套
手段である。本発明の１つの観点において、アッセイは、医者や高等な医療機器
の補助なしに特異的な反応を比較し編集できるように準備する。しかし、当業者
に理解されるように、相当数の予想マーカーは、現在のところ高価な装置なしに
は測定できず、研究室のセットに試料を移す必要がある。この場合アッセイの結
果は哺乳類における卵吸引のタイミングを示す。 濃度、相対的な増加、相対的な減少、絶対的な増加、絶対的な減少、プラトー
及びカットオフ値が複雑であるために、本発明の１つの観点は、IVM処理が考え
られる月経周期中に記入するスキームである。１つの具体例では、このスキーム
は、月経周期の各日のための縦列と各予想マーカーのための行からなり、予想マ
ーカーの測定値を得るにしたがって各セル(欄)に記入してゆくようにする。予想
マーカーにおける変更を自動、半自動及び手動で算出することにより、特異的反
応の結果が説明しやすくなるであろう。
【００２３】超音波のガイダンス 本発明の１つの具体例で、予想マーカーについてのアッセイは最初の選択基準
として用いられる。この基準を満たせば、女性を子宮と卵巣の超音波測定に付す
。超音波測定の評価により - 多数の洞小胞、 - 大きさ約10mmの導小胞(leading follicle)、 - 均一な小胞のコホート、 - 約3mm以上の子宮内膜の厚み、及び - 子宮内膜内層の三層構造の始まり が測定された場合、卵吸引、MF-IIへの体外成熟、受精、着床及び妊娠を成功さ
せるための正確な時間を見出せる見込みは非常に高い。
【００２４】 本発明の現在好ましい具体例で、卵は、卵巣小胞の直径が8〜12mmの女性から
得られる。このように小さい小胞の利点は、先の深刻なホルモン治療なしに月経
周期のこの時に小胞が実質的な数で存在し、小胞が超音波処理によって認められ
、かつ超音波で誘導する小胞の経膣穿刺を実施して卵母細胞を取り出せることで
ある。 当業者によれば、他の大きさの卵が他の哺乳類から吸引されることは理解され
るであろう。 本発明の１つの具体例において、女性の月経周期に関する一般的な知識は、卵
の吸引のタイミングに組み込まれる。例えば吸引は通常6〜17日目、つまり通常
は9〜11日目のあいだに行われる。
【００２５】 したがって、本発明の１つの具体例において、卵の吸引のタイミングを決定す
る方法は、以下の工程からなる： a) 哺乳類の試料において少なくとも１つの予想マーカーをアッセイし； 工程a)のアッセイにおける特異的反応の結果が、体外で成熟し、その後哺乳類で
受精し得る未受精卵の存在を予測するまで、 b) 月経の出血の最初の日に対する時間を求め； 日が月経周期の6〜17日目のあいだである場合には、次いで c) 哺乳類の卵巣の超音波図を評価し； 小胞の大きさが8〜12mmで、小胞のコホートが単一である場合には、次に d) 哺乳類の子宮の超音波図を評価し； 子宮内膜の厚みが約3mmより厚く、子宮内膜内層の初期の三層構造が認められる
場合には、卵の吸引時は適当である。しかし、上記工程のいずれを欠いても周期
はIVMにおそらく不適当で、卵の吸引は方法を繰り返す次の周期まで延長すべき
である。
【００２６】 減数分裂を終えて発達に適応性となるIVM卵母細胞の能力は、卵母細胞の吸引
前のFSHプライミングによって増強される。ヒトIVMにおいて、短いFSH刺激は患
者当たりの回収される卵母細胞数を2倍にするのみならず、48時間後にMF-IIに達
する卵母細胞の割合を増す。この方法の１つの具体例では、月経周期の3日目及
び/又は4日目及び/又は5日目にFSHのようなホルモンで女性を治療し、その後治
療を中断する。実施例３において、成熟割合と卵割割合の増加は、即時のFSHプ
ライミングに比較して最後の注入から吸引のあいだに時間をおいたFSHプライミ
ング群で認められた。最後の注入から吸引のあいだに時間をおいたFSHプライミ
ング群では、未刺激の卵母細胞に比較して成熟割合の増加が認められた。しかし
、成熟したMF-II卵母細胞の卵割割合は影響を受けなかった。それは、双方の群
で高かった。小胞の成長における初期のアポトーシス期又は人為的な安定期は、
発達能力に関して最終的な排卵前の小胞の成熟を模している可能性がある。この
ようにして、人為的な安定又はエストラジオールレベルの低下は、未成熟な卵母
細胞に上記シグナルをもたらす卵巣でのアポトーシス過程を引起こして生じる。
このようなエストラジオールレベルの低下は、月経周期の約10日目に期待される
。ホルモンの刺激がない女性では、卵母細胞の取出しは月経周期の10日目に行う
ことが好ましい。なぜなら、その日は、前期の多くの卵母細胞に統計的に関わっ
ているからである。
【００２７】 本発明の１つの観点において、月経周期の3、4及び5日目にFSHのようなホルモ
ンで最初に治療し、次いで治療を中断することは、女性に有益である。この治療
法で、女性におけるエストラジオールの血液レベルは、非成長(成長停止)小胞で
間接的に測定される成熟卵母細胞を選択する目的でモニターしてもよい。アポト
ーシスが運命づけられている初期アポトーシスの卵母細胞は、小胞の穿刺中に卵
巣から容易に離れ、小型の丘塊を有することを特徴とする。次いで、エストラジ
オールレベルのプラトー又は低下が認められるまでに、卵母細胞を取出す。エス
トラジオール濃度において観察されたプラトー又は低下は、月経周期の3日目か
ら卵の吸引日までのエストラジオール濃度の事前の増加による。１つの具体例で
は、卵の吸引時はエストラジオール濃度の増加時、つまりエストラジオール濃度
のプラトー又は低下前である。さらに好ましい具体例では、エストラジオール濃
度のモニターはインヒビンA濃度のモニターに追加される。 したがって、本発明の１つの具体例は、適当なFSH薬物療法と上記アッセイか
らなるキットである。任意に、キットは、さらにアッセイ用試料又は試料類を得
るための手段を含む。
【００２８】 引用文献
【００２９】 以下に記載する図面と実施例は本発明の具体例の例示であり、本発明がこのよ
うに限定されることを意図しないものと理解される。 実施例 雄性要因(male factor)及び/又は官疾患(tubal disease)のため、IVF/ICSI用
に呼んだ全部で83人の規則的に周期のある女性を研究に含めた。研究は、地域の
倫理委員会で承認された。女性は全て、同意書を書いた後研究に参加した。ホル
モンのプロフィル(ゴナドトロピン、インヒビンA、インヒビンB、エストラジオ
ール及びプロゲステロン)を、モニターした。ホルモンのプロフィルは、Groome(
1996)によって記載された方法でインヒビンA及びインヒビンBのプロフィルを測
定する以外はRIA(イムノ1、Bayer)で測定した。
【００３０】 10mmの小胞が超音波で検出された後に、未成熟な卵を回収した。Carl Woodに
よって記載されたCook Ltdの吸引針を用いた。未成熟な丘又は卵は機械的障害に
より感受性である、又は卵が少量の液体から針の末端に力で吸込まれる場合に小
さい小胞中の針は卵を直接損傷するとの仮定のもとに、吸引圧は100mmHgに下げ
た。 小胞を穿刺した。吸引後、Trounsonらによって記載されているようにヘパリン
(100IU/ml)を加えたへペス及び重炭酸緩衝液を有するアール平衡化塩溶液で針を
洗浄した。 小胞の吸引液はチューブで実験室に移し、孔度70μmの胚(embryo)フィルター
で洗浄した。赤血球と他の小さい細胞はフィルターで洗浄し、卵母細胞と大きな
細胞フラグメントは培養ペトリ皿に回収した。完全に多層化されているか、散在
しているか又は全く層化されていないもののいずれかとして丘細胞の存在に基づ
いて未成熟な卵母細胞を同定し、分類分けした。
【００３１】 卵母細胞は、ピルビン酸ナトリウム0.3mM、rec-FSH 0.075IU/ml (Gonal-F; S
erono)、hCG 0.05IU/ml(Profasi; Seerono)及びアルブミン1％を補足した組織培
養培地199(TCM 199; Sigma)又はBBEM(Medicult, Denmark)で成熟した。その後、
エストラジオール1μg/mlと、アルブミンの代わりの濃度を増したHSA(5％)又は
患者血清(10％)を培地に補足した。 卵母細胞は、ヒアルロニダーゼ(IVF Science, Sweden)と機械的なピペッティ
ングで露出させた。運動型の精子は、Puresperm(登録商標、Cryos, Denmark)の
勾配分離又はスイムアップで調製した。ICSI用に、露出させた卵母細胞を5μl滴
の精子予備培地(Medicult, Denmark)に個々に入れ、2μlの精子懸濁液をPVP 10
μl滴に入れた(IVF Science, Sweden)。全てのMF-II卵母細胞をISCIにより受精
させ、次いで10μl滴のBBEMに入れて5％CO2で培養し、37℃で空気を湿潤化させ
た。受精から約10〜20時間後に、成功した受精の測定として前核の存在について
300Xで卵母細胞を調べた。胚を2〜3日目(0日=受精日)まで培養し、適当な胚(最
大2個)を女性に戻した。適当な胚は、卵割したものである。
【００３２】実施例１ ：IVM周期におけるインヒビンA及びエストラジオールの分析 関連する内分泌パラメータを入手できた83個の治療周期のデータを示す統計値
を表１に示す。これらの83個の治療周期により、10件の妊娠が生じた。
【００３３】
【表１】 *非子宮傍組織試験を用いる。データは、正常な分布にしたがっては分布してい
ない。
【００３４】 表１は、3日目からのインヒビンAの増加が妊娠の生じる周期で高く、エストラ
ジオールの増加は著しくなく、エストラジオールの増加で増強されるインヒビン
Aの増加は、妊娠が生じる周期で著しく高いことを示している。 増殖性と非増殖性との治療周期を識別するためだけに、血清インヒビンAとエ
ストラジオールの分析能力をその後分析した。この目的のため、種々の識別子(d
iscriminator)を用い、データと妊娠の可能性との統計的な相関関係を決定した
。
【００３５】
【表２】
【００３６】
【表３】
【００３７】
【表４】
【００３８】
【表５】
【００３９】
【表６】
【００４０】
【表７】
【００４１】 増殖と非増殖との治療周期を識別するための血清インヒビンAとエストラジオ
ールの分析組合わせ能力
【表８】
【００４２】
【表９】
【００４３】
【表１０】
【００４４】
【表１１】
【００４５】
【表１２】
【００４６】 上に示したデータは、血清インヒビンAのレベルがIVM周期での成功に関する強
力な予測物であることを示している。これらのデータは、インヒビンAレベルが
月経周期の3日目で10pg/mlより高い周期では妊娠しないことを示している(表２)
。さらに、インヒビンAが月経周期の3日目に9pg/mlより高い群でのみ妊娠が生じ
ている(表３)。 3日目のインヒビンAの絶対レベルのみならず、3日目から卵の回収(OPU)の日ま
での血清インヒビンAの上昇もIVM周期の成功を予測している。例えば、増殖性周
期は、3日目からOPUの日までの少なくとも80％の血清インヒビンAの上昇に強力
に相関している(表４及び表５)。
【００４７】 エストラジオールに関するデータは、増殖性周期が3日目からOPUの日までの少
なくとも87％の血清エストラジオールの上昇に相関していることを示している(
表６及び表７)。 血清インヒビンAとエストラジオールの相伴う上昇は、IVMの成功についての良
好な予測物であると考えられる。3日目からOPUの日までのインヒビンAとエスト
ラジオールの上昇の組合わせは、増殖性周期の非常に良好な予測物である(表８
、表９及び表１０)。また、この予想により、3日目からOPUの日までのインヒビ
ンAが80％より高く増加しない周期では妊娠せず(表１１)、インヒビンAが増加し
エストラジオールが増加しない周期では妊娠しない(表１２)といった不成功が分
かるであろう。
【００４８】実施例２ ：IVM周期の将来的な分析のためのインヒビンAとエストラジオールパラ
メータの使用 卵の吸引に進行する周期を決定するための、インヒビンAとエストラジオール
の分析を用いる実施例１で測定したパラメータの予想される作用
【００４９】
【表１３】
【００５０】
【表１４】
【００５１】
【表１５】
【００５２】
【表１６】
【００５３】
【表１７】
【００５４】 これらのデータは、非生産的であることが運命づけられている周期は、治療周
期における初期のインヒビンAと、周期の後期におけるインヒビンAとエストラジ
オールの測定値に基づいて中断され得ることを示している(表１３、表１４、表
１５、表１６、表１７)。これらの測定は、IVM周期の効果を非常に増すであろう
。これまでに回収されたデータは、患者それぞれが周期の初期にインヒビンAが
高い周期(未妊娠)と周期の初期にインヒビンAが低い周期(妊娠)とを交替できる
ことを示している。
【００５５】実施例３ ：FSHプライミングの影響 小胞から除いた際に自発的に減数分裂を再開する未成熟卵母細胞の能力は、Pi
ncusとEnzmanによって1935年に最初に立証された。小胞由来のヒト卵母細胞は、
他の哺乳類より程度は低いが体外で減数分裂を再開し、これを終えることができ
る(Edwards, 1965)。未刺激卵母細胞の成功した成熟が報告されている(Chaら、1
991；Trousonら、1994；Barnesら、1996；Russellら、1997)。これらの卵母細胞
が細胞質内精子注入(ICSI)に付される際、受精割合は高くなるが(Russelら、199
7)、発達上の可能性は低いことが報告されている(Cha及びChian, 1998；Barnes
ら、1996)。IVMプロトコルは治療期間が短く比較的簡単で、従来のIVFに比して
費用を減らす。さらに、卵巣の排卵過度、特に高刺激症候群の副作用がない。こ
れまでのヒトの試験では妊娠割合は低かったにもかかわらず、実験動物での成功
の記録は勢いづいている。サルでは、FSHプライミングは、体外で卵母細胞の核
及び細胞質の成熟を増強することが分かっている(Schramm及びBavister, 1994)
。小胞内でのFSHレベルの増加は、ヒトにおいて卵母細胞の成熟を体内で完了す
るのに必要な陽性シグナルの発生と一致している(Gomezら、1993)。短いFSH刺激
は、体外成熟後に分裂中期IIに達する卵母細胞の割合を増すことが分かっている
(Wynnら、1998)。 この将来に関する無作為化した予備研究で、体外成熟した未成熟な卵母細胞の
発達上の可能性は吸引前にFSHプライミングで改善されるか否かを調査した。
【００５６】材料と方法 雄性要因及び/又は官疾患のため、IVF/ICSI用の夫婦を研究に含めた。女性は
最年少で18歳、最年長で38歳で、平均24〜35日長の正常な排卵周期と18〜29kg/m 2 の体容量指数(body mass index)(BMI)を有していた。高プロラクチネミ(hyperp
rolactinaemi)、多嚢胞性卵巣症候群のような内分泌異常を原因とし、卵巣高刺
激周期を予め制御して3個未満の卵母細胞を取出している不妊症の患者は全て除
いた。さらに、周期の3日目にFSH値が上昇(＞15IU)した女性は全て除いた。 研究は、地域の倫理委員会で承認された。全ての夫婦が、同意書を書いた後研
究に参加した。最初の実験は、雄性要因のためにICSIを予定した夫婦から補充し
た20人の患者を含む将来に関する無作為研究であった。女性は、2つの群に無作
為に分けた。群I(n=10周期)は刺激を受けず、群II(n=10周期)は最初の3日間rec-
FSH(Gonal-F, Seron)を受けた。超音波で10mmの導小胞を確認した後に、吸引を
行った。全ての卵母細胞は、ICSIの36時間前に体外で成熟した。
【００５７】 第2の実験では、引き続き12組の夫婦を含めた。全女性が吸引前にrec-FSH (Go
nal, Serono)プライミングを受け、3日目から毎日150IUを投与された。5人の患
者は3日間150IU/日の所定量で最初の実験の群２と同じ刺激を受け、10mmの導小
胞が認められた後、吸引に付した。残りの7人の患者は導入小胞が10mmになるま
で刺激が続けられ、72時間後に吸引を行った。全卵母細胞は、ICSIでの受精まで
48時間培養した。 全患者で周期の3日目に経膣超音波を行い、FSH、LH、エストラジオール、イン
ヒビンA及びインヒビンBのベースラインを得た。ホルモンのプロフィルは、吸引
の日まで3日間続けた。卵巣嚢胞の場合には、周期は中断した。第二の超音波検
査は6〜7日目に行い、その後小胞の大きさによって毎日又は2〜3日の間隔で超音
波を行った。 双方の実験で、17-β-エストラジオールからなる子宮内膜プライミングは卵母
細胞を取出した日に始め、女性に一日当たり3回経口で2mgを与えた。吸引日に超
音波で6mm未満の厚みの子宮内膜は、認められなかった。吸引から2日後に膣内プ
ロゲステロン座薬で治療を始め、妊娠試験まで続けた。エストロゲンとプロゲス
テロンは、妊娠試験が50日の妊娠期間まで陽性の場合に続行した。
【００５８】 卵母細胞は、Trousonら(1994)によって記載されているように、吸引圧を減ら
した17-Gクック針(Cook needle)を用いて経膣で回収した。小胞の吸引物はチュ
ーブで研究室に移し、孔度70μmの胚フィルターで洗浄した。成熟と受精はSmith
ら(1998)によって詳細に記載されているが、手短に言えば、ピルビン酸ナトリウ
ム0.3mM、ペニシリンG 1500IU/ml、硫酸ストレプトマイシン50mg/ml、エストラ
ジオール1μg/ml(全てSigma)、rec-FSH 0.075IU/ml(Gonal-F; Serono)、hCG 0.5
IU/ml (Profaasi; Serono)及び患者血清(10％)を補足した組織培養培地199(TCM
199;Sigma, Roedorve, Denmark)で卵母細胞は成熟した。患者の血清は、吸引日
に得た。卵母細胞は、5％CO2中で37℃のパラフィンオイル下のIVM培地25μl滴で
個別に培養した。卵母細胞は、核膜がない際に卵核胞が崩壊するものとして分類
わけし、最初の極体が押出された際に成熟した分裂中期II(MFII)卵母細胞として
分類分けした。 ICSIでの受精は、全ての分裂中期II卵母細胞で行った。次いで、卵母細胞をIV
F培地(Medicult, Copenhagen Denmark)10μl滴に入れ、受精から2日後にFalcon
ペトリ皿で油中で培養した。胚は1〜4のスケールでスコアをつけ、タイプ1及び2
(フラグメント化10％未満)は移動可能と考えた(Deschachtら、1988)。最大2個の
胚を移した。胚の発達割合は、注入した卵母細胞の全数のうち移動可能な胚の数
として定義した。着床割合は、置換した胚の全数のうち超音波検査で認められた
妊娠嚢(gestational sac)の数として定義した。
【００５９】超音波測定 小胞の直径は、7.5MHzの経膣トランスデューサー(Bruel & Kjaer)を用いる経
膣超音波スキャンニング中に同じ観察者によって測定した。小胞の直径は、同じ
スキャンプレート中でもっとも長い小胞軸及びそれに垂直な軸の平均として算出
した。統計方法 統計分析は、学生によってT-試験で行った。正常な分布を示すホルモン変化が
ないために、母数によらないMann-Whitney U-試験は、不対データと対データのP
ratt試験との統計的に著しい違いを分析するのに用いた。有用性は、pが0.05よ
り小さい際に著しいと考えた。
【００６０】結 果 患 者 実施例１で、女性の平均年齢はFSHプライミングのない群で31歳(28〜36歳の幅
)及びFSHを受けた群で32歳(28〜36歳の幅)であった。これは、実施例２の女性の
年齢(平均32歳、27〜37歳の幅)とあまり異ならない。不妊期間を含む他の臨床的
な特徴、不妊の原因及びこれまでのIVF周期数は、群全体に類似していた。最初の実験：成熟及び胚の発達 20人の女性を含む最初の実験で、77個の卵母細胞をIVMに用い、62個(81％)が3
6時間後にMFIIに成熟した。ICSIでの受精後、2PNの受精が49個(79％)で認められ
、これらのうち45個(72％)が卵割した。胚の発達割合は40/62 (65％)で、着床割
合は5/33(15％)であった。開始した周期当たりの臨床上の妊娠割合は、5/20(25
％)だった。患者の1人は妊娠8週目に流産し、残りの患者は進行した。FSHプライ
ミングは、卵母細胞の成熟、受精割合、卵割割合又は胚発達のいずれにも全く影
響しないことが分かった(表１８)。全部で5人が妊娠した。1人は健康な男児を産
み、1人は妊娠8週で流産し、残りは妊娠が32週以上続いた。
【００６１】ホルモンプロフィル 2つの群間で、3日目と吸引の日のエストラジオール、FSH、LH、インヒビンA及
びインヒビンBレベルにそれぞれ違いはない(表１９)。非刺激群で、小胞期のFSH
レベルは、個々間には大きな変化が見られるが、刺激群の値と異ならない。血清
エストラジオールのレベルは、非刺激群で3日目から6〜7日目に同レベルで残存
していた。吸引日は、著しく増加することが認められた。刺激した群で、エスト
ラジオール濃度は、吸引前のプラトー期で初期(6〜7日目)に増した。2つの群で
、未熟なLHピークは認められなかった。 インヒビンAのレベルは刺激した群で初期に増加し、非刺激群で後に増加する
エストラジオールのレベルと同じパターンを示した。非刺激群で、インヒビンB
のレベルはインヒビンAよりも早く増加した(6〜7日目)。この時に、刺激した群
でも増加が認められたが、レベルは非刺激群の3倍で、インヒビンBの著しい減少
は6〜7日目から吸引までに認められた。
【００６２】第２実験 ： 12人の女性を含む第2実験では、38個の卵母細胞をIVMに用い、48時間後に27個
(71％)が成熟し、ICSIで受精した。受精割合と卵割割合はそれぞれ61％と53％で
、これは実施例１で得た受精割合と卵割割合と異ならなかった。15個の胚を10人
の患者に移し、いずれも凍結保存しなかった。妊娠した1人は健康な女児を産ん
だ。この群での胚の発達は56％で、着床割合は7％であった。小胞が10mmになる
まで6日目までの3日間、150IU/日の所定量から刺激を延長することによって、吸
引日に大きさの増した小胞を得て、血清中のエストラジオールレベルを増した。
しかし、吸引あたりに得た卵母細胞数は増加しなかった(表２０)。安全性 婦人科として言及される感染、出血又は腹痛による入院は、この研究では観察
されなかった。子宮外妊娠も認められなかった。
【００６３】論 考 我々が知る限り、これは、卵母細胞の体外成熟後の着床割合が15％で、吸引当
たりの妊娠割合が25％であることを報告する最初の研究である。この研究の未成
熟な卵母細胞は、体内での過剰排卵と成熟の後に回収したものとほぼ同じように
機能するものと思われた(Meldrumら、1998)。 刺激していない規則的な周期のある女性から回収した卵母細胞数は、Barnesら
の研究(1996)で回収し成熟した卵母細胞の収率と異ならなかった。組換えFSHで
の患者の予備治療は、回収される卵母細胞数を増やさなかった。先の研究は、相
容れない結果を生じている。Wynnら(1998)は、FSHプライミングのない女性に比
較してFSHプライミングをした規則的な月経のある女性では、回収される卵母細
胞数は増大することを報告しているが、Trousonら(1998)は、得られた卵母細胞
数に全く相違はないことを立証した。先の知見は、補充される小胞数は先の黄体
期と同じくらい初期に決定し(Gougeon及びTestart, 1990)、短い初期のFSH刺激
は補充し得る未成熟卵母細胞数を変えないことを示唆している。これは、この研
究結果に一致している。実施例２でFSH量が増え、小胞の大きさが増すにしたが
って、吸引時に卵母細胞を得る機会は増えないことが認められた。これは、hCG
不在下でこれらの大きな小胞から卵母細胞を得る機会は非常に少なかった前記の
文献(Templetonら)に合致している。
【００６４】 この研究で認められる成熟、受精及び卵割の割合は先の研究の知見と矛盾がな
いが、高い妊娠割合と高い着床割合は卵母細胞の胚発達の改善を示すことが認め
られた。幾つかの要因が、このことについての原因となっている可能性がある。
IVM卵母細胞の胚発達は、先のFSHプライミングによって改善され得る。アカゲザ
ルでは、短いFSHプライミングは成熟と卵滑割合を改善した(Schram及びBavister
, 1994)。ヒトでは、刺激した周期から未成熟な卵母細胞を移した後に妊娠した(
Nagyら、1996、Liuら、1997、Jaroudiら、1997、Edrisingheら、1997)。 最近、Wynnら(1998)は、FSH予備処理後の卵母細胞の成熟割合が増したことを
報告している。しかし、最初の実験で、卵母細胞採取前の女性のFSHプライミン
グは体外成熟の割合を改善しなかった。認められた相違には、2つの説明：(1)使
用される培養条件、又は(2)吸引のタイミングが可能である。受精のタイミング
と培養条件は重要な要因で、これらはSmithら(1999)によって論議されている。
卵母細胞の吸引は、Wynnらの研究では所定日(月経周期の7日目)に行われるが、
この研究での吸引の日は小胞の大きさによっている。刺激した群では、吸引の日
は非刺激群(平均10日目)に比べて早く(平均9日目)行ったが(表１９)、吸引の日
は2群で同様に定めた。小胞の大きさは超音波でモニターし、10mmの導小胞が認
められた後に卵母細胞を採取した。
【００６５】 MII卵母細胞は、Wynnら(1998)による研究では受精しなかった。この研究では
、FSHプライミングは受精割合にも卵割割合にも全く影響しなかった。これは、T
rousonら(1998)のデータと矛盾がない。彼らは、自然な周期の女性を組換えFSH
を用いて3日間治療したところ、体外での成熟割合と受精割合には影響がなかっ
たことを報告している。規則的に月経のある女性の群では、女性達自身のFSH刺
激が体外成熟に適した卵母細胞を得るのに十分であるものと考えられる。これま
での研究から、3日目の小胞期FSHにおける広範囲にわたる個々間の相違及び最大
FSH濃度の個々間の著しい変化が立証されていることが知られている(Schipperら
、1998)。この個々間のFSHレベルの変化は、FSH閾値の相違とFSHに感受性の卵巣
における相違を反映しており、これは、FSHレベルが異なるが成熟割合と受精割
合の相違がない理由の１つとなり得る。
【００６６】 非刺激群では、吸引の日にエストラジオールとインヒビンAの血清濃度が増す
ことが観察された。これは、優勢な小胞の選択に付随していることが知られてい
る(Schipperら、1998)。インヒビンAよりも早く増したインヒビンBの濃度及び両
方のホルモンのレベルは、吸引の日まで維持した。これは、吸引の日が10mmの優
勢な小胞を確認した直後であったが、先の研究(Schipperら、1998；Groomeら、1
996)及び我々の超音波イメージに合致している。これは、これらの場合のIVM用
に選択した卵母細胞が閉鎖に向かう小胞から得られたことを意味し、卵母細胞の
胚の発達は閉鎖の初期段階によって悪影響を受けないことを我々は観察した。こ
れは以前にウシで立証されている(Smithら、1996)。 インヒビンAとインヒビンB双方の生産はゴナドトロピン(Lockwoodら、1996)に
依存しており、この研究でゴナドトロピンを刺激した群では、インヒビンAとイ
ンヒビンBの双方のレベルがFSHでの刺激中に3倍に増加することが認められた。6
〜7日目から吸引まで、インヒビンAとインヒビンB双方のレベルが著しく減少し
た。この知見は、非成長小胞と一致している(Priceら、1995)。
【００６７】 吸引のタイミングとIVM用の卵母細胞の選択は、他の哺乳類種での実験に基づ
いている(Eppigら、1992；Edwards 1965)、しかし、ヒト卵母細胞は減数分裂を
再開し成熟を終える能力を大きさにも依存しているようである(Durenziら、1995
))。Tsujiら(1985)は、大きな小胞(9〜15mm)由来の卵母細胞と比較して小さい小
胞(3〜4mm)由来の卵母細胞の成熟割合は低下することを見出している。Dubeyら(
1995)も、大きさの小さい小胞の過剰排卵由来の卵母細胞の受精割合は低下する
ことを認めている。10〜14mmの小胞由来卵母細胞の58％が受精するが、22〜26mm
の小胞由来卵母細胞は74％が受精した。この研究で、多量のゴナドトロピンで刺
激した第2の実験での大きな小胞由来卵母細胞は成熟し卵割するのに適している
が(表２０)、8〜10mmの大きさの小胞由来卵母細胞も、吸引を導小胞が超音波で
確認された後に行う場合に発達に適していたことが認められている。Russellら(
1998)は、優勢な小胞の大きさが14mmを越えた際、未成熟な卵母細胞を吸引する
と成熟及び受精の割合が劇的に減少することを経験している。これは、選択プロ
セスが存在する小胞にネガティブに作用し得る重要なポイントであることを示し
ている。小胞の直径のモニターは、体外成熟に適した卵母細胞の実際的な選択手
段として有用であることが分かっている。小胞の大きさ以外の要因は、IVM系の
効率を制限していると思われる。子宮内膜のプライミングは、別の重要な要因で
ある。未成熟な卵母細胞周期では、優勢な小胞由来の十分に内因性のエストラジ
オールは不足している。したがって、外因性のプライミングが必要であり、胚発
達と着床時機を同期化しなければならない(Russellら、1997)。エストラジオー
ルでの中程度の小胞のプライミングが早期子宮内膜のプライミングに対して開始
された時、成熟割合と受精割合が増した。ドナーの卵母細胞を受けるホルモン置
換から、2日齢の胚はプロゲステロン露出の3日又は4日目で子宮内膜洞にもっと
も良好に移ることが分かっている(Rosenwaksら、1987)。我々は、正常なプライ
ミングをできるだけ似せて模倣することを目的とし、吸引の日にエストラジオー
ルを開始し、その2日後にプロゲステロンを補足した。FSHプライミングの周期で
は、6〜7日目のエストラジオール濃度の上昇は、刺激していない周期よりも良好
に吸引直前にエストラジオールを増す子宮内膜をつくることが期待されている。
2群間の着床割合には、全く相違が認められなかった。これは、小胞期の血清エ
ストラジオール濃度と着床割合に相関関係は見られないとする先の研究と一致し
ている(Younisら、1996、Remohiら、1997)。
【００６８】 これらの結果は、多くの患者で確認する必要がある。結果から、体外受精用に
卵巣の高刺激を制御する魅力的な代替法がもたらされる可能性がある。副作用を
低下する、特に高刺激症候群を除く臨床上の効果に加えて、この治療はIVFの費
用を低減させ得る。近年、過剰な卵巣刺激薬剤の使用がEdwardsら(1997)によっ
て疑問視されている。外因性ゴナドトロピンを用いずに、自然の周期でIVFを行
う多くの試みがなされている。未成熟な卵母細胞の取出しとIVMとを組合わせる
ことによって、自然なIVF周期がますます成功する可能性がある。IVF/ICSIでは
、雄性要因のために大部分の女性が卵巣小胞の刺激を補助する自身のFSHを産生
しており、これをIVMに利用することができる。胚発生において自然な周期に比
較すると低用量のFSHプライミングの利点がないことは、この研究で立証されて
いる。しかし、この点を明らかにするにはより多くの研究が必要である。
【００６９】
【表１８】
【００７０】
【表１９】
【００７１】
【表２０】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年４月２６日（２０００．４．２６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (71)出願人 Ｍｏｌｌｅｈａｖｅｎ 12，ＤＫ−4040 Ｊｙｌｌｉｎｇｅ ＤＥＮＭＡＲＫ Ｆターム(参考） 2G045 CA25 CA26 CB01 CB03 CB07 DA36 DA54 FB03

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 体外で成熟でき、その後受精し得る未受精卵が哺乳類に存
    在する際に少なくとも１つの予想マーカーに対する特異的な反応を示す、哺乳類
    の試料における少なくとも１つの予想マーカーについてのアッセイ。
  2. 【請求項２】 哺乳類の試料が、体分泌物、唾液、血液、尿、子宮分泌物
    及び細胞からなる群から選択される試料である請求項１に記載のアッセイ。
  3. 【請求項３】 試料が血液試料である請求項２に記載のアッセイ。
  4. 【請求項４】 哺乳類がヒトのような霊長類である前記請求項のいずれか
    に記載のアッセイ。
  5. 【請求項５】 特異的な反応がイムノアッセイ及び/又はPCR反応に基づく
    前記請求項のいずれかに記載のアッセイ。
  6. 【請求項６】 少なくとも１つの予想マーカーが、タンパク質、ホルモン
    、脂質、核酸、細胞間メッセンジャー及び酵素からなる群から選択されるマーカ
    ーである前記請求項のいずれかに記載のアッセイ。
  7. 【請求項７】 １つの予想マーカーがインヒビンAである前記請求項のい
    ずれかに記載のアッセイ。
  8. 【請求項８】 １つの予想マーカーがエストラジオールである前記請求項
    のいずれかに記載のアッセイ。
  9. 【請求項９】 インヒビンAについての特異的な反応が、3日目から吸引の
    日までに認められるインヒビンAの増加である請求項７及び８に記載のアッセイ
    。
  10. 【請求項１０】 増加が少なくとも80％である請求項９に記載のアッセイ。
  11. 【請求項１１】 インヒビンAに対する特異的な反応がカットオフ値である
    請求項７〜１０のいずれかに記載のアッセイ。
  12. 【請求項１２】 特異的な反応が、9pg/mlより多い3日目のインヒビンAの濃
    度である請求項１１に記載のアッセイ。
  13. 【請求項１３】 エストラジオールに対する特異的な反応が、3日目から吸
    引の日までのエストラジオールの増加である請求項７〜１２のいずれかに記載の
    アッセイ。
  14. 【請求項１４】 増加が少なくとも87％である請求項１３に記載のアッセイ
    。
  15. 【請求項１５】 アッセイが、少なくとも１つの予想マーカーについての少
    なくとも2回の測定を含む前記請求項のいずれかに記載のアッセイ。
  16. 【請求項１６】 特異的な反応の結果が、哺乳類の試料における少なくとも
    １つの予想マーカーの濃度の低下、プラトー又は増加である前記請求項のいずれ
    かに記載のアッセイ。
  17. 【請求項１７】 IVM周期の成功を予測するための、哺乳類の試料中の予想
    マーカーの存在又は定量のためのアッセイの使用。
  18. 【請求項１８】 IVM周期に対する妊娠の可能性が少なくとも15％である請
    求項１７に記載の使用。
  19. 【請求項１９】 - 哺乳類から少なくとも１つの試料を得る手段、 - 請求項１〜１６のいずれかに記載のアッセイ からなるキット。
  20. 【請求項２０】 特異的な反応を評価するスキームをさらに含む請求項１９
    に記載のキット。
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