HRP20000888A2 - Assay to indicate the presence of non-fertilisable ova - Google Patents
Assay to indicate the presence of non-fertilisable ova Download PDFInfo
- Publication number
- HRP20000888A2 HRP20000888A2 HR20000888A HRP20000888A HRP20000888A2 HR P20000888 A2 HRP20000888 A2 HR P20000888A2 HR 20000888 A HR20000888 A HR 20000888A HR P20000888 A HRP20000888 A HR P20000888A HR P20000888 A2 HRP20000888 A2 HR P20000888A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- day
- inhibin
- oocytes
- aspiration
- estradiol
- Prior art date
Links
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 16
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 71
- 108010067471 inhibin A Proteins 0.000 claims description 64
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 claims description 57
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 claims description 56
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 claims description 56
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims description 41
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims description 36
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 claims description 36
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 26
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 claims description 23
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 22
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 22
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 19
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 14
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 claims description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 4
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 3
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 3
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 claims 2
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 claims 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims 2
- 210000003103 bodily secretion Anatomy 0.000 claims 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 98
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 26
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 23
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 21
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 18
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 17
- 238000011161 development Methods 0.000 description 15
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 12
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 11
- 108010067479 inhibin B Proteins 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 10
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 10
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 10
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 10
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 9
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 9
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 8
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 7
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 7
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 7
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 6
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 6
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 5
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 5
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 5
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 5
- 210000002503 granulosa cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 5
- 230000002175 menstrual effect Effects 0.000 description 5
- 230000011599 ovarian follicle development Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 108010006578 follitropin alfa Proteins 0.000 description 4
- 229940057854 gonal f Drugs 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 4
- 210000004508 polar body Anatomy 0.000 description 4
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000008144 egg development Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 3
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 230000029849 luteinization Effects 0.000 description 3
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000031877 prophase Effects 0.000 description 3
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 2
- 206010033266 Ovarian Hyperstimulation Syndrome Diseases 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108010020661 Profasi Proteins 0.000 description 2
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000008339 endometrial blood flow Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000008217 follicular development Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 2
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002394 ovarian follicle Anatomy 0.000 description 2
- 230000000624 ovulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000009597 pregnancy test Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 11-dehydrocorticosterone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 1
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 1
- 101710150365 Albumin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 241000269350 Anura Species 0.000 description 1
- 108010037003 Buserelin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N Cortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N Cortisone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)(O)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012594 Earle’s Balanced Salt Solution Substances 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000007984 Female Infertility Diseases 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- NMJREATYWWNIKX-UHFFFAOYSA-N GnRH Chemical compound C1CCC(C(=O)NCC(N)=O)N1C(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CC=1NC=NC=1)NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 NMJREATYWWNIKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000904173 Homo sapiens Progonadoliberin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 238000003744 In vitro fertilisation Methods 0.000 description 1
- 206010021928 Infertility female Diseases 0.000 description 1
- 108010004250 Inhibins Proteins 0.000 description 1
- 102000002746 Inhibins Human genes 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 229940099471 Phosphodiesterase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010036049 Polycystic ovaries Diseases 0.000 description 1
- 102100024028 Progonadoliberin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 1
- 229940030486 androgens Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- CUWODFFVMXJOKD-UVLQAERKSA-N buserelin Chemical compound CCNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](COC(C)(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 CUWODFFVMXJOKD-UVLQAERKSA-N 0.000 description 1
- 229960002719 buserelin Drugs 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007705 chemical test Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 229960004544 cortisone Drugs 0.000 description 1
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005786 degenerative changes Effects 0.000 description 1
- 230000030699 diplotene Effects 0.000 description 1
- 201000003511 ectopic pregnancy Diseases 0.000 description 1
- 230000000486 effect on maturation Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960001348 estriol Drugs 0.000 description 1
- PROQIPRRNZUXQM-ZXXIGWHRSA-N estriol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H]([C@H](O)C4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 PROQIPRRNZUXQM-ZXXIGWHRSA-N 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 210000001667 gestational sac Anatomy 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 239000003163 gonadal steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 230000031852 maintenance of location in cell Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008627 meiotic prophase Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 238000007474 nonparametric Mann- Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000008182 oocyte development Effects 0.000 description 1
- 208000025661 ovarian cyst Diseases 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 239000002571 phosphodiesterase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 201000010065 polycystic ovary syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035752 proliferative phase Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 238000013214 routine measurement Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000012285 ultrasound imaging Methods 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/743—Steroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0608—Germ cells
- C12N5/0609—Oocytes, oogonia
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/48—Regulators of apoptosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
- C12N2517/10—Conditioning of cells for in vitro fecondation or nuclear transfer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
- G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
- G01N2800/367—Infertility, e.g. sperm disorder, ovulatory dysfunction
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
- Management, Administration, Business Operations System, And Electronic Commerce (AREA)
- Stringed Musical Instruments (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Description
Pozadina izuma
Žena s normalnom ovulacijom proizvede približno 300 nezrelih oocita (jajašaca) u svakom menstrualnom ciklusu. Normalno, za vrijeme procesa apoptoze, sva jajašca osim jednoga umiru prije ovulacije. Uobičajena oplodnja in viiro (IVF), obradba posebnih slučajeva muške i ženske neplodnosti, temelji se na izvlačenju zrelih humanih jajašaca i potom oplodnji zrelih oocita spermatoziodima. Proizvodnja humanih zrelih oocita postiže se nekim složenim hormonskim obradbenim postupcima, često uznemirujućim i riskantnim za ženu. Ti će hormonski obradbeni postupci posebice postati problem u budućnosti, jer se IVF često nudi potpuno normalnim ženama, koje se u tom programu nalaze zbog loše kakvoće sperme njihovih muževa. Nadalje, ta vrsta obradbe normalno pribavlja učestalost trudnoće od 20 % po početnom ciklusu.
Zbog rizika, uznemirenja i troškova hormonske stimulacije, tijekom godina pokušani su neki drugi pristupi. U životinja je sazrijevanje in vitro (IVM) postalo djelotvornom metodom proizvodnje oocita za IVF, ali je do sada zabilježena učestalost uspješnosti za kliničku humanu IVM bila niska (Cha, Trounson, Barnes, Russel).
Jedan od najjednostavnjih načina za izbjegavanje hormonske stimulacije je neprovođenje hormonske stimulacije uopće. Međutim, takva obradba rezultirala je tek s ograničenim brojem trudnoća, a izračunata učestalost trudnoća nikad nije iznad 5 % po početnom ciklusu.
Sažetak izuma
Sadašnji izum odnosi se na mogućnost testovnog sustava za predviđanje pravog vremena i razvoja specifičnih zdravih, aktiviranih profaznih jajašaca koja se mogu dalje razvijati in vitro do MF-II bez egzogene hormonske obradbe u žene, te se time izbjegava degeneriranja većine jajašaca, čak iako žena nije obrađivana hormonima. Nasuprot svim prethodnim hormonskim analizama koje su se uvijek fokusirale na kasnije stadije razvoja jajašaca, obično na jajašca u stupnju MF-II, mjerenja su usmjerena na pravo vrijeme za aspiracije neoplodivih jajašaca koja mogu sazriti in vitro i biti oplođena. Ovom metodom postižu se učestalosti trudnoće više od 15 %.
Podroban opis izuma
Znanstvena pozadina
Nuklearni razvoj jajašaca zaustavljen je u diplotenskoj fazi kao germinalni mjehurić. To se naziva dicitatnim stupnjem. Taj je stadij karakteriziran visokodifuznim kromosomima, čija DNA ima malo afiniteta za takve nuklearne sojeve kao Feulgenov reagens. Kromosomi jajašaca u dicitatnom stadiju nose lateralne projekcije u obliku grana i petlja koje aktivno repliciraju ribonukleinsku kiselinu (RNA). Oni su vrlo slični kromosomima "Lampbrush", koji su nađeni gotovo univerzalno u jajima nižih vertebrata i nekih invertebrata. RNA može djelovati kao glasnik koji usmjeruje sintezu proteina unutar samog jajašca. Uvjetni dokaz prema proučavanjima jajašaca u žaba i gubavica pokazuje naznake, da neke od RNA mogu djelovati kao rani organizatori razvoja u sisavaca. Kakav god bio ishod dodatnih proučavanja potrebnih za rasvjetljivanje tih složenih problema, dicitatni stadij se naravno ne smije smatrati fazom mirovanja, budući da oociti pokazuju visok stupanj metaboličke i sintetičke aktivnosti u vrijeme kada se folikularna ovojnica sastoji od tek nekoliko spljoštenih epitelnih stanica.
Razvoj humanih oocita/folikula je kontrolni mehanizam i u vremenu i u biološkim procesima. Postotak od 99% svih jajašaca je zaustavljen u mejotičkoj profazi (to znači u dicitatnom stadiju) čak prije rođenja. Iz tog skupa odabere se nekoliko stotina jajašaca i aktivira svakog mjeseca (menstrualni ciklus) za daljnji razvoj, što je ponovno započinjanje mejoze razbijanjem germinalnog mjehurića (GVB) i metafaze I (MF-I) do metafaze II (MF-II) i rasta folikule.
Reproduktivno stanje ljudske ženke je cikličko sa složenim međudjelovanjem između hipotalamusa, prednje hipofize i ovarija, što eventualno vodi do procesa ovulacije. Ciklus se ponavlja u prosječnom periodu od 28-30 dana (raspon 25-35 dana). Prva faza, menstruacija, traje 4-5 dana. Prvi dan ciklusa je prvi dan prve faze, to jest prvi dan menstrualnog krvarenja. Druga folikularna faza ovarija odgovara proliferativnoj fazi endometrija i traje 10-16 dana (tj. jako je varijabilna). Potom slijedi ovulatorna faza (36 sati) i konačno lutealna faza koja odgovara sekretornoj fazi endometrija i obično je konstantna pri 14 dana. Tri su komponente kritične za razumijevanje manstrualnog ciklusa:
1. hipotalamična GnRH kontrola odpuštanja FSH/LH,
2. ovarijski foliktdarni razvoj do ovulacije i potom tvorba žutog tijela, te
3. povratna kontrola sekrecije FSH/LH pomoću ovarijskih hormona.
Za vrijeme druge polovice reproduktivnog ciklusa, razvija se žuto tijelo i izlučuje i estrogen i progesteron. Estrogen nastavlja poticati proliferativnu aktivnost u endometriju. Progesteron s druge strane prouzročuje punjenje endometrijske žlijezde sekretornim produktima koji uključuju glikogen (važan za razvoj embrija ukoliko dođe do implantacije). Endometrijski krvni protok se poveća i spiralne arterije se petljaju i svijaju. Druga polovica ciklusa naziva se lutealnom fazom (ovariji) ili sekretornom fazom (uterus). Ukoliko ne dođe do implantacije, žuto tijelo nazaduje, dolazi do brzog opadanja sekrecije estrogena i progesterona, endometrij se podvrgava stezanju zbog gubitka ekstracelularnih tekućina, spiralne arterije se stežu, endometrijski protok krvi opada s umiranjem stanica i destrukcijom krvnih žila. To vodi eventualno do faze menstrualnog krvarenja pri čemu se gubi sve osim bazalnog sloja endometrij a. Prvi dan menstrualnog krvarenja je, iz praktičnih razloga, prvi dan menstrualnog ciklusa.
Sazrijevanje jajašca je konačni stupanj razvoja jajašca koje se priprema za oplodnju i razvoj embrija. Može se podijeliti u dva općenita procesa: nuklearno sazrijevanje i citoplazmičko sazrijevanje. Nuklearno sazrijevanje se definira kao ponovno započinjanje mejoze i razvijenje do MF-II, dok se citoplazmičko sazrijevanje definira kao ekstragenomične promjene koje pripremaju jajašce za aktivaciju, pronuklearnu formaciju i ranu embriogenezu.
Folikula koje okružuje jajašce u dicitatnom stupnju sadrži jednostruk sloj spljoštenih granuloznih stanica. Znakovi daljnjeg razvoja jajašca i folikule uključuju daljnje množenje broja granuloznih stanica i također prolaz tekućine u prostore između granuloznih stanica. Kako raste količina tekućine, šupljine koje tekućina puni rastu po veličini i srastaju te tvore antrum. Tada se kaže da su folikule Graafijanskog tipa. Daljnjom ekspanzijom antruma jajašce zauzme položaj s jedne strane folikule i okruženo je s dva ili više slojeva granuloznih stanica. Unutrašnji sloj tih stanica postaje oblika stupa i tvori corona radiata koja, kao središnji dio cumulus oophorus, traje oko jajeta kroz period nakon ovulacije.
Nuklearno sazrijevanje nastavlja se paralelno s folikularnim razvojem. Tako se jajašca GVB i MF-I opažaju tijekom tvorbe antruma, u antralnoj i preantralnoj folikuli. Kad se antrum potpuno razvije, mejotička razdioba se završava i opaža se prva polarna tjelesna ekstruzija.
Nekoliko stotina jajašaca postiže taj stadij za vrijeme svakog menstrualnog ciklusa. Međutim, zbog do sada neobjašnjenih čimbenika, većina njih ulazi u atreziju, pri čemu jajašca podliježu apoptotičkom procesu i umire. Raspad središnjeg dijela granuloznih stanica za vrijeme pribivanja jajašca u folikuli, ili prerano nakon njegovog odlaska, siguran je znak degenerativnih promjena koje se zbivaju i koje rezultiraju smrću jajašaca. Samo nekoliko, normalno samo jedno, nastavlja s razvojem.
Tehnička pozadina IVF
Ukoliko žena primi FSH, više od jedne folikule nastavlja s razvojem do MF-II izbjegavajući atreziju.
Pod pojmom MF-II podrazumijeva se oocit s jednim polarnim tijelom i ekspandiranim cumulus complex i koji je konačno prošao kroz germinalno razaranje mjehurića. Te oocite lako prepoznaju rutinski tehničari koji se uobičajeno bave oocitima za IVF. Jajašca MF-II su tip jajašaca koja su pripravljena i sposobna za oplodnju pomoću spermnih stanica. Sada to nije moguće ni u jednom ranijem stadiju razvoja jajašaca.
Konvencionalne obradbe za fertilizaciju in vitro (IVF) ciljaju na dobivanje što je više moguće jajašaca u MF-II. To je dobiveno egzogenom hormonskom obradbom žene, uključujući folikularne stimulacijske hormone (FSH). rFSH, ili od urina deriviran FSH, daje se u dozi od 100 do 250 IU/dan. Često se ta obradba nastavlja kroz 8-10 dana. Daljnja obradba s GNRH agonistima kao što je Buserelin dnevno je dodana obradbi. Tom obradbom izbjegava se degeneracija većine tih aktiviranih jajašaca. Taj tip hormonske obradbe uvijek uključuje rizik hiperstimulacijskog sindroma i drugih sporednih efekata, kao što je povećani rizik od ovarijskog raka, nauzeja, nelagoda, edem, bol, alergijska reakcija na medikament, depresija i povećanje težine, a sve njih teško je opravdati, posebice ako je žena zdrava, a razlog obradbe s IVF je teški problem muške neplodnosti. Stoga, u ovom trenutku, više od 30 % svih IVF ciklusa u svijetu inicirano je teškom medikamentnom obradbom žena, iako je problem muški faktor.
Sa ciljem dobivanja zdravih jajašaca MF-II, hormonska obradba žene je podržana praćenjem razine serumskog hormona estradiola, FSH, LH, progesterona, PP14 i/ili PP12. Utvrđivanje pravog vremena aspiracije zdravih MF-II jajašaca potpomognuto je ultrazvučnim skeniranjem folikularnog razvoja. Svi ti klinički testovi namijenjeni su povećanju zdravlja i broja raspoloživih jajašaca MF-II.
IVM
IVM ponajprije započinje s nezrelim ili ne potpuno zrelim gametama. U žene se jajašca prepoznaju kao oociti guste gomilaste mase, bez vidljivih nepolarnih tijela ili germinalnih mjehurića. Stručnjaci uključeni u rutinske IVF obradbe lako prepoznaju takva jajašca kao nezrela jajašaca.
Ukoliko se ne daju hormoni, samo jedno jajašce sazrijeva u žene s normalnom ovulacijom. Odpuštanjem nezrelih oocita iz ovarija prije inicijacije apoptotičkih procesa pri čemu jajašca ulaze u atreziju, i potom daljnjim sazrijevanjem jajašaca in viiro, žena može izbjeći rizik i nelagode povezane s hormonskom obradbom, a ipak će bili raspoloživ dovoljan broj zrelih jajašaca metafaze II (MF-II) za fertilizaciju in vitro koja slijedi.
Bilo je moguće proizvesti oocite čije je nuklearno sazrijevanje napredovalo do MF-II, ali koja su nesposobna za završetak predimplantacijskog razvoja. Važnost citoplazmičke kontrole nad razvojnom sposobnošću opisana je u nezrelih majmunskih oocita. Primjenom mikromanipulacije, ooplazma je uklonjena iz oocita MF-II i ubrizgana u oocite profaze I. Majmuni koji su primili oocite citoplazmičkom transfuzijom, imali su sedmerostruko povećanje učestalosti trudnoće u odnosu na oocite bez ooplazmičke injekcije (Flood).
Do sada objavljeni protokoli za IVM primjenjivali su ili fiksni dan u menstrualnom ciklusu, izračunat iz prethodne ovulacije ili početka menstruacije, ili su samo primjenjivali pogodan dan prije konačnog razvoja antralnih folikula. Time su se postizale učestalosti trudnoća od O % do 10 %.
Izum
Sadašnji izum odnosi se na pronalazak da je mjerenje specifičnih signalnih hormona indikativno za pronalaženje pogodnog vremena za aspiraciju jajašaca u postupku IVM. To mjerenje indikativno za pronalaženje pogodnog vremena za aspiraciju jajašaca optimizirati će broj jajašaca specifično sposobnih za daljnje sazrijevanje in uitro, fertilizaciju i daljnji razvoj. Identifikacija specifičnih signalnih hormona kao markera za predviđanje pravog vremena kada postoje neoplodiva jajašaca sposobna za sazrijevanje in vitro i potom fertilizaciju, cijepanje, implantaciju i trudnoću u sisavaca, znatno povećava učestalost uspješnosti ciklusa IVM.
Neoplodivo jajašce predstavlja u ovoj patentnoj prijavi nezrelo jajašce (= oocit) koji u kontaktu sa zrelim spermnim stanicama neće završiti mejotičku razdiobu i prihvatiti genetički materijal iz spermne stanice, te tvoriti fertiliziranu stanicu. Sada je prihvaćeno, da endokrina i intraovarijska regulacija sazrijevanja jajašaca ostavljaju jajašca s preciznim, ali složenim sastavom tvari sa specifičnim koncentracijama ili koncentracijskim omjerima, tako da će neoplodiva jajašca nakon sazrijavanja in vttro do MF-II biti sposobna za fertilizaciju, potom cijepanje i tada trudnoću nakon implantacije u ženku sisavca.
Jedan aspekt izuma stoga se odnosi na analizu prisutnosti ili količine barem jednog predviđajnog markera u uzorku iz sisavaca, pri čemu specifično određivanje prisutnosti ili količine barem jednog predviđajnog markera inidicira kada su u sisavaca prisutna neoplodiva jajašca sposobna za sazrijevanje in vitro i potom za oplodnju.
Analiza barem jednog predviđajnog markera temeljena je na uzorku iz ženke sisavca. U jednom obličju izuma uzorak predstavlja uzorak odabran iz skupine koja se satoji od na pr. tjelesne izlučine, tjelesne tekućine, staničnih hrnidbenih tvari, sadržaja folikula, sputuma, krvi, urina, stolice, uterusnih ili vaginalnih sekreta i komponenata, menstrualnih produkata, epitela i komponenata izvedenih iz epitela, kožnih komponenata, te mrtvih ili živih stanica. Stručnjak u tom području lako će razumjeti kako se dobiva svaki od ovih uzoraka.
U jednom obličju sadašnjeg izuma, uzorak potječe od sisavaca, kao što su kućni ljubimci, na pr. mačka, pas, ili zamorac, ili kao što su životinje iz zoološkog vrta, na pr. primati. U drugom obličju izuma, sisavci su laboratorijske životinje kao što su štakor ili miš. U daljnjem obličju koje je u prednosti, sisavac je dio industrije, ponajprije životinjske farme, kao što je stoka, konj, svinja, kuna, koza ili ovca. U obličju koje je sada najviše u prednosti, sisavac je ljudsko biće.
U jednom aspektu, ženka sisavca testira se prije aspiracije jajašaca. Po mogućnosti se provede više od jednog testa. Pravo vrijeme za aspiraciju jajašaca za IVM može se predvidjeti bilo kao apsolutni odsječni stupanj ili kao relativna mjera, kao što je plato, porast ili opadanje ranije spomenutog markera.
U tom kontekstu kao predviđajni marker treba razumjeti bilo koju supstanciju koja mijenja koncentraciju, boju, strukturu, konformaciju, i/ili reakcijski način u biološkom, fizičkom ili kemijskom testu. Treba razumjeti da postoji mnoštvo potencijalnih predviđajnih markera. U jednom obličju izuma analizom se podrazumijeva analiza, u kojoj je barem jedan predviđajni marker hormon odabran iz skupine koja se sastoji od gonadotropina (kao što su FSH, LH, prolaktm i HCG), tiroidni hormoni (kao što su TSH, T3 i T4) i steroidni hormoni (kao što su spolni hormoni: estradiol, estrogen, estratriol, progesteron i testosteron; androgeni: kortizon ili kortizol). U drugom obličju izuma analizom se podrazumijeva analiza, u kojoj je barem jedan predviđajni marker mali peptidni hormon (kao što je GIP ili VIP). U drugom obličju izuma, analizom se podrazumijeva analiza, u kojoj je barem jedan predviđajni marker peptidni hormon (kao što je PP12, PP14, neki inhibin: inhibin A ili inhibin B: aktivin, ili α1 ili α2 globulini). U drugom obličju izuma, analizom se podrazumijeva analiza, u kojoj je barem jedan predviđajni marker lipid, odabran iz skupine koja se sastoji od lipida odabranih iz skupine koja se sastoji od sterola koji aktiviraju mejozu (MAS) i prostaglandina. U drugom obličju izuma, analizom se podrazumijeva analiza, u kojoj je barem jedan predviđajni marker nukleinska kiselina odabrana iz skupine koja se sastoji od fragmenata DNA, mRNA i tRNA. U drugom obličju izuma, analizom se podrazumijeva analiza, u kojoj je barem jedan predviđajni marker odabran iz skupine koja se sastoji od LFN1, LFN2, LFN3, glikokonjugata, ugljikohidrata, celularnih hranidenih tvari, integrina kao stoje integrin 1, te ugljikohidratnih epitopa. U drugom obličju izuma, analizom se podrazumijeva analiza, u kojoj je barem jedan predviđajni marker neki intra- ili intercelularni glasnik, kao što je cAMP. U još jednom obličju izuma, analizom se podrazumijeva analiza, u kojoj je barem jedan predviđajni marker neki enzim, kao stoje fosfodiesteraza, ili inhibitor fosfodiesteraze.
Zbog visoke složenosti interakcije između proteina, hormona, lipida, nukleinskih kiselina, intercelularnih glasnika i enzima, sada se smatra da će pravo vrijeme aspiracije neoplodivih jajašaca biti ovisno o kombinacijama odsječnih razina nekih predviđajnih markera i/ili relativnih mjerenja na jednom ili više predviđajnih marker a, odnosno relativnih mjerenja istog markera, ukoliko su uzorci uzeti u različita vremena, ili relativnih mjerenja dva ili više markera prisutnih u uzorku u isto vrijeme.
Analiza uključuje barem jedan predviđajni marker. To znači, dva predviđajna markera, kao i tri, četiri, pet ili šest predviđajnih markera.
Više je nego vjerojatno da će predviđajna vrijednost analize znatno narasti, ako se kombinira procjena dva ili više predviđajnih markera.
Temeljem opisa u primjerima l i 2 o tome kako korelacija između dva markera inhibina A i estradiola korelira glede ishoda IVM ciklusa, stručnjak u tom području moći će odrediti takve korelacije između drugih predviđajnih markera. U jednom obličju postoji znatna korelacija između vjerojatnosti pojave trudnosće u tom ciklusu i relativnog porasta, ili relativnog opadanja, ili platoa u koncentraciji predviđajnog markera podvrgnutog ispitivanju u uzorku iz dana 1, dana 2, dana 3, dana 4, dana 5, dana 6, dana 7, dana 8 i čak dana 9, prije dana aspiracije jajašaca. U drugom obličju postoji znatna korelacija između vjerojatnosti pojave trudnosće u tom ciklusu i apsolutnog porasta, ili apsolutnog opadanja, ili platoa u koncentraciji predviđajnog markera podvrgnutog ispitivanju u uzorku iz dana 1, dana 2, dana 3, dana 4, dana 5, dana 6, dana 7, dana 8 i čak dana 9, prije dana aspiracije jajašaca. U još jednom obličju, postoji znatna korelacija između koncentracije predviđajnog markera podvrgnutog ispitivanju u uzorku iz dana 1, dana 2, dana 3, dana 4, dana 5, dana 6, dana 7, dana 8 i čak dana 9 i vjerojatnosti pojave trudnoće u tom ciklusu. U jednom aspektu tog obličja, znatna korelacija između koncentracije predviđajnog markera podvrgnutog ispitivanju u uzorku i vjerojatnosti pojave trudnoće u tom ciklusu reducirana je na binarnu korelaciju, tako da je odsječna razina postavljena, a vjerojatnost pojave trudnoće u tom ciklusu korelirana je s podatkom, je li koncentracija predviđajnog markera podvrgnutog ispitivanju viša ili manja od odsječne razine.
U jednom obličju prema izumu, učestalost trudnoće u proučavanju ciklusa IVM, pri čemu je vrijeme za aspiraciju jajašaca postavljeno analizom prema opisu u sadašnjem izumu, iznosi više od 10 %, kao što je više od 13 %, 15 %, 18 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 % ili čak više od 40 %.
U obličju sadašnjeg izuma koje je u prednosti, odabrana su dva predviđajna markera. To su inhibin A i estradiol. Kao što je prikazano Primjerima 1 i 2, porast estradiola i inhibina A predviđa uspješnost IVM ciklusa.
Ponekad će se opaziti porast estradiola prije porasta inhibina A. U tom slučaju, koncentracija estradiola može opasti ili postići plato u vrijeme kad se opaža porast inhibina A. U tom slučaju se ipak smatra da je porast estradiola postignut, te je vjerojatnost uspješnosti velika zbog činjenice da je porast inhibina A glavni čimbenik. To je posebice slučaj kada se provodi priprema FSH (vidi Primjer 3).
U obličju sadašnjeg izuma koje je najviše u prednosti, analiza uključuje tri specifične reakcije i rezultate za dva selektivna markera. Prva specifična reakcija je mjerenje koncentracije inhibina A manje od 10 pg/ml u uzorcima krvi na dan 3 menstrualnog ciklusa. Druga specifična reakcija i rezultat je porast koncentracije inhibina A veći od 80 %, od dana 3 do dana aspiracije jajašaca. Treća specifična reakcija i rezultat je porast koncentracije estradiola veći od 87 % od dana 3 do dana aspiracije jajašaca. Tako u jednom aspektu obličja, ženi će se provesti analiza krvi na dan 3 menstrualnog ciklusa i odrediti će se koncentracije inhibina A i estradiola u uzorku krvi. Ukoliko je u rečenom uzorku krvi koncentracija inhibina A manja od 10 pg/ml, taj ciklus neće biti ciklus IVM. Međutim, ukoliko je koncentracija inhibina A veća ili jednaka 10 pg/ml u rečenom uzorku krvi, uzeti će se novi uzorak krvi u danu 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 i 16, osim ukoliko nisu opažene druga specifična i treća specifična reakcija. Ukoliko su opažene druga specifična i/ili treća specifična reakcija, dan opažanja treba biti dan aspiracije jajašaca. Smatra se, temeljeno na rezultatima iz Primjera 2, da će IVM ciklusi u kojima se vrijeme aspiracije jajašaca podudara s te tri specifične reakcije imati učestalost trudnoće veću od 12 %, na pr. veću od 16 %, 22 %, 25 %, 26 % ili čak više od 28 %.
Kao što stručnjak u tom području može procijeniti, mjerenja predviđajnih markera u uzorcima iz sisavaca rutinska su mjerenja.
Prema jednom aspektu izuma, analiza se pripravi na takav način da se specifična reakcija može usporediti i kompilirati bez pomoći liječnika ili napredne medicinske opreme. Međutim, kao što stručnjak u tom području može shvatiti, tek neki od predviđajnih markera se danas ne mogu mjeriti bez skupe opreme, što stvara potrebu za prijenosom uzorka u laboratorijske uvjete, gdje će rezultat analize odrediti pravo vrijeme za aspiraciju jajašaca u sisavaca.
Zbog složenosti koncentracija, relativnih porasta, relativnih opadanja, apsolutnih porasta, platoa i odsječnih vrijednosti, jedan aspekt izuma je shema koju treba ispuniti za vrijeme trajanja menstrualnog ciklusa u kojem se predmnijeva IVM-obradba. U jednom obličju shema uključuje kolone za svaki dan menstrualnog ciklusa, a redke za svaki od predviđajnih markera, tako da se svaka ćelija može popuniti kad se provede mjerenje svakog od predviđajnih markera. Automatska, poluautomatska i ručna preračunavanja promjena u predviđajnih markera olakšavaju interpretaciju rezultata specifičnih reakcija.
Ultrazvučno vođenje
U jednom obličju izuma, analiza predviđajnih markera primjenjuje se kao prvi odabirni kriterij. Ukoliko je taj kriterij ispunjen, žena će biti podvrgnuta ultrazvučnim mjerenjima uterusa i ovarija. Ukoliko se ultrazvučnim mjerenjima odredi:
- velik broj antralnih folikula,
- veličina vodećih folikula od oko 10 mm,
- jednolična kohorta folikula,
- endometrijska gustoća veća od 3 mm, te
- početak trilaminarne strukture endometrijskih linija, vjerojatnost postignuća pravog vremena za uspješnu aspiraciju jajašaca, sazrijevanje in viiro do MF-II, fertilizaciju, implantaciju i trudnoću vrlo je visoka.
U obličju koje je u prednosti prema sadašnjem izumu, iz humane ženke dobivaju se jajašca koja imaju ovarijsku folikulu promjera 8-12 mm. Prednost takvih malih folikula u tome je, što su one prisutne u znatnom broju u to vrijeme u menstrualnom ciklusu bez prethodne teške hormonske obradbe, mogu se vidjeti ultrazvukom, te je moguće provesti ultrazvučno vođenu trans-vaginalnu punkciju folikula sa ciljem izvlačenja oocita.
Stručnjak u tom području zna, da jajašca drugih veličina treba aspirirati iz drugih sisavaca.
U jednom obličju izuma, općenito znanje o ženinom menstrualnom ciklusus ugrađeno je u pronalaženje pravog vremena za aspiraciju jajašaca. Stoga, obično se aspiracija provodi između dana 6 i 17, a obično između dana 9 i 11.
Stoga, u jednom obličju sadašnjeg izuma, metoda određivanja pravog vremena aspiracije jajašaca uključuje sljedeće korake:
a) analiza barem jednog predviđajnog markera u uzorku iz sisavca;
u vrijeme kada rezultat specifične reakcije u analizi u koraku a) predviđa prisutnost neoplodivih jajašaca sposobnih za sazrijevanje in vitro i potom fertilizaciju u sisavaca
b) procjena vremena relativno prema prvom danu menstrualnog krvarenja; ukoliko je taj dan između dana 6 i 17, tada
c) procjena ultrazvučne slike ovarija sisavca;
ukoliko je veličina folikula između 8 mm i 12 mm, a kohorta folikula je jednolična, tada
d) procjena ultrazvučne slike uterusa sisavca;
ukoliko je endometrijska debljina veća od oko 3 mm i opažaju se početci trilaminarne strukture endometrijskih linija, vrijeme za aspiraciju jajašaca je pravo.
Međutim, ukoliko bilo koji od gore spomenutih koraka izostane, ciklus vjerojatno nije pogodan za IVM, a aspiraciju jajašaca treba odgoditi do sljedećeg ciklusa, kada se metoda ponovi.
Sposobnost IVM oocita da završe mejozu i postanu razvojno kompetentni može se povećati pomoću pripreme s FSH prije aspiracije oocita. U humanom IVM kratka stimulacija s FSH udvostručuje broj oocita dobiven po pacijentu, te povećava udio oocita koji postižu MF-II nakon 48 sati. U jednom obličju sadašnje metode, žena je obrađena u danima 3 i/ili 4 i/ili 5 menstrualnog ciklusa hormonima kao što je FSH, za čime je nastupio prekid obradbe. U Primjeru 3, opažena je povećana učestalost sazrijevanja i cijepanja u skupini pripremanoj s FSH, s odmakom između posljednje injekcije i aspiracije u usporedbi s pripremom s FSH bez odmaka. U skupini pripremanoj s FSH s odmakom između posljednje injekcije i aspiracije, opažena je povećana učestalost sazrijevanja u usporedbi s nestimuliranim oocitima, ali nije opažen utjecaj na učestalost cijepanja sazrelih MF-II oocita. Ona je bila visoka u obje skupine. Rana apoptotička faza iz faze umjetnog platoa u folikularnom rastu može oponašati konačno predovulatorno folikularno sazrijevanje u smislu razvojne kompetencije. Na taj način dobiven je umjetni plato ili pad razine estradiola, što prouzročuje apoptotički proces u ovariju koji dovodi do gore spomenute signalizacije u nezrelom oocitu. Takav pad razine estradiola očekuje se oko dana 10 u menstrualnom ciklusu. Izvlačenje oocita u žena bez hormonske stimulacije treba ponajprije biti učinjeno u danu 10 menstrualnog ciklusa, budući daje taj dan statistički povezan s brojnim oocitima u profazi.
Prema jednom aspektu izuma, žena će imati koristi od inicijalne obradbe u danima 3, 4 i 5 menstrualnog ciklusa hormonom kao što je FSH, za čime slijedi prekid obradbe. U tom načinu obradbe, krvna razina estradiola u žene može se promatrati sa ciljem odabira sazrijevajućih oocita, indirektno mjerenih pomoću folikula koje ne rastu (pauza u rastu). Rani apoptotički oociti namijenjeni da postanu apoptotički, karakterizirani su time što se lako odvajaju od ovarija za vrijeme punkcije folikula i imaju kompaktnu gomilastu masu. Kada se opazi pojava platoa ili pada razine estradiola, provede se izvlačenje oocita. Promatrani plato ili pad koncentracije estradiola pojavljuje se zbog prethodnog povećanja koncentracije estradiola između dana 3 menstruanog ciklusa i dana aspiracije jajašaca. U jednom obličju vrijeme za aspiraciju jajašaca je vrijeme povećanja koncentracije estradiola, što znači prije pojave platoa ili pada koncentracije estradiola. U daljnjem obličju koje je u prednosti, promatranje koncentracije estradiola dodatno je podržano promatranjem koncentracije inhibina A.
Stoga, jedno obličje sadašnjeg izuma je oprema koja sadrži prikladni FSH medikament i pribor za analizu prema gornjem opisu. Opcijski, oprema dalje sadrži sredstva za dobivanje uzorka ili uzoraka za analizu.
Literaturni navodi
Flood J., Chillik C.F., van Uem J.F.H.M., Iritani A., Hodgen G.D., Ooplasmatic transfusion: pro-phase germinal vesicle oocytes made developmentally cornpetent by microinjection of methase II egg cytoplasma. Fertil Steril 1990; 53:1049-54.
Cha K.Y. Koo J.J., Ko J.J., Choi D.H., Han S.Y., Yoon T.K.
Pregnancy after in vitro fertilization of human follicular oocytes collected from nonstimulated cycles, their culture in vitro and their transfer in a donor oocyte program. Fertil Steril 1991; 55:109-13.
Russell J.B., Knezevich K.M., Fabian K., Dickson J.A.
Unstimulated immature oocyte retrieval: early versus midfollicular endometrial priming. Fertil Steril 1997;67:616-20.
Barnes F.L., Kausche A.K., Tlglias J., Wood C., Wilton L.,
Trounson A. Production of embiyos from in uitro-matured primaiy oocytes. Fertil Steril 1996;65:1151-6.
Trounson A., Wood C., Kaunsche A. In vitro maturation and the fertilization and developmental competance of oocytes recovered from untreated polycystic ovarian patients. Fertil Steril 1994:62:353-62.
Cha K.Y., Chung H.M., Han S.Y., Yoon T.K., Oum K.B., Chung M.K. Successful in vitro maturation, fertilization and pregnancy by using immature follicular oocytes collected from unstimulated polycystic ovarian syndrome patients. Fertil Steril Abstract O-044; 1996:Supl.S23.
Wynn P., Hcton H.M., Krapez J., et ol (1998). Randomized study of oocytes matured after collection from unstimulated or mildly stimulated patients. Hum. Reprod; 13:3132-3138.
Groome N.P., Illingwowrth P.J. and O'Brien M., et al (1996),
Measurement of Dimeric Inhibin B throughout the Human Menstrual cycle. J. Clln. Endocrin. Metab., 81,1401-1405.
Podrazumijeva se da su dolje navedeni brojevi i primjeri ilustrativni za obličja sadašnjeg izuma, a nije namjera da izum bude tako ograničen.
Primjeri
U ovo proučavanje uključene su 83 žene s redovitim ciklusima, namijenjene za IVF/ICSI zbog muškog faktora i/ili bolesti kanala. Sve su žene sudjelovale u proučavanju nakon pismenog pristanka. Pormatrani su profili hormona (gonadotropina, inhibina A, inhibina B, estradiola i progesterona). Profili hormona određeni su pomoću RIA (Immuno 1, Bayer), osim profila inhibina A i inhibina B, koji su određeni metodom koju je opisao Groome (1996).
Skupljanje nezrelih jajašaca provedeno je dan nakon što je ultrazvukom detektirana folikula od 10 mm. Primijenili smo aspiracijsku iglu tvrtke Cook Ltd. koju je opisao Carl Wood. Aspiracijski tlak je smanjen na 100 mm Hg, zbog pretpostavke da nezreli kumulus ili jaje može biti osjetljivije na mehaničke povrede, ili igla u maloj folikuli može izravno oštetiti jaje ukoliko se jaje snažno usiše iz malog volumena tekućine u vršak igle. Folikule su punktirane. Nakon aspiracije igla je isprana s Earles ravnotežnom solnom otopinom, s Hepes i bikarbonatnim puferom uz heparin (100 lU/ml), kao što je opisao Trounson et al.
Folikularni aspirati prenijeti su u epruvetama u laboratorij i isprani na embrijskom filtru veličina pora od 70 μm. Eritrociti i druge male stanice isprane su kroz fllter, a oociti i veći fragmenti stanica skupljeni su u Petrijevim zdjelicama. Nezreli oociti identificirani su i razvrstani prema prisutnosti ili odsutnosti stanica kumulusa, bilo kao potpuno višeslojni, raštrkani ili goli.
Oociti su sazrijevali u mediju za kulturu tkiva 199 (TCM 199; Sigma) ili BBEM (Medicult, Denmark), uz natrij ev piruvat 0.3 mM, rec-FSH 0.075 IU/ml (Gonal-F; Serono), hCG 0.05IU/ml (Profasi; Serono) i albumin 1 %. Kasnije je mediju dodan estradiol 1 μg/ml i povećana koncentracija HSA (5 %) ili seruma od pacijenta (10 %) umjesto albumina.
Oociti su ogoljeni pomoću hijaluronidaze (IVF Science, Sweden) i mehaničkog pipetiranja. Pokretljiva sperma je pripravljena pomoću Puresperm™ (Cryos, Denmark) gradijentne separacije ili isplivavanjem. Oociti ogoljeni za ICSI smješteni su pojedinačno u 5 μl-ske kapi spermnog preparativnog medija (Medicult, Denmark) i 2 μl spermne suspenzije smješteno je u 10 jil-sku kap PVP (IVF Science, Sweden). Svi oociti MF-II osjemenjeni su s ICSI i potom smješteni u 10 μl-ske kapi BBEM, te je uzgajana kultura u 5 % CO2 i vlaženom zraku, pri 37 °C. Približno 10-20 sati nakon osjemenjivanja u oocita je pri 300X ispitana prisutnost pronukleusa kao mjere uspješne fertilizacije. Kultura embrija je uzgajana do dana 2 ili 3 (dan 0 = dan osjemenjivanja), kada su pogodni embriji (maksimalno 2) smješteni u ženu. Pogodni embriji su oni koji su se cijepali.
Primjer 1: Analiza inhibina A i estradiola u ciklusima IVM
Deskriptivna statistika podataka iz 83 obradbena ciklusa gdje su bili dostupni relevantni endokrinološki parametri prikazana je u Tablici 1. Ta 83 obradbena ciklusa rezultirala su sa 10 trudnoća.
Tablica 1:
Usporedba skupine žena koje se ostale trudne i skupine žena koje nisu ostale trudne
[image] *Primijenjen neparametarski test. Podatci nisu raspodijeljeni prema normalnoj razdiobi.
Tablica 1 pokazuje da je porast inhibina A od dana 3 veći u ciklusima u kojima se dogodila trudnoća, da porast estradiola nije važan, te da je umnožak porasta inhibina A i porasta estradiola znatno veći u ciklusima gdje je došlo do trudnoće.
Mogućnost analize samih serumskih inhibina A i estradiola, kojima se može uočiti razlika između produktivnog i neproduktivnog obradbenog ciklusa, upotrijebljena je za sljedeću uzastopnu analizu. U tu svrhu primijenjeni su različiti diskriminatori, te je određena statistička korelacija između podataka i vjerojatnosti za trudnoću.
Tablica 2:
Diskriminator: Serumski inhibin A razine ispod 10(pg/ml) u danu 3
[image] * Test Fischer Exact
Tablica 3:
Diskriminator: Serumski inhibin A razine ispod 9 (pg/ml) u danu 3
[image] * Test Fischer Exact
Tablica 4:
Diskriminator: Porast serumskog inhibina A od dana 3 do dana OPU od barem 80 %
[image] Test Fischer Exact
Tablica 5:
Diskriminator: Porast serumskog inhibina A od dana 3 do dana OPU od barem 100 %
[image] * Test Fischer Exact
Tablica 6:
Diskriminator: Porast serumskog inhlbina A od dana 3 do dana OPU od barem 87 %
[image] * Test Fischer Exact
Tablica 7:
Diskriminator: Porast serumskog estradiola od dana 3 do dana OPU od barem 100 %
[image] * Test Fischer Exact
Mogućnost kombinacije analiza serumskog inhibina A i estradiola za razlikovanje između produktivnog i neproduktivnog obradbenog ciklusa,
Tablica 8:
Diskriminator: Produkt porasta serumskog inhibina A i serumskog estradiola od dana 3 do dana OPU od barem 7500 (%x%)
[image] * Test Fischer Exact
Tablica 9:
Diskriminator: Porast serumskog estradiola od dana 3 do dana OPU od barem 87 % u skupini s porastom serumskog inhibina A od barem 80 %
[image] * Test Fischer Exact
Tablica 10:
Diskriminator: Porast serumskog estradiola od dana 3 do dana OPU od barem 87 % u skupini bez porasta inhibina A od dana 3 do dana OPU
[image] * Test Fischer Exact
Tablica 11;
Učinak nepostojanja porasta inhibina A
[image]
Tablica 12:
Učinak nepostojanja porasta estradiola
[image]
Prikazani podatci ilustriraju da je razina serumskog inhibina A snažan čimbenik za predviđanje uspjeha ciklusa IVM. Ovi podatci pokazuju da nije došlo do trudnoće u ciklusima u kojima je razina inhibina A bila iznad 10 pg/ml u danu 3 menstrualnog ciklusa (Tablica 2). Nadalje, došlo je do samo jedne trudnoće u skupini s inhibinom A iznad 9 pg/ml u danu 3 menstrualnog ciklusa (Tablica 3).
Nije samo apsolutna razina inhibina A u danu 3 predviđajni čimbenik za uspjeh ciklusa IVM, nego i porast serumskog inhibina A od dana 3 do dana izvlačenja jajašaca (OPU). Tako se produktivni ciklus snažno korelira s porastom serumskog inhibina A od dana 3 do dana OPU od barem 80 % (Tablica 4 i Tablica 5).
Podatci glede estradiola pokazuju da se produktivni ciklus korelira s porastom serumskog estradiola od barem 87 % od dana 3 do dana OPU (Tablica 6 i Tablica 7).
Istodoban porast serumskog inhibina A i estradiola izgleda da je čak i bolji predviđajni čimbenik za uspjeh IVM. Kombinacija porasta inhibina A i estradiola od dana 3 do dana OPU vrlo je dobar predviđajni čimbenik produktivnog ciklusa (Tablica 8, Tablica 9 i Tablica 10). Također se predviđanjem može utvrditi i neuspjeh, budući da nije došlo ni do jedne trudnosće u ciklusima bez porasta inhibina A iznad 80 % od dana 3 do dana OPU (Tablica 11), te nije došlo ni do jedne trudnoće u ciklusima s porastom inhibina A, ali bez porasta estradiola (Tablica 12).
Primjer 2:
Primjena parametara inhibina A i estradiola za izglednu analizu ciklusa TVM
Predviđajni učinak parametara određenih u Primjeru l, uz primjenu analize inhibina A i estradiola, za određivanje ciklusa za provođenje aspiracije jajašaca.
Tablica 13:
Efekt poništenja ciklusa s povišenim inhibinom A u danu 3
[image]
Tablica 14:
Efekt poništenja ciklusa bez porasta inhibina A na dan OPU
[image]
Tablica 15:
Efekt poništenja ciklusa s inhibinom A pri 10 (pg/ml) ili više u danu 3 ili bez porasta inhibina A na dan OPU iznad 80 %
[image]
Tablica 16:
Efekt poništenja ciklusa s inhibinom A pri 10 (pg/ml) ili više u danu 3 ili produkt porasta inhibina A i estradiola od dana 3 do dana OPU za manje od 7500 %
[image] *Znatno različito od "svi ciklusi" (p<0.05 CHI2-test).
Tablica 17:
Efekt poništenja ciklusa s inhibinom A pri 10 (pg/ml) ili više u danu 3 ili bez porasta inhibina A i estradiola na dan OPU
[image] *Znatno različito od "svi ciklusi" (p<0.05 CHI2-test).
Ovi podatci indiciraju da se ciklusi namijenjeni tome da postanu neproduktivni mogu poništiti prema mjerenjima inhibina A rano u obradbenom ciklusu i inhibina A i estradiola kasnije u ciklusu (Tablica 13, Tablica 14, Tablica 15, Tablica 16, Tablica 17). Ta mjerenja će znatno povećati učinkovitost ciklusa IVM. Sakupljeni podatci do sada indiciraju da svaki pacijent može alternirati između ciklusa s visokim inhibinom A rano u ciklusu (bez trudnoće) i ciklusa s niskim inhibinom A rano u ciklusu (trudnoća).
Primjer 3
Utjecaj pripreme za FSH
Sposobnost nezrelih oocita za spontanu ponovnu mejozu nakon uklanjanja iz folikule prvi su pokazali Pincus i Enzman 1935. Humani oociti iz malih folikula mogu opetovati i završiti mejozu in vitro, ali u manjem opsegu od drugih sisavaca (Edwards, 1965). Objavljeno je uspješno sazrijevanje nestimuliranih oocita (Cha et oL, 1991; Trounson et oL, 1994; Barnes et aL9 1996; Russell et al, 1997), te se mogu postići visoke učestalosti fertilizacije kada se ti oociti podvrgnu intracitoplazmičkoj injekciji sperme (ICSI) (Russell et oL, 1997), ali je objavljen nizak razvojni potencijal (Cha and Chain, 1998; Barnes et oL, 1996). Protokol za IVM relativno je jednostavan s kraćim periodom obradbe i smanjenim troškovima u usporedbi s konvencionalnim IVF. Nadalje, eliminiran je utjecaj sporednih učinaka sindroma ovarijske superovulacije, posebice hiperstimulacije. Usprkos slaboj učestalosti trudnoće, do sada opaženoj u humanim pokusima, zabilježeni uspjeh u laboratorijskih životinja ohrabruje. U majmuna je pokazano da priprema s FSH povećava nuklearno i citoplazmičko sazrijevanje oocita in vitro (Schramm and Bavister, 1994). Povećanje razina FSH unutar folikule koincidira s generiranjem pozitivnog signala potrebnog za završetak sazrijevanja oocita in vivo u ljudi (Gomez et oL, 1993), a kratka stimulacija s FSH pokazano je da povećava postotak oocita koji postižu metafazu II (Wynn et oL, 1998) nakon sazrijevanja in vitro.
U ovom izglednom slučajnom pilot proučavaju istraživali smo, može li se razvojni potencijal nezrelih oocita sazrelih in vitro poboljšati pripremom s FSH prije aspiracije.
Materijali i metode
U istraživanje su bili uključeni parovi za IVF/ICSI zbog muškog faktora i/ili oboljenja tuba. Žene su bile stare najmanje 18 i najviše 38 godina, i imale su normalan ovulacijski ciklus prosječne duljine od između 24 i 35 dana i indeks tjelesne mase (BMI) između 18 i 29 kg/m2. Isključene su bile sve pacijentice s infertilnošću prouzročenom endokrinim abnormalnostima kao što su hipeiprolaktinemija, policistički ovarijski sindrom i prethodno kontrolirani ovarijski hiperstimulacijski ciklusi u kojima je izvučeno manje od tri oocita. Nadalje, isključene su sve žene s povišenom vrijednosti FSH (>15 IU) po ciklusu u danu 3.
Istraživanje je odobreno od lokalnog etičkog odbora. Svi parovi su sudjelovali u istraživanju nakon potpisane suglasnosti. Prvi pokus bio je slučajno izgledno istraživanje koje je uključivalo dvadeset pacijenata između parova upisanih za ISCI zbog muškog faktora. Žene su slučajnim odabirom svrstane u dvije skupine. Skupina I (n = 10 ciklusa) nije dobila nikakvu stimulaciju, Skupina II (n = 10 ciklusa) primila je rec-FSH (Gonal-F, Serono) 150 IU/dan kroz 3 dana, počevši od dana 3. Aspiracija je provedena dan nakon što je ultrazvukom opažena vodeća folikula od 10 mm. Svi oociti sazrijevali su in vitro kroz 36 sati prije ISCI.
U drugi pokus uključeno je dvanaest parova. Sve žene primile su pripremu s rec-FSH (Gonal-F, Serono) prije aspiracije i 150 IU je davano dnevno od dana 3. Pet pacijenata primilo je istu stimulaciju kao Skupina II u prvom pokusu, s fiksnom dozom od 150 IU/dan kroz tri dana i aspiracijom dan nakon opažanja vodeće folikule od 10 mm. Preostalih sedam pacijenata nastavilo je stimulaciju dok folikula nije postigla 10 mm, te je aspiracija provedena 72 sata nakon toga. Svi oociti uzgajani su kroz 48 sati do ferttlizacije s ICSI.
U svih pacijenata proveden je transvaginalni ultrazvuk na dan 3 ciklusa i dobivena je bazna linija FSH, LH, inhibina A i inhibina B. Hormonski profili praćeni su od dana 3 do dana aspiracije. U slučaju ovarijske ciste ciklus je poništen. Drugo ultrazvučno ispitivanje obavljeno je u danima 6-7, a sljedećih dana ultrazvuk je primijenjen dnevno ili u intervalu od 2-3 dana ovisno o veličini folikula.
U oba pokusa endometrijska priprema sastojala se od 17-p-estradiola počevši od dana izvlačenja oocita, te je žena primala po 2 mg oralno tri puta dnevno. Endometrijska debljina <6 mm određena ultrazvučno, na dan aspiracije, nije prihvaćena. Dva dana nakon aspiracije započela je obradba s intravaginalnim progesteronskim supozitorijima i nastavljena je do testa trudnoće. Nastavljeno je s estrogenom i progesteronom, ukoliko je test na trudnoću bio pozitivan, do 50 dana trudnoće.
Izvlačenje oocita provedeno je transvaginalno, iglom 17-G Cook uz smanjeni aspiracijski tlak, kako je opisao Trounson et al. (1994). Folikularni aspirati prenijeti su u epruvetama u laboratorij i isprani na embrijskom filtru veličine pora 70 |im. Sazrijevanje i fertilizaciju opisao je podrobno Smith et al. (1998), a ukratko, oociti su sazrijevali u mediju za kulturu tkiva 199 (TCM 199; Sigma, Roedovre, Denmark) uz Na piruvat 0.3 mN, 1500 IU/ml penicilin G, 50 mg/ml strpetomicin sulfat, estradiol 1 μg/ml (sve od Sigme), rec-FSH 0.075 IU/ml (Gonal-F; Serono), hCG 0.5 IU/ml (Profasi; Serono), te serum pacijenta (10 %). Serum pacijenta dobiven je na dan aspiracije. Oociti su uzgajani odvojeno u 25 μl-skim kapima IVM medija pod parafinskim uljem pri 37 °C u 5 % CO2 Smatrano je da je oocit podvrgnut puknuću germinalnog mjehurića, kad je bila odsutna nuklearna membrana, te je bio klasificiran kao oocit zrele metafaze II (MF-II) kad je ekstrudirano prvo polarno tijelo.
Fertilizacija s ICSI provedena je na svim oocitima metafaze II. Oociti su tada smješteni u 10 μl-ske kapljice IVF medija (Medicult, Copenhagen Denmark) i uzgajani pod uljem u Falcon petrijevim posudicama do dana 2 nakon fertilizacije. Embriji su procijenjeni na ljestvici od 1-4, gdje se smatra da su tip l i 2 (< 10 % fragmentacije) prenosivi (Deschacht et al. 1988). Prenijeta su maksimalno dva embrija. Učestalost embrijskog razvoja definirana je kao broj prenosivih embrija prema ukupnom broju injektiranih oocita. Implantacijska učestalost je definirana kao broj gestacijskih vrećica opaženih ultrazvučnim ispitivanjem prema ukupnom broju zamijenjenih embrija.
Ultrazvučna mjerenja
Folikularni promjeri mjereni su istodobno s transvaginalnim ultrazvučnim snimanjem uz primjenu transvaginalnog pretvornika od 7.5 MHz (Briiel & Kjaer). Folikularni promjer izračunat je kao srednja vrijednost najdulje folikularne osi i osi okomite na nju u istoj ravnini snimanja.
Statističke metode
Statistička analiza provedena je pomoću Studentovog T-testa. Budući da nijedna od hormonskih varijabla nije pokazala normalnu razdiobu, neparametarski Mann-Whitneyev U-test je primijenjen za analizu statistički značajnih razlika između nesparenih podataka, a Prattsov test za analizu sparenih podataka. Vrijednosti su smatrane značajnima kada je p<0.05.
Rezultati
Pacijenti
U Pokusu 1 srednja starost žena bila je 31 godina (raspon od 28-36 godina) u skupini bez pripreme s FSH i 32 godine (raspon 28-36 godina) u skupini koja je primila FSH. To se nije razlikovalo od starosti žena u Pokusu 2 (srednja vrijednost 32 godine, raspon 28-36 godina). Druge kliničke značajke, uključujući trajanje neplodnosti, uzrok neplodnosti i broj prethodnih IVF ciklusa, bile su slične u svim skupinama.
Prvi pokus:
Sazrijevanje i razvoj embrija
U prvom pokusu koji je uključio 20 žena, za IVM se moglo uporabiti 77 oocita, a 62 (81 %) je sazrelo do MF-II nakon 36 sati. Nakon fertilizacije s ICSI, 2PN fertilizacija je opažena u 49 (79 %), a od njih je 45 (72 %) cijepano. Učestalost embrijskog razvoja bila je 40/62 (65 %), a implantacijska učestalost 5/33 (15 %). Učestalost kliničke trudnoće po početnom ciklusu iznosila je 5/20 (25 %). Jedna pacijentica imala je pobačaj u osmom gestacijskom tjednu, preostale su nastavile. Priprema s FSH nije pokazala nikakav učinak na sazrijevanje oocita, učestalost fertilizacije, učestalost cijepanja ili razvoj embrija (Tablica 18). Ukupno je dobiveno pet trudnoća. U jednoj je dobiven zdrav dječak, jedna je prekinuta u osmom gestacijskom tjednu, preostale su nastavljene preko 32 gestacijska tjedna.
Hormonski profili
Nije bilo razlika između dvije skupine u razinama estradiola, FSH, LH, inhibina A i inhibina B, trećeg dana odnosno na dan aspiracije (Tablica 19). U nestimuliranoj skupini razine FSH za vrijeme folikularne faze nisu se razlikovale od vrijednosti u stimuliranoj skupini, iako je opažena velika interindividualna varijacija. Razina serumskih estradiola ostala je na istoj razini od trećeg dana do dana 6-7 u skupini bez stimulacije. Na dan aspiracije opažen je znatan porast. U stimuliranoj skupini koncentracija estradiola povisila se ranije (dan 6-7) uz postojanje faze platoa prije aspiracije. U dvije skupine nije opažen preuranjeni pik LH. Razine inhibina A pokazale su isti uzorak kao razine estradiola s ranim porastom u stimuliranoj skupini i kasnim porastom u nestimuliranoj skupini. U nestimuliranoj skupini razina inhibina B porasla je ranije od one inhibina A (dan 6-7). U to vrijeme opažen je porast i u stimulirane skupine, ali razina je bila trostruka od one u nestimulirane skupine i znatan pad inhibina B je opažen od dana 6-7 do aspiracije.
Drugi pokus:
U drugom pokusu koji je uključio 12 žena, 38 oocita moglo se uporabiti za IVM, i nakon 48 sati 27 (71 %) je sazrelo i bilo fertilizirano pomoću ICSI. Učestalost fertilizacije i učestalost cijepanja bile su 61 % odnosno 53 %, a to se nije razlikovalo od učestalosti fertilizacije i učestalosti cijepanja dobivenih u Pokusu 1. Petnaest embrija prenijeto je u 10 pacijentica, nijedan nije bio krioterapijski sačuvan. Dobivena je jedna trudnoća s porodom zdrave djevojčice. Razvoj embrija u toj skupini bio je 56 %, a implantacijska učestalost 7 %. Produljenjem stimulacijskog perioda od fiksne doze od 150 IU/dan kroz tri dana do 6 dama, dok flikule nisu postale vličine 10 mm, dobili smo porast veličine folikula na dan aspiracije i porast razine estradiola u serumu, ali broj oocita dobiven po aspiraciji nije povećan (Tablica 20).
Sigurnost
U ovom istraživanju nije opažena hospitalizacija zbog infekcije, krvarenja ili abdominalnih bolova koji se mogu smatrati ginekološkima. Nije opažena ekstrauterina trudnoća.
Diskusija
Prema našim spoznajama, ovo je prvo istraživanje koje objavljuje učestalost trudnoće od 25 % po aspiraciji, uz implantacijsku učestalost od 15 % nakon sazrijevanja oocita in viiro. Nezreli oociti u ovom istraživanju izgleda da se ponašaju jednako dobro kao i oni izvučeni nakon superovulacije i sazrijevanja in vivo (Meldrum et al., 1998).
Broj oocita izvučenih iz žena s nestimuliranim redovitim ciklusima nije se razlikovao od broja oocita izvučenih i sazrelih prema istraživanju koje su proveli Barnes et al. (1996). Predobradba pacijenata s rekombinantnim FSH nije povećala broj izvučenih oocita. Prethodnim istraživanjima dobiveni su nepodudarni rezultati. Wynn et al. (1998) objavili su povećem broj oocita izvučen iz žena s redovitom menstruacijom uz pripremu s FSH u usporedbi sa ženama bez pripreme s FSH, dok Trounson et al. (1998) nije pokazao nikakvu razliku u broju dobivenih oocita. Prethodna promatranja sugerirala su da je broj raspoloživih folikula fiksiran rano u prethodnoj lutealnoj fazi (Gougeon i Testart, 1990), a kratka, rana stimulacija s FSH ne mijenja broj raspoloživih nezrelih oocita. To je u skladu s rezultatima sadašnjeg istraživanja. S povećanjem količine FSH i povećanjem veličine folikula u Pokusu 2, opazili smo da se vjerojatnost za dobivanje oocita u aspiraciji nije povećala. To je u skladu s prethodnim publikacijama (Templeton et al.), gdje je vjerojatnost za dobivanje oocita iz tih velikih folikula u odsutnosti hCG bila vrlo niska.
Učestalosti sazrijevanja, fertilizacija i cijepanja promatrane u ovom istraživanju sukladne su nalazima u prethodnim proučavanjima, ali smo opazili višu učestalost trudnoće i višu implantacijsku učestalost, što indicira postojanje poboljšanog razvoja oocita. Niz čimbenika može na to utjecati. Razvoj embrija iz IVM-oocita može se poboljšati prethodnom pripremom s FSH. U Rhesus majmuna kratka priprema s FSH poboljšala je sazrijevanje i učestalost cijepanja (Schramm i Bavister, 1994). U ljudi su trudnoće postignute nakon prijenosa nezrelih oocita iz stimuliranih ciklusa (Nagy et al., 1996; Liu et al., 1997; Jaroudi et al., 1997; Edirisinghe et al., 1997).
Nedavno su Wynn et al. (1988) objavili povećanu učestalost sazrijevanja oocita nakon prethodne obradbe s FSH. Međutim, u prvom eksperimentu, priprema s FSH u žena prije prikupljanja oocita nije poboljšala učestalost sazrijevanja in vitro. Postoje dva moguća objašnjenja za opaženu razliku: (1) primijenjeni uvjeti uzgoja ili (2) vrijertie aspiracije. Vrijeme fertilizacije i uvjeti uzgoja važni su čimbenici, a razmatrao ih je Smith et al. 1999, Aspiracija oocita provedena je fiksnog dana (dan 7 u menstrualnom ciklusu) u istraživanju koje je proveo Wynn et al., dok je dan aspiracije u sadašnjem istraživanju ovisio o veličini folikula. U stimuliranoj skupini dan aspiracije bio je ranije (srednji dan 9) u usporedbi s nestimuliranom skupinom (srednji dan 10) (Tablica 19), ali je dan aspiracije fiksiran u dvije grupe na isti način. Veličina folikula praćena je ultrazvukom i uzimanje oocita provedeno je dan nakon što je opažena vodeća folikula od 10 mm.
U istraživanju koje su proveli Wynn et al. (1998) nije provedena fertilizacija M-II oocita. U sadašnjem istraživanju priprema s FSH nije imala naikakav učinak na učestalost feertilizacije niti na učestalost cijepanja. To je sukladno podacima koje su objavili Trounson et al. (1998). Oni su objavili da obradba žena normalnih ciklusa s rekombinantnim FSH kroz 3 dana nije imala nikakav učinak na učestalost sazrijevanja niti učestalost fertilizacije in vitro. U sadašnjoj skupini žena s redovitom menstruacijom, čini se daje njihova vlastita stimulacija s FSH bila dovoljna za dobivanje oocita sposobnih za sazrijevanje in vitro. Poznato je iz prethodnih proučavanja, da je pokazana široka interindividualna razlika u folikularnoj fazi FSH u danu 3 i izražena interindividualna varijacija maksimalnih koncentracija FSH (Schipper et al., 1998). Ta interindividualna varijacija u razinama FSH može reflektirati razlike u pragovima FSH i razlike u ovarijskoj osjetljivosti prema FSH, te to može biti jedan od mogućih razloga za nedostatak razlika u učestalosti sazrijevanja i učestalosti fertilizacije, iako su se razine FSH razlikovale.
U nestimuliranoj skupini opazili smo povećanje serumskih koncentracija estradiola i inhibina A na dan aspiracije, a poznato je da je to u skladu s odabirom dominantne folikule (Schipper et al, 1998). Koncentracija inhibina B povećala se ranije od one inhibina A, a razina oba hormona zadržana je do dana aspiracije. To je u skladu s prethodnim proučavanjima (Schipper et al., 1998; Groome et al., 1996) i u skladu s našim ultrazvučnim slikama, jer je dan aspiracije bio neposredno nakon opažanja dominantne folikule od 10 mm. To implicira da su oociti odabrani za IVM u tim slučajevima dobiveni iz folikula namijenjenih ulazu u atreziju, te smo opazili da razvoj embrija iz oocita nije bio pod nepovoljnim utjecajem ranih stadija atrezije. To je ranije pokazano u stoke (Smith et al., 1996).
Proizvodnja i inhibina A i inhibina B ovisna je o gonadotropinu (Lockwood et al., 1996) i u gonadotropinskoj stimulacijskoj skupini u sadašnjem istraživanju opažen je trostruki porast razine kako inhibina A tako i inhibina B za vrijeme stimulacije s FSH. Od dana 6-7 do aspiracije, razine inhibina A i inhibina B znatno su opale, te je to opažanje u skladu s folikulama koje ne rastu (Priče et al,1995).
Vrijeme aspiracije i odabir oocita za IVM temeljen je na iskustvu s drugim vrstama sisavaca (Eppig et al., 1992; Edwards, 1965), ali i humani oociti izgleda da imaju sposobnost ponovne mejoze i završetka sazrijevanja ovisne o veličini (Durenzi et al., 1995). Tsuji et al., (1985) pronašli su smanjenu učestalost sazrijevanja oocita iz malih folikula (3-4 mm) u usporedbi s oocitima iz većih folikula (9-15 mm). Dubey et al. (1995) također su opazili smanjenje fertilizacijske učestalosti oocita iz superovulacijskih folikula manjih veličina. Dok je oplođeno 58 % oocita iz folikula veličine 10-14 mm, za oocite iz folikula veličine 22-26 mm postotak je iznosi 74 %. U sadašnjem proučavanju opazili smo da su oociti iz velikih folikula u drugom pokusu uz visoku dozu gonadotropinske stimulacije bili sposobni za sazrijevanje i cijepanje (Tablica 20), ali su i oociti iz folikula veličine 8-10 mm bili sposobni za razvoj kad je provedena aspiracija nakon što je ultrazvukom pronađena vodeća folikula. Russell et al. (1998) je opazio dramatičan pad učestalosti sazrijevanja i fertilizacije pri aspiraciji nezrelih oocita, kada je veličina dominantne folikule premašila 14 mm. To indicira, da mogu postojati kritične točke gdje selekcijski proces može imati negativan učinak na postojeće folikule. Promatranje promjera folikule može se pokazati korisnim kao praktično sredstvo odabira oocita sposobnih za sazrijevanje in vitro. Drugi čimbenici osim veličine folikula izgleda da ograničuju djelotvornost IVM sustava. Priprema endometrija je drugi važan čimbenik. U nezrelom oocitnom ciklusu nedostaje adekvatan endogeni estradiol iz dominantne folikule. Stoga je potrebna egzogena priprema i mora se sinkronizirati implantacijska s razvojem embrija. Russell et al. (1997) pronašli su povećanu učestalost sazrijevanja i učestalost fertilizacije kada je započeta srednja folikularna priprema estradiolom, u usporedbi s ranom endometrijskom pripremom. Znamo iz hormonske zamjene u recipijenata donornih oocita, da se dva dana stari embriji najbolje prenose u endometrijsku šupljinu trećeg ili četvrtog dana izlaganja progesteronu (Rosenwaks et al., 1987). Namjeravali smo imitirati normalnu pripremu što je bolje moguće i inicirali estradiol na dan aspiracije, te ga zamijenili progesteronom dva dana kasnije. Moglo bi se očekivati da u ciklusima s pripremom s FSH, povišene koncentracije estradiola od dana 6-7 mogu pripremiti endometrij bolje nego u nestimuliranim ciklusima, gdje je estradiol porastao neposredno prije aspiracije. Nismo mogli pokazati bilo kakavu razliku u učestalosti implantacija između dvije skupine, a to je u skladu s prethodnim proučavanjima, budući da nije nađena nikakva korelacija između folikularne faze serumskih estradiolnih koncentracija i implantacijske učestalosti (Younis et al, 1996; Remohi et al., 1997).
Ove rezultate treba potvrditi na većem broju pacijenata. Oni mogu voditi prema privlačnoj alternativi kontroliranoj ovarijskoj hiperstimulaciji za fertilizaciju in vitro. Osim kliničkih pogodnosti zbog sniženja popratnih učinaka, posebice eliminacije hiperstimulacijskog sindroma, ova obradba može smanjiti troškove IVF. Nedavno je Edsvards et al. (1997) učinio upitnom široku primjenu lijekova za ovarijsku stimulaciju. Učinjeni su mnogi pokušaji provedbe IVM u prirodnom ciklusu bez uporabe egzogenih gonadotropina. Kombinacija izvlačenja nezrelih oocita i IVM mogu povećati uspjeh prirodnog ciklusa IVF. U IVF/ICSI zbog muškog faktora, većina žena proizvodi svoj vlastiti FSH čime pomaže stimulaciji ovarijskih folikula, a to se može uporabiti u IVM. U ovom istraživanju nije se mogla pokazati nikakva prednost niske doze pripreme s FSH u usporedbi s prirodnim ciklusom, na razvoj embrija. Međutim, potrebno je više istraživanja za rasvjetljavanje tog područja.
Tablica 18: Broj oocita dobivenih za IVM, učestalost sazrijevanja, fertilizacijska učestalost, učestalost cijepanja i učestalost trudnoće u Pokusu 1.
[image]
Tablica 19:
Razine hormona u danima 3, danima 6-7 i danu aspiracije u dvije skupine u Pokusu 1.
[image] a) p<0.05, b) p<0.05, c) p<0.05.
Tablica 20:
Broj oocita dobivenih za IVM, učestalosti sazrijevanja i cijepanja u maloj dozi prema stimulaciji visokom dozom gonadotropina u Pokusu 2.
[image]
Claims (15)
1. Primjena analize prisutnosti ili količine supstancije u uzorku tjelesne izlučine, sputuma, krvi, urina, ili sekreta uterusa iz sisavaca, naznačena time, da je za predviđanje vremena kada su u sisavaca prisutna neoplodiva jajašca sposobna za sazrijevanje in vitro i potom za fertilizaciju.
2. Primjena prema zahtjevu 1, naznačena time, da predviđanje uključuje vrijeme kada su u sisavaca prisutna jajašca sposobna za sazrijevanje in vitro i potom za fertilizaciju, cijepanje, implantaciju i trudnoću.
3. Primjena prema bilo kojemu od zahtjeva 1 ili 2, naznačena time, da je supstancija hormon, mali peptidni hormon, peptidni hormon, lipid, nukleinska kiselina, intra- ili intercelularni glasnik, ili enzim.
4. Primjena prema zahtjevima 1-3, naznačena time, da uzorak predstavlja uzorak krvi.
5. Primjena prema bilo kojemu od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da je sisavac primat, kao što je ljudsko biće.
6. Primjena prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da se prisutnost ili količina odredi imunoanalizom i/ili reakcijom PCR.
7. Primjena prema bilo kojemu od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da se odredi prisutnost ili količina inhibina A.
8. Primjena prema bilo kojemu od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da se odredi prisutnost ili količina estradiola.
9. Metoda određivanja vremena kada su u uzorku iz sisavaca prisutna neoplodiva jajašca sposobna za sazrijevanje in vitro i potom za fertilizaciju, naznačena time, da uključuje analizu prisutnosti ili količine supstancije u uzorku tjelesne izlučine, sputuma, krvi, urina, ili sekreta uterusa iz sisavaca.
10. Metoda prema zahtjevu 9, naznačena time, da je supstancija hormon, mali peptidni hormon, peptidni hormon, lipid, nukleinska kiselina, intra- ili intercelularni glasnik, ili enzim.
11. Metoda prema zahtjevima 9 ili 10, naznačena time, da je uzorak iz sisavaca uzorak krvi.
12. Metoda prema bilo kojemu od zahtjeva 9-11, naznačena time, da je sisavac primat, kao što je ljudsko biće.
13. Metoda prema bilo kojemu od zahtjeva 9-12, naznačena time, da se pravo vrijeme odredi pomoću količine koja je manja od 10 pg/ml inhibina A u danu 3 menstrualnog ciklusa.
14. Metoda prema bilo kojemu od zahtjeva 9-13, naznačena time, da se pravo vrijeme odredi pomoću porasta količine inhibina A za više od 80 % od dana 3 menstrualnog ciklusa do dana aspiracije.
15. Metoda prema bilo kojemu od zahtjeva 9-14, naznačena time, da se pravo vrijeme odredi pomoću porasta količine estradiola za više od 87 % od dana 3 menstrualnog ciklusa do dana aspiracije.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9011598P | 1998-06-22 | 1998-06-22 | |
| DK199900885A DK199900885A (da) | 1998-06-22 | Fremgangsmåde for tildeling af et vilkårligt beløb på en given taletidskortkonto | |
| PCT/DK1999/000344 WO1999067644A1 (en) | 1998-06-22 | 1999-06-22 | Assay to indicate the presence of non-fertilisable ova |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HRP20000888A2 true HRP20000888A2 (en) | 2001-12-31 |
Family
ID=26064838
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HR20000888A HRP20000888A2 (en) | 1998-06-22 | 2000-12-20 | Assay to indicate the presence of non-fertilisable ova |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20010028878A1 (hr) |
| EP (2) | EP1090300B1 (hr) |
| JP (1) | JP2002519640A (hr) |
| CN (2) | CN1607391A (hr) |
| AT (1) | ATE407363T1 (hr) |
| AU (2) | AU760165B2 (hr) |
| BR (1) | BR9911470A (hr) |
| CA (2) | CA2335632A1 (hr) |
| DE (1) | DE69939468D1 (hr) |
| EE (1) | EE200000763A (hr) |
| ES (1) | ES2313785T3 (hr) |
| HR (1) | HRP20000888A2 (hr) |
| HU (1) | HUP0103392A2 (hr) |
| ID (1) | ID27197A (hr) |
| IL (2) | IL140283A0 (hr) |
| IS (1) | IS5768A (hr) |
| NO (2) | NO20006519L (hr) |
| NZ (1) | NZ509451A (hr) |
| PL (1) | PL345318A1 (hr) |
| RU (1) | RU2227916C2 (hr) |
| SK (1) | SK19152000A3 (hr) |
| TR (1) | TR200003830T2 (hr) |
| WO (2) | WO1999067365A1 (hr) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1483368A2 (en) * | 2002-03-08 | 2004-12-08 | McGill University | In vitro maturation of immature human oocytes |
| WO2003106662A1 (en) * | 2002-06-01 | 2003-12-24 | KØBENHAVNS AMTS SYGEHUS, Herlev | In vitro fertilisation |
| PL1697504T3 (pl) * | 2003-11-26 | 2012-01-31 | Merck Serono Sa | Zastosowanie cytokin typu IL-6 do dojrzewania oocytów |
| US20070020755A1 (en) * | 2005-07-07 | 2007-01-25 | Teresa Woodruff | Stage specific follicle maturation systems |
| CN103275930B (zh) * | 2013-06-20 | 2014-07-09 | 江苏皓康生物医药科技有限公司 | 一种卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法 |
| JP6806970B2 (ja) * | 2014-06-10 | 2021-01-06 | ポリバイオセプト ゲーエムベーハー | 細胞免疫療法用培養培地 |
| BR112018068474B1 (pt) * | 2016-02-24 | 2024-01-30 | Universitá Degli Studi Di Milano, Unimi | Sistema folicular para maturação de oócitos in vitro e kit |
| CN110628705A (zh) * | 2019-10-22 | 2019-12-31 | 山东畜牧兽医职业学院 | 一种驴胚胎冲洗液及其应用方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4614715A (en) * | 1982-05-14 | 1986-09-30 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Predictive test for impending ovulation in mammals |
| RU2013989C1 (ru) * | 1991-08-13 | 1994-06-15 | Борис Васильевич Леонов | Способ определения овуляции |
| GB9217866D0 (en) * | 1992-08-21 | 1992-10-07 | Unilever Plc | Monitoring method |
| EP0734531A1 (en) * | 1993-12-16 | 1996-10-02 | Abbott Laboratories | Methods and means for determining the female fertile period |
| GB9410345D0 (en) * | 1994-05-24 | 1994-07-13 | Univ Oxford Brookes | Method of genetic testing |
| GB9603326D0 (en) * | 1996-02-16 | 1996-04-17 | Royal Free Hosp School Med | Predictive assay |
| DE69619236D1 (de) * | 1996-09-27 | 2002-03-21 | Unilever Plc | Überwachungsverfahren |
| GB9625175D0 (en) * | 1996-12-04 | 1997-01-22 | Medi Cult As | Serum-free cell culture media |
-
1999
- 1999-06-22 TR TR2000/03830T patent/TR200003830T2/xx unknown
- 1999-06-22 EP EP99926293A patent/EP1090300B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-22 HU HU0103392A patent/HUP0103392A2/hu unknown
- 1999-06-22 AU AU43604/99A patent/AU760165B2/en not_active Ceased
- 1999-06-22 WO PCT/DK1999/000345 patent/WO1999067365A1/en not_active Application Discontinuation
- 1999-06-22 RU RU2001101921/15A patent/RU2227916C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-06-22 WO PCT/DK1999/000344 patent/WO1999067644A1/en active IP Right Grant
- 1999-06-22 ID IDW20010153A patent/ID27197A/id unknown
- 1999-06-22 NZ NZ509451A patent/NZ509451A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-06-22 DE DE69939468T patent/DE69939468D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-22 ES ES99926293T patent/ES2313785T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-22 IL IL14028399A patent/IL140283A0/xx unknown
- 1999-06-22 BR BR9911470-4A patent/BR9911470A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-06-22 AU AU43605/99A patent/AU4360599A/en not_active Abandoned
- 1999-06-22 EE EEP200000763A patent/EE200000763A/xx unknown
- 1999-06-22 JP JP2000556250A patent/JP2002519640A/ja active Pending
- 1999-06-22 SK SK1915-2000A patent/SK19152000A3/sk unknown
- 1999-06-22 PL PL99345318A patent/PL345318A1/xx not_active Application Discontinuation
- 1999-06-22 CN CNA2004100489940A patent/CN1607391A/zh active Pending
- 1999-06-22 EP EP99926294A patent/EP1088056A1/en not_active Withdrawn
- 1999-06-22 AT AT99926293T patent/ATE407363T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-06-22 CA CA002335632A patent/CA2335632A1/en not_active Abandoned
- 1999-06-22 CA CA002335793A patent/CA2335793A1/en not_active Abandoned
- 1999-06-22 IL IL14039499A patent/IL140394A0/xx unknown
- 1999-06-22 CN CNB998099309A patent/CN1161615C/zh not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-12-12 IS IS5768A patent/IS5768A/is unknown
- 2000-12-20 NO NO20006519A patent/NO20006519L/no not_active Application Discontinuation
- 2000-12-20 HR HR20000888A patent/HRP20000888A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2000-12-21 NO NO20006545A patent/NO20006545L/no not_active Application Discontinuation
- 2000-12-22 US US09/746,656 patent/US20010028878A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-22 US US09/746,633 patent/US20020115211A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jurema et al. | In vitro maturation of human oocytes for assisted reproduction | |
| Trounson et al. | Effect of delayed insemination on in-vitro fertilization, culture and transfer of human embryos | |
| Tesařík et al. | Zona pellucida resistance to sperm penetration before the completion of human oocyte maturation | |
| EP1847595B1 (en) | Methods of assessing embryo viability | |
| HRP20000888A2 (en) | Assay to indicate the presence of non-fertilisable ova | |
| Fried et al. | Increase in transforming growth factor beta1 in ovarian follicular fluid following ovarian stimulation and in-vitro fertilization correlates to pregnancy. | |
| Chen et al. | Schedule to inject in vitro matured oocytes may increase pregnancy after intracytoplasmic sperm injection | |
| Mikkelsen et al. | Time interval between FSH priming and aspiration of immature human oocytes for in-vitro maturation: a prospective randomized study | |
| US20110002907A1 (en) | Methods, Systems, Compositions And Dosage Forms For Diagnosing And Treating Male Infertility | |
| van der Ven et al. | Fertilization of human oocytes in capillary tubes with very small numbers of spermatozoa | |
| US6649344B1 (en) | Assay to indicate the presence of non-fertilizable ova | |
| Idil et al. | Does granulosa cell apoptosis have a role in the etiology of unexplained infertility? | |
| Clark | Host immunoregulatory mechanisms and the success of the conceptus fertilised in vivo and in vitro | |
| Russell | Immature oocyte retrieval with in-vitro oocyte maturation | |
| WO2008094016A1 (en) | Uses of mmp-9 activities present in blood | |
| MXPA00012478A (en) | Assay to indicate the presence of non-fertilisable ova | |
| KR20010071559A (ko) | 수정-불능 난자의 존재를 지시하기 위한 분석법 | |
| Pohler | Effect of ovulatory follicle size on steroidogenic capacity, molecular markers of oocyte competence and bovine pregnancy associated glycoproteins in beef cows | |
| Kuzniar | Effects of Interleukin-1 Beta on Bovine Endometrial and Oviductal Gene Expression, Blastocyst Development, and Conceptus Survival | |
| Timlin | Strategies for Improving Reproductive Efficiency of Beef Cattle with Assisted Reproductive Technologies | |
| CZ20004629A3 (cs) | Test na přítomnost neplodného vajíčka | |
| Inoue et al. | A hyaluronic acid‐containing reagent compatible with glass‐bottom dishes and capable of sustained binding of human spermatozoa | |
| Tao et al. | Optimized hormonal stimulation is critical for production of viable embryos and establishment of subsequent implantation | |
| de Abreu | The effect of progesterone concentrations during follicular development in cattle on luteinizing hormone secretion, follicular development, oocyte competence and fertility | |
| Bridges | Impact of preovulatory estradiol concentrations on mechanisms affecting fertility in cattle |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1OB | Publication of a patent application | ||
| OBST | Application withdrawn |