JP2022513704A - Ｈｃｖ検出 - Google Patents
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Abstract
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸を検出するための方法が記載されている。本方法は、臨床現場即時（ＰＯＣ）検査に有用であり、いくつかの異なるＨＣＶ遺伝子型を検出することができる迅速な検査を提供する。キット、プライマー、プローブ、プライマーの組、オリゴヌクレオチドの組、およびオリゴヌクレオチド、ならびに本方法におけるそれらの使用も記載されている。本出願人は、ＨＣＶコア核酸配列（またはその相補物）の保存された領域に特異的にハイブリッド形成する核酸増幅プライマーを使用することによって、いくつかの異なるＨＣＶ遺伝子型を検出することができる迅速なＰＯＣ核酸検査を提供できることを十分に認識した。
Description
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸を検出するための、特に臨床現場即時（ＰＯＣ（ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅ））検査のための方法、キット、プライマー、プローブ、プライマーの組、オリゴヌクレオチドの組およびオリゴヌクレオチドならびに前記方法におけるこれらの使用に関する。
Ｃ型肝炎は、主に肝臓に影響を及ぼすＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）によって引き起こされる感染性疾患である。初期感染の間には、多くの場合、軽度の症状が存在するにすぎず、または症状が全く存在しない。ウイルスは、最初に感染した者の約７５％～８５％において肝臓内に存続する。慢性感染の早期には、通例、症状がない。しかしながら、長年にわたって、慢性感染は、しばしば肝疾患、特には肝硬変に至る。場合によっては、肝硬変患者は、肝不全、肝臓がん、または食道および胃内の拡張した血管などの合併症を発症する。
ＨＣＶは、主に、静脈内薬物使用、滅菌が不十分な医療器具、健康管理における針刺し損傷および輸血に関連する血液と血液との接触によって拡散する。２０１５年現在、世界中で１億４３００万人（２％）がＣ型肝炎に感染していると推定された（ＧＢＤ ２０１５ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｉｎｊｕｒｙ Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ，Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｓ．（８ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１６）．Ｌａｎｃｅｔ，３８８（１００５３）：１５４５－１６０２）。Ｃ型肝炎は、アフリカならびに中央アジアおよび東アジアで最も一般的に発生する。２０１５年には、Ｃ型肝炎に起因して、約１６７，０００人が肝臓がんで死亡し、３２６，０００人が肝硬変で死亡した（ＧＢＤ ２０１５ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ａｎｄ Ｃａｕｓｅｓ ｏｆ Ｄｅａｔｈ，Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｓ．（８ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１６）．Ｌａｎｃｅｔ，３８８（１００５３）：１４５９－１５４４）。Ｃ型肝炎に対するワクチンは存在しない。しかしながら、強力で忍容性の高い直接作用する抗ウイルス薬の組み合わせの開発および承認によって、ＨＣＶ感染の処置は、革命的な変化を遂げている。これらの治療法は、ほとんどの患者集団において８～２４週間の投与後に９５％を超える治癒率をもたらす（Ｂｅｌｐｅｒｉｏら、２０１７，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １６７，４９９－５０４５；Ｆａｌａｄｅ－Ｎｗｕｌｉａら、２０１７，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ，１６６，６３７－６４８）。
ＨＣＶは、エンベロープに覆われたフラビウイルス科のＲＮＡウイルスである。ＨＣＶ粒子は、２つのウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ１およびＥ２がその中に埋め込まれている脂質膜エンベロープを含む。Ｅ１およびＥ２は、ウイルスの付着および細胞内への侵入に関与する。エンベロープ内には、ウイルスのＲＮＡ材料を含有する正二十面体のコアが存在する。ＨＣＶは、９，６００ヌクレオチド塩基長である単一のオープンリーディングフレームからなる一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを有する。この単一のオープンリーディングフレームは、翻訳されて約３，０００アミノ酸の単一のタンパク質産物を生成し、次いで、このタンパク質産物は、細胞のプロテアーゼおよびウイルスのプロテアーゼによって、宿主細胞内でのウイルス複製を可能にする１０個のより小さいタンパク質へとさらにプロセシングされるか、または成熟ウイルス粒子へと集合する。このＲＮＡの５’および３’末端には非翻訳領域（ＮＴＲ）があり、これらはタンパク質に翻訳されないが、ウイルスＲＮＡの翻訳および複製にとって重要である。
Ｃ型肝炎ウイルスによって作られる構造タンパク質には、コアタンパク質、Ｅ１およびＥ２が含まれる。非構造（ＮＳ）タンパク質には、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂが含まれる。タンパク質は、ゲノムに沿って以下の順序で配置されている。Ｎ末端－コア－エンベロープ（Ｅ１）－Ｅ２－ｐ７－ＮＳ２－ＮＳ３－ＮＳ４Ａ－ＮＳ４Ｂ－ＮＳ５Ａ－ＮＳ５Ｂ－Ｃ末端。コアタンパク質は１９１個のアミノ酸を有する。
ＨＣＶは、７つの主要な遺伝子型（１～７）および６７のサブタイプに分類されている（Ｓｍｉｔｈら、２０１４（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１４；５９；３１８－３２７）。遺伝子型は、完全なゲノムに対してヌクレオチド部位の３０～３５％が異なる（Ｏｈｎｏら（２００７）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５（１）：２０１－７）。遺伝子型のサブタイプのゲノム組成の差は、通常２０～２５％である。サブタイプ１ａおよび１ｂは世界中で見出されており、全症例の６０％を引き起こす。
ＨＣＶの診断は、ウイルスまたはそのＲＮＡに対する抗体を探すための血液検査による。ＨＣＶ検出のいくつかの方法が米国ＦＤＡによって承認されている。
・ Ｃ型肝炎ウイルスにコードされた抗原（抗ＨＣＶアッセイ）：ＡＢＢＯＴＴ ＨＣＶ ＥＩＡ ２．０（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；Ｃｈｉｒｏｎ ＲＩＢＡ ＨＣＶ ３．０ Ｓｔｒｉｐ Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ Ａｓｓａｙ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ）；ＡＢＢＯＴＴ ＰＲＩＳＭ ＨＣＶ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；
・ 核酸試験：ＵｌｔｒａＱｕａｌ ＨＣＶ ＲＴ－ＰＣＲ Ａｓｓａｙ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＳｃｒｅｅｎ ＨＣＶ Ｔｅｓｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）；Ｐｒｏｃｌｅｉｘ ＨＩＶ－１／ＨＣＶ Ａｓｓａｙ（Ｇｅｎ－Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ）；Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｕｌｔｒｉｏ Ａｓｓａｙ（Ｇｅｎ－Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ）；Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｕｌｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ Ａｓｓａｙｓ（Ｇｅｎ－Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ）；Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＲＴ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）Ａｓｓａｙ（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｐｌａｓｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｌ．Ｐ．）；
・ ＥＬＩＳＡ試験：Ｏｒｔｈｏ ＨＣＶ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０ ＥＬＩＳＡ Ｔｅｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｏｒｔｈｏ－Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ）。
・ Ｃ型肝炎ウイルスにコードされた抗原（抗ＨＣＶアッセイ）：ＡＢＢＯＴＴ ＨＣＶ ＥＩＡ ２．０（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；Ｃｈｉｒｏｎ ＲＩＢＡ ＨＣＶ ３．０ Ｓｔｒｉｐ Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ Ａｓｓａｙ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ）；ＡＢＢＯＴＴ ＰＲＩＳＭ ＨＣＶ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；
・ 核酸試験：ＵｌｔｒａＱｕａｌ ＨＣＶ ＲＴ－ＰＣＲ Ａｓｓａｙ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＳｃｒｅｅｎ ＨＣＶ Ｔｅｓｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）；Ｐｒｏｃｌｅｉｘ ＨＩＶ－１／ＨＣＶ Ａｓｓａｙ（Ｇｅｎ－Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ）；Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｕｌｔｒｉｏ Ａｓｓａｙ（Ｇｅｎ－Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ）；Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｕｌｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ Ａｓｓａｙｓ（Ｇｅｎ－Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ）；Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＲＴ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）Ａｓｓａｙ（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｐｌａｓｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｌ．Ｐ．）；
・ ＥＬＩＳＡ試験：Ｏｒｔｈｏ ＨＣＶ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０ ＥＬＩＳＡ Ｔｅｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｏｒｔｈｏ－Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ）。
これらの方法は、検査室において実施され、時間と費用がかかるので、ＨＣＶ感染が蔓延している支援が届きにくい集団および医療制度が十分でない環境での使用には適していない。また、抗体に基づく試験は、一般に感染の６～１２週後にＨＣＶ感染を検出することができるに過ぎない。したがって、支援が届きにくい集団および医療制度が十分でない環境での使用に適し、感染後できるだけ早くＨＣＶを検出することができる迅速な試験が必要とされている。
ＧＢＤ ２０１５ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｉｎｊｕｒｙ Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ，Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｓ．（８ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１６）．Ｌａｎｃｅｔ，３８８（１００５３）：１５４５－１６０２
ＧＢＤ ２０１５ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ａｎｄ Ｃａｕｓｅｓ ｏｆ Ｄｅａｔｈ，Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｓ．（８ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１６）．Ｌａｎｃｅｔ，３８８（１００５３）：１４５９－１５４４
Ｂｅｌｐｅｒｉｏら、２０１７，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １６７，４９９－５０４５
Ｆａｌａｄｅ－Ｎｗｕｌｉａら、２０１７，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ，１６６，６３７－６４８
Ｓｍｉｔｈら、２０１４（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１４；５９；３１８－３２７
Ｏｈｎｏら（２００７）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５（１）：２０１－７
本出願人は、ＨＣＶコア核酸配列（またはその相補物）の保存された領域に特異的にハイブリッド形成する核酸増幅プライマーを使用することによって、いくつかの異なるＨＣＶ遺伝子型を検出することができる迅速なＰＯＣ核酸検査を提供できることを十分に認識した。
本発明によれば、試料がＨＣＶ核酸を含むかどうかを決定する方法であって、順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーを使用する等温増幅反応によって、前記試料の核酸を増幅すること、または前記試料の核酸に由来する核酸を増幅することを含み、各核酸増幅プライマーは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、方法が提供される。
ＨＣＶコア核酸配列を図２に示す。
保存された配列は、ＢＬＡＳＴ、ＨＭＭＥＲおよびＩｎｆｅｒｎａｌなどのツールを使用して、相同性検索によって同定され得る。相同性検索ツールは、個々の核酸配列を入力として採用し得、または既知の関連配列の多重配列アラインメントから生成された統計モデルを使用し得る。プロファイル－ＨＭＭなどの統計モデル、および構造情報も取り込んだＲＮＡ共分散モデルは、より関連性が遠い配列を検索するときに役立つことができる。次いで、関連する個体または他の種からの配列のデータベースに対して、入力配列が整列される。次いで、マッチする塩基の数、およびアラインメントによって生じたギャップまたは欠失の数に基づいて、得られたアラインメントにスコアを与える。許容され得る保存的置換は、ＰＡＭおよびＢＬＯＳＵＭなどの置換行列を使用して同定され得る。高スコアのアラインメントは、相同配列に由来すると想定される。次いで、広範な系統学的範囲にわたって高度に類似する相同体を検出することによって、配列の保存が推測され得る。
必要に応じて、異なるＨＣＶ遺伝子型間での保存されたＨＣＶコア核酸配列は、各ＨＣＶ遺伝子型１～６に対して２０ヌクレオチドあたり最大２個のミスマッチを含む核酸配列である。
必要に応じて、異なるＨＣＶ遺伝子型間での保存されたＨＣＶコア核酸配列は、各ＨＣＶ遺伝子型１～６に対して同一である核酸配列である。
保存された配列を可視化するために、多重配列アラインメントを使用することができる。ＣＬＵＳＴＡＬフォーマットは、アラインメントの保存されたカラムに注釈を付すためのプレーンテキストキーを含んでおり、保存された配列（＊）、保存的変異（：）、半保存的変異（．）および非保存的変異（）を表す。多重配列アラインメントを行うために、ＭａｃＶｅｃｔｏｒなどのソフトウェアを使用することができる。
必要に応じて、核酸増幅プライマーが、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成すれば、核酸増幅プライマーはＨＣＶコア核酸配列に特異的にハイブリッド形成する。
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、塩濃度、イオン強度およびハイブリダイゼーション緩衝液組成などの条件によって影響される。一般的には、低ストリンジェンシー条件は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列に対する熱融解点（Ｔｍ）より約３０℃低いように選択される。中ストリンジェンシー条件は、温度がＴｍより２０℃低い場合であり、高ストリンジェンシー条件は、温度がＴｍより１０℃低い場合である。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に一致したプライマーまたはプローブにハイブリッド形成する、所定のイオン強度およびｐＨ下での温度である。Ｔｍは、溶液条件および塩基組成およびプローブの長さに依存する。例えば、より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリッド形成する。ハイブリダイゼーションの最大速度は、Ｔｍを約１６℃～最大３２℃下回ると得られる。ハイブリダイゼーション溶液中の一価カチオンの存在は、２つの核酸鎖間の静電的反発を減少させ、それによってハイブリッド形成を促進する；この効果は、０．４Ｍまでのナトリウム濃度に対して見られる（より高い濃度では、この効果は無視され得る。）。ホルムアミドは、各パーセントのホルムアミドについて、ＤＮＡ－ＤＮＡおよびＤＮＡ－ＲＮＡ二本鎖の融解温度を０．６～０．７℃低下させ、５０％ホルムアミドの添加は、３０～４５℃でハイブリダイゼーションを実施することを可能にするが、ハイブリダイゼーションの速度は低下する。塩基対ミスマッチは、二本鎖のハイブリダイゼーション速度および熱安定性を低下させる。平均すると、大きなプローブでは、Ｔｍは％塩基ミスマッチ当たり約１℃減少する。Ｔｍは、ハイブリッドの種類に応じて、以下の式を使用して計算することができる。
１）ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッド（Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ａｎｄ Ｗａｈｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：２６７－２８４，１９８４）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６×ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］ａ＋０．４１×％［Ｇ／Ｃｂ］－５００×［Ｌｃ］－１－０．６１×％ホルムアミド；
２）ＤＮＡ－ＲＮＡまたはＲＮＡ－ＲＮＡハイブリッド：
Ｔｍ＝７９．８℃＋１８．５（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］ａ）＋０．５８（％Ｇ／Ｃｂ）＋１１．８（％Ｇ／Ｃｂ）２－８２０／Ｌｃ；
３）オリゴＤＮＡまたはオリゴＲＮＡハイブリッド：
２０ヌクレオチド未満の場合：Ｔｍ＝２（ｌｎ）；
２０～３５ヌクレオチドの場合：Ｔｍ＝２２＋１．４６（ｌｎ）；
ａまたは他の一価カチオンについては、０．０１～０．４Ｍの範囲でのみ正確。
ｂ３０％～７５％の範囲の％ＧＣに対してのみ正確。
ｃＬ＝塩基対中の二本鎖の長さ。
ｄオリゴ、オリゴヌクレオチド；１ｎ，＝プライマーの有効長＝２×（Ｇ／Ｃの数）＋（ＮＴの数）。
１）ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッド（Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ａｎｄ Ｗａｈｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：２６７－２８４，１９８４）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６×ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］ａ＋０．４１×％［Ｇ／Ｃｂ］－５００×［Ｌｃ］－１－０．６１×％ホルムアミド；
２）ＤＮＡ－ＲＮＡまたはＲＮＡ－ＲＮＡハイブリッド：
Ｔｍ＝７９．８℃＋１８．５（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］ａ）＋０．５８（％Ｇ／Ｃｂ）＋１１．８（％Ｇ／Ｃｂ）２－８２０／Ｌｃ；
３）オリゴＤＮＡまたはオリゴＲＮＡハイブリッド：
２０ヌクレオチド未満の場合：Ｔｍ＝２（ｌｎ）；
２０～３５ヌクレオチドの場合：Ｔｍ＝２２＋１．４６（ｌｎ）；
ａまたは他の一価カチオンについては、０．０１～０．４Ｍの範囲でのみ正確。
ｂ３０％～７５％の範囲の％ＧＣに対してのみ正確。
ｃＬ＝塩基対中の二本鎖の長さ。
ｄオリゴ、オリゴヌクレオチド；１ｎ，＝プライマーの有効長＝２×（Ｇ／Ｃの数）＋（ＮＴの数）。
ハイブリダイゼーション条件に加えて、ハイブリダイゼーションの特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後洗浄の機能にも依存する。非特異的ハイブリダイゼーションから生じるバックグラウンドを除去するために、試料は希塩溶液で洗浄される。このような洗浄の重要な要素には、最終的な洗浄溶液のイオン強度および温度が含まれる：塩濃度が低く、かつ洗浄温度が高いほど、洗浄のストリンジェンシーは高くなる。洗浄条件は、典型的には、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーでまたはそれを下回るストリンジェンシーで行われる。陽性のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドのシグナルの少なくとも２倍のシグナルを与える。一般に、核酸ハイブリダイゼーションアッセイまたは遺伝子増幅検出手順に適したストリンジェントな条件は、上記の通りである。より高いまたはより低いストリンジェントな条件も選択され得る。当業者は、洗浄中に変更され得、ストリンジェンシー条件を維持または変更する様々なパラメータを承知している。
例えば、５０ヌクレオチドより長いＤＮＡハイブリッドに対する典型的なストリンジェントな条件（高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件とも呼ばれる）は、１×ＳＳＣ中６５℃でのまたは１×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミド中４２℃でのハイブリダイゼーション、その後０．３×ＳＳＣ中６５℃での洗浄を包含する。ハイブリッドの長さは、ハイブリッド形成する核酸に対する予想される長さである。公知の配列の核酸がハイブリッドを形成する場合、配列のアラインメントを行い、本明細書に記載されている保存された領域を同定することによって、ハイブリッド長が決定され得る。１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである；ハイブリダイゼーション溶液および洗浄溶液は、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔの試薬、０．５～１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性断片化サケ精子ＤＮＡ、０．５％ピロリン酸ナトリウムをさらに含み得る。
ストリンジェンシーの水準を定義する目的で、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＣＳＨ，Ｎｅｗ ＹｏｒｋまたはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９年および毎年の更新版）を参照することができる。
必要に応じて、順方向核酸プライマーは、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、を含む。
必要に応じて、逆方向核酸プライマーは、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、を含む。
配列番号１の配列に対応する配列（プライマーＦ２、順方向プライマー）および配列番号２の配列の逆相補物に対応する配列（プライマーＲ１．２、逆方向プライマー）のＨＣＶコア領域中での位置を図２に示す。ＨＣＶ遺伝子型１～６に対するＨＣＶコア核酸配列の配列アラインメントが、配列番号１に対応する配列（プライマーＦ２）および配列番号２の逆相補物に対応する配列（プライマーＲ１．２）の位置とともに図３に示されている。
例えば、試料のＨＣＶコア核酸を逆転写し、順方向および逆方向核酸増幅プライマーを用いる等温核酸増幅反応によって逆転写の産物を増幅することによって、核酸は試料の核酸から誘導され得る。
必要に応じて、本発明の方法は、試料のＨＣＶ ＲＮＡを逆転写すること、ならびに順方向および逆方向核酸増幅プライマーを使用して等温増幅反応によって逆転写の産物を増幅することをさらに含む。
等温核酸増幅の任意の適切な方法が本発明の方法において使用され得る。等温核酸増幅のいくつかの適切な方法が当業者に公知である。必要に応じて、等温核酸増幅は、転写に基づく増幅である。そのような方法は、逆転写酵素（ＲＴ）、ＲＮアーゼＨおよびＲＮＡポリメラーゼ活性を使用したＲＮＡ鋳型の増幅を含み、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）および自家持続配列複製（３ＳＲ）を含む（ＣｈａｎおよびＦｏｘ，Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：１８５－１９６（１９９９）；Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：１８７４－１８７８（１９９０）；Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３５０：９１－９２（１９９１））。ＮＡＳＢＡおよび３ＳＲは、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）由来のＲＴ（ＲＮアーゼＨ活性も有する）、大腸菌由来のＲＮアーゼＨおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用する。ＴＭＡは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ＲＴ（ＲＮアーゼＨ活性も有する）およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用する。
転写に基づく増幅法などの等温増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する増幅よりもいくつかの利点を有する。反応は単一の管内で同時に起こり、等温条件下で行われるため、サーモサイクラーは必要とされない。増幅反応はＰＣＲより速い（ＰＣＲでの、２０サイクル後における１×１０６倍の増幅と比較して、５サイクル後に１×１０９倍の増幅を認めることができる。）。ＤＮＡバックグラウンドは転写に基づく増幅を妨害しないので、これらの方法は二本鎖ＤＮＡ夾雑によって影響を受けない。増幅産物は一本鎖であり、鎖分離を必要とせずに検出することができる。
必要に応じて、逆方向核酸プライマーは、その５’末端に、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列をさらに含む。このようなプライマーは、逆転写のためにおよび転写に基づく等温増幅反応のために使用することができ、それによって逆転写および等温核酸増幅を実行するために必要とされるプライマーの数を最小限に抑えることができる。
例えば、プロモーター配列は、Ｔ７プロモーター配列：５’ ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ ３’（配列番号：６）、であり得る。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、このプロモーター配列中の下線が付されたＧにおいて転写を開始する。次いで、このポリメラーゼは、反対鎖を鋳型として使用して、５’→３’へ転写する。転写物中の第１の塩基はＧである。
例えば、Ｔ７プロモーター配列をその５’末端に有する逆方向核酸プライマーは、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ（配列番号７）の核酸配列を含み得る。
本発明の方法における使用に適した転写に基づく等温増幅反応を、図４を参照しながら以下に記載する。
アンチセンスプライマー１は、プライマーが標的ＲＮＡに特異的にハイブリッド形成することができるように、標的ＲＮＡの一部に相補的な核酸配列（例えば、配列番号２、プライマーＲ１．２、逆方向プライマー）を含み、およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列の一本鎖バージョン（例えば、配列番号７、Ｔ７プロモーター配列）をその５’末端に含む。プライマー１をＲＮＡ標的にアニーリングする。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ標的の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーを合成するためにプライマー１を伸長する。ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖特異的リボヌクレアーゼは、ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを消化する。センスプライマー２は、ｃＤＮＡの一部に相補的な核酸配列を含む。プライマー２は、プライマー１によって形成されたｃＤＮＡの部分の下流のｃＤＮＡにアニーリングする。プライマー２は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、一方の末端のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を通じて伸長する第２のＤＮＡ鎖を生成する（それによって二本鎖プロモーターを形成する）。このプロモーターは、元の標的配列に相補的な多数のＲＮＡを合成するためにＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって使用される。次いで、これらのＲＮＡ産物は、反応の循環相のための鋳型として機能するが、プライマーアニーリング工程は逆転している、すなわちプライマー２の後にプライマー１が続く。
この方法の変形例において、プライマー２は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列の一本鎖バージョンも含み得る。これは、元の標的配列と同じセンスを有するＲＮＡ（および元の標的配列に相補的なＲＮＡ）の産生をもたらす。
いくつかの従来の転写に基づく等温増幅反応では、ｃＤＮＡ合成のための鋳型として機能する前に５’末端で標的ＲＮＡを切断することが知られている。標的ＲＮＡの５’末端と重複し、隣接する領域に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（切断オリゴヌクレオチド）を付加することによって形成されたＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を切断するために、ＲＮアーゼＨ活性を有する酵素が用いられる。切断オリゴヌクレオチドは、伸長反応を防止するために、その３’末端ＯＨが適切に修飾されてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、切断オリゴヌクレオチドを使用することができるが、本発明の方法は、切断オリゴヌクレオチドの非存在下で実施され、それによって増幅反応および必要とされる成分を単純化することが好ましい。
等温核酸増幅は、物資が限られた環境で容易に使用できるので有利である。このような方法は、物資が限られた環境では利用できないことがあり得るサーマルサイクラーの使用を必要としない。適切な方法の例は、国際公開第２００８／０９０３４０号およびＬｅｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１０；２０１（Ｓ１）：Ｓ６５－Ｓ７１に記載されている。
ＲＮＡの逆転写を実施するための、および逆転写の生成物の等温増幅のための適切な試薬の例は、国際公開第２００８／０９０３４０号に示されており、例えば、以下の酵素活性が挙げられる：ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖特異的リボヌクレアーゼおよびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ。
必要とされる酵素活性に加えて、適切なヌクレオチド三リン酸（転写ベースの増幅のために、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ、すなわちｒＡＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＣＴＰおよびｒＵＴＰ）およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）が必要である）、標的核酸の特異的増幅のための適切なプライマー、増幅反応を実施するための適切な緩衝液、および酵素活性によって必要とされる任意の必要な補因子（例えば、マグネシウムイオン）を提供することも必要であることが理解されよう。適切な緩衝液の例としては、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳまたは酢酸緩衝液が挙げられる。塩化カリウムまたは塩化ナトリウムなどの適切な塩が与えられ得る。これらの成分の適切な濃度は、当業者によって容易に決定され得る。適切なｒＮＴＰ濃度は、典型的には、０．２５～５ｍＭ、または０．５～２．５ｍＭの範囲である。適切なｄＮＴＰ濃度は、典型的には、０．２５～５ｍＭのｄＮＴＰまたは０．５～２．５ｍＭの範囲である。適切なマグネシウムイオン濃度は、典型的には５～１５ｍＭの範囲である。
いくつかの従来の転写に基づく増幅方法は、非常に大量のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、１４２またはそれを超える単位、ここで、１単位は、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ｒＮＴＰ、４００μＭ ［３Ｈ］－ＵＴＰ（３０ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅｓ）、２０μｇ／ｍｌ Ｔ７ ＤＮＡ、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１００μｌ反応体積、３７℃、１０分などの標準的アッセイ条件下において、３７℃で１時間に、１ｎｍｏｌｅの標識されたヌクレオチドを酸不溶性材料中に組み込む）を使用する。本発明の方法は、そのような従来の方法よりも有意に少ないＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して実施することができ、それによってコストを削減する。例えば、本発明の方法は、１４２単位未満、適切には１００単位未満または５０単位未満、例えば３０～４０単位のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）を使用して実施することができる。
必要に応じて、試料の核酸は、単離された核酸中に存在する試料のＨＣＶ ＲＮＡを逆転写する前に単離される。
核酸を単離するための多くの好適な方法が当業者に公知である。いくつかの方法は、細胞を溶解し、タンパク質を変性させるために、チオシアン酸グアニジニウムなどのカオトロピック剤および有機溶媒を使用する。例えば、Ｂｏｏｍら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０，Ｖｏｌ．２８（３）：４９５－５０３）は、チオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解／結合緩衝液の存在下で試料をシリカ粒子と接触させる方法を記載している。放出された核酸はシリカ粒子に結合し、次いで、シリカ粒子は、チオシアン酸グアニジニウムを含有する洗浄緩衝液で、次いでエタノール、次いでアセトンで洗浄される。続いて、結合した核酸は、水性低塩緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０）で溶出される。
いくつかの方法は、カオトロピック塩および有機溶媒の必要性を回避する。例えば、Ｈｏｕｒｆａｒら（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，５１（７）：１２１７－１２２２）は、プロテイナーゼＫの添加前に、コスモトロピック塩（硫酸アンモニウム）を含有する溶解／結合緩衝液の存在下で試料を磁性シリカ粒子と混合する方法を記載している。分離後に、プロテイナーゼＫを含む洗浄緩衝液で磁性粒子を洗浄し、８０℃の溶出緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８．５）で溶出する。他の適切な方法は、国際公開第２０１０／０１５８３５号に記載されている。
核酸の単離は、第１のｐＨで結合緩衝液の存在下で核酸を結合することができ、第２のｐＨで核酸をそこから溶出することができる固相とともに使用するための従来の結合緩衝液および／または溶出緩衝液を使用して実施され得る。
必要に応じて、固相は、周囲条件に従って電荷を変化させるイオン化可能な基を含む。イオン化可能な基のｐＫａは、固相に核酸を結合し、固相から核酸を放出することが望まれる条件に適している。一般に、核酸は、ｐＫａより低いまたは概ね等しいｐＨで固相に結合し、より高いｐＨ（通常、ｐＫａより上）で放出される。第１のｐＨで核酸を結合させ、第１のｐＨよりも高い第２のｐＨで結合した核酸を溶出するための適切な固相は、当業者に周知である。例えば、第１のｐＨでは、固相は正電荷を含み得、第２のｐＨでは、固相は、より少ない正電荷、中性電荷または負電荷を含み得る。これに代えてまたはこれに加えて、第１のｐＨでは、固相は中性電荷またはより少ない負電荷を含み得、第２のｐＨでは、固相は負電荷またはより多い負電荷を有し得る。このような電荷の変化は、核酸が第１のｐＨで固相に吸着され、第２のｐＨで放出されることを可能にする。
例えば、固相は、第１のｐＨと第２のｐＨの間にｐＫａを有する負にイオン化可能な基を含み得る。核酸は、固相が中性にまたはより少なく負に帯電されると固相に結合し、固相が負にまたはより多く負に帯電されると放出される。これに代えてまたはこれに加えて、固相は、第１のｐＨと第２のｐＨの間にｐＫａを有する正にイオン化可能な基を含み得る。核酸は、固相が正に帯電しているときに固相に結合し、固相が中性にまたはより少なく正に帯電していないときに放出される。
核酸の抽出のために使用され得る固相の例としては、無機酸化物、例えばシリカもしくはガラス（例えば、Ｂｏｏｍら、またはＨｏｕｒｆａｒらに記載されている）、または酸化アルミニウム、糖ポリマー、または電荷スイッチ材料（例えば、国際公開第０２／４８１６４号に記載されている）を含む固相が挙げられる。
固相は、例えば膜、ゲルまたは粒子、例えば磁性粒子を含む任意の適切な形態であり得る。シリカ膜またはゲル、および磁性シリカ粒子が好ましい例である。シリカ膜が特に好ましい。これは、（例えば、Ｈｏｕｒｆａｒらによって使用されている）磁性シリカ粒子より安価であり、磁性シリカ粒子とは異なり、冷蔵貯蔵を必要としない。
固相は、コスモトロピック剤の存在によって核酸の結合が増強される固相であり得る。必要に応じて、固相への核酸の結合は、コスモトロピック剤の存在下で行われてもよい。そのような剤は、シリカをベースとする固相などの固相への核酸の結合を増強することが知られている。
「カオトロピック」および「コスモトロピック」剤という用語は、高分子および水の構造への影響に応じてこれらの剤を分けるホフマイスター系列（Ｃａｃａｃｅら、Ｑ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ １９９７；３０：２４１－７７）に由来する。カオトロープは、溶媒構造を破壊する物質として定義され得、コスモトロープは、溶媒構造を増強する物質として定義され得る。Ｃａｃａｃｅらの図１は、ホフマイスター系列およびタンパク質の構造／機能に影響を及ぼす一般的に存在する有機溶質を示す。カオトロピック剤の例は当業者に公知であり、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジニウムおよびグアニジニウム塩酸塩が挙げられる。コスモトロピック剤の例は当業者に公知であり、硫酸アンモニウムおよび塩化リチウムが挙げられる。
必要に応じて、溶解は、結合緩衝液を用いて行われる。細胞溶解のために使用され得る結合緩衝液は、当業者に公知である。Ｂｏｏｍらによって使用された溶解緩衝液は、チオシアン酸グアニジニウム、Ｔｒｉｓ塩酸、ｐＨ ６．４、ＥＤＴＡ（ｐＨ ８に調整される）およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む。必要に応じて、溶解緩衝液はカオトロピック剤を含まない。例えば、コスモトロピック剤を含む溶解／結合緩衝液が使用され得る。必要に応じて、緩衝液は酸性緩衝液、適切には３～５の範囲のｐＫａ（２５℃）を有する強酸性緩衝液である。
必要に応じて、本発明の方法は、等温増幅反応の生成物の核酸を核酸捕捉プローブにハイブリッド形成させることによって前記等温増幅反応の生成物を捕捉することをさらに含み、前記捕捉プローブは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する。
必要に応じて、捕捉プローブが、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成すれば、捕捉プローブはＨＣＶコア核酸配列に特異的にハイブリッド形成する。
必要に応じて、捕捉プローブは、ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む。
必要に応じて、本発明の方法は、等温増幅反応の生成物を核酸検出プローブにハイブリッド形成させることによって前記等温増幅反応の生成物を検出することをさらに含み、前記検出プローブが、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する。
必要に応じて、検出プローブが、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成すれば、検出プローブはＨＣＶコア核酸配列に特異的にハイブリッド形成する。
必要に応じて、検出プローブは、ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む。
配列番号３（プローブＣＰ２、捕捉プローブ）および配列番号４（プローブＤＰ２、検出プローブ）の配列に対応する配列のＨＣＶコア領域内の位置が図２に示されている。ＨＣＶ遺伝子型１～６に対するＨＣＶコア核酸配列の配列アラインメントが、配列番号３（捕捉プローブ２）および配列番号４（検出プローブ）に対応する配列の位置とともに図３に示されている。
例えば、捕捉プローブおよび検出プローブが、等温増幅反応中に存在する他の核酸（すなわち、コア領域外のＨＣＶ核酸を含む非ＨＣＶコア核酸）に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成しなければ、捕捉プローブおよび検出プローブはＨＣＶコア核酸配列に特異的にハイブリッド形成する。
核酸配列間の配列同一性は、配列のアラインメントを比較することによって決定することができる。比較される配列中の等価な位置が同じヌクレオチドによって占められている場合に、分子はその位置において同一である。同一性のパーセンテージとしてアラインメントをスコア化することは、比較される配列によって共有される位置における同一のヌクレオチドの数の関数である。配列を比較する場合、最適なアラインメントでは、配列への挿入および欠失の可能性を考慮に入れて、配列の１つまたはそれより多くへとギャップを導入することが必要な場合がある。比較されている配列中の同一分子の同じ数について、２つの比較された配列間のより高い関連性を反映する可能な限り少ないギャップを有する配列アラインメントが、多くのギャップを有する配列アラインメントより高いスコアを達成するように、配列比較方法は、ギャップペナルティを使用し得る。最大パーセント同一性の計算は、ギャップペナルティを考慮に入れた、最適なアライメントの生成を含む。
配列比較を実行するための適切なコンピュータプログラムは、商業および公共部門で広く利用可能である。例としては、ＭａｔＧａｔ（Ｃａｍｐａｎｅｌｌａら、２００３、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ４：２９；ｈｔｔｐ：／／ｂｉｔｉｎｃｋａ．ｃｏｍ／ｌｅｄｉｏｎ／ｍａｔｇａｔから入手可能なプログラム）、Ｇａｐ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｆａｓｔａから入手可能なプログラム）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ ２．０およびＸ ２．０（Ｌａｒｋｉｎら、２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：２９４７－２９４８；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２から入手可能なプログラム）ならびにＥＭＢＯＳＳ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，上掲；Ｋｒｕｓｋａｌ，１９８３，Ｉｎ：Ｔｉｍｅ ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ ｅｄｉｔｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，Ｓａｎｋｏｆｆ＆Ｋｒｕｓｋａｌ（ｅｄｓ），ｐｐ １－４４，Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎから入手可能なプログラム）が挙げられる。すべてのプログラムは、デフォルトパラメータを使用して実行され得る。
例えば、配列比較は、ＥＭＢＯＳＳ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓの「ｎｅｅｄｌｅ」法を使用して行うことができ、この方法では、２つの配列の全長にわたって検討する場合に、２つの配列の最適なアラインメント（ギャップを含む）を決定し、パーセント同一性スコアを提供する。
必要に応じて、検出プローブは、視覚的に検出され得る標識（すなわち、計測手段を使用せずに視覚的に検出され得る標識）で標識される。適切な視覚的に検出され得る標識の例としては、コロイド状金属ゾル粒子、ラテックス粒子または織物染料（ｔｅｘｔｉｌｅ ｄｙｅ）粒子が挙げられる。コロイド状金属ゾル粒子の例は、コロイド状金粒子である。
等温核酸増幅の生成物は、視覚的に検出され得る標識で標識され、例えば国際公開第２００８／０９０３４０号およびＬｅｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１０；２０１（Ｓ１）：Ｓ６５－Ｓ７１に記載されているように、クロマトグラフィー試験片を使用して捕捉および検出され得る。
必要に応じて、試料は液体試料である。必要に応じて、試料は、ＨＣＶに感染している疑いのある対象から得られた生物学的試料、例えば液体生物学的試料である。必要に応じて、試料は、ＨＣＶに感染している疑いのある対象から得られた血液または血漿試料である。
必要に応じて、本発明の方法はインビトロ方法である。
本発明の方法は、ＨＣＶ感染に関してスクリーニングするためのＰＯＣ検査として特に有用である。特に、本発明の方法は、検査室設備やサーマルサイクラーを使用せずに迅速に実施することができる。ＨＣＶ感染は、感染の１～２週間以内に検出することができる。対象がＨＣＶに感染していると同定されたら、対象に適切な処置を施すことができ、感染を監視することができる。適切であれば、どのＨＣＶ遺伝子型が感染の原因であるかを決定するために、対象を再度検査し、次いで、その遺伝子型に適した処置を施すことができる。
本発明によれば、試料がＨＣＶ核酸を含むかどうかを決定するためのキットであって、
等温増幅反応によって鋳型核酸を増幅するための順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーであって、各核酸増幅プライマーは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーと；
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸捕捉プローブと；ならびに／または
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸検出プローブであって、必要に応じて、等温核酸増幅の生成物を標識するための視覚的に検出され得る標識を含む、核酸検出プローブと；
を含む、キットも提供される。
等温増幅反応によって鋳型核酸を増幅するための順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーであって、各核酸増幅プライマーは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーと；
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸捕捉プローブと；ならびに／または
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸検出プローブであって、必要に応じて、等温核酸増幅の生成物を標識するための視覚的に検出され得る標識を含む、核酸検出プローブと；
を含む、キットも提供される。
必要に応じて、順方向核酸プライマーは、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、を含む。
必要に応じて、逆方向核酸プライマーは、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、を含む。
必要に応じて、捕捉プローブは、ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む。
必要に応じて、検出プローブは、ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む。
必要に応じて、本発明のキットは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖特異的リボヌクレアーゼおよびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをさらに含む。
必要に応じて、本発明のキットは、適切なヌクレオチド三リン酸（転写ベースの増幅のために、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ、すなわちｒＡＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＣＴＰおよびｒＵＴＰ）およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）が必要とされる）、増幅反応を実施するための適切な緩衝液、および酵素活性によって必要とされる任意の必要な補因子（例えばマグネシウムイオン）をさらに含む。適切な緩衝液の例としては、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳまたは酢酸緩衝液が挙げられる。塩化カリウムまたは塩化ナトリウムなどの適切な塩が与えられ得る。これらの成分の適切な濃度は、当業者によって容易に決定され得る。適切なｒＮＴＰ濃度は、典型的には、０．２５～５ｍＭ、または０．５～２．５ｍＭの範囲である。適切なｄＮＴＰ濃度は、典型的には、０．２５～５ｍＭのｄＮＴＰまたは０．５～２．５ｍＭの範囲である。適切なマグネシウムイオン濃度は、典型的には５～１５ｍＭの範囲である。
本発明のキットは、等温核酸増幅の生成物を標識するための視覚的に検出され得る標識および／またはクロマトグラフィー試験片、ならびに等温核酸増幅の生成物を捕捉および検出するための試薬をさらに含み得る。適切な標識、試験片および試薬、ならびに単純な増幅ベースのアッセイ（ＳＡＭＢＡ）による等温核酸増幅の生成物を捕捉および検出するための方法は、国際公開第２００８／０９０３４０号およびＬｅｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１０；２０１（Ｓ１）：Ｓ６５－Ｓ７１に記載されている。
本発明のキットは、例えば上記の核酸抽出の方法を使用して、試料から核酸を単離するための試薬をさらに含み得る。核酸を抽出するための適切な試薬は、試料中に存在する細胞を溶解するための溶解緩衝液と、核酸を結合するための固相と、核酸を固相に結合させるための結合緩衝液（必要に応じて、溶解緩衝液は結合緩衝液と同一である）とを含み得、固相に結合された核酸を洗浄するための洗浄緩衝液と、固相から核酸を溶出するための溶出緩衝液とを必要に応じて含み得る。適切な溶解、洗浄および溶出緩衝液、ならびにこれらの緩衝液とともに使用するための適切な固相が上記されている。
本発明のキットは、以下の追加の構成要素のいずれをもさらに含み得る：指穿刺または踵穿刺によって対象から全血の試料を得るためのランセット；対象から血液の試料を採取するための血液採取器；陽性および／または陰性対照；キットを使用して本発明の試験方法を実施するための指示。
本発明によれば、等温核酸増幅反応によってＨＣＶ核酸を増幅するためのプライマーの組であって、順方向核酸増幅プライマーと逆方向核酸増幅プライマーとを含み、各核酸増幅プライマーは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、プライマーの組も提供される。
必要に応じて、プライマーの組は、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、を含む。
必要に応じて、プライマーの組は、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、を含む。
必要に応じて、順方向核酸プライマーおよび／または逆方向核酸プライマーは最大５０ヌクレオチド長である。
本発明によれば、等温増幅反応によってＨＣＶ核酸を増幅するための、ならびに増幅反応の生成物を捕捉および／または検出するためのオリゴヌクレオチドの組であって、
本発明のプライマーの組と；
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸捕捉プローブと；ならびに／または
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸検出プローブと；
を含む、オリゴヌクレオチドの組も提供される。
本発明のプライマーの組と；
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸捕捉プローブと；ならびに／または
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸検出プローブと；
を含む、オリゴヌクレオチドの組も提供される。
必要に応じて、オリゴヌクレオチドの組は、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、を含む。
必要に応じて、オリゴヌクレオチドの組は、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、を含む。
必要に応じて、オリゴヌクレオチドの組は、ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む。
必要に応じて、オリゴヌクレオチドの組は、ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む。
必要に応じて、捕捉および／または検出プローブは最大５０ヌクレオチド長である。
本発明によれば、
核酸配列：ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）、もしくはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物を含むもしくはそれからなる核酸配列；
核酸配列：ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）、もしくはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物を含むもしくはそれからなる核酸配列；
核酸配列ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物を含むもしくはそれからなる核酸配列；または
核酸配列ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物を含むもしくはそれからなる核酸配列；
を含むオリゴヌクレオチドも提供される。
核酸配列：ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）、もしくはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物を含むもしくはそれからなる核酸配列；
核酸配列：ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）、もしくはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物を含むもしくはそれからなる核酸配列；
核酸配列ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物を含むもしくはそれからなる核酸配列；または
核酸配列ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物を含むもしくはそれからなる核酸配列；
を含むオリゴヌクレオチドも提供される。
本発明のプライマーの組、オリゴヌクレオチドの組またはオリゴヌクレオチドは、本発明のキットにおいてまたは本発明の方法において使用され得る。
本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するための、プライマー、プローブまたはオリゴヌクレオチドは、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチドの長さ、または５０ヌクレオチドを超える長さであり得る。
本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するための、プライマー、プローブまたはオリゴヌクレオチドは、最大２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。
核酸配列：ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）を含む、本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するための、プライマーまたはオリゴヌクレオチドは、最大１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。
核酸配列：ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の相補物を含む、本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するためのオリゴヌクレオチドは、最大１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。
核酸配列：GCTCATGATGCACGGTCTACGAGA（配列番号２）を含む、本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するための、プライマーまたはオリゴヌクレオチドは、最大２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。
核酸配列：GCTCATGATGCACGGTCTACGAGA（配列番号２）の相補物を含む、本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するためのオリゴヌクレオチドは、最大２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。
核酸配列：ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）を含む、本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するための、プローブまたはオリゴヌクレオチドは、最大２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。
核酸配列：ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の相補物を含む、本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するための、プローブまたはオリゴヌクレオチドは、最大２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。
核酸配列：TGATAGGGTGCTTGCGAGTG（配列番号４）を含む、本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するための、プローブまたはオリゴヌクレオチドは、最大２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。
核酸配列：TGATAGGGTGCTTGCGAGTG（配列番号４）の相補物を含む、本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するための、プローブまたはオリゴヌクレオチドは、最大２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１～４もしくは７のいずれかのヌクレオチド配列と、その全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であり、もしくは１００％同一である配列またはその相補物を含むまたはそれからなるヌクレオチド配列を含み得る。
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号７のヌクレオチド配列と、その全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であり、もしくは１００％同一である配列またはその相補物を含むまたはそれからなるヌクレオチド配列を含み得る。
オリゴヌクレオチドは、例えば、視覚的に検出され得る標識で標識され得る。特に、ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含むまたはそれからなるオリゴヌクレオチドは、視覚的に検出され得る標識で標識され得る。視覚的に検出され得る標識の例としては、コロイド状金属ゾル粒子、ラテックス粒子または織物染料粒子が挙げられる。コロイド状金属ゾル粒子の例は、コロイド状金粒子である。
本発明のプライマーまたはオリゴヌクレオチドの組は、本発明のオリゴヌクレオチドを含み得る。
本発明のキットは、本発明の、プライマーの組、オリゴヌクレオチドの組またはオリゴヌクレオチドを含み得る。
本発明によれば、本発明の方法における、本発明の、プライマーの組、オリゴヌクレオチドの組またはオリゴヌクレオチドの使用も提供される。
本発明の実施形態は、添付の図面を参照しながら、単なる例として以下に説明される。
ＨＣＶ遺伝子型１～６を検出するための臨床現場即時（ＰＯＣ）核酸検査
ＨＣＶウイルスＲＮＡを抽出し、逆転写し、等温核酸増幅によって増幅し、Ｌｅｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１０；２０１（Ｓ１）：Ｓ６５－Ｓ７１に記載されている方法と同様の単純な増幅ベースのアッセイ（ＳＡＭＢＡ）法を用いて、ディップスティックを用いた迅速な目視検出によって増幅生成物を検出した。
ＨＣＶウイルスＲＮＡを抽出し、逆転写し、等温核酸増幅によって増幅し、Ｌｅｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１０；２０１（Ｓ１）：Ｓ６５－Ｓ７１に記載されている方法と同様の単純な増幅ベースのアッセイ（ＳＡＭＢＡ）法を用いて、ディップスティックを用いた迅速な目視検出によって増幅生成物を検出した。
簡潔には、逆方向核酸増幅プライマーは、プライマーが標的ＲＮＡに特異的にハイブリッド形成することができるように、ＨＣＶ標的ＲＮＡの一部に相補的な核酸配列を含み、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列の一本鎖バージョンをその５’末端に含む。逆方向プライマーはＲＮＡ標的にハイブリッド形成する。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、逆方向プライマーを伸長してＲＮＡ標的の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーを合成する。ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖特異的リボヌクレアーゼは、ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを消化する。順方向核酸増幅プライマーは、ｃＤＮＡの一部に相補的な核酸配列を含む。順方向プライマーは、逆方向プライマーによって形成されたｃＤＮＡの部分の下流のｃＤＮＡにハイブリッド形成する。順方向プライマーは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、一方の末端のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を通じて伸長する第２のＤＮＡ鎖を生成する（それによって二本鎖プロモーターを形成する）。このプロモーターは、元の標的配列に相補的な多数のＲＮＡを合成するためにＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって使用される。次いで、これらのＲＮＡ産物は、反応の循環相のための鋳型として機能するが、プライマーハイブリッド形成工程は逆転している、すなわち順方向プライマーの後に逆方向プライマーが続く。
遺伝子型１～６のＨＣＶ核酸の等温増幅のために、以下のプライマー配列を使用した：
ＨＣＶプライマーＦ２（順方向プライマー）：
ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）；
ＨＣＶプライマーＲＥＶ１．２（逆方向プライマー）／Ｔ７プロモーター：
ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ（配列番号：７）。
ＨＣＶプライマーＦ２（順方向プライマー）：
ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）；
ＨＣＶプライマーＲＥＶ１．２（逆方向プライマー）／Ｔ７プロモーター：
ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ（配列番号：７）。
以下の捕捉および検出プローブを使用して増幅産物を捕捉および検出した：
ＨＣＶプローブＣＰ２（捕捉プローブ）：
ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）；
ＨＣＶプローブＤＰ２（検出プローブ）：
ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）。
ＨＣＶプローブＣＰ２（捕捉プローブ）：
ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）；
ＨＣＶプローブＤＰ２（検出プローブ）：
ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）。
６つのＨＣＶ遺伝子型のそれぞれについて少なくとも３つの異なる試料に対してＨＣＶプライマー／プローブを試験した。結果を図５に記録する。ＨＣＶ遺伝子型１～６が効率的に検出された。
Claims (39)
- 試料がＨＣＶ核酸を含むかどうかを決定する方法であって、順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーを使用する等温増幅反応によって、前記試料の核酸を増幅すること、または前記試料の核酸に由来する核酸を増幅することを含み、各核酸増幅プライマーは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、方法。
- 前記順方向核酸プライマーが、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記逆方向核酸プライマーが、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記試料のＨＣＶ ＲＮＡを逆転写することと、前記順方向および逆方向核酸増幅プライマーを使用する等温増幅反応によって前記逆転写の産物を増幅することと、をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記逆方向核酸プライマーが、その５’末端にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列をさらに含み、逆転写が前記逆方向核酸プライマーを用いて行われる、請求項５に記載の方法。
- 単離された前記核酸中に存在する前記試料のＨＣＶ ＲＮＡを逆転写する前に、前記試料の核酸を単離することをさらに含む、請求項４または５に記載の方法。
- 前記等温増幅反応の生成物の核酸を核酸捕捉プローブにハイブリッド形成させることによって前記等温増幅反応の生成物を捕捉することをさらに含み、前記捕捉プローブは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記捕捉プローブが、ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む、請求項７に記載の方法。
- 前記等温増幅反応の生成物を核酸検出プローブとハイブリッド形成させることによって前記等温増幅反応の生成物を検出することをさらに含み、前記検出プローブが、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記検出プローブが、ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む、請求項９に記載の方法。
- 前記検出プローブが、視覚的に検出され得る標識で標識されている、請求項９または１０に記載の方法。
- 前記等温増幅反応の前記生成物の捕捉および／または検出がクロマトグラフィーディップスティックアッセイによって行われる、請求項７～１１のいずれかに記載の方法。
- 前記試料が、ＨＣＶに感染している疑いのある対象から得られた生物学的試料である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記試料が、ＨＣＶに感染している疑いのある対象から得られた血液または血漿試料である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- インビトロ法である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 試料がＨＣＶ核酸を含むかどうかを決定するためのキットであって、
等温増幅反応によって鋳型核酸を増幅するための、順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーであって、各核酸増幅プライマーは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーと；
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸捕捉プローブと；ならびに／または
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸検出プローブであって、前記等温核酸増幅の生成物を標識するための視覚的に検出され得る標識を必要に応じて含む、核酸検出プローブと；
を含む、キット。 - 前記順方向核酸プライマーが、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１６に記載のキット。
- 前記逆方向核酸プライマーが、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１６または１７に記載のキット。
- 前記捕捉プローブが、ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む、請求項１６～１８のいずれかに記載のキット。
- 前記検出プローブが、ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む、請求項１６～１９のいずれかに記載のキット。
- ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖特異的リボヌクレアーゼおよびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１６～２０のいずれかに記載のキット。
- 指穿刺または踵穿刺によって対象から全血の試料を得るためのランセットをさらに含む、請求項１６～２１のいずれかに記載のキット。
- 対象から血液の試料を採取するための血液採取器をさらに含む、請求項１６～２２のいずれかに記載のキット。
- 前記等温核酸増幅の生成物を捕捉および検出するためのクロマトグラフィー試験片をさらに含む、請求項１６～２３のいずれかに記載のキット。
- 血液または血漿試料から核酸を抽出するための、溶解／結合緩衝液と、溶出緩衝液と、および必要に応じて洗浄緩衝液とをさらに含む、請求項１６～２４のいずれかに記載のキット。
- 等温核酸増幅反応によってＨＣＶ核酸を増幅するためのプライマーの組であって、順方向核酸増幅プライマーと逆方向核酸増幅プライマーとを含み、各核酸増幅プライマーは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、プライマーの組。
- 前記順方向核酸プライマーが、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項２６に記載のプライマーの組。
- 前記逆方向核酸プライマーが、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項２６または２７に記載のプライマーの組。
- 前記順方向および／または前記逆方向核酸プライマーが最大５０ヌクレオチド長である、請求項２６～２８のいずれかに記載のプライマーの組。
- 等温核酸増幅反応によってＨＣＶ核酸を増幅するための、ならびに前記増幅反応の生成物を捕捉および／または検出するためのオリゴヌクレオチドの組であって、
請求項２６～２９のいずれかに記載のプライマーの組と；
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸捕捉プローブと；および／または
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸検出プローブと；
を含む、オリゴヌクレオチドの組。 - 前記順方向核酸プライマーが、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項３０に記載のオリゴヌクレオチドの組。
- 前記逆方向核酸プライマーが、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項３０または３１に記載のオリゴヌクレオチドの組。
- 前記捕捉プローブが、ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む、請求項３０～３２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組。
- 前記検出プローブが、ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む、請求項３０～３３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組。
- 前記捕捉および／または検出プローブが最大５０ヌクレオチド長である、請求項３０～３４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組。
- オリゴヌクレオチドであって、
ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物；
ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物；
ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物；または
ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物；
を含む、オリゴヌクレオチド。 - 最大２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長である、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項２６～２９のいずれかに記載のプライマーの組、請求項３０～３５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組、または請求項３６もしくは３７に記載のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１６～２５のいずれかに記載のキット。
- 請求項１～１５のいずれかに記載の方法における、請求項２６～２９のいずれかに記載のプライマーの組、請求項３０～３５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組、または請求項３６もしくは３７に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
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