SK19152000A3 - Test na prítomnosť neplodného vajíčka - Google Patents

Test na prítomnosť neplodného vajíčka Download PDF

Info

Publication number
SK19152000A3
SK19152000A3 SK1915-2000A SK19152000A SK19152000A3 SK 19152000 A3 SK19152000 A3 SK 19152000A3 SK 19152000 A SK19152000 A SK 19152000A SK 19152000 A3 SK19152000 A3 SK 19152000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
day
assay
inhibin
estradiol
increase
Prior art date
Application number
SK1915-2000A
Other languages
English (en)
Inventor
Svend Lindenberg
Anne Lis Mikkelsen
Original Assignee
Medi-Cult A/S
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DK199900885A external-priority patent/DK199900885A/da
Application filed by Medi-Cult A/S filed Critical Medi-Cult A/S
Publication of SK19152000A3 publication Critical patent/SK19152000A3/sk

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/0609—Oocytes, oogonia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/48—Regulators of apoptosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/10—Conditioning of cells for in vitro fecondation or nuclear transfer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
    • G01N2800/367—Infertility, e.g. sperm disorder, ovulatory dysfunction

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
  • Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
  • Stringed Musical Instruments (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka aspoň jedného z prediktívnych markerov vo vzorke od cicavca, kde špecifická reakcia aspoň na jeden prediktívny marker indikuje u cicavca prítomnosť neplodného vajíčka schopného dozrievania in vitro (IVM) a nasledovnej fertilizácia in vitro. Toto je užitočné hlavne na určenie, či po ašpirácii neplodného vajíčka po dozrievaní in vitro do štádia MF-II bude po implantácii cicavcovi ženského pohlavia toto vajíčko schopné fertilizácie a následného tehotenstva. Test je založený na vzorke vybranej zo skupiny tvorenej telovým sekrétom, sputáciou, krvou, močom, maternicovými sekrétmi a bunkami.
Doterajší stav techniky
U normálne ovulujúcej ženy sa v každom menštruačnom cykle vyvíja približne 300 nezrelých oocytov ( vajíčok). Normálne počas procesu apoptózy zahynú pred ovuláciou okrem jedného všetky vajíčka. Konvenčná in vitro fertilizácia (IVF), teda liečba špeciálnych prípadov mužskej a ženskej neplodnosti je založená na získaní zrelých ludských vajíčok s následnou fertilizáciou zrelých oocytov so spermatozoami. Získanie zrelých ludských oocytov sa dosahuje pomocou niekolkých komplikovaných foriem režimov hormonálnej liečby, často sprevádzaných diskomfortom alebo rizikom pre zzainteresované ženy. Tieto režimy hormonálnej liečby sa stanú problémom hlavne v budúcnosti, pretože IVF je v • · ··· · · · ·· ·· · · · · · ·· • · · · · · · · · • · · · · ···· · · · · • · ··· ··· ··· ··· ·· · ·· ··· zvýšenej miere ponúkaná úplne zdravým ženám začleneným do týchto programov pre zlú kvalitu spermií ich manželov. Tento typ liečby naviac poskytuje 20 % úspešnosť otehotnenia na započatý cyklus.
Pre riziko, diskomfort a cenu hormonálnej stimulácie bol v priebehu rokov skúšaný celý rad ďalších postupov. U zvierat sa stalo in vitro dozrievanie (IVM) účinnou metódou produkcie oocytov pre IVF, ale doposiaľ zaznamenaná úspešnosť na klinické IVM u človeka bola nízka (Cha, Trounson, Barnes, Russel). Jedným z najjednoduchších spôsobov, ako vylúčiť hormonálnu stimuláciu, bolo nestimulovať hormóny vôbec. Tento liečebný protokol však viedol len k obmedzenému počtu tehotensitev a vypočítaná miera vzniknutých tehotenstiev nikdy neprekročila 5 % na započatý cyklus.
Opis vynálezu
Predkladaný vynález sa týka schopnosti testovaného systému predpovedať načasovanie a vývoj špecificky zdravých vajíčok v aktívnej profáze, ktoré sa za podmienok in vitro vyvíjajú do štádia MF-II bez exogénnej hormonálnej liečby žien a týmto zamedzujú degeneráciu väčšiny vajíčok, hoci žena nie je liečená hormónmi. Na rozdiel od skorších hormonálnych testov, ktoré boli vždy zamerané na neskoršie štádiá vývoja vajíčok, obyčajne na vajíčka v štádiu MF-II, predkladané opatrenia sú zacielené na načasovanie ašpirácie neplodných vajíčok, ktoré môžu dozrievať za podmienok in vitro, aby mohli byť oplodnené. Týmto spôsobom sa dosiahne úspešnosť otehotnenia viac ako 15 %.
• i
Podrobný opis vynálezu
Λ Λ ·· • • · ·
• · • · • • · • ·
• • • • · • · · • · • · ···· • • · • · e • ·
9 · • · · ·· • • · • ·
Vedecký základ
Vývoj jadra vajíčok je zastavený v diplontnej fáze vo forme germinálnych vezikúl, ktoré sa nazýva dicytátovým štádiom. Toto štádium je charakterizované vysoko difúznymi chromozómami, ktorých DNA má nízku afinitu, k takým typom jadier, podobne ako Feulgenovo činidlo. Chromozómy vajíčok v dicytátovom štádiu majú v laterálnej projekcii vetvičky a slučky, ktoré aktívne replikujú ribonuleovú kyselinu (RNA). Významne sa podobajú Lampbrusch chromozómom, ktoré sa nachádzajú takmer univerzálne u nižších stavovcov a niektorých bezstavovcoch. RNA môže účinkovať ako posol riadiaci syntézu bielkovín vo vlastných vajíčkach. Dôkazy z podrobných štúdií vajíčok u žiab a ropúch naznačujú, že niektoré typy RNA môžu pôsobiť v rýchlu organizáciu vývoja cicavcov. Nech už bude výsledok dodatočných štúdií, ktoré požadujú objasnenie týchto komplexných problémov akýkoľvek, dicytátové štádium nemôže byť považované za štádium pokoja, pretože ocyty vykazujú vysoký stupeň metabolickej a syntetickej aktivity v dobe, kedy sa folikulárny obal skladá len z niekoľkých sploštených epiteliálnych buniek.
Vývoj ľudského oocytu/folikula je kontrolovaným mechanizmom v čase aj v biologických procesoch. Vývoj 99 % všetkých vajíčok je zastavený v meiotickej profáze (čo je dicytátové štádium) dokonce zásoby je vybraté niekoľko aktivované každý mesiac ešte pred narodením. Z tejto stoviek vajíčok, ktoré sú menaštruačnom cykle), aby sa ďalej vyvíjali, čo znamená opäť začatie meiózy cez rozpad germinálnych vezikúl (GVB) a metasfáz I (MF-I) až k metafáze
II (MF-II) a k rastu folikula.
I
• ·· • • · ·
• · ·· • · • • · • ·
• • · • · • · •
• • • • · · • · ···· • ♦ · · • · • •
··· • · 9 ·· • • · • · ·
Reprodukčný stav človek ženského pohlavia je cyklický s komplexom interakcie medzi hypotalámom, prednou častou hypofýzy a vaječníkmi, ktorý nakoniec vedie k procesu ovulácie. Cyklus sa opakuje s priemernou periódou 28 - 30 dní ( rozmedzie 25 - 35 dní). Prvá fáza, menštruácia, trvá 4-5 dní. Prvý deň cyklu je prvým dňom prvej fázy, čo je tiež prvý deň menštruačného krvácania. Druhá folikulárna fáza vaječníkov korešponduje s proliferačnou fázou endometria a trvá 10 - 16 dní ( tj. vysoko variabilná). Potom nasleduje ovulačná fáza ( 36 hodín) a nakoniec fáza luteálna, ktorá zodpovedá sekrečnej fáze endometria a je obyčajne konštantná a trvá 14 dní. Na porozumenie menštruačného cyklu sú kritické tri zložky:
1. Kontrola uvoíňovania FSH/LH hypotalamickým GnRH,
2. Vývoj ovariálneho folikula do ovulácie a nasledovne vytvorenie žltého telieska a
3. Spätná kontrola sekrécie FSH/LH ovariáInými hormónmi.
Počas druhej polovice reprodukčného cyklu sa vyvíja žlté teliesko a vylučuje estrogény aj progesterón. Estrogény podporujú proliferačnú aktivitu v endometriu. Progestrón na druhej strane spôsobuje distenziu endometriálnych žliaz sekréčnymi produktami, ktoré obsahujú glykogén ( dôležitý pre vývoj implantovaného embrya). Endometriálny prietok krvi sa zvyšuje a špirálové artérie sa stáčajú. Druhá polovica cyklu sa nazýva luteálna fáza ( ováriá) alebo sekrečná fáza ( maternica). Ak nedôjde k implantácii, dochádza k regresii žltého telieska a k rýchlemu poklesu sekrécie estrogénov a progesterónu, endometrium sa zmršťuje dôsledkom straty extracelulárnej tekutiny, špirálové artérie sa kontrahujú, endometriálny prietok krvi sa znižuje s odumieraním buniek a deštrukciou krvných ciev. Tieto okolnosti vedú nakoniec k menštruačnému krvácaniu, kedy dochádza k odlúčeniu všetkých vrstiev endometria okrem bazálnej vrstvy. Prvý deň menštruačného krvácania je z praktických dôvodov prvým dňom *
menštruačného cyklu.
Dozrievanie vajíčok ke konečným štádiom vývoja vajíčok, ktoré sa pripravujú na fertilizáciu a vývoja embrya. Dozrievanie môže byť rozdelené na dva všeobecné procesy: dozrievanie jadra a dozrievanie cytoplazmy. Dozrievanie jadra je definované ako znovuzačatie meiózy a progresie do štádia MF-II, pokiaľ dozrievanie cytoplazmy je definované ako extragenomické zmeny, ktoré pripravujú vajíčko na aktiváciu, na pronukleárnu tvorbu a rýchlu embryogenézu.
Folikul obsahujúci vajíčka v dicytátovom štádiu obsahuje jednu vrstvu sploštených granulózových buniek. Známky ďalšieho vývoja vajíčok a folikula obsahujú ďalšie znásobenie počtu granulózových buniek a tiež prestup tekutiny do priestoru medzi granulózovýmu bunkami. Ako narastá množstvo tekutiny, dochádza k zväčšovaniu splývajú pri vzniku antrasu. Taký Graafov folikul. S ďalšou expanziou okupovaných dutín, ktoré folikul sa teraz nazýva antras okupuje vajíčko jednu stranu folikulu a je obklopené dvoma alebo viacerými vrstvami granulózvých buniek. Najvnútornejšia vrstva týchto buniek nadobúda cylindrický tvar a tvorí corona radiata, ktorá ako najvnútornejší cumulus oophorus pretrváva okolo vajíčka počas ovulácie. Dozrievanie jedra pokračuje paralelne s vývojom folikula. Preto sú pozorované GVB a MF-I vajíčka počas tvorby antrasu a jedná sa o antrálny a preantrálny folikul.Časom dochádza k plnému vyvinutiu antrasu k ukončeniu meiotického delenia a je pozorovaná extrúzia prvého polárneho telieska.
Počas každého menštruačného cyklu dosahuje toto štádium niekoľko stoviek vajíčok. Na v dôsledku prítomnosti v súčasnosti nevysvetliteľných faktorov dochádza u väčšiny z týchto vajíčok k atrézii, pri ktorej vajíčka podliehajú apoptóze a zanikajú. Rozpustenie najvnútornejšej vrstvy granulózových buniek za prítomnosti vajíčka vo folikule, alebo toto rozpustenie predčasne po odchode vajíčka je istou známkou výskytu degeneratívnych zmien, ktoré majú za následok zánik vajíčok. Za normálnych okolností sa vyvíja len niekoľko, normálne len 1 vajíčko.
Technikcý základ IVF
Ak je žene podaný FSH, dochádza k vývoju viac ako len jedného folikula do štádia MF-II.
Štádiom MF-II sa rozumie oocyt s jedným polárnym telieskom a expandovaným kumulusovým komplexom, v ktorom nakoniec došlo k ruptúre gereminálnj vezikuly. Tieto oocyty sú ľahko rozpoznané rutinným pracovníkom, ktorý pracuje s oocytmi určenými na IVF. Vajíčka v štádiu MHF-II sú typom vajíčok, ktoré sú pripravené na fertilizáciu spermiami. Tieto znaky vajíčok nie sú prítomné v žiadnej skoršej fáze vývoja vajíčok.
Konvenčná in vitro (IVF) fertilizácia má za cieľ získať čo najviac vajíčok v štádiu MF-II. Tento cieľ sa dosiahne liečbou žien exogénnymi hormónmi, ktoré zahŕňajú folikuly stimulujúce hormón (FSH). RFSH alebo z moča derivovaný FSH sa podáva v dávke 100 až 250 IU/deň. V tejto liečbe sa často pokračuje počas 8 - 10 dní. K liečbe sa pridáva podávanie agonistov GNRH, ako napríklad denné podávanie Buserelínu.
Touto liečbou sa zamedzí degenerácii väčšiny z týchto aktivovaných vajíčok. Tento typ hormonálnej liečby obsahuje vždy riziko hyperstimulačného syndrómu a ďalšie vedľajšie účinky, ako je napríklad zvýšené riziko vzniku nádorov vaječníkov, ďalej nauzea, diskomfort, opuchy, bolesť, alergické reakcie na liečbu, depresiu a váhový úbytok, teda príznaky, ktoré možno ťažko ospravedlniť, zvlášť ak je žena zdravá a dôvodom na liečbu pomocou IVF je závažný problém mužskej neplodnosti. V súčasnosti viac ako 30 % všetkých IVF cyklov na svete je začaté za pomoci rozsiahlej medikácie podávanej ženám, hoci problém je mužským faktorom.
• ·· • • e •
• · • · • · • • • • ·
• • • · • · • •
• • · · ···· • · • •
• · • • • •
·· · ··· ·· • · 9 · ·
Na získanie zdravých vajíčok v štádiu MF-II bola hormonálna liečba žien doplnená monitorovaním sérových hladín estrádiolu, FSH, LH, progesterónu, PP14 alebo PP12. Načasovanie ašpirácie zdravých vajíčok v štádiu MF-II bolo realizované za pomoci ultrazvukového sledovania vývoja flikúl. Všetky tieto klinické testy boli navrhnuté na zvýšenie počtu zdravých vajíčok v štádiu MF-II.
IVM
IVM je uprednostnené začatá s nezrelými alebo úplne dozretými gametami. Vajíčka sú u ženy zistené ako oocyty s pevnou kumulusovou masou bez viditeľných polárnych teliesok alebo germinálnych vezikúl. Tieto vajíčka sa dajú lahko rozpoznať osobou zaoberajúcou sa rutinnou IVF liečbou ako nezrelé vajíčka.
Ak sa nepodajú hormóny, dozrievajú len oocyty, ako je to jasné u normálne ovulujúcich žien. Uvoľnením nezrelých oocytov z vaječníka pred začatím apoptotických procesov, kedy vajíčka podliehajú atrézii a následne vajíčka d’alej dozrievajú za podmienok in vitro, by malo byť u žien zamedzené riziku a diskomfortu spojeného s hormonálnou liečbou a stále by malo byť k dispozícii dostatočné množstvo zrelých vajíčok v štádiu metafázy II ( MF- II) na následnú in i
·· vitro fertilizáciu.
Možno produkovať ocyty, ktorých nukleárne dozrievanie dosiahlo štádium MF- II, ale ktoré bolo nekompetentné pre úplný predimplatačný vývoj. Dôležitosť cytoplazmatickej kontroly na vývojovú kompetenciu bola opísaná u nezrelých opičích oocytov. Za použitia mikromanipulácie bola z oocytov v štádiu MF-II odstránená ooplazma, ktorá bola injikovaná do oocytov v profáze I. Opice, ktorým boli implantované oocyty s cytopiazmatickou transfúziou, mali sedemnásobný nárast úspešnosti tehotenstva v porovnaní s oocytmi bez injekcie ooplazmy. (Flood).
Doposiaľ publikované IVM protokoly používali bud’ fixný deň v menštruačnom cykle, vypočítaný z predchádzajúcej ovulácie alebo začiatku menzesu, alebo používali deň pred finálnym vývojom antrálnych folikúl. Tento spôsob viedol k úspešnosti tehotenstva od 0 do 10 %.
Vynález
Predkladaný vynález sa týka nálezu, že stanovenie špecifických signálnych hormónov indikuje príslušné načasovanie ašpirácie vajíčok pre IVM vstup. Toto stanovenie indikujúce načasovanie ašpirácie vajíčok optimalizuje počet vajíčok špecificky schopných dozrievania za podmienok in vitro, oplodnenia a ďalší vývoj. Identifikácia špecifických signálnych hormónov ako prediktívnych markerov schopnosti neplodných vajíčok dozrievať za podmienok in vitro, a ďalej následnej fertilizácie, delenia, implantácie a tehotenstva zvyšuje u cicavcov stupeň úspešnosti IVM cyklov.
Neplodné vajíčka v tejto patentovej prihláške sú
• • • · • ··
• · • · • • • • · •
• • • · • · • ·
• • • · • ···· • · ·
• • • · • • ·
··· ··· ·· • • · •
neplodné vajíčka ( oocyty), u ktorých po kontakte so zrelou spermiou nedochádza k meiotickému deleniu a prijatiu genetického materiálu spermie a tvorbe oplodnenej bunky. V súčasnosti sa predpokladá, že endokrinná a intraovariálna regulácia dozrievania vajíčka vedie k presnému a komplexnému zloženiu látok so špecifickou koncentráciou alebo s koncentračnými pomermi, takže neplodné vajíčko po in vitro dozrievaní do štádia MF -II sa stáva schopným oplodnenia, následného delenia a potom tehotenstva po implantáci cicavcovi ženského pohlavia.
Jeden aspekt vynálezu sa týka testu na prítomnosť alebo množstvo aspoň jedného prediktívneho markera vo vzorke cicavca, kde špecifické stanovenie prítomnosti alebo množstva tohto markera indikuje prítomnosť neplodného vajíčka schopného dozrievania za podmienok in vitro a následného oplodnenia u cicavca.
Test aspoň na jeden prediktívny marker je založený na stanovení vo vzorke cicavca ženského pohlavia. V jednej forme vynálezu je vzorkou vzorka vybratá zo skupiny tvorenej napríklad telovým sekrétom, telovou tekutinou bunečnými živinami, obsahom folikula, sputom, krvou, močom, stolicou, maternicovými alebo vaginálnymi sekrétmi a zložkami, menštruačnými produktami, epitelami a zložkami odvodenými z epitelov, zložkami kože a mŕtvymi alebo živými bunkami.Osoba, ktorá pozná odbor, bude Ihko rozumieť, ako sú tieto vzorky získané.
V jednej forme predkladaného vynálezu pochádza vzorka od cicavca, ako je napríklad domáce zviera, napríklad mačka, pes alebo morča, alebo napríklad iné zviera, ako sú napríklad
• ·· • ··
• · ·· • • • • · ·
• • • • • · • 9
• • e • ···· 9 9 ·
• • • • • ·
··· ··· ·· • ·· ·
primáti. V ďalšej forme vynálezu sú cicavcom chápané laboratórne zvieratá, ako je napríklad potkan alebo myš. V ďalšej uprednostňovanej forme vynálezu sú zvieraťom priemyselne používané zvieratá, výhodne farmárske zvieratá, ako napríklad hovädzí dobytok, kone, prasce, norky, kozy alebo ovce. V súčasnej najvýhodnejšej forme vynálezu je cicavcom človek.
V jednom aspekte vynálezu je cicavec ženského pohlavia testovaný pred ašpiráciou vajíčok. Ak je to možné, je robených viac testov ako jeden . Načasovanie ašpirácie vajíčok pre IVM môže predikovať buď absolútna cut off hodnota, alebo relatívny konštantná hladina, zvýšenie parameter, ako je napríklad alebo zníženie vyššie uvedeného selektívneho markeru.
v tomto kontexte by malo byť termínom prediktívny marker chápaná akákolvek látka, ktorá mení koncentráciu, farbu, štruktúru, konfirmáciu a/lebo správanie reakcie v biologickom, fyzikálnom alebo chemickom teste. Malo by sa chápať, že existuje mnoho potenciálnych prediktívnych markerov. v jedne forme vynálezu je testom test, kde aspoň jedným prediktívnym markerom je hormón vybratý zo spkupiny tvorenej gonadotropínmi ( ako sú napríklad FSH, LH, prolaktín a HCG), tyroidálne hormóny (ako sú napríklad TSH, T3 a T4), steroidné hormóny ( ako sú napríklad estradiol, estrogén, estratriol, progesterón a testosterón, androgény, kortizón alebo kortizol). V ďalšej forme vynálezu je testom test, kde aspoň jedným prediktívnym markerom je malý peptidový hormón ( ako je napríklad GIP alebo VIP). v ďalšej forme vynálezu je testom test, kde aspoň jedným prediktívnym markerom je peptidový hormón ( ako je napríklad PP12, PP14, inhibín :
• · ·· · ·· ·· ·· · · · · · · • · ···· ·· • · · · · ···· · · · inhibín A alebo inhibín B, aktivín alebo alfa 1 alebo alfa 2 globulíny). V ďalšej forme vynálezu je testom taký test, kde aspoň jedným prediktívnym markerom je lipid vybratý zo skupiny tvorenej meiózou aktivovanými sterolovými (MAS) lipidmi a prostaglandinmi. V ďalšej forme vynálezu je testom taký test, v ktorom aspoň jedným prediktívnym markerom je nukleová kyselina vybratá zo skupiny tvorenej fragmentárni DNA, mRNA a tRNA. V ďalšej forme vynálezu je testom taký test, kde aspoň jedným prediktívnym markerom je markér vybratý zo skupiny tvorenej LFN1, LFN, LFN, glykokonjugátmi, sacharidmi, bunečnými živiami, integrínmi, ako je napríklad integrín 1 a sacharidové epitopy. V ďalšej forme vynálezu je testom taký test, v ktorom aspoň jedným prediktívnym markerom je intra alebo inter- bunečný posol, ako je napríklad cAMP. V ďalšej forme predkladaného vynálezu je testom taký test, kde aspoň jedným prediktívnym markerom je enzým, ako je napríklad fosfodiesteráza alebo inhibítor fosfodiesterázy. Dôsledkom vysokej komplexity interakcie medzi bielkovinami, hormónmi, lipidmi, nukleovými kyselinami, medzibunečnými poslami a enzýmami sa v súčasnosti predpokladá, že načasovanie ašpirácie neplodných vajíčok je závislé od kombinácie cut off hodnôt určitých prediktívnych markerov a/lebo relatívnych parametrov jedného viac prediktívnych markerov, tj. relatívne stanovenie rovnakého markera, kde boli vzorky odobraté v rôznom čase, alebo relatívne stanovenie dvoch alebo viacerých markerov prítomných vo vzorke z rovnakého odberu.
Stanovenie je markerom, to znamená tvorené aspoň jedným prediktívnym dvoma prediktívnymi markermi, napríklad troma, štyrmi, piatimi alebo šiestimi prediktívnymi markermi.
Je viac ako pravdepodobné, že prediktívna hodnota testu sa bude výrazne zvyšovať, ak bude kombinované dva alebo viac prediktívnych markerov.
Na podklade opisov v príkladoch 1 a 2 týkajúcich sa korelácie medzi dvoma prediktívnymi markermi, inhibínom A a estradiolom voči výsledku IVM cyklu bude osoba, ktorá sa vyzná v odbore a je schopná určiť takú koreláciu medzi ďalšími prediktívnymi markermi. V jednej forme vynálezu existuje významná korelácia medzi šancou otehotnieť v takom cykle a relatívnym zvýšením, alebo relatívnym znížením koncentrácie prediktívneho markera, ktorý je vzorke zo dňa 1, 2, 3, 4, pred ašpiráciou vajíčok, významná korelácia medzi zvýšením, absolútnym koncentráciou prediktívneho vyšetrovania vo
5, 6, 7,
V ďalšej šancou znížením, markera, vzorke zo dňa 1, 2, 3 , predmetom vyšetrovania vo 8 alebo dokonca zo dňa 9 forme vynálezu existuje otehotnieť alebo ktorý 4, 5, a absolútnym konštantnou j e predmetom 6, 7, 8 alebo dokonca z deviateho dňa pred ašpiráciou vajíčok. Ešte v ďalšej forme vynálezu existuje významná korelácia medzi koncentráciou prediktívneho markera, ktorý je predmetom vyšetrovania vo vzorke zo dňa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 alebo dokonca z deviateho dňa, a šancou otehotnieť v takom cykle. V jednom aspekte tejto formy vynálezu je významná korelácia medzi koncentráciou prediktívneho markera, ktorý je predmetom vyšetrovania vo vzorke, a šancou otehotnieť v takom cykle znížená na úroveň binárnej korelácie, takže môže byť nastavená cut off hodnota a šanca otehotnieť v takom cykle je korelovaná podlá koncentrácie prediktívneho markera, ktorý je predmetom vyšetrovania, tak, že táto koncentrácia je viac alebo menej na úrovni cut off hodnoty.
V jednej forme vynálezu je úspešnosť otehotnenia v štúdii cyklov IVM, kde doba ašpirácie bola nastavená pódia testu opísaného vyššie, vyššia ako 10 %, napríklad vyššia ako % , 15 %, 18 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, alebo dokonca vyššia ako 40 %.
• · ·· · ·· ·· ·· · · · · · · • · ···· · · • · · · · ···· · · · • · · · · · · ··· ··· ·· · ·· ·
V súčasnej uprednostnenej forme predkladanej vynálezu sú zvolené dva prediktívne markery. Sú to inhibín A estradiol. Ako je ilustrované na príkladoch la 2, zvýšenie koncentrácie estradiolu a inhibínu A predikuje IVM cyklu.
Niekedy sa môže pozorovali, že zvýšeniu koncentrácie estradiolu predchádza zvýšenie konentrácie inhibínu A. V tomto prípade môže dôjsť. k zníženiu koncentrácie estradiolu alebo k vyrovnaniu jeho hladiny v dobe zvýšenia koncentrácie inhibínu A. V tomto prípade sa stále považuje, že sa dosiahlo zvýšenie: koncentrácie estradiolu, takže šanca na úspech je vysoká, pretože zvýšenie koncentrácie inhibínu A je hlavný faktor. Toto je pravda hlavne vtedy, ak predchádza liečba FSH ( viď príklad 3).
V súčasnej najupredňovanejšej forme predkladaného vynálezu obsahuje test tri špecifické reakcie a výsledky pre dva selektívne markery. Prvou špecifickou reakciou je stanovenie koncentrácie inhibínu A, ktorá je menšia ako 10 pg/ml vo vzorke krvi tretí deň menštruačného cyklu. Druhou špecifickou reakciou a výsledkom je zvýšenie koncentrácie inhibínu A na viac ako 80 % tretí deň po ašpirácii vajíčok. Tretou špecifickou reakciou a výsledkom je zvýšenie koncentrácie estradiolu na viac ako 87 % tretí deň po ašpirácii vajíčok. Preto v jednom aspekte vynálezu sa žene odoberie krv tretí deň menštruačného cyklu a sú stanovené
• ·· • ·· ·
• · • • • • · ··
• • • • · • · •
• • · • ···· • · · •
• • • • • · •
··· ·· • ·· ···
koncentrácie inhibínu A a estrediolu vo vzorke krvi. Ak je koncentrácia inhibínu A menšia ako 10 pg/ml v uvedenej vzorke krvi, tento cyklus nebude cyklom pre IVM. Ak je však koncentrácia inhibínu A vyššia alebo rovná 10 pg/ml v uvedenej vzorke krvi, bude odobratá vzorka krvi štvrtý, piaty, šiesty,siedmy, ôsmy, deviaty, desiaty, jedenásty, dvanásty, trinásty, štrnásty pätnásty a šestnásty deň, len ak by sa pozorovala druhá a tretia špecifická reakcia. Ak je pozorovaná druhá a/lebo tretia špecifická reakcia, bude deň pozorovania dňom ašpirácie vajíčok. Na podklade výsledkov z príkladu 2 sa očakáva, že cykly IVM, v ktorých doba ašpirácie vajíčok splnila tieto tri špecifické kritériá, bude mať úspešnosť otehotnenia viac ako 12 %, napríklad vyššiu ako 16 %, 22 %, 25 %, 26 %, alebo dokonca viac ako 28 %.
Ako bude ocenené osobou, ktorá sa vyzná v odbore, sú stanovenia prediktívnych markerov vo vzorkách cicavcov rutinnými stanoveniami. V jednom aspekte je test pripravený tak, že špecifická reakcia môže byť porovnaná a stanovená bez asistencie lekárov alebo moderného lekárskeho vybavenia. Ako však bude chápať osoba, ktorá sa vyzná v odbore, môže byť stanovené bez drahého vybavenia len niekolko prediktívnych markerov, čo vedie k nevyhnutnosti zasielania vzorky do laboratórií, kde podlá výsledku testu je riadené načasovanie ašpirácie vajíčok u cicavcov.
Dôsledkom komplexnosti koncentrácií, relatívneho zvýšenia, relatívneho zníženia, absolútneho zvýšenia, konštantnej koncentrácie a cut off hodnôt je jedným aspektom vynálezu schéma, ktorá sa vypĺňa počas menštruačného cyklu, kde sa uvažuje o IVM cykle. V jednej forme obsahuje schéma stĺpce na každý deň menštruačného cyklu a riadky na každý prediktívny marker, takže každé okienko môže byť vyplnené po • 9 ·· ··· ·9 · 9 · 9 99 • 9 9 9 9 ·99 • · 9 · 9 99·· · ·· • · · · ·· · ··· ··· ·· · ·· · stanovení prediktívnych markerov. Interpertáciu výsledkov špecifických reakcií ulahčujú auromatické, poloautomatické a manuálne riadené výpočty alternácií prediktívnych markerov.
Ultrazvuková kontrola
V jednej forme vynálezu je test na prediktívne markery použitý ako prvé selekčné kritérium. Ak je toto kritérium splnené, je žena podrobená ultrazvukovému vyšetreniu maternice a vaječníkov. Ak ultrazvukové vyšetrenie zistí: - velké množstvo antrálnych folikúl, velkosť hlavného folikula okolo 10 mm, jednotnosť skupiny folikúl, hrúbku endometria viac ako 3 mm, a začatie tvorby trilaminárnych štruktúr v endometriálnej výstelke , je pravdepodobnosť zistenia správnej doby na ašpiráciu vajíčok in vitro dozrievania do štádia MF-II, oplodnenia, implantáciu a otehotnenie velmi vysoká.
V súčasnej uprednostňovanej forme predkladaného vynálezu sú vajíčka získané od ženy majúcej ovariálny folikúl o priemere 8-12 mm. Výhodou takých malých folikúl je, že sú v tejto dobe prítomné vo významných množstvách v menštruačnom cykle bez predcádzajúcej hormonálnej liečby, môžu byť pozorované ultrazvukom a je možno urobiť ultrazvukom kontrolovanú transvaginálnu punkciu folikúl, s cielom získania oocytov.
Osoba, ktorá sa vyzná v odbore, pochopí, že od iných cicavcov by mali byť aspirované vajíčka inej velkosti.
V jednej forme vynálezu je znalosť menštruačného cyklu ženy využitá v načasovaní asporácie vajíčok. Preto je obyčajne ašpirácia zrealizovaná medzi dňami 6 a 17, obyčajne medzi 9. a 11. dňom.
Preto v jednej forme predkladaného vynálezu sa spôsob určenia načasovania ašpirácie vajíčok skladá z nasledujúcich krokov:
a. testovanie aspoň jedného predikrívneho markera vo vzorke cicavca, výsledok špecifickej reakcie v teste v kroku a. predikuje prítomnosť neplodných vajíčok schopných dozrievania in vitro a nasledovnej fertilizácie u cicavca
b. zhodnotenie doby relatívne k prvému dňu menštruačného krvácania, ak je deň medzi šiestym a sedemnástym dňom menštruačného krvácania, tak
c. vyhodnotenie ultrazvukového obrazu vaječníkov u cicavca, ak je veľkosť folikúl medzi 8 a 12 mm a skupina folikúl je rovnomerná, potom je nasledujúcim krokom
d. vyhodnotenie ultrazvukového obrazu maternice cicavca, ak je hrúbka endometria viac ako 3 mm a je pozorované začatie tvorby trilaminárnych štruktúr endometriálnej výstelky, nastala správna doba ašpirácie vajíčok. Ak zlyhá akýkoľvek z vyššie uvedených krokov, nie je cyklus pravdepodobne vhodný na IVM a ašpirácia vajíčok by mala byť odložená do ďalšieho cyklus, kde sa celý spôsob zopakuje.
Schopnosť IVM oocytov dokončiť meiózu a stať sa vývojovo kompetentnými môže byť zvýšená pomocou FSH podaného pre ašpiráciou oocytu. U ľudskej IVM zvyšuje krátka stimulácia pomocou FSH dvojnásobne počet oocytov získaných od jedeného pacienta, rovnako ako zvyšuje pomer ooctytov, ktoré dosahujú štádium MF-II po 48 hodinách. V jednej forme predkladaného spôsobu je žena liečená tretí a/lebo štvrtý, alebo piaty deň menštruačného cyklu pomocou hormónov, ako je napríklad FSH , po ktorom nasleduje vysadenie liečby. V príklade 3 bol pozorovaný zvýšený stupeň dozrievania a delenia u skupiny predliečenej FSH s predĺžením medzi poslednou injekciou a ašpiráciou v porovnaní s liečbou pomocou FSH bez tohto predĺženia. U skupiny predliečenej FSH s predĺžením medzi poslednou injekciou a ašpiráciou bol pozorovaný zvýšený stupeň dozrievania v porovnaní s nestimulovanými oocytmi, ale stupeň delených dozretých MF-II oocytov nebol ovplyvnený. Bol vysoký v oboch skupinách. Fáza skorej apoptózy, alebo fáza arteficiálneho plató môže v raste folikula napodobňovať finálne pre-ovulačné dozrievanie folikula, čo sa týka vývojovej kompetencie. Týmto sa získa arteficiálne plató alebo pokles hladiny estradiolu, čo spôsobuje proces apoptózy vo vaječníkoch, vedúci k vyššie uvedenej signalizácii do nezrelého oocytu. Taký pokles hladín estradiolu sa očakáva okolo desiateho dňa menštruačného cyklu. Odber oocytov u žien bez hormonálnej stimulácie by mal byť výhodne urobený desiaty deň menštruačného cyklu, pretože tento deň je štatisticky asociovaný s velkým počtom oocytov v profáze.
V jednom aspekte vynálezu bude mať žena prospech z iniciálnej liečby podanej tretí, štvrtý a piaty deň menštruačného cyklu pomocou hormónu, ako je napríklad FSH za ktorým nasleduje vysadenie liečby, v tomto liečebnom režime môžu byť monitorované hladiny estradiolu v krvi žien s cielom vybrať dozreté oocyty, nepriamo merané pomocou nerastúcich ( rastová pauza) folikúl. Skoré apoptotické folikuly určené na zánik sú charakterizované tým, že môžu byť íahko uvoínené z vaječníka počas punkcie folikúl a majú kompaktnú kumulusovú hmotu. Po dosiahnutí fázy plató alebo poklesu hladín estradiolu je urobený odber oocytov. Pozorovaná konštantná hladina alebo pokles hladín estradiolu je spôsobený predchádzajúcim zvýšením koncentráie estradiolu medzi tretím dňom menštruačného cyklu a dňom ašpirácie vajíčok. V jednej forme vynálezu je dobou ašpirácie vajíčok doba zvýšenia koncentrácie estradiolu, ktorá je pred fázou konštantnej hladiny alebo poklesu koncentrácie estradiolu. V ďalšej uprednostnenej forme vynálezu je monitorizácia koncentrácie estradiolu ďalej doplnená monitorizáciou koncentrácie inhibínu A.
Z tohto dôvodu je jednou formou predkladaného vynálezu súprava obsahujúca vhodný liek s FSH a test opísaný vyššie. Voliteľne súprava ďalej obsahuje prostriedok na získanie vzorky alebo vzoriek na realizáciu testu.
Referencie
Flood J, Chillik CF, van Uem JFHM, Iritani A, Hodgen GD. Ooplasmatic transfusion: prophase germiant vesicle oocytes made developmenta11y competent by microinjection of metphase II egg cytoplasma. Fertil Steril 1990, 53: 1049- 54.
Cha KY, Koo JJ, Ko JJ, Choi DH, Han SY, Yoon TK. Pregnancy after in vitro fertilization of human folicular oocytes collected from nonstimulated cycles, their culture in vitro and thier transfer in a donor oocyte program. Fertil Steril 1991, 55109 - 13.
Russel JB, Knezevich KM, Fabian K, Dickson JA: Unstimulated immature oocyte retrieval . early versus midfollicular endometrial priming. Fertil Steril 1997 , 67: 616 - 20.
Barnes FL, Kausche AK, Tiglias J, Wood C, Wilton L, Trounson A, Production of embryos from in vitro-maturated primary oocytes. Fertil Steril 1996, 651151 - 6.
Trounson A, Wood C, Kaunsche A. In vitro maturation and the fertilization and developmental competence of oocytes recovered from untreated polycystic ovarian patients. Fertil Steril 1994, 62* 353 - 62.
Cha KY, Chung HM, Han SY, Yoon TK, Oum KB, Chung MK. Succesful in vitro maturation, fertilization, and pregnancy by using immature follicular oocytes collected from unstimulated polycystic ovarian syndróme patients. Fertil Steril Abstract 0- 044, 1996: Supl.S236.
Wynn P, Picton HM, Krapez J, et al. (1998). Randomized study of oocytes matured after collestion from unstimulated or mildly stimulated patients. Hum. Reprod, 13, 3132 - 3138.
Grcome NP, Illingrowth PJ, and 0’Brien M, et al., (1996). Measurement of dimetric inhibin B throughout the human menstrual cycle. J.Cli. Endocrin. Metab., 81, 1401 1405.
Príklady realizácie vynálezu
Malo by byť jasné, že obrázky a príklady opísané nižšie sú ilustráciou foriem predkladaného vynálezu a vynález týmto nijako neobmedzujú.
Príklady
Do štúdie bolo zahrnuté celkom 83 žien s pravidelným cyklom, ktoré boli indikované na IVF/ICSI z dôvodov mužskej neplodnosti a/lebo ochorenia vajcovodov. Štúdia bola povolená mistnou etickou komisiou. Všetky ženy sa zúčastnili štúdie po písomnom súhlase. Boli monitorované profily hormónov ( gonadotropíny, inhibín A, inhibín B , estradiol a progesterón). Profily hormónov boli stanovené pomocou RIA (Immuno 1, Bayer) s výnimkou profilov inhibínu A a inhibínu B, ktoré boli stanovené metódou opísanou Groomom ( 1996).
Odber nezrelých vajíčok bol ralizovaný deň po zistení velkosti folikula 10 mm podlá ultrazvuku. Použili sme aspiračnú ihlu od spoločnosti Cook Ltd. opísanú Carlom Woodom. Aspiračný tlak bol znížený na 100 mm Hg za prdpokladu, že nezrelý kumulus alebo vajíčko môžu byt velmi vnímavé mechanickému poškodeniu, alebo ihla môže v malom folikule priamo poškodiť vajíčko, ak je vajíčko násilne nasiate z malého množstva tekutiny do konca ihly. Folikuly boli punktované. Po ašpirácii bola ihla premytá roztokom Earles Ballanced Sált s Hepes a bikarbonátovým pufrom plus heparínom ( 100 IU/ml) ako bolo opísané Trunsonom et al.
Folikulárne aspiráty boli prenesené v skúmakách do laboratória a naliate na embryonálny filter s velkosťou pórov 70 um. Erytrocyty a ďalšie malé bunky boli vymyté cez filter a oocyty a väčšie fragmenty buniek boli zbierané do Petriho kultivačných misiek. Nedozreté oocyty boli identifikované a zaradené na podklade prítomnosti alebo absencie kumulusových buniek ako kompletne mnohovrstvové, rozptýlené a obnažené.
Dozrievanie oocytov bolo zrealizované v médiu pre kultúry tkanív 199 (TCM 199, Sigma) alebo BBEM (Medicult, Dánsko) doplnenom pyruvátom sodným 0,3 mM. rec- FSH 0,075
IU/ml (Gonal-F, Serono), hCG 0,05 IU/ml (Profasi, Serono) a albumínom 1 %. Neskoršie bolo médium doplnené estradiolom 1 ug/ml a zvýšenou koncentrácoiu HSA ( 5%) alebo sérom od pacienta ( 10 %) namiesto albumínu.
boli obnažené pomocou hyaluronidázy (IVF Science, mechanickým pipetovaním. Pohyblivé pomocou Puresperm (Cryos, alebo pomocou plavenia.
ICSI boli individuálne umiesnené
Oocyty Švédsko) a pripravené tovej separácie určené na spermiového pripravovacieho média (Medicult, spermie boli Dánsko) gradienObnažené do 65 ul
Dánsko) oocyty kvapiek a 2 ul spermiovej suspenzie bolo umiesnené do 10 ul kvapky PVP (IVF Science, Švédsko). Všetky oocyty v štádiu MF-II boli inseminované pomocou ICSI a potom umiestnené do 10 ul kvapiek BBEM, kultivoavané v 5 % CO2 a zvlhčené pri teplote 37° C. Pribižne 10 až 20 hodín po inseminácii boli oocyty vyšetrené mikroskopicky pri 300 násobnom zväčšení na zistenie prítomnosti projadier ako parametra úspešného oplodnenia. Embryá boli kultivované do druhého alebo tretieho dňa ( deň 0 = deň inseminácie), kedy boli vhodné embryá (maximálne dve vrátené do ženy. Vhdné embryá sú tie, u ktorých došlo k deleniu.
Príklad 1: Analýza inhibínu A a estradiolu v cykloch IVM
Deskriptívna štatistika údajov z 83 liečebných cyklov, u ktorých boli dostupné endokrinologické parametre, sú prezentované v tabuľke 1. Tieto 83 liečebné cykly viedli k 10 tehotenstvám.
Tabuľka 1 Porovnanie medzi skupinou žien, ktoré otehotneli a skupinou žien, ktoré neotehotneli
netehotné priemer + SD tehotné priemer ± SD P hodnota T-test*
koncentrác. inhibínu A tretí deň (pg/ml) 9,0 01773,1 7,4i 0,7 0,1
koncentr.estradiolu tretí deň (nmol/1) 0,15 ± 0,08 0,14 i 0,03 0,7
koncent.inhibínu A v deň OPU(pg/ml) 16,3 ±. 9,2 19,6 ± 6 0,28
zvýšenie kone, inhibínu A od tretieho dňa (%) 87 ± 93 164 ± 73 0,01
koncent.estradiolu v deň OPU 0,35 ± 22 0,48i 26 0,1
zvýšenie kone, estradiolu od tretieho dňa (%) 157 i 138 264 + 224 0,08
zvýšenie kone, inhibínu A x zvýšenie koncent.estradiolu (%)2 17607 ± 26753 49433i 61156 0,005
• Bol použitý neparametrický test. Dáta nie sú rozložené podlá normálneho rozdelenia.
Tabulka 1 ukazuje, že zvýšenie inhibinu A od tretieho dňa je vyššie u cyklov, kde došlo k otehotneniu, že zvýšenie estradiolu je nevýznamné a že zvýšenie inhibinu A násobené zvýšením estradiolu je významne vyššie u cyklov, kde došlo k otehotnenoiu.
Následne bola analyzovaná schopnosť analýzy sérového inhibinu A a estradiolu samotných odlíšiť produktívne a neproduktívne liečebné cykly.Na tento účel boli použité rôzne diskriminačné faktory a bola stanovená štatistická korelácia medzi údajmi a schopnosťou otehotnieť.
Tabulka 2 Diskriminačný faktor : koncentrácia inhibinu A v sére pod 10(pg/ml) tretí deň
netehotné tehotné P hodnota*
koncent.inhibínu A pod 10 tretí deň 51 10 0,03
kone. inhibinu A rovná alebo nad 10 tretí deň 22 0
*Fischerov presný test
Tabulka 3 Diskriminačný faktor : koncentrácia inhibinu A v sére pod 9 (pg/ml) tretí deň
netehotné tehotné P hodnota*
koncent.inhibínu A pod 9 tretí deň 43 9 0,04
koncent.inhibínu A rovná alebo nač 9 tretí deň 30 1
♦Fischerov presný test
Tabuľka 4 Diskriminačný faktor : aspoň 80 % zvýšenie koncentrácie inhibínu A v sére od tretieho dňa do dňa OPU
netehotné tehotné P hodnota*
koncentr.inhib. A zvýšená viac ako o 80 % 35 10 0,001
kone, inhib. A zvýšená menej ako o 80 % 38 0
4Fischerov presný test
Tabulka 5 Diskriminačný faktor : aspoň 100 % zvýšenie koncentrácie inhibínu A v sére od tretieho dňa OPU
netehotné tehotné P hodnota*
kone, inhibínu A zvýšená viac ako o 100 % 30 8 0,02
kone, inhibínu A zvýšená menej ako 100 % 43 2
4Fischerov presný test
Tabulka 6 Diskriminačný faktor : zvýšenie koncentrácie estradiolu v sére od tretieho dňa OPU viac ako o 87 %
netehotné tehotné P hodnota*
kone.estradiolu zvýšená o viac ako 87 % 47 10 0,02
kone, estradiolu zvýšená o menej ako 87 % 26 0
4 Fischerov presný test
Tabuľka 7 Diskriminačný faktor: aspoň 100 % zvýšenie koncentrácie estradiolu v sére od tretieho dňa do dňa OPU
letehotné tehotné P hodnota*
kone, estradiolu zvýšená o viac ako 100 % 41 9 0,04
kone.estradiolu zvýšená o menej ako 100 % 31 1
* Fischerov presný test
Schopnosť kombinácie analýz sérového inhibínu A a estradiolu rozlíšiť produktívne a neproduktívne liečebné cykly.
Tabuľka 8 Diskriminačný faktor: aspoň 7500 násobné zvýšenie koncentrácie inhibínu A estradiolu v sére od tretieho dňa do dňa OPU (% x %)
netehotné tehotné P hodnota*
viac ako 7500 46 10 0,004
menej ako 7500 37 0
*Fischerov presný test • ·· · ·· • · · · · · • · · · · · · • · · · ···· · · · • I · · · · ·· ·· · ··
Tabulka 9 Diskriminačný faktor: zvýšenie koncentrácie estradiolu v sére od tretieho dňa do dňa OPU aspoň o 87 % v skupine so zvýšením sérového inhibínu A aspoň o 80 %
netehotné tehotné P hodnota *
inhibín A a estradiol zvý šený o viac ako 85 % a 87 % 38 10 0,2
inhibín A zvýšený o 80 % a estradiol zvýšený o menej ako 87 % 7 0
’Fischerov presný test
Tabulka 10 Diskriminačný faktor : zvýšenie koncentrácie estradiolu v sére od tretieho dňa do dňa OPU o viac ako 87% v skupine so zvýšením inhibínu A od tretieho dňa do dňa OPU
netehotné tehotné P hodnota*
estradiol zvýšený o viac ako 87 % a inhibín A o viac ako 80% 38 10 0,03
estradiol zvýšený o viac ako 87 % inhibín A o menej ako 80 % 19 0
Tabuľka 11 Efekt požadoveného zvýšenia inhibinu A
• ·· • ·· ·
• · • • • · ··
Q • • • • · • · •
• • I • ···· • · · •
• • • • • · •
··· ··· ·· • ·· ···
*Fischerov presný test
netehotné tehotné
zvýšenie estradiolu o menej ako 87 % a žiadne zvýšenie inhibinu A 20 0
zvýšenie estradiolu o menej ako 87 % a zvýšenie inhibinu A nad 80 % 7 0
Tabuľka 11 Efekt požadovaného zvýšenia estradiolu
netehotné tehotné
zvýšenie inhibinu o menej ako 87 % a žiadne zvýš, estradiolu 20 0
zvýš, inhibinu o menej ako 87 % a zvýšenie estradiolu nad 87 % 19 0
Vyššie uvedené údaje ilustrujú, že koncentrácia sérového inhibinu A je silným predikčným ukazovateľom úspechu
IVM cyklov. Tieto údaje ukazujú, že nedošlo k otehotneniu u cyklov, kde bola konentrácia inhibinu A nad 10 pg/ml tretí • · ·· · ·· ·· · ·· • · · · ·· • · · · · ···· · • · · ·· ··· ··· ·· · ·· · • · ·· • · · • · · • · · ·· ··· deň menštruačného cyklu ( tabuľka 2). Otehotnenie sa naviac vyskytlo v skupine s koncentráciou inhibínu A nad 9 pg/ml tretí deň menštruačného cyklu ( Tabuľka 3).
Nielen absolútna koncentrácia inhibínu A tretí deň predikuje úspešnosť IVM cyklu, ale tiež to isté robí zvýšenie inhibínu A v sére do dňa získania vajíčok (OPU). Preto produktívny cyklus veľmi koreluje aspoň s 80 % zvýšením sérového inhibínu A od tretieho dňa OPU ( Tabuľka 4 a Tabuľka
5).
Údaje týkajúce sa estradiolu ukazujú, že produktívny cyklus koreluje aspoň s 87 % zvýšením sérového estradiolu od tretieho dňa do dňa OPU ( Tabulka 6 a Tabuľka 7).
Sprievodné zvýšenie sérového inhibínu A a estradiolu sa zdá byť dokonca lepším predikčným ukazovateľom na úspešnosť IVM. Kombinácia zvýšenia inhibínu A a estradiolu od tretieho dňa do dňa OPU je veľmi dobrým predikčným ukazovateľom produktívneho cyklu ( Tabuľka 8, Tabuľka 9 a Tabuľka 10). Predikcia sa týka tiež neúspechu, pretože k otehotneniu nedošlo v cykloch bez zvýšenia inhibínu A nad 80 % od tretieho dňa do dňa OPU (Tabuľka 11), ani v cykloch so zvýšením inhibínu A bez zvýšenia estradiolu (Tabuľka 12).
Príklad 2: Použitie inhibínu A a estradiolu ako paramertov na perspektívnu analýzu IVM cyklov
Prediktívny efekt parametrov stanovených v príklade 1 za použitia analýzy inhibínu A a estradiolu bol stanovený na zistenie, ktoré cykly by mali pokračovať k ašpirácii vajíčok.
·· • ··
• e • • ·
• • • · • ·
• · ···· • · ·
• • • • ·
·· • ··
Tabuľka 13 Efekt zrušenia cyklov s elevovaným inhibínom A tretí deň
netehotné tehotné percento otehotn. (%)
všetky cykly 83 10 12,1
cykly s inhibínom A pod 10 pg/mi tretí deň 62 10 16,1
cykly s inhibínom A pod 9 pg/ml 3.deň 52 9 17,3
Tabuľka 14 Efekt zrušenia cyklov bez nárastu inhibínu A v deň OPU
netehotné tehotné %
všetky cykly 83 10 12,1
len cykly s nárastom inhibínu A od 3.dňa do dňa OPU nad 80 % 45 10 22,2
Tabuľka 15 Efekt zrušenia cyklov s inhibínom A o koncentrácii pg/ml alebo viac tretí deň alebo bez nárastu inhibínu A v deň OPU nad 80 %
netehotné tehotné %
všetky cykly 83 10 12,1
vybraté cykly 40 10 25,0
Tabulka 16 Efekt zrušenia cyklov s inhibínom A o koncentrácii 10 pg/ml alebo viac tretí deň, alebo produktu zvýšenia inhibínu A a estradiolu od tretieho dňa do dňa OPU nad 80 % menšom ako 7500 %
netehotné -tehotné %
všetky cykly 83 10 12,1
vybraté cykly 38 10 26,3*
*Významne odlišný od všetkých cyklov (p menšie ako 0,05. CHI2-test)
Tabulka 17 Efekt zrušenia cyklov s inhibínom A o koncentrácii 10 pg/ml alebo viac tretí deň alebo žiadnym zvýšením inhibínu A a estradiolu v deň OPU
netehotné tehotné %
všetky cykly 83 10 12,1
vybraté cykly 35 10 28,6*
•Významne odlišný od všetkých cyklov ( p menšie ako
0,05. CHI2-test) φ φ φφ φ ·· · ·· ·· · · · · φ ·· • · φφφφ φφφ • φ · · · φφφφ · φ · · φ φ φφφ φφφ • ΦΦ φφφ φφ · φφ ·Φ·
Tieto údaje ukazujú, že cykly určené na to, aby boli neproduktívne, môžu byť zrušené na podklade stanovenia inhibínu A rýchlo v liečebnom cykle a stanovenie inhibínu A a estradiolu neskoršie v cykle ( Tabulka 13, Tabulka 14, Tabulka 15, Tabulka 16, Tabulka 17). Tieto ustanovenia výrazne zvyšujú účinnosť IVM cyklu. Doposial získané dáta ukazujú, že každý pacient môže alternovať medzi cyklami s vysokým inhibínom A rýchlo počas cyklu ( žiadne tehotenstvo) a cyklami s nízkym inhibínom a rýchlo počas cyklu. ( tehotenstvo).
Príklad 3: Dopad predliečenia pomocou FSH
Schopnosť nezrelých oocytov spontánne pokračovať v meióze po vybratí z folikula bola najskôr opísaná Pincusom a Enzmanom v roku 1935. ľudské oocyty z malých foikúl môžu obnoviť a dokončiť meiózu za podmienok in vitro, ale do menšieho rozsahu ako cicavci (Edwards, 1965). Bolo opísané úspešné dozrievanie nestimulovaných oocytov (Cha et. al., 1991, Trounson et al., 1994, Barnes et al., 1996, Russell et al., 1997), a dosiahla sa vysoká úspešnosť oplodnenia po podrobení oocytov intracytoplazmatickej injikácii spermiami (ICSI) (Russel et al., 1997), ale vysoký vývojový potenciál bol opísaný ako nízky (Cha a Chian, 1998, Barnes et al., 1996). IVM protokol je relatívne jednoduchý s kratším liečebným obdobím a znižuje náklady v porovnaní s konvenčnými IVF. Naviac sú eliminované vediajšie účinky ovariálnej superovulácie, hlavne hyperstimulačný syndróm. Napriek zlej úspešnosti otehotnení doposial opísaných v štúdiách u človeka sa úspešnosť dosiahne u laboratórnych zvierat povzbudzujúco. U opíc bolo preukázané, že predliečenie pomocou FSH zvyšuje jaderné cytopiazmatické dozrievanie oocytov (Schramm a Bavister, 1994). Zvýšenie hladín FSH vo folikule súvisí s tvorbou pozitívneho signálu nevyhnutného na ukončenie dozrievania oocytu u človeka za podmienok in vivo (Gomez et ·· · ··
9 9 9 9 9
9 9 9 9 9
9 9 9999 9 9 9
9 9 9 9
9 99 9 al., 1993). Ukázalo sa, že krátka stimulácia pomocou FSH zvyšuje percento oocytov, ktoré dosiahnu metafázu II (Wynn et al., 1998) po dozrievaní za podmienok in vitro.
V tejto perspektívnej randomizovanej pilotnej štúdii sa skúmalo, či vývojový potenciál oocytov dozretých za podmienok in vitro sa môže zlepšiť predliečením pomocou FSH pred ašpiráciou.
Materiál a metodika
Do tejto štúdie boli zahrnuté páry indikované na IVF/ICSI z dôvodov mužskej neplodnosti a/lebo tubárneho ochorenia, ženy mali aspoň 18 a najviac 38 rokov a mali normálne ovulačné cykly s priemernou dĺžkou medzi 24 a 35 dňami a ich Body mass index (BMI) bol medzi 18 a 29 kg/m2. Zo štúdie boli vyradení všetci pacienti s naplodnosťou spôsobenou endokrinnými abnormalitami, ako napríklad s hyperprolaktinémiou, so syndrómom polycystických vaječníkov a predchádzajúcimi cyklami kontrolovanej ovariálnej hyperstimulácie, z ktorých boli získané menej ako 3 oocyty. Ďalej boli vyradené všetky ženy so zvýšenou hodnotou FSH ( viac ako 15 IU) tretí deň cyklu.
Štúdia bola povolená miestnou etickou komisiou. Všetky páry sa zúčastnili štúdie po písomnom súhlase. Prvým experimentom bola randomizovaná prospektívna štúdia obsahujúca dvdsať pacientov z párov plánovaných na ICSI z dôvodov mužskej neplodnosti. Ženy boli náhodne rozdelené do dvoch skupín. Skupina I ( n = 10 cyklov) nebola stimulovaná, skupina II ( n = 10 cyklov ) bola od tretieho dňa stimulovaná pomocou rec-FSH (Gonal-F, Serono) 150 IU/ deň počas 3 dní.
Ašpirácia bola urobená deň po ultrazvukovom zistení hlavného folikula o velkosti 10 mm. Všetky oocyty boli pred ICSI dozrievané za podmienok in vitro počas 36 hodín.
Druhého experimentu sa zúčastnilo dvanásť po sebe idúcich párov. Všetky ženy boli pred ašpiráciou predliečené pomocou rec-FSH (Gonal F, Serono) a od tretieho dňa sa im podávalo 150 IU denne. Päť pacientov bolo stimulovaných rovnakým spôsobom ako skupina 2 v prvom experimente pomocou fixnej dávky 150 IU/deň počas 3 dní a ašpirácia bola urobená deň po zistení hlavného folikula o velkosti 10 mm. Zostávajúcich sedem pacientov bolo d’alej stimulovaných až do velkosti hlavného folikula 10 mm a ašpirácia bola urobená o 72 hodnín neskoršie. Všetky oocyty boli kultivoavané počas 48 hodín až do oplodnenia pomocou ICSI.
U všetkých pacientov bolo urobené transvaginálne ultrazvukové vyšetrenie tretí deň cyklu a boli stanovené bazálne hladiny FSH, LH, estradiolu, inhibínu A a inhibínu B. Profily hormónov boli sledované od tretieho dňa až po deň ašpirácie. V prípade vzniku ovariálnej cysty bol cyklus zrušený. Druhé ultrazvukové vyšetrenie bolo urobené šiesty až siedmy deň a následne sa robili ultrazvukové vyšetrenia denne alebo s intervalom 2 -3 dní v závislosti od velkosti folikúl.
V oboch experimentoch bolo endometriálne predliečenie tvorené podávaním 17-β- estradiolu od odberu oocytu v dávke 2 mg trikrát denne per os. Hrúbka endometria pod 6 mm pri ultrazvukovom vyšetrení v deň ašpirácie sa neprijímala.Dva dni po ašpirácii bola začatá liečba intravaginálnymi progesterónovými čipkami a v tejto liečbe sa pokračovalo až do realizácie tehotenského testu. V liečbe estrogénom a progesterónom sa pokračovalo, kým nebol tehotenský test • ·· · ·· ·· * · · · · · • · · · · · · • · · · ···· · · · • · · · · · pozitívny, do päťdesiateho dňa tehotenstva.
Odber oocytu bol urobený transvaginálne pomocou 17-G ihly Cook s redukovaným aspiračným tlakom, ako bolo opísané Trounsonom et al. (1994). Folikulárne aspiráty boli prenesené v skúmavkách do laboratória a premyté na embryovom filtri s veľkosťou pórov 70 um. Dozrievanie a fertilizácia je podrobne opísaná Smithom et al. (1998), ale v stručnosti oocyty dozrievali v médiu pre kultúry tkanív č. 199 (TCM 199, Sigma, Roedovre, Dánsko) suplementovanom na pyruvátom 0,3 mM, 1500 IU/ml penicilínu G, 50 mg/ml streptomycín sulfátu, estradiolom 1 ug/ml (všetko od spoločnosti Sigma), rec-FSH 0,075 IU/ml (Gonal-F, Serono), hCG 0,5 IU/ml (Profasi, Serono) a sérom od pacientov ( 10 %). Sérum od pacientov bolo získané v deň ašpirácie. Oocyty boli kultivované separátne v 25 ul v kvapkách IVM média pod parafínovým olejom pri teplote 37 °C v 5 % CO2. Pri oocyte bol klasifikovaný rozpad germinálneho vezikula, ak chýbala jadrová membrána. Ak došlo k extrúzii polárneho telieska, bol oocyt klasifikovaný ako dozretý do metafázy.
Fertilizácia pomocou ICSI bola urobená vo všetkých oocytov v metafáze II. Oocyty boli potom umiestnené do 10 ul kvapiek IVF média (Medicult, Kodaň, Dánsko) a kultivoavané pod olejom v Petriho miskách Falcon. Embryá boli klasifikované podľa stupnice 1-4, kde typy 1 a 2 (menej ako 10 % framentácie) boli považované za schopné transferu (Deschant et al. 1988). Prenesené boli maximálne dve embryá. Stupeň rozvoja embrya bol definovaný ako počet embryí schopných transferu z celkového počtu injikovaných oocytov. Stupeň implantácie bol definovaný ako počet gestačných vačkov viditeľných pri ultrazvukovom vyšetrení z celkového množstva nahradených embryí.
Ultrazvukové meranie e · ·· · ··· • · · · a······ • · · · · ···· • · · · · ···· ·· · · • · · · ···· ··· ··· ·· · ·· ···
Priemery folikúl boli merané rovnakým pracovníkom počas transvaginálneho ultrazvukového vyšetrenia za použitia 7,5 Mhz transvaginálnej sondy (Bruer a Kjaer). Priemer folikúl bol vypočítaný ako priemer najdlhšej osi folikula a kolmej osi na túto v rovnakej vyšetrovacej rovine.
Štatistické metódy
Štatistická analýza bola zhotovená pomocou Študentovho T-testu. Pretože žiaden zo stanovovaných hormónov nevykazoval normálne rozdelenie, na analýzu štatisticky významných roz dielov sa použil neparametrický Mann-Whitneyov U-test pre nepárové dáta a Prattov test pre párové dáta. Hodnoty boli považované za významné, ak bolo p menšie ako 0,05.
Výsledky
Pacienti
V experimente bol medián veku žien 31 rokov ( rozmedzie
- 36 rokov) v skupine bez predliečenia pomocou FSH a 32 rokov (rozmedzie 28 - 36 rokov) v skupine, ktorej bolo FSH podávané. Toto sa nelíšilo od veku žien v experimente 2 ( medián 32 rokov, hranica 27 - 37 rokov). Ďalšie klinické charakteristiky včítane trvania neplodnosti, príčiny neplodnosti a počtu predchádzajúcich IVF cyklov boli vo všetkých skupinách podobné.
Prvý experiment: Dozrievanie a vývoj embrya
V prvom experimente zahŕňajúcom 20 žien mohlo byť na IVM • · ·· · ·· · ·· ·· · · · · ··· • β · · · · ·· • · · · · ···· · · · * • · · · · · ·· ··· ··· ·· · ·· ··· použité 77 oocytov a 62 (81%) dozrelo do štádia MFII po 36 hodinách. Po fertilizácii pomocou ICSI sa pozorovalo 2PN oplodnení u 49 ( 79%) a u 45 z nich (72%) došlo k rozdeleniu. Stupeň vývoja embrya bol 40 /62 (65%) a stupeň implantácie bol 5/33 (15 %). Pomer klinického tehotenstva na začatý cyklus bol 5/20 (25 %). U jednej pacientky došlo v ôsmom gestačnom týždni k potratu, zvyšné tehotenstvá pokračujú. Predliečenie pomocou FSH nemalo žiaden efekt na dozrievanie oocytu, stupeň fertilizácie, stupeň delenia alebo vývoj embrya (Tabulka 18). Celkovo sa dosiahlo päť tehotenstiev. Jedna žena porodila zdravého chlapca, jedna potratila v ôsmom gestačnom týždni, zvyšné sú za 32. týždňom gestácie.
Profily hormónov
Tretí deň po ašpirácii neboli nájdené rozdiely medzi oboma skupinami v koncentráciách estradiolu, FSH, LH,inhibínu A a inhibinu B (Tabulka 19). V nestimulovanej skupine sa koncentrácie FSH nelíšili od hodnôt stimulovanej skupiny, no boli pozorované velké inter-individuálne rozdiely. Hladina estradiolu v sére zostala v skupine bez stimulácie na rovnakej úrovni od tretieho dňa do šiesteho až siedmeho dňa. V deň ašpirácie sa pozorovalo významné zvýšenie. V stimulovanej skupine s koncentrácia estradiolu zvýšila skôr ( šiesty až siedmy deň ) a dosiahla konštantnú hladinu pred ašpiráciou. V oboch skupinách sa nepozorovalo predčasné zvýšenie LH.
Koncentrácie inhibinu A mali rovnaký profil ako koncentrácie estradiolu s rýchlym vzostupom v stimulovanej skupine a pozdným zvýšením v skupine nestimulovanej. V nestimulovanej skupine sa koncentrácia inhibinu B zvýšila skôr ako koncentrácia inhibinu A ( šiesty až siedmy deň ).
Súčasne bolo pozorované zvýšenie v stimulovanej skupine, ale koncentrácia bola trojnásobná oproti nestimulovanej skupine a významné zníženie koncentrácie inhibinu B sa pozorovalo od šiesteho do siedmeho dňa po ašpirácii.
Druhý experiment:
V druhom experimente, zahŕňajúcom 12 žien mohlo byť pre IVM použité 38 oocytov a po 48 hodinách 27 (71 %) dozrelo a bolo fertilizované pomocou ICSI. Stupeň fertilizácie a delenia bol 61 %, respektíve 53 % a tieto hodnoty sa nelíšili od údajov získaných v experimnte 1. Pätnásť embryí bolo prenesené u 10 pacientov, žiadne embryo nebolo kryoprezervované. Dosiahlo sa jedno tehotenstvo ukončené pôrodom zdravého dievčatka. Vývoj embrya bol v tejto skupine 56 % a stupňom implantácie bol 7 %. Predĺžením stimulačného obdobia z fixnej dávky 150 IU/deň počas 3 až 6 dní do získania folikúl o veíkosti 10 m sme získali väčšiu veíkosť folikúl v deň ašpirácie a vyššiu koncentráciu estradiolu v sére, ale počet oocytov získaných na jednu ašpiráciu sa nezvýšil (Tabulka 20 ).
Bezpečnosť
V tejto štúdii nebola žiadna pacientka hospitalizovaná z dôvodu infekcie, krvácania alebo abdominálnych bolestí. Nebolo pozorované žiadne mimomaternicové tehotenstvo.
Diskusia
Podía našich vedomostí sa jedná o prvú štúdiu s percentom otehotnenia 25 % na jednu ašpiráciu so stupňom implantácie 15 % po dozrievaní oocytov za podmienok in vitro.
999
9
99
9999
99
999
Nedozreté oocyty sa v tejto štúdii javili ako rovnocenné oocytom po superovulácii a dozrievaní za podmienok in vivo (Meldrum et al., 1998).
Počet oocytov získaných od nestimulovaných žien s pravidelným cyklom sa nelíšil od počtu oocytov získaných a dozretých v štúdii Barnesa et al (1996). Predliečenie pacientov rekombinantným FSH nezvýšilo počet odobratých oocytov. V predchádzajúcich štúdiách boli uvádzané konfliktné výsledky. Wynn et al (1998) opísal zvýšený počet oocytov získaných od pravidelne menštruujúcich žien predliečených pomocou FSH v porovnaní so ženami bez tohto predliečenia, kým Trounson et al ( 1998) nepreukázal žiaden rozdiel v počte získaných oocytov. Predchádzajúce pozorovania naznačili, že počet použiteľných folikúl je daný už pred luteálnou fázou ( Gougeon a Testart, 1990 ) a krátka stimulácia pomocou FSH neovplyvnila počet použiteľných nezrelých oocytov. To je v zhode s výsledkami predkladanej štúdie. So vzrastajúcim množstvom FSH a zvyšujúcou sa veľkosťou folikúl v experimente 2 sme pozorovali, že šanca získať oocyty pri ašpirácii sa nezvýšila. To sa zhoduje s predchádzajúcimi publikáciami (Templeton et al.), kde šanca získať oocyty z týchto veľkých folikúl bola v neprítomnosti hCG veľmi nízka.
Stupeň, dozrievanie, pozorované v predkladanej predchádzajúcich štúdií, fertilizácia a delenie oocytov štúdii je v zhode s výsledkami ale my sme pozorovali vyššie percento otehotnenia a vyšší stupeň implantácie, čo ukazuje na zlepšený embryonálny vývoj oocytov.
Toto pozorovanie môže vysvetliť celý rad faktorov.
Embryonálny vývoj IVM oocytov môže byť zlepšený predliečením pomocou FSH. U opíc rodu Rhesus zlepšuje predliečenie ·· 9
9 9
9 9 9
9 9999
9 9
9
9
9 99
9 9
9 9 9
9 9
999 pomocou FSh dozrievanie a delenie oocytov (Schram a
·· · ··· ·
Bavister,
1994). U človeka sa dosiahlo tehotenstvo po transfere nezrelých oocytov zo stimulovaných cyklov ( Nagy et al., 1996, Liu et al., 1997, Jaroudi et al., 1997, Edirisinghe et al., 1997).
V nedávnej dobe opísal Wynn et al ( 1998) zvýšený stupeň dozrievania oocytov po predliečení pomocou FSH. V prvom experimente však predliečenie žien pomocou FSH pred odberom oocytov nezlepšilo stupeň dozrievania za podmienok in vitro. Na pozorovaný rozdiel sú možné dve vysvetlania:
1. použité kultivačné podmienky alebo
2. načasovanie ašpirácie.
Načasovanie fertilizácie a kultivačné podmienky sú dôležitými faktormi, ktoré boli diskutované Smithom et Ašpirácia oocytov bola menštruačného cyklu) v ašpirácie v predkladanej urobená fixný štúdii Wanna štúdii závisel al., siedmy deň pokiaľ deň
1999.
deň ( et al, od veľkosti folikúl.
V stimulovanej skupine bol deň ašpirácie zrealizovaný skôr ( v priemere deviaty deň ) v provnaní s nestimulovanou skupinou ( v priemere desiaty deň ) (Tabuľka 19), ale deň ašpirácie bol fixný rovnako v oboch skupinách. Veľkosť folikúl bola monitorovaná ultrazvukom a odber oocytov bol urobený v deň zistenia veľkosti hlavného folikula 10 mm.
V štúdii Wynna et al. (1998) nebola urobená fertilizácia oocytov v štádiu MII. V predkladanej štúdii nemalo predliečenie pomocou FSH žiaden efekt na stupeň fertilizácie alebo delenia. To je v zhode s výsledkami Trounsona et al ( 1998). Títo autori opísali, že liečba žien s prirodzeným cyklom pomocou rekombinantného FSH počas 3 dní nemala efekt na stupeň dozrievania a fertilizácie za podmienok in vitro. V našej skupine pravidelne menštruujúcich žien sa zdala byť ich vlastná stimulácia pomocou FSH dostatočná na získanie oocytov, ktoré sú kompetentné na • · ·· 9 ··· ·· ·· · · · · ··· • · · · · · · ·· • · · · · ···· · · · · • · 9 9 9 9 99 ··· ··· ·· 9 99999 dozrievanie za podmienok in predchádzajúcich štúdií, že bol vitro.
Známe je z opísaný veíký inter individuálny rozdiel v koncentrácii
FSH vo folikulárnej fáze tretí deň a výrazný inter - individuálny rozdiel maximálnych
koncentrácií FSh (Schipper et al., 1998). Tieto interindividuálne rozdiely hladín FSH môžu odrážať rozdiely v prahu pre FSH a senzitivite vaječníkov voči FSH a toto môže byť jedným z možných dôvodov na chýbanie rozdielu v stupni dozrievania a fertilizácie, hoci sa koncentrácia FSH líšila.
Pri nestimulovanej skupine sme pozorovali rozdiel v sérových koncentráciách etradiolu a inhibínu A v deň ašpirácie, čo je známe, že je sprievodným javom pri výbere dominantného folikula (Schipper et al., 1998). Koncentrácia inhibínu B sa zvýšila skôr ako koncentrácia inhibínu A a koncentrácie oboch hormónov boli udržiavané až do dňa ašpirácie. To je v súlade s predchádzajúcimi štúdiami (Schipper et al. , 1998, Groome et al., 1996 ) a v súlade s našimi ultrazvukovými nálezmi, pretože ašpirácia bola realizovaná po zistení velkosti dominantného folikula 10 mm. To znamená, že oocyty vybraté pre IVM boli v týchto prípadoch vybraté z folikúl určených na atréziu. My sme pozorovali, že embryonálny vývoj oocytov nebol nepriaznivo ovplyvnený skorými štádiami atrézie. Toto bolo skôr opísané u hovädzieho dobytka (Smith et al., 1996).
Tvorba inhibínu A a inhibínu B závisí od gonadotropínov ( Lockwood et al., 1996) a v skupine stimulovanej gonadotropínmi bol v predkladanej štúdii počas stimulácie pomocou FSH pozorovaný trojnásobný nárast koncentrácie inhibínu A a inhibínu B. Od šiesteho až siedmeho dňa po ašpiráciu došlo k významnému zníženiu koncentrácie inhibínu A • 9 ·· · ··· ·· ·· · · · · · ·· • · · · · · ··· • · · · · ···· · · · · • · 9 9 9 9 99
999 999 99 9 99999 a inhibínu B a toto pozorovanie je v súlade s nerastúcimi folikulami ( Price et al., 1995).
Načasovanie ašpirácie a výber oocytov pre IVM sú založené na skúsenosti s inými druhmi cicavcov ( Eppig et al., 1992, Edwards 1965 ), ale tiež sa zdá, že ľudské oocyty majú schopnosť dokončiť meiózu a dozrievanie, ktoré sú závislé od veľkosti ( Durenzi et al., 1995). Tsuji et al., 1985 zistil znížený stupeň dozrievania oocytov pochádzajúcich z malých folikúl ( 3- 4 mm) v porovnaní s oocytmi pochádzajúcich z väčších folikúl (9 - 15 mm) Dubey et al. (
1995) tiež pozoroval zníženie stupňa fertlizácie oocytov pochádzajúcich zo superovulovačných folikúl o menších rozmeroch. Pokial 58 % oocytov z folikúl o velkosti 10 - 14 mm bolo oplodnených, bolo oplodnených 74 % oocytov z folikúl o veľkosti 22 - 26 mm. V predkladanej štúdii sme pozorovali, že oocyty z veľkých folikúl v druhom experimente so stimuláciou vysokými dávkami gonadotropínov stali kompetentnými dozrievať a deliť sa (Tabuľka 20 ).
Ale tiež oocyty z folikúl o veľkosti 8 - 10 mm boli vývojovo kompetentné, ak bola ašpirácia urobená po zistení hlavného folikula ultrazvukovým vyšetrením. Russell et al ( 1998) opísal dramatický pokles stupňa dozrievania a fertilizácie, ked’ boli nezrelé oocyty aspirované pri veľkosti dominantného folikula viac ako 14 mm. To ukazuje, že môže existovať kritický bod, kde selekčný proces môže mať negatívny efekt na existujúce folikuly. Môže sa ukázať, že monitorácia priemeru folikúl bude užitočným praktickým prostriedkom selekcie oocytov kompetentných na dozrievanie za podmienok in vitro. Iné faktory, ako je veľkosť folikula, sa javí ako obmedzujúca účinnosť IVM systému. Predliečenie endometria je ďalším významným faktorom. V cykle s nezrelým oocytom chýba adekvátna endogénna produkcia estradiolu z dominantného folikulu. Preto je potrebná exogénna suplementácia, ktorá musí
• • ·· • ·· •
• · ·· • • • • • • ·
• • • • • · • • •
• • • · • ···· • · • •
• • • · • • • •
·· · ··· ·· • ·· ···
byť synchronizovaná s implementáciou embryonálneho vývoja. (Russell et al., 1997) zistil zvýšený stupeň dozrievania a fertilizácie, keď bola začatá suplementácia estradiolom folikúl priemernej velkosti, v porovnaní so skorším endometriálnym predliečením estradiolom. Je známe od príjemcov darcovských oocytov liečených hormonálnou náhradou, že je najlepšie prenášať do endometriálnej dutiny dva dni staré embryá tretí alebo štvrtý deň po expozícii progesterónu (Rosenwaks et al., 1987). Naším cielom bolo imitovať čo najlepšie normálny stav a liečbu estradiolom sme začali v deň ašpirácie a suplementáciu progesterónom o dva dni neskoršie. Mohlo by sa čakať, že cykly s predliečením pomocou FSH elevovaných hladín estradiolu od šiesteho až siedmeho dňa pripravili endometrium lepšie ako nestimulované cykly, kde došlo k zvýšeniu hladín estradiolu až tesne pred ašpiráciou. Nie sme schopní demonštrovať žiaden rozdiel v percente implantácie medzi oboma skupinami a toto je v súlade s predchádzajúcimi informáciami, pretože nebola nájdená žiadna korelácia medzi koncentráciou sérového estradiolu a stupňom implantácie (Yuonis et al., 1996, Remohi et al., 1997).
Je potrebné potvrdiť tieto výsledky na väčšom počte pacientov. To by mohlo viesť k atraktívnej alternatíve kontrolovanej ovariálnej hyperstimulácie pre in vitro fertilizáciu. Pre klinický prospech pri znížení vedlajších , účinkov, hlavne elimináciu hyperstimulačného syndrómu, môže táto liečba znížiť náklady na IVF. V nedávnej dobe bolo * spochybnené extenzívne používanie liekov na ovariálnu stimuláciu Edwardsom et al., 1997. Bolo urobených vela pokusov s cielom realizácie IVF počas prirodzeného cyklu bez použitia exogénnych gonadotropínov. Kombinácia odberu nezrelých oocytov a IVM môže zvýšiť úspech IVF s prirodzeným cyklom. U IVF/ICSI realizovaných z dôvodov mužskej

Claims (19)

1. Test aspoň na jeden prediktívny marker vo vzorke cicavca, kde špecifická reakcia aspoň na jeden prediktívny marker ukazuje, či je u cicavca prítomné neplodné vajíčko schopné in vitro dozrievania a nasledovnej fertilizácie.
2. Test podlá patentového nároku 1, kde vzorka od cicavca je vzorkou vybratou zo skupiny tvorenej telovým sekrétom, sputom, krvou, močom, maternicovými sekrétmi a bunkami.
3. Test podlá patentového nároku 2, kde vzorkou je krvná vzorka.
4. Test podlá akéhokolvek z predchádzajúcich patentových nárokov, kde cicavcom je primát, ako je napríklad človek.
5. Test podlá akéhokolvek z predchádzajúcich patentových nárokov, kde špecifická reakcia je založená na princípe imunoanalýzy a/lebo PCR reakcie.
6. Test podlá akéhokolvek z predchádzajúcich patentových nárokov, kde aspoň jedným prediktívnym markerom je marker zvolený zo skupiny tvorenej bielkovinami, hormónmi, lipidmi, nukleovými kyselinami, medzibunkovými poslami a enzýmami.
7. Test podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich patentových nárokov, kde jedným prediktívnym markerom je inhibín A.
8. Test podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich patentových nárokov, kde jedným prediktívnym markerom je estradiol.
k
9 · ·· · ··· ·· ·· 9 · 9 9 ··· • · t · · · · ·9 • · · · 9 ···· 9 99 e • · 9 9 9 · ··
999 ··· ·· · ·····
9. Test podľa patentových nárokov 7 a 8, kde špecifickou reakciou na inhibín A je zvýšenie inhibínu A od tretieho dňa do dňa ašpirácie.
10. Test podľa patentového nároku 9, kde zvýšenie je aspoň 80 %.
11. Test podľa akéhokoľvek z patentových nárokov 7-10, kde špecifickou reakciou na inhibín A je cut off hodnota.
12. Test podľa patentového nároku 11, kde špecifickou reakciou je koncentrácia inhibínu A tretí deň viac ako 9 pg/ml.
B
13. Test podľa akéhokoľvek z patentových nárokov 7-12, « kde špecifickou reakciou na estradiol je zvýšenie estradiolu od tretieho dňa do dňa ašpirácie.
14. Test podľa patentového nároku 13, kde zvýšenie je aspoň 87 %.
15. Test podlá akéhokolvek patentových nárokov, kde test zahŕňa predchádzajúcich aspoň dve stanovenia aspoň jedného prediktivneho markeru.
16. Test podlá akéhokolvek z predchádzajúcich patentových nárokov, kde výsledok špecifickej reakcie je pokles, konštantná hladina alebo zvýšenie koncentrácie aspoň jedného prediktivneho markeru vo vzorke od cicavca.
17. Použitie testu na prítomnosť alebo množstvo prediktivneho markeru vo vzorke od cicavca na predvídanie úspešnosti IVM cyklu.
18. Použitie podlá patentového nároku 17, kde šanca otehotnieť je pre IVM cykly aspoň 15 %.
19. Súprava obsahujúca
- prostriedok na získanie vzorky od cicavca
- test podlá akéhokolvek z patentových nárokov 1-16 B 20. Súprava podlá patentového nároku 19 obsahujúca ďalej schému s návodom na vyhodnotenie špecifickej reakcie.
SK1915-2000A 1998-06-22 1999-06-22 Test na prítomnosť neplodného vajíčka SK19152000A3 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9011598P 1998-06-22 1998-06-22
DK199900885A DK199900885A (da) 1998-06-22 Fremgangsmåde for tildeling af et vilkårligt beløb på en given taletidskortkonto
PCT/DK1999/000344 WO1999067644A1 (en) 1998-06-22 1999-06-22 Assay to indicate the presence of non-fertilisable ova

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK19152000A3 true SK19152000A3 (sk) 2001-12-03

Family

ID=26064838

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1915-2000A SK19152000A3 (sk) 1998-06-22 1999-06-22 Test na prítomnosť neplodného vajíčka

Country Status (23)

Country Link
US (2) US20010028878A1 (sk)
EP (2) EP1088056A1 (sk)
JP (1) JP2002519640A (sk)
CN (2) CN1161615C (sk)
AT (1) ATE407363T1 (sk)
AU (2) AU760165B2 (sk)
BR (1) BR9911470A (sk)
CA (2) CA2335793A1 (sk)
DE (1) DE69939468D1 (sk)
EE (1) EE200000763A (sk)
ES (1) ES2313785T3 (sk)
HR (1) HRP20000888A2 (sk)
HU (1) HUP0103392A2 (sk)
ID (1) ID27197A (sk)
IL (2) IL140394A0 (sk)
IS (1) IS5768A (sk)
NO (2) NO20006519L (sk)
NZ (1) NZ509451A (sk)
PL (1) PL345318A1 (sk)
RU (1) RU2227916C2 (sk)
SK (1) SK19152000A3 (sk)
TR (1) TR200003830T2 (sk)
WO (2) WO1999067644A1 (sk)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005518823A (ja) * 2002-03-08 2005-06-30 マクギル・ユニバーシテイ 未成熟ヒト卵母細胞の体外成熟
JP2005529609A (ja) * 2002-06-17 2005-10-06 ケベンハウンス・アムツ・シゲフス・ハーレウ 体外受精
WO2005054449A1 (en) * 2003-11-26 2005-06-16 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Use of il-6-type cytokines for maturation of oocytes
WO2007008521A1 (en) * 2005-07-07 2007-01-18 Lonnie Shea Stage specific follicle maturation systems
CN103275930B (zh) * 2013-06-20 2014-07-09 江苏皓康生物医药科技有限公司 一种卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法
AU2015273531B2 (en) 2014-06-10 2021-07-29 Polybiocept Gmbh Culture medium for cellular immunotherapy
WO2017143412A1 (en) * 2016-02-24 2017-08-31 Universidade Estadual Paulista "Júlioo De Mesquita Filho" - Unesp Follicular system for in vitro oocyte maturation and kit
CN110628705A (zh) * 2019-10-22 2019-12-31 山东畜牧兽医职业学院 一种驴胚胎冲洗液及其应用方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4614715A (en) * 1982-05-14 1986-09-30 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Predictive test for impending ovulation in mammals
RU2013989C1 (ru) * 1991-08-13 1994-06-15 Борис Васильевич Леонов Способ определения овуляции
GB9217866D0 (en) * 1992-08-21 1992-10-07 Unilever Plc Monitoring method
EP0734531A1 (en) * 1993-12-16 1996-10-02 Abbott Laboratories Methods and means for determining the female fertile period
GB9410345D0 (en) * 1994-05-24 1994-07-13 Univ Oxford Brookes Method of genetic testing
GB9603326D0 (en) * 1996-02-16 1996-04-17 Royal Free Hosp School Med Predictive assay
EP0833160B1 (en) * 1996-09-27 2002-02-13 Unilever Plc Monitoring methods
GB9625175D0 (en) * 1996-12-04 1997-01-22 Medi Cult As Serum-free cell culture media

Also Published As

Publication number Publication date
NZ509451A (en) 2003-03-28
AU760165B2 (en) 2003-05-08
EP1090300A1 (en) 2001-04-11
ID27197A (id) 2001-03-08
CN1161615C (zh) 2004-08-11
ATE407363T1 (de) 2008-09-15
AU4360499A (en) 2000-01-10
NO20006545D0 (no) 2000-12-21
DE69939468D1 (de) 2008-10-16
CN1313951A (zh) 2001-09-19
WO1999067644A1 (en) 1999-12-29
IL140283A0 (en) 2002-02-10
BR9911470A (pt) 2001-03-20
NO20006545L (no) 2001-02-21
EP1090300B1 (en) 2008-09-03
HRP20000888A2 (en) 2001-12-31
HUP0103392A2 (hu) 2002-01-28
US20020115211A1 (en) 2002-08-22
WO1999067365A1 (en) 1999-12-29
IS5768A (is) 2000-12-12
ES2313785T3 (es) 2009-03-01
CN1607391A (zh) 2005-04-20
EE200000763A (et) 2002-06-17
RU2227916C2 (ru) 2004-04-27
PL345318A1 (en) 2001-12-03
JP2002519640A (ja) 2002-07-02
TR200003830T2 (tr) 2002-01-21
CA2335632A1 (en) 1999-12-29
NO20006519L (no) 2001-02-21
CA2335793A1 (en) 1999-12-29
US20010028878A1 (en) 2001-10-11
AU4360599A (en) 2000-01-10
EP1088056A1 (en) 2001-04-04
NO20006519D0 (no) 2000-12-20
IL140394A0 (en) 2002-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Teh et al. What is the contribution of embryo-endometrial asynchrony to implantation failure?
Timeva et al. Recurrent implantation failure: the role of the endometrium
Overstreet et al. Penetration of the zona pellucida of nonliving human oocytes by human spermatozoa in vitro
Abreu et al. Role of progesterone concentrations during early follicular development in beef cattle: I. Characteristics of LH secretion and oocyte quality
Lahoud et al. Elevated progesterone in GnRH agonist down regulated in vitro fertilisation (IVFICSI) cycles reduces live birth rates but not embryo quality
Lee et al. The predictability of serum anti-Müllerian level in IVF/ICSI outcomes for patients of advanced reproductive age
Tesařík et al. Zona pellucida resistance to sperm penetration before the completion of human oocyte maturation
Esterhuizen et al. Clinical importance of zona pellucida-induced acrosome reaction and its predictive value for IVF
Takahashi et al. The kinetics of the acrosome reaction of human spermatozoa and its correlation with in vitro fertilization
Wiley et al. Effects of endogenous progesterone during ovarian follicle superstimulation on embryo quality and quantity in beef cows
Maciel et al. Follicular dynamics and in vivo embryo production in Santa Inês ewes treated with smaller doses of pFSH
Fried et al. Increase in transforming growth factor beta1 in ovarian follicular fluid following ovarian stimulation and in-vitro fertilization correlates to pregnancy.
SK19152000A3 (sk) Test na prítomnosť neplodného vajíčka
US20110002907A1 (en) Methods, Systems, Compositions And Dosage Forms For Diagnosing And Treating Male Infertility
Jacob et al. Human sperm non-nuclear progesterone receptor expression is a novel marker for fertilization outcome.
van der Ven et al. Fertilization of human oocytes in capillary tubes with very small numbers of spermatozoa
Li et al. Ovarian adipocytokines are associated with early in vitro human embryo development independent of the action of ovarian insulin
Idil et al. Does granulosa cell apoptosis have a role in the etiology of unexplained infertility?
Avrech et al. Treatment variables in relation to oocyte maturation: lessons from a clinical micromanipulation-assisted in vitro fertilization program
US6649344B1 (en) Assay to indicate the presence of non-fertilizable ova
Cruz et al. Age and reproduction
CZ20004629A3 (cs) Test na přítomnost neplodného vajíčka
US8747294B2 (en) Assay of nitric oxide metabolites in the culture media of human preimplantation embryos
Berger et al. Estradiol to progesterone ratio is not a predictor of oocyte maturity at time of ovulation trigger
MXPA00012478A (en) Assay to indicate the presence of non-fertilisable ova