RU2673472C1 - Способ оценки качества эякулята по содержанию сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК - Google Patents
Способ оценки качества эякулята по содержанию сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК Download PDFInfo
- Publication number
- RU2673472C1 RU2673472C1 RU2017141883A RU2017141883A RU2673472C1 RU 2673472 C1 RU2673472 C1 RU 2673472C1 RU 2017141883 A RU2017141883 A RU 2017141883A RU 2017141883 A RU2017141883 A RU 2017141883A RU 2673472 C1 RU2673472 C1 RU 2673472C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ejaculate
- dna
- sperm
- spermatozoa
- content
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 22
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 claims description 2
- 238000007031 hydroxymethylation reaction Methods 0.000 abstract description 19
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 39
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 8
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 5
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 5
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IISBACLAFKSPIT-UHFFFAOYSA-N bisphenol A Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(C)(C)C1=CC=C(O)C=C1 IISBACLAFKSPIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003646 Spearman's rank correlation coefficient Methods 0.000 description 2
- 208000002312 Teratozoospermia Diseases 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 229940106691 bisphenol a Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 2
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 101000653360 Homo sapiens Methylcytosine dioxygenase TET1 Proteins 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 102100030819 Methylcytosine dioxygenase TET1 Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000008995 epigenetic change Effects 0.000 description 1
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 231100000502 fertility decrease Toxicity 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000008775 paternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003711 photoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 201000001076 spermatogenic failure 9 Diseases 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к репродуктологии, андрологии и вспомогательным репродуктивным технологиям, и может быть использовано для оценки качества эякулята по содержанию в нем индивидуальных сперматозоидов с высоким уровнем гидроксиметилирования ДНК. Для этого проводят фиксацию сперматозоидов на предметных стеклах и детектируют содержание гидроксиметилированной ДНК методом иммунофлуоресценции, при этом оценивают не менее 5000 индивидуальных сперматозоидов. Нормой считают долю сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК, не превышающую 0.5% от общего проанализированного количества сперматозоидов. Изобретение обеспечивает точную дифференциальную диагностику мужского бесплодия. 1 ил., 3 пр.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к репродуктологии, андрологии и вспомогательным репродуктивным технологиям.
На сегодняшний день каждая шестая супружеская пара сталкивается с трудностями наступления и вынашивания беременности. По данным Всемирной Организации Здравоохранения доля мужского бесплодия составляет 50-60% (World Health Organization. WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen (5th edn). WHO Press: Geneva, 2010; 271). Мужское бесплодие может быть обусловлено широким спектром причин, включающих как соматические заболевания пациентов, так и генетически обусловленные нарушения сперматогенеза, приводящие к снижению качества эякулята. Значительную долю составляют нарушения репродуктивной функции без видимой причины (идиопатическое бесплодие). Последнее может быть вызвано в том числе функциональными нарушениями генома сперматозоидов из-за его аномального эпигенетического статуса.
В соответствии с рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения (WHO Press: Geneva, 2010; 271 (World Health Organization. WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen (5th edn)), оценка качества эякулята проводится по таким параметрам, как объем эякулята, концентрация, подвижность и морфология сперматозоидов. Недавно внедренным в медицинскую практику, но уже широко используемым способом оценки качества эякулята является оценка целостности генома сперматозоидов методом TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labelling), выявляющим одно- и двунитевые разрывы в ДНК (фрагментацию ДНК).
Используемые способы позволяют оценить морфологические характеристики сперматозоидов и целостность их ДНК, но не дают представления об их эпигенетическом статусе. Эпигенетический статус клетки можно оценить по наличию и характеру распределения специфических эпигенетических маркеров, наиболее значимыми из которых являются метилированный цитозин (5-метилцитозин) и его кислородсодержащая форма -5-гидроксиметилцитозин. Эпигенетическому модифицированию подвергается цитозин, входящий в состав ДНК, но при этом не происходит изменения последовательности нуклеотидов. Превращение цитозина в 5-гидроксиметилцитозин происходит как запрограммированно, так и спонтанно под влиянием экзогенных факторов, в том числе оксидативного стресса. Как запрограммированные, так и спонтанные эпигенетические изменения приводят к изменению работы генома. Таким образом, эпигенетический статус сперматозоида важен для реализации основной его функции, которая заключается в передаче генетической и эпигенетической информации и инициации программы развития нового организма.
Связь качества эякулята с уровнем метилирования ДНК (содержанием 5-метилцитозина) доказана. Однако специфичность гидроксиметилирования ДНК сперматозоидов (содержания 5-гидроксиметилцитозина) остается малоизученной в связи с тем, что эпигенетическая роль 5-гидроксиметилцитозина была установлена только в 2009-2011 годах (Tahiliani M, Koh KP, Shen Y, Pastor WA, Bandukwala H, Brudno Y, Agarwal S, Iyer LM, Liu DR, Aravind L, Rao A. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 2009; 324: 930-935. Branco MR, Ficz G, Reik W. Uncovering the role of 5-hydroxymethylcytosine in the epigenome. Nat Rev Genet. 2011; 13: 7-13). В дальнейшем Дженкинс с соавторами изучил уровень гидроксиметилирования в ДНК, выделенной из образцов эякулята (тотальной ДНК), и установил, что с возрастом содержание 5-гидроксиметилцитозина в эякуляте увеличивается (Jenkins TG, Aston KI, Cairns BR, Carrell DT. Paternal aging and associated intraindividual alterations of global sperm 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine levels. Fertil Steril. 2013; 100: 945-951). Ванг с соавторами выявил различия по специфичности содержания 5-гидроксиметилцитозина в 9029 генах между нормальными сперматозоидами, морфологически аномальными сперматозоидами и сперматозоидами при глобозооспермии (Wang XX, Sun BF, Jiao J, Chong ZC, Chen YS, Wang XL, Zhao Y, Zhou YM, Li D. Genome-wide 5-hydroxymethylcytosine modification pattern is a novel epigenetic feature of globozoospermia. Oncotarget. 2015; 6: 6535-6543. doi: 10.18632/oncotarget.3163). В другом исследовании было показано повышение общего уровня гидроксиметилирования ДНК на 19.37% в эякуляте мужчин, подверженных в силу профессиональной вредности действию бисфенола-А, вызывающего также снижение концентрации и подвижности сперматозоидов (Zheng H, Zhou X, Li DK, Yang F, Pan H, Li T, Miao M, Li R, Yuan W. Genome-wide alteration in DNA hydroxymethylation in the sperm from bisphenol A-exposed men. PLoS One. 2017;12(6):e0178535. doi: 10.1371/journal.pone.0178535. eCollection 2017). Эти данные указывают на возможную связь аномальных изменений характера гидроксиметилирования ДНК сперматозоидов с ухудшением характеристик эякулята. Однако авторами этих исследований не было заявлено об их диагностическом характере.
Ограничениями указанных способов является то, что устанавливается средний уровень гидроксиметилирования ДНК, т.к. анализ проводят на ДНК, выделенной из большого числа сперматозоидов (тотальной ДНК). Такой способ оценки не чувствителен в ситуации, когда в одних сперматозоидах происходит увеличение гидроксиметилирования, а в других - уменьшение, при этом общий уровень гидроксиметилирования ДНК не меняется. Между тем, анализ индивидуальных сперматозоидов крайне важен в рамках вспомогательных репродуктивных технологий, где идет искусственно направленный селекционный отбор гамет.
Задачей заявляемого решения является разработка способа оценки качества эякулята по содержанию в нем индивидуальных сперматозоидов с высоким уровнем гидроксиметилирования ДНК.
Техническим результатом предлагаемого способа является более точная дифференциальная диагностика мужского бесплодия.
Технический результат достигается тем, что способ диагностики формы мужского бесплодия включает исследование эякулята на содержание в нем сперматозоидов с повышенным уровнем гидроксиметилирования ДНК.
Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе оценки качества эякулята по содержанию сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК на преаналитическом этапе проводят фиксацию сперматозоидов на предметных стеклах и детектируют в них гидроксиметилированную ДНК с помощью иммунофлуоресценции, затем оценивают при микроскопическом анализе флуоресценцию в не менее чем 5000 индивидуальных сперматозоидов, при этом нормой считают долю сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК, не превышающую 0.5% от общего числа проанализированных сперматозоидов.
Отличие способа заключается в том, что проводят иммунофлуоресцентный анализ гидроксиметилированной ДНК в индивидуальных сперматозоидах, зафиксированных на предметном стекле, а не в тотальной ДНК, выделенной из эякулята.
Этот способ является более точным и информативным по сравнению с другими способами оценки гидроксиметилированной ДНК в эякуляте, т.к. позволяет оценить гидроксиметилирование ДНК в индивидуальных сперматозоидах с учетом их морфологических особенностей и определить их долю в эякуляте. Для оценки доли сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК в эякуляте одного пациента необходимо и достаточно провести анализ 5000 клеток, что дает возможность с 95% вероятностью выявить определить 25 и более сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК.
Анализ специальной и патентной литературы показал, что предлагаемый способ является оригинальным и не имеет аналогичных решений по оценке качества эякулята. Следовательно, предлагаемое техническое решение соответствует критерию изобретения «новизна».
Авторами заявляемого способа впервые проведено исследование эякулята на содержание в нем сперматозоидов с повышенным уровнем гидроксиметилирования ДНК. Ранее никем не было предложено использовать долю гидроксиметилированных сперматозоидов в эякуляте для оценки его качества, на основании которого можно диагностировать бесплодие.
Данный способ предназначен для использования в медицине, а именно в репродуктологии, андрологии и вспомогательных репродуктивных технологиях. Осуществление его возможностей подтверждено описанными в изобретении приемами и средствами.
Следовательно, предлагаемый «Способ оценки качества эякулята по содержанию сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК» соответствует критериям «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».
Предлагаемый способ заключается в том, что у пациентов на препаратах из эякулята определяют под микроскопом долю сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК, выявленной методом иммунофлуоресценции.
Изобретение поясняется фиг. 1, на которой представлены сперматозоиды из эякулята пациента со сниженным репродуктивным потенциалом, сфотографированные в режиме фазового контраста (А) и в режиме флуоресценции после иммунофлуоресцентной детекции 5-гидроксиметилцитозина (Б). Гидроксиметилированные сперматозоиды характеризуются ярким флуоресцентным сигналом (Б).
Способ осуществляют следующим образом. Образцы эякулята, полученные путем мастурбации, помещают в центрифужные пробирки (по 1 мл в пробирку) и осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 1700 об/мин. Далее готовят препараты сперматозоидов, зафиксированных на предметном стекле, а именно: удаляют супернатант и осуществляют пипетирование осадка до образования однородного раствора. Затем в пробирку с эякулятом по капле добавляют 5 мл гипотонического раствора (0.9% цитрат натрия) и снова пипетируют. Проводят гипотоническую обработку материала при комнатной температуре в течение 40 минут. После этого проводят центрифугирование в течение 10 минут при 1700 об/мин, удаляют супернатант и пипетируют осадок. К осадку добавляют по капле 5 мл фиксатора (этанол + ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1), периодически встряхивая пробирку, после чего пипетируют до образования однородного раствора. Фиксируют при температуре +4°С не менее 2 часов. Зафиксированный эякулят пипетируют и делают препараты, нанося на чистые обезжиренные предметные стекла путем раскапывания 30-50 мкл суспензии с высоты 30-50 см. Стекла высушивают на воздухе при комнатной температуре в течение суток. Препараты проводят через серию спиртов 70, 80, 95% по 3 минуты в каждом и высушивают. Проводят денатурацию препаратов в 2М HCl в течение 25-30 минут при комнатной температуре. Отмывают препараты в трех сменах охлажденного в морозильной камере (-20°С) фосфатного буфера 1xPBS (pH 7.2-7.4) по 3 минуты в каждой, а затем в трех сменах фосфатного буфера 1xPBS (pH 7.2-7.4) при комнатной температуре по 3 минуты в каждой. На влажные препараты под покровные стекла 24×60 мм наносят по 100 мкл блокирующего раствора (1% BSA, 0.1% Tween 20 в 1xPBS) и инкубируют в течение 30-40 минут во влажной камере при температуре +37°С. Далее на влажные препараты под покровные стекла 24×60 мм наносят по 100 мкл раствора антител к 5-гидроксиметилцитозину (rabbit anti-5hmC, ActiveMotif, USA), разведенных в блокирующем растворе в соотношении 1:500, и инкубируют во влажной камере не менее 90 минут при комнатной температуре. Препараты отмывают в трех сменах 1xPBS (рН 7.2-7.4), содержащего 0.5% Tween 20, по 3 мин в каждой, на водяной бане при температуре +37°С. На влажные препараты под покровные стекла 24×60 мм наносят по 100 мкл раствора вторых антител, коньюгированных с флуорохромом Alexa 488 (goat anti-rabbit. Life technologies, USA), разведенных в блокирующем растворе в соотношении 1:200, и инкубируют во влажной камере не менее 90 минут при 37°С. Препараты отмывают в трех сменах 1xPBS (рН 7.2-7.4), содержащего 0,5% Tween 20, по 3 мин в каждой, на водяной бане при температуре +37°С, а затем в двух сменах фосфатного буфера (1xPBS, 7.2-7.4) при комнатной температуре в течение 3 минут в каждой. Препараты ополаскивают дистиллированной водой, проводят через серию спиртов 70, 80, 95% по 3 минуты в каждом и высушивают на воздухе при комнатной температуре. Препараты заключают под покровные стекла 24×60 мм в фотозащитный раствор Vectashield, содержащий краситель DAPI (VetorLabs, США), и анализируют с помощью люминесцентного микроскопа, оборудованного светофильтрами для флуорохромов Alexa 488 и DAPI. О гидроксиметилировании ДНК в сперматозоидах судят по наличию флуоресцентного сигнала Alexa 488 (флуоресценция с зеленой части спектра) в головке. В норме подавляющее большинство сперматозоидов окрашивается антителами к 5-гидроксиметилцитозину одинаково слабо и не содержат яркого флуоресцентного сигнала; яркая флуоресценция, свидетельствующая о повышенном уровне гидроксиметилирования ДНК, характерна для единичных сперматозоидов (фиг. 1). Производят анализ 5000 сперматозоидов, подсчитывая среди них сперматозоиды с повышенным уровнем гидроксиметилирования ДНК. В результате анализа устанавливают в эякуляте долю сперматозоидов с повышенным уровнем гидроксиметилирования ДНК (= гидроксиметилированных сперматозоидов). В норме она не должна превышать 0.5%.
Пример 1. Проведен сравнительный анализ содержания сперматозоидов с повышенным уровнем гидроксиметилирования ДНК у пациентов из бесплодных пар (n=37) и доноров спермы (n=13). Доля таких сперматозоидов варьировала в широких пределах у пациентов (от 0.12 до 21.24%) и была стабильно низка у доноров спермы: 0.02-0.46%. С помощью U-критерия Манна-Уитни установлено, что в эякуляте пациентов из бесплодных пар содержание гидроксиметилированных сперматозоидов статистически значимо выше, чем в эякуляте доноров спермы (Р<0.0001). Следовательно, увеличение в эякуляте доли сперматозоидов с повышенным уровнем гидроксиметилирования ДНК ассоциировано с нарушением фертильности.
Пример 2. Проведен корреляционный анализ (путем расчета коэффициента ранговой корреляции Спирмена) между содержанием в эякуляте гидроксиметилированных сперматозоидов и другими качественными и количественными параметрами спермограммы: концентрацией, подвижностью и морфологией, в том числе содержанием в эякуляте сперматозоидов с нормальной головкой, аномальной головкой, аномальным хвостом, аномальной шейкой. Выявлена сильная отрицательная корреляция между содержанием в эякуляте гидроксиметилированных сперматозоидов и сперматозоидов с нормальной общей морфологией (r = -0.567, Р < 0.0001), а также сперматозоидов с нормальной морфологией головки (r = -0.609, Р < 0.0001). Слабая положительная корреляция выявлена с содержанием непрогрессивно-подвижных сперматозоидов (r = 0.346, Р = 0.014) и общей подвижностью (r = 0.317, Р = 0.025). Не выявлено статистически значимых корреляций между содержанием в эякуляте гидроксиметилированных сперматозоидов и концентрацией (r = 0.077, Р = 0.595), прогрессивной подвижностью (r = -0.192, Р = 0.183), содержанием сперматозоидов с аномалиями хвоста (r = -0.192, Р = 0.183) и шейки (r = -0.157, Р = 0.276). Следовательно, чем выше в эякуляте доля гидроксиметилированных сперматозоидов, тем меньше в нем содержание морфологически нормальных сперматозоидов и сперматозоидов с нормальной морфологией головки.
Пример 3. Проведен корреляционный анализ (путем расчета коэффициента ранговой корреляции Спирмена) между содержанием в эякуляте гидроксиметилированных сперматозоидов и сперматозоидов с фрагментированной ДНК, выявленных методом TUNEL. Высокая доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК свидетельствует о снижении качества эякулята. Выявлена сильная положительная корреляция между содержанием в эякуляте гидроксиметилированных сперматозоидов и сперматозоидов с фрагментированной ДНК (r = 0.46, Р = 0.001). Следовательно, чем выше в эякуляте доля гидроксиметилированных сперматозоидов, тем больше в нем содержание сперматозоидов с фрагментированной ДНК.
Таким образом, впервые показано, что оценка качества эякулята может быть основана на определении доли сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК, повышение которой является негативным прогностическим критерием фертильности.
Claims (1)
- Способ оценки качества эякулята по содержанию сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК, отличающийся тем, что на преаналитическом этапе проводят фиксацию сперматозоидов на предметных стеклах и детектируют в них гидроксиметилированную ДНК с помощью иммунофлуоресценции, затем оценивают при микроскопическом анализе флуоресценцию в не менее чем 5000 индивидуальных сперматозоидов, при этом нормой считают долю сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК, не превышающую 0.5% от общего числа проанализированных сперматозоидов.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017141883A RU2673472C1 (ru) | 2017-11-30 | 2017-11-30 | Способ оценки качества эякулята по содержанию сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017141883A RU2673472C1 (ru) | 2017-11-30 | 2017-11-30 | Способ оценки качества эякулята по содержанию сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2673472C1 true RU2673472C1 (ru) | 2018-11-27 |
Family
ID=64556418
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017141883A RU2673472C1 (ru) | 2017-11-30 | 2017-11-30 | Способ оценки качества эякулята по содержанию сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2673472C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2795567C1 (ru) * | 2022-12-06 | 2023-05-05 | Жанна Юрьевна Сапожкова | Способ лабораторной диагностики мужской репродуктивной функции на базе оценки дисперсии днк-фрагментов сперматозоидов |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1310553A1 (en) * | 2000-08-17 | 2003-05-14 | Japan Tobacco Inc. | Method of estimating the genotype of fertility recovery locus to rice bt type male fertility cytoplasm |
| RU2328736C1 (ru) * | 2007-02-01 | 2008-07-10 | Любовь Федоровна Курило | Способ цитологической диагностики нарушения сперматогенеза |
| RU2360247C2 (ru) * | 2007-06-25 | 2009-06-27 | Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Институт Федеральной службы безопасности Российской Федерации (г.Нижний Новгород)" - Институт ФСБ России (г. Нижний Новгород) | Способ оценки фертильности мужчины |
| RU2371720C1 (ru) * | 2008-06-10 | 2009-10-27 | Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова | Способ диагностики бесплодия у мужчин |
| RU2012153836A (ru) * | 2010-05-18 | 2014-06-27 | Юстус-Либиг-Универзитет Гиссен | Способ определения фертильности сперматозоидов и экспресс-анализ для определения фертильности сперматозоидов |
-
2017
- 2017-11-30 RU RU2017141883A patent/RU2673472C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1310553A1 (en) * | 2000-08-17 | 2003-05-14 | Japan Tobacco Inc. | Method of estimating the genotype of fertility recovery locus to rice bt type male fertility cytoplasm |
| RU2328736C1 (ru) * | 2007-02-01 | 2008-07-10 | Любовь Федоровна Курило | Способ цитологической диагностики нарушения сперматогенеза |
| RU2360247C2 (ru) * | 2007-06-25 | 2009-06-27 | Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Институт Федеральной службы безопасности Российской Федерации (г.Нижний Новгород)" - Институт ФСБ России (г. Нижний Новгород) | Способ оценки фертильности мужчины |
| RU2371720C1 (ru) * | 2008-06-10 | 2009-10-27 | Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова | Способ диагностики бесплодия у мужчин |
| RU2012153836A (ru) * | 2010-05-18 | 2014-06-27 | Юстус-Либиг-Универзитет Гиссен | Способ определения фертильности сперматозоидов и экспресс-анализ для определения фертильности сперматозоидов |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, М., Капитал Принт, 2012, стр. 35, 46-47, 65, 189-190, найдено 17.04.2018 в Интернете [on line] на сайте https://maximus2012.nethouse.ru/static/doc/0000/0000/0349/349989.hkxwiajjzo.pdf. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2795567C1 (ru) * | 2022-12-06 | 2023-05-05 | Жанна Юрьевна Сапожкова | Способ лабораторной диагностики мужской репродуктивной функции на базе оценки дисперсии днк-фрагментов сперматозоидов |
| RU2819094C1 (ru) * | 2023-08-22 | 2024-05-14 | Жанна Юрьевна Давидова | Способ исследования мужской репродуктивной функции |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zidi-Jrah et al. | Relationship between sperm aneuploidy, sperm DNA integrity, chromatin packaging, traditional semen parameters, and recurrent pregnancy loss | |
| Petersen et al. | The effects of male age on sperm DNA damage: an evaluation of 2,178 semen samples | |
| Javed et al. | Evaluation of sperm DNA fragmentation using multiple methods: a comparison of their predictive power for male infertility | |
| Zeyad et al. | Relationships between bacteriospermia, DNA integrity, nuclear protamine alteration, sperm quality and ICSI outcome | |
| Lamb | Semen analysis in 21st century medicine: the need for sperm function testing | |
| WO2019079851A1 (en) | IMPROVEMENTS IN OR RELATING TO CELL ANALYSIS | |
| AU2018275005A1 (en) | Method of intracellular infectious agent detection in sperm cells | |
| Stahl et al. | Concordance among sperm deoxyribonucleic acid integrity assays and semen parameters | |
| Zambrano et al. | Increase of leucocyte-derived extracellular traps (ETs) in semen samples from human acute epididymitis patients—A pilot study | |
| RU2673472C1 (ru) | Способ оценки качества эякулята по содержанию сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК | |
| Alargkof et al. | Relationships between sperm DNA integrity and bulk semen parameters in Bulgarian patients with varicocele | |
| Zümrütbaş et al. | The effect of varicocele on sperm morphology and DNA maturity: does acridine orange staining facilitate diagnosis? | |
| JP2009288189A (ja) | 精子機能の検査方法 | |
| Pourmasumi et al. | Male factor testing in recurrent pregnancy loss cases: A narrative review | |
| Sharma et al. | Sperm chromatin integrity tests and indications | |
| RU2528060C2 (ru) | Иммунологический тест для определения аутоантител против антигенов семенников | |
| WO2021259903A1 (en) | Sperm stratification | |
| CN112014367A (zh) | AuNPs1-2 pH探针在男性不育症中的应用和产品 | |
| Madian et al. | Detection of low-grade mosaicism and its correlation with hormonal profile, testicular volume, and semen quality in a cohort of Egyptian Klinefelter and Klinefelter-like patients | |
| US20210041336A1 (en) | Method and system for evaluating fertility of human spermatozoa | |
| RU2804207C1 (ru) | Способ прогнозирования мужского бесплодия на основе анализа фрагментации днк сперматозоидов | |
| RU2795567C1 (ru) | Способ лабораторной диагностики мужской репродуктивной функции на базе оценки дисперсии днк-фрагментов сперматозоидов | |
| Sharma et al. | Sperm 8 and Indications | |
| RU2827620C1 (ru) | СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ МУЖСКОГО БЕСПЛОДИЯ НА ОСНОВЕ АССОЦИАЦИИ С ПОЛИМОРФНЫМ ВАРИАНТОМ rs25487 ГЕНА БЕЛКА РЕПАРАЦИИ ДНК XRCC1 | |
| RU2730947C1 (ru) | Способ для определения целостности хроматина/ДНК в сперматозоидах |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191201 |