JPH06292600A - Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピング用ｐｃｒプライマーセットおよびそれを用いるグルーピング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のグループＩ又
はＩＩのグルーピングに使用するためのＰＣＲプライマ
ー、およびこれを使用するＨＣＶのグルーピング方法。 【効果】 ＨＣＶの遺伝子型の分類法において、誤判定
が少なく且つＨＣＶ遺伝子の検出率が高い、という利点
をもつため、インターフェロン治療の実施判定に有効に
使用し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのグ
ループＩ又はＩＩのグルーピングに使用するためのポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー、及び、このプ
ライマーを用いるＣ型肝炎ウイルスのグルーピング方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｃ型肝炎ウイルス（または「ＨＣＶ」と
も称する）の遺伝子が発見され、その遺伝子の発現産物
を用いた抗体検出系の開発によりＨＣＶ感染の診断が可
能になった。現在、ＨＣＶ感染の診断は主に抗体検出系
により行なわれているが、ウイルス蛋白自体を検出する
有効な抗原検出系は開発されていない。これはＨＣＶの
場合血中のウイルス量が少ないために通常のＥＩＡ法や
ＲＩＡ法ではウイルス抗原の検出が難しいためである。
そのため抗原検出系に替わる方法としてＰＣＲ法により
ＨＣＶ遺伝子を検出する方法が使用されている。ＰＣＲ
法は理論上は１コピーの遺伝子でも検出可能なのでＨＣ
Ｖのように微量のウイルスしか存在しない場合でも検出
が可能となる。

【０００３】最近、ＨＣＶによる慢性肝炎の治療にイン
ターフェロン（ＩＦＮ）が有効であることが示されて来
ている。しかしながら、ＩＦＮが有効な症例は、慢性肝
炎の３０％〜４０％程度であり効果のあるものとないも
のが見られる。この有効性の差はＨＣＶの遺伝子型の差
（Ｙｏｓｈｉｏｋａら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１６：
２９３−２９９，１９９２；Ｋａｎａｉら、ＬＡＮＣＥ
Ｔ，３３９：１５４３，１９９２）と考えられている。
このため、ＨＣＶ遺伝子を分類することがＩＦＮ治療の
指針として有用である可能性が大であり注目されてい
る。

【０００４】Ｃ型肝炎ウイルスはその塩基配列あるいは
アミノ酸配列からタイプ１からタイプ４の４つに分類す
るタイピング法（Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉ
ｒｏｌ，７３：６７３−６７９，１９９２；Ｅｎｏｍｏ
ｔｏ Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．ｃｏｍ．１７０（３）：１０２１−１０２５，１９
９０）と、タイプ１とタイプ２をグループＩ、タイプ３
とタイプ４をグループＩＩとするグルーピング法（本出
願人が平成４年１０月３０日に出願した特願平４−３１
６６３４号及び特願平４−３１６６３５号）とが提唱さ
れている。図１に各タイプと各グループの系統樹を示し
ているが、グループＩとグループＩＩの間の塩基配列の
相同性は７０〜７５％程度しかなく、塩基配列の上から
もかなり異なるウイルスと考えられるのに対し、グルー
プＩの中のタイプ１とタイプ２間及びグループＩＩの中
のタイプ３とタイプ４間の塩基配列の相同性はそれぞれ
８５〜８８％及び８０〜９０％でありタイプ１とタイプ
２、タイプ３とタイプ４のウイルスはかなり近いウイル
スではないかと考えられる。またタイプ１〜４のウイル
スは血清学的に４つに分類する方法はまだ確立されてい
ないが、グループＩとグループＩＩは血清学的にも分類
可能であり（本出願人による特願平４−３１６６３４号
及び特願平４−３１６６３５号；Ｍａｃｈｉｄａら、Ｈ
ｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１６：８８６−８９１）、血清学
的にもグループＩとＩＩの間にかなりの隔たりがあると
考えられる。

【０００５】現在、ＨＣＶのタイピングまたはグルーピ
ングを行なう場合、分類基準がその塩基配列あるいはア
ミノ酸配列に拠っているために、ＨＣＶ遺伝子をクロー
ニングし、クローニングした遺伝子の核酸配列を決定
し、核酸あるいはアミノ酸配列の相同性を検索し、分類
する方法が最も確実な方法である。しかしながら、この
方法は時間も費用も掛り煩雑である。これに替わる方法
として岡本ら（上掲）はＨＣＶのＣＯＲＥ領域に相当す
るプライマーを用いＰＣＲ法により４つのタイプに分類
する方法を開発した。この方法は、各タイプに共通なセ
ンス及びアンチセンスプライマーを用い第一段階目のＰ
ＣＲを行ない、つぎに第２ＰＣＲで第１ＰＣＲで増幅さ
れた領域の内側に設定した各タイプに共通なセンスプラ
イマーと各タイプのそれぞれ異なる位置に設定したタイ
プ特異的な４種のアンチセンスプライマーを用いＰＣＲ
を行なう方法である。また槙ら（特願平４−３５９１６
０号）はＨＣＶのＮＳ５領域に相当する４本のプライマ
ーを用いＰＣＲ法によりグループＩとグループＩＩに分
類する方法を開発した。この方法はＨＣＶのグループＩ
とグループＩＩのウイルス遺伝子の長さが異なる領域に
着目し、この長さの異なる領域であるＮＳ５の領域をは
さみこむようにプライマーを設定し、４本のプライマー
でグルーピングを可能にした方法である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ＨＣＶ分類のため、従
来行なわれてきた核酸配列を決定し分類する方法は、時
間や手間がかかるため大量の検体を処理することは不可
能である。一方、岡本ら（上掲）のＣＯＲＥ領域のプラ
イマーを用いたＰＣＲによるタイピングは簡便ではある
がつぎのような問題点がある。すなわち、ＨＣＶはＲＮ
Ａウイルスであるために変異が起こりやすい。岡本ら
は、第２ＰＣＲに用いるアンチセンスプライマーは各タ
イプに良く保存された領域のプライマーを選択している
が、各タイプに特異的な４種のプライマーはＨＣＶ遺伝
子上の異なる位置に設定されているために変異の起きか
たによっては全く同じウイルスでも二本のＰＣＲ産物が
検出されたりあるいは判定不能になる可能性がある。実
際にこのＣＯＲＥのプライマーを用いた分類では分類不
能であった例が２４．１％あるいは１２〜２０％あると
報告されている（第３９回日本臨床病理学会総会講演要
旨集（１９９２年）、第１８６頁の演題２６０；第２７
回日本肝臓学会西部会講演要旨集（１９９２年）、第５
０頁の一般演題１３；Ｍｏｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．１８３：３３２−３４
２，１９９２）。一方、槙らのＮＳ５のプライマーを用
いたグルーピング法は判定率の点で岡本らのＣＯＲＥの
領域プライマーよりもすぐれているが、この方法を用い
てもすべてのＨＣＶ ＲＮＡ陽性の検体を判別できるわ
けではない。

【０００７】このような状況下、本出願人は、ＰＣＲ−
ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism
）法によるＨＣＶの遺伝子型の分類法を検討し、ＨＣ
Ｖ遺伝子の５’ＵＴＲ配列上にＨＣＶのグループＩとグ
ループＩＩを識別する各々に特異的なヌクレオチド配列
が存在することを見出した。

【０００８】したがって、本発明の第１の目的は、ＨＣ
ＶのグループＩおよびＩＩのグルーピングに使用するた
めのＰＣＲプライマーを提供することである。

【０００９】本発明の第２の目的は、該ＰＣＲプライマ
ーを用いるＨＣＶのグルーピング方法を提供することで
ある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】一般的にＰＣＲ−ＳＳＣ
Ｐ法（Ｏｒｉｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２７６６−２７７０，１９８
９）は、遺伝子の変異が一塩基でもあれば検出可能であ
る。そのためＲＮＡウイルスのように変異が起こりやす
い遺伝子を分類する場合には、ＰＣＲで増幅される領域
の中に一塩基でも変異が起きると電気泳動後の移動度に
差が出てしまい分類が不可能になる可能性がある。Ｃ型
肝炎ウイルス（ＨＣＶ）はＲＮＡウイルスであるためこ
のような問題が起こる可能性がある。そこで、本出願人
はＰＣＲで増幅する領域を選択するポイントとして、
（ｉ）変異が起こりにくい領域であること、及び（ii）
グループＩとグループＩＩでは必ず異なる塩基配列（塩
基配列の違いは一塩基以上であれば構わない）を含む領
域であることに着目した。

【００１１】（ｉ）と（ii）の条件にあてはまるような
領域を探した結果、ＨＣＶ５’ＵＴＲの前半部分に適当
な領域を見い出した。すなわち、図２に示した種々のＨ
ＣＶ５’ＵＴＲ塩基配列中ＨＣＪ６（II）のヌクレオチ
ド番号１０７とヌクレオチド番号１１９の配列がグルー
プ内でよく保存されており１０７番目はグループＩで
Ｇ，グループＩＩでＡ，１１９番目がグループＩでＡ，
グループＩＩでＣとなっており、グループ内でよく保存
されている。またこの領域の前後はグループＩでもグル
ープＩＩでも全く同じ配列であり、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法
でのグルーピングに非常に適した領域だと考えられる。

【００１２】したがって、本発明は、配列番号１に示さ
れるヌクレオチド番号２９〜９７の配列中に存在する少
なくとも１０マーのヌクレオチド配列を有するセンスプ
ライマーと、配列番号１に示されるヌクレオチド番号１
１１〜１６６の配列中に存在する少なくとも１０マーの
ヌクレオチド配列に相補的で且つ逆向きの配列を有する
アンチセンスプライマーとを含む、Ｃ型肝炎ウイルスの
グループＩ及びＩＩを識別するためのＰＣＲプライマー
セットを提供する。

【００１３】この場合、上記定義のセンス及びアンチセ
ンスプライマーを用いたＰＣＲ産物を、後述のＳＳＣＰ
法で分析し、グループを分類するが、１段階のＰＣＲで
分析可能な量までＰＣＲが増幅された場合は、上記定義
のセンス及びアンチセンスプライマーでのＰＣＲ産物を
用い分析を行なう。

【００１４】しかしながら、１段階のＰＣＲで分析可能
な量までＰＣＲ産物が増幅されない場合は、上記定義の
プライマーは２段階目のＰＣＲのプライマーとして用
い、この２段階目のＰＣＲ産物をＳＳＣＰ法での解析に
用いることとなる。この場合第１段階目のＰＣＲは他の
プライマーを用いて予め第２段階目のＰＣＲで増幅され
る領域を含む遺伝子を一定量まで増幅させなければなら
ない。この第１段階目のＰＣＲで用いる他のプライマー
とは、第１センスプライマーは、第２段階目のＰＣＲで
用いる選択したセンスプライマー配列の５’側に位置す
るプライマーで第２アンチセンスプライマーは第２段階
目のＰＣＲで用いる選択したアンチセンスプライマー配
列の３’側に位置するプライマーであり、第１と第２の
プライマーはある程度重なっていてもよい。また、第１
ＰＣＲに用いるプライマーはグループＩとグループＩＩ
の間で全く同じ配列の場所を選ぶ必要はなく、ＰＣＲで
の増幅が可能な領域であればかまわない。

【００１５】下記にプライマーセットの非限定的具体例
を示す。

【００１６】第１ＰＣＲ： センスプライマー（ＹＯＣ−３）： ５’−ＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧＡＴＣＡＣＴＣ−
３’、 アンチセンスプライマー（ＹＯＣ−４）： ５’−ＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡ−
３’、 第２ＰＣＲ： センスプライマー（ＹＯＣ−１）： ５’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−
３’、 アンチセンスプライマー（ＹＯＣ−２）： ５’−ＡＡＴＴＣＣＧＧＴＧＴＡＣＴＣＡＣＣＧＧ−
３’。

【００１７】ここで、ＹＯＣ−１およびＹＯＣ−３はそ
れぞれ配列番号１中ヌクレオチド番号５４〜７３および
ヌクレオチド番号１４〜３３の配列に対応し、また、Ｙ
ＯＣ−２およびＹＯＣ−４はそれぞれヌクレオチド番号
１４７〜１６６およびヌクレオチド番号２８５〜３０４
の配列と相補的で且つ逆向きの配列に対応している。

【００１８】プライマーのサイズは、ＰＣＲのアニーリ
ング段階の温度及び検出特異性に依存して変化させ得る
が、好ましくは少なくとも１０マー、より好ましくは１
５〜３０マーである。しかし、１０マー未満のプライマ
ーサイズも使用可能である。本発明のプライマー類は、
当業者に公知の手法、特にＤＮＡシンセサイザー法で合
成し得る。

【００１９】本発明はさらに、上記定義のＰＣＲプライ
マーを用いるＣ型肝炎ウイルスのグループＩ又はＩＩの
グルーピング方法を提供する。

【００２０】この方法は、具体的には、該ウイルスを含
有すると思われる検体から該ウイルス由来のＲＮＡを露
出し、該ウイルスＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成し、グ
ループＩ又はＩＩを特異的に識別可能にするための上記
定義のプライマーセットを用いてＰＣＲを行なうことに
より該ＤＮＡを増幅し、これをＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によ
って検出して該ウイルスのグループＩ又はＩＩを識別す
ることを包含する。

【００２１】本方法で使用するＰＣＲ−ＳＳＣＰ法は１
本鎖のＤＮＡが塩基配列に基づいて形成する高次構造の
違いを電気泳動の差として検出するものであり、全く同
じ長さの１本鎖ＤＮＡでもその中の１塩基が異なるだけ
で高次構造が変化し、電気泳動を行なうとその移動度に
差が生じることを利用している。このＳＳＣＰ法とＰＣ
Ｒ法を組み合わせることにより微量の試料からでも容易
に塩基配列の違い、特に１塩基の違いまでを検出するこ
とが可能である。このため、本発明においては、ＨＣＶ
のグルーピングを行なうためにＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を用
いるのが好適である。

【００２２】以下に本発明の方法を説明する。

【００２３】ＨＣＶ ＲＮＡは蛋白変性剤であるグアニ
ジンチオシアネートあるいは蛋白質分解酵素であるプロ
ティナーゼＫなどを用いて血漿あるいは肝臓の組織など
から抽出可能である。また市販のＲＮＡ抽出キット、例
えばＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いてもよ
い。ＲＮＡ抽出後、フェノール／クロロホルム等で除蛋
白を行ないエタノール沈殿で濃縮する。これを適当なバ
ッファーあるいは水に溶解し、ＲＮＡサンプルとして用
いる。

【００２４】ＲＮＡサンプルは常法に従いｃＤＮＡ合成
を行なう（Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．６０：２１５−２２２，１９９０）。ｄＮＴＰ、
ＲＮａｓｅ阻害剤、逆転写酵素、さらに第１ＰＣＲに用
いる２種のプライマーのうち、アンチセンスプライマー
を加えｃＤＮＡ合成を行なう。逆転写酵素はＡＭＶ−リ
バーストランスクリプターゼやＭＭＬＶ−リバーストラ
ンスクリプターゼを用いることができる。

【００２５】次に遺伝子増幅反応（ＰＣＲ）を行なう。
ＰＣＲは１段階又は２段階のＰＣＲを用い得るが、ＨＣ
Ｖ遺伝子の場合特に増幅率を高める必要があるため２段
階ＰＣＲ法が好ましい。２段階ＰＣＲ法では、まず合成
されたｃＤＮＡにＰＣＲバッファー、ｄＮＴＰ、１〜１
００ｐｍｏｌｅのセンスプライマーのみ、あるいはセン
ス、アンチセンスプライマーを加え、１０〜５０サイク
ルの第１ＰＣＲを行なう。ＰＣＲのプロファイルは、例
えばＤＮＡ変性９０〜９４℃、１５秒〜２分、アニーリ
ング３７〜６０℃、１５秒〜２分、伸長反応５０〜８０
℃、１５秒〜２分で行なうことが可能である。次に第１
ＰＣＲの産物の１／１０〜１／１０⁷ を用い第２ＰＣＲ
を行なう。適当量の第１ＰＣＲ産物にＰＣＲバッファ
ー、ｄＮＴＰ第２ＰＣＲ用センス及びアンチセンスプラ
イマーを１〜１００ｐｍｏｌｅ程度加えＰＣＲ反応を行
なう。ＰＣＲのプロファイルは第１ＰＣＲと同じでよ
い。

【００２６】第１又は第２ＰＣＲ用センスもしくはアン
チセンスプライマーは、上記定義のＨＣＶグループＩ又
はＩＩのグルーピング用プライマーから任意に選択され
る。

【００２７】ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法に基づ
いてアクリルアミドゲルで電気泳動し移動度の差により
グループの違いを検出する。泳動に先立ち、適当量のＰ
ＣＲ産物にホルムアミド、ＥＤＴＡ，色素（ブロムフェ
ノールブルー、キシレンシアノール）を加え８０℃〜１
００℃で数分処理し、ＤＮＡ断片を１本鎖にする。泳動
には尿素等の変性剤を含まない架橋度の低い総濃度５〜
６％程度のアクリルアミドゲルを使用する。ゲルにはグ
リセリンを加えてもよい。泳動する場合、ＤＮＡの微妙
な構造の差を検出するため移動度に大きな影響を及ぼす
温度の設定は重要であり、泳動中は温度を一定に保つよ
うにする。このためには恒温の電気泳動槽を用いればよ
い。しかしながら、電圧を掛けすぎないようにし、温度
を一定に保てるような条件を設定できれる場合には、恒
温の電気泳動槽を使用しなくても検出は可能である。電
気泳動後、ＤＮＡのバンドを検出するため銀染色を行な
う。このような方法でグループＩとグループＩＩの遺伝
子の判定が可能である。

【００２８】

【実施例】本発明を、下記の実施例によりさらに詳しく
説明する。

【００２９】実施例１ Ｃ型肝炎患者血清からの全ＲＮＡの抽出 血清１００μｌに６ＭのＧＴＣ溶液（６Ｍグアニジンチ
オシアネート、３７．５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．
７５％ザルコシル、０．２Ｍメルカプトエタノール）４
００μｌと酵母ｔＲＮＡ（ベーリンガーマンハイム・ヤ
マノウチ社、１０ｍｇ／ｍｌ）を１μｌ加え撹拌する。
さらに３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）２７μｌ、Ｔ
Ｅ飽和フェノール（ｐＨ７．５）４００μｌ、クロロホ
ルム／イソアミルアルコール（４９：１）８０μｌを加
え、１０秒間撹拌した後、氷中に１５分間静置する。微
量高速冷却遠心機（ＴＯＭＹ ＭＲ１５０）で１５００
０ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心する。水溶液層を３５
０μｌ分取し、これにイソプロピルアルコールを等量加
え、−２０℃で１時間以上置く。

【００３０】これを１５０００ｒｐｍ、２０分間、４℃
で遠心し、沈殿させる。さらに沈殿物を４Ｍ ＧＴＣ溶
液（６Ｍ ＧＴＣ溶液を滅菌水で希釈したもの）１００
μｌに再溶解し、１００μｌのイソプロパノールを加え
−２０℃で１時間以上静置する。その後、遠心機で１５
０００ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心し、沈殿物を得
る。７０％エタノール１ｍｌで２回洗浄後、室温で風乾
し、１０μｌの滅菌水に溶解し、ＲＮＡとして使用し
た。

【００３１】ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成及びＰＣＲによ
る遺伝子増幅 ｃＤＮＡ合成は常法に従い、ＲＮＡ１０μｌをシリコン
処理を行なったチューブ（０．５ｍｌ）に分注後、７０
℃、３分間加熱し、氷上で急冷する。次にＲＮａｓｅイ
ンヒビター（宝酒造）０．２５μｌ（２００単位／μ
ｌ）、ｄＮＴＰｓ（各２ｍＭ）２μｌ、１０×ＰＣＲバ
ッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３、５
００ｍＭ ＫＣｌ）２μｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂
０．５μｌ、４０ｍＭ ＤＴＴ ０．５μｌ、第１ＰＣ
Ｒ用アンチセンスプライマー（５’−ＣＡＣＴＣＧＣＡ
ＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡ−３’（ＹＯＣ−４））２５
ｐｍｏｌｅ、逆転写酵素（生化学工業）０．４μｌ（２
４単位／μｌ）を加え、滅菌水で２０μｌにする。４２
℃で１時間保持し、酵素を失活させるために９５℃で５
分間加熱する。このｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行なっ
た。第１ＰＣＲとしてｃＤＮＡ溶液２０μｌに１０×Ｐ
ＣＲバッファー８μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ８μｌ、第
１ＰＣＲ用センスプライマー（５’−ＣＡＣＴＣＣＡＣ
ＣＡＴＡＧＡＴＣＡＣＴＣ−３’（ＹＯＣ−３））２５
ｐｍｏｌｅ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガ
ーマンハイム・ヤマノウチ社製、５単位／μｌ）を加
え、滅菌水で１００μｌにする。これにミネラルオイル
（シグマ社）を２滴重層し、撹拌後軽く遠心する。ＰＣ
Ｒ反応は、パーキンエルマーシータス社のＤＮＡ ｔｈ
ｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒを用いて行なった。反応のプ
ロファイルはＤＮＡ変性９４℃、１．５分、アニーリン
グ５０℃、１．５分、伸長反応７２℃、１．５分で３５
サイクルとした。終了後７２℃で１０分間保持し、４℃
に冷却した。この第１ＰＣＲ産物中の５μｌを、ＰＣＲ
用チューブ（０．５ｍｌ）に分取し、１０×ＰＣＲバッ
ファー９μｌ、第２ＰＣＲ用センス（５’−ＴＴＣＡＣ
ＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−３’（ＹＯＣ１））
及びアンチセンスプライマー（５’−ＡＡＴＴＣＣＧＧ
ＴＧＴＡＣＴＣＡＣＣＧＧ−３’（ＹＯＣ２））各２５
ｐｍｏｌｅ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ９μｌ、Ｔａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム・ヤマノウチ
社製、５単位／μｌ）を０．５μｌ加え、滅菌水で１０
０μｌにする。これにミネラルオイルを重層し、撹拌
後、軽く遠心する。ＰＣＲ反応は第１ＰＣＲの反応条件
と同様の方法で行なった。

【００３２】ＳＳＣＰ法による電気泳動バンドの検出 バンドの検出は次のように行なった。２ｎｄ ＰＣＲ産
物２μｌにＦｏｒｍａｍｉｄｅ 溶液（９５％ Ｆｏｒ
ｍａｍｉｄｅ，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ＢＰ
Ｂ，０．０５％ｘｃ）８μｌを加える。軽くｖｏｒｔｅ
ｘで混合し、ヒートブロックで９５℃１０分間加熱す
る。この工程でＤＮＡは一本鎖になる。加熱後、氷中で
急冷する。次にこのサンプルを電気泳動する。ゲルは次
の要領で作製する。２０％アクリルアミド溶液（重量比
でアクリルアミド４９に対しビスアクリルアミド１の割
合で溶解する）２．５ｍｌ、５×ＴＢＥ（０．４５Ｍ
Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ）２．５
ｍｌに純水を加え２５ｍｌにする。これに１０％Ａｍｍ
ｏｎｉｕｍ ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ ２５０μｌ、Ｎ，
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅ
ｎｅｄｉａｍｉｄｅ ２５μｌを加え、軽く撹拌する。
１４０ｍｍ×１４０ｍｍ×０．７５ｍｍのゲル板にこの
溶液を流し込み、コームをさしこみ静置する。ゲルが固
まったならば、バッファーを循環させ、温度制御のでき
る泳動槽（アトー：レゾルマックス，２連スラブ）にセ
ットし、２μｌのサンプルをアプライし、室温で１５０
Ｖの定電流で約１８０分間電気泳動する。ゲルの温度は
２１℃に保つように設定する。電気泳動終了後、ゲル板
をはずし、ポリアクリルアミドゲルを銀染色した。銀染
色は市販のキット（バイオラド：シルバーステインキッ
ト）を用いて行なった。染色はメーカーにより添付され
たプロトコールに従った。また槙ら（特願平４−３５９
１６０号）のプライマーでグルーピングを行なったサン
プルについて分類を行なった。図３に電気泳動の結果を
示す。レーン１〜５がグループＩ、レーン６〜１０がグ
ループＩＩに分類される検体を用いた。レーン１１が９
５℃、５分間のＤＮＡ変性を行なっていない２本鎖ＤＮ
Ａをコントロールとして泳動したものである。図３から
明らかなように、グループＩとグループＩＩでは２本の
１本鎖ＤＮＡ（図中、下端の近接する２本のバンドによ
り示される）の移動度は明らかに異なっており、この方
法でグルーピングが可能であることを示している。

【００３３】実施例２ ＩＦＮの治療効果とＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によるグルーピ
ングの相関 ＩＦＮ治療を行ない、効果の分かっている検体１２検体
について実施例１のプロトコールに従ってグルーピング
を行なった。著効例（ＩＦＮ治療終了後、ＡＬＴ値の正
常化が持続した症例）５例、一過性有効例（ＩＦＮ治療
開始後、ＡＬＴ値が治療前値の５０％以下に低下した
が、その後の観察で再上昇をきたした症例）５例、無効
例（ＩＦＮ治療開始後、ＡＬＴ値の低下が５０％未満で
あった症例）２例である。すべての症例について槙ら
（特願平４−３５９１６０号）の方法でのグルーピング
（ＮＳ５として示されている）あるいは岡本ら（J. Ge
n.Virol, 73:673-679）の方法でのタイピング（ＣＯＲ
Ｅとして示されている）も同時に行なった。表１にＰＣ
Ｒ−ＳＳＣＰ法でのグルーピングとＩＦＮ治療との相関
を示す。本方法で分類された検体のうち、一過性有効例
５例及び無効例２例はグループＩと判定された。著効例
５例はグループＩＩと判定された。これらの結果は、本
方法によるＨＣＶの分類がＩＦＮ治療の指針として有用
である可能性を示している。

【００３４】

【表１】

【００３５】

【発明の効果】Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型の識別にお
いて、５’ＵＴＲ領域は変異が入りにくい領域であり、
ここでのＰＣＲを行なうことにより誤判定が少なく且つ
該ウイルス遺伝子の検出率が高い、という利点をもつ。
したがって、該ウイルスの検出だけでなくインターフェ
ロン（ＩＦＮ）治療（グループＩＩに著効を示す）の実
施判定にも有効に使用し得る。

【００３６】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：３３２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源 生物名：Ｃ型肝炎ウイルス 配列の特徴 特徴を表す記号：５’ＵＴＲ 配列 CKRWTRGGGG CGACACTCCR CCATRRAYCA CTCCCCTGTG AGGAACTACT GTCTTCACGC 60 AGAAAGCGTC TAGCCATGGC GTTAGTATGA GTGTCGTRCA GCCTCCAGGY CCCCCCCTCC 120 CGGGAGAGCC ATAGTGGTCT GCGGAACCGG TGAGTACACC GGAATTRCCR GRAMGACYGG 180 GTCCTTTCTT GGAYHAACCC RCTCWRTGYC YGGHSATTTG GGCRYGCCCC CGCRAGMCTG 240 CTAGCCGWGT AGYGTTGGGT YGCGAAAGGC CWTGTGGTAC TGCCTGATAG GGTGCTTGCG 300 AGTGCCCCGG GAGGTCTCGT AGACCGTGCA TC 332

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の各グループと各
タイプの系統樹を示す。

【図２】異なるＣ型肝炎患者血清から取得されたＨＣＶ
ＲＮＡの５’ＵＴＲ領域のｃＤＮＡ配列の比較であ
る。図中、ボックスはグループＩ及びグループＩＩに特
異的な塩基の存在を示し、また、ＹＯＣ１及びＹＯＣ２
はプライマーの設定部位を示す。これらのプライマーは
該特異的塩基をはさみこむように設定されていることが
分かる。

【図３】本発明のグルーピング方法によるＰＣＲ産物の
電気泳動図を示す。レーン１〜５はグループＩに属する
検体１〜５の泳動結果、及び、レーン６〜１０はグルー
プＩＩに属する検体６〜１０の泳動結果をそれぞれ示
す。また、レーン１１は、９５℃、５分間のＤＮＡ変性
を行なっていない２本鎖ＤＮＡ（コントロール）であ
る。図中、下端の２本のバンドの移動度がグループＩと
ＩＩで互いに異なることが分かる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示されるヌクレオチド番号
   ２９〜９７の配列中に存在する少なくとも１０マーのヌ
   クレオチド配列を有するセンスプライマーと、配列番号
   １に示されるヌクレオチド番号１１１〜１６６の配列中
   に存在する少なくとも１０マーのヌクレオチド配列に相
   補的で且つ逆向きの配列を有するアンチセンスプライマ
   ーとを含む、Ｃ型肝炎ウイルスのグループＩ及びＩＩを
   識別するためのＰＣＲプライマーセット。
2. 【請求項２】 Ｃ型肝炎ウイルスを含有すると思われる
   検体から該ウイルス由来のＲＮＡを露出し、該ウイルス
   ＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成し、請求項１記載のプラ
   イマーセットを用いてＰＣＲを行なうことにより該ＤＮ
   Ａを増幅し、これをＳＳＣＰ法によって検出して該ウイ
   ルスのグループＩ又はＩＩを識別することを包含する、
   Ｃ型肝炎ウイルスのグループＩ又はＩＩのグルーピング
   方法。