JP3347785B2 - Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピング用ｐｃｒプライマーセット - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピング用ｐｃｒプライマーセットInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのグ
ルーピングに使用するためのポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）プライマーセット、及び、このプライマーセット
を用いるＣ型肝炎ウイルスのグルーピング方法に関す
る。
ルーピングに使用するためのポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）プライマーセット、及び、このプライマーセット
を用いるＣ型肝炎ウイルスのグルーピング方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】最近、Ｃ型肝炎ウイルス（または「ＨＣ
Ｖ」とも称する）による慢性肝炎の治療にインターフェ
ロン（ＩＦＮ）が有効であることが示されて来ている。
しかしながら、ＩＦＮが有効な症例は、慢性肝炎の３０
％程度であり効果のあるものとないものが見られる。こ
の有効性の差はウイルス量の差（第２８回日本肝臓学会
講演要旨集（１９９２年）、吉田健太郎ら、第７７頁の
一般演題７；片野義明、第７７頁の一般演題８）あるい
はＨＣＶの遺伝子型の差（Ｙｏｓｈｉｏｋａら、Ｈｅｐ
ａｔｏｌｏｇｙ，１６：２９３−２９９，１９９２；Ｋ
ａｎａｉら、ＬＡＮＣＥＴ，３３９：１５４３，１９９
２）と考えられている。
Ｖ」とも称する）による慢性肝炎の治療にインターフェ
ロン（ＩＦＮ）が有効であることが示されて来ている。
しかしながら、ＩＦＮが有効な症例は、慢性肝炎の３０
％程度であり効果のあるものとないものが見られる。こ
の有効性の差はウイルス量の差（第２８回日本肝臓学会
講演要旨集（１９９２年）、吉田健太郎ら、第７７頁の
一般演題７；片野義明、第７７頁の一般演題８）あるい
はＨＣＶの遺伝子型の差（Ｙｏｓｈｉｏｋａら、Ｈｅｐ
ａｔｏｌｏｇｙ，１６：２９３−２９９，１９９２；Ｋ
ａｎａｉら、ＬＡＮＣＥＴ，３３９：１５４３，１９９
２）と考えられている。
【０００３】Ｃ型肝炎ウイルスはその塩基配列あるいは
アミノ酸配列からタイプ１からタイプ４の４つに分類す
るタイピング法（Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉ
ｒｏｌ，７３；６７３−６７９，１９９２；Ｅｎｏｍｏ
ｔｏ Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．ｃｏｍ．１７０（３）：１０２１−１０２５，１９
９０）と、タイプ１とタイプ２をグループＩ、タイプ３
とタイプ４をグループＩＩとするグルーピング法（本出
願人が平成４年１０月３０日に出願した特願平４−３１
６６３４号及び特願平４−３１６６３５号）とが提唱さ
れている。図１に各タイプと各グループの系統樹を示し
ているがタイプ１とタイプ２の間及びタイプ３とタイプ
４の間の塩基配列の相同性は８５〜８８％及び８０〜９
０％であり、グループＩとグループＩＩの間の塩基配列
の相同性は７０〜７５％である。またグループＩとグル
ープＩＩは血清学的にも分類可能であり（本出願人によ
る特願平４−３１６６３４号及び特願平４−３１６６３
５号；第２８回日本肝臓学会総会講演要旨集（１９９２
年）、三井健宏ら、第８４頁の一般演題２２）、ウイル
ス学的にもグループＩとＩＩの間にかなりの隔たりがあ
ると考えられる。
アミノ酸配列からタイプ１からタイプ４の４つに分類す
るタイピング法（Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉ
ｒｏｌ，７３；６７３−６７９，１９９２；Ｅｎｏｍｏ
ｔｏ Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．ｃｏｍ．１７０（３）：１０２１−１０２５，１９
９０）と、タイプ１とタイプ２をグループＩ、タイプ３
とタイプ４をグループＩＩとするグルーピング法（本出
願人が平成４年１０月３０日に出願した特願平４−３１
６６３４号及び特願平４−３１６６３５号）とが提唱さ
れている。図１に各タイプと各グループの系統樹を示し
ているがタイプ１とタイプ２の間及びタイプ３とタイプ
４の間の塩基配列の相同性は８５〜８８％及び８０〜９
０％であり、グループＩとグループＩＩの間の塩基配列
の相同性は７０〜７５％である。またグループＩとグル
ープＩＩは血清学的にも分類可能であり（本出願人によ
る特願平４−３１６６３４号及び特願平４−３１６６３
５号；第２８回日本肝臓学会総会講演要旨集（１９９２
年）、三井健宏ら、第８４頁の一般演題２２）、ウイル
ス学的にもグループＩとＩＩの間にかなりの隔たりがあ
ると考えられる。
【０００４】現在、ＨＣＶのタイピングまたはグルーピ
ングを行なう場合、分類基準がその核酸配列あるいはア
ミノ酸配列に拠っているために、ＨＣＶ遺伝子をクロー
ニングし、クローニングした遺伝子の核酸配列を決定
し、核酸あるいはアミノ酸配列の相同性を検索し、分類
する方法が最も確実な方法である。しかしながら、この
方法は時間も費用も掛り煩雑である。これに替わる方法
として岡本らはＨＣＶのＣＯＲＥ領域に相当するプライ
マーを用いＰＣＲ法により４つのタイプに分類する方法
を開発した。この方法は、各タイプに共通なセンス及び
アンチセンスプライマーを用い第一段階目のＰＣＲを行
ない、つぎに第２ＰＣＲで第１ＰＣＲで増幅された領域
の内側に設定した各タイプに共通なセンスプライマーと
各タイプのそれぞれ異なる位置に設定したタイプ特異的
な４種のアンチセンスプライマーを用いＰＣＲを行なっ
た後、アガロースゲルで電気泳動し各タイプに特異的な
サイズのバンドを検出することによりタイプを決定す
る、というものである。
ングを行なう場合、分類基準がその核酸配列あるいはア
ミノ酸配列に拠っているために、ＨＣＶ遺伝子をクロー
ニングし、クローニングした遺伝子の核酸配列を決定
し、核酸あるいはアミノ酸配列の相同性を検索し、分類
する方法が最も確実な方法である。しかしながら、この
方法は時間も費用も掛り煩雑である。これに替わる方法
として岡本らはＨＣＶのＣＯＲＥ領域に相当するプライ
マーを用いＰＣＲ法により４つのタイプに分類する方法
を開発した。この方法は、各タイプに共通なセンス及び
アンチセンスプライマーを用い第一段階目のＰＣＲを行
ない、つぎに第２ＰＣＲで第１ＰＣＲで増幅された領域
の内側に設定した各タイプに共通なセンスプライマーと
各タイプのそれぞれ異なる位置に設定したタイプ特異的
な４種のアンチセンスプライマーを用いＰＣＲを行なっ
た後、アガロースゲルで電気泳動し各タイプに特異的な
サイズのバンドを検出することによりタイプを決定す
る、というものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ＨＣＶ分類のため、従
来行なわれてきた核酸配列を決定し分類する方法は、時
間や手間がかかるため大量の検体を処理することは不可
能である。一方、岡本ら（上掲）のＣＯＲＥ領域のプラ
イマーを用いたＰＣＲによるタイピングは簡便ではある
がつぎのような問題点がある。すなわち、ＨＣＶはＲＮ
Ａウイルスであるために変異が起こりやすい。岡本ら
は、第２ＰＣＲに用いるアンチセンスプライマーは各タ
イプに良く保存された領域のプライマーを選択している
が、各タイプに特異的な４種のプライマーはＨＣＶ遺伝
子上の異なる位置に設定されているために変異の起きか
たによっては全く同じウイルスでも二本のＰＣＲ産物が
検出されたりあるいは判定不能になる可能性がある。実
際にこのＣＯＲＥのプライマーを用いた分類では分類不
能であった例が２４．１％あるいは１２〜２０％あると
報告されている（第３９回日本臨床病理学会総会講演要
旨集（１９９２年）、第１８６頁の演題２６０；第２７
回日本肝臓学会西部会講演要旨集（１９９２年）、第５
０頁の一般演題１３；Ｍｏｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．１８３：３３２−３４
２，１９９２）。
来行なわれてきた核酸配列を決定し分類する方法は、時
間や手間がかかるため大量の検体を処理することは不可
能である。一方、岡本ら（上掲）のＣＯＲＥ領域のプラ
イマーを用いたＰＣＲによるタイピングは簡便ではある
がつぎのような問題点がある。すなわち、ＨＣＶはＲＮ
Ａウイルスであるために変異が起こりやすい。岡本ら
は、第２ＰＣＲに用いるアンチセンスプライマーは各タ
イプに良く保存された領域のプライマーを選択している
が、各タイプに特異的な４種のプライマーはＨＣＶ遺伝
子上の異なる位置に設定されているために変異の起きか
たによっては全く同じウイルスでも二本のＰＣＲ産物が
検出されたりあるいは判定不能になる可能性がある。実
際にこのＣＯＲＥのプライマーを用いた分類では分類不
能であった例が２４．１％あるいは１２〜２０％あると
報告されている（第３９回日本臨床病理学会総会講演要
旨集（１９９２年）、第１８６頁の演題２６０；第２７
回日本肝臓学会西部会講演要旨集（１９９２年）、第５
０頁の一般演題１３；Ｍｏｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．１８３：３３２−３４
２，１９９２）。
【０００６】本発明の第１の目的は、Ｃ型肝炎ウイルス
のグルーピングに使用するためのＰＣＲプライマーセッ
トを提供することである。
のグルーピングに使用するためのＰＣＲプライマーセッ
トを提供することである。
【０００７】本発明の第２の目的は、このＰＣＲプライ
マーセットを用いるＣ型肝炎ウイルスのグルーピング方
法を提供することである。
マーセットを用いるＣ型肝炎ウイルスのグルーピング方
法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本出願人は前記の課題を
解決するため、簡便で誤判定が少なく検出率の高いグル
ーピング用のＰＣＲプライマーを発見した。このプライ
マーを用いると、ＨＣＶのグルーピングの判定結果とＩ
ＦＮ治療効果との間に正確な相関性が得られることが判
明した。
解決するため、簡便で誤判定が少なく検出率の高いグル
ーピング用のＰＣＲプライマーを発見した。このプライ
マーを用いると、ＨＣＶのグルーピングの判定結果とＩ
ＦＮ治療効果との間に正確な相関性が得られることが判
明した。
【０００９】すなわち、現在公表されているグループＩ
Ｉと考えられているＨＣＶ遺伝子のうち全領域を含むも
のはＨＣ−Ｊ６とＨＣ−Ｊ８と考えられるが（Ｏｋａｙ
ａｍａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２６９７〜
２７０４（１９９１）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８８：３
３１〜３４１（１９９２））、これらの塩基配列と他の
グループＩのＨＣＶの塩基配列を比較しもっとも異なる
領域を探した。その結果、本出願人はＮＳ５領域にグル
ープＩＩではグループＩより５４〜５７ｂｐ長い挿入部
位があることに着目し、その領域をはさむように第１Ｐ
ＣＲ及び第２ＰＣＲのプライマーを設定した。このプラ
イマーでグループＩで９７〜１００ｂｐ、グループＩＩ
で１５４ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。すなわちグルー
プＩあるいはグループＩＩそれぞれに特異的な配列のプ
ライマーを用いるのではなく、同一の４種のプライマー
セットでグループＩ及びグループＩＩ両方の遺伝子を検
出する方法を見出した。この４種のプライマーはグルー
プＩ及びグループＩＩどちらの遺伝子にも良く保存され
た領域を選択しているが、検出率を上げるためグループ
ＩとグループＩＩで塩基配列の異なる部位ではミックス
プライマーを用いた。判定方法はアガロースゲル電気泳
動後、エチジウムブロマイド染色しＰＣＲ産物の長さで
判定するが、この長さの差は設定したプライマーの位置
に依存せず、ＨＣＶ遺伝子そのものの長さに依存してい
るために遺伝子の変異による誤判定は非常に少なくなる
と考えられる。
Ｉと考えられているＨＣＶ遺伝子のうち全領域を含むも
のはＨＣ−Ｊ６とＨＣ−Ｊ８と考えられるが（Ｏｋａｙ
ａｍａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２６９７〜
２７０４（１９９１）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８８：３
３１〜３４１（１９９２））、これらの塩基配列と他の
グループＩのＨＣＶの塩基配列を比較しもっとも異なる
領域を探した。その結果、本出願人はＮＳ５領域にグル
ープＩＩではグループＩより５４〜５７ｂｐ長い挿入部
位があることに着目し、その領域をはさむように第１Ｐ
ＣＲ及び第２ＰＣＲのプライマーを設定した。このプラ
イマーでグループＩで９７〜１００ｂｐ、グループＩＩ
で１５４ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。すなわちグルー
プＩあるいはグループＩＩそれぞれに特異的な配列のプ
ライマーを用いるのではなく、同一の４種のプライマー
セットでグループＩ及びグループＩＩ両方の遺伝子を検
出する方法を見出した。この４種のプライマーはグルー
プＩ及びグループＩＩどちらの遺伝子にも良く保存され
た領域を選択しているが、検出率を上げるためグループ
ＩとグループＩＩで塩基配列の異なる部位ではミックス
プライマーを用いた。判定方法はアガロースゲル電気泳
動後、エチジウムブロマイド染色しＰＣＲ産物の長さで
判定するが、この長さの差は設定したプライマーの位置
に依存せず、ＨＣＶ遺伝子そのものの長さに依存してい
るために遺伝子の変異による誤判定は非常に少なくなる
と考えられる。
【００１０】従って、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのＲ
ＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅を介する該ウイルスのグルーピ
ングに使用するための下記に示すＰＣＲプライマーセッ
ト： 第１ＰＣＲ用センスプライマー（以下「ＧＦ１」と称す
る）： ５’−ＣＣＴＣＴＣＧＡＧＧＧ［ＡまたはＧ］ＧＡ［Ａ
またはＧ］ＣＣ［Ｇ，ＡまたはＴ］ＧＧ−３’、 第１ＰＣＲ用アンチセンスプライマー（以下「ＧＲ１」
と称する）： ５’−ＣＣＴＧＴＣＣＡＧＧ［ＡまたはＴ］［Ａまたは
Ｇ］ＴＡ［Ｇ，ＡまたはＴ］ＧＡＣＡＴ−３’、 第２ＰＣＲ用センスプライマー（以下「ＧＦ２」と称す
る）： ５’−ＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＧ［ＡまたはＧ］ＧＡ
［ＴまたはＣ］ＣＣ−３’、および 第２ＰＣＲ用アンチセンスプライマー（以下「ＧＲ２」
と称する）： ５’−ＧＡＧＴＡＴＧＡＣＡＴ［Ｇ，ＡまたはＴ］ＧＡ
ＧＣＡＧＣＡ−３’、を提供する。
ＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅を介する該ウイルスのグルーピ
ングに使用するための下記に示すＰＣＲプライマーセッ
ト： 第１ＰＣＲ用センスプライマー（以下「ＧＦ１」と称す
る）： ５’−ＣＣＴＣＴＣＧＡＧＧＧ［ＡまたはＧ］ＧＡ［Ａ
またはＧ］ＣＣ［Ｇ，ＡまたはＴ］ＧＧ−３’、 第１ＰＣＲ用アンチセンスプライマー（以下「ＧＲ１」
と称する）： ５’−ＣＣＴＧＴＣＣＡＧＧ［ＡまたはＴ］［Ａまたは
Ｇ］ＴＡ［Ｇ，ＡまたはＴ］ＧＡＣＡＴ−３’、 第２ＰＣＲ用センスプライマー（以下「ＧＦ２」と称す
る）： ５’−ＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＧ［ＡまたはＧ］ＧＡ
［ＴまたはＣ］ＣＣ−３’、および 第２ＰＣＲ用アンチセンスプライマー（以下「ＧＲ２」
と称する）： ５’−ＧＡＧＴＡＴＧＡＣＡＴ［Ｇ，ＡまたはＴ］ＧＡ
ＧＣＡＧＣＡ−３’、を提供する。
【００１１】本発明はさらに、上記定義のＰＣＲプライ
マーセットを用いるＣ型肝炎ウイルスのグルーピング方
法を提供する。この方法は、具体的には、該ウイルスを
含有すると思われる検体から該ウイルスのＲＮＡを露出
し、該ウイルスＲＮＡに、第１ＰＣＲ用アンチセンスプ
ライマーの存在下、逆転写酵素を作用して該ＲＮＡに対
するｃＤＮＡを合成し、その後、第１ＰＣＲ用センスプ
ライマーを作用させ、次いで第２ＰＣＲ用センス及びア
ンチセンスプライマーを作用させて該ＤＮＡを増幅し、
これを検出することを包含する。
マーセットを用いるＣ型肝炎ウイルスのグルーピング方
法を提供する。この方法は、具体的には、該ウイルスを
含有すると思われる検体から該ウイルスのＲＮＡを露出
し、該ウイルスＲＮＡに、第１ＰＣＲ用アンチセンスプ
ライマーの存在下、逆転写酵素を作用して該ＲＮＡに対
するｃＤＮＡを合成し、その後、第１ＰＣＲ用センスプ
ライマーを作用させ、次いで第２ＰＣＲ用センス及びア
ンチセンスプライマーを作用させて該ＤＮＡを増幅し、
これを検出することを包含する。
【００１２】本発明の方法においては、検出率をあげる
ためＨＣＶのＲＮＡ遺伝子上の長さの異なる領域で上記
のように２回のＰＣＲを行なうことが好ましい。
ためＨＣＶのＲＮＡ遺伝子上の長さの異なる領域で上記
のように２回のＰＣＲを行なうことが好ましい。
【００１３】以下に本発明の方法を説明する。
【００１４】ＨＣＶ ＲＮＡは蛋白変性剤であるグアニ
ジンチオシアネートあるいは蛋白質分解酵素であるプロ
ティナーゼＫなどを用いて血漿あるいは肝臓の組織など
から抽出可能である。また市販のＲＮＡ抽出キット、例
えばＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いてもよ
い。ＲＮＡ抽出後、フェノール／クロロホルム等で除蛋
白を行ないエタノール沈殿で濃縮する。これを適当なバ
ッファーあるいは水に溶解し、ＲＮＡサンプルとして用
いる。
ジンチオシアネートあるいは蛋白質分解酵素であるプロ
ティナーゼＫなどを用いて血漿あるいは肝臓の組織など
から抽出可能である。また市販のＲＮＡ抽出キット、例
えばＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いてもよ
い。ＲＮＡ抽出後、フェノール／クロロホルム等で除蛋
白を行ないエタノール沈殿で濃縮する。これを適当なバ
ッファーあるいは水に溶解し、ＲＮＡサンプルとして用
いる。
【００１５】ＲＮＡサンプルは常法に従いｃＤＮＡ合成
を行なう（Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．６０：２１５−２２２，１９９０）。ｄＮＴＰ、
ＲＮａｓｅ阻害剤、逆転写酵素、さらに第１ＰＣＲに用
いる２種のプライマーのうち、アンチセンスプライマー
を加えｃＤＮＡ合成を行なう。逆転写酵素はＡＭＶ−リ
バーストランスクリプターゼやＭＭＬＶ−リバーストラ
ンスクリプターゼを用いることができる。
を行なう（Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．６０：２１５−２２２，１９９０）。ｄＮＴＰ、
ＲＮａｓｅ阻害剤、逆転写酵素、さらに第１ＰＣＲに用
いる２種のプライマーのうち、アンチセンスプライマー
を加えｃＤＮＡ合成を行なう。逆転写酵素はＡＭＶ−リ
バーストランスクリプターゼやＭＭＬＶ−リバーストラ
ンスクリプターゼを用いることができる。
【００１６】次に遺伝子増幅反応（ＰＣＲ）を行なう。
ＰＣＲは２段階のＰＣＲを用いるが、まず合成されたｃ
ＤＮＡにＰＣＲバッファー、ｄＮＴＰ、１〜１００ｐｍ
ｏｌｅのセンスプライマーのみ、あるいはセンス、アン
チセンスプライマーを加え、１０〜５０サイクルの遺伝
子増幅反応を行なう。ＰＣＲのプロファイルは、例えば
ＤＮＡ変性９０〜９４℃、１５秒〜２分、アニーリング
３７〜６０℃、１５秒〜２分、伸長反応５０〜８０℃、
１５秒〜２分で行うことが可能である。次に第１ＰＣＲ
の産物の１／１０〜１／１０7 を用い第２ＰＣＲを行な
う。適当量の第１ＰＣＲ産物にＰＣＲバッファー、ｄＮ
ＴＰ第２ＰＣＲ用センス及びアンチセンスプライマーを
１〜１００ｐｍｏｌｅ程度加えＰＣＲ反応を行なう。Ｐ
ＣＲのプロファイルは第１ＰＣＲと同じでよい。
ＰＣＲは２段階のＰＣＲを用いるが、まず合成されたｃ
ＤＮＡにＰＣＲバッファー、ｄＮＴＰ、１〜１００ｐｍ
ｏｌｅのセンスプライマーのみ、あるいはセンス、アン
チセンスプライマーを加え、１０〜５０サイクルの遺伝
子増幅反応を行なう。ＰＣＲのプロファイルは、例えば
ＤＮＡ変性９０〜９４℃、１５秒〜２分、アニーリング
３７〜６０℃、１５秒〜２分、伸長反応５０〜８０℃、
１５秒〜２分で行うことが可能である。次に第１ＰＣＲ
の産物の１／１０〜１／１０7 を用い第２ＰＣＲを行な
う。適当量の第１ＰＣＲ産物にＰＣＲバッファー、ｄＮ
ＴＰ第２ＰＣＲ用センス及びアンチセンスプライマーを
１〜１００ｐｍｏｌｅ程度加えＰＣＲ反応を行なう。Ｐ
ＣＲのプロファイルは第１ＰＣＲと同じでよい。
【００１７】検出は、アガロースゲル電気泳動後、エチ
ジウムブロマイド染色しＰＣＲ産物の長さで判定するの
が便利である。
ジウムブロマイド染色しＰＣＲ産物の長さで判定するの
が便利である。
【００１８】
【実施例】本発明を、下記の実施例によりさらに詳しく
説明する。
説明する。
【００１９】実施例１ ＨＣＶ−ＲＮＡの抽出 血清１００μｌに６ＭのＧＴＣ溶液（６Ｍグアニジンチ
オシアネート、３７．５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．
７５％ザルコシル、０．２Ｍメルカプトエタノール）４
００μｌと酵母ｔＲＮＡ（ベーリンガーマンハイム・ヤ
マノウチ社、１０ｍｇ／ｍｌ）を１μｌ加え撹拌する。
さらに３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）２７μｌ、Ｔ
Ｅ飽和フェノール（ｐＨ７．５）４００μｌ、クロロホ
ルム／イソアミルアルコール（４９：１）８０μｌを加
え、１０秒間撹拌した後、氷中に１５分間静置する。微
量高速冷却遠心機（ＴＯＭＹ ＭＲ１５０）で１５００
０ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心する。水溶液層を３５
０μｌ分取し、これにイソプロピルアルコールを等量加
え、−２０℃で１時間以上置く。
オシアネート、３７．５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．
７５％ザルコシル、０．２Ｍメルカプトエタノール）４
００μｌと酵母ｔＲＮＡ（ベーリンガーマンハイム・ヤ
マノウチ社、１０ｍｇ／ｍｌ）を１μｌ加え撹拌する。
さらに３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）２７μｌ、Ｔ
Ｅ飽和フェノール（ｐＨ７．５）４００μｌ、クロロホ
ルム／イソアミルアルコール（４９：１）８０μｌを加
え、１０秒間撹拌した後、氷中に１５分間静置する。微
量高速冷却遠心機（ＴＯＭＹ ＭＲ１５０）で１５００
０ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心する。水溶液層を３５
０μｌ分取し、これにイソプロピルアルコールを等量加
え、−２０℃で１時間以上置く。
【００２０】これを１５０００ｒｐｍ、２０分間、４℃
で遠心し、沈殿させる。さらに沈殿物を４Ｍ ＧＴＣ溶
液（６Ｍ ＧＴＣ溶液を滅菌水で希釈したもの）１００
μｌに再溶解し、１００μｌのイソプロパノールを加え
−２０℃で１時間以上静置する。その後、遠心機で１５
０００ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心し、沈殿物を得
る。７０％エタノール１ｍｌで２回洗浄後、室温で風乾
し、１０μｌの滅菌水に溶解し、ＲＮＡとして使用し
た。
で遠心し、沈殿させる。さらに沈殿物を４Ｍ ＧＴＣ溶
液（６Ｍ ＧＴＣ溶液を滅菌水で希釈したもの）１００
μｌに再溶解し、１００μｌのイソプロパノールを加え
−２０℃で１時間以上静置する。その後、遠心機で１５
０００ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心し、沈殿物を得
る。７０％エタノール１ｍｌで２回洗浄後、室温で風乾
し、１０μｌの滅菌水に溶解し、ＲＮＡとして使用し
た。
【００２１】ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲによる遺伝子増幅 ｃＤＮＡ合成は常法に従い、ＲＮＡ１０μｌをシリコン
処理を行なったチューブ（０．５ｍｌ）に分注後、７０
℃、３分間加熱し、氷上で急冷する。次にＲＮａｓｅイ
ンヒビター（宝酒造）０．２５μｌ（２００単位／μ
ｌ）、ｄＮＴＰ（各２ｍＭ）２μｌ、１０×ＰＣＲバッ
ファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５
００ｍＭ ＫＣｌ）２μｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2
０．５μｌ、４０ｍＭ ＤＴＴ ０．５μｌ、第１ＰＣ
Ｒ用アンチセンスプライマー（ＧＲ２）２５ｐｍｏｌ
ｅ、逆転写酵素（生化学工業）０．４μｌ（２４単位／
μｌ）を加え、滅菌水で２０μｌにする。４２℃で１時
間保持し、酵素を失活させるために９５℃で５分間加熱
する。このｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった。第１Ｐ
ＣＲとしてｃＤＮＡ溶液２０μｌに１０×ＰＣＲバッフ
ァー８μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ８μｌ、第１ＰＣＲ用
センスプライマー（ＧＦ１）２５ｐｍｏｌｅ、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム・ヤマノ
ウチ社製、５単位／μｌ）を加え、滅菌水で１００μｌ
にする。これにミネラルオイル（シグマ社）を２滴重層
し、撹拌後軽く遠心する。ＰＣＲ反応は、パーキンエル
マーシータス社のＤＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅ
ｒを用いて行なった。反応のプロファイルはＤＮＡ変性
９４℃、１．５分、アニーリング５０℃１．５分、伸長
反応７２℃、１．５分で３５サイクルとした。終了後７
２℃で１０分間保持し、４℃に冷却した。この第１ＰＣ
Ｒ産物中の５μｌを、ＰＣＲ用チューブ（０．５ｍｌ）
に分取し、１０×ＰＣＲバッファー９μｌ、第２ＰＣＲ
用センス及びアンチセンスプライマー各２５ｐｍｏｌ
ｅ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ９μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼ（ベーリンガーマンハイム・ヤマノウチ社製、５
単位／μｌ）を０．５μｌ加え、滅菌水で１００μｌに
する。これにミネラルオイルを重層し、撹拌後、軽く遠
心する。ＰＣＲ反応は第１ＰＣＲの反応条件として同様
の方法で行なった。
処理を行なったチューブ（０．５ｍｌ）に分注後、７０
℃、３分間加熱し、氷上で急冷する。次にＲＮａｓｅイ
ンヒビター（宝酒造）０．２５μｌ（２００単位／μ
ｌ）、ｄＮＴＰ（各２ｍＭ）２μｌ、１０×ＰＣＲバッ
ファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５
００ｍＭ ＫＣｌ）２μｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2
０．５μｌ、４０ｍＭ ＤＴＴ ０．５μｌ、第１ＰＣ
Ｒ用アンチセンスプライマー（ＧＲ２）２５ｐｍｏｌ
ｅ、逆転写酵素（生化学工業）０．４μｌ（２４単位／
μｌ）を加え、滅菌水で２０μｌにする。４２℃で１時
間保持し、酵素を失活させるために９５℃で５分間加熱
する。このｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった。第１Ｐ
ＣＲとしてｃＤＮＡ溶液２０μｌに１０×ＰＣＲバッフ
ァー８μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ８μｌ、第１ＰＣＲ用
センスプライマー（ＧＦ１）２５ｐｍｏｌｅ、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム・ヤマノ
ウチ社製、５単位／μｌ）を加え、滅菌水で１００μｌ
にする。これにミネラルオイル（シグマ社）を２滴重層
し、撹拌後軽く遠心する。ＰＣＲ反応は、パーキンエル
マーシータス社のＤＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅ
ｒを用いて行なった。反応のプロファイルはＤＮＡ変性
９４℃、１．５分、アニーリング５０℃１．５分、伸長
反応７２℃、１．５分で３５サイクルとした。終了後７
２℃で１０分間保持し、４℃に冷却した。この第１ＰＣ
Ｒ産物中の５μｌを、ＰＣＲ用チューブ（０．５ｍｌ）
に分取し、１０×ＰＣＲバッファー９μｌ、第２ＰＣＲ
用センス及びアンチセンスプライマー各２５ｐｍｏｌ
ｅ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ９μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼ（ベーリンガーマンハイム・ヤマノウチ社製、５
単位／μｌ）を０．５μｌ加え、滅菌水で１００μｌに
する。これにミネラルオイルを重層し、撹拌後、軽く遠
心する。ＰＣＲ反応は第１ＰＣＲの反応条件として同様
の方法で行なった。
【００２２】第２ＰＣＲ反応の終了したＰＣＲ産物は、
電気泳動でサイズを確認する。電気泳動はＮｕｓｌｅｖ
ｅ ３：１（宝酒造）のアガロースゲル４％を用いて行
なった。ＰＣＲ産物１０μｌに５×染料［０．２５％ブ
ロモフェノールブルー、０．２５％キシレン・シアノー
ルＦＦ、４０％グリセロール］を２．５μｌ加え、Ｍｕ
ｐｉｄ電気泳動槽１００Ｖで約３０分間泳動する。泳動
終了後、エチジウムブロマイドで染色し、ＵＶライト下
でバンドの検出を行った。グループＩのＨＣＶＲＮＡの
場合、９７〜１００ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。グル
ープＩＩのＨＣＶ ＲＮＡの場合、１５４ｂｐのＰＣＲ
産物が得られる。図２にグループＩのＨＣＶのＰＣＲ産
物２検体（レーン１と２）及びグループＩＩのＰＣＲ産
物２検体（レーン３と４）の分析結果を示す。図から、
本発明方法によりＨＣＶのグループＩとグループＩＩを
明瞭に且つ正確に識別できることが分かる。
電気泳動でサイズを確認する。電気泳動はＮｕｓｌｅｖ
ｅ ３：１（宝酒造）のアガロースゲル４％を用いて行
なった。ＰＣＲ産物１０μｌに５×染料［０．２５％ブ
ロモフェノールブルー、０．２５％キシレン・シアノー
ルＦＦ、４０％グリセロール］を２．５μｌ加え、Ｍｕ
ｐｉｄ電気泳動槽１００Ｖで約３０分間泳動する。泳動
終了後、エチジウムブロマイドで染色し、ＵＶライト下
でバンドの検出を行った。グループＩのＨＣＶＲＮＡの
場合、９７〜１００ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。グル
ープＩＩのＨＣＶ ＲＮＡの場合、１５４ｂｐのＰＣＲ
産物が得られる。図２にグループＩのＨＣＶのＰＣＲ産
物２検体（レーン１と２）及びグループＩＩのＰＣＲ産
物２検体（レーン３と４）の分析結果を示す。図から、
本発明方法によりＨＣＶのグループＩとグループＩＩを
明瞭に且つ正確に識別できることが分かる。
【００２３】実施例２ Ｃ型慢性肝炎患者のＰＣＲ法による分類とインターフェ
ロン（ＩＦＮ）治療効果の相関 実施例１のプロトコールに従って、ＩＦＮ治療を行な
い、その効果が判定された検体についてＮＳ５（ＨＣＶ
の非構造領域５）のプライマーを用い型分類（タイピン
グ）を行なった。実施した検体は２７検体でＩＦＮ治療
効果は著効（ＩＦＮ治療終了後ＡＬＴ値の正常化が持続
した症例）１０例、一過性（ＩＦＮ治療開始後ＡＬＴ値
が治療前値の５０％以下に低下したが、その後の観察で
再上昇をきたした症例）８例、無効（ＩＦＮ治療開始後
ＡＬＴ値の低下が５０％未満であった症例）９例であ
る。
ロン（ＩＦＮ）治療効果の相関 実施例１のプロトコールに従って、ＩＦＮ治療を行な
い、その効果が判定された検体についてＮＳ５（ＨＣＶ
の非構造領域５）のプライマーを用い型分類（タイピン
グ）を行なった。実施した検体は２７検体でＩＦＮ治療
効果は著効（ＩＦＮ治療終了後ＡＬＴ値の正常化が持続
した症例）１０例、一過性（ＩＦＮ治療開始後ＡＬＴ値
が治療前値の５０％以下に低下したが、その後の観察で
再上昇をきたした症例）８例、無効（ＩＦＮ治療開始後
ＡＬＴ値の低下が５０％未満であった症例）９例であ
る。
【００２４】表１に型分類の結果を示す。対照として岡
本ら（Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７
３：６７３−６７９（１９９２））のＣＯＲＥのプライ
マーを用いた型分類の結果を併記する。タイピングは岡
本らの方法に従った。なお、５’ＵＴＲの欄は、ＨＣＶ
の５’ＵＴＲ領域（５’非翻訳領域）に設定したプライ
マーを用いたＰＣＲの結果を示したものであり、このプ
ライマーによりグループ、タイプに拘らずほとんど全て
のＨＣＶが検出される。
本ら（Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７
３：６７３−６７９（１９９２））のＣＯＲＥのプライ
マーを用いた型分類の結果を併記する。タイピングは岡
本らの方法に従った。なお、５’ＵＴＲの欄は、ＨＣＶ
の５’ＵＴＲ領域（５’非翻訳領域）に設定したプライ
マーを用いたＰＣＲの結果を示したものであり、このプ
ライマーによりグループ、タイプに拘らずほとんど全て
のＨＣＶが検出される。
【００２５】
【表１】 ＮＳ５によるグルーピングの結果２５検体が分類可能で
あり、ＣＯＲＥのプライマーによって分類可能であった
２２検体と比較すると判定率は高かった。また分類可能
であった２５検体中Ｉ型は１７検体、ＩＩ型は８検体で
あり、Ｉ型１７検体中著効は２例（１１％）、ＩＩ型８
検体中著効が７例（８７．５％）であり、ＩＩ型に対す
る著効率が高いことがわかった。ＮＳ５のプライマーを
用いた型分類（グルーピング）はＩＦＮ治療の目安とし
て有効であることを示している。
あり、ＣＯＲＥのプライマーによって分類可能であった
２２検体と比較すると判定率は高かった。また分類可能
であった２５検体中Ｉ型は１７検体、ＩＩ型は８検体で
あり、Ｉ型１７検体中著効は２例（１１％）、ＩＩ型８
検体中著効が７例（８７．５％）であり、ＩＩ型に対す
る著効率が高いことがわかった。ＮＳ５のプライマーを
用いた型分類（グルーピング）はＩＦＮ治療の目安とし
て有効であることを示している。
【００２６】
【発明の効果】Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型の分類法に
おいて、誤判定が少なく且つ該ウイルス遺伝子の検出率
が高い、という利点をもつため、インターフェロン（Ｉ
ＦＮ）治療の実施判定に有効に使用し得る。
おいて、誤判定が少なく且つ該ウイルス遺伝子の検出率
が高い、という利点をもつため、インターフェロン（Ｉ
ＦＮ）治療の実施判定に有効に使用し得る。
【図１】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の各グループと各
タイプの系統樹を示す。
タイプの系統樹を示す。
【図２】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）後のＰＣＲ産
物のサイズを電気泳動的に分析した結果を示す写真であ
る。レーンＭはマーカーであり、レーン１と２はグルー
プＩのＨＣＶのＰＣＲ産物であり、また、レーン３と４
はグループＩＩのＨＣＶのＰＣＲ産物である。
物のサイズを電気泳動的に分析した結果を示す写真であ
る。レーンＭはマーカーであり、レーン１と２はグルー
プＩのＨＣＶのＰＣＲ産物であり、また、レーン３と４
はグループＩＩのＨＣＶのＰＣＲ産物である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 槙 昇 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡一丁目３番 １号 東燃株式会社 総合研究所内 (72)発明者 山口 健次郎 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡一丁目３番 １号 東燃株式会社 総合研究所内 (56)参考文献 特開 平５−176773（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−301887（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−337000（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．170, Ｎｏ．３（1990）ｐ．1021−1025 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．188，Ｎ ｏ．１（1992，Ｍａｙ）ｐ．331−341 Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ. 72，Ｐｔ．９（1991）ｐ．2105−2112 Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ，Ｖｏｌ. ５，Ｎｏ．３（1991）ｐ．243−254 臨床病理，Ｖｏｌ．39，Ｎｏ．12 （1991）ｐ．1291−1297 肝臓，Ｖｏｌ．33，Ｎｏ．10（1992. Ｏｃｔ．）ｐ．805−806 肝臓，Ｖｏｌ．33，Ｎｏ．６（1992. Ｊｕｎ．）ｐ．500−501 肝臓，Ｖｏｌ．33，Ｓｕｐｐｌ. （1992．Ｍａｙ）ｐ．84 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (2)
- 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡ遺伝子のポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を介する該ウイルスの
グルーピングに使用するための下記に示すＰＣＲプライ
マーセット。 第１ＰＣＲ用センスプライマー： ５’ＣＣＴＣＴＣＧＡＧＧＧ［ＡまたはＧ］ＧＡ［Ａま
たはＧ］ＣＣ［Ｇ、ＡまたはＴ］ＧＧ−３’、 第１ＰＣＲ用アンチセンスプライマー： ５’−ＣＣＴＧＴＣＣＡＧＧ［ＡまたはＴ］［Ａまたは
Ｇ］ＴＡ［Ｇ、ＡまたはＴ］ＧＡＣＡＴ−３’、 第２ＰＣＲ用センスプライマー： ５’−ＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＧ［ＡまたはＧ］ＧＡ
［ＴまたはＣ］ＣＣ−３’、および 第２ＰＣＲ用アンチセンスプライマー： ５’−ＧＡＧＴＡＴＧＡＣＡＴ［Ｇ、ＡまたはＴ］ＧＡ
ＧＣＡＧＣＡ−３’。 - 【請求項２】 Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピング方法で
あって、該ウイルスを含有すると思われる検体から該ウ
イルスのＲＮＡを露出し、該ウイルスＲＮＡに、第１Ｐ
ＣＲ用アンチセンスプライマーの存在下、逆転写酵素を
作用して該ＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成し、その後、
第１ＰＣＲ用センスプライマーを作用させ、次いで第２
ＰＣＲ用センス及びアンチセンスプライマーを作用させ
て該ＤＮＡを増幅し、これを検出することを包含し、第
１及び第２ＰＣＲ用センス及びアンチセンスプライマー
が請求項１に定義されるＰＣＲプライマーセットであ
る、ことを特徴とする方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35916092A JP3347785B2 (ja) | 1992-12-25 | 1992-12-25 | Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピング用ｐｃｒプライマーセット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35916092A JP3347785B2 (ja) | 1992-12-25 | 1992-12-25 | Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピング用ｐｃｒプライマーセット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06237799A JPH06237799A (ja) | 1994-08-30 |
| JP3347785B2 true JP3347785B2 (ja) | 2002-11-20 |
Family
ID=18463059
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35916092A Expired - Fee Related JP3347785B2 (ja) | 1992-12-25 | 1992-12-25 | Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピング用ｐｃｒプライマーセット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3347785B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5216721B2 (ja) * | 1995-02-01 | 2013-06-19 | 株式会社エスアールエル | Ｃ型肝炎ウイルスのジェノタイプの判別方法 |
-
1992
- 1992-12-25 JP JP35916092A patent/JP3347785B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．１７０，Ｎｏ．３（１９９０）ｐ．１０２１−１０２５ |
| Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７２，Ｐｔ．９（１９９１）ｐ．２１０５−２１１２ |
| Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８８，Ｎｏ．１（１９９２，Ｍａｙ）ｐ．３３１−３４１ |
| Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．３（１９９１）ｐ．２４３−２５４ |
| 肝臓，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．１０（１９９２．Ｏｃｔ．）ｐ．８０５−８０６ |
| 肝臓，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．６（１９９２．Ｊｕｎ．）ｐ．５００−５０１ |
| 肝臓，Ｖｏｌ．３３，Ｓｕｐｐｌ．（１９９２．Ｍａｙ）ｐ．８４ |
| 臨床病理，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．１２（１９９１）ｐ．１２９１−１２９７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06237799A (ja) | 1994-08-30 |
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