BR112018068474B1 - Sistema folicular para maturação de oócitos in vitro e kit - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se a um novo sistema para maturação de oócitos in vitro denominado "sistema folicular". isso compromete um método de cultura de duas etapas combinado com uma estratégia para obter oócitos especificamente adequada ao protocolo de cultura. mais especificamente, o sistema proposto visa proporcionar ao oócito um ambiente mais fisiológico para seu desenvolvimento, a fim de adquirir totalmente a competência meiótica e de desenvolvimento, ambas relacionadas à capacidade do oócito de completar a divisão meiótica, para ser fertilizado e se desenvolver em um embrião viável. a invenção refere-se ainda a um kit compreendendo o meio básico e os componentes do método de cultura em duas etapas, bem como o protocolo para a obtenção dos oócitos no estágio de desenvolvimento perfeito para o sistema de cultura.
Description
[01] A presente invenção refere-se a um novo sistema para a maturação de oócitos in vitro, daqui em diante denominado como "sistema folicular". O sistema folicular proposto compreende um método de cultura em duas etapas combinado com uma estratégia para obter oócitos especificamente adequados para o protocolo de cultura, visando melhorar a maturação de oócitos.
[02] Mais especificamente, o sistema folicular proposto visa proporcionar ao oócito um ambiente mais fisiológico para o seu desenvolvimento, a fim de adquirir totalmente a competência meiótica e de desenvolvimento, que estão ambos relacionados com a capacidade do oócito para completar a divisão meiótica, para ser fertilizado e se desenvolver em um embrião viável.
[03] A invenção aqui proposta refere-se ainda a um kit compreendendo o meio básico e os componentes do método de cultura em duas etapas, bem como o protocolo para a obtenção dos oócitos na fase de desenvolvimento perfeita para o sistema de cultura.
[04] Em tecnologias de reprodução assistida (TRA), a produção de embriões in vitro (PIV) desperta grande interesse econômico, tanto na produção pecuária quanto biomedicina. Na produção pecuária, PIV permite otimizar a exploração do potencial reprodutivo de animais de alto mérito e, portanto, a produtividade do rebanho. Na medicina humana, PIV é amplamente utilizada em casos de infertilidade feminina ou masculina.
[05] Apesar de sua viabilidade comercial, na criação de animais e medicina, PIV tem uma eficiência limitada. Para ilustrar, apenas cerca de 30-35% dos gametas femininos (oócitos) recuperados a partir de vacas e submetidos a PIV são capazes de gerar embriões viáveis.
[06] Melhorias na taxa de produção e qualidade do embrião iria proporcionar ganhos econômicos substanciais na criação de animais e medicina. A ineficiência dos sistemas de cultura existente para promover maturação de oócitos in vitro (MIV), a fase que deve preceder a fertilização in vitro (FIV), é um dos principais problemas tecnológicos para PIV.
[07] É conhecido, a partir da técnica, que oócitos maturados in vitro têm menor fertilidade em comparação com oócitos maturados in vivo. Os sistemas de cultura atualmente utilizados para MIV promovem a maturação nuclear de oócitos e rápida perda de comunicação mediada por junções comunicantes (GJC) entre o oócito e as células vizinhas (células de cumulus). O fechamento repentino de comunicações entre estes compartimentos celulares tem sido demonstrado afetar a realização completa de competência de desenvolvimento embrionário antes do início da retomada meiótica.
[08] Assim, o conceito de pré-maturação como um processo de "capacitação" de oócito surgiu. A população de oócitos que é isolada a partir do ovário é muito heterogênea e vem de folículos em fases diferentes de desenvolvimento. Além disso, como com a excepção do folículo ovulatório, nenhum outro folículo alcança a fase ovulatória de desenvolvimento no mesmo ciclo do ovário (em espécies mono- ovulatórias como bovinos e seres humanos, ciclo estral ou menstrual, respectivamente); a grande maioria dos oócitos restantes no ovário é destinado a regredir e morrem durante o processo chamado atresia folicular.
[09] Com base neste raciocínio, vários laboratórios têm tentado desenvolver sistemas de pré-maturação para colmatar o estado de imaturidade do oócito na altura do seu isolamento a partir do folículo do ovário. Vários estudos tentaram promover a conclusão do desenvolvimento por cultura do oócito por diferentes períodos, evitando a retomada meiótica espontânea por adição de agentes farmacológicos que mantêm o oócito em paragem meiótica.
[010] Para ilustrar este cenário, os documentos CN102676450 e US20090137478 referem-se a métodos que utilizam hormônios (LH e FSH, por exemplo) para promover a maturação do oócito in vitro e in vivo, respectivamente. Por outro lado, os documentos WO200032140, WO9419455 e CN103923878 revelam a combinação de hormônios, citocinas e fatores de crescimento para a mesma finalidade.
[011] Embora os biólogos reprodutivos ainda não tenham descoberto a "fórmula mágica" para MIV, vários sistemas de cultura, incluindo uma fase de pré-maturação utilizando agentes farmacológicos susceptíveis de retardar a maturação nuclear (retomada meiótica) foram testados sem sucesso consistente. Isto é principalmente devido à falta de gradualidade na estimulação durante o tempo de pré- maturação.
[012] Em vista deste fato, a presente invenção refere- se a um sistema folicular para maturação de oócito in vitro, que tem por objetivo melhorar a eficiência de PIV, fornecendo ao oócito um ambiente mais fisiológico e adequado para a aquisição de competência para completar a meiose, para ser fertilizado e produzir um embrião com alto potencial de desenvolvimento.
[013] O sistema folicular proposto compreende um método de cultura em duas etapas combinado com uma estratégia para obter oócitos especificamente adequados para o protocolo de cultura, visando melhorar a maturação do oócito.
[014] A cultura contém agentes presentes no folículo ovariano que são conhecidos por estarem envolvidos na regulação da maturação do complexo cumulus-oócito. Além disso, com vista à obtenção de oócitos no estágio de maturação apropriado para a composição do sistema folicular, a consideração da fase de crescimento folicular no doador fêmea também é importante. Portanto, o sistema folicular inclui uma estratégia para sincronizar e estimular o crescimento de folículos do ovário no doador visando obter oócitos especificamente adequados para o protocolo de cultura.
[015] Métodos em duas etapas são também revelados nos documentos CA2015707 e CN101225373 e o documento da técnica anterior mais próximo é CN102899286, que compreende uma etapa de pré-maturação utilizando hormônios. No entanto, as concentrações de hormônio reveladas no documento são muito mais altas e não são compatíveis com as condições fisiológicas desejadas da presente invenção.
[016] A invenção aqui proposta refere-se ainda a um kit que compreende o meio básico e os componentes do método de cultura em duas etapas, bem como o protocolo para a obtenção dos oócitos na fase de desenvolvimento perfeita para o sistema de cultura.
[017] O conceito de pré-maturação como uma forma de melhorar a competência de desenvolvimento de oócitos isolados de folículos em crescimento não é nova. No entanto, a presente invenção aborda o conceito de pré-maturação com um sistema fisiológico evitando metodologias farmacológica anteriormente propostas e potencialmente prejudiciais para o metabolismo do complexo cumulus-oócito. Outro aspecto inovador do sistema aqui proposto é a sincronização da atividade folicular do ovário no doador para obter uma população homogênea de oócitos em uma fase de desenvolvimento especificamente compatível com o sistema de cultura.
[018] Além disso, a formulação do sistema folicular para a maturação dos oócitos (MIV) integrando agentes biológicos presentes nos folículos do ovário conhecidos por estarem envolvidos na regulação da maturação do complexo cumulus- oócito não tem precedentes.
[019] A presente invenção refere-se a um sistema folicular para a maturação de oócitos in vitro utilizando um método de cultura em duas etapas combinado com uma estratégia para obter uma população homogênea de oócitos especificamente adequada para o protocolo de cultura, visando melhorar a maturação do oócito.
[020] O sistema visa fornecer ao oócito um ambiente mais fisiológico para o seu desenvolvimento, a fim de adquirir totalmente a competência meiótica e de desenvolvimento.
[021] A invenção refere-se ainda a um kit que compreende o meio básico e os componentes do método de cultura em duas etapas, bem como o protocolo para a obtenção dos oócitos na fase de desenvolvimento perfeita para o sistema de cultura.
[022] A Figura 1 é um gráfico que mostra o efeito de diferentes meios de cultura na percentagem de oócitos em vesícula germinal (GV), desagregação da vesícula germinal (GVBD) e metafase I (MI) após 6 horas de cultura.
[023] A Figura 2 é um gráfico que mostra o efeito de diferentes meios de cultura na percentagem de complexos cumulus-oócitos com comunicações mediadas por junção de comunicação aberta.
[024] A invenção aqui revelada refere-se a um sistema folicular para a maturação de oócitos in vitro, que combina um método de cultura de duas etapas e uma estratégia para obter uma população homogênea de oócitos especificamente adequadas para o protocolo de cultura, visando melhorar a maturação do oócito.
[025] Especificamente, o invento visa melhorar a eficiência de PIV, fornecendo ao oócito um ambiente mais fisiológico e adequado para o seu desenvolvimento a fim de adquirir totalmente a capacidade meiótica e de desenvolvimento para ser fertilizado e para produzir um embrião com alto potencial de desenvolvimento.
[026] Para este fim, é aqui proposto um sistema folicular que compreende agentes biológicos em um método de cultura de duas etapas, a saber: - etapa de pré-maturação, que imita o ambiente folicular pré-ovulatório e a qual duração se estende de 6 a 12 horas, e - etapa de MIV, que imita o ambiente folicular após a ativação da cascata ovulatória e a qual duração se estende de 20 a 24 horas.
[027] O método de cultura em duas etapas é combinado com uma estratégia de sincronização para obter oócitos especificamente adequados para o protocolo de cultura, uma vez que o padrão de crescimento folicular no doador fêmea é um fator importante para obter oócitos em uma fase de maturação apropriada para a composição do sistema folicular.
[028] Assim, espera-se aumentar a taxa de produção de embriões, a qualidade dos embriões produzidos através de tecnologias in vitro e, por conseguinte, o rendimento e a rentabilidade de PIV.
[029] O método de cultura em duas etapas do sistema folicular aqui revelado compreende um meio de base, que é suplementado com peptídeos e hormônios que estão presentes naturalmente no fluido folicular, em concentrações próximas às suas concentrações fisiológicas para cada etapa.
[030] Em uma modalidade exemplar da presente invenção, o sistema folicular é utilizado para melhorar a maturação de oócitos em gado. O meio de base habitualmente utilizado [TCM 199 com sais de Earle, glutamina, NaHCO3, amicacina (75 μg/mL), piruvato (22 μg/mL) e albumina de soro bovino (4 mg/mL)] é suplementado com os seguintes componentes (intervalos de dose de cada constituinte em cada etapa do sistema de cultura são mostrados na tabela abaixo): - Hormônios: estradiol; progesterona; testosterona ou androstenediona e rFSH (hormônio estimulante do folículo recombinante). - Peptídeos: NPPC (peptídeo natriurético tipo C), IGF1 (fator de crescimento 1 semelhante à insulina), AREG (anfirregulina), FGFs (fatores de crescimento de fibroblasto), BMP (proteínas morfogenéticas do osso) e cumulin. Tabela 1 - Componentes do meio de cultura para a etapa de pré-maturação Tabela 2 - Componentes do meio de cultura para a etapa de MIV
[031] A presença de fatores de crescimento de fibroblastos, proteínas morfogenéticas dos ossos e cumulin não é obrigatória.
[032] O sistema folicular proposto compreende agentes fisiológicos que impedem a retomada e progressão meiótica, enquanto suporta o metabolismo das células do cumulus e a sua comunicação com o oócito.
[033] É importante ressaltar que as doses e tempo de cultura para ambas as etapas variam de acordo com raças de gado, espécie, idade e estado metabólico do doador.
[034] Também é importante que os oócitos sejam obtidos em um estágio específico de desenvolvimento que possam se beneficiar do sistema de cultura. Devido a este fato, o sistema folicular é combinado com uma estratégia de sincronização para se obter oócitos especificamente adequados para o protocolo de cultura.
[035] O protocolo para a sincronização do ovário e estimulação do crescimento folicular combina aspiração folicular guiada por ultrassom (visando eliminar os folículos mais antigos a partir de ciclos anteriores maiores do que 5 mm e para induzir o surgimento de uma coorte sincronizado de folículos) com a estimulação do crescimento do folículo por meio da administração de BSTr (somatrotopina bovina recombinante, 250-500 mg, por via subcutânea) 7 dias antes da aspiração do folículo e/ou FSH (100-300 mg, por via intramuscular) no mesmo dia da aspiração folicular de sincronização. Os oócitos sincronizados serão coletados por aspiração folicular guiada por ultrassom 2-4 dias mais tarde.
[036] É necessário salientar que o protocolo de sincronização deve ser adaptado para a utilização em outras espécies e mulheres, utilizando doses específicas da espécie e protocolos hormonais.
[037] Assim, o sistema folicular para melhorar a maturação dos oócitos da invenção compreende o sistema de cultura em duas etapas combinado com a sincronização folicular no doador do oócito, conforme detalhado acima.
[038] A finalidade da etapa de pré-maturação é expor o complexo de cumulus-oócitos a agentes fisiológicos que estimulam as funções das células do cumulus e a sua comunicação com o oócito e a cross-talk global entre os dois compartimentos.
[039] A Figura 1 demonstra que a fase de pré-maturação folicular do sistema aqui proposto eficazmente prendeu a maturação nuclear durante 6 horas, tal como indicado pela manutenção do estágio de vesícula germinal (GV).
[040] No que diz respeito as legendas, básico corresponde meio básico (sem fatores foliculares); FS corresponde ao meio básico mais estradiol, progesterona, androstenediona, FSH e IGF1 perto de concentrações fisiológicas e FS + NPPC corresponde ao meio básico mais estradiol, progesterona, androstenediona, FSH, IGF1 e NPPC perto de concentrações fisiológicas.
[041] Apenas para contextualização, no folículo, o oócito é preso na prófase da primeira divisão meiótica desde estágios iniciais do desenvolvimento folicular. A repartição da vesícula germinal corresponde ao desaparecimento do envelope nuclear e marca a retomada meiótica.
[042] Além disso, a etapa de pré-maturação do sistema folicular prolongou a funcionalidade de comunicação por junção comunicante entre as células de oócitos e cumulus, em que a funcionalidade da junção comunicante foi avaliada durante 9 horas de cultura por microinjeção de corante fluorescente no oócito, seguido por medição de transferência de corante para as células de cumulus (como pode ser visto nas Figura 2). As definições para básico, FS e FS + NPPC são iguais à Figura 1.
[043] A invenção refere-se ainda a um kit que compreende o meio básico e os componentes do método de cultura em duas etapas, bem como o protocolo para a obtenção dos oócitos na fase de desenvolvimento perfeita para o sistema de cultura.
[044] O meio de base habitualmente utilizado [TCM 199 com sais de Earle, glutamina, NaHCO3, amicacina (75 μg/mL), piruvato (22 μg/mL) e albumina sérica bovina (4 mg/mL)] é suplementado com hormônios e peptídeos, que são proporcionados nos seguintes intervalos de concentração. Tabela 1 - Componentes do meio de cultura para a etapa de pré-maturação Tabela 2 - Componentes do meio de cultura para a etapa de MIV
[045] É importante enfatizar que as doses podem variar de acordo com as raças de gado, espécie, idade e estado metabólico do doador. Além disso, a presença de fatores de crescimento de fibroblastos, proteínas morfogenéticas do osso e cumulin não é obrigatória.
[046] O protocolo propõe ainda a utilização do sistema de cultura acima descrito, em combinação com aspiração folicular guiada por ultrassom e estimulação do crescimento do folículo por meio da administração de hormônios, de modo a obter uma população homogênea de oócitos em uma fase adequada de desenvolvimento para o sistema de cultura.
Claims (2)
1. Sistema folicular para a maturação de oócitos in vitro CARACTERIZADO pelo fato de combinar agentes biológicos em um método de cultura de duas etapas e uma estratégia de sincronização para obter uma população homogênea de oócitos especificamente adequada para o protocolo de cultura, o qual compreende: - uma etapa de pré-maturação a qual duração se estende de 6 a 12 horas, e - uma etapa de maturação de oócitos in vitro (MIV), a qual duração se estende de 20 a 24 horas. - um meio de base complementado com peptídeos e hormônios que estão presentes naturalmente no fluido folicular, em que os peptídeos são selecionados a partir de NPPC, IGF1, AREG, FGFs, BMP e cumulin e os hormônios são selecionados a partir de estradiol; progesterona; testosterona ou androstenediona e rFSH. - o meio de base ser TCM 199 com sais de Earle, glutamina, NaHCO3, 75 μg/mL de amicacina, 22 μg/mL de piruvato e 4 mg/mL de albumina de soro bovino. - os componentes do meio de cultura na etapa de pré- maturação serem: - 250-500 ng/mL de estradiol; - 20-70 ng/mL de progesterona; - 20-70 ng/mL de testosterona; - 20-70 ng/mL de androstenediona; - 10-100 pg/mL de FSH; - 50-200 pmol/mL de NPPC; e - 5-25 ng/mL de IGF1. - os componentes do meio de cultura na etapa de MIV serem: - 25-50 ng/mL de estradiol; - 100-200 ng/mL de progesterona; - 10-50 ng/mL de testosterona; - 10-50 ng/mL de androstenediona; - 1-10 pg/mL de FSH; - 50-100 ng/mL de anfiregulina; e, alternativamente, - 10-100 ng/mL de FGFs 2, 10 e 17; - 50-150 ng/mL de BMP15 e GDF9; e - 10-50 ng/mL de Cumulin. - a estratégia de sincronização combinar aspiração folicular guiada por ultrassom com a estimulação do crescimento do folículo pela administração de 250-500 mg de BSTr por via subcutânea a 7 dias antes da aspiração folicular e/ou 100-300 mg de FSH por via intramuscular no mesmo dia da aspiração folicular de sincronização; - os oócitos sincronizados serem coletados por aspiração folicular guiada por ultrassom 2-4 dias mais tarde.
2. Kit para a maturação in vitro de oócitos CARACTERIZADO pelo fato de ele compreender: - o meio básico, - os componentes do método de cultura em duas etapas, - protocolo para a obtenção dos oócitos no estágio de desenvolvimento perfeito para o sistema de cultura; - o meio de base ser TCM 199 com sais de Earle, glutamina, NaHCO3, 75 g/mL de amicacina, 22 pg/mL de piruvato e 4 mg/mL de albumina de soro bovino; - os componentes do meio de cultura para a preparação da etapa de pré-maturação serem: - 250-500 ng/mL de estradiol; - 20-70 ng/mL de progesterona; - 20-70 ng/mL de testosterona; - 20-70 ng/mL de androstenediona; - 10-100 pg/mL de FSH; - 50-200 pmol/mL de NPPC; e - 5-25 ng/mL de IGF1. - os componentes do meio de cultura da etapa de MIV serem: - 25-50 ng/mL de estradiol; - 100-200 ng/mL de progesterona; - 10-50 ng/mL de testosterona; - 10-50 ng/mL de androstenediona; - 1-10 pg/mL de FSH; - 50-100 ng/mL de anfiregulina; e, alternativamente, - 10-100 ng/mL de FGFs 2, 10 e 17; - 50-150 ng/mL de BMP15 e GDF9; e - 10-50 ng/mL de Cumulin. - o protocolo indicar a combinação de aspiração folicular guiada por ultrassom com a estimulação de crescimento do folículo por meio da administração de hormônios.
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