CZ20004629A3 - Test na přítomnost neplodného vajíčka - Google Patents

Abstract

Test se týká alespoň jednoho z prediktivnich markérů v tělním vzorku savce, kde specifická reakce prediktivního markéru indukuje u savce přítomnost neplodného vajíčka schopného vyzrání in vitro (IVM) a následné fertilizace Ín vitro. Vzorkem může být tělní sekret, sputum, krev, moč a děložní sekrety a buňky. Prediktivním markéremje markér, vybraný ze skupiny zahrnující bílkoviny, hormony, lipidy, nukleové kyseliny a enzymy.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká alespoň jednoho z prediktivních markérů ve vzorku od savce, kde specifická reakce na alespoň jeden prediktivní markér indikuje u savce přítomnost neplodného vajíčka schopného vyzrávání in vitro (IVM) a následné fertilizace in vitro. Toto je zejména užitečné pro určení, zdali po aspiraci neplodného vajíčka po vyzrávání in vitro do stádia MF-II bude po implantaci savci ženského pohlaví toto vajíčko schopné fertilizace a následného těhotenství. Test je založen na vzorku vybraném ze skupiny tvořené tělním sekretem, sputem, krví, moči, děložními sekrety a buňkami.

Dosavadní stav techniky

U normálně ovulující ženy se v každém menstruačním cyklu vyvíjí přibližně 300 nezralých oocytů (vajíček). Normálně během procesu apoptózy zahynou před ovulací kromě jednoho všechna vajíčka. Konvenční in vitro fertilizace (IVF), tedy léčba speciálních případů mužské i ženské neplodnosti je založena na získání zralých lidských vajíček s následnou fertilizací zralých oocytů se spermatozoami. Získání zralých lidských oocytů je dosahováno pomocí několika komplikovaných forem režimů hormonální léčby, často provázených diskomfortem nebo rizikem pro zainteresované ženy. Tyto režimy hormonální léčby se stanou problémem zejména v budoucnosti, protože IVF je ve zvýšené míře nabízena zcela zdravým ženám začleněných do těchto programů kvůli špatné kvalitě spermatu jejich manželů. Tento typ léčby navíc poskytuje 20% úspěšnost otěhotnění na započatý cyklus.

Kvůli riziku, diskomfortu a ceně hormonální stimulace byla v průběhu let zkoušena celá řada dalších postupů. U zvířat se stalo in vitro vyzrávání (IVM) účinnou metodou produkce oocytů pro IVF, ale doposud zaznamenaná úspěšnost pro klinické IVM u člověka byla nízká (Cha, Trounson, Barnes, Russel) . Jedním

z nejjednodušších způsobů, jak vyloučit hormonální stimulaci, bylo nestimulovat hormony vůbec. Tento léčebný protokol však vedl pouze k omezenému počtu těhotenství a vypočítaná míra vzniklých těhotenství nikdy nepřekročila 5% na započatý cyklus.

Popis vynálezu

Předkládaný vynález se týká schopnosti testovacího systému předpovídat načasování a vývoj specificky zdravých vajíček v aktivované profázi, které se za podmínek in vitro vyvíjejí do stádia MF-II bez exogenní hormonální léčby žen a tímto zamezují degeneraci většiny vajíček, ačkoli žena není léčena hormony. Na rozdíl od dřívějších hormonálních testů, které byly vždy zaměřeny na pozdější stádia vývoje vajíček, obvykle na vajíčka ve stádiu MF-II, předkládaná opatření jsou zacílena na načasování aspirace neplodných vajíček, které mohou vyzrávat za podmínek in vitro, aby mohly být oplodněny. Tímto způsobem je dosaženo úspěšnosti otěhotnění více než 15%.

Detailní popis vynálezu

Vědecký základ

Vývoj jádra vajíček je zastaven v diplotenní fázi ve formě germinálních vezikul, které je nazýváno dicytátovým stádiem. Toto stádium je charakterizováno vysoce difúzními chromozómy, jejichž DNA má nízkou afinitu k takovým typům jader, podobně jako Feulgenovo činidlo. Chromozómy vajíček v dicytátovém stádiu mají v laterální projekci větvičky a kličky, které aktivně replikují ribonuleovou kyselinu (RNA). Významně se podobají Lampbrush chromozómům, které jsou nacházeny téměř univerzálně u nižších obratlovců a některých bezobratlých. RNA může účinkovat jako posel řídící syntézu bílkovin ve vlastních vajíčkách. Důkazy z podrobných studií vajíček u žab a ropuch naznačují, že některé typy RNA mohou působit v časné organizaci vývoje savců. Ať už bude výsledek dodatečných studií požadovaných k objasnění těchto komplexních problémů jakýkoli, dicytátové stádium nemůže být považováno za klidové stádium, protože oocyty vykazují vysoký stupeň metabolické a syntetické • 0 • 0 0 0* 0 • «•0 0 00 00 0000 aktivity v době, kdy se folikulárni obal skládá pouze z několika oploštělých epiteliálních buněk.

Vývoj lidského oocytu/folikulu je kontrolovaným mechanismem v čase i v biologických procesech. Vývoj 99% všech vajíček je zastaven v meiotické profázi (což je dicytátové stádium) dokonce ještě před narozením. Z této zásoby je vybráno několik set vajíček, které jsou aktivovány každý měsíc (v menstruačním cyklu), aby se dále vyvíjely, což znamená znovu zahájení meiózy přes rozpad germinálních vezikul (GVB) a metafázi I (MF-I) až k metafázi II (MF-II) a k růstu folikulu.

Reprodukční stav člověka ženského pohlaví je cyklický s komplexem interakcí mezi hypotalamem, přední částí hypofýzy a vaječníky, který nakonec vede k procesu ovulace. Cyklus je opakován s průměrnou periodou 28-30 dnů (rozmezí 25-35 dnů) . První fáze, menstruace, trvá 4-5 dnů. První den cyklu je prvním dnem první fáze, což je také první den menstruačního krvácení. Druhá folikulárni fáze vaječníků koresponduje s proliferační fází endometria a trvá 10-16 dnů (tj. je vysoce variabilní). Poté následuje ovulační fáze (36 hodin) a nakonec fáze luteální, která odpovídá sekreční fázi endometria a je obvykle konstantní a trvá 14 dnů. Pro porozumění menstruačního cyklu jsou kritické tři složky:

1. Kontrola uvolňování FSH/LH hypotalamickým GnRH,

2. Vývoj ovariálního folikulu do ovulace a následné vytvoření žlutého tělíska a

3. Zpětná kontrola sekrece FSH/LH ovariálními hormony.

Během druhé poloviny reprodukčního cyklu se vyvíjí žluté tělísko a vylučuje estrogeny i progesteron. Estrogeny podporují proliferační aktivitu v endometriu. Progesteron na druhé straně způsobuje distenzí endometriálních žláz sekrečními produkty, které obsahují glykogen (důležitý pro vývoj implantovaného embrya). Endometriální průtok krve se zvyšuje a spirální artérie se stáčejí. Druhá polovina cyklu je nazývána luteální fází (ovaria) nebo sekreční fází (děloha). Pokud nedojde k implantaci, dochází k regresi žlutého tělíska a k rychlému poklesu sekrece estrogenů a progesteronu, endometrium se smršťuje v důsledku ztráty extracelulární tekutiny, spirální artérie se kontrahují, endometriální průtok krve se snižuje s odúmrtím buněk a destrukcí krevních cév. Tyto okolnosti vedou nakonec k menstruačnímu krvácení, kdy dochází k odloučení všech vrstev endometria kromě vrstvy bazální. První den menstruačního krvácení je z praktických důvodů prvním dnem menstruačního cyklu.

Vyzrávání vajíček je konečným stádiem vývoje vajíček, které se připravují na fertilizaci a vývoj embrya. Vyzrávání může být rozděleno na dva obecné procesy: vyzrávání jádra a vyzrávání cytopíazmy. Vyzrávání jádra je definováno jako znovuzahájení meiózy a progrese do stádia MF-II, zatímco vyzrávání cytopíazmy je definováno jako extragenomické změny, které připravují vajíčko pro aktivaci, k pronukleární tvorbě a časné embryogenezi.

Folikul obklopující vajíčka v dicytátovém stádiu obsahuje jednu vrstvu oploštělých granulózových buněk. Známky dalšího vývoje vajíček a folikulu zahrnují další znásobení počtu granulózových buněk a také přestup tekutiny do prostor mezi granulózovými buňkami. Jak narůstá množství tekutiny, dochází ke zvětšování okupovaných dutin, které splývají za vzniku antra. Takový folikul se nyní nazývá Graafův folikul. S další expanzí antra okupuje vajíčko jednu stranu folikulu a je obklopeno dvěmi nebo více vrstvami granulózových buněk. Nejvnitřnější vrstva těchto buněk nabývá cylindrického tvaru a vytváří corona radiata, která jako nejvnitřnější část cumulus oophorus přetrvává okolo vajíčka po dobu ovulace. Vyzrávání jádra pokračuje paralelně s vývojem folikulu. Proto jsou pozorována GVB a MF-I vajíčka během tvorby antra a jedná se o antrální a preantrální folikul. Časem dochází k plnému vyvinutí antra, k ukončení meiotického dělení a je pozorována extruze prvního polárního tělíska.

* · 0 · *·« • 0 «00 0*«0 0*00 00· 00 0000 00 0·0

Během každého menstruačního cyklu dosahuje tohoto stádia několik stovek vajíček. Avšak v důsledku přítomnosti v současnosti nevysvětlitelných faktoru dochází u většiny z těchto vajíček k atrézii, při které vajíčka podléhají apoptóze a zanikají. Rozpuštění nejvnitřnější vrstvy granulózových buněk při přítomnosti vajíčka ve folikulu, nebo toto rozpuštění předčasně po odchodu vajíčka je jistou známkou výskytu degenerativních změn, které mají za následek zánik vajíček. Za normálních okolností se vyvíjí pouze několik, normálně jen 1 vajíčko.

Technický základ IVF

Pokud je ženě podán FSH, dochází vývoji více než jen jednoho folikulu do stádia MF-II.

Stádiem MF-II je rozuměn oocyt s jedním polárním tělískem a expandovaným kumulusovým komplexem, u kterého nakonec došlo k ruptuře germinálního vesikulu. Tyto oocyty jsou snadno rozpoznány rutinním pracovníkem, který pracuje s oocyty určenými pro IVF. Vajíčka ve stádiu MF-II jsou typem vajíček, které jsou připraveny k fertilizaci spermiemi. Tyto znaky vajíček nejsou přítomny v žádné časnější fázi vývoje vajíček.

Konvenční in vitro (IVF) fertilizace má za cíl získat co nejvíce vajíček ve stádiu MF-II. Tohoto cíle je dosahováno léčbou žen exogenními hormony, které zahrnují folikuly stimulující hormon (FSH). RFSH nebo z moči derivovaný FSH je podáván v dávce 100 až 250 IU/den. V této léčbě je často pokračováno po dobu 8-10 dnů. K léčbě je přidáváno podávání agonistů GNRH, jako je například denní podávání Buserelinu. Touto léčbou je zamezeno degeneraci většiny z těchto aktivovaných vajíček. Tento typ hormonální léčby zahrnuje vždy riziko hyperstímulačního syndromu a další vedlejší účinky, jako je například zvýšené riziko vzniku nádorů vaječníků, dále nausea, diskomfort, otoky, bolest, alergické reakce na léčbu, • · 0 0 0 t *» ·

0··0 0 00 00 00 00 00 0*0 deprese a váhový úbytek, tedy příznaky, které lze těžko ospravedlnit, obzvláště je-li žena zdravá a důvodem pro léčbu pomocí IVF je závažný problém mužské neplodnosti. V současnosti více než 30% všech IVF cyklů na světě je zahajováno za pomoci rozsáhlé medikace podávané ženám, ačkoli problémem je mužský faktor.

Za účelem získání zdravých vajíček ve stádiu MF-II byla hormonální léčba žen doplněna monitorací sérových hladin estradiolu, FSH, LH, progesteronu, PP14, a a/nebo PP12. Načasování aspirace zdravých vajíček ve stádiu MF-II bylo provedeno za pomoci ultrazvukového sledování vývoje folikulů. Všechny tyto klinické testy byly navrženy za účelem zvýšení počtu zdravých vajíček ve stádiu MF-II.

IVM

IVM je přednostně zahájena s nezralými nebo ne plně vyzrálými gametami. Vajíčka jsou u ženy rozpoznány jako oocyty s pevnou kumulusovou masou bez viditelných polárních tělísek nebo germinálních vezikul. Tato vajíčka jsou snadno rozpoznána osobou zabývající se rutinní IVF léčbou jako nezralá vajíčka.

Pokud nejsou podány hormony, vyzrávají pouze oocyty, jak je patrné u normálně ovulujících žen. Uvolněním nezralých oocytů z vaječníků před zahájením apoptotických procesů, kdy vajíčka podléhají atrézii a následně vajíčka dále vyzrávají za podmínek in vitro, by mělo být u žen zamezeno riziku a diskomfortu spojeného s hormonální léčbou a stále by mělo být k dispozici dostatečné množství zralých vajíček ve stádiu metáfáze II (MFII) pro následnou in vitro fertilizaci.

Je možné produkovat oocyty, jejichž nukleární vyzrávání dostoupilo do stádia MF-II, ale které bylo nekompetentní pro úplný předimplantační vývoj. Důležitost cytoplazmatické kontroly na vývojovou kompetenci byla popsána u nezralých opičích oocytů. Za použití mikromanipulace byla z oocytů ve

Ί φ # ·» · · · * * · * · • « ·· · · · * φ 9 19 9 · ' · * ··«· 9·* 9· ·«·· «· ^,Ο stádiu MF-II odstraněna ooplazma, která byla injikována do oocytů v profázi I. Opice, kterým byly implantovány oocyty s cytoplazmatickou transfúzí měly sedminásobný nárůst úspěšnosti těhotenství ve srovnání s oocyty bez injekce ooplazmy (Flood).

Dosud publikované IVM protokoly používaly buďto fixní den v menstruačním cyklu, vypočítaný z předchozí ovulace nebo začátku menzes, nebo používaly den před finálním vývojem antrálních folikulů. Tento způsob vedl k úspěšnosti těhotenství od 0 do 10%.

Vynález

Předkládaný vynález se týká nálezu, že stanovení specifických signálních hormonů indikuje příslušné načasování aspirace vajíček pro IVM postup. Toto stanovení indikující načasování aspirace vajíček optimalizuje počet vajíček specificky schopných dalšího vyzrávání za podmínek in vitro, oplodnění a další vývoj. Identifikace specifických signálních hormonů jako prediktivních markérů schopnosti neplodných vajíček vyzrávat za podmínek in vitro, a dále následné fertílizace, dělení, implantace a těhotenství zvyšuje u savců stupeň úspěšnosti IVM cyklů.

Neplodná vajíčka v této patentové přihlášce jsou neplodná vajíčka (oocyty), u kterých po kontaktu se zralou spermií nedochází k meiotickému dělení a přijmutí genetického materiálu spermie a tvorbě oplodněné buňky. V současnosti je předpokládáno, že endokrinní a intraovariální regulace vyzrávání vajíčka vede k přesnému a komplexnímu složení látek o specifické koncentraci nebo koncentračních poměrech, takže neplodné vajíčko po in vitro vyzrávání do stádia MF-II se stává schopným oplodnění, následného dělení a poté i těhotenství po implantaci savci ženského pohlaví.

φφφ* ··»

Jeden aspekt vynálezu se týká testu na přítomnost nebo množství alespoň jednoho prediktivního markéru ve vzorku savce, kde specifické stanovení přítomnosti nebo množství tohoto markéru indikuje přítomnost neplodného vajíčka schopného vyzrávání za podmínek in vitro a následného oplodnění u savce.

φ · φ • Φ ···

Test na alespoň jeden prediktivní markér je založen na stanovení ve vzorku savce ženského pohlaví. V jedné formě vynálezu je vzorkem vzorek vybraný ze skupiny tvořené například tělním sekretem, tělní tekutinou buněčnými živinami, obsahem folikulu, sputem, krví, močí, stolicí, děložními nebo vaginálními sekrety a složkami, menstruačními produkty, epiteliemi a složkami odvozenými z epiteiií, složkami kůže a mrtvými nebo živými buňkami. Osoba znalá oboru bude snadno rozumět, jak jsou tyto vzorky získány.

V jedné formě předkládaného vynálezu pochází vzorek od savce, jako je například domácí zvíře, například kočka, pes, nebo morče, nebo jiné zvíře, jako jsou například primáti. V další formě vynálezu jsou savcem míněna laboratorní zvířata, jako je například potkan nebo myš. V další přednostní formě vynálezu jsou zvířetem průmyslově používaná zvířata, přednostně farmářská zvířata jako například hovězí dobytek, koně, prasata, norci, kozy nebo ovce. v současnosti nejpřednostnější formě vynálezu je savcem člověk.

V jednom aspektu vynálezu je savec ženského pohlaví testován před aspirací vajíček. Pokud je to možné, je prováděn více než jen jeden test. Načasování aspirace vajíček pro IVM může predikovat buďto absolutní cut off hodnota, nebo relativní parametr jako je například konstantní hladina, zvýšení nebo snížení výše zmíněného selektivního markéru.

V tomto kontextu by mělo být termínem prediktivní markér rozuměna jakákoli látka, která mění koncentraci, barvu, strukturu, konfirmaci a/nebo chování reakce v biologickém, ··r » *·· ··♦» ·*· fyzikálním, nebo chemickém testu. Mělo by být rozuměno, že existuje mnoho potenciálních prediktivních markérů. V jedné formě vynálezu je testem test, kde alespoň jedním prediktivním markérem je hormon vybraný ze skupiny tvořené gonadotropiny (jako jsou například FSH, LH, prolaktin a HCG), thyroidální hormony (jako jsou například TSH, T3 a T4), steroidní hormony (jako jsou například estradiol, estrogen, estratriol, progesteron a testosteron, androgeny, kortison nebo kortízol). V další formě vynálezu je testem test, kde alespoň jedním prediktivním markérem je malý peptidový hormon (jako je například GIP nebo VIP). V další formě vynálezu je testem test, kde alespoň jedním prediktivním markérem je peptidový hormon (jako je například PP12, PP14, inhibin: inhibin A nebo inhibin B, aktivin, nebo alfa 1 nebo alfa 2 globuliny) . V další formě vynálezu je testem test, kde alespoň jedním prediktivním markérem je lipid vybraný ze skupiny tvořené meiózou aktivivanými sterolovými (MAS) lipidy a prostaglandiny. V další formě vynálezu je testem test, kde alespoň jedním prediktivním markérem je nukleová kyselina vybraná ze skupiny tvořené fragmenty DNA, mRNA a tRNA. V další formě vynálezu je testem test, kde alespoň jedním prediktivním markérem je markér vybraný ze skupiny tvořené LFN1, LFN, LFN, glykokonjugáty, sacharidy, buněčnými živinami, integriny, jako je například íntegrin 1, a sacharidové epitopy. V další formě vynálezu je testem test, kde alespoň jedním prediktivním markérem je intranebo inter- buněčný posel, jako je například cAMP. V další formě předkládaného vynálezu je testem test, kde alespoň jedním prediktivním markérem je enzym, jako je například fosfodiesteráza nebo inhibitor fosfodíesterázy. V důsledku vysoké komplexity interakcí mezi bílkovinami, hormony, lipidy, nukleovými kyselinami, mezibuněčnými posly a enzymy je v současnosti předpokládáno, že načasování aspirace neplodných vajíček je závislé na kombinaci cut off hodnot určitých prediktivních markérů a/nebo relativních parametrů jednoho více prediktivních markérů, tj. relativní stanovení stejného markéru, kde vzorky byly odebrány v různé době, nebo relativní flflfl · · « fl • · flfl · · stanovení dvou nebo více markérů přítomných ve vzorku ze stejného odběru.

Stanovení je tvořeno alespoň jedním prediktivním markérem, to znamená dvěmi prediktivními markéry, například třemi, čtyřmi, pěti nebo šesti prediktivními markéry.

Je více než pravděpodobné, že prediktivní hodnota testu se bude výrazně zvyšovat, pokud budou kombinovány dva nebo více prediktivních markérů.

Na podkladě popisů v příkladech 1 a 2 týkajících se korelace mezi dvěmi prediktivními markéry, inhibinem A a estradiolem vůči výsledku IVM cyklu bude osoba znalá oboru schopna určit takovou korelaci mezi dalšími prediktivními markéry. V jedné formě vynálezu existuje významná korelace mezi šancí otěhotnět v takovém cyklu a relativním zvýšením, nebo relativním snížením koncentrace prediktivního markéru, který je předmětem vyšetřování ve vzorku ze dne 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 nebo dokonce ze dne 9 před aspirací vajíček. V další formě vynálezu existuje významná korelace mezi šancí otěhotnět a absolutním zvýšením, absolutním snížením, nebo konstantní koncentrací prediktivního markéru, který je předmětem vyšetřování ve vzorku ze dne 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 nebo dokonce ze dne 9 před aspirací vajíček. V ještě další formě vynálezu existuje významná korelace mezi koncentrací prediktivního markéru, který je předmětem vyšetřování ve vzorku ze dne 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 nebo dokonce ze dne 9, a šancí otěhotnět v takovém cyklu. V jednom aspektu této formy vynálezu je významná korelace mezi koncentrací prediktivního markéru, který je předmětem vyšetřování ve vzorku, a šancí otěhotnět v takovém cyklu snížena na úroveň binární korelace, takže může být nastavena cut off hodnota, a šance otěhotnět v takovém cyklu je korelována podle koncentrace prediktivního markéru, který je předmětem vyšetřování, tak, že tato koncentrace je více nebo méně na úrovni cut off hodnoty.

···· ·*» • · «« ··*»

V jedné formě vynálezu je úspěšnost otěhotnění ve studii cyklů IVM, kde doba aspirace byla nastavena podle testu popsaného výše, vyšší než 10%, například vyšší než 13%. 15%, 18%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, nebo dokonce vyšší než 40%.

V součásné přednostní formě předkládané vynálezu jsou zvoleny dva prediktivní markéry. Jsou to inhibin A estradiol. Jak je ilustrováno na příkladech 1 a 2 zvýšení koncentrací estradiolu a inhibinu A predikuje úspěšnost IVM cyklu.

Někdy může být pozorováno, že zvýšení koncentrace estradiolu předchází zvýšení koncentrace inhibinu A. V tomto případě může dojít ke snížení koncentrace estradiolu nebo k vyrovnání jeho hladiny v době zvýšení koncentrace inhibinu A. V tomto případě je stále považováno, že bylo dosaženo zvýšení koncentrace estradiolu, takže šance na úspěch je vysoká, protože zvýšení koncentrace inhibinu A je hlavní faktor. Toto je zejména pravda, předchází-li léčba FSH (viz příklad 3).

V současné nejpřednostnější formě předkládané vynálezu zahrnuje test tři specifické reakce a výsledky pro dva selektivní markéry. První specifickou reakcí je stanovení koncentrace inhibinu A, která je menší než 10 pg/ml ve vzorku krve třetí den menstruačního cyklu. Druhou specifickou reakcí a výsledkem je zvýšení koncentrace inhibinu A na více než 80% třetí den po aspiraci vajíček. Třetí specifickou reakcí a výsledkem je zvýšení koncentrace estradiolu na více než 87% třetí den po aspiraci vajíček. Proto v jednom aspektu vynálezu je ženě odebrána krev třetí den menstruačního cyklu a jsou stanoveny koncentrace inhibinu A a estradiolu ve vzorku krve. Pokud je koncentrace inhibinu A menší než 10 pg/ml v řečeném vzorku krve, tento cyklus nebude cyklem pro IVM. Je-li však koncentrace inhibinu A vyšší nebo rovna 10 pg/ml v řečeném vzorku krve, bude odebrán nový vzorek krve čtvrtý, pátý, šestý, ♦ ·* · ··· ·· « « ·· ··*· sedmý, osmý, devátý, desátý, jedenáctý, dvanáctý, třináctý, čtrnáctý, patnáctý a šestnáctý den, ledaže by byla pozorována druhá a třetí specifická reakce. Pokud je pozorována druhá a/nebo třetí specifická reakce, bude den pozorování dnem aspirace vajíček. Na podkladě výsledků z příkladu 2 je očekáváno, že cykly IVM, ve kterých doba aspirace vajíček splnila tyto tři specifická kritéria, bude mít úspěšnost otěhotnění více než 12%, například vyšší než 16%, 22%, 25%, 26%, nebo dokonce více než 28%.

Jak bude oceněno osobou znalou oboru, jsou stanovení prediktivních markérů ve vzorcích savců rutinními stanoveními. V jednom aspektu je test připraven tak, že specifická reakce může být porovnána a stanovena bez asistence lékařů nebo moderního lékařského vybavení. Jak však bude rozuměno osobou znalou oboru, může být stanoveno bez drahého vybavení pouze několik prediktivních markérů, což vede k nezbytnosti zasílání vzorku do laboratoří, kde podle výsledku testu je řízeno načasování aspirace vajíček u savců.

V důsledku relativního koncentrace komplexity snížení, koncentrací, relativního zvýšení, absolutního zvýšení, konstantní a cut off hodnot je jedním- aspektem vynálezu schéma, které se vyplňuje během menstruačního cyklu, kde je uvažováno o IVM cyklu. V jedné formě osahuje schéma sloupce pro každý den menstruačního cyklu a řádky pro každý prediktivní markér, takže každé okénko může být vyplněno po stanovení prediktivních markérů. Interpretaci výsledků specifických reakcí usnadňují automatické, poloautomatické a řízení manuální výpočty alterací prediktivních markérů.

Ultrazvuková kontrola

V jedné formě vynálezu je test na prediktivní markéry použit jako první selekční kritérium. Pokud je toto kritérium splněno, je žena podrobena ultrazvukovému vyšetření dělohy a vaječníku. Pokud ultrazvukové vyšetření zjistí:

« *·

- velké množství antrálních folikulů,

- velikost hlavního folikulu okolo 10 mm,

- jednotnost skupiny folikulů,

- tloušťku endometria více než 3 mm, a

- zahájení tvorby trilaminárních struktur v endometriální výstelce je pravděpodobnost zjištění správné doby pro aspiraci vajíček, in vitro vyzrávání do stádia MF-II, oplodnění, implantaci a otěhotnění velmi vysoká.

V současné přednostní formě předkládaného vynálezu jsou vajíčka získána od ženy mající ovariální folikul o průměru 8-12 mm. Výhodou takto malých folikulů je, že jsou v této době přítomny ve významných množstvích v menstruačním cyklu bez předchozí hormonální léčby, mohou být pozorovány ultrazvukem, a je možno provést ultrazvukem řízenou transvaginální punkci folikulů, za účelem získání oocytů.

Osobou znalou oboru bude rozuměno, že od jiných savců by měly být aspirovány vajíčka o jiné velikosti.

V jedné formě vynálezu je znalost menstruačního cyklu ženy využita v načasování aspirace vajíček. Proto je obvykle aspirace provedena mezi dny 6 a 17, obvykle mezi dny 9 a 11.

Proto v jedné formě předkládaného vynálezu se způsob určení načasování aspirace vajíček sestává z následujících kroků:

a) testování alespoň jednoho prediktivního markéru ve vzorku savce;

výsledek specifické reakce v testu v kroku a) predikuje přítomnost neplodných vajíček schopných vyzrávání in vitro a následné fertilizace u savce

b) zhodnocení doby relativně k prvnímu dni menstruačního krvácení;

• 9

999· ··· ► « · • 0 *00* pokud je den mezi šestým a sedmnáctým dnem menstruačního krvácení tak

c) vyhodnocení ultrazvukového obrazu vaječníků savce;

pokud je velikost folikulu mezi 8 a 12 mm a skupina folikulů je stejnoměrná, poté je dalším krokem

d) vyhodnocení ultrazvukového obrazu dělohy savce;

pokud je tloušťka endometria více než 3 mm a je pozorováno zahájení tvorby trilaminárních struktur endometriální výstelky, nastala správná doba aspirace vajíček. Selže-li však jakýkoli z výše uvedených kroků, není cyklus pravděpodobně vhodný pro IVM a aspirace vajíček by měla být odložena do příštího cyklu, kde je celý způsob zopakován.

Schopnost IVM oocytů dokončit meiózu a stát se vývojově kompetentními může být zvýšena pomocí FSH podaného před aspirací oocytů. U lidské IVM zvyšuje krátká stimulace pomocí FSH dvojnásobně počet oocytů získaných od jednoho pacienta, stejně tak jako zvyšuje poměr oocytů, které dosahují stádia MFII po 48 hodinách. V jedné formě předkládaného způsobu je žena léčena třetí, a/nebo čtvrtý, a/nebo pátý den menstruačního cyklu pomocí hormonů, jako je například FSH následovaný vysazením léčby. V příkladu 3 byl pozorován zvýšený stupeň vyzrávání a dělení u skupiny předléČené FSH s prodlevou mezi poslední injekcí a aspirací ve srovnání s léčbou pomocí FSH bez této prodlevy. U skupiny předléčené FSH s prodlevou mezi poslední injekcí a aspirací byl pozorován zvýšený stupeň vyzrávání ve srovnání s nestimulovanými oocyty, ale stupeň dělení vyzrálých MF-II oocytů nebyl ovlivněn. Byl vysoký v obou skupinách. Fáze časné apoptózy, neboli fáze arteficiálního plató může v růstu folikulu napodobovat finální pre-ovulační vyzrávání folikulu, co se týká vývojové kompetence. Tímto je získáno arteficiální plató nebo pokles hladiny estradiolu, což způsobuje proces apoptózy ve vaječnících vedoucí k výše zmíněné signalizaci do nezralého oocytů. Takový pokles hladin estradiolu je očekáván okolo desátého dne menstruačního cyklu. Odběr oocytů u žen bez hormonální stimulace by měl být **«· *·· « ···· • · ·» přednostně proveden desátý den menstruačního cyklu, protože tento den je statisticky asociován s velkým počtem oocytů v profázi.

V jednom aspektu vynálezu bude mít žena prospěch z iniciální léčby podané třetí, čtvrtý a pátý den menstruačního cyklu pomocí hormonu, jako je například FSH následované vysazením léčby. V tomto léčebném režimu mohou být monitorovány hladiny estradiolu v krvi u žen s cíiem vybrat vyzrálé oocyty, nepřímo měřené pomocí nerostoucích (růstová pauza) folikulů. Časné apoptotické folikuly určené pro zánik jsou charakterizované tím, že mohou být snadno uvolněny z vaječníku během punkce folikulů a mají kompaktní kumulusovou hmotu. Po dosažení fáze plato nebo poklesu hladin estradiolu je proveden odběr oocytů. Pozorovaná konstantní hladina nebo pokles hladin estradiolu je způsoben předchozím zvýšením koncentrace estradiolu mezi třetím dnem menstruačního cyklu a dnem aspirace vajíček. V jedné formě vynálezu je dobou aspirace vajíček doba zvýšení koncentrace estradiolu, která předchází fázi konstantní hladiny nebo poklesu koncentrace estradiolu. V další přednostní formě vynálezu je monitorace koncentrace estradiolu dále doplněna monitorací koncentrace inhibinu A.

Z tohoto důvodu je jednou formou předkládaného vynálezu souprava obsahující vhodný lék s FSH a test popsaný výše. Volitelně souprava dále obsahuje prostředek k získání vzorku nebo vzorků pro provedení testu.

Reference

Flood J, Chillik CF, van Uem JFHM, Iritani A, Hodgen GD. Ooplasmatic transfusion: prophase germiant vesicle oocytes made developmentally competent by microinjection of metphase II egg cytoplasma. Fertil Steril 1990;53:1049-54.

Cha KY, Koo JJ, Ko JJ, Choi DH, Han SY, Yoon TK. Pregnancy after in vitro fertilization of human folicular oocytes • 4 4 4 ’ * · * * • 4 * 4 4 · · ·, * * * · 4 4 4 · · * _L Ό 44·· 444 44 4444 44 ··· collected from nonstimulated cycles, their culture in vitro and their transfer in a donor oocyte program. Fertil Steril

1991;55109-13.

Russel JB, Knezevich KM, Fabian K, Dickson JA: Unstimulateč immature oocyte retrieval: early versus midfollicular enóometrial priming. Fertil Steril 1997;67:616-20.

Barnes FL, Kausche AK, Tiglias J, Wood C, Wilton L, Trounson A, Production of embryos from in vítro-maturated primary oocytes. Fertil Steril 1996;651151-6.

Trounson A, Wood C, Kaunsche A. In vitro maturation and the fertilization and developmental competence of oocytes recovered from untreated polycystic ovarian patients. Fertil Steril 1994;62353-62.

Cha KY, Chung HM, Han SY, Yoon TK, Oum KB, Chung MK. Succesful in vitro maturation, fertilization, and pregnancy by using immature follicular oocytes collected from unstimulateč polycystic ovarian syndrome patients. Fertil Steril Abstract 0044;1996:Supl.S236.

Wynn P, Picton HM, Krapez J, et al. (1998). Randomized study of oocytes matured after collestion from unstimulated or mildly stimulated patients. Hum. Reprod, 13,3132-3138.

Groome NP, Illingrowth PJ, and O'Brien M, et al., (1996). Measurement of dimeric inhibin B throughout the human menstrual cycle. J. Cli. Enčocrin. Metab., 81, 1401-1405.

Příklady provedení vynálezu

Mělo by být rozuměno, že obrázky a příklady popsané níže jsou ilustrací forem předkládaného vynálezu a vynález tímto nijak neomezuj í.

flflflfl *·· • fl flflflfl • fl fl fl,

Příklady

Do studie bylo zahrnuto celkem 83 žen s pravidelným cyklem, které byly indikovány k IVF/ICSI z důvodu mužské neplodnosti a/nebo onemocnění vejcovodů. Studie byla povolena místní etickou komisí. Všechny ženy se zúčastnily studie po písemném souhlasu. Byly monitorovány profily hormonů (gonadotropiny, inhibin A, inhibin B, estradiol a progesteron). Profily hormonů byly stanoveny pomocí RIA (Immuno 1, Bayer) s výjimkou profilů inhibinu A a inhibinu B, které byly stanoveny metodou popsanou Groomem (1996).

Odběr nezralých vajíček byl proveden den po zjištění velikosti folikulu 10 mm podle ultrazvuku. Použili jsme aspirační jehlu od společnosti Cook Ltd. popsanou Carlem Woodem. Aspirační tlak byl snížen na 100 mm Hg za předpokladu, že nezralý kumulus nebo vajíčko mohou být více vnímavé mechanickému poškození, nebo jehla může v malém folikulu přímo poškodit vajíčko, pokud je vajíčko násilně nasáto z malého objemu tekutiny do konce jehly. Folikuly byly punktovány. Po aspiraci byla jehla promyta roztokem Earles Ballanced Salt s Hepes a bikarbonátovým pufrem plus heparinem (100 IU/ml) jak bylo popsáno Trounsonem et al.

Folikulární aspiráty byly přeneseny ve zkumavkách do laboratoře a nality na embryonální filtr s velikostí pórů 70 um. Erytrocyty a další malé buňky byly vymyty přes filtr a oocyty a větší fragmenty buněk byly sbírány do Petriho kultivačních misek. Nezralé oocyty byly identifikovány a zařazeny na podkladě přítomnosti nebo absence kumulusových buněk jako kompletně mnohovrstevné, rozptýlené a obnažené.

Vyzrávání oocytů bylo provedeno v médiu pro tkáňové kultury 199 (TCM 199; Sigma) nebo BBEM (Medicult, Dánsko) doplněném pyruvátem sodným 0,3 mM, rec-FSH 0,075 IU/ml (Gonal-F; Serono), hCG 0,05 IU/ml (Profasi; Serono) a albuminem 1%. Později bylo * * ·.

• · φφφ · * * ··»· <* φφ «φφφ φ* ··· médium doplněno estradiolem 1 ug/ml a zvýšenou koncentrací HSA (5%) nebo sérem od pacienta (10%) místo albuminu.

Oocyty byly obnaženy pomocí hyaluronidázy (IVF Science, švédsko) a mechanickým pipetováním. Pohyblivé spermie byly připraveny pomocí Puresperm^ítm) (Cryos, Dánsko) gradientově separace nebo pomocí plavení. Obnažené oocyty určené pro ICSI byly individuálně umístěny do 65 ul kapek spermiového připravovacího média (Medicult, Dánsko) a 2 ul spermiové suspenze byly umístěny do 10 ul kapky PVP (IVF Science, Švédsko). Všechny oocyty ve stádiu MF-II byly inseminovány pomocí ICSI a poté umístěny do 10 ul kapek BBEM, kultivovány v 5% C02 a zvlhčeny vzduchem při teplotě 37°C. Přibližně 10 až 20 hodin po inseminaci byly oocyty vyšetřeny mikroskopicky při 300 násobném zvětšení za účelem zjištění přítomnosti projader jako parametru úspěšného oplodnění. Embrya byla kultivována do druhého nebo třetího dne (den 0 = den inseminace), kdy byla vhodná embrya (maximálně dvě vrácena do ženy. Vhodná embrya jsou ta, u kterých došlo k dělení.

Příklad 1: Analýza inhibinu A a estradiolu v cyklech IVM.

Deskriptivní statistika údajů z 83 léčebných cyklů, u kterých byly dostupné endokrinologické parametry, jsou prezentovány v Tabulce 1. Tyto 83 léčebné cykly vedly k 10 těhotenstvím.

·

9

9999 které otěhotněly a • t • 9

9

9999 999

99

Tabulka 1 Srovnání mezi skupinou žen, skupinou žen, které neotěhotněly

	Netěhotné Průměr ± SD	Těhotné Průměr ± SD	P hodnota T-test*
Koncentrace inhibinu A třetí den (pg/ml)	9,0 01773,1	7,4+0,7	0,1
Koncentrace estradiolu třetí den (nmol/1)	0,15+0,08	0,14+0,03	0,7
Koncentrace inhibinu A v den OPU (pg/ml)	16,3+9,2	19,6+6	0,28
Zvýšení koncentrace inhibinu A od třetího dne (¾)	87 + 93	164+73	0,01
Koncentrace estradiolu v den OPU	0,35+22	0,48+26	0,1
Zvýšení koncentrace estradiolu od třetího dne (%)	157+138	246+224	0,08
Zvýšení koncentrace inhibinu A x zvýšení koncentrace estradiolu (%)2	17607+26753	49433+61156	0,005

* Použit byl neparametrický test. Data nejsou rozložena podle normálního rozdělení.

Tabulka 1 ukazuje, že zvýšení inhibinu A od třetího dne je vyšší u cyklů, kde došlo k otěhotnění, že zvýšení estradiolu je nevýznamné, a že zvýšení inhibinu A násobené zvýšením estradiolu je významně vyšší u cyklů, kde došlo k otěhotnění.

Následně byla analyzována schopnost analýzy sérového inhibinu A a estradiolu samotných odlišit produktivní a neproduktivní léčebné cykly. Pro tento účel byly použity různé diskriminační faktory a byla stanovena statistická korelace mezí údaji a schopností otěhotnět.

• * φ φ φ φ φφ • · φφφφ «φφ

ΦΦΦ φ · · φφ φφφφ

Tabulka 2 Diskriminační faktor: Koncentrace inhibinu A v séru pod 10 (pg/ml) třetí den

	Netěhotné	Těhotné	P hodnota*
Koncentrace inhibinu A pod 10 třetí den	51	10	θ’, 03
Koncentrace · inhibinu A rovná nebo nad 10 třetí den	22	0

* Fischerův přesný test

Tabulka 3 Diskriminační faktor: Koncentrace inhibinu A v séru pod 9 (pg/ml) třetí den

	Netěhotné	Těhotné	P hodnota*
Koncentrace inhibinu A pod 9 třetí den	43	9	0,04
Koncentrace inhibinu A rovná nebo nad 9 třetí den	30	1

* Fischerův přesný test

Tabulka 4 Diskriminační faktor: Alespoň 80% zvýšení koncentrace inhibinu A v séru od třetího dne do dne OPU

	Netěhotné	Těhotné	P hodnota*
Koncentrace inhibinu A zvýšena o více než 80%	35	10	0,001
Koncentrace inhibinu A zvýšena o méně než 80%	38	0

* Fischerův přesný test

Tabulka 5 Diskriminační faktor: Alespoň 100% zvýšení koncentrace inhibinu A v séru od třetího dne do dne OPU

	Netěhotné	Těhotné	P hodnota*
Koncentrace inhibinu A zvýšena o více než 100%	30	8	0,02
Koncentrace inhibinu A zvýšena o méně než 100%	43	2

* Fischerův přesný test

Tabulka 6 Diskriminační faktor: Zvýšení koncentrace estradiolu v séru od třetího dne do dne OPU o více než 87%

	Netěhotné	Těhotné	P hodnota*
Koncentrace estradiolu zvýšena o více než 87%	47	10	0,02
Koncentrace estradiolu zvýšena o méně než 87%	26	0

* Fischerův přesný test

Tabulka 7 Diskriminační faktor: Alespoň 100% zvýšení koncentrace estradiolu v séru od třetího dne do dne OPU

	Netěhotné	Těhotné	P hodnota*
Koncentrace estradiolu zvýšena o více než 100%	41	9	0,04
Koncentrace estradiolu zvýšena o méně než 100%	31	1

* Fischerův přesný test ♦ · · • 9 • · oo · · · · ·

Í.L 444· ··· ·· ··*·

Schopnost kombinace analýz sérového inhíbinu A a estradiolu rozlišit produktivní a neproduktivní léčebné cykly.

Tabulka 8 Diskriminační faktor: Alespoň 7500 násobné zvýšení koncentrace inhíbinu A estradiolu v séru od třetího dne do dne OPU (% x %)

	Netěhotné	Těhotné	P hodnota*
více než 7500	46	10	0,004
méně než 7500	37	0

* Fischerův přesný test

Tabulka 9 Diskriminační faktor: Zvýšení koncentrace estradiolu v séru od třetího dne do dne OPU o alespoň 87% ve skupině se zvýšením sérového inhíbinu A o alespoň 80%

	Netěhotné	Těhotné	P hodnota*
Inhibin A a estradiol zvýšen o více než 85% a 87%	38	10	0,2
Inhibin A zvýšen o 80% a estradiol zvýšen o méně než 87%	7	0

Fischerův přesný test • i • · *

999 • 9«

9999

Tabulka 10 Diskriminační faktor: Zvýšení koncentrace estradiolu v séru od třetího dne do dne OPU o více než 87% ve skupině se • · • · • · 99 •9 zvýšením inhibinu A od třetího dne do dne OPU

	Netěhotné	Těhotné	P hodnota*
Estradiol zvýšen o více než 87% a inhibin A o více než 80%	38	10	0,03
Estradiol zvýšen o více než 87% inhibin A o méně než 80%	19	0

* Fischerův přesný test

Tabulka 11 Efekt žádného zvýšení inhibinu A

	Netěhotné	Těhotné
Zvýšení estradiolu o méně než 87% a žádné zvýšení inhibinu A	20	0
Zvýšení estradiolu o méně než 87% a zvýšení inhibinu A nad 80%	7	0

Tabulka 11 Efekt žádného zvýšení estradiolu

	Netěhotné	Těhotné
Zvýšení inhibinu o méně než 87% a žádné zvýšení estradiolu	20	0
Zvýšení inhibinu o méně než 87% a zvýšení estradiolu nad 87%	19	0

Výše uvedené údaje ilustrují, že koncentrace sérového inhibinu A je silným predikčním ukazatelem úspěchu IVM cyklů. Tyto údaje ukazují, že nedošlo otěhotnění u cyklů, kde byla koncentrace inhibinu A nad 10 pg/ml třetí den menstruačního cyklu (Tabulka 2). Otěhotnění se navíc vyskytlo ve skupině s koncentrací • 0 • 00 inhibinu A nad 9 pg/ml třetí den menstruačního cyklu (Tabulka 3) .

Nejen pouze absolutní koncentrace inhibinu A třetí den predikuje úspěšnost IVM cyklu, ale také to samé dělá také zvýšení inhibinu A v séru do dne získání vajíček (OPU). Proto produktivní cyklus silně koreluje s alespoň 80% zvýšením sérového inhibinu A od třetího dne do dne OPU (Tabulka 4 a Tabulka 5).

Údaje týkající se estradiolu ukazují, že produktivní cyklus koreluje s alespoň 87% zvýšením sérového estradiolu od třetího dne do dne OPU (Tabulka 6 a Tabulka 7).

Doprovodné zvýšení sérového inhibinu A a estradiolu se zdá být i dokonce lepším predikčním ukazatelem pro úspěšnost IVM. Kombinace zvýšení inhibinu A a estradiolu od třetího dne do dne OPU je velmi dobrým predikčním ukazatelem produktivního cyklu (Tabulka 8, Tabulka 9 a Tabulka 10) . Predikce se týká také neúspěchu, protože k otěhotnění nedošlo v cyklech bez zvýšení inhibinu A nad 80% od třetího dne do dne OPU (Tabulka 11), ani v cyklech se zvýšením inhibinu A bez zvýšení estradiolu (Tabulka 12).

Přiklad 2: Použití inhibinu A a estradiolu jako parametrů pro prospektivní analýzu IVM cyklů

Prediktivní efekt parametrů stanovených v příkladu 1 za použití analýzy inhibinu A a estradilu byl stanoven za účelem zjištěni, které cykly by měly pokračovat k aspiraci vajíček.

Tabulka 13 Efekt zrušení cyklů s elevovaným inhibinem A třetí den

	Netěhotné	Těhotné	Procento otěhotnění (%)
Všechny cykly	83	10	12,1
Cykly s inhibinem A pod 10 pg/ml třetí den	62	10	16,1
Cykly s inhibinem A pod 9 pg/ml třetí den	52	9	17,3

Tabulka 14 Efekt zrušení cyklů bez nárůstu inhibinu A v den OPU

	Netěhotné	Těhotné	%
Všechny cykly	83	10	12,1
Pouze cykly s nárůstem inhibinu A od třetího dne do dne OPU nad 80%	45	10	22,2

Tabulka 15 Efekt zrušení cyklů s inhibinem A o koncentraci 10 pg/ml nebo více třetí den, nebo bez nárůstu inhibinu A v den OPU nad 80%

	Netěhotné	Těhotné	%
Všechny cykly	83	10	12,1
Vybrané cykly	40	10	25,0

Tabulka 16 Efekt zrušení cyklů s inhibinem A o koncentrací 10 pg/ml nebo více třetí den, nebo produktu zvýšení inhibinu A a estradiolu od třetího dne do dne OPU nad 80% menším než 7500%

	Netěhotné	Těhotné	%
Všechny cykly	83	10	12,1
Vybrané cykly	38	10	26,3*

* Významně odlišný od všech cyklů“ (p menší než 0,05. CHI2test)

AAA

Tabulka 17 Efekt zrušení cyklů s inhibinem A o koncentraci 10 pg/ml nebo více třetí den, nebo žádným zvýšením inhibinu A a estradiolu v den OPU

	Netěhotné	Těhotné	%
Všechny cykly	83	10	12,1
Vybrané cykly	35	10	28,6*
* Významně odlišný od všech cyklů (p menší než	3,05. CHI2-

test)

Tyto údaje ukazují, že cykly určené k tomu, aby byly nereproduktívní, mohou být zrušeny na podkladě stanovení inhibinu A časně v léčebném cyklu a stanovení inhibinu A a estradiolu později v cyklu (Tabulka 13, Tabulka 14, Tabulka 15, Tabulka 16, Tabulka 17). Tato stanovení výrazně zvyšují účinnost IVM cyklu. Dosud získaná data ukazují, že každý pacient může alternovat mezi cykly s vysokým inhibinem A časně během cyklu (žádné těhotenství) a cykly s nízkým ihibinem A časně během cyklu (těhotenství).

Přiklad 3: Dopad předléčeni pomoci FSH

Schopnost nezralých oocytů spontánně pokračovat v meióze po vyjmutí z folikulu byla poprvé popsána Pincusem a Enzmanem v roce 1935. Lidské oocyty z malých folikulů mohou obnovit a dokončit meiózu za podmínek in vitro, ale do menšího rozsahu než jiní savci (Eówards, 1965). Bylo popsáno úspěšné vyzrávání nestimulovaných oocytů (Cha et al·., 1991; Trounson et al., 1994; Barnes et al., 1996; Russell et al., 1997), a bylo dosaženo vysoké úspěšnosti oplodnění po podrobení oocytů intracytoplazmatické injikaci spermiemi (ICSI) (Russell et al., 1997), ale vývojový potenciál byl popsán jako nízký (Cha a Chian, 1998; Barnes et al., 1996). IVM protokol je relativně jednoduchý s kratším léčebným obdobím a snižuje náklady ve srovnání s konvenční IVF. Navíc jsou eliminovány vedlejší účinky ovariální superovulace, zejména hyperstimuiační syndrom. Navzdory špatné úspěšnosti otěhotnění dosud popsaných ve

9 .

• 9 9999

9 · 9

9999 ·»· studiích u člověka je úspěšnost dosažená u laboratorních zvířat povzbuzující. U opic bylo prokázáno, že předléčení pomocí FSH zvyšuje jaderné a cytoplazmatické vyzrávání oocytů (Schramm a Bavister, 1994). Zvýšení hladin FSH ve folikulu souvisí s tvorbou pozitivního signálu nezbytného k ukončení vyzrávání oocytů u člověka za podmínek in vivo (Gomez et al., 1993). Bylo prokázáno, že krátká stimulace pomocí FSH zvyšuje procento oocytů, které dosáhnou metafáze II (Wynn et al., 1998) po vyzrávání za podmínek in vitro.

V této prospektivní randomizované pilotní studii bylo zkoumáno, zdali vývojový potenciál oocytů vyzrálých za podmínek in vitro se může zlepšit předléčením pomocí FSH před aspirací.

Materiál a metodika

Do této studie byly zahrnuty páry indikované k IVF/ICSI z důvodu mužské neplodnosti a/nebo tubárního onemocnění. Ženám bylo alespoň 18 a nejvíce 38 let a měly normální ovulační cykly s průměrnou délkou mezi 24 a 35 dny a jejich Body mass index (BMI) byl mezi 18 a 29 kg/m². Ze studie byly vyřazeni všichni pacienti s neplodností způsobenou endokrinními abnormalitami, jako například s hyperprolaktinémií, se syndromem polycystických vaječníků a předchozími cykly kontrolované ovariální hyperstimulace, z kterých byly získány méně než 3 oocyty. Dále byly vyřazeny všechny ženy se zvýšenou hodnotou FSH (více než 15 IU) třetí den cyklu.

Studie byla povolena místní etickou komisí. Všechny páry se zúčastnily studie po psaném souhlasu. Prvním experimentem byla randomizovaná prospektivní studie zahrnující dvacet pacientů z párů plánovaných na ICSI z důvodu mužské neplodnosti. Ženy byly náhodně rozděleny do dvou skupin. Skupina I (n = 10 cyklů) nebyla stimulována, skupina II (n = 10 cyklů) byla od třetího dne stimulována pomocí rec-FSH (Gonal-F, Serono) 150 IU/den po dobu 3 dnů. Aspirace byla provedena den po ultrazvukovém • *

..................

zjištění hlavního folikulu o velikosti 10 mm. Všechny oocyty byly před ICSI vyzrávány za podmínek in vitro po dobu 36 hodin.

Druhého experimentu se zúčastnilo dvanáct po sobě jdoucích párů. Všechny ženy byly před aspirací předléčeny pomocí rec-FSH (Gonal F, Serono) a od třetího dne jim bylo podáváno 150 IU denně. Pět pacientů bylo stimulováno stejným způsobem jako skupina 2 v prvním experimentu pomocí fixní dávky 150 lU/den po dobu 3 dnů a aspitrace byla provedena den po zjištění hlavního folikulu o velikosti 10 mm. Zbývajících sedm pacientů bylo dále Stimulováno až do velikosti hlavního folikulu 10 mm a aspirace byla provedena o 72 hodin později. Všechny oocyty byly kultivovány po dobu 48 hodin až do oplodnění pomocí ICSI.

U všech pacientů bylo provedeno transvagináiní ultrazvukové vyšetření třetí den cyklu a byly stanoveny bazální hladiny FSH, LH, estradiolu, inhibinu A a inhibinu B. Profily hormonů byly sledovány od třetího dne až do dne aspirace. V případě vzniku ovaríální cysty byl cyklus zrušen. Druhé ultrazvukové vyšetření bylo provedeno šestý až sedmý den a následně byly byla ultrazvuková vyšetření prováděna denně nebo s intervalem 2-3 dnů v závislosti na velikosti folikulů.

V obou experimentech bylo endometriální předléčení tvořeno podáváním 17-p-estradiolu od odběru oocytů v dávce 2 mg třikrát denně per os. Tloušťka endometria pod 6 mm při ultrazvukovém vyšetření v den aspirace nebyla přijímána. Dva dny po aspiraci byla zahájena léčba intravaginálními progesteronovými čípky a v této léčbě bylo pokračováno až do provedení těhotenského testu. V léčbě estrogenem a progesteronem bylo pokračováno, pokud byl těhotenský test pozitivní, do padesátého dne těhotenství.

Odběr oocytů byl proveden transvaginálně pomocí 17-G jehly Cook s redukovaným aspiračním tlakem, jak bylo popsáno Trounsonem et • · 0 ·«*« «

al. (1994). Folikulární aspiráty byly přeneseny ve zkumavkách do laboratoře a promyty na embryovém filtru s velikostí pórů 70 um. Vyzrávání a fertilizace je detailně popsána Smithem et al. (1998), ale ve stručnosti byly oocyty vyzrávány v médiu pro tkáňové kultury č. 199 (TCM 199; Sigma, Roedovre, Dánsko) suplementovaném Na pyruvátem 0,3 mM, 1500 IU/ml penicilinu G, 50 mg/ml streptromycin sulfátu, estradiolem 1 ug/ml (vše od společnosti Sigma), rec-FSH 0,075 IU/ml (Gonal-F; Serono), hCG 0,5 IU/ml (Profasi; Serono) a sérem od pacientů (10%). Sérum od pacientů bylo získáno v den aspiarce. Oocyty byly kultivovány separátně v 25 ul kapkách IVM média pod parafinovým olejem při teplotě 37°C v 5% C0₂. U oocytů byl klasifikován rozpad germinálního vezikulu, pokud chyběla jaderná membrána. Pokud došlo k extruzi prvního polárního tělíska, byl oocyt klasifikován jako vyzrálý do metafáze.

Fertilizace pomocí ICSI byla provedena u všech oocytů v metafázi II. Oocyty byly poté umístěny do 10 ul kapek IVF média (Medicult, Kodaň, Dánsko) a kultivovány pod olejem v Petriho miskách Falcon. Embrya byla klasifikována podle stupnice 1-4, kde typy 1 a 2 (méně než 10% framentace) byly považovány za schopné transferu (Deschant et al. 1988). Přenesena byla maximálně dvě embrya. Stupeň rozvoje embrya byl definován jako počet embryí schopných transferu z celkového počtu injikovaných oocytů. Stupeň implantace byl definován jako počet gestačních váčků viditelných při ultrazvukovém vyšetření z celkového množství nahrazených embryí.

Ultrazvukové měření.

Průměry folikulů byly měřeny stejným pracovníkem během transvagináiního ultrazvukového vyšetření za použití 7,5 Mhz transvaginální sondy (Bruer a Kjaer). Průměr folikulů byl vypočítán jako průměr nejdelší osy folikulu a osy kolmé k této ve stejné vyšetřovací rovině.

♦ · · «*·· ·*· v··

Statistické metody.

Statistická analýza byla provedena pomocí Studentova T-testu. Protože žádný ze stanovovaných hormonů nevykazoval normální rozdělení, byl k analýze statisticky významných rozdílů použit neparametrický Mann-Whitneyův U-test pro nepárová data a Prattův test pro data párová. Hodnoty byly považovány za významné, pokud bylo p menší než 0,05.

Výsledky.

Pacienti.

V experimentu 1 byl medián věku žen 31 let (rozmezí 28-36 let) ve skupině bez předléčení pomocí FSH a 32 let (rozmezí 28-36 let) ve skupině, které bylo FSH podáváno. Toto se nelišilo od věku žen v experimentu 2 (medián 32 let, rozmezí 27-37 let) . Další klinické charakteristiky včetně trvání neplodnosti, příčiny neplodnosti a poctu předchozích IVF cyklů byly ve všech skupinách podobné.

První experiment: Vyzrávání a vývoj embrya.

V prvním experimentu zahrnujícím 20 žen mohlo být pro IVM použito 77 oocytů a 62 (81%) vyzrálo do stádia MFII po 36 hodinách. Po fertlizaci pomocí ICSI bylo pozorováno 2PN oplodnění u 49 (79%) a u 45 z nich (72%) došlo k rozdělení. Stupeň vývoje embrya byl 40/62 (65%) a stupeň implantace byl 5/33 (15%). Poměr klinického těhotenství na zahájený cyklus byl 5/20 (25%). U jedné pacientky došlo v osmém gestačním týdnu k potratu, zbylá těhotenství pokračují. Předléčení pomocí FSH nemělo žádný efekt na vyzrávání oocytů, stupeň fertilizace, stupeň dělení nebo vývoj embrya (Tabulka 18). Celkem bylo dosaženo pěti těhotenství. Jedna žena porodila zdravého chlapce, jedna potratila v osmém gestačním týdnu, zbývající jsou za 32. týdnem gestace.

• · « · ·

A A · · · A··· ♦ ·· ·♦ ····

Profily hormonů.

Třetí den po aspiraci nebyly nalezeny rozdíly mezi oběmi skupinami v koncentracích estradiolu, FSH, LH, inhibinu A a inhibinu B (Tabulka 19). U nestimulované skupiny se koncentrace FSH nelišily od hodnot stimulované skupiny, ačkoli byly pozorovány velké ínter-individuální rozdíly. Hladina estradiolu v séru zůstala ve skupině bez stimulace na stejné úrovni od třetího dne do šestého až sedmého dne. V den aspirace bylo pozorováno významné zvýšení. Ve stimulované skupině se koncentrace estradiolu zvýšila dříve (šestý až sedmý den) a dosáhla konstantní hladiny před aspirací. V obou skupinách nebylo pozorováno předčasné zvýšení LH.

Koncentrace inhibinu A měly stejný profil jako koncentrace estradiolu s časným vzestupem ve stimulované skupině a pozdním zvýšením ve skupině nestimulované. V nestimulované skupině se koncentrace inhibinu B zvýšila dříve než koncentrace inhibinu A (šestý až sedmý den). Současně bylo pozorováno zvýšení ve stimulované skupině, ale koncentrace byla trojnásobná oproti nestimulované skupině a významné snížení koncentrace inhibinu B bylo pozorováno od šestého do sedmého dne po aspiraci.

Druhý experiment:

V druhém experimentu zahrnujícím 12 žen mohlo být pro IVM použito 38 oocytů a po 48 hodinách 27 (71%) vyzrálo a bylo fertilizováno pomocí ICSI. Stupeň fertilizace a dělení byl 61%, respektive 53% a tyto hodnoty se nelišily od údajů získaných v exprimentu 1. Patnáct embryí bylo přeneseno u 10 pacientů, žádné embryo nebylo kryoprezervováno. Bylo dosaženo jednoho těhotenství ukončeném porodem zdravé dívky. Vývoj embrya byl v této skupině 56% a stupe^vm implantace byl 7%. Prodloužením stimulačního období z fixní dávky 150 IU/den po dobu 3 až 6 dnů do získání folikulů o velikosti 10 mm jsme získali větší velikost folikulů v den aspirace a vyšší koncentraci estradiolu v séru, ale počet oocytů získaných na jednu aspiraci se nezvýšil (Tabulka 20).

···· ···

Bezpečnost.

V této studii nebyla žádná pacientka hospitalizována z důvodu infekce, krvácení nebo abdominálních bolestí. Nebylo pozorováno žádné mimoděložní těhotenství.

Diskuse.

Podle našich znalostí se jedná o první studii s procentem otěhotnění 25¾ na jednu aspiraci se stupněm implantace 15% po vyzrávání oocytů za podmínek in vitro. Nezralé oocyty se v této studii jevily jako rovnocenné oocytům po superovulaci a vyzrávání za podmínek in vivo (Meldrum et al., 1998).

Počet oocytů získaných od nestimulovaných žen s pravidelným cyklem se nelišil od počtu oocytů získaných a vyzrálých ve studii Barnese et al (1996). Předléčení pacientů rekombinantním FSH nezvýšilo počet odebraných oocytů. V předchozích studiích byly uváděny konfliktní výsledky. Wynn et al (1998) popsal zvýšený počet oocytů získaných od pravidelně menstruujících žen předléčených pomocí FSH ve srovnání s ženami bez tohoto předléčení, zatímco Trounson et al (1998) neprokázal žádný rozdíl v počtu získaných oocytů. Předchozí pozorování naznačila, že počet použitelných folikulu je dán již před luteální fází (Gougeon a Testart, 1990) a krátká stimulkace pomocí FSH neovlivnila počet použitelných nezralých oocytů. To je ve shodě s výsledky předkládané studie. Se vzrůstajícím množstvím FSH a zvyšující se velikostí folikulu v experimetu 2 jsme pozorovali, že šance získat oocyty při aspiraci se nezvýšila. To je ve shodě s předchozími publikacemi (Templeton et al.), kde šance získat oocyty z těchto velkých folíkulů byla v nepřítomnosti hCG velmi nízká.

Stupeň, vyzrávání, fertilizace a dělení oocytů pozorované v předkládané studii je ve shodě s výsledky předchozích studií, ale my jsme pozorovali vyšší procento otěhotnění a vyšší stupeň implantace, což ukazuje na zlepšený embryonální vývoj oocytů.

0 0 0 «00

0 0 * · « 0 0 0

Toto pozorování může vysvětlit celá řada faktorů. Embyonální vývoj IVM oocytů může být zlepšen předléčením pomocí FSH. U opic rodu Rhesus zlepšuje předléčení pomocí FSH vyzrávání a dělení oocytů (Schram a Bavister, 1994). U člověka bylo dosaženo těhotenství po transferu nezralých oocytů ze stimulovaných cyklů (Nagy et al., 1996, Liu et al,, 1997, Jaroudi et al., 1997, Edirisinghe et al., 1997).

V nedávné době popsal Wynn et al (1998) zvýšený stupeň vyzrávání oocytů po předléčení pomocí FSH. V prvním experimentu však předléčení žen pomocí FSH před odběrem oocytů nezlepšilo stupeň vyzrávání za podmínek in vitro. Pro pozorovaný rozdíl jsou možná dvě vysvětlení: 1) použité kultivační podmínky nebo 2) načasování aspirace. Načasování fertilizace a kultivační podmínky jsou důležitými faktory, které byly diskutovány Smithem et al. 1999. Aspirace oocytů byla provedena fixní den (sedmý den menstruačního cyklu) ve studii Wanna et al, zatímco den aspirace v předkládané studii závisel na velikosti folikulů. Ve stimulované skupině byl den aspirace proveden dříve (v průměru devátý den) ve srovnání s nestimulovanou skupinou (v průměru desátý den) (Tabulka 19), ale den aspirace byl fixní stejně v obou skupinách. Velikost folikulů byla monitorována ultrazvukem a odběr oocytů byl proveden den zjištění velikosti hlavního folikulu 10 mm.

Ve studii Wynna et al. (1998) nebyla provedena fertilizace oocytů ve stádiu Mil. V předkládané studii nemělo předléčení pomocí FSH žádný efekt na stupeň fertilizace či dělení. To je ve shodě s výsledky Trounsona et al (1998). Tito autoři popsali, že léčba žen s přirozeným cyklem pomocí rekombinantního FSH po dobu 3 dnů neměla efekt na stupeň vyzrávání a fertilizace za podmínek in vitro. V naší skupině pravidelně menstruujících žen se zdála být jejich vlastní stimulace pomocí FSH dostatečná k získáni oocytů, které jsou kompetentní k vyzrávání za podmínek in vitro. Je známo z předchozích studií, že byl popsán velký inter-individuální ··· rozdíl v koncentraci FSH ve folikulární fázi třetí den a výrazný inter-individuální rozdíl maximálních koncentrací FSH (Schipper et al., 1998). Tyto inter-individuální rozdíly hladin FSH mohou odrážet rozdíly v prahu pro FSH a v senzitivitě vaječníku vůči FSH, a toto může být jedním z možných důvodů pro chybění rozdílu ve stupni vyzrávání a fertilizace, ačkoli se koncentrace FSH lišila.

U nestimulované skupiny jsme pozorovali rozdíl v sérových koncentracích estradiolu a inhibinu A v den aspirace, což je známo, že je doprovodný jev při výběru dominantního folikulu (Schipper et al., 1998). Koncentrace inhibinu B se zvýšila dříve než koncentrace inhibinu A a koncentrace obou hormonů byly udržovány až do dne aspirace. To je ve shodě s předchozími studiemi (Schipper et al., 1998, Groome et al., 1996) a ve shodě s našimi ultrazvukovými nálezy, protože aspirace byla prováděna po zjištění velikosti dominantního folikulu 10 mm. To znamená, že oocyty vybrané pro IVE byly v těchto případech vybrány z folikulu určených k atrézii. My jsme pozorovali, že embryonální vývoj oocytů nebyl nepříznivě ovlivněn časnými stádii atrézie. Toto bylo dříve popsáno u hovězího dobytka (Smith et al., 1996).

Tvorba inhibinu A i inhibinu B závisí na gonadotrópinech (Lockwood et al., 1996) a ve skupině stimulované gonadotropiny byl v předkládané studii během stimulace pomocí FSH pozorován trojnásobný nárůst koncentrací inhibinu A i inhibinu B. Od šestého až sedmého dne do aspirace došlo k významnému snížení koncentrací inhibinu A i inhibinu B a toto pozorování je ve shodě s nerostoucími folíkuly (Price et al., 1995).

Načasování aspirace a výběr oocytů pro IVM jsou založeny na zkušenosti s jinými savčími druhy (Eppig et al., 1992, Edwards 1965), ale také se zdá, že lidské oocyty mají schopnost dokončit meiózu a vyzrávání, která je závislá na velikosti (Durenzi et al·., 1995). Tsuji et al., 1985 zjistil snížený • · ··> »·«· «··« · stupeň vyzrávání oocytů pocházejících z malých folikulů (3-4 mm) ve srovnání s oocyty pocházejících z větších folikulů (9-15 mm). Dubey et al. (1995) také pozoroval snížení stupně fertilizace oocytů pocházejících ze superovulovcaných folikulů o menší velikosti. Zatímco 58% oocytů z folikulů o velikosti

10-14 mm bylo oplodněno, bylo oplodněno 74% oocytů z folikulů o velikosti 22-26 mm. V předkládané studii jsme pozorovali, že oocyty z velkých folikulů v druhém experimentu se stimulací vysokými dávkami gonadotropinů staly kompetentními vyzrávat a dělit se (Tabulka 20) . Ale také oocyty z folikulů o velikosti

8-10 mm byly vývojově kompetentní, pokud byla aspirace provedena po zjištění hlavního folikulu ultrazvukovým vyšetřením. Russell et al (1998) popsal dramatický pokles stupně vyzrávání a fertilizace, když byly nezralé oocyty aspirovány při velikosti dominantního folikulu přes 14 mm. To ukazuje, že může existovat kritický bod, kde selekční proces může mít negativní efekt na existující folikuly. Může se prokázat, že monitorace průměru folikulů bude užitečným praktickým prostředkem selekce oocytů kompetentních pro vyzrávání za podmínek in vitro. Jiné faktory, než je velikost folikulu, se jeví jako omezující účinnost IVM systému. Předléčení endometria je dalším významným faktorem. V cyklu s nezralým oocytem chybí adekvátní endogenní produkce estradiolu z dominantního folikulu. Proto je potřeba exogenní suplementace, která musí být synchronizována s implementací embryonálního vývoje. (Russell et al., 1997) zjistil zvýšený stupeň vyzrávání a fertilizace, když byla zahájena suplementace estradiolem folikulů o střední velikosti, ve srovnání s časným endometriálním předléčením estradiolem. Je známo od příjemců dárcovských oocytů léčených hormonální náhradou, že je nej lepší přenášet do endometriální dutiny dva dny stará embrya třetí nebo čtvrtý den po expozici progesteronu (Rosenwaks et al., 1987). Našim cílem bylo imitovat co nejlépe normální stav a léčbu estradiolem jsme zahájili v den aspirace a suplementci progesteronem o dva dny později. Mohlo by být očekáváno, že cykly s předléčením pomocí FSH elevovaných hladin estradiolu od « · • 9 · ·· 9999 šestého až sedmého dne připravily endometrium lépe než nestimulované cykly, kde došlo ke zvýšeni hladin estradiolu až těsně před aspirací. Nejsme schopni demonstrovat žádný rozdíl v procentu implantací mezi oběma skupinami a toto je ve shodě s předchozími informacemi, protože nebyla nalezena žádná korelace mezi koncentrací sérového estradiolu a stupněm implantace (Younis et al., 1996, Remohi et al., 1997).

Je zapotřebí potvrdit tyto výsledky na větším počtu pacientů. To by mohlo vést k atraktivní alternativě kontrolované ovariální hyperstimulace pro in vitro fertilizaci. Pro klinický prospěch ze snížení vedlejších účinků, zejména eliminace hyperstimulačního syndromu, může tato léčba snížit náklady na IVF. V nedávné době bylo zpochybněno extenzivní používání léků pro ovariální stimulaci Edwardsem et al., 1997. Bylo provedeno mnoho pokusů za účelem provedení IVF během přirozeného cyklu bez použití exogenních gonadotropinů. Kombinace odběru nezralých oocytů a IVM může zvýšit úspěch IVF s přirozeným cyklem. U IVF/ICSI prováděných z důvodu mužské neplodnosti produkuje většina žen jejich vlastní FSH, čímž pomáhá stimulaci ovariálních folikulů a toho může být využito při IVM. V této studii nebyl demonstrován žádný prospěch předléčení pomocí nízkých dávek FSH na embryonální vývoj ve srovnání s přirozeným cyklem. K objasnění tohoto tématu je však zapotřebí více studií.

Tabulka 18

Počet oocytu získaných pro IVM, stupeň vyzrávání, fertilizace a dělení, a procento otěhotnění v experimentu 1.

·· ···· ·· ·«·

	Počet pacientů	Počet oocytú pro ivm	Počet MFII (%MF- II)	Počet 2PN fertili žací (ΪΜΙΙ)	Počet dělení (ΪΜΙΙ)	Počet transfe rú	Embryon álnl cykly	Počet kryopre zervací	Počet klínick ých těhoten ství	iaplant ace
Bez FSH 36 hod IVM	10	37	2B (76)	23 (62)	20 (54)	16	9	2	3	3
+FSH 36 hod IVM	10	40	34 (85)	36 (65)	25 (62)	17	9	5	2	2

Tabulka 19

Koncentrace hormonů třetí den, šestý až sedmý den a v den aspirace v obou skupinách v experimentu 1

	Skupina stimulac	I bez e	Skupina stimulac rec-FSH	Π, ;e pomocí í i
Počet cyklů	10	10 j
Den aspirace	10	(8-12)	9	(8-11) '
Medián (rozmezí)				1 1
FSH v séru IU/ml				-!
Medián (rozmezí)				i
Třetí den	6,6	4,5-12,7)	7,3	(5,1-10,9) 1
Šestý až sedmý den	4,6	(3,7-10,0	7,3	(5,4-15,8) s
Den aspirace	7,3	5,1-10,9)	4,6	(3,7-10,0) i

Estradiol v séru nmol/1

Medián (rozmezí)

Třetí den	0,12 (0,07-0,44)	0,15 (0,07-0,25)b
Šestý až sedmý den	0,17 (0,11-0,47)a'Ď	0,33 (0,17-3,7)a'b
Den aspirace	0,47 (0,12-1,20)b	0, 32 (0, 13-1, 08)
LH v séru IU/ml
Medián (rozmezí)
Třetí den	5,6 (2,4-11,6)	6,1 (3,2-10,9)
Šestý až sedmý den	8,7 (5,0-10,2)	3,1 (0,9-8,3)
Den aspirace	6,9 (4,2-11,8	6,1 (3,6-12,2)

• · • » · • · 9 · · • · · ' ·· ···· φ

* ··· ···♦

Inhibin A v séru Medián (rozmezí)
Třetí den	9 (8-26)	8 (méně než 7-17)b
šestý až sedmý den	17 (7-29)a,b	45 (16-89)a'b'c
Den aspirace	24 (12-52)b	18 (méně než 7-60)c
Inhibin B v séru Medián (rozmezí)
Třetí den	105 (méně než 20- 205)b	153 (82-174)β
Šestý až sedmý den	119 (66-327 )a'b	449 (143-2693)a'b,c
Den aspirace	121 (81-175)	107 (66-365)c

a. ρ méně než 0,05, b. p méně než 0,05, c. p méně než 0,05.

Tabulka 20

Počet oocytů získaných pro IVM, stupeň vyzrávání, fertilizace a dělení u stimulace nízkými versus vysokými dávkami gonadotropinů v experimentu 1.

	Počet pacien tú	Počet ampulí Medián rozmezí	Den aspir. Medián rozmezí	Velikost folikulů Medián rozmezí	Estradi ol Den aspir. Medián rozmezi	Počet oocytů	Mil Počet (%)	dělení	Transfer Počet embryi	Těhoten štvi
Nízká dávka rec-FSH 43 hod IVM	5	6	8 8-11	10 7-15	0,3 0,05- 1,89	21	15 (71% )	10 (66%	7	1
Vysoká dávka rec-FSH 48 hod IVM	7	9 6-12	10 9- 12	14 10- 16	1,56 1,53- 5,19	17	12 (71% )	10 (83%)	8

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Test na alespoň jeden prediktivní markér ve vzorku savce, kde specifická reakce na alespoň jeden prediktivní markér ukazuje, je-li u savce přítomno neplodné vajíčko schopné in vitro vyzrávání a následné fertilizace.

   Test podle patentového nároku 1, kde vzorek od savce je vzorkem vybraným ze skupiny tvořené tělním sekretem, sputem, krví, močí, děložními sekrety a buňkami.

   Test podle patentového nároku 2, kde vzorkem je krevní vzorek.

   Test podle jakéhokoli z předchozích patentových nároků, kde savcem je primát, jako je například člověk.

   Test podle jakéhokoli z předchozích patentových nároků, kde specifická reakce je založena na principu imunoanalýzy a/nebo PCR reakce.

   Test podle jakéhokoli z předchozích patentových nároků, kde alespoň jedním prediktivním markérem je markér zvolený ze skupiny tvořené bílkovinami, hormony, lipidy, nukleovými kyselinami, mezibuněčnými posly a enzymy.

   Test podle jakéhokoli z předchozích patentových nároků, kde jedním prediktivním markérem je inhibin A.

   Test podle jakéhokoli z předchozích patentových nároků, kde jedním prediktivním markérem je estradioi.

   Test podle patentových nároků 7 a 8, kde specifickou reakcí

   na inhibin A je zvýšení inhibinu A od třetího dne do dne aspirace. Test podle patentového nároku 9, kde zvýšení je alespoň 80%. Test podle jakéhokoli z patentových nároků 7- 10, kde

   specifickou reakcí na inhibin A je cut off hodnota.

   Test podle patentového nároku 11, kde specifickou reakcí je koncentrace inhibinu A třetí den více než 9 pg/ml.

   Test podle jakéhokoli z patentových nároků 7-12, kde specifickou reakcí na estradioi je zvýšení estradiolu od třetího dne do dne aspirace.

   • · * ♦ · · · · • · · •0 »··· ♦

   * »«*« ··· ··

   14. Test podle patentového nároku 13, kde zvýšení je alespoň 87%.

   15. Test podle jakéhokoli z předchozích patentových nároků, kde test zahrnuje alespoň dvě stanovení alespoň jednoho prediktivního markéru.

   16. Test podle jakéhokoli z předchozích patentových nároků, kde výsledek specifické reakce je pokles, konstantní hladina nebo zvýšení koncentrace alespoň jednoho prediktivního markéru ve vzorku od savce.

   17. Použití testu na přítomnost nebo množství prediktivního markéru ve vzorku od savce pro předpověď úspěšnosti IVM cyklu.

   18. Použití podle patentového nároku 17, kde šance otěhotnět je pro IVM cykly alespoň 15%.

   19. Souprava obsahující

   - prostředek k získání vzorku od savce

   - test podle jakéhokoli z patentových nároků 1-16

   20. Souprava podle patentového nároku 19 obsahující dále schéma s návodem k vyhodnocení specifické reakce.