KR102183228B1

KR102183228B1 - 난자의 체외성숙 및 초기배 발달 향상을 위한 미토 템포(Mito-TEMPO)를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 배양 방법

Info

Publication number: KR102183228B1
Application number: KR1020190077797A
Authority: KR
Inventors: 구덕본; 박효진; 양슬기
Original assignee: 대구대학교 산학협력단
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2020-11-25

Abstract

본 발명은 미토 템포(Mito-TEMPO)를 포함하는 난자 체외 성숙용 배양액 조성물, 상기 배양액 조성물이 첨가된 체외 성숙용 배지에서 난자를 체외 성숙시키는 단계를 포함하는 난자의 체외 성숙 방법, Mito-TEMPO를 포함하는 수정란의 체외 배양용 조성물 및 상기 체외 배양용 조성물이 첨가된 체외 배양용 배지에서 수정란을 체외 배양하는 단계를 포함하는 수정란의 체외 배양 방법에 관한 것이다.
본 발명의 Mito-TEMPO를 포함하는 난자 체외 성숙용 배양액 조성물 또는 수정란의 체외 배양용 조성물은 포유동물의 미성숙 난자 또는 체외 수정에 의해 생성된 수정란의 성숙 및 발달 과정에서 미토콘드리아 유래 초과산화물을 제거함으로써 핵 성숙율을 증가시키거나 수정란의 난할율 및 배반포 단계로의 발달 효율을 증가시키는 바, 난자의 성숙 효율 및 초기배(early embryo) 품질 개선을 통해 난임 환자를 대상으로 한 체외/인공 수정시 착상 효율을 높이거나, 난임 기전에 대한 연구 및 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

난자의 체외성숙 및 초기배 발달 향상을 위한 미토 템포(Mito-TEMPO)를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 배양 방법 {Composition for in vitro oocyte maturation and early embryonic development comprising Mito-TEMPO and culture method using the same}

본 발명은 미토 템포(Mito-TEMPO)를 포함하는 난자 체외 성숙용 조성물, 상기 조성물이 첨가된 체외 성숙용 배지에서 난자를 체외 성숙시키는 단계를 포함하는 난자의 체외 성숙 방법, Mito-TEMPO를 포함하는 수정란의 체외 배양용 조성물 및 상기 체외 배양용 조성물이 첨가된 체외 배양용 배지에서 수정란을 체외 배양하는 단계를 포함하는 수정란의 체외 배양 방법에 관한 것이다.

최근 출산 연령이 높아지고, 식습관의 변화 및 스트레스 등 다양한 원인에 의한 난임으로 인해 저출산 문제가 사회적인 문제로 알려져 있다. 이러한 난임 극복을 위한 치료 방법에는 보조 생식술, 인공수정 및 체외배양 시스템을 통한 체외수정과 배아 생성 등이 알려져 있다. 그 중 포유동물을 이용한 난모세포의 체외성숙을 통한 품질 향상 및 체외배양을 통한 배아 및 배반포의 생성 효율 증가는 착상 및 임신율의 증가로 이어지는바, 이에 대한 연구는 난임 문제의 극복을 위해 반드시 필요하다. 그러나 수정란과 관련된 연구가 활발하게 이루어지고 있음에도 불구하고 현재 체외성숙 및 수정을 통해 생성된 배반포의 품질은 여전히 낮은 수준이다.

대표적인 포유동물로 돼지의 난포란은 체외성숙(In vitro maturation) 시스템을 통해서 이루어지며, 성숙된 난자의 상태 및 품질은 향후 체외수정(In vitro fertilization)을 통한 배아(embryo) 및 배반포(blastocyst) 단계로의 발달과 관련되기 때문에 매우 중요하다. 현재 돼지 체외배양 시스템은 난소의 난포로부터 얻은 미성숙 난구세포·난모세포 복합체(COCs)를 체외 배양액 500μl에 50-60개 정도를 넣고 44시간 동안 성숙을 유도하는 것으로 알려져 있다.

이러한 체외배양 시스템을 통해 성숙된 난자 및 수정란 그리고 배아를 생성하는 과정은 체내와는 달리 배양하는 조건 그리고 환경에 따라 다양한 영향 및 손상을 받을 수 있다. 돼지 난모세포는 체외성숙 과정 동안 미토콘드리아로부터 생산되는 ATP(adenosine tri-phosphate)를 높은 수준으로 필요로 하는데, 일반적으로 ATP가 생산될 때 미토콘드리아 내막에 존재하는 호흡계 회로의 전자전달로부터 활성산소(reactive oxygen species: ROS)가 생성된다. 이러한 과정에서 세포 내 ROS가 축적되거나 다량으로 생성될 경우 산화적 스트레스 및 에너지 생산 감소 등의 문제가 발생하고, 미토콘드리아의 기능 저하와 같은 세포 내 손상을 일으킬 수 있다.

최근 이러한 미토콘드리아 유래 초과산화물의 생성은 미토콘드리아의 기능, 다이나믹스(dynamics) 및 세포 사멸과 관련되는 것으로 보고되었다. 구체적으로, 미토콘드리아 유래 초과산화물을 포함하는 활성산소의 과도한 생성은 미토콘드리아 분열 반응 또는 불충분한 미토콘드리아 융합에 의해 미토콘드리아 단편화(fragmentation)를 유도한다. 이러한 미토콘드리아 단편화는 세포 내 호흡 및 에너지 생산 감소로 이어지며, 나아가 미토콘드리아 막전위(mitochondria membrane potential: MMP)가 무너지고 미토콘드리아 유래 세포 사멸까지 이어질 수 있다.

비스페놀 A(Bisphenol A, BPA)는 대표적인 환경호르몬으로서 플라스틱류, 비닐 등에 함유되어 있는 물질이다. 이러한 BPA는 세포 내에서 산화적 스트레스, 세포 사멸, 세포기능 이상을 일으키고, 성 호르몬인 에스트로겐을 교란시켜 생식 기관의 장애를 유발시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근 연구에서 BPA는 중요 세포 소기관인 미토콘드리아의 기능 이상, 미토콘드리아 유래 활성산소의 생성 및 세포 사멸과도 관련 있는 것으로 보고되었다.　이러한 BPA는 난모세포의 체외성숙 및 수정란의 체외배양 과정에서 사용되는 플라스틱 디쉬(dish) 또는 보관 용기로부터 노출될 수 있으며, 이 경우 BPA 유래 미토콘드리아 초과산화물 생성은 난자의 핵 성숙율 및 성숙된 난자의 발달 효율을 저하시키는 주요 원인이 될 수 있다.

한편, 체외수정에 의한 수정란을 체외 배양하는 과정에 있어서, 세포질 내 지질 함유량에 따라 비균등한 세포질이 관찰되는 수정란의 경우 배반포로의 발달에 필요한 균등한 난할 및 원활한 ATP 공급 여부 등의 차이로 인해 이후 발달 과정에서 비균등 난할을 보이거나 발달의 진행이 정지될 수 있으며, 나아가 세포 사멸이 일어나는 비율 또한 높은 것으로 알려져 있다. 이에, 체외수정에 의해 생성된 수정란이 균등하지 않은 세포질을 나타낼 경우 체외 배양시 정상적인 배반포로의 발달율이 현저히 떨어지는 문제가 발생할 수 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명의 발명자들은 최근 미토 템포(Mito-TEMPO)를 이용한 미토콘드리아 내 초과산화물 생성 조절과 이에 따른 기능 유지를 포유동물의 초기배 발달 과정 동안 새로운 조절 메커니즘으로 제시한바 있으며, 이를 기초로 포유동물 난자의 체외 성숙 및 배양을 위한 조성물 및 배양 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, Mito-TEMPO를 포함하는 난자 체외 성숙 및 배양용 조성물이 BPA에 의한 미토콘드리아 내 초과산화물 생성을 억제하여 난자의 핵 성숙율 및 성숙된 난자의 발달 효율을 증가시키고, 비균등 세포질이 관찰되는 수정란에 대해서도 배판포로의 발달 효율을 증가시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 미토 템포(Mito-TEMPO)를 포함하는, 난자 체외 성숙용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 a) 인간을 제외한 포유동물의 미성숙 난자를 준비하는 단계; b) 상기 난자 체외 성숙용 조성물이 첨가된 체외 성숙용 배지에서 난자를 체외 성숙시키는 단계; 및 c) 성숙된 난자를 배양하여 MⅡ 단계의 성숙된 난자를 수득하는 단계를 포함하는, 난자의 체외 성숙 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 미토 템포(Mito-TEMPO)를 포함하는, 수정란 체외 배양용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 a) 인간을 제외한 포유동물의 체외수정에 의한 수정란을 준비하는 단계; b) 상기 수정란 체외 배양용 조성물이 첨가된 체외 배양용 배지에서 수정란을 체외 배양하는 단계; 및 c) 체외 배양을 통해 배반포 단계로 발달된 수정란을 수득하는 단계를 포함하는, 수정란의 체외 배양 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 미토 템포(Mito-TEMPO)를 포함하는, 난자 체외 성숙용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "미토 템포(Mito-TEMPO)"는 초과산화물(superoxide) 및 알킬 라디칼에 대한 소거 특성을 갖는 미토콘드리아-표적 항산화제로, 실험식은 C₂₉H₃₅N₂O₂PCl, 분자량은 약 510.03이며, 이는 아래 화학식 1로 표현될 수 있다.

[화학식 1]

본 발명에서 사용한 Mito-TEMPO의 항산화적 효과, 즉 미토콘드리아 유래 초과산화물의 조절·제거 효과는 미성숙 난자의 체외 핵 성숙 효율 증가 및 체외수정된 수정란의 초기배(early embryo) 발달 효율 증가에 직접적으로 관련된 것으로, 이를 난임 환자를 대상으로 한 체외/인공 수정시 착상 효율의 증가 또는 난임 기전에 대한 연구 목적으로 활용할 수 있음은 본 발명의 발명자들에 의해 최초로 밝혀진 것이기에 그 의의가 크다.

구체적으로, 본 발명에서 사용한 Mito-TEMPO는 난자의 체외 성숙을 위한 배지에 0.1 내지 1.0 μM 농도로 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 1.0 μM 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "난자(oocyte)"는 여성 또는 암컷의 생식세포로 생식기관인 난소에서 방출되는 단세포를 의미하나 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명의 난자는 난소로부터 채취된 난포의 난포액으로부터 수득된 난포란(follicular oocyte) 또는 성숙된 난포란에서 난구세포를 제거한 난모세포를 의미하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 본 발명의 목적상 MⅡ(제2 감수분열 중기) 단계의 난자를 의미할 수 있다.

본 발명의 난자는 포유동물의 난자를 의미하는 것일 수 있으며, 상기 용어 "포유동물"은 개, 고양이, 양, 소, 마우스, 래트, 토끼 등을 의미하며, 바람직하게는 돼지를 의미하는 것일 수 있으나 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "체외 성숙(in vitro　maturation, IVM)"은 난소 내 난포로부터 분리된 난포란 또는 난자를 체외의 배지에서 성숙시키는 것으로, 성숙한 난자의 체외 수정(in vitro　fertilization, IVF) 및 수정란의 체외　배양(in vitro　culture, IVC) 기술을 통해 배아(embryo) 및 배반포(blastocyst)를 형성시키고, 나아가 이를 자궁 내에 착상시켜 착상 및 임신율을 증가시키기 위한 목적으로 수행될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 "배지" 또는 "체외 성숙용 배지"는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하여 생체 외에서 세포의 성장 및 성숙을 가능케 하는 물질을 의미하며, 구체적으로 미성숙한 난포란 또는 난자의 체외 성숙을 수행하기 위해 사용되는 기본배지를 제한없이 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 배지는 상피세포성장인자(EGF), 여포 자극 호르몬(FSH), 황제형성호르몬(LH) 또는 난포액 등이 포함된 배지일 수 있으며, 난포란 또는 난자의 종류에 따라 당업자가 공지된 배지를 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.

예컨대, 상기 배지는 North Carolina State University-23(NCSU-23) 기본 배지에 10% porcine follicular fluid, 10 IU/ml human chorionic gonadotropin(hCG), 10 IU/ml pregnant mare’s serum gonadotropin(PMSG), 10 ng/ml epidermal growth factor(EGF), 10 ng/ml β-mercaptoethanol 및 0.57mM cystein을 포함할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 NCSU-23 배지에 Mito-TEMPO 0.1, 0.5 또는 1.0 μM을 첨가한 배지를 사용하여 난자의 체외 성숙시 핵 성숙율에 미치는 영향을 평가하였다.

본 발명에서 상기 Mito-TEMPO를 포함하는 난자 체외 성숙용 조성물은 난자의 핵 성숙율을 증가시키는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 상기 난자의 핵 성숙율 증가는 초과산화물(superoxide) 생성을 억제함으로써 이루어지는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 초과산화물의 생성은 비스페놀 A(Bisphenol A, BPA)에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 BPA는 난자의 체외성숙 및 수정란의 체외배양 과정에서 사용되는 플라스틱 디쉬(dish) 또는 보관 용기 등으로부터 노출될 수 있으며, 이 경우 BPA 유래 미토콘드리아 초과산화물 생성은 난자의 핵 성숙율 및 성숙된 난자의 발달 효율을 저하시키는 주요 원인이 될 수 있는바, Mito-TEMPO를 포함하는 상기 조성물은 이러한 원인을 제거하고 난자의 핵 성숙율 증가에 유용하게 활용될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 a) 인간을 제외한 포유동물의 미성숙 난자를 준비하는 단계; b) 상기 난자 체외 성숙용 조성물이 첨가된 체외 성숙용 배지에서 난자를 체외 성숙시키는 단계; 및 c) 성숙된 난자를 배양하여 MⅡ 단계의 성숙된 난자를 수득하는 단계를 포함하는, 난자의 체외 성숙 방법을 제공한다. 상기 용어 포유동물, 난자 및 체외 성숙은 전술한 바와 같다.

상기 b) 난자를 체외 성숙시키는 단계에 있어서, 상기 체외 성숙용 배지는 예컨대, North Carolina State University-23(NCSU-23) 기본 배지에 10% porcine follicular fluid, 10 IU/ml human chorionic gonadotropin(hCG), 10 IU/ml pregnant mare’s serum gonadotropin(PMSG), 10 ng/ml epidermal growth factor(EGF), 10 ng/ml β-mercaptoethanol 및 0.57mM cystein 을 포함할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 b) 단계는 미성숙 난자들을 22시간 동안 배양한 후, 상기 PMSG와 hCG가 첨가되지 않은 배지에서 22시간 동안 추가 배양하여 수행될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 c) 성숙된 난자를 수득하는 단계에 있어서, MⅡ 단계의 성숙된 난자에서의 핵 성숙율이 가장 높았으며, BPA 전처리 후 Mito-TEMPO 처리시 감소되는 핵 성숙 효율에 대한 극복 효과가 우수함을 확인하였다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 미토 템포(Mito-TEMPO)를 포함하는, 수정란 체외 배양용 조성물을 제공한다. 상기 용어 미토 템포는 전술한 바와 같으며, 본 발명에서 사용한 Mito-TEMPO는 수정란의 체외 배양을 위한 배지에 0.1 내지 1.0 μM 농도로 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 1.0 μM 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "수정란(fertilized　ovum)"은 반수체 정자의 핵과 반수체 난자의 핵이 합쳐져 융합하는 수정의 결과로 생성되는 것으로, 접합자(zygote)라고도 한다. 구체적으로, 본 발명의 수정란은 체외 수정(in vitro　fertilization, IVF) 및 체외　배양(in vitro　culture, IVC)에 의해 생성된 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 용어 "포유동물"은 개, 고양이, 양, 소, 마우스, 래트, 토끼 등을 의미하며, 바람직하게는 돼지를 의미하는 것일 수 있으나 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "체외　배양(in vitro　culture, IVC)"은 상기 수정란을 체외의 배지에서 배양하는 것을 의미하며, 상기 수정란은 체외 수정(in vitro　fertilization, IVF) 또는 인공 수정을 통해 생성된 것으로, 수정란의 체외 배양을 통해 배아 및 배반포를 형성시키고, 나아가 이를 자궁 내에 착상시켜 착상 및 임신율을 증가시키기 위한 목적으로 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 Mito-TEMPO를 포함하는 수정란 체외 배양용 조성물은 수정란의 발달 효율을 증가시키는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 상기 수정란의 발달 효율 증가는 초과산화물 생성 억제에 의한 난할율 증가 및 배반포 단계로의 발달 효율 증가를 의미하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 초과산화물의 생성은 비스페놀 A(BPA)에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 "체외 배양용 배지"는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하여 생체 외에서 세포의 성장 및 증식을 가능케 하는 물질을 의미하며, 구체적으로 체외 수정된 수정란을 배양하기 위해 사용되는 기본배지를 제한없이 포함할 수 있다. 상기 배지는 체외 수정된 수정란의 종류에 따라 당업자가 공지된 배지를 적절하게 선택하여 사용할 수 있으며, 예컨대 porcine zygote medium-3 (PZM-3) 또는 SOF-BE1 (modified synthetic oviduct fluid-bovine embryo 1) 배지 등을 사용할 수 있으나 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 PZM-3 배지에 Mito-TEMPO 1.0 μM을 첨가한 배지를 사용하여 수정란의 난할율 및 배반포 단계로의 발달 효율을 평가하였고, 수정란의 체외수정 후 2일 뒤 배지를 교체할 때에도 1.0 μM Mito-TEMPO를 포함하는 PZM-3 배지를 이용하여 체외 배양하였다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 a) 인간을 제외한 포유동물의 체외수정에 의한 수정란을 준비하는 단계; b) 상기 수정란 체외 배양용 조성물이 첨가된 체외 배양용 배지에서 수정란을 체외 배양하는 단계; 및 c) 체외 배양을 통해 배반포 단계로 발달된 수정란을 수득하는 단계를 포함하는, 수정란의 체외 배양 방법을 제공한다. 상기 용어 포유동물, 수정란 및 체외 배양은 전술한 바와 같다.

본 발명의 일 실시예에서는 PZM-3 배지에 Mito-TEMPO 1.0 μM을 첨가한 배지를 사용하여 수정란을 체외 배양함에 있어 돼지 초기배 발달을 확인하기 위해 배반포 단계로의 발달율 차이를 보이는 두 그룹으로 나누어 평가하였다. 구체적으로, 돼지 수정란의 비균등 세포질이 관찰되는 군(Group 2: G2)이 세포질이 균등한 군(Group 1: G1) 대비 미토콘드리아 유래 초과산화물 생성이 높았고, 미토 템포를 포함하는 수정란 체외 배양 배지를 사용한 경우 미토콘드리아 유래 초과산화물을 제거하여 G2의 난할율 및 배반포 단계로의 발달 효율을 G1과 유사한 수준으로 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 미토 템포(Mito-TEMPO)를 포함하는 난자 체외 성숙용 조성물 또는 수정란의 체외 배양용 조성물은 포유동물의 미성숙 난자 또는 체외 수정에 의해 생성된 수정란의 성숙 및 발달 과정에서 미토콘드리아 유래 초과산화물을 제거함으로써 핵 성숙율을 증가시키거나 수정란의 난할율 및 배반포 단계로의 발달 효율을 증가시키는 바, 난자의 성숙 효율 및 초기배(early embryo) 품질 개선을 통해 난임 환자를 대상으로 한 체외/인공 수정시 착상 효율을 높이거나, 난임 기전에 대한 연구 및 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 체외성숙 배양액에 BPA의 노출 농도에 따른 돼지 난포란의 체외 핵 성숙율을 나타낸 것이다.
도 2는 75μM BPA가 함유된 배양액에서 성숙된 돼지 난포란으로부터 미토콘드리아 특이적 초과산화물의 검출을 위해 Mito-SOX 염색 시약을 이용하여 붉은 형광 발현 여부를 확인한 결과, 및 미토콘드리아 특이적 염색 시약인 Mito tracker를 이용하여 미토콘드리아 유래 초과산화물의 검출을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에서 Mito-TEMPO를 포함하는 돼지 난포란의 체외배양 배지를 이용하여 BPA 전처리 후 처리하여 감소되는 핵 성숙율에 대한 회복 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 Mito-SOX를 이용하여 미토콘드리아 유래 초과산화물 생성이 BPA에 의해 증가하였으며, Mito-TEMPO를 함께 처리함에 따라 초과산화물 생성이 감소되는 효과를 돼지 체외성숙 난자에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 체외수정 후 수정란(zygote) 세포질의 밀도 및 Oil Red O 염색을 통한 수정란의 세포질 내 지질 함유량을 기준으로 돼지 초기배 발달율에 차이를 보이는 두 그룹 G1과 G2를 나타낸 것이다.
도 6은 돼지 초기배 발달율에 차이를 보이는 G1과 G2에서 Mito-SOX를 이용하여 미토콘드리아 초과산화물의 생성 여부를 형광 이미지로 나타낸 것이다.
도 7은 Mito-TEMPO가 함유된 체외 배양 배지에서 배양된 G2의 돼지 초기배에서 Mito-SOX를 이용하여 미토콘드리아 유래 초과산화물 생성 여부 변화를 나타낸 것이다.
도 8은 Mito-TEMPO가 함유된 체외 배양 배지에서 배양된 G2 수정란으로부터 생성된 배반포 중 확장된 배반포의 생성 비율을 나타낸 것이다.
도 9는 체외배양 시 상대적으로 세포질 밀도가 높아 배반포 발달율이 높은 G1 수정란을 Mito-TEMPO가 함유된 체외 배양 배지에서 배양한 뒤 배반포의 발달 효율을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 돼지 난포란의 체외성숙 동안 Mito-TEMPO가 함유된 배지 개발 및 돼지 난포란의 핵 성숙 효율에 미치는 영향 조사

본 발명에서 사용한 기본 돼지 난포란의 체외배양액은 NCSU-23을 사용하였다. Mito-TEMPO는 Sigma-Aldrich Korea(St. Louis, MO, USA)로부터 구매하였다. 이전의 연구 결과에서 돼지 난포란의 체외성숙 과정 동안 Mito-TEMPO를 포함하는 배지에서 체외 핵 성숙 효율을 조사한 결과가 보고된 바는 없다. 따라서 본 발명에서는 돼지 체외배양 배지인 NCSU-23에서 0.1, 0.5 그리고 1.0 μM Mito-TEMPO의 처리 농도에 따른 체외성숙 이후 핵상 변화를 조사하였다. 체외성숙 44시간 후, orcein 염색을 이용하여 핵상을 germinal vesicl(GV), germinal vesicle breakdown(GVBD), metaphase I(M I) 그리고 metaphase II (M II)로 나뉘어 조사하였다. 1.0 μM Mito-TEMPO가 함유된 체외성숙 배지에서 44시간 동안 체외성숙을 유도하였을 때, M II 단계까지의 핵 성숙율이 가장 높았다. 이를 기반으로 1.0 μM Mito-TEMPO를 포함하는 NCSU-23 배지를 제조하였다. 상기 Mito-TEMPO 함유 돼지 난포란의 체외성숙 배지에서 핵성숙 효율을 아래 표 1에 나타내었고, 이후 1.0 μM Mito-TEMPO 농도를 이용하여 체외배양 배지 제조에 적용하였다.

Mito-TEMPO (μM)	조사한 난모세포의 수	난모세포(n)의 %
Mito-TEMPO (μM)	조사한 난모세포의 수	GV	GVBD	MI	MII
대조군	251	2.9±4.0 (7)	1.1±1.5 (4)	16.5±8.3 (42)	79.6±12.4 (198)
0.1	231	3.1±3.1 (9)	0.0±0.0 (0)	12.7±7.9 (32)	84.2±10.9 (190)
0.5	247	0.9±2.0 (5)	1.9±1.4 (4)	16.6±8.1 (43)	80.6±8.2 (195)
1.0	242	3.0±2.0 (7)	0.0±0.0 (0)	21.1±15.2 (48)	75.9±15.4 (187)

1-1. 돼지 난포란 체외배양

본 발명에서 사용된 돼지 난소는 지역의 도축장(대구축산물도매시장 신흥산업(주))에서 채취하여 30-35℃온도 조건의 75μg/ml Penicillin G가 첨가된 0.9% 생리식염수가 담긴 보온병에 넣어 실험실로 운반하였다. 생리식염수로 2-3회 세척한 난소는 18 게이지 바늘이 장착된 10ml 주사기를 이용하여 3-6mm 지름의 난포로부터 난포액을 채취하였다. 채취한 난포액은 15분 가량 침전 후 petridish에 옮긴 뒤 실체현미경 아래에서 마우스 피펫을 이용하여 난포란 선별을 진행하였다. 난포란은 tyrode's lactate-4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid(TL-HEPES) 용액과 체외성숙 배양액에서 세척한 다음, 1개의 well당 40-50개의 미성숙한 난포란을 배양액 500 μl씩 분주된 4-well multi dish(NUNC, Roskilde, Denmark)에서 38.5℃, 5% CO₂ 배양기에서 성숙을 진행하였다. 미성숙한 난포란의 체외성숙에 사용된 배양액은 North Carolina State University-23(NCSU-23) 배지이며, 여기에 10% porcine follicular fluid, 10IU/ml pregnant mare serum gonadotropin(PMSG), 10IU/ml human chorionic gonadotropin(hCG), 10ng/ml epidermal growth factor(EGF), 25 μM β-mercaptoethanol 및 0.57mM cysteine을 첨가하여 사용하였다. 총 44시간 체외성숙 중 미성숙 난포란들을 22시간 동안 배양시킨 후, PMSG와 hCG가 첨가되지 않은 배양액에서 22시간 동안 추가 배양하였다. 다양한 Mito-TEMPO의 처리 농도 0.1, 0.5 그리고 1.0 μM 중 가장 핵 성숙 효율이 증가된 효과를 보인 1.0 μM 농도를 함유하는 배양액을 제조하였다.

1-2. 돼지 난포란의 핵 성숙 확인

제조된 0.1, 0.5 및 1.0 μM Mito-TEMPO 농도를 갖는 돼지 체외 성숙 배지에서 orcein 염색을 이용하여 난포란의 핵 성숙 확인하였다. 상기 다른 농도의 Mito-TEMPO를 함유하는 체외배양 배지에서 44시간 동안 성숙된 난포란을 0.1% hyaluronidase를 이용하여 난구세포를 조심스럽게 벗겨준 뒤 0.1% PVA가 포함된 PBS에서 3회 세척하였다. 난구세포가 벗겨진 난모세포는 슬라이드 글라스에 올려 둔 뒤 커버 글라스를 덮어 압착한 뒤 아세트산:에탄올(1:3) 용액에 하루 동안 고정시켰다. 하루 동안 고정된 난모세포는 1% 오르세인 용액에서 10분 동안 염색하였다. 이후 글리세롤:아세트산:물(1:1:3) 용액으로 탈 염색 반응을 실시하고 광학 현미경(Leica, Solms, Germany) 아래에서 핵상을 확인하여 성숙 정도를 판별하였다. 핵상 판별 기준은 핵상의 형태에 따라 구분하였다.

실시예 2: Mito-TEMPO가 함유된 체외성숙 배양을 통해 BPA에 대한 보호 효과 확인

2-1. BPA 노출에 따른 돼지 난포란의 핵 성숙율 변화 조사

Bisphenol A(BPA)는 Sigma-Aldrich Korea (St. Louis, MO, USA)로부터 구매하여 사용하였다. 50, 75 그리고 100 μM BPA 농도에 따른 노출이 돼지 난포란의 핵 성숙에 미치는 영향을 도 1에 나타내었다. 실시예 1)에서 사용한 방법과 같이, BPA 75 μM 농도의 체외성숙 배지에서 성숙된 돼지 난포란에서 대조군과 비교하였을 때 70% 정도의 핵 성숙율을 확인하였다.

2-2. 돼지 난포란에서 BPA 처리에 의한 미토콘드리아 초과산화물 생성 여부를 Mito-SOX를 통해 확인

BPA가 첨가된 체외성숙 배지인 NCSU-23에서 44시간 동안 성숙된 난포란을 0.1% PVA가 포함된 PBS에서 3회 세척하였다. 이후 최종 농도가 4μg/ml이 되도록 Mito-SOX 시약을 체외성숙에 사용된 배양액에 희석 후 38.5℃, 5% CO₂ 배양기에서 30분 동안 염색을 진행하였다. 염색이 끝난 난포란은 2.5% glutaraldehyde 고정액에 4℃에서 하루 동안 고정을 진행하였다. 고정된 난포란은 슬라이드 글라스에 올려준 뒤 커버 글라스로 덮어서 형광현미경(iRiS Digital Cell Imaging System, Logos Biosystems, Gyeonggi-do, South Korea)을 통하여 초과산화물 생성 여부를 발현을 붉은색 형광 발현 양상으로 관찰하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이로부터 미토콘드리아 내 초과산화물을 특이적으로 염색하는 Mito-SOX와 미토콘드리아를 녹색 형광으로 염색하는 Mito tracker로 위치와 적색 형광을 나타내는 위치가 일치함을 확인하였고, 이는 Mito-SOX에 의한 초과산화물의 검출이 미토콘드리아 특이적으로 발생한 것임을 나타낸다.

2-3. BPA 전처리 후 Mito-TEMPO 포함 체외배지를 이용하여 돼지 난포란의 핵 성숙 효율 회복 조사

총 44시간 체외성숙 중 미성숙 난포란들을 22시간 동안 배양시킨 후, PMSG와 hCG가 첨가되지 않은 배양액에서 22시간 동안 추가 배양하는 방법을 기반으로 BPA 전처리와 Mito-TEMPO의 처리를 진행하였다. NCSU-23에 최종 농도 75 μM BPA가 되도록 첨가하여 체외배양 22시간 동안 전처리 한 후, Mito-TEMPO 1.0μM을 포함하는 배양액으로 교체하여 체외성숙을 총 44시간 진행하였다. 실시예 1에서 사용한 방법과 같이 핵 성숙을 조사한 결과, BPA에 의해 감소되었던 핵 성숙율이 회복됨을 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

2-4. BPA 유래 미토콘드리아 초과산화물 생성에 대한 Mito-TEMPO의 항산화적 역할 및 제거능 확인

돼지 난포란을 체외성숙 44시간 후, 성숙된 난포란으로부터 발생되는 미토콘드리아 유래 초과산화물 생성을 Mito-SOX 시약을 통해 붉은 형광으로 검출하였다. Mito-TEMPO 첨가에 따라 BPA가 전처리된 돼지 체외성숙란에서 발생되는 초과산화물이 유의적으로 감소하는 효과를 검증하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

실시예 3: 돼지 수정란의 체외배양을 통한 배반포 생성 및 발달에서 Mito-TEMPO가 함유된 체외배양 방법 및 배지 개발

돼지 난자의 체외수정에 사용된 배지는 113.1mM NaCl, 3mM KCl, 7.5mM CaCl₂, 5mM sodium pyruvate, 11mM glucose, 20mM Tris, 2.5mM caffeine sodium benzoate 및 1mg/ml BSA로 구성된 modified Tris-buffered medium(mTBM)을 사용하였다. 신선한 액상 정액은 1주일에 2번 Darby Porcine AI Center(Anseong, Korea)로부터 구입하였으며, 17℃를 유지하며 보관하였다. 신선한 정액은 1mg/ml BSA, 100μg/ml penicillin G 및 75μg/ml streptomycin sulfate가 첨가된 PBS에서 원심분리기를 사용하여 3회 세척하였다. 이후 1,500rpm에서 3분간 원심분리한 후 상등액을 제거하고 Makler chamber를 이용해 정자수를 계산하여 체외수정에 사용하였다. 체외수정을 위한 최종정자의 농도는 1.5×10⁵ 정자수/ml로 적용하였으며, 체외 성숙을 통해 성숙된 돼지 난포란을 이용하여 체외 수정을 위한 난자로 사용하였다. 돼지의 성숙된 난포란은 각각 0.1% hyaluronidase에서 부드럽게 피펫팅하여 난구세포를 제거한 후, mTBM에서 3회 세척하였다. 체외수정 배양액을 이용하여 그룹을 분리하여 60mm 배양접시에 48μl씩 소적(microdroplet)을 만든 후, 10-15개의 성숙된 난포란을 넣고 준비된 정자를 각각 2μl씩 첨가하여 38.5℃, 5% CO₂ 배양기에서 6시간 동안 체외수정을 유도하였다.

체외수정 후 돼지 수정란의 체외배양액은 PZM-3을 사용하였다. Mito-TEMPO는 상기 실시예1에서 체외성숙 효율이 높았던 1.0 μM Mito-TEMPO 첨가 농도를 적용하였다. 구체적으로, 돼지 수정란의 체외배양에 사용되는 배지인 PZM에 1.0 μM Mito-TEMPO를 함유하는 배지 구성을 개발하고, 이에 따른 돼지 수정란의 난할율과 배반포 단계로의 발달 효율을 조사하였다. 체외수정 후 2일 뒤 배지를 교체할 때에도 1.0 μM Mito-TEMPO를 포함하는 배지를 이용하여 체외배양하였다. 상기 Mito-TEMPO를 포함하는 체외배양 배지 PZM에서 돼지 수정란을 배반포 단계까지 발달을 유도한 뒤, 발달 효율을 조사한 결과를 아래 표 2에 나타내었고, 이를 기반으로 상기 1.0 μM Mito-TEMPO 농도를 이용하여 돼지 초기배 체외배양 배지 제조에도 적용하였다.

Groups	배양된 수정란의 수	난할율 % (n)	배반포 발달율 % (n)
Group 1	290	78.4 ± 14.1 (227)	26.5 ± 5.9 (78)
Group 2	268	67.5 ± 15.3 (192)	16.2 ± 7.9 (44)

3-1. 세포질 내 지질 함유량에 따라 분리된 돼지 수정란의 배반포 단계로의 발달 효율 확인

Mito-TEMPO 함유 배지에서의 돼지 초기배 발달을 확인하기 위해 배반포 단계로의 발달율 차이를 보이는 두 그룹으로 나누어서 검증했다. 구체적으로, 돼지 수정란의 세포질이 균등한 군(Group 1: G1)과 비균등 세포질이 관찰되는 군(Group 2: G2)으로 나누었다. 특히, 체외수정 후 돼지 수정란 세포질 내 지질 함유량을 Oil red O 염색을 통해서 관찰하고, 이를 이소-프로판올(iso-propanol)에 녹여서 ELISA를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 돼지 수정란 세포질 내 균일하고 작은 지질 방울들이 관찰되는 G1에 비해 비균등 세포질이 관찰되었던 G2에서는 지질 방울들의 크기가 크고 한쪽으로 치우쳐 있었으며, 이는 도 5에 나타내었다. 또한, 두 그룹 G1과 G2의 돼지 수정란을 체외배양을 통해 배반포 단계로의 발달을 진행한 결과, G1에서 배반포 생성 효율이 높고 G2에서 상대적으로 낮았으며, 이러한 차이는 유의적으로 나타났다(표 2).

3-2. 돼지 초기배 발달 동안 미토콘드리아 초과산화물 생성 여부 확인

상기 돼지 수정란의 두 그룹 G1과 G2를 이용하여 수정란, 난할 중인 배아 그리고 배반포 단계로 분리하여 미토콘드리아 초과산화물의 생성을 상기 실시예2 의 실험 방법과 동일한 방법으로 관찰하였다. 그 결과, 상대적으로 돼지 수정란에서 지질 함유량에 따른 수정란으로부터 발달된 배아와 배반포에서는 초과산화물이 생성되어 붉은 형광 발현으로 관찰되었다. 또한, 비균등 지질 함유를 보이는 수정란과 배반포 발달효율이 감소되는 G2에서 G1보다 미토콘드리아 유래 초과산화물의 생성이 높았다. 이로부터 미토콘드리아 초과산화물의 생성 여부는 돼지 초기배의 발달율을 평가하는 기준으로 적용될 수 있음을 알 수 있으며, 이에 대한 결과를 도 6에 나타내었다.

3-3. Mito-TEMPO가 함유되는 체외배양 배지에서 돼지 배반포 발달 효율 향상

1.0 μM Mito-TEMPO를 함유하는 돼지 체외배양 배지인 PZM에서 체외배양 시킨 돼지 수정란의 배반포 단계로의 발달 효율을 조사하였다. 그 결과, 낮은 배반포 발달율을 보인 G2에서 G1와 유사한 수준으로 발달 효율의 개선 효과가 있음을 확인하였다(표 3).

Groups	배양된 수정란의 수	난할율 % (n)	배반포의 % (n)
Group 1	330	75.2 ± 6.9 (250)	27.8 ± 4.0 (70)
Group 2	304	67.1 ± 19.4 (213)	19.1 ± 5.1 (56)
Group 2 + Mito-TEMPO	306	74.7 ± 15.2 (231)	28.8 ± 4.0 (89)

이러한 발달 효율 회복에 따른 Mito-TEMPO의 초과산화물 제거능을 Mito-SOX를 이용하여 붉은 형광 발현으로 관찰한 결과, G2에서 검출되던 초과산화물의 생성 또한 감소됨을 확인하였다(도 7). 또한, 확장된 배반포의 생성이 Mito-TEMPO 1.0 μM 을 포함하는 배지에서 체외 배양된 G2 난자에서 G1과 유사하거나 더 높은 수준으로 증가함을 확인하였다(도 8). 아울러, 상대적으로 높은 배반포 발달능을 보여주는 G1의 돼지 수정란을 체외배양 6일 동안 Mito-TEMPO 1.0μM 포함하는 배지에서 배양한 결과, 배반포의 생성 및 발달능이 증가함을 확인하였으며, 이에 대한 결과를 도 9에 나타내었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

미토 템포(Mito-TEMPO)를 포함하는, 난자 체외 성숙용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 미토 템포의 농도는 0.1 내지 1.0 μM인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 난자는 포유동물의 난자인 것인, 조성물.
제3항에 있어서, 상기 포유동물은 돼지인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 난자는 MⅡ(제2 감수분열 중기) 단계의 난자인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 난자의 핵 성숙율을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제6항에 있어서, 상기 난자의 핵 성숙율 증가는 비스페놀 A(Bisphenol A, BPA)에 의한 초과산화물 생성을 억제함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
a) 인간을 제외한 포유동물의 미성숙 난자를 준비하는 단계;
b) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물이 첨가된 체외 성숙용 배지에서 난자를 체외 성숙시키는 단계; 및
c) 성숙된 난자를 배양하여 MⅡ 단계의 성숙된 난자를 수득하는 단계를 포함하는, 난자의 체외 성숙 방법.
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